Biología y Patogénesis del Retrovirus no Oncogénico
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INVESTIGACIONES PECUARIAS : Enero - Julio 1998, Vol. 9 Nº 1
ARTÍCULOS DE REVISIÓN BIOLOGÍA Y PATOGÉNESIS DEL RETROVIRUS NO ONCOGÉNICO (LENTIVIRUS) EN OVINOS (Neumonía Intersticial Linfoide, Neumonía Progresiva Crónica, Enfermedad del Maedi/Visna) 1 Raúl Rosadio A.
Abstract Maedi/Visna virus is both the name traditionally given to ovine lentivirus (LvOv), and the prototype of the lentivirinae retrovirus subfamily. LvOv produces systemic infections which affect lung (Maedi), brain (Visna), articular (arthritis) and mammary (mastitis) tissues. Lentiviral infection develops slowly and progressively and is only clinically observed when affected organs are seriously compromised. The progressive nature of LvOv infection depends principally upon orchestrated viral replication episodes controlled by immunological factors and/or inflammatory products liberated within infected tissue. LvOv does not suppress immunity, but any type of infection or immunogenic stimulation in the affected organ will enhance viral replication and produce pathological lesions. Key words: Ovine lentivirusi Maedi/Visna virus, Lentiviral replication.
Resumen El virus Maedi/Visna es el nombre histórico del lentivirus ovino (LvOv) y el prototipo de la subfamilia lentivirinae de los retrovirus. La infección por el LvOv produce infecciones sistémicas con una tremenda predilección por el tejido pulmonar (Maedi), nervioso (Visna), articulaciones (artritis) y mamario (mastitis). La biología de la infección lentiviral es lenta, progresiva y solamente se manifiesta clínicamente cuando compromete seriamente la fisiología de los órganos infectados. La naturaleza progresiva de la infección depende principalmente del mecanismo de control en la replicación viral sincronizado armoniosamente por productos génicos virales y/o factores inmunológicos y/o inflamatorios liberados en el lecho del tejido infectado. El LvOv no es inmunosupresor, pero cualquier tipo de infección y/o estimulación inmunogénica en el sitio de infección (Ej. pulmón) fomentaría la replicación viral que conduciría al desencadenamiento de las lesiones asociadas con la infección. Palabras clave: Lentivirus ovino, virus Maedi/Visna, replicación lentiviral
Rev. de Investigaciones Pecuarias 1998; 9 (1):1-19
Las enfermedades retrovirales en Medicina Veterinaria no son recientes, infecciones por el retrovirus no oncogénico (lentivirus) en ovinos se han reportado desde fines del siglo pasado. La manifestación clínico-patológica más común en estos animales se caracteriza por producir lesiones de neumonía intersticial linfoide. Sin embargo, la infección también suele acompañarse de inflamaciones de las glándulas mamarias y menos frecuentemente de
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encefalitis crónica no supurativa (Visna), poliartritis erosiva y vasculitis. El presente artículo es una revisión de literatura sobre la patobiología del lentivirus ovino (virus del Maedi/Visna), prototipo de la familia lentivirinae.
Aspectos Históricos Las primeras descripciones sobre infecciones lentivirales en ovinos, generalmente asociados a cuadros estrictamente pulmonares, provienen de varios países del mundo. Estos reportes iniciales, sin embargo, utilizaron diferentes terminologías, y muchas veces los casos descritos tenían frecuentemente evidencias histopatológicas de infecciones del retrovirus productor de la Enfermedad de Jaagsiekte (Adenomatosis Pulmonar Ovina, APO, Carcinoma Pulmonar Ovino). Los sudafricanos de la Estación Experimental de Graaf-Reinet, realizaron las primeras descripciones sobre neumonías progresivas crónicas en ovinos. Mitchell (1915) reporta una enfermedad de tipo pulmonar con cambios histopatológicos caracterizados por infiltraciones de células linfoides en el intersticio (Maedi) pero acompañados de proliferaciones del epitelio alveolar (APO). Años más tarde, en Norteamérica, Estado de Montana, se describen cuadros similares descritos como Neumonía Progresiva de Montana (Marsh, 1923). Indudablemente, estas primeras descripciones un tanto confusas acerca de procesos respiratorios con diferentes denominaciones, incluyendo la Enfermedad del Jaagsiekte, indujeron la necesidad de realizar investigaciones patológicas comparativas a fin de elucidar si todos estos reportes describían similares enfermedades. Estos estudios determinaron que los pulmones afectados por la neumonía progresiva de Montana y de la enfermedad de Graaf-Reinet eran similares en morfología histopatológica, pero ambas eran distintas a la enfermedad del Jaagsiekte (APO) (De Koch, 