Molekularna identyfikacja gatunkowa i analiza zróżnicowania genetycznego polskich izolatów
Trichoderma mających potencjalne zastosowanie w biologicznej ochronie roślin mgr inż. Michał Oskiera Zakład Mikrobiologii, Pracownia Mikrobiologii Instytut Ogrodnictwa w Skierniewicach
Promotor: dr hab. Grzegorz Bartoszewski Katedra Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin SGGW w Warszawie Recenzenci: prof. dr hab. Hanna Kwaśna, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu dr hab. Ewa Król, prof. Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie
Znaczenie grzybów Trichoderma w uprawie roślin Są powszechne w środowisku naturalnym i znajdują zastosowane w rolnictwie jako:
•
biologiczne środki wspomagające wzrost roślin (PGPF)
•
preparaty ochrony roślin (BCA)
Trichoderma wykazują różnorodne mechanizmy działania Poprawiają właściwości gleby przez
•
Intensyfikację rozkładu materii organicznej
•
Wykazują działanie antagonistyczne względem innych mikroorganizmów glebowych: •
konkurencja o składniki pokarmowe i przestrzeń
•
modyfikacja środowiska (zakwaszanie, siderofory)
•
wydzielaniu antybiotyków (antybioza)
•
produkcji enzymów litycznych (mikopasożytnictwo)
W obecności grzybów Trichoderma rośliny odznaczają się: •
lepszym wzrostem
•
lepiej wykształconym systemem korzeniowym
•
wyższą odpornością na patogeny (SAR, ISR)
Poszukiwanie izolatów przydatnych w biologicznej ochronie roślin w Polsce Polskie szczepy Trichoderma w ochronie roślin i zagospodarowaniu odpadów organicznych UDA-POIG.01.03.01-00-129/09
• Kolekcja izolatów Trichoderma (104 izolaty + izolaty typowe + izolaty z pola IO) Większość izolatów zidentyfikowano morfologicznie jako gatunki: • T. atroviride • T. virens • T. harzianum Część izolatów niezidentyfikowanych • Ze względu na przyszłą komercjalizację produktu biologicznego niezwykle istotne staje się
poznanie pozycji taksonomicznej badanych grzybów oraz ocena ich zróżnicowania genetycznego służąca opracowaniu sposobu identyfikacji danego izolatu
Cele pracy doktorskiej 1.
Wykonanie identyfikacji gatunkowej 104 izolatów Trichoderma o potencjalnej przydatności w ochronie biologicznej za pomocą metod molekularnych.
2.
Ocena zróżnicowania wewnątrzgatunkowego badanych izolatów Trichoderma na poziomie molekularnym.
3.
Opracowanie serii markerów molekularnych opartych o metodę PCR i przydatnych do identyfikacji wybranych izolatów Trichoderma.
4.
Monitoring dwóch mieszanek izolatów Trichoderma zastosowanych w formie mieszaniny aktywnych szczepów w trzech doświadczeniach polowych z uprawą sałaty kruchej. Określenie w jakiej ilości i jak długo utrzymują żywotność izolaty wprowadzone do środowiska glebowego.
Etapy pracy Optymalizacja izolacji DNA
grzybnia
gleba
MLST
Rep-PCR
Identyfikacja molekularna Analiza zróżnicowania genetycznego
Opracowanie markerów molekularnych
Monitoring Trichoderma
MLST
NCBI GenBank
SCAR
Sekwencje genomowe
Podłoża mikrobiologiczne
Liczebność
Izolacja DNA z gleby
MultiplexPCR
Optymalizacja izolacji DNA z Trichoderma oraz z gleby I.
Różne źródła pozyskiwania materiału do izolacji DNA (pożywki stałe, płynne / wytrząsanie)
II.
Porównywano 6 metod izolacji DNA z grzybni Trichoderma: 1.
gotowanie komórek (12 minut, 105 ºC)
2.
metoda solna (Aljanabi i Martinez, 1997)
3.
metoda wykorzystująca bufor CTAB (Aldrich i Cullis, 1993)
4.
zestaw Genomic Mini (A&A Biotech, Polska)
5.
zestaw NucleoSpin Plant II (Macherey-Nagel, Niemcy)
6.
zestaw DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Niemcy)
III. Porównywano 5 metod izolacji DNA z gleby: 1.
Fast DNA Spin Kit For Soil (MP Biomedicals, USA) + homogenizator MP Biomedicals
2.
