Moskiera phd autoreferat

Instytut Ogrodnictwa Zakład Mikrobiologii, Pracownia Mikrobiologii

mgr inż. Michał Oskiera

Molekularna identyfikacja gatunkowa i analiza zróżnicowania genetycznego polskich izolatów Trichoderma mających potencjalne zastosowanie w biologicznej ochronie roślin Autoreferat pracy doktorskiej

Promotor: dr hab. Grzegorz Bartoszewski, SGGW w Warszawie

Recenzenci: prof. dr hab. Hanna Kwaśna, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu dr hab. Ewa Król, prof. Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie

Skierniewice, 2015

Praca wykonana w ramach projektu pt. „Polskie szczepy Trichoderma w ochronie roślin i zagospodarowaniu odpadów organicznych” współfinansowanego przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Działania 1.3 Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, Poddziałanie 1.3.1 numer projektu: UDA-POIG.01.03.01-00-129/09

Wstęp i cele pracy Niektóre gatunki grzybów znajdują zastosowanie w rolnictwie jako biologiczne środki wspomagające wzrost roślin (PGPF, ang. Plant Growth Promoting Fungi) lub jako preparaty ochrony roślin (BCA, ang. Biological Control Agent). Do grzybów tych należą między innymi szczepy z różnych gatunków Trichoderma. Prowadzone są liczne badania mające na celu selekcję i identyfikację gatunków oraz izolatów grzybów wyróżniających się swoimi właściwościami, które mogą być wykorzystane w uprawie roślin. Rośliny w obecności tych mikroorganizmów odznaczają się przyspieszonym wzrostem, zwiększoną powierzchnią korzeni oraz podwyższoną tolerancją bądź odpornością na patogeny.

Preparaty na bazie grzybów Trichoderma są również stosowane w celu poprawienia właściwości gleby przez intensyfikację rozkładu materii organicznej, czy też eliminację grzybów patogenicznych występujących w glebie. Ważnym etapem badań, mających na celu selekcję pożądanych izolatów Trichoderma, jest wyodrębnienie izolatów z gatunków wykazujących korzystne właściwości względem roślin oraz wyeliminowanie izolatów z gatunków potencjalnie niebezpiecznych, mogących powodować choroby grzybów uprawnych np. pieczarek. Małe zróżnicowanie morfologii grzybów z rodzaju Trichoderma utrudnia identyfikację, a wprowadzenie do środowiska szkodliwych gatunków może mieć negatywne skutki.

Głównym celem pracy było przeprowadzenie molekularnej identyfikacji gatunkowej kolekcji polskich izolatów grzybów Trichoderma, o potencjalnej przydatności w rolnictwie jako PGPF lub BCA. W przeprowadzonych badaniach zastosowano metody molekularne, takie jak: rep-PCR, gatunkowo-specyficzny PCR, sekwencjonowanie fragmentów genów tef1, rpb2, chi18-5 i rejonów ITS1 i ITS2.

Określono również zróżnicowanie wewnątrzgatunkowe badanych izolatów Trichoderma.

Kolejnym celem pracy było zbadanie przeżywalności w glebie grzybów zastosowanych w formie preparatów biologicznych. Grzyby stosowane jako PGPF lub BCA, aby wykazywały aktywność względem roślin, powinny utrzymywać się na odpowiednio wysokim poziomie w glebie. Z tego względu podjęto próbę oceny przeżywalności mieszanek aplikowanych izolatów Trichoderma w glebie uprawnej podczas przeprowadzonych doświadczeń z uprawą sałaty. Aby zrealizować ten cel, niezbędne było wykonanie identyfikacji gatunkowej Trichoderma naturalnie zasiedlających gleby uprawne Instytutu Ogrodnictwa w Skierniewicach. Do identyfikacji wprowadzonych do gleby izolatów grzybów z gatunków T. atroviride i T. harzianum zastosowano opracowane w ramach pracy markery molekularne i potwierdzono ich przydatność do monitorowania tych gatunków Trichoderma w glebie.

Cele szczegółowe pracy 1.

2.

3.

4.

Wykonanie identyfikacji gatunkowej 104 izolatów Trichoderma o potencjalnej przydatności w rolnictwie za pomocą metod molekularnych.

Ocena zróżnicowania wewnątrzgatunkowego badanych izolatów Trichoderma na poziomie molekularnym.

Opracowanie serii markerów molekularnych opartych o metodę PCR i przydatnych do identyfikacji wybranych izolatów Trichoderma.

Ocena przeżywalności w glebie izolatów Trichoderma zastosowanych w formie mieszaniny aktywnych szczepów. Określenie w jakiej ilości i jak długo utrzymują żywotność izolaty wprowadzone do środowiska glebowego.

1

Metodyka badań i wyniki Izolaty grzybów Izolaty grzybów Trichoderma, które wykorzystano w badaniach, pochodziły z kolekcji mikroorganizmów Pracowni Mikrobiologii, Instytutu Ogrodnictwa w Skierniewicach (IO) (Tabela 1). Badane izolaty zostały zebrane na potrzeby realizacji projektu badawczego pt. „Polskie szczepy Trichoderma w ochronie roślin i zagospodarowaniu odpadów organicznych” współfinansowanego przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Działania 1.3 Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, Poddziałanie 1.3.1 numer projektu UDAPOIG.01.03.01-00-129/09. Wykorzystano także izolaty referencyjne Trichoderma pochodzące z międzynarodowych kolekcji grzybów oraz izolaty pochodzące z innej kolekcji Pracowni Mikrobiologii IO o potwierdzonej metodami molekularnymi przynależności gatunkowej. Wszystkie izolaty grzybów przechowywano w glicerolu w -80 °C.

Doświadczenia polowe Doświadczenia polowe wykonano we współpracy z Pracownią Uprawy Warzyw IO na polu doświadczalnym IO w Skierniewicach w trzech różnych lokalizacjach.

Agrotechniczna część doświadczeń została wykonana w ramach osobnego zadania badawczego pt. „Zastosowanie „szczepionek” i biomasy Trichoderma w integrowanej produkcji warzyw” pod kierownictwem dr Agnieszki Stępowskiej w ramach realizacji wspólnego projektu pt. „Polskie szczepy Trichoderma w ochronie roślin i zagospodarowaniu odpadów organicznych”.

W doświadczeniach polowych uprawiano sałatę kruchą odmiany Elenas (Rijk Zwaan BV, Holandia) oraz wykorzystano preparaty własne Trichoderma w postaci granulatów T-GRAN (wyprodukowanych na bazie odpadów organicznych), przerośniętych grzybnią izolatów Trichoderma (Smolińska i inni, 2014a i 2014b).

Aplikowane doglebowo preparaty składały się z granulatów T-GRAN przerośniętych mieszankami izolatów Trichoderma: - TRS25+TRS59 (wariant 9 w doświadczeniu I i wariant 10 w doświadczeniach II i III), - TRS43+TRS85 (wariant 13 w doświadczeniu I i wariant 11 w doświadczeniu II i III).

Wykorzystane w preparatach izolaty T. atroviride TRS25 i TRS43 należały do kladu A. Natomiast izolaty T. harzianum TRS59 i TRS85 należały do T. harzianum sensu stricto.

Po ok. 2 tygodniach od aplikacji preparatów (po 4 poletka dla danego wariantu doświadczalnego) na poletka wysadzono rozsadę sałaty (Fot. 1).

Fotografia 1. Poletka doświadczalne z II doświadczenia (zdjęcie wykonano 1.07.2013).

2

Monitoring obecności Trichoderma w glebie podczas I doświadczenia polowego prowadzono przez ponad 2 lata (od 8.05.2012 do 10.07.2014) pobierając próbki gleby w 11 terminach. W doświadczeniach II i III (2013 rok) w analizach uwzględniono również drugi wariant kontrolny w postaci poletek po aplikacji samych granulatów bez Trichoderma oraz ustalono 3 terminy poboru prób: (1) przed zastosowaniem preparatów z Trichoderma - termin odzwierciedlający stan „0” pola, (2) około miesiąca od wysadzenia roślin - termin „1” odzwierciedlający stan podczas uprawy sałaty, (3) 1-2 tygodnie po zbiorze roślin - termin „2” - stan pola po zakończeniu uprawy przed likwidacją doświadczenia.

Analizie łącznie poddano 44 poletka doświadczalne. Każde poletko, niezależnie od wariantu, traktowano indywidualnie. W sumie w analizach wykorzystano 252 niezależne, reprezentatywne próby gleby pochodzące z trzech doświadczeń.

Optymalizacja

procedury

izolacji

DNA

z

czystych

kultur

Trichoderma W pierwszym etapie ustalania procedury izolacji DNA testowano różne sposoby pozyskiwania materiału. Przetestowano trzy źródła pozyskiwania materiału do izolacji DNA: (1) zeskrobywano zarodniki z pożywek agarowych, (2) kultury płynne izolatów grzybów namnażane z wytrząsaniem przez 4 do 7 dni, (3) kultury płynne izolatów grzybów namnażane bez wytrząsania. W oparciu o analizy elektroforetyczne i spektrofotometryczne izolowanego DNA stwierdzono, że zeskrobywanie zarodników nie jest najlepszą metodą pozyskiwania materiału biologicznego na potrzeby izolacji DNA, ze względu na to, że ilości uzyskanego DNA znacznie różniły się pomiędzy próbami. W przypadku pozyskiwania DNA z hodowli płynnych ilości wyizolowanego DNA były podobne dla poszczególnych prób i izolatów. Dodatkowo zastosowanie wytrząsania kultur grzybów w pożywce płynnej pozwalało na uzyskanie wyższych koncentracji DNA, niż w przypadku, gdy prowadzono kulturę na pożywkach stałych. Również dodatek piasku kwarcowego podczas ucierania grzybni w ciekłym azocie powodował, że uzyskiwano wyższe koncentracje DNA. Ustalono, że najlepszym sposobem pozyskiwania materiału do izolacji DNA jest namnożenie grzybni w kulturze płynnej w pożywce PDA z wytrząsaniem przez okres od 4 do 7 dni w temperaturze 25 ºC. W kolejnym etapie optymalizacji porównywano różne metody izolacji DNA. Porównywano zarówno metody wykorzystujące bufory i odczynniki przygotowywane w laboratorium, jak również metody oparte o zestawy komercyjne. Procedury izolacji różnymi metodami wykonano zgodnie z instrukcjami producenta lub protokołu.

