CRIOPRESERVACION DE CELULAS STEM DE PULPA DENTAL DE DIENTES TEMPORALES Y PERMANENTES Unidad de Investigación Básica Oral U.I.B.O. Universidad el Bosque. Bogotá. Colombia A.S ROMERO OYUELA, K. CORDOBA PEREZ, J.C MUNEVAR NIÑO, S.J PERDOMO.
INTRODUCCIÓN: Durante los siglos XIX y parte del siglo XX, diversos investigadores trabajaron dilucidando el cómo y el porqué de los mecanismos de reparación y regeneración tisular. Las observaciones de este período, permitieron llegar a la conclusión general que las células Stem están involucradas en los procesos de desarrollo y regeneración tisular. Aunque los mecanismos de regeneración de tejidos varían según la especie así como el origen de las células Stem y desde el descubrimiento de la capacidad de las células stem adultas para formar diferentes tipos de tejidos in vivo e in vitro, se ha generado un amplio interés sobre el potencial terapéutico en seres humanos. Gronthos en el 2.002, demostró por primera vez la existencia de células stem postnatales de pulpa dental humana, utilizando la tecnología desarrollada para aislar y caracterizar células stem mesenquimales de médula ósea. Posteriormente se han publicado en la literatura biomédica internacional estudios in vitro que evaluaron distintos métodos para aislar, caracterizar y cultivar células Stem mesenquimales obtenidas de tejidos dentales y periodontales. Es fundamental establecer protocolos de criopreservación específicos para células stem dentales humanas. La evaluación e implementación de un sistema de criopreservación de células stem mesenquimales de diente temporales y permanentes en Colombia, contribuirá al desarrollo de futuros proyectos dentro de la línea de investigación “Regeneración Tisular” los cuales, evaluarían en primer lugar la síntesis in vitro de órganos híbridos artificiales o biomiméticos y su posterior comportamiento in vivo para demostrar su potencial terapéutico en la práctica clínica odontológica.
RESULTADOS En efecto, se presentó modificación de la expresión CD105+ con el tiempo de criopreservación. El rango de expresión en SHEDs del marcador estuvo entre 80,02% +/-8,23 SD y 88,40% +/-7,65 SD. En DPSCs estuvo entre 74,58% +/-26,54 SD y 48,99% +/-20,41 SD. Sin embargo, no se comprometió la viabilidad celular. El porcentaje de exclusión 7AAD postcriopreservación en SHEDs fue de 97,47% +/0,81 SD en 1 mes, 97,76% +/1,64 SD en 3 meses y 98,62% +/-1,26 SD en 6 meses y en DPSCs de 98,32% +/-1,28 SD en 1 mes, 94,61% +/-0,08 en 3 meses y 96,69% +/-1,78 SD en 6
C
B
A
Figura 1. Morfología in vitro de las células obtenidas por separación magnética con el sistema Miltenyi. A. Se observan fibroblastos pulpares de la fracción CD 105-, B. Células DPSCh CD105+. C. Unidad formadora de colonias de DPSCh CD 105+.
B
A
C
D
OBJETIVO: Evaluar si las células stem de dientes deciduos en exfoliación (SHED) y las células stem de pulpa dental de dientes permanentes (DPSC) aisladas y crio-preservadas durante 1, 3 y 6 meses conservan la viabilidad y expresión de marcadores específicos de células madre pos crio-preservación
MATERIALES Y METODOS Consentimiento informado aprobado por el comité institucional de ética de la investigación en Salud.
Estudio Experimental in vitro
Figura 2. Expresión de genes marcadores de células Stem Mesenquimales de dientes permanentes A. Se observa expresión de CD105+, B. Expresión de CD34-, CD45-, CD90+, C. Expresión de CD73+, D. Viabilidad a 1, 3, 6 meses postcriopreservación.
A
Dientes temporales 1 mes
100
OBTENCION DE MUESTRAS:
90
1. Procedimientos realizados en la Clínicas odontológicas de la Universidad El Bosque. 2. Luego de la exodoncia se sumergió el diente en NaOCl 5% y solución salina. 3. Sección del diente a nivel UAC .
80 70
Paciente1 60
Paciente 3
50
4. Deposito en medio de transporte
5.
Paciente 2
Figura 3. Porcentaje de viabilidad y expresión de genes marcadores de células Stem Mesenquimales de dientes temporales aisladas de 6 pacientes A. Evaluación de viabilidad y expresión de los fenotipos a 1 mes postcriopreservación.
Paciente 4 40
Procesamiento de la muestra.
B. Evaluación de viabilidad y expresión de los fenotipos a 3 meses postcriopreservación.
Paciente 5 Paciente 6
30
20
1. TRANSPORTE DE LA MUESTRA DMEM suplementado SFB 10% y antibióticos
2. DISGREGACION DE LA PULPA DENTAL Mecánica
-
10
Enzimática
0 CD34 (-)
B 4. SEPARACIÓN MAGNETICA Células CD105+MILTENYI MiniMACS
3. VIABILIDAD CELULAR
CD105 (+)
CD45 (-)
Cámara de Neubauer
Papaccio et al/2006
CD90 (+)
CD73 (+)
7AAD (-)
C
Dientes temporales 3 mes
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
6. CRIOPRESERVACIÓN 5. EXPANSIÓN IN VITRO CD105+
C. Evaluación de viabilidad y expresión de los fenotipos a 6 meses postcriopreservación.
Paciente1 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4 Paciente 5 Paciente 6
Dientes temporales 6 mes
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Paciente1 Paciente 2 Paciente 3
Paciente 4 Paciente 5 Paciente 6 CD34 (-)
8. CITOMETRIA DE FLUJO Papaccio et al/2006
CONCLUSIONES
Test T Student
U Mann Whitney P≤0.05
Control -
Control +
CD45 (-) CD90 (+) CD73 (+) 7AAD (-)
7. DESCONGELACION Papaccio et al/2006
9. ANALISIS ESTADISTICO
CD105 (+)
Los resultados sugieren que las células stem de dientes permanentes y temporales conservan la viabilidad poscriopreservación La expresión de marcadores celulares de stem mesenquimales de igual manera es conservada poscriopreservacion El tiempo de preservación podría modificar la expresión de los mismos probablemente por alterar la configuración de las proteínas de membrana celular o inducir en las células cierto grado de diferenciación
REFERENCIAS 1.Barry FP, Murphy JM. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. Int J Biochem Cell Biol. 2004 Apr;36(4):568-84. 2. Bartold PM, Shi S, Gronthos S. Stem cells and periodontal regeneration. Periodontol 2000.2006; 40:164-72. 3. Beyer Nardi N, da Silva Meirelles L. Mesenchymal stem cells: isolation, in vitro expansion and characterization. Handb Exp Pharmacol. 2006; (174):249-82. 4. Bieback K, Kern S, Klüter H, Eichler H. Critical parameters for the isolation of Mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Stem Cells. 2004;22(4):625-34. 5. Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J.Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 2007 Nov;25(11):2739-49. Epub 2007 Jul 26. 6. M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006;8 (4):315-7. 7. Duff SE, Li C, Garland JM, Kumar S. CD105 is important for angiogenesis: evidence and potential applications. FASEB J. 2003 Jun;17(9):984-92. 8. Fahy GM, Wowk B, Wu J, Phan J, Rasch C, Chang A, Zendejas E.Cryopreservation of organs by vitrification: perspectives and recent advances. Cryobiology. 2004 Apr;48(2):157-78. 9. Graziano A, d'Aquino R, Cusella-De Angelis MG, Laino G, Piattelli A, Pacifici M, De Rosa A, Papaccio G.Concave pit-containing scaffold surfaces improve stem cell-derived osteoblast performance and lead to significant bone tissue formation. PLoS One. 2007 Jun 6;2(6):e496. 10. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Dec 5;97(25):13625-30. 11. Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Cherman N, Boyde A, DenBesten P, Robey PG, Shi S Stem cell properties of human dental pulp stem cells.J Dent Res. 2002 Aug;81(8):531-5.