Genomic DNA from Soil (Macherey-Nagel, Niemcy)
3.
SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicentre, USA)
4.
DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Niemcy)
5.
CTAB + DNeasy Plant Mini Kit (Aldrich i Cullis, 1993 + Qiagen)
Optymalizacja izolacji DNA z Trichoderma oraz z gleby I.
Metody pozyskiwania materiału do izolacji DNA (pożywki stałe, płynne / wytrząsanie).
II.
Porównywano 6 metod izolacji DNA z grzybnii Trichoderma: 1.
gotowanie komórek (12 minut, 105 ºC)
2.
metoda solna (Aljanabi i Martinez, 1997)
3.
metoda wykorzystująca bufor CTAB (Aldrich i Cullis, 1993)
4.
zestaw Genomic Mini (A&A Biotech, Polska)
5.
zestaw NucleoSpin Plant II (Macherey-Nagel, Niemcy)
6.
zestaw DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Niemcy)
III. Porównywano 5 metod izolacji DNA z gleby: 1.
Fast DNA Spin Kit For Soil (MP Biomedicals, USA) + homogenizator MP Biomedicals
2.
Genomic DNA from Soil (Macherey-Nagel, Niemcy)
3.
SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicentre, USA)
4.
DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Niemcy)
5.
CTAB + DNeasy Plant Mini Kit (Aldrich i Cullis, 1993 + Qiagen)
Dobór starterów i uzyskanie sekwencji MLST Po przetestowaniu szeregu kombinacji starterów wytypowano 4 pary do PCR Zsekwencjonowano 4 niezależne loci wykorzystywane w taksonomii dla 104 izolatów
Gen/rejon
ITS1 i 2
Obszar zmienny ITS1 ITS2
Nazwa amplifikowanego rejonu/fragmentu genu kodującego
Obszar nietranskrybowany w rejonie genów kodujących rRNA
Startery ITS4 ITS6
Długość [bp]
620
tef_int4(large)
tef1α
tef1_int5(short)
Pierwszy czynnik elongacji translacji
EF1_728F TEF_LLErev
1 260
tef1_exon6(large)
chi18-5
large exon chi18-5
Chitynaza 42 kDa
chit42_1af chit42_2ar
800
916 sekwencji zgłoszono do bazy danych NCBI GenBank rpb2
exon rpb2
Druga największa podjednostka polimerazy II RNA
RPB2_210up RPB2_1450low
1200
Łącznie
3880
Analizy bioinformatyczne
Identyfikacja gatunkowa
Analizy filogenetyczne
TrichOKEY
TrichoMARK
TrichoBLAST
ISTH
BLASTn
BLASTclust
CLC Genomics Workbench
GenBank
ClustalX
CLC Genomics Workbench
gBLOCKS
jModelTest
Zróżnicowanie genetyczne i identyfikacja markerów
CLC Genomics Workbench
BLASTclust
MrBayes
MEGA
DNAsp
MEGA
FigTree
Geneious
Identyfikacja gatunkowa Rejon
Liczba badanych izolatów
Liczba izolatów zidentyfikowanych
ITS1 i 2 (TrichOKEY)
104
94
tef1
104
100
chi18-5
104
94
rpb2
104
100
Łącznie
104
100
Uwagi
%
90,3
(Brak lub identyczne sekwencje) Brak: T. gamsii; T. crassum Identyczne: T. cerinum i T. tomentosum Nowe warianty ITS: T.atroviride, T.velutinum, T.cerinum
96,1
Sekcja Trichoderma, Klad Rogersonii
90,3
Brak: T. gamsii, T. crassum, T. spirale, T. pleuroticola
96,1 96,1
Sekcja Trichoderma, Klad Rogersonii
Zidentyfikowano następujące gatunki Trichoderma
Zidentyfikowano następujące gatunki Trichoderma
Zidentyfikowano następujące gatunki Trichoderma
Kompleks gatunkow T. harzianum
(species complex)
2015 rok
Zidentyfikowano następujące gatunki Trichoderma
Zidentyfikowano 100 izolatów, dla 4 izolatów wykonano analizy filogenetyczne