1929). Posteriormente, neumonías crónicas similares a Graaf-Reinet o Neumonía Progresiva de Montana fueron descritas en todo el mundo. En muchos de estos reportes los autores describen la enfermedad utilizando el nombre del lugar de procedencia, nombre regional y/o designación coloquial de la enfermedad para expresar disfunciones clínicas respiratorias. Consecuentemente, en Francia se le reporta como "La bouhite", "Maedi" en Islandia (Sigurdsson, et al., 1952), "Zwoergerziekte" en Holanda (Ressang, et al., 1968), Neumonía Intersticial Progresiva en la India (Rajya y Singh, 1964), Alemania (Straub, 1970) y Kenya (Wandera, 1970). Actualmente, la enfermedad ha sido descrita en Dinamarca, Noruega, Suecia, Grecia, España, Canadá, Rumania, Rusia, Méjico (Palsson, 1976, a Sharp y Hoff-Jorgensen, 1985) y en el Perú se describió como Neumonía Progresiva Crónica (Snyder, et al., 1983). La enfermedad del Maedi, en lslandia, adopta características epizoóticas, y los animales afectados muestran además signos progresivos neurológicos que terminan con cuadros de parálisis total (Visna) (Sigurdsson, et al., 1957). El comportamiento epizoótico de la enfermedad en Islandia hace que se inicie estudios del Maedi y otras enfermedades crónicas tales como Rida (Seraple), Jaagsiekte y la Enfermedad de Joline (Paratuberculosis). Todas estas enfermedades son agrupadas por Sigursdsson bajo la denominación de "infecciones lentas". Los métodos microbiológicos actuales excluyen ahora a la Enfermedad de Jolme del grupo, pero el concepto de "infecciones lentas" persiste para describir infecciones virales caracterizadas por tener períodos de incubación largos (meses o años). Actualmente, los taxónomos microbiólogos utilizan el concepto de infecciones para clasificar a los retrovirus con características no oncogénicas dentro de la subfamilia lentivirinae, que tiene al histórico virus del Maedi/Visna (lentivirus ovino) como prototipo de la subfamilia, y a numerosos nuevos integrantes productores de cuadros de inmunodeficiencias adquiridas en el humano (SIDA), así como animales domésticos (sida felina, lentivirus bovino y felino) y silvestres (sida simia).
Signos Clínicos y Lesiones Desde los reportes iniciales, la enfermedad del complejo Maedi/Visna mostró su naturaleza infectiva lenta y progresiva. La enfermedad generalmente afecta a animales mayores de dos años de edad, ocasionando progresivamente dificultades respiratorias (disnea) y pérdida
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progresiva de peso (Marsh, 1923). Cuando los signos respiratorios son evidentes, los animales afectados son generalmente reconocidos en el campo por la intolerancia al esfuerzo físico, pues quedan regazados durante el movimiento del hato (DeBoer, et al., 1979). La severa disnea que muestran los animales afectados es consecuencia de la destrucción de los componentes celulares del pulmón que desencadena una disfunción en el intercambio de oxígeno. Al examen de necropsia, los pulmones afectados pesan generalmente 2-3 veces más de lo normal (Sigurdsson, 1954). A la necropsia, estos pulmones afectados no colapsan, permanecen insuflados ocupando completamente la cavidad torácica (Fig. 1). Esto es consecuencia del engrosamiento del septo interalveolar ocasionado por infiltraciones mixtas de células inflamatorias compuestas por linfocitos, células plasmáticas y macrófagos (Georgsson y Palsson, 1971).
Figura 1. Apariencia macroscópica de un pulmón afectado de lentivirus ovino. Nótese área pulmonar presentando hepatización gris y evidencias de retracción tisular (flechas)
Las infiltraciones celulares destruyen las paredes alveolares y consecuentemente producen el acortamiento o separación anormal interalveolar. Los cambios histopatológicos más prominentes son la presencia de agregados linfoides distribuidos por todo el parénquima pulmonar y generalmente alrededor de bronquiolos y vasos sanguíneos formando verdaderos centros germinales linfoides (Palsson, 1976b) (Fig. 2 y 3). Las infiltraciones peribronquiolares y perivasculares están compuestas principalmente de linfocitos CD4 y CDS (Gordier, et al., 1992). Además, se observa, comúnmente una hiperplasia fibromuscular (Oliver, et al., 1981) que al parecer sería respuesta a ciertos factores de inflamación liberados en el lecho pulmonar consecuencia de la cronicidad del proceso. Estas alteraciones patológicas se observan macroscópicamente como hepatizaciones grisáceas e inclusive retracciones del tejido pulmonar (Cutlip, et al., 1979) (Fig. 1). Mientras que, la prominente infiltración linfoide sustenta la denominación histopatológica de la enfermedad como neumonías intersticiales linfoides (Fig. 3).