Porównywano 6 metod izolacji DNA: 1. gotowanie komórek (12 minut 105 ºC), 2. metoda solna (Aljanabi i Martinez, 1997), 3. metoda wykorzystująca bufor CTAB (Aldrich i Cullis, 1993), 4. zestaw Genomic Mini (A&A Biotech, Polska), 5. zestaw NucleoSpin Plant II (Macherey-Nagel, Niemcy), 6. zestaw DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Niemcy).

Spośród testowanych metod największą wydajnością izolacji DNA charakteryzowała się metoda wykorzystująca bufor CTAB w połączeniu z pozyskiwaniem materiału biologicznego z kultur płynnych z wytrząsaniem i dodatkiem piasku kwarcowego na etapie homogenizacji materiału biologicznego. Natomiast, stosując metodę DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Niemcy) z modyfikacjami polegającymi 3

na dodawaniu PVP, PVPP i proteinazy K do buforu lizującego, uzyskiwano najczystsze preparaty DNA. W zależności od przeznaczenia DNA dobierano metodę izolacji uwzględniając koszty procedury i późniejszego przeznaczenia preparatów. Na potrzeby identyfikacji izolatów odszczepionych w doświadczeniach polowych stosowano procedurę wykorzystującą bufor CTAB. Natomiast, gdy DNA potrzebne było do wielu analiz, takich jak optymalizacje warunków PCR, czy sprawdzanie specyficzności gatunkowej markerów molekularnych, DNA izolowano metodą CTAB i doczyszczano z wykorzystaniem zestawu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Niemcy).

Optymalizacja protokołu izolacji DNA z gleby Przetestowano izolację całkowitego DNA z próbek gleby pozyskiwanej z pola doświadczalnego przy użyciu pięciu metod, w tym czterech opartych o komercyjne zestawy do izolacji DNA: 1.

Fast DNA Spin Kit For Soil (MP Biomedicals, USA), 2.

Genomic DNA from Soil (Macherey-Nagel, Niemcy), 3.

SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, USA), 4.

DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Niemcy), 5.

CTAB + DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Niemcy) (metoda własna opracowana do izolacji wysokiej czystości DNA z grzybni Trichoderma namnażanych w pożywkach płynnych).

Wykonane pomiary stężeń i czystości prób DNA uzyskanych z zastosowaniem pięciu testowanych metod pozwoliły zaobserwować, że głównym czynnikiem wpływającym na wydajność izolacji DNA jest homogenizacja prób gleby. Zastosowanie homogenizatora FastPrep24 (MP Biomedicals, USA) pozwoliło uzyskać najwyższe stężenia DNA, dodatkowo zastosowanie jednolitych warunków homogenizacji (ten sam czas i prędkość) skutkowało uzyskaniem bardziej powtarzalnych i zbliżonych do siebie stężeń i czystości DNA pomiędzy próbami. Za najlepszy zestaw do izolacji całkowitego DNA z gleby uznano zestaw Genomic DNA from Soil (Macherey-Nagel, Niemcy) ze względu na uzyskane najczystsze preparaty DNA. Stosunek absorbancji 260/280 miał średnią wartość ok. 1,87 (+/- 0,05), natomiast stosunek absorbancji 260/230 miał średnią wartość 1,37 (+/- 0,25). Finalna procedura izolacji DNA z gleby została opracowana przez połączenie procedury izolacji DNA, wykonywanej zgodnie z zaleceniami producenta zestawu Genomic DNA from Soil (Macherey-Nagel, Niemcy), z procedurą homogenizacji prób, wykonaną zgodnie z zaleceniami i narzędziami firmy MP Biomedicals, tj. z zastosowaniem złoża do homogenizacji gleby (Lysing MatrixE) oraz homogenizatora (FastPrep24).

Przeprowadzone testowe reakcje PCR na martycy DNA wyizolowanego z gleby potwierdziły, że zoptymalizowana procedura izolacji DNA umożliwia uzyskanie preparatów DNA dobrej jakości. Uzyskane DNA nie powodowało inhibicji PCR, co pozwalało na wykrycie Trichoderma w próbach gleby już na poziomie 103 jtk g-1 s. m. gleby. Opracowana metoda izolacji całkowitego DNA z gleby została wykorzystana do izolacji DNA z prób gleby pochodzących z trzech doświadczeń, w których identyfikowano Trichoderma po zaaplikowaniu mieszanin izolatów w uprawie sałaty.

4

Identyfikacja Trichoderma Wykonano identyfikację gatunkową kolekcji 104 izolatów grzybów Trichoderma o potencjalnej przydatności jako BCA / PGPF. Zastosowano metody molekularne i analizy MLST (MLST - Multilocus sequence typing) wykorzystując 4 loci taksonomiczne (region ITS1 i ITS2 oraz fragmenty genów: tef1, chi18-5 i rpb2). Uzyskane sekwencje (916) zostały zdeponowane w publicznej bazie sekwencyjnej NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Postępowanie zostało przeprowadzone według zaleceń ISTH (http://www.isth.info). Sekwencje ITS1i ITS2 porównywano z bazą ISTH z zastosowaniem programu TrichOKEY 2. Sekwencje ITS1, ITS2, tef1 i rpb2 analizowano również z zastosowaniem programów TrichoMARK oraz TrichoBLAST (http://isth.info/tools/blast/blast.php) (Kopchinskiy i inni., 2005). Wszystkie uzyskane sekwencje porównywano również z bazą sekwencji nr GenBank z zastosowaniem BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Potwierdzono, że wszystkie izolaty stanowiące kolekcję projektu należą do rodzaju Trichoderma. Spośród badanych izolatów Trichoderma, w oparciu o najnowszą taksonomię rodzaju, zidentyfikowano 100 izolatów, wśród których rozróżniono 15 gatunków Trichoderma: T. atroviride (39 izolatów), T. harzianum sensu stricto (22 izolaty), T. simmonsii (6 izolatów), T. atrobrunneum (3 izolaty), T. lentiforme (9 izolatów), T. virens (9 izolatów), T. gamsii (2 izolaty), T. viridescens (1 izolat), T. hamatum (2 izolaty), T. crassum (1 izolat), T. aggressivum f. europaeum (1 izolat), T. pleuroticola (2 izolaty), T. tomentosum (1 izolat), T. spirale (1 izolat), T. citrinoviride (1 izolat) (Tabela 1). Dla czterech izolatów Trichoderma TRS4, TRS29, TRS33 i TRS73 nie udało się określić przynależności gatunkowej i postanowiono wykonać analizę filogenetyczną.

Tabela 1. Oznaczenie i pochodzenie izolatów stanowiących kolekcję Pracowni Mikrobiologii Instytutu Ogrodnictwa w Skierniewicach, potencjalnie przydatnych do selekcji izolatów BCA i PGPF oraz zestawienie uzyskanych grup profili amplifikacyjnych rep-PCR z typami sekwencyjnymi (gwiazdką oznaczono izolaty stosowane w doświadczeniach polowych).

Gatunek Nazwa izolatu

Profil rep-PCR i typ sekwencyjny Pochodzenie ITS1 i 2

tef1

chi18-5 rpb2

ERIC

BOX

REP

T. atroviride P. Karsten TRS1

Podłoże pieczarkarskie; Maków

A1

A1a

A1

A2a

A1

A1

A1

TRS2

Kurz, pieczarkarnia; kompostownia; Łódź

A1

A1c

A1

A1

A1b

A1b

A1

TRS3

Pieczarkarnia, podłoga; Maków

A1

A1a

A1

A1

A1

A2

A1

TRS5

Podłoże pieczarkarskie; kompostownia ; Łódź

A1

A1a

A1

A1

A1

A1

A1

TRS6

Podłoże pieczarkarskie; Sława

A1

A1c

A1

A1

A1b

A3

A2a

TRS7

Pieczarkarnia; Bierun

A1

A1d

A1

A1

A1

A2

A1

TRS9

Pieczarkarnia, powietrze; Maków

A1

A1a

A1

A1

A1

A1

A1

TRS10

N/A; Turek

A1

A2

A2

A3

A1b

A3

A1

TRS11

N/A; Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

A1

A1

A1

A1

A1

A2

A1

TRS12

N/A; Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

A1

A1

A1

A1

A1

A2

A1

TRS13

A1

A1

A1

A1

A1

A2

A1

A1

A1

A1

A1

A1

A1

A1

TRS14

N/A; Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Podłoże pieczarkarskie; Pracownia Grzybów Uprawnych, Instytut Ogrodnictwa, Skierniewice