Izolaty TRS 4, TRS29 i TRS33 naleşą do nowego gatunku Trichodema w kladzie Rogersoni
Drzewo filogenetyczne - intron 4 genu tef1 dla kladu Rogersonii Trichoderma
Izolat TRS18 naleĹźy do nowego kladu T. atroviride
Drzewo filogenetyczne - fragment genu tef1 (intron 4 i 5) dla gatunku T. atroviride
Profile genetyczne rep-PCR ERIC / REP / BOX Pogrupowano izolaty względem podobieństwa genetycznego Szybka metoda wstępnej identyfikacji Analiza zróżnicowania genetycznego
Zgodność metody z wynikami analiz sekwencji
Zróżnicowanie sekwencji
Graficzne przedstawienie różnic w sekwencjach (program Geneious)
Opracowanie markerรณw molekularnych przydatnych do identyfikacji i monitorowania Trichoderma Sekwencje DNA Trichoderma wล asne, GenBank, ISTH, SCAR, JGI
Przyrรณwnanie sekwencji
Identyfikacja rejonรณw zmiennych
Zaprojektowanie starterรณw
Optymalizacja PCR
Weryfikacja specyficznosci gatunkowej
metody multiplex-PCR Identyfikacja
Monitoring
Markery molekularne Startery gatunkowo specyficzne:
W oparciu o sekwencje fragmentów genów tef1 oraz chi18-5 T. atroviride T. simmonsii T. harzianum sensu stricto, T. simmonsii Startery typu SCAR dla T. atroviride T. atroviride klad A T. harzianum sensu stricto T. harzianum sensu stricto, T. simmonsii, T. atrobrunneum T. harzianum sensu stricto, T. atrobrunneum, T. afroharzianum T. harzianum sensu stricto, T. atrobrunneum, T. afroharzianum, T. lentiforme
Specyficzność gatunkową określono względem 20 kladów Trichoderma
Metody diagnostyczne multiplex-PCR 1. kontrola pozytywna reakcji: startery specyficzne dla rejonu ITS grzybów 2. specyficzne dla Trichoderma – jako kontrola pozytywna reakcji startery specyficzne do genu chitynazy chi18-5 startery specyficzne do genu beta-tubuliny tub 3. startery gatunkowo-specyficzne dla poszczególnych gatunków Trichoderma chi18-5, tef1, SCAR-y T. atroviride, SCAR T. harzianum (QTh)
T. harzianum
T. atroviride TVD-If/Ir E04_1F/1R ITS4/6
Kontrola wewnętrzna reakcji – amplikon specyficzny dla grzybów
Metody identyfikacji T. atroviride T. atroviride
T. atroviride
tef1
ITS
ITS
T. atroviride
chi18-5
T. atroviride klad A ITS
ITS
SCAR X18
T. atroviride + T. atroviride klad A
SCAR X18
T. atroviride + T. atroviride klad A ITS
SCAR Q01 chi18-5 SCAR X18
ITS chi18-5 SCAR X18 SCAR B07
Metody identyfikacji T. harzianum T. harzianum sensu stricto
T. simmonsii
chi18-5 ITS
βtub SCAR QTh
T. harzianum sensu stricto T. simmonsii T. atrobrunneum
T. harzianum sensu stricto T. simmonsii
tef1
SCAR QTh
ITS βtub
Monitoring Trichoderma w glebie
Doświadczenia polowe I doświadczenie (2012-2014) 8.05.2012 - pobór prób gleby termin „0” - przed aplikacją 26.06.2012 - aplikacja Trichoderma 14 i 16.08.2012 - zbiór sałaty - likwidacja doświadczenia 11.10.2012 - pobór prób termin „9” (15 tyg. od aplikacji) 9.05.2013 - pobór prób termin „10” (liczebność po zimie) 10.07.2014 - pobór prób termin “11” - po ponad 2 latach od aplikacji Trichoderma
Monitoring Trichoderma prowadzony przez ponad 2 lata od aplikacji Trichoderma.
