The Application of UNA Fold Software in the Design of Biosensor

Biotechnology Frontier April 2015, Volume 4, Issue 1, PP.39-43

The Application of UNA Fold Software in the Design of Biosensor Zhang Zhang, Ting Wang, Guoming Xie# Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics of Education, Department of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400000, China #

Email: guomingxie@cqmu.edu.cn

Abstract The detection of nucleic acid is in great demand for clinical diagnosis, pathology and genetics due to its significance in disease.

The recent developments of DNA biosensor have received much attention due to its fast response, convenience, high sensitivity and easiness of operation. So it is essential to monitor the nucleic acid secondary structure and the kinetics of nucleic acid hybridization. In this paper, we focus on the function of UNA fold in the design of biosensor.

Keywords: DNA Biosensor; UNA Fold; Secondary Structure of Nucleic Acid and the Kinetics of Nucleic Acid Hybridization

UNA fold 在 DNA 传感器设计中的应用* 张章，汪婷，谢国明 重庆医科大学 检验医学院临床检验诊断学国家重点实验室，重庆 400000 摘 要：分子诊断中核酸的检测对于了解其在疾病的发生和发展中所起到的作用至关重要。近年来发展的核酸生物传感器 因其响应迅速、特异性强、操作简单、易于微型化等优点受到广泛关注。因此对核酸分子杂交和核酸二级结构的预测便 具有很重要的意义。本文基于 Zuker 的最小自由能算法所开发的 UNA fold，对其在核酸生物传感器设计中所起的作用进 行阐述。 关键词：DNA 传感器；UNA fold；核酸二级结构与核酸杂交动力学预测

引言 生物传感器是一种极具潜力的快速检测手段，以具有分子识别能力的生物活性物质作为敏感元件，通 过转换器能够将目标物与敏感元件之间的生物化学反应的信号转变为数字信号，从而得出分析物的浓度。 DNA 传感器是 20 世纪 90 年代中期逐渐发展起来的一种新的传感器技术。能够从基因水平上对靶物质迚行 特异性检测。与传统的传感器相比，DNA 生物传感器具有快速、灵敏、操作简单、特异性强、易于小型化 等特点，拥有更为广阔的应用前景。根据换能器的不同，DNA 传感器可以分为荧光[1]，电化学[2]，石英晶体 微天平[3]和表面离子共振[4]DNA 传感器等。近年来，生物医学工程科学研究更加活跃，并与多学科交叉融合， 基于 DNA 双链碱基互补配对原则的 DNA 生物传感器在基因诊断，环境监控，药物研究等领域的应用受到 广泛重视。 DNA 传感器的生物分子识别元件是核酸，它主要通过一系列的核酸杂交反应建立靶物质与生物信号分 子间的相关性，并将靶物质的信号转化为可检测生物信号，从而得出待测物的浓度。以最简单的电化学 DNA 传感器为例，首先在打磨好的金电极上通过 Au-S 键固定上单链 DNA 作为分子识别元件，当另一条与 之完互补配对的单链 DNA 即靶物质存在时，靶物质可以与金电极上固定的捕获探针碱基互补配对形成双链 *

基金资助：受国家自然科学基金支持资助（81171415） - 39 http://www.ivypub.org/bf

DNA。该杂交反应是靶物质直接与敏感元件相互作用，最终将杂交反应的生物变化转变为电信号，从而对 作为靶物质的单链 DNA 进行定量分析。DNA 生物传感器的基本原理是基于碱基互补配对原则的一系列复 杂的核酸链杂交反应，而杂交反应过程中又会产生一系列二级结构和动力学的变化，因此，在建立以及评 价新的核酸传感器平台时，核酸链杂交反应的动力学分析和核酸二级结构分析就变得尤为重要。

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生物传感器的分类

1.1 DNA 生物传感器检测致病基因 细菌及病毒感染是引起人类疾病的主要原因之一，传统的细菌培养方法费时费力，且对操作条件和操 作人员要求高。生物传感器特异性强，并且在很短的时间便可获得实验结果。Park[5]等报道了基于生物芯片 技术检测细菌 RNA 的生物传感器。DNA 生物传感器不仅可以检测病原菌的基因，也可对人类体细胞的致病 基因进行检测。Wang[6]等报道了一种基于石墨烯、聚苯胺、金纳米颗粒复合物的传感器实现了对慢性粒细 胞白血病 BCR/ABL 融合基因的检测。

1.2 DNA 生物传感器检测 miRNA miRNA 是真核生物中广泛存在的一种长约 21 到 23 个核苷酸的 RNA 分子。miRNA 来源于非编码 RNA， 通过与 mRNA 特异性的结合，从而抑制转录后基因表达，并在调控基因表达、基因沉默、细胞周期、生物 发育时序等方面都起重要作用。一系列的研究都证实，miRNA 与多种疾病如癌症、糖尿病、心脏病等相关， 为疾病检测提供了一个很好的靶点。Ren[7]等报道了一种基于双链特异性核酸酶的循环放大技术来直接实现 对血浆中 miRNA 的检测，其检测限可以达到飞摩尔的水平。

1.3 DNA 生物传感器用于表观遗传学研究 DNA 甲基化[8]作为表观遗传学的一个重要分支，是指在 DNA 甲基转移酶存在的条件下，基因组 CpG 核苷酸的胞嘧啶的 5 号位碳原子共价结合一个甲基基团。近年来发现 DNA 甲基化与人类发育和肿瘤等疾病 密切相关，甲基转移酶可以成为潜在的肿瘤标志物引起了科学界的广泛关注。Jing[9] 等报道了一种基于 DNA-金纳米颗粒的信号放大策略来检测甲基转移酶的活性及其抑制剂的筛选，其检测限可低至 0.02U/mL。

1.4 DNA 生物传感器用来检测某些金属离子 汞对人体健康危害严重，是水环境监测的重要指标。研究发现，汞离子能介导胸腺嘧啶(T)之间形成稳 定的 T-Hg2+-T 结构。并由此发展了具有良好选择性的 Hg2+检测方法。Yang[10]等报道了一种基于 T-Hg2+-T 结构的特异性检测 Hg2+的电化学传感器，最低检测限可低至 0.3pM。

1.5 DNA 生物传感器检测小分子物质 核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列，能与相应的配体进行高亲和力和特异性的结合， 它的出现为分析化学提供了一种新的快速识别研究平台，并在许多方面展示了良好的应用前景。Wu[11]等报 道了一种基于适配体技术用来检测 ATP 的 DNA 传感器，检测限可以达到 1.9nM，实现了对 ATP 的超灵敏 检测。

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UNA fold 简介 UNA Fold[12, 13](http://mfold.rna.albany.edu/)主要包括 mfold Application 和 DINAmelt Application 两部分，

mfold 可以对 DNA 或者 RNA 的二级结构进行预测，DINAmelt 可以对 DNA 或 RNA 杂交的动力学进行预测。 对于二级结构的预测结合了最小自由能，配分函数的计算和抽样估计；并提供二级结构的图片。对于杂交 反应，提供解链温度(Tm)和杂交特征性参数（包括 260nm UV 值，热容，不同分子摩尔量对于温度变化的 函数）。 - 40 http://www.ivypub.org/bf

UNA fold 在核酸二级结构预测和核酸分子杂交中的应用

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3.1 两条链之间的杂交 UNA fold 预测两条核苷酸链之间的杂交，并不预测单条核酸链内部之间的碱基配对关系。也可以用来 预测短链核酸与长链核酸可能的结合位点。（UNA fold 建议核酸杂交时核酸链的长度小于 100 base）对于 两条核酸链，可以是完全互补配对，也可以存在错配或小的凸起，甚至可以是两条完全无关的核酸链。 3.1.1

同源二聚体的形成

以短链 DNA 5’-CGCAATTCGCG -3’为例（图 1 所示），在 0-100 ℃的范围内，出现两种类型的同源二 聚体。

图 1 同源二聚体和异源二聚体结构

3.1.2

异源性核酸二聚体（DNA 和 RNA 之间的杂交）

以 miRNA let-7a 为例，其核苷酸序列为 5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’，互补的核苷酸序列 为 5’-AACTATACAACCTACTACCTCA-3’（如图 1 所示）。

3.2 分子信标 分子信标[14]是一种呈茎环结构的寡核苷酸探针，具有操作简单、选择性好、不必与未反应的探针分离 即可实时检测等优点，在特定序列单链核苷酸的检测中扮演着越来越重要的角色。其利用茎环结构和靶物 质的杂交之间的竞争性关系，来检测单核苷酸多态性。典型的分子信标是在核苷酸的 3’和 5’端分别标记荧 光物质和淬灭剂。分子信标的茎域由 5-7 个互补的碱基构成，形成茎环结构，并且使得荧光物质和淬灭基团 相互靠近，使得分子信标产生的荧光信号被淬灭。当茎环结构被破坏时，淬灭基团不发挥作用从而使得荧 光信号被释放。环域由 10-40 个碱基的寡核苷酸构成，与靶物质互补结合。本文中所模拟的分子信标的核苷 酸序列如下：5’-gcgagcTAGGAAACACCAAAGATGATATTTgctcgc-3’（小写为茎域结构，大写为环域结 构 ） ； 靶 物 质 序 列 ： 5’-AAATATCATCTTTGGTGTTTCCTA-3’ ； SNP 序 列 ： 5’-AAATATCATCTC TGGTGTTTCCTA-3’（红色字母为突变序列）。图 3 为分子信标二级结构，以及靶物质和 SNP 分别与分子 信标反应的结构。 整个实验的核心是在一定的温度，离子、核酸链浓度的条件下，所有的分子信标可以和靶物质杂交， 却不可以和 SNP 杂交或杂交效率很低。先前的预测已经证明靶物质不会形成茎环结构，也不会形成自身二 - 41 http://www.ivypub.org/bf

聚体；设置靶物质的浓度是分子信标的两倍，来保证分子信标最高的杂交效率（分子信标浓度为 1，靶 物质为 2）。图 2 表示靶物质和分子信标，SNP 和分子信标反应后产物的模拟曲线。SNP 和分子信标反 应的解链温度较靶物质与分子信标反应的解链温度低 3.6℃.理想情况下，分子信标全部处于折叠的茎环结 构，直链的分子信标则产生假阳性结果。最佳的反应温度在 73℃，分子信标和靶物质的结合效率较高，而 SNP 和分子信标的结合效率较低。

图 2 分子信标与靶物质和 SNP 反应曲线

图 3 分子信标二级结构，靶物质、SNP 与分子信标反应结果

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结语 DNA 生物传感器以其特异性、稳定性、快速等优点为分子生物学开辟了新的领域，为生命科学的研究

提供了一个新的方法。并且在医疗，环境监测等领域取得了较大的成绩。而 UNA fold 促进了 DNA 生物传 感器的蓬勃发展。

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【作者简介】 1

张章（1989-），男，汉族，在读研究

2

汪婷（1990-），女，汉族，在读研究生，研究方向为即时

生，研究方向为即时检验与生物传感，

检验与生物传感，学习经历：（2013-）就读于重庆医科大

学习经历：（2013-）就读于重庆医科大

学。Email: 664736904@qq.com

学。Email: cqmuzhangzhang@163.com

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