TRS15

Drewno; Głuchów

A

A1a

A1

A1

A1

A1

A1

5

TRS16

N/A

A1

A2

A1

A3

A1b

A3

A2

TRS17

Podłoże pieczarkarskie; Skierniewice

A1

A1

A1

A1

A1a

A2

A1

TRS18

Podłoże pieczarkarskie; Maków

G

A3

A2b

A2b

A1

A3

A3

TRS19

Gleba

A1

A1

A1

A1

A1a

A2

A1

TRS20

Pieczarkarnia, podłoga; Sierakowice Lewe

A1

A1

A1

A2

A1

A1

A1

TRS21

Gleba; Topolowo koło Sochaczewa

A1

A1

A1

A2

A1

A1

A1

TRS22

Gleba; Wiskitki koło Żyrardowa

A1

A1

A1

A2a

A1

A1

A1

TRS24

Pieczarkarnia, ściany; Ignanie Nowe

A

A1

A1

A1

A1

A1

A1

TRS25

Pieczarkarnia, ściany; Ignanie Nowe

A1

A1

A1

A2

A1a

A2

A1

TRS26

Gleba; Lipniak koło Kocka

A1

A2

A1

A3

A1b

A3

A2

TRS28

Pieczarkarnia, podłoga; Kolonia Bolimowska

A

A1

A1

A2

A1

A1

A1

TRS30

Gleba; Skierniewice

A

A1

A1

A2a

A1

A1a

A1

TRS31

Gleba; Balcerów

A1

A1a

A1

A1

A1

A1

A1

TRS32

Pieczarkarnia, powietrze; Maków

A1

A1a

A1

A1

A1

A2

A1

TRS34

N/A

A

A1

A1

A1

A1

A1a

A1

TRS36

Gleba; Kątno

A1

A1

A1

A2

A1

A1

A1

TRS38

Gleba; Myslibórz

A1

A1

A1

A1

A1a

A2

A1

TRS39

Gleba; Myslibórz

A1

A1

A1

A1

A1

A1

A1

TRS40

Kompost; Rzeczyce

A1

A2

A2

A3

A1b

A3

A1

TRS42

Gleba; Radzanów

A1

A2

A1

A3

A1b

A3

A2

TRS43*

Gleba leśna; Wielkopolski Park Narodowy

A1

A1d

A1

A1

A1a

A1a

A1

TRS44

N/A

A1

A2

A2

A3

A1b

A3

A1

TRS45

Podłoże pieczarkarskie; Maków

A

A1

A1

A1

A1

A1

A1

TRS46

N/A

A

A1

A1

A2

A1

A2

A1

TRS47

N/A

A1

A1a

A1

A1

A1

A2

A1

TRS68

Podłoże pieczarkarskie; Skierniewice

A1

A1a

A1

A1

A1

A2

A1

T. gamsii Samuels & Druzhinina TRS123

Gleba; Strobow

G1

G1

G1

G1a

G1a

G1

G1b

TRS125

Gleba; Wola Skromowska koło Kocka

G1

G1a

G1

G1

G1

G1

G1

G2

G2

T3

G2

T. viridescens (A.S. Horne & H.S. Williamson) Jaklitsch & Samuels TRS35

G2

Gleba; Lękosz koło Brodnicy

G2

G2

T. sp. = T. sp. 435 (Hoyos-Carvajal i inni, 2009) i T. sp. C.P.K. 3606 (López-Quintero i inni, 2013) TRS4

Pieczarkarnia; Kolonia Bolimowska

K1

K1

K

K1

K1

K1

K1

TRS29

Pieczarkarnia, ściany; Maków

K1

K1

K

K1

K1

K1

K1

TRS33

Pieczarkarnia, podłoga; Skierniewice

K1

K1

K

K1

K1

K1

K1

T. hamatum (Bonorden) Bainier TRS121

Drewno; Głuchów

Ha

Ha

Ha

Ha

Ha

Ha

Ha

TRS127

N/A

Ha

Ha

Ha

Ha

Ha

Ha

Ha

V1

V1

V

V1

V1

V1

V1

V1

V2

V2

V2a

V2

V1a

V3

T. virens (J.H. Miller, Giddens & A.A. Foster) Arx TRS106 TRS107

Podłoże pieczarkarskie; Pracownia Grzybów Uprawnych, Instytut Ogrodnictwa, Skierniewice Podłoże pieczarkarskie; Pracownia Grzybów Uprawnych, Instytut Ogrodnictwa,

6

Skierniewice

V1

V1

V

V1

V1

V1

V1

TRS108

Podłoże pieczarkarskie; Pracownia Grzybów Uprawnych, Instytut Ogrodnictwa, Skierniewice

TRS109

Podłoże pieczarkarskie; Skierniewice

V1

V2

V

V2

V2

V2

V3

TRS110

Podłoże pieczarkarskie; Skierniewice

V1

V2

V

V2

V2

V2

V3

TRS112

Podłoże pieczarkarskie; Skierniewice

V1

V2

V2

V2a

V2

V1a

V2

TRS114

Gleba; Wola Skromowska koło Kocka

V1

V1

V

V1

V1

V1b

V2

TRS116

Gleba; Radzanów

V1

V1

V1

V1

V1

V1b

V2a

TRS117

N/A

V1

V1

V

V1

V1

V1b

V3

V1a

V3

T3b

V3

V3

T3

V2b

T. crassum Bissett TRS113

Gleba; Wola Skromowska koło Kocka

T. harzianum Rifai (T. harzianum sensu stricto) TRS53

Podłoże pieczarkarskie; Maków

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1a

TRS54

Gleba; N/A

H1a

H1b

H1

H1

H1

H1

H1

TRS55

Pieczarkarnia; Maków

H1a

H1

H1

H1

H1

H1

H1

TRS56

Podłoże pieczarkarskie; Czestochowa

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1

TRS57

Gleba; Skierniewice

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1a

TRS58

Gleba; Wadowice

H1a

H1

H1

H1

H1

H1

H1

TRS59*

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1a

H1

H1

H1

H1

H1

H1

TRS61

Gleba; Balcerów Podłoże pieczarkarskie; Pracownia Grzybów Uprawnych, Instytut Ogrodnictwa, Skierniewice