II doświadczenie (wiosna 2013) 25.04.2013 - pobór prób termin „0” – przed aplikacją 26.04.2013 – aplikacja Trichoderma 15.05.2013 - wysadzenie rozsady sałaty 13.06.2013 - pobór prób termin "1"- w trakcie uprawy sałaty 10.07.2013 - zbiór sałaty - likwidacja doświadczenia 24.07.2013 - pobór prób termin "2" – po likwidacji doświadczenia, 12 tyg. od aplikacji Trichoderma
III doświadczenie ( lato 2013) 24.07.2013 - pobór prób termin „0” – przed aplikacją 24.07.2013 – aplikacja Trichoderma 31.07.2013 - wysadzenie roślin 05.09.2013 - pobór prób termin "1"- w trakcie uprawy sałaty 27.09.2013; 30.10.2013 - zbiór sałaty - likwidacja doświadczenia 03.10.2013 - pobór prób termin "2" – po likwidacji doświadczenia, 10 tyg. od aplikacji Trichoderma
Perturbacje pogodowe – część poletek była przez krótki czas zalana
Najlepsze doświadczenie pod względem uprawy roślin i niedogodności pogodowych
Monitoring Trichoderma w glebie Próby gleby
Analizy mikrobiologiczne
Analizy molekularne
Posiewy na podłoże wg Martin (1950)
Izolacja DNA
Liczenie kolonii o morfologii typowej dlaTrichoderma
Multiplex-PCR
Identyfikacja molekularna reprezentatywnych izolatów
Ocena amplifikacji PCR
-80°C
Liczebności Trichoderma w glebie (104 jtk./gram suchej gleby) Doświadczenie I
1-2 x 106 jtk./gram s.m. gleby Doświadczenie II
1-2 x 105 jtk./ gram s.m. gleby
Wzrost liczebności Trichoderma w glebie po aplikacji Trichoderma utrzymuje się: • na wysokim poziomie w trakcie uprawy sałaty • przez 2 lata, ale liczebność spada (Doświadczenie I) Doświadczenie III
1–2 x 104 jtk. / gram s.m. gleby dla kombinacji T-GRAN + TRS25 + TRS59 1-2 x 105 jtk. / gram s.m. gleby dla kombinacji T-GRAN +TRS43 + TRS85
Identyfikacja molekularna izolatów grzybów odszczepionych z prób gleby Reprezentatywne izolaty grzybów (369) odszczepiono z gleby przed (kontrola) oraz po aplikacji Trichoderma Zidentyfikowano 13 gatunkówTrichoderma T. atroviride T. gamsii T. viridescens T. rossicum T. viride T. koningiopsis T. hamatum T. virens T. harzianum sensu stricto T. afroharzianum T. brevicompactum T. cerinum T. velutinum Potwierdzono identyczność izolatów aplikowanych z izolatami odszczepionymi
BOXPCR
Monitoring Trichoderma w glebie z wykorzystaniem metody multiplex-PCR
Doświadczenie 1, 2012 rok Metoda multiplex-PCR (różne markery) - potwierdzenie obecność Trichoderma, T. atroviride i T. harzianum w glebie po aplikacji Trichoderma
Podsumowanie i wnioski 1. Zoptymalizowano metody izolacji DNA z czystych kultur Trichoderma i z gleby. 2. Analizy sekwencji DNA pozwoliły na identyfikację gatunkową 100 spośród 104 badanych izolatów Trichoderma. 3. Określono pozycję filogenetyczną izolatów, których gatunku nie można było zidentyfikować.
4. Analiza filogenetyczna T. atroviride pozwoliła uaktualnić wiedzę o zróżnicowaniu genetycznym tego gatunku. Izolat TRS18 reprezentuje (przypuszczalnie) nieopisany klad T. atroviride. 5. Metoda rep-PCR może być stosowana w diagnostyce Trichoderma do grupowania i wstępnej identyfikacji gatunkowej izolatów oraz do analizy zróżnicowania genetycznego niektórych gatunków. 6. Połączenie multiplex-PCR, rep-PCR i sekwencjonowania umożliwia efektywną identyfikację gatunkową Trichoderma.
Podsumowanie i wnioski 7. W glebie uprawnej na polu Instytutu Ogrodnictwa w Skierniewicach zidentyfikowano występowanie 13 gatunków Trichoderma. 8. Po aplikacji Trichoderma, w trakcie uprawy sałaty, izolaty występowały w glebie na poziomie od 1 × 105 do 1 × 106 jtk. g-1 s. m. 9. Potwierdzono obecność wprowadzonych do gleby izolatów dwa lata po ich aplikacji przy jednoczesnym spadku ich liczebności. 10. Opracowano metodykę multiplex-PCR umożliwiającą detekcję T. atroviride i T. harzianum w próbach DNA uzyskanych z gleby po aplikacji izolatów z tych gatunków. 11. Opracowana metodyka może być wykorzystana do identyfikacji i monitoringu tych gatunków.
Dziękuję za uwagę