Figura 2. Corte histopatológico de un pulmón afectado de lentivirus ovino mostrando la presencia de centros germinales dentro de folículo periarteriolar linfoide.
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Figura 3. Corte de pulmón afectado por lentivirus ovino. Folículo linfoide hiperplásico comprimiendo severamente bronquio y arteriolas. El intersticio adyacente engrosado con infiltraciones linfocíticas
La típica proliferación linfoide no se limita a los pulmones, también compromete los nódulos linfáticos pulmonares produciendo una linfomegalia (2-5 veces su peso normal), caracterizada por una severa hiperplasia folicular (Ellis y DeMartini, 1985c). Estos nódulos hiperplásicos son, al parecer, producto de una disfunción en la maduración de linfocitos B nodulares pero con presencia de células plasmáticas normales (Ellis y DeMartini, 1985c). Sin embargo, recientes identificaciones fenotípicas celulares en los nódulos regionales demuestran incremento en el número de células T, particularmente las subpoblaciones de CD8 y linfocitos gd. (Watt, et al., 1992). Por otro lado, la infección lentiviral produce una secuela, poco común, pero que altera dramáticamente la capacidad neurológica. Esta forma es denominada por los islandeses "Visna" (enfermedad debilitante) y se caracteriza por producir parálisis posterior, que progresa terminando con parálisis total (Sigurdsson, et al., 1957), permaneciendo los animales alertas, mantienen apetito normal y afebriles (Sigurdsson, et al., 1957). Los ovinos afectados muestran lesiones histopatológicas prominentes y multifocales afectando principalmente las regiones periventriculares y subpiales (Sigurdsson, et al., 1962). Las lesiones iniciales consisten en acumulaciones focales leucocitaria mononuclear y usualmente alrededor de los vasos sanguíneos, así como una moderada gliosis. Las lesiones progresan ocasionando malasia focal, con infiltraciones de células inflamatorias que se vuelven mixtas compuestas de linfocitos, células plasmáticas, macrófagos terminando por producir desmielinizaciones (Georgsson, et al., 1979; Georgsson, et al., 1982). Se reportan además proliferaciones del plexo coroideo asociadas con infiltraciones linfoides (Narayan y Cork, 1985). Los cuadros patológicos respiratorios (Maedi) y nerviosos (Visna) son descripciones históricas de las infecciones por lentivirus ovino (LvOv). Actualmente, se conoce además que las infecciones por el LvOv producen otras complicaciones crónicas tales como artritis/sinovitis linfocítica erosiva (Cutlip, et al., 1985), vasculitis (Cutlip, et al., 1985) y mastitis linfoproliferativa (Deng, et al., 1986; Rosadio, no publicados). La prevalencia, de las lesiones artríticas producidas por el LvOv, es menor a lo observado en infecciones por el lentivirus caprino (virus de la artritis-encefalitis caprina) (Adams, et al., 1980). Sin embargo, las lesiones artríticas pueden ocurrir simultáneamente con lesiones neumónicas (neumonía intersticial linfoide) y neurológicas (visna) (Oliver, et al., 1981). Los ovinos con lesiones de artritis muestran una patología muy similar a la observada en cabras afectadas por el lentivirus caprino (Fig. 4). Las articulaciones se muestran hinchadas (particularmente las articulaciones carpales) produciendo que los animales afectados caminen en forma rígida y con signos de dolor. Las lesiones comprenden inflamaciones crónicas y progresivas de los tejidos periarticulares que producen un aumento en el tamaño de las articulaciones afectadas. Las articulaciones se encuentran edematosas y poseen las membranas sinoviales hiperplásicas y necrosadas (Cutlip, et al., 1985). Las lesiones articulares suelen acompañarse de erosiones de los huesos articulares y fibrosis de los huesos subcondrales (Cutlip, et al., 1985).
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Figura 4. Articulación carpal de un animal infectado con lentivirus caprino mostrando proliferación de tejido sinovial y proliferación de tejido periarticular.