TRS62

Podłoże pieczarkarskie; Maków

H1a

H1

H1

H1

H1

H1

H1a

TRS65

N/A; Sokolow Podlaski

H1

H1

H1

H1a

H1

H1

H1a

TRS69

Pieczarkarnia; Maków

H1a

H1

H1

H1b

H1

H1

H1

TRS71

Gleba; Janowek

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1

TRS72

Pieczarkarnia; Skierniewice

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1

TRS83

Gleba; Nowy Bialynin

H1b

H1

H1

H1a

H1

H1

H1

TRS87

Kompost; Rzeczyce

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1

TRS88

Kompost; Rzeczyce

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1

TRS89

Kompost; Rzeczyce

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1

TRS92

Gleba; Radzanów

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1

TRS93

Gleba; Radzanów

H1

H1

H1

H1a

H1

H1

H1

TRS94

Gleba; Lipniak koło Kocka

H1

H1

H1

H1a

H1

H1

H1

TRS95

Gleba; Janowo

H1

H1

H1

H1a

H1

H1

H1

TRS122

Podłoże pieczarkarskie; Skierniewice

H1

H1

H1

H1

H1

H1

H1

T. atrobrunneum F.B. Rocha, P. Chaverri & W. Jaklitsch, sp. nov.

TRS60

Podłoże pieczarkarskie; Balcerów

H4

H4

H1a

H1e

H2b

H3

H3

TRS86

Gleba; Rzeczyce

H3a

H4a

H1a

H1d

H2a

H3

H3

TRS91

Gleba; Wysoka

H4

H4

H1b

H1d

H2

H3

H3a

T. lentiforme (Rehm) P. Chaverri, Samuels & F.B. Rocha, comb. nov.

TRS35x

Gleba; Lękosz koło Brodnicy

H1c

H2b

H3

H4

Hx

Hx

Hx

TRS58x

Gleba; Wadowice Gleba; Pole Instytutu Ogrodnictwa, Skierniewice

H3a

H2b1

H2a

H4b

Hx

Hx

Hx

H1c

H2b

H3

H8

Hx

Hx

Hx

TRS63x

7

TRS64

N/A; Pszczyna

H1c

H2b

H3

H8

Hx

Hx

Hx

TRS65x

N/A; Sokołów Podlaski

H1c

H2b

H3

H4

Hx

Hx

Hx

TRS74

Gleba; Kątno

H1d

H2d

H2a

H4c

Hx

Hx

Hx

TRS76

Gleba; N/A

H1d

H2d

H2a

H4c

Hx

Hx

Hx

TRS78

Podłoże pieczarkarskie; Skorzec

H1d

H2d

H2a

H4c

Hx

Hx

Hx

TRS79

Pieczarkarnia; Ignanie Nowe

H1c

H2c

H3a

H4c

Hx

Hx

Hx

T. simmonsii P. Chaverri, F.B. Rocha, Samuels, Degenkolb & W. Jaklitsch, sp. nov.

TRS66

N/A; Parczew

H3

H2

H2

H2

H1a

H2

H1a

TRS67

N/A; Radzyn Podlaski

H3

H2

H2

H2

H1a

H2

H2

TRS75

Pieczarkarnia; Sierakowice Lewe

H3

H2

H2

H2

H1

H2

H2

TRS77

Pieczarkarnia, podłoga; Maków

H3

H2

H2

H3

H1a

H2

H2a

TRS80

Podłoże pieczarkarskie; Skierniewice

H3

H2

H2

H3

H1a

H2

H2

H3

H2

H2

H2

H1

H2

H2

H4a

H2a

H2

H1c

H1a

H2

H2a

Hagr

Hagr

Hagr

Hagr

H3a

H3

H4

TRS85MO Pieczarkarnia, powietrze; Sierakowice Lewe

T. cf. harzianum TRS73

Pieczarkarnia; Kolonia Bolimowska

T. aggressivum f. europaeum Samuels & W. Gams TRS27

Pieczarkarnia, powietrze; Sierakowice Lewe

T. pleuroticola S.H. Yu & M.S. Park TRS70

Drewno; Głuchów

P

P

P

P

P1

P

P1

TRS120

Drewno; Głuchów

P

P

P

P

P1a

P

P1a

T2

T2

T3a

T2

T

T

T

S

S

S

S

S

S

S

C

C

C

C

C

C

C

T. tomentosum Bissett TRS82

Gleba; Nowy Dwor

T. spirale Bissett TRS111

Gleba; Rudzieniec

T. citrinoviride Bissett TRS119

N/A; Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Filogeneza Trichoderma, kladu Rogersonii Przeprowadzono analizy filogenetyczne na podstawie fragmentów sekwencji genu tef1 izolatów reprezentujących gatunki Trichoderma należące do kladu Rogersonii wraz z grupą zewnętrzną reprezentowaną przez T. strigosum i T. strigosellum. Ustalono, że izolaty TRS4, TRS29 i TRS33 wraz z trzema izolatami pochodzącymi z Ameryki Środkowej: DAOM231245 (Hoyos-Carvajal i inni, 2009), H11 (Gazis i Chaverri, 2010), C.P.K. 3606 (López-Quintero i inni, 2013) należą do nieopisanego gatunku w kladzie Rogersonii (Rycina 1). Przeprowadzona analiza filogenetyczna potwierdza również przynależność do kladu Rogersonii, oprócz T. austrokoningii i T. rogersonii oraz T. subeffusum gatunku T. pararogersonii opisanego w 2015 roku (Rycina 1).

8

Rycina 1. Drzewo filogenetyczne skonstruowane metodą bayesowską w oparciu o przyrównania sekwencji intronu 4 genu tef1 przedstawiające klad Rogersonii Trichoderma oraz grupę zewnętrzną T. strigosum i T. strigosellum, uzyskane jako konsensus ze zbioru 50% najbardziej prawdopodobnych drzew. Numery przy rozgałęzieniach oznaczają wartości prawdopodobieństwa a posteriori. Nazwy zawierają numery sekwencji w GenBank oraz nazwę izolatu. Po prawej stronie podano nazwy gatunkowe. Sekwencje TRS4, TRS29 i TRS33 (KP008948, KP008949 i KP008950 ) są identyczne i lokują się na wyraźnie oddzielonej gałęzi oznaczonej jako nieopisany gatunek Trichoderma (T. sp. ).

Ocena zróżnicowania genetycznego wykonana metodą rep-PCR Wykonano analizę rep-PCR dla izolatów stanowiących kolekcję projektu i uzyskano dobrej jakości profile amplifikacyjne (Fot. 2 i 3). Średnio uzyskano po 6-10 amplikonów dla danej kombinacji starterów. Stwierdzono, że profile amplifikacyjne uzyskiwane metodą rep-PCR z wykorzystaniem starterów ERIC, REP i BOX były charakterystyczne dla poszczególnych gatunków Trichoderma (Fot. 2). Profile te oznaczono i zestawiono w postaci tabeli (Tabela 1).

9

Fotografia 2. Zestawienie profili amplifikacyjnych rep-PCR ze starterami ERIC dla wybranych izolatów reprezentujących trzy gatunki Trichoderma. Profile amplifikacyjne były charakterystyczne dla gatunku. Widoczne jest także zróżnicowanie wewnątrzgatunkowe (T. atroviride i T. virens). W ścieżce po lewej stronie rozdzielano marker wielkości DNA.

W obrębie danego gatunku obserwowano niewielkie różnice w profilach amplifikacyjnych poszczególnych izolatów (Fot. 2). W przypadku T. harzianum sensu stricto praktycznie nie obserwowano tych różnic. Charakterystyczne dla gatunku wzory profili amplifikacyjnych umożliwiły wykorzystanie rep-PCR do grupowania izolatów, które odpowiadało przynależności gatunkowej (Fot. 2 i 3). Dla badanych izolatów T. atroviride wyróżniono również podgrupy profili amplifikacyjnych świadczące o wewnątrzgatunkowym zróżnicowaniu izolatów. Wzory uzyskanych grup profili amplifikacyjnych zestawiono z uzyskanymi w późniejszych etapach badań typami sekwencji, potwierdzając dużą zgodność profili amplifikacyjnych rep-PCR z typami sekwencyjnymi (Tabela 1). Umożliwiło to grupowanie i wstępną identyfikację izolatów odszczepionych z prób gleby podczas dalszych badań (Fot. 3).

Fotografia 3. Zestawienie profili amplifikacyjnych rep-PCR uzyskanych ze starterem BOXA1R dla izolatów z kolekcji i odszczepionych z pola, obrazujące identyfikację izolatów odszczepionych z pól doświadczalnych (izolaty oznaczone liczbą bez TRS) przez porównanie ich profili rep-PCR z izolatami zidentyfikowanymi (izolaty z TRS w nazwie, TRS121 i TRS127 T. hamatum, TRS123 i TRS125 T. gamsii). W skrajnych ścieżkach rozdzielono marker wielkości DNA 100 bp.

Analiza zróżnicowania genetycznego izolatów T. atroviride Dla izolatów T. atroviride wykonano analizy filogenetyczne w oparciu o sekwencje intronu 4 genu tef1 z zastosowaniem metody Bayesa, które potwierdziły grupowanie tych izolatów zgodnie z podziałem RAPD (Skoneczny i inni, 2015) i pozwoliły na wydzielenie podgrup w obrębie danej grupy RAPD (Rycina 2). W grupie 1 RAPD wydzielono dwie duże podgrupy izolatów, przy czym większość izolatów (18) grupowała się razem z izolatem referencyjnym IMI206040, podczas gdy w mniejszej podgrupie znalazło się 9 izolatów. Większe zróżnicowanie obserwowano w grupie 2 10

RAPD, w której również wydzielono dwie podgrupy izolatów (6 i 2 izolaty). Poza głównymi grupami RAPD w prezentowanej analizie filogenetycznej wydzielono pojedyncze izolaty: TRS43 i CBS693.94. Izolat TRS43 należał do grupy 1 RAPD (Skoneczny i inni, 2015), a jego sekwencje ITS1 i ITS2, rpb2 i chi18-5 są identyczne z izolatem referencyjnym IMI206040 (Tabela 1). Izolat CBS693.94 należał do grupy 2 RAPD (Skoneczny i inni, 2015), a jego sekwencja rpb2 i profil BOX-PCR okazały się identyczne, tak jak u izolatów z grupy 2 RAPD (Tabela 1). Izolat TRS18 nie został zakwalifikowany do żadnej z głównych grup. Analizy sekwencji potwierdziły przynależność wszystkich izolatów do kladu A T. atroviride zdefiniowanego przez Dodd i inni (2003). W przypadku izolatu TRS18 stwierdzono, że należy on do gatunku T. atroviride, jednak do innego kladu niż A.

Rycina 2. Drzewo filogenetyczne skonstruowane metodą bayesowską w oparciu o przyrównania fragmentu (ok. 1200 pz) sekwencji tef1 przedstawiające izolaty badane i referencyjne (IMI206040 i CBS693.94, pogrubiona czcionka) należące do kladu A T. atroviride oraz izolat TRS18 należący do innego kladu. Drzewo uzyskano jako konsensus ze zbioru 50% najbardziej prawdopodobnych drzew.

Numery przy rozgałęzieniach oznaczają wartości prawdopodobieństwa a posteriori uzyskane po 1 milionie powtórzeń. Grupowanie izolatów wg Skoneczny i inni (2015).

Sekwencje intronu 4 genu tef1 TRS18 były najbardziej podobne do sekwencji izolatów z kladu B oraz C T. atroviride. Jednak poziom identyczności sekwencji (ok.

95%) z tymi kladami świadczył o prawdopodobnej odrębności badanego izolatu. Ze względu na to, że nie udało się, na podstawie porównań sekwencji, ustalić przynależności izolatu TRS18 do żadnego z opisanych w literaturze kladów T. atroviride, zdecydowano się na przeprowadzenie rozszerzonej analizy filogenetycznej.

Analiza filogenetyczna T. atroviride Wykonano analizy filogenetyczne z uwzględnieniem wszystkich dostępnych sekwencji zawierających intron 4 i 5 genu tef1 izolatów T. atroviride zarówno własnych, jak i z prac uwzględniających taksonomię tego gatunku: Dodd i inni (2003), Samuels i inni (2006), Mulaw i inni (2010), Gal-Hemed i inni (2011), Błaszczyk i inni (2011), Atanasova i inni (2013), Sandoval-Denis i inni (2014) i Jaklitsch i Voglmayr (2015).

Przeprowadzone analizy filogenetyczne pozwoliły na wyróżnienie następujących kladów (Rycina 3):  klady A, B, C i D (Dodd i inni, 2003),  klad 2006 (wydzielony w 2006 roku, Samuels i inni, 2006; Jaklitsch i inni, 2006),  klad E (Mulaw i inni, 2010; Gal-Hemed i inni, 2011),  nowy klad TRS18,  klad (T. sp.) reprezentowany przez izolat C.P.K. 2725 (Mulaw i inni, 2010).

11

Wykazano, że izolat TRS18 należy do nowego do tej pory niezdefiniowanego kladu T. atroviride (Rycina 3). Analiza potwierdziła obecność i odrębność kladu E, zaproponowanego w pracach Mulaw i inni (2010) oraz Gal-Hemed i inni (2011), reprezentowanego przez izolat C.P.K. 2622 (inna nazwa PPRC RW18). Ponadto wykazano odrębność kladu 2006, grupującego izolaty O.Y. 4407 i O.Y. 8607 z pracy Gal-Hemed i inni (2011) razem z izolatami z prac Samuels i inni (2006) oraz Jaklitsch i inni (2006). Uzyskany dendrogram tef1 (Rycina 3) potwierdził też, że izolat C.P.K. 2725 tworzy nowy odrębny klad, jednak ze względu na niezdefiniowaną pozycję kladu D nie można go oddzielić od T. atroviride. W pracy Mulaw i inni (2010) izolat ten tworzył nową gałąź przy podstawie gatunku T. atroviride i z tego względu został określony jako nowy gatunek blisko spokrewniony z T. atroviride, czego wykonana analiza nie potwierdziła, jak również nie wykluczyła.

Rycina 3. Drzewo filogenetyczne skonstruowane metodą bayesowską w oparciu o przyrównania fragmentu zawierającego intron 4 i 5 sekwencji tef1, przedstawiające filogenezę gatunku T. atroviride z grupą zewnętrzną T. gamsii, uzyskane jako konsensus ze zbioru 50% najbardziej prawdopodobnych drzew. Numery przy rozgałęzieniach oznaczają wartości prawdopodobieństwa a posteriori. Nazwy oznaczają numery sekwencji w GenBank oraz nazwę izolatu. Po prawej stronie podano nazwy kladów T. atroviride. Izolat TRS18 (KJ786839) grupuje się niezależnie, reprezentując nowy klad.

12

Projektowanie markerów molekularnych, wybór najlepszych par starterów i ocena specyficzności gatunkowej Opracowanie markerów specyficznych dla T. atroviride i T. harzianum przeprowadzono w kilku etapach. Wszystkie startery projektowano w programie CLC Genomics Workbench. W pierwszym etapie porównywano sekwencje uzyskane podczas identyfikacji gatunkowej izolatów z kolekcji projektu (ITS1 i 2, tef1, chi18-5 i rpb2), wyszukiwano rejony polimorficzne, a następnie projektowano startery specyficzne gatunkowo. Drugie podejście miało na celu analizę sekwencji polimorficznych amplikonów RAPD, uzyskanych dla izolatów T. atroviride i zaprojektowanie specyficznych starterów. W trzecim etapie projektowania markerów wykorzystano zidentyfikowany dla T. atroviride wysoce zmienny rejon Q01, zawierający rejon mikrosatelitarny (Skoneczny i inni, 2015). Uzyskane sekwencje rejonu Q01 izolatów T. atroviride i T. gamsii mapowano na dostępnych sekwencjach genomowych i na podstawie porównań opracowano startery specyficzne dla T. harzianum.

Opracowane startery sprawdzano eksperymentalnie wykonując PCR względem specyficzności gatunkowej oraz ich użyteczności do identyfikacji czystych kultur grzybów oraz detekcji Trichoderma w glebie. Wykonano przegląd możliwych kombinacji zaprojektowanych starterów, które początkowo testowano w układzie dwóch matryc (mieszanin DNA dla T. atroviride i T. harzianum sensu stricto) w dwóch temperaturach przyłączania starterów (50 °C i 60 °C). Następnie oceniano specyficzność amplifikacji z zastosowaniem zaprojektowanych markerów molekularnych dla dwudziestu wydzielonych taksonów Trichoderma: T. harzianum sensu stricto, T. simmonsii, T. atrobrunneum, T. afroharzianum, T. lentiforme, T. aggressivum, T. pleuroticola, T. cerinum, T. tomentosum, T. velutinum, T. spirale, T. citrinoviride, T. crassum, T. virens, T. hamatum, T. sp., T. viridescens, T. gamsii, T. atroviride klad TRS18 i T. atroviride klad A. PCR przeprowadzano na matrycy DNA sporządzonej z mieszaniny DNA izolatów Trichoderma zaklasyfikowanych do danego taksonu na podstawie przeprowadzonych porównań profili rep-PCR, sekwencji oraz analiz filogenetycznych. Dodatkowo zastosowano matrycę DNA uzyskaną ze zmieszania matryc DNA wszystkich wymienionych 20 taksonów. Oceniano również, czy badane zestawienie par starterów może być zastosowane dla monitoringu Trichoderma bezpośrednio na matrycy DNA uzyskanej z gleby. Przeprowadzano amplifikację na matrycy DNA uzyskanej z prób gleby pobranych w terminach: przed aplikacją Trichoderma oraz po aplikacji Trichoderma: w trakcie uprawy sałaty i po zbiorze roślin.

Startery gatunkowo-specyficzne

opracowane

na

podstawie

sekwencji stosowanych w identyfikacji Trichoderma Na podstawie przyrównania sekwencji fragmentów genów tef1 oraz chi18-5 opracowano serię starterów PCR gatunkowo-specyficznych: 1. oparte o startery opracowane na podstawie sekwencji fragmentu genu chitynazy (chi18-5) specyficzne dla:  T. atroviride (startery A2_chi2f/A2_chi1r, Fot. 4 F),  T. simmonsii (startery H2_chi_4f/H2_chi1r i H2_chi4F32/H2_chi1r, Fot. 4 A i B),  sekcji Trichoderma: T. atroviride, T. gamsii, T. viridescens i T. sp. (startery A_chi11f/A_chi11r),

13

 większości gatunków z rodzaju Trichoderma z wykluczeniem T. hamatum i T. citrinoviride (startery H2_chi_1f/H2_chi_2r); 2. oparte o startery opracowane na postawie fragmentu genu tef1 specyficzne dla:  T. atroviride (startery A_tef1f/A_tef1r, Fot. 4 E),  T. harzianum sensu stricto wraz z T. simmonsii (startery H2_tef_1f/H2_tef_1r, Fot. 4 C i D).

Startery specyficzne dla T. atroviride Część pracy związana z projektowaniem starterów PCR specyficznych do T. atroviride została wykonana we współpracy z mgr inż. Dominikiem Skonecznym (SGGW, Warszawa) i stanowiła fragment jego pracy magisterskiej (Skoneczny, 2012), w ramach której zsekwencjonowano 13 polimorficznych amplikonów (Skoneczny i inni, 2015). Sekwencje tych amplikonów zmapowano na sekwencji genomowej szczepu IMI206040 T. atroviride i zaprojektowano markery SCAR (ang. Sequence Characterized Amplified Region) oraz CAPS (ang. Cleaved Amplified Polymorphic Sequence). Podczas realizacji tej pracy doktorskiej zweryfikowano specyficzność gatunkową opracowanych markerów SCAR i CAPS dla T. atroviride względem kolekcji 20 taksonów Trichoderma oraz opracowano metody multiplex-PCR ze starterami najlepszymi względem specyficzności do T. atroviride. Dla wybranego rejonu Q01 przeprowadzono sekwencjonowanie ze starterami Q01_1F i Q01_1R dla wszystkich izolatów T. atroviride oraz reprezentatywnych izolatów z gatunku T. gamsii w celu identyfikacji rejonów zmiennych.

Wyniki oceny specyficzności gatunkowej ze starterami opracowanymi na podstawie sekwencji amplikonów: A10, B07, E03, E04, H08, Q01, X18 i Z04 wykazały, że nie dla wszystkich kombinacji starterów udało się uzyskać specyficzne amplikony dla T. atroviride. Specyficzną amplifikację PCR dla izolatów z gatunku T. atroviride uzyskano dla starterów opracowanych na podstawie sekwencji amplikonów RAPD Z04 (startery Z04_2F/Z04_2R) oraz B07, E04, Q01 i X18 (Fot. 4 G-J oraz M i N, pary starterów B07_1F/B07_1R, E04_1F/E04_3R, Q01_4F/Q01_4R i X18_4F/X18_3R). Dla pary starterów opracowanych na podstawie sekwencji amplikonu A10 (A10_2F/A10_2R) w badaniach specyficzności gatunkowej uzyskiwano silniejszy produkt amplifikacji z izolatami z gatunków T. viridescens i T. sp., niż z izolatami z kladu A T. atroviride oraz nie uzyskano amplifikacji z izolatem T. atroviride TRS18. Natomiast dla starterów amplifikujących rejon H08 w ogóle nie uzyskano produktów PCR.

Startery specyficzne dla T. harzianum sensu stricto W celu opracowania markerów specyficznych dla T. harzianum wykorzystano informacje o zróżnicowaniu sekwencji wybranych loci u T. atroviride i wybrano rejon mikrosatelitarny Q01, rozpoznany jako wysoce zmienny (Skoneczny i inni, 2015).

Następnie na podstawie analiz własnych sekwencji T. atroviride i T. gamsii oraz publicznie dostępnych sekwencji genomowych Trichoderma (T. asperellum, T. atroviride, T. reesei, T. harzianum sensu stricto, T. longibrachiatum, T. virens) wygenerowano serię starterów QTh (QTh_1-9F oraz QTh_1-12R) specyficznych do sekwencji genomowej T. harzianum sensu stricto.

Najlepsze kombinacje starterów QTh pozwalają na identyfikację:  T. harzianum sensu stricto (startery QTh_8F/QTh_3R, Fot. 4 K),  T. harzianum sensu stricto wraz z T. simmonsii i T. atrobrunneum (startery QTh_5F/QTh_4R, Fot. 4 L oraz startery QTh_4F/QTh_4R), 14

 T. harzianum sensu stricto wraz z T. atrobrunneum i T. afroharzianum (startery QTh_8F/QTh_4R),  T. harzianum sensu stricto wraz z T. atrobrunneum, T. afroharzianum i T. lentiforme (startery QTh_8F/QTh_11R).

Opracowanie multiplex-PCR w celu identyfikacji i monitorowania Trichoderma Opracowane specyficzne markery wykorzystano do przygotowania metodyki multiplex-PCR pozwalającej na identyfikację i monitorowanie wybranych gatunków Trichoderma. Najlepsze kombinacje par starterów testowano pod względem specyficzności i efektywności PCR oraz wielkości produktu amplifikacji. Następnie komponowano ze sobą startery specyficzne dla grzybów (kontrolne), specyficzne dla Trichoderma, ze starterami gatunkowo-specyficznymi: 1. kontrola pozytywna reakcji: - startery specyficzne dla rejonu ITS grzybów (FR1/FF390, ITS4/ITS6 i 5.8SR/LR6), 2. specyficzne dla Trichoderma – jako kontrola pozytywna reakcji - startery specyficzne do genu chitynazy chi18-5 (chit42_1af/chit42_2ar i H2_chi1f/H2_chi2r), - startery specyficzne do genu beta-tubuliny tub (Btub_F/Btub_R), 3. startery gatunkowo-specyficzne dla poszczególnych gatunków Trichoderma - chi18-5, tef1, SCAR T. atroviride (B07, E04, X18, Q01, Z04), SCAR T. harzianum (QTh).

Przetestowanie licznych kombinacji starterów i warunków reakcji umożliwiło wskazanie starterów do wykorzystania w pojedynczym PCR (multiplex-PCR), umożliwiając detekcję grupy gatunków, gatunku, a nawet pojedynczego izolatu (TRS18), także w warunkach środowiskowych. Opracowano metody multiplex-PCR, umożliwiające detekcję następujących gatunków Trichoderma: T. harzianum sensu stricto (Fot. 4 K), T. simmonsii (Fot. 4 A i B) i T. atroviride (Fot. 4 E-G, I). MultiplexPCR z zastosowaniem starterów E04_1F/E04 (Fot. 4 H) lub X18_4F/X18_3R (Fot. 4 M i N) umożliwiał rozróżnienie izolatu T. atroviride TRS18 od pozostałych, należących do kladu A (Fot. 4 J, M i N). Niektóre z opracowanych metod pozwalały identyfikować grupę gatunków należących do tzw. kompleksu gatunków T. harzianum: T. harzianum sensu stricto i T. simmonsii (Fot. 4 C i D); T. harzianum sensu stricto, T. simmonsii i T. atrobrunneum (Fot. 4 L). Zastosowanie starterów QTh_4F/QTh_6R umożliwiało identyfikację izolatów należących do kompleksu gatunków T. harzianum (T. harzianum sensu stricto, T. simmonsii, T. afroharzianum, T. atrobrunneum, T. lentiforme) wraz z gatunkami agresywnymi względem grzybów uprawnych (T. aggressivum, T. pleuroticola) (Tabela 2).

Do identyfikacji izolatów z gatunków T. atroviride oraz T. harzianum sensu stricto odszczepionych z gleby (tzw. „czyste kultury”) zastosowano następujące metody multiplex-PCR (podano kombinacje stosowanych starterów): T. atroviride:  X18_4F/3R + B07_1F/1R + chit42_1af/2ar + 5.8SR/LR6 (Fot. 5 D) T. harzianum sensu stricto:  H2_tef_1f/ H2_tef_1r + ITS4/ITS6 (Fot. 5 A)  QTh_8F/ QTh_4R + Btub_F/Btub_R (Fot. 5 B) 15

 TVD_If/TVD_Ir + Btub_F/Btub_R (Fot. 5 C) Do identyfikacji Trichoderma metodami multiplex-PCR na matrycy DNA izolowanego z gleby zastosowano następujące metody multiplex-PCR: T. atroviride:  X18_1F/X18_3R + chit42_1af/chit42_2ar + 5.8SR/LR6 (Fot. 6)  Q01_3F/Q01_3R + chit42_1af/chit42_2ar + 5.8SR/LR6 (Fot. 6) T. harzianum sensu stricto:  TVD_If/TVD_Ir + Btub_F/Btub_R (Fot. 5 C i 6)  QTh_5F/QTh_4R + Btub_F/Btub_R (Fot. 4 L) Tabela 2. Zestawienie opracowanych metod identyfikacji gatunków Trichoderma z zastosowaniem markerów molekularnych PCR opracowanych w czasie prowadzenia badań oraz zaczerpniętych z literatury. Po prawej stronie podano pary starterów kontrolnych, z którymi można łączyć markery gatunkowo specyficzne. W ostatniej kolumnie podano stosowany cykl bądź temperaturę przyłączania starterów w przypadku stosowania standardowego cyklu PCR.

16

Fotografia 4. Zestawienie wyników analizy specyficzności opracowanych metod multiplex-PCR. Gatunki Trichoderma (w nawiasach podano numer ścieżki na żelu): T. harzianum sensu stricto (1), T. simmonsii (2), T. atrobrunneum (3), T. afroharzianum (4), T. lentiforme (5), T. aggressivum (6), T. pleuroticola (7), T. cerinum (8), T. tomentosum (9), T. velutinum (10), T. spirale (11), T. citrinoviride (12), T. crassum (13), T. virens (14), T. hamatum (15), T. sp. (16), T. viridescens (17), T. gamsii (18), T. atroviride TRS18 klad (19), T. atroviride klad A (20) oraz mieszanina wymienionych taksonów Trichoderma (21), gleba przed aplikacją Trichoderma (22), gleba 2 miesiące po aplikacji Trichoderma (23), gleba 5 miesięcy po aplikacji Trichoderma (24).

Kombinacje starterów, (identyfikowane gatunki): A - H2_chi_4F/H2_chi_1r + 5.8SR/LR6, (T. simmonsii), B - H2_chi_4F32/H2_chi_1r + FR1/FF390, (T. simmonsii), C - H2_tef_1f/H2_tef_1r + 5.8SR/LR6, (T. harzianum sensu stricto i T. simmonsii), D - H2_tef_1f/H2_tef_1r + ITS4/ITS6, (T. harzianum sensu stricto i T. simmonsii), E - A_tef_1f/A_tef_1r + FR1/FF390, (T. atroviride), F - A2_chi_2f/A2_chi_1r + ITS4/ITS6, (T. atroviride), G - B07_1F/B07_1R + chit42_1af/chit42_1ar +5.8SR/LR6, (T. atroviride), H - E04_1F/E04_3R + ITS4/ITS6, (T. atroviride klad A), I - Q01_4F/Q01_4R + chit42_1af/chit42_1ar + 5.8SR/LR6, (T. atroviride), J - X18_4F/X18_3R + chit42_1af/chit42_1ar + 5.8SR/LR6, (T. atroviride klad A), K - QTh_8F/QTh_3R + Btub_F/Btub_R, (T. harzianum sensu stricto), L - QTh_5F/QTh_4R + Btub_F/Btub_R, (T. harzianum sensu stricto, T. simmonsii, T. atrobrunneum, M - X18_4F/X18_3R + B07_1F/B07_1R + chit42_1af/chit42_1ar + 5.8SR/LR6, (T. atroviride oraz T. atroviride klad A), N - X18_4F/X18_3R + Q01_4F/Q01_4R + chit42_1af/chit42_1ar + 5.8SR/LR6, (T. atroviride oraz T. atroviride klad A).

17

Monitoring Trichoderma w środowisku glebowym Wykonano monitoring dwóch mieszanek izolatów Trichoderma w trzech doświadczeniach polowych z uprawą sałaty kruchej. Przeżywalność grzybów Trichoderma określano za pomocą posiewów mikrobiologicznych na podłoże selektywne dla wzrostu grzybów z różem bengalskim i streptomycyną według Martin (1950) i zliczania jednostek tworzących kolonie (jtk) Trichoderma oraz opracowaną metodą multiplex-PCR.

Mikrobiologiczna ocena liczebności Trichoderma w glebie Wykonanie posiewów prób gleby na podłożu mikrobiologicznym według Martina (Martin, 1950) pozwoliło na określenie ogólnej liczebności grzybów z rodzaju Trichoderma w glebie przed, podczas i po uprawie roślin sałaty, w której stosowano preparaty Trichoderma. Przeprowadzone analizy pokazały, że na poletkach przed aplikacją Trichoderma, jak również na poletkach kontrolnych liczebność Trichoderma w glebie wahała się na poziomie od 103 do 104 jtk g-1 s. m. gleby (Wykresy 1-2). Po aplikacji granulatów przerośniętych grzybnią, poziom Trichoderma w glebie istotnie wzrastał i wahał się pomiędzy od 105 do 106 jtk g-1 s. m. gleby (Wykresy 1-2). We wszystkich trzech doświadczeniach stwierdzono, że podwyższony poziom Trichoderma utrzymuje się przez cały okres uprawy sałaty w porównaniu z poletkami kontrolnymi. W doświadczeniu III w kombinacji T-GRAN + TRS25 + TRS59 aplikowane granulaty były przypuszczalnie słabiej przerośnięte grzybami Trichoderma i ich liczebność w trakcie uprawy sałaty była mniejsza i wynosiła od 1 × 104 do 1 × 105 jtk g-1 s. m. gleby (Wykres 2). W posiewach stwierdzono pojedyncze kolonie Trichoderma, jednak dominowały grzyby z rodzaju Mucor, podobnie jak w przypadku, gdy do gleby zostały dodane same granulaty T-GRAN. W doświadczeniu I potwierdzenie obecności i ocena przeżywalności izolatów grzybów Trichoderma aplikowanych do gleby prowadzona była przez ponad 2 lata.

Stwierdzono spadek liczebności Trichoderma po okresie zimowym i dalsze utrzymywanie się liczebności na dość wysokim poziomie w 2013 roku, aż do jesieni 2014, czyli ponad dwa lata po aplikacji (Wykres 1). Należy zauważyć, że po zakończeniu uprawy sałaty pole było w 2013 i 2014 roku ugorowane i nie prowadzono tam zabiegów agrotechnicznych, jedynie koszono chwasty.

Wykres 1. Liczebność Trichoderma w glebie dla I doświadczenia polowego z sałatą. Oś pionowa przedstawia średnią liczebność (jtk × 104 g-1s. m. gleby), oś pozioma terminy pobrania prób gleby.

Literami a, b, c oznaczono grupy jednorodne wydzielone w teście Duncana.

18

Wykres 2. Liczebność Trichoderma (jtk × 104 g-1s. m. gleby) w glebie dla poszczególnych wariantów (średnie dla wariantu z poszczególnych poletek) oraz terminów II i III doświadczenia polowego z sałatą.

Identyfikacja

izolatów

grzybów

wyizolowanych

z

pól

doświadczalnych Z płytek na których wykonano posiewy z prób gleby odszczepiano reprezentatywne izolaty grzybów różniące się morfologicznie (do trzech izolatów o zbliżonej morfologii kolonii). Grzyby uzyskano z gleby przed aplikacją mieszanek Trichoderma, jak również z poletek kontrolnych w celu określenia gatunków, (głównie z rodzaju Trichoderma) już występujących w polu. Odszczepiano i charakteryzowano również izolaty grzybów z poletek po aplikacji mieszanek Trichoderma w celu potwierdzenia, że obserwowane izolaty grzybów to faktycznie te izolaty, które wcześniej aplikowano.

Identyfikację uzyskanych izolatów grzybów oraz potwierdzenie tożsamości izolatów aplikowanych z odszczepionymi przeprowadzono przez: 1. określenie morfologii kolonii (kolor) na podłożu z różem bengalskim, 2. zastosowanie gatunkowo specyficznych markerów PCR (multiplex-PCR), 3. porównanie profili genetycznych rep-PCR izolatów odszczepionych z pola z profilami genetycznymi izolatów, które wcześniej zaaplikowano na to pole lub zidentyfikowano do gatunku, 4. sekwencjonowanie i analizy fragmentu genu tef1 izolatów odszczepionych z gleby reprezentatywnych dla poszczególnych profili rep-PCR. Przed rozpoczęciem doświadczeń polowych (2010 rok) pobrano próby gleby z pól doświadczalnych Instytutu Ogrodnictwa w Skierniewicach, z których wyizolowano grzyby Trichoderma. Po wstępnej ocenie morfologicznej kolonii do analiz wybrano w oparciu o morfologię kolonii 35 reprezentatywnych izolatów. Izolaty te zidentyfikowano z zastosowaniem sekwencjonowania regionu ITS1 i ITS2 oraz metody rep-PCR, a następnie wybrano 15 izolatów reprezentujących indywidualne profile rep-PCR, które poddano dokładniejszej identyfikacji z zastosowaniem sekwencjonowania loci: tef1, chi18-5 i rpb2. Kolejne izolaty grzybów (głównie Trichoderma) odszczepiono z prób gleby z trzech pól doświadczalnych IO (2012 i 2013 rok), na których przeprowadzono doświadczenia z uprawą sałaty i aplikacją mieszanek Trichoderma. Do identyfikacji tej grupy izolatów zastosowano markery PCR opracowane w ramach tej pracy oraz markery PCR opracowane przez innych badaczy specyficzne do gatunków: T. aggressivum, T. pleuroticola wraz z T. pleurotum, T. hamatum, T. virens wraz z T. crassum, T. harzianum sensu stricto wraz z T. atrobrunneum. Zastosowanie własnych metod multiplex-PCR umożliwiło szybkie wytypowanie izolatów z gatunków T. atroviride oraz T. harzianum 19

sensu stricto (Fot. 5 A-D). W drugim etapie, identyfikację uzyskaną ze starterami specyficznymi potwierdzono z zastosowaniem metody rep-PCR (Fot. 3 i 5 E), w której porównywano profile genetyczne izolatów zidentyfikowanych wraz z izolatami wzorcowymi, co potwierdziło zgodność tej metody z zastosowaną w pierwszym etapie metodą multiplex-PCR. Zastosowanie metody multiplex-PCR i rep-PCR dla aplikowanych izolatów T. atroviride (TRS25 i TRS43) pozwoliło na ich rozróżnienie i potwierdzenie identyczności izolatów wprowadzonych do gleby oraz odszczepionych (Fot. 5). Identyfikację gatunków potwierdzano z zastosowaniem sekwencjonowania fragmentu genu tef1 dla izolatów reprezentujących daną próbę gleby oraz profil rep-PCR.

Fotografia 5. Identyfikacja izolatów odszczepionych z pola z gatunku T. harzianum sensu stricto (A, B i C i E, izolaty oznaczone strzałkami na górze) oraz T. atroviride (D i E, izolaty oznaczone strzałkami na dole) z zastosowaniem opracowanych metod multiplex-PCR (A-D) oraz rep-PCR BOX (E). Do skrajnych studzienek naniesiono marker wielkości 1kb (A-D) oraz 100bp (E). Kolejne zdjęcia przedstawiają amplikony uzyskane dla tych samych izolatów (numery kolejno od 825 do 849) ze starterami gatunkowo-specyficznymi do T. harzianum: (A) H2_tef_1f/H2_tef_1r, (B) QTh_8F/QTh_4R, (C) TVD_If/TVD_Ir oraz T. atroviride: (D) X18_4F/X18_3R i B07_1F/B07_1R.

Łącznie odszczepiono z gleby 369 izolatów grzybów. Z zastosowaniem opracowanej procedury skriningowej (Fot. 5) poddano identyfikacji 334 izolaty. Spośród tych izolatów 245 zidentyfikowano jako należące do rodzaju Trichoderma, natomiast 89 izolatów należało do innych rodzajów grzybów. Spośród wszystkich izolatów grzybów, wybrano 117 izolatów Trichoderma oraz 34 izolaty innych rodzajów i przeprowadzono identyfikację z zastosowaniem sekwencjonowania minimum jednego locus (tef1).

Przeprowadzona dodatkowa identyfikacja z zastosowaniem metody sekwencyjnej dla wybranych izolatów pozwoliła zweryfikować diagnostykę skriningową.

Wśród odszczepionych izolatów Trichoderma wyróżniono 13 gatunków Trichoderma. Najwięcej izolatów odszczepiono z gatunków T. atroviride (79 izolatów) i T. harzianum sensu stricto (49 izolatów). Izolaty z gatunków T. cerinum i T. velutinum odszczepiono w 2010 roku, jednak z prób gleby pobranej w 2012 i 2013 roku z trzech doświadczeń polowych z uprawą sałaty nie odszczepiono tych gatunków.

Podczas odszczepiania grzybów z poletek po aplikacji mieszanek Trichoderma na podłożach mikrobiologicznych zauważalne było znacznie mniejsze zróżnicowanie 20

morfologii kolonii grzybów. Analiza rep-PCR oraz identyfikacja sekwencyjna izolatów odszczepionych po aplikacji mieszanek potwierdziła identyczność odszczepionych izolatów z aplikowanymi (Fot. 5). Jedynie dwa izolaty na 75 uzyskanych po aplikacji mieszanek zidentyfikowano, że należą do gatunków T. afroharzianum (TRS835) oraz T. virens (TRS897). Stanowi to jednocześnie potwierdzenie, że zliczane kolonie Trichoderma podczas mikrobiologicznej oceny liczebności należały do gatunków T. atroviride oraz T. harzianum sensu stricto.

Analizując gatunki grzybów uzyskane z próbek gleby pochodzących z poletek IO przed aplikacją Trichoderma, stwierdzono występowanie grzybów z innych rodzajów niż Trichoderma. Dla wytypowanych 34 izolatów wykonano identyfikację gatunkową w oparciu o analizy sekwencji fragmentu genu tef1. Najwięcej izolatów należało do rodzaju Fusarium: F. oxysporum, F. solani, F. culmorum, F. equiseti i F. redolens.

Zidentyfikowano również pojedyncze izolaty z gatunków: Scopulariopsis brevicaulis, Alternaria sp., Alternaria alternata, Penicillium chrysogenum, Arthrinium arundinis i Bionectriaceae sp.. Nie zidentyfikowano przynależności taksonomicznej czterech izolatów. Sekwencja tef1 izolatu MOS880 była najbardziej podobna do sekwencji izolatów z gatunków Aspergillus spp.. Kolejne trzy izolaty (MOS641, MOS876 i MOS875) posiadały niemal identyczne sekwencje czterech rejonów taksonomicznych i nie udało się ich zaklasyfikować do żadnego rodzaju w oparciu o analizę sekwencji tych rejonów. Wydaje się, że reprezentują one nieopisany taksonomicznie rodzaj blisko spokrewniony z rodzajem Acremonium.

Monitoring T. atroviride i T. harzianum sensu stricto w glebie z zastosowaniem metody multiplex-PCR W celu potwierdzenia obecności aplikowanych izolatów Trichoderma w glebie pobranej z doświadczeń polowych z uprawą sałaty wykorzystano opracowane w ramach pracy metody multiplex-PCR. Do identyfikacji Trichoderma metodami multiplex-PCR na matrycy DNA izolowanego z gleby wybrano i zastosowano następujące kombinacje starterów: Detekcja T. atroviride: - X18_1F/X18_3R + chit42_1af/chit42_2ar + 5.8SR/LR6 - Q01_3F/Q01_3R + chit42_1af/chit42_2ar + 5.8SR/LR6 Detekcja T. harzianum sensu stricto: - TVD_If/TVD_Ir + Btub_F/Btub_R - QTh_5F/QTh_4R + Btub_F/Btub_R Zastosowanie markerów molekularnych specyficznych dla gatunków T. atroviride i T. harzianum razem ze starterami specyficznymi dla grzybów i chitynazy charakterystycznej dla Trichoderma, stanowiącymi kontrolę w reakcji multiplex-PCR, pozwoliło monitorować aplikowane do gleby mieszanki izolatów Trichoderma. Było to możliwe dzięki temu, że przed aplikacją mieszanek tą metodą nie detektowano tych gatunków (Fot. 6, próby gleby z 8.05.2012 ze wszystkich poletek oraz z poletek kontrolnych w terminach po aplikacji Trichoderma). Zwiększona liczebność T. atroviride i T. harzianum na poziomie wyższym niż 1×104 jtk g-1 s. m. gleby po aplikacji umożliwiała przeprowadzenie specyficznej amplifikacji DNA tych gatunków opracowanymi metodami multiplex-PCR (Fot. 6). Analiza multiplex-PCR potwierdziła 21

wyniki monitorowania Trichoderma uzyskane metodą mikrobiologiczną. Stwierdzono obecność T. atroviride i T. harzianum po zastosowaniu granulatów w kolejnych terminach, aż do zbioru i po zbiorze sałaty (Fot. 6).

Fotografia 6. Detekcja T. atroviride i T. harzianum sensu stricto z zastosowaniem multiplex-PCR na matrycy DNA uzyskanej z gleby. Monitorowane poletka zestawiono w kolejności alfabetycznej (numery poletek podano u góry) przedstawiono wyniki dla poszczególnych terminów. 8.05 termin przed aplikacją Trichoderma *a – oznaczenie poletek kontrolnych.

Podsumowanie i wnioski 1. Optymalizacja metod izolacji DNA z czystych kultur Trichoderma i z gleby umożliwiła opracowanie skutecznych metod umożliwiających identyfikację gatunkową Trichoderma.

2. Analizy sekwencji DNA czterech loci filogenetycznych (MLST) pozwoliły na identyfikację gatunkową 100 spośród 104 badanych izolatów Trichoderma oraz określenie pozycji filogenetycznej izolatów, których gatunku nie można było zidentyfikować. Stwierdzono, że izolaty TRS4, TRS29 i TRS33 należą do nieopisanego gatunku w kladzie Rogersonii sekcji Trichoderma, zaś izolat TRS75 wstępnie zaklasyfikowano do kompleksu gatunków T. harzianum. Wyniki te sugerują potrzebę dalszego rozwoju i ulepszania taksonomii Trichoderma.

3. Analiza filogenetyczna T. atroviride oparta o locus tef1 pozwoliła uaktualnić wiedzę o zróżnicowaniu genetycznym tego gatunku i pokazała, że wszystkie badane izolaty oprócz TRS18 należą do kladu A. Izolat TRS18 reprezentuje przypuszczalnie nieopisany klad T. atroviride, jednakże aby to potwierdzić, potrzebne są dalsze analizy filogenetyczne.

4. Metoda rep-PCR może być stosowana w diagnostyce Trichoderma do grupowania i wstępnej identyfikacji gatunkowej izolatów oraz do analizy zróżnicowania genetycznego niektórych gatunków. Połączenie rep-PCR i sekwencjonowania umożliwia efektywną identyfikację gatunkową Trichoderma.

5. Izolaty Trichoderma zaaplikowane do gleby w postaci granulatów przerośniętych grzybnią w trakcie uprawy sałaty występowały na poziomie od 1 × 105 do 1 × 106 jtk g-1 s. m. gleby.

22

6. Liczebność Trichoderma w glebie po aplikacji grzybów (granulatów przerośniętych grzybnią) wzrastała, a następnie malała proporcjonalnie z upływem czasu.

Potwierdzono obecność wprowadzonych izolatów dwa lata po ich aplikacji, przy jednoczesnym spadku ich liczebności.

7. W glebie uprawnej na polu Instytutu Ogrodnictwa w Skierniewicach zidentyfikowano 13 gatunków Trichoderma. Stwierdzono także występowanie grzybów należących do innych rodzajów, w tym przypuszczalnie należących do nieopisanego taksonomicznie rodzaju najbardziej spokrewnionego z Acremonium.

8. Opracowano metodykę multiplex-PCR umożliwiającą detekcję T. atroviride i T. harzianum w próbach DNA uzyskanych z gleby po aplikacji izolatów z tych gatunków. W próbach kontrolnych sprzed lub bez aplikacji preparatów nie wykrywano T. atroviride i T. harzianum. Metodyka ta może być wykorzystana do identyfikacji i monitoringu tych gatunków.

Spis literatury Aldrich J., Cullis C.A. 1993. RAPD analysis in flax: optimization of yield and reproducibility using KlenTaq 1 DNA polymerase, Chelex 100, and gel purification of genomic DNA. Plant Molecular Biology Reporter 11:128-141 Aljanabi S. M., Martinez I. 1997. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Research 25:4692-4693 Atanasova L., Druzhinina I.S., Jaklitsch W.M. 2013. Two hundred Trichoderma species recognized on the basis of molecular phylogeny. W: Mukherjee P.K., Horwitz B.A., Singh U.S., Mukherjee M., Schmoll M. (Red.) Trichoderma: biology and applications. CABI, Wallingford, UK, pp. 10-42 Błaszczyk L., Popiel D., Chełkowski J., Koczyk G., Samuels G.J., Sobieralski K., Siwulski M. 2011. Species diversity of Trichoderma in Poland. Journal of Applied Genetics 52:233-243 Dodd S.L., Lieckfeldt E., Samuels G.J. 2003. Hypocrea atroviridis sp. nov., the teleomorph of Trichoderma atroviride.

Mycologia 95:27-40 Gal-Hemed I., Atanasova L., Komoń-Żelazowska M., Druzhinina I.S., Viterbo A., Yarden O. 2011. Marine isolates of Trichoderma spp. as potential halotolerant agents of biological control for arid-zone agriculture. Applied and Environmental Microbiology 77:5100-5109 Gazis R., Chaverri P. 2010. Diversity of fungal endophytes in leaves and stems of wild rubber trees (Hevea brasiliensis) in Peru. Fungal Ecology 3:240-254 Hoyos-Carvajal L., Orduz S., Bissett J. 2009. Genetic and metabolic biodiversity of Trichoderma from Colombia and adjacent neotropic regions. Fungal Genetics and Biology 46:615-631 Jaklitsch W.M., Samuels G.J., Dodd S.L., Lu B.S., Druzhinina I.S. 2006. Hypocrea rufa / Trichoderma viride: a reassessment, and description of five closely related species with and without warted conidia. Studies in Mycology 56:135-177 Jaklitsch W.M., Voglmayr H. 2015. Biodiversity of Trichoderma (Hypocreaceae) in Southern Europe and Macaronesia.

Studies in Mycology 80:1-87 Kopchinskiy A., Komoń M., Kubicek C.P., Druzhinina I.S. 2005. TrichoBLAST: A multilocus database for Trichoderma and Hypocrea identifications. Mycological Research 109:658-660 López-Quintero C.A., Atanasova L., Franco-Molano A.E., Gams W., Komoń-Żelazowska M., Theelen B., Müller W.H., Boekhout T., Druzhinina I. 2013. DNA barcoding survey of Trichoderma diversity in soil and litter of the Colombian lowland Amazonian rainforest reveals Trichoderma strigosellum sp. nov. and other species. Antonie van Leeuwenhoek 104:657-674 Martin J.P. 1950. Use of acid, rose bengal, and streptomycin in the plate method for estimating soil fungi. Soil Science 69:215-232 Mulaw T.B., Kubicek C.P., Druzhinina I.S. 2010. The rhizosphere of Coffea arabica in its native highland forests of Ethiopia provides a niche for a distinguished diversity of Trichoderma. Diversity 2:527-549

23

Samuels G.J., Dodd S.L., Lu B.S., Petrini O., Schroers H.J., Druzhinina I.S. 2006. The Trichoderma koningii aggregate species. Studies in Mycology 56:67-133

Sandoval-Denis M., Sutton D.A., Cano-Lira J.F., Gené J., Fothergill A.W., Wiederhold N.P., Guarro J. 2014.

Phylogeny of the clinically relevant species of the emerging fungus Trichoderma and their antifungal susceptibilities.

Journal of Clinical Microbiology 52:2112-2125 Skoneczny D. 2012. Analiza zróżnicowania genetycznego polskich izolatów Trichoderma atroviride z wykorzystaniem markerów molekularnych. Praca magisterska, SGGW, Warszawa Skoneczny D., Oskiera M., Szczech M., Bartoszewski G. 2015. Genetic diversity of Trichoderma atroviride strains collected in Poland and identification of loci useful in detection of within-species diversity. Folia Microbiologica 60:297-307 Smolińska U., Gołębiewska E., Kowalska B., Kowalczyk W., Szczech M. 2014a. Materiały odpadowe jako nośniki antagonistycznych grzybów Trichoderma. Inżynieria i Ochrona Środowiska 17:5-20 Smolińska U., Kowalska B., Kowalczyk W., Szczech M. 2014b. The use of agro-industrial wastes as carriers of Trichoderma fungi in the parsley cultivation. Scientia Horticulturae 179:1-8

24