La mastitis asociada con infecciones por el LvOv es variada. Se describe una difusa mastitis intersticial con moderada fibrosis, severa hiperplasia nodular linfoide que puede progresar y producir mastitis severamente fibrótica (Van der Molen, et al., 1985; Cutlip, et al., 1985). La significancia clínica de las lesiones mastíticas no está del todo esclarecida. Histológicamente, en muchos de estos casos, se observan bloqueos de los conductos del pezón por acumulaciones linfoides (Fig. 5) (Van der Molen, et al., 1985), que pueden traer consecuencias adversas en la lactación del cordero (Anderson, et al., 1985).
Figura 5. Sección de tejido mamario con severa infiltración linfocítica alrededor de acinus glandulares mamarios
Transmisión Natural del Lentivirus Ovino El virus se transmite naturalmente a través de ingestión de calostro y leche o por exposiciones a secreciones respiratorias (DeBoer, et al., 1979; Sigurdsson, 1954). Los mecanismos de transmisión han sido extensamente confirmados mediante estudios epidemiológicos y/o transmisiones experimentales. El calostro y la leche de animales infectados contienen virus en forma libre y asociado a células (DeBoer, et al., 1979; Cutlip, et al., 1981) siendo las principales fuentes de infección para los corderos neonatos (DeBoer, et al., 1979; Houwers, et al., 1983). Sin embargo, el virus también se transmite eficientemente por vía respiratoria (Sigursdsson, et al., 1953). La transmisión del LvOv por contacto entre animales sanos y enfermos ocurre sobre todo cuando los animales se mantienen en ambientes cerrados durante los meses de invierno (Gialason, citado por DeBoer, 1979). La transmisión por contacto es más eficiente cuando se mantiene animales adultos enfetinos y corderos susceptibles (Sigurdsson, et al., 1953). Curiosamente, la enfermedad se logró transmitir contaminando el agua de bebida con heces de animales infectados (Sigurdsson, et al., 1953). Sin embargo, no se realizaron estudios
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posteriores a fin de determinar si excresiones del lentiVirus en las heces u orina tienen cierto rol en la transmisión de la enfermedad. Ciertos vectores biológicos, como el Melophagus ovino, sospechado por Sigurdsson, han sido eliminados como posibles transmisores del LvOv. La transmisión vertical del LvOv es muy rara y al parecer no es el mecanismo adecuado de transmisión. La mayoría de las informaciones especula sobre la poca importancia de la transmisión del virus in útero. Sin embargo, existen reportes sobre muertes fetales y nacimientos de corderos débiles después de inoculaciones experimentales del virus por vía uterina (Cutlip, et al., 1981). Interesantemente, existen descripciones de lesiones neumónicas de morfología similar a las inducidas por LvOv en un cordero de 4 meses obtenido por histerectomía, el que lamentablemente no fue confirmado con aislamiento viral o pruebas serológicas (Cross, et al., 1975). Por otro lado, se reporta detección lentiviral y anticuerpos específicos en corderos obtenidos por cesárea (Hoff-Jorgensen, 1977) y se especula sobre reproducción experimental por vía intrauterina a fetos ovinos (Georgsson, et al., 1978; Cutlip, et al., 1981). Todo esto parecería indicar infecciones intrauterinas, sin embargo, el LvOv no ha sido aislado de semen (Krogsrud y Udnes, 1978), tampoco se ha detectado genoma viral en el óvulo, embrión, ni esperma mediante técnicas específicas como hibridizaciones in situ. Estas informaciones tienden a descartar la habilidad del virus de integrarse en genomas de células germinales. Pero sí se ha demostrado que animales neonatos desarrollan infecciones experimentales con reducido período de incubación (Lairmore, et al., 1986).
Estructura y Replicación del Lentivirus Una de las características peculiares del LvOv es persistir a pesar de la respuesta inmune del hospedero. Esta habilidad es producto de muchos factores, pero fundamentalmente al control restringido de la replicación viral en las células del hospedero infectado (restricción génica viral). Este interesante mecanismo sólo se observa in vivo y se pierde cuando se cultivan células infectadas o se manipula el virus in vitro. Las células infectadas bajo estas condiciones evidencian rápida replicación viral produciendo lisis celular consecuente de una expresión incontrolada del genoma y producción de las proteínas estructurales virales. Esta dualidad o dicotomía es producto de una perfecta sincronización en las expresiones genéticas del virus que ha comenzado a elucidarse utilizando técnicas moleculares, incluyendo manipuleos genéticos para crear mutantes específicos así como usando técnicas de hibridizaciones in situ para detectar ARN o ADN proviral. El LvOv es un virus ARN, encapsulado, de 80-120 nm de diámetro conteniendo un core con características de electrón denso de 40 nm de diámetro, y con proyecciones superficiales de 8 nm compuesto de glicoproteínas (Brahic y Haase, 1981). La envoltura viral contiene aproximadamente 35% de material lipídico obtenido principalmente de la membrana celular infectada durante el proceso de brotamiento viral. La cápside viral contiene un complejo ribonueleoproteico, el cual se encuentra recubierto por una envoltura proteica. Dentro de la cápside, el genoma ARN es un complejo compuesto de transcriptasa reversa, ARN de transferencia de la lisina (ARNt-lisina y usada para iniciar la reacción de la polimerasa) y proteínas estructurales internas (Sonigo, et al., 1985). El ácido nucleico del LvOv es una cadena simple de ARN, con capacidad mensajera (polaridad positiva), lineal, y compuesta por dos subunidades idénticas (diploide, cada una de 30-35s) (Harris, et al., 1981). El genoma ARN del LvOy, de manera similar al ARN mensajero (ARNm) de las células eucarióticas, sufre modificaciones postranscripcionales que consisten en la adición de una estructura metilada en el extremo [denominado prima (‘)] 5 mediante mecanismo conocido como "capping". Esta particularidad es importante para promover la unión con los ribosomas celulares necesarios para la traducción genómica. Paralelamente, al extremo (3’) se agrega una "cola" de nucleótidos de adenosina (poliade-nilada, Poli A) la cual le confiere estabilidad y previene la degradación del ARN viral. El genoma es capaz de producir nueva progenie (replicación competente) utilizando los marcos de lectura abierta ("open reading frames", ORFs) para la producción de varias proteínas virales. Los principales marcos de lectura son los siguientes: gag, encargada de codificar los antígenos estructurales internos o antígenos grupales; pol, que codifica enzimas polimerasas (entre ellas la transeriptasa reversa); env, que produce las proteínas de la envoltura viral (Fig. 6).
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Figura 6. Estructura genética del lentivirus, incluyen a genes identificados en el virus HIV, que se encuentran distribuidos a lo largo del ARN viral, flanqueados por secuencias terminales repetidas (LTR). Los LTR no codifican ninguna proteína, solo sirven para iniciar la expresión de otros genes virales. Solamente tres genes: gag, pol y env codifican componentes virales. Los otros genes regulan la expresión genética.
Recientes datos obtenidos mediante el secuenciamiento nucleótido (desciframiento de la cadena nucleótida) y análisis del patrón de transcripción del ARNm del virus elonado del Visna, se ha descubierto la existencia de otros marcos de lectura abierta encargados de la producción de proteínas no estructurales pero necesarias para el proceso de replicación viral. Estos marcos menores son varios, pero principalmente se describen al tat (factor de transactivación), rev (factor de regulación selectiva), vif (factor de infección viral) y nef (factor de regulación negativa) (Sonigo, et al., 1985; Davis, et al., 1987; Schoborg y Clements, 1994). La sineronización de la replicación viral dependerá de un control orquestado entre las expresiones de los principales genes estructurales y los genes menores o auxiliares (no estructurales) (Fig. 7).
Figura 7. Una cadena de interacciones entre los genes reguladores controlan en el desarrollo viral en el virus productor del SIDA. Cada gen, a través del producto proteíco y existencia de una secuencia nucleótida en el genoma en donde ejercen su función, afecta la expresión tanto de genes virales, genes reguladores y el gen celular (regulación negativa). El geg tat actúa mediante regulación positiva activando (+) todos los genes del lentivirus, el gen nef actúa mediante regulación negativa reprimiendo (-) todos los genes. El gen rev reprime los genes reguladores pero activa todos los genes virales, favoreciendo el desarrollo viral.
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El 90% de la masa proteica del virión se encuentra compuesto por cuatro proteínas estructurales denominadas gp 135, p30 (p26 ó p28), p16 y p14 (Brahic y Haase, 1981). Tres de éstas son proteínas estructurales internas (p30, p16 y p14), y tienen su origen en la región gag procedentes de una proteína precursora de 55,000 dalton de peso molecular, denominada pr55 (Vigne, et al., 1982). La glicoproteína (gp) 135, se origina de una proteína precursora de 150 kilodalton y es el antígeno viral responsable de la adherencia viral a la membrana celular y de la formación de anticuerpos neutralizantes específicos por el hospedero (Griffin y Narayan, 1980). A diferencia de los retrovirus oncogénicos, los lentivirus no contienen oncogenes celulares. Estudios realizados en el genoma de la cepa islándica del virus del Maedi/Visna (cepa 1514) indican que el genoma del lentivirus tiene en total 9202 nueleótidos. El genoma se encuentra flanqueado, en ambos extremos, por unidades conteniendo secuencias reguladoras y denominadas, terminales largas repetidas o LTR compuestas de 414 bases pareadas (Sonigo, et al., 1985). A pesar de que estos extremos LTR tienen secuencias que no codifican productos génicos [descritos como U5, U3 y secuencias idénticas repetidas (R)], estas unidades son componentes importantes en la transferencia de la información genética del genoma viral ARN a ADN actuando como verdaderos elementos genéticos promotores y activadores de replicación. Los LTR, además, de ser componentes importantes en el proceso de integración del ADN intermedio (provirus) al ADN celular, contienen secuencias utilizadas para la adherencia e iniciación de la síntesis de la cadena negativa del ADN, son sitios de uniones complementarias específicas para el ARN de transporte de la lisina (ARNt-lisina). Una vez integrados en el genoma celular, los LTR adoptan características de verdaderos promotores para la transcripción viral debido a que contienen secuencias de adherencia para la transcriptasa viral, secuencias potenciadoras ("enhancing") que ayudan a la propia transcripción viral, así como secuencias que modifican los transcriptos adicionando la cola "poli A" al extremo 5’ del genoma viral (Hess, et al., 1985). En general los lentivirus son virus de replicación competente (no requieren ayuda de otros agentes) gracias a los tres principales genes: gag, pol, y env. La replicación de los lentivirus, al igual que todos los retrovirus, se hace a través de un ADN intermedio gracias a la existencia de la enzima transcriptasa reversa. Pero, a diferencia de los retrovirus oncogénicos, el ADN intermedio viral, del lentivirus en cultivos celulares está compuesto por una cadena negativa completa y dos cadenas complementarias separadas por una brecha o vacío en el centro de la molécula. Esta particularidad hace que el ADN lentiviral se mantenga linealmente en doble cadena asociado, no covalentemente, al ADN celular (Harris, et al., 1981). Esta característica, además, evidencia que la síntesis de la cadena positiva del ADN ocurre en dos lugares distintos. La síntesis se inicia en el LTR para luego detenerse y reiniciarse en un lugar muy cercano a la brecha (Harris, et al., 1981). La identificación de polipurinas (adenmas, guanmas) cercana a la "brecha" en los virus HIV y el LvOv (Sonigo, et al., 1985), no solamente demuestra que la síntesis de la cadena de ADN se realiza en forma discontinua, también sugiere que el proceso de replicación viral debe esperar otros signos virales o celulares para continuar la formación de nuevos viriones. El hallazgo de los genes complementarios o no estructurales en el lentivirus es necesario para que la replicación viral se realice en forma orquestada y sincronizada. El gen regulador diferencial denominado rev (trs/art), el gen transactivador tat, y el gen regulador negativo nef (3’ orf) son genes sincronizadores de la replicación viral. Estos genes utilizan proteínas denominadas "reguladoras", algunas de ellas con efectos positivos y otras negativas en la replicación viral. El gen tat, presente en dos partes del genoma, amplifica la replicación a través de una proteína (p14) con funciones de potente transactivador génico. Esta proteína ejerce sus funciones en una región específica del LTR, estimulando 500-1000 veces la expresión génica. Por otro lado, el rev es un gen regulador selectivo con efectos diferenciales, su presencia o ausencia controla la expresión de los otros genes reguladores. En ausencia de
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la proteína rev, el virus integrado produce selectivamente proteínas reguladoras inhibiendo consecuentemente la producción de genes estructurales (bloquean la producción de nuevos viriones). La presencia de la proteína rev al bloquear la producción de las proteínas reguladoras, desinhibe la restriccion ge-nica dejando en libertad la producción de los componentes estructurales víricos (producción de nuevos viriones). El gen nef regula negativamente, mediante una proteína que se localiza adherida en la capa interna de la membrana citoplasmática, por lo que se especula que obedece a otros signos extracelulares. La ausencia de este gen causa incremento en la replicación viral en el laboratorio. Para hacer más complicado el conocimiento del genoma del lentivirus, se ha reportado la existencia de otros genes, cuyas funciones son desconocidas. Uno de estos genes es el denominado vif (factor infectiVo viral), gen dividido en dos subunidades y ubicado entre los genes pol y env. La ausencia de este gen produce la pérdida de la capacidad citopática del virus en el laboratorio (Sodroski, et al., 1986). Es conveniente aclarar que las observaciones descritas han sido estudiadas en el laboratorio, en donde las replicaciones virales son abundantes. En razón de que la replicación viral in vitro es totalmente diferente in vivo, las funciones de estos genes adicionales ¡n vivo son hasta el momento obscuras. La replicación lentiViral, al parecer, también es sineronizada por factores celulares del hospedero. Narayan, et al., (1983) demostró que la expresión del lentivirus caprino depende de la diferenciación de los monocitos a macrófagos tisulares. Esta afirmación sugiere que los lentivirus poseen genes que responden a factores de crecimiento y/o diferenciación celular. Sobre este particular, es interesante observar reportes sobre ciertos factores que activarían la replicación viral de manera similar a la activación de los linfocitos B mediante el NF-Kappa b (Factor nuclear de activación de la cadena k de las Igs). Como es de suponer el virus se activaría durante cualquier proceso que involucre respuesta inmune y/o inflamatoria que desencadene éstos u otros factores. Este mecanismo explicaría la presencia de lesiones pulmonares (neumonías intersticiales) en donde existe una intensa diferenciación de monocitos sanguíneos cirulantes a macrófagos alveolares en respuesta a un sin número de factores inflamatorios liberados en el lecho pulmonar. Durante este proceso se fomentaría constantemente expresiones virales que conducirían a un continuo y progresivo proceso inflamatorio en forma de círculo vicioso. Por otro lado, cuando el lentivirus se manipula en el laboratorio, la replicación del LvOv se caracteriza por expresiones líticas en varios tipos de células de origen mamífero, sobre todo cuando se utilizan células de origen ovino y caprino (Fig. 8). En estas células, el LvOv, de manera similar a in vivo, se replica a través de un ADN intermedio utilizando la transcriptasa reversa. En estos cultivos celulares el ADN se encuentra predominantemente en forma lineal, asociado nocovalentemente, pero sin lograr integrarse al ADN celular (Harris, et al., 1984). Después de algunas horas postinfección, se sintetiza una copia completa del genoma ARN viral y la cadena negativa de ADN. La síntesis de una parte de la cadena positiva del ADN, se inicia en la región "brecha" y la otra en el extremo 5’ extendiéndose hacia la parte central del genoma (Blum, et al., 1985). Esta forma, muy poco usual, de transcripcion retroviral, al parecer explicaría la presencia de formas intermedias virales, poco usuales (dos hebras de la cadena ADN positiva) en forma lineales no integrada al genoma celular. Esto sirve de fundamento para especular que las formas lineales observadas en los lentivirus no facilitarían la integración celular (las formas circulares se integran eficientemente) pero lo hacen resistentes a la acción de los interferones. Estas formas, sin embargo, al parecer, serían causantes de efectos citopáticos a las células infectadas.
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Figura 8. Monocapa de células sinoviales de origen caprino infectado con lentivirus ovino. La monocapa contiene numerosos sincitios multinucleados (flechas)
Alteraciones Celulares Producidas por el Lentivirus A pesar de que la infección por LvOv produce infiltración leucocitaria debilitante en los órganos afectados, no se ha logrado observar inmunosupresión y/o severo agotamiento linfocitario, como ocurre en infecciones producidas por el HIV (Bowen, et al., 1984). La respuesta blastogénica de las células mononueleares sanguíneas (periféricas) en los animales infectados por el LvOv es generalmente normal en el proceso de la infección (Larsen, et al., 1982; Griffin, et al., 1978). Sin embargo, existen reportes, que indican una disminución en la proliferación linfocítica en los nódulos linfáticos pulmonares estimulados por mitógenos como la concavalina A (Con A) en infecciones naturales (Ellis y DeMartini, 1985a). Por otro lado, existen evidencias sobre alteraciones en la regulación de la respuesta immune en animales enfermos naturalmente, tales como hipergamaglobulinemia (Molitor, et al., 1979), disminución en el número de céluIas plasmáticas en los nódulos linfáticos hiperplásicos (Ellis y DeMartini, 19850, disminución de linfocitos generados por la interleucina-2 UL-2) (Ellis y DeMartini, 1985b) y disminución de la actividad supresora inducida por la Con A (Ellis y DeMartini, 1985a). En lavados broncopulmonares realizados de animales infectados artificialmente con diferentes cepas de LvOv, y analizados mediante anticuerpos monoclonales se encontró que estos lavados contienen un elevado porcentaje de células identificadas como células citotóxicas/ supresoras (equivalentes a CD8) (Lairmore, et al., 1986). A pesar de todo esto, no existen evidencias clínicas sobre dichas alteraciones inmunes. De existir alteraciones inmunes, éstas al parecer ocurrirían a nivel de células presentadoras de antígeno. Sobre este particular, se ha descrito ciertas alteraciones directas o indirectas en las funciones de los monocitos/macrófagos a consecuencia de infecciones virales. Se tiene cierta información sobre la posible relación entre infecciones de los macrófagos alveo-lares y el establecimiento de cuadros de neumonías intersticiales. El macrófago alveolar es la célula que actúa como una especie de conductor central en la respuesta iminune a nivel pulmonar (Fel y Cohn, 1986). Por otro lado, esta célula es la principal célula blanco, y tal vez sea el reservorio y difusor principal de la infección viral (Geldelman, et al., 1985). Sin embargo, investigaciones realizadas sobre los efectos del LvOv sobre las funciones del macrófago alveolar, indican que estas células infectadas mantienen sus actividades fagocíticas normales (Narayan y Griffin, et al., 1985), y actúan normalmente como células accesorias en la blastogénesis linfocitaria en respuesta a mitógenos (Griffin, et al., 1983). Se conoce, además, que macrófagos alveolares infectados in vitro con lentivirus caprino fagocitan normalmente partículas de látex; también evidencian actividades bioquímicas propias de estas células tales como N-acetil-beta-D glucosaminasas, y responden normalmente a nivel de receptores del fragmento Fe y del complemento (Anderson, et al., 1983). Tal vez la disfunción celular ocurra a nivel de liberación y/o producción de ciertos factores de inflamación. Esto último, ha sido confirmado al describirse la producción de un interferón (IFN) con características peculiares producido por linfocitos caprino y ovino en presencia de macrófagos infectados con lentiVirus (Narayan, et al., 1983). Esta proteína es sensible a la tripsina, es resistente a cielos de congelación y descongelación, es resistente a pH ácido, no posee residuos de manosa como producto de glicosilaciones, y tiene la capacidad de activar expresión de antígenos de histocompatibilidad mayor (MHC) del tipo II en una línea celular de
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macrófagos alveolares. Las características y particularidades descritas de estas proteínas, y sobre todo la estabilidad a 56º y pH 2, no corresponden a los IFNg (immunes), más bien se asemejan a IFNa. Estas alteraciones inmunológicas han sido corroboradas in vivo, pues se ha detectado cantidades considerables de IFN asociadas con expresiones elevadas de antígenos MHC en un animal infectado experimentalmente (Kennedy, et al., 1985), y están presentes en fluidos obtenidos de lavados pulmonares en animales infectados natural y experimentalmente con LvOv (Lairmore, et al., 1987). Estos últimos autores han demostrado que linfocitos de animales severamente afectados (natural y experimentalmente) liberan cantidades elevadas de IFN cuando se cocultivan con macrófagos alveolares. Lo interesante de todo esto es que se observó una correlación entre la elevada producción de IFN y las lesiones patológicas. Los linfocitos provenientes de animales ligeramente afectados produjeron cantidades mínimas o nulas de IFN (Lairmore, et al., 1988). Al parecer, la producción de IFN en sitios donde ocurre la infeccion viral, sería un mecanismo de defensa para contrarrestar la replicación viral. Paradógicamente, este mecanismo de defensa ocasiona enorme perjuicio para el animal, pues produciría continua activación celular y consecuentemente diferenciación de monocitos a macrófagos y/o activación de macrófagos infectados que conduciría paralelamente a una activa producción retroviral. La continua expresión de antígenos MHC-II, es un componente necesario para mantener una permanente inflamación que llevaría a los cambios progresivos a nivel pulmonar, que terminan produciendo cuadros de neumonía intersticial linfoide (Lairmore, et al., 1988). La existencia de animales virémicos sin, aparentemente, presentar signos clínicos de la enfermedad sugieren que cualquier mecanismo y/o factor inflamatorio y/o inmunológico activaría los macrófagos iniciándose el largo proceso de daño tisular. Estos factores podrían ser cualquier tipo de infección mierobiana a nivel pulmonar que desencadene citoquinas (Ej.) (IFN). Sorprendentemente, existen muchas infecciones, incluyendo las parasitarias y micobacterianas que el hospedero responde con infiltraciones de macrófago al sitio de la inflamación liberando mediadores inflamatorios (Ellis, et al., 1994). Animales portadores de la infección lentiviral y paralelamente infectados con microorganismos productores de estos mediadores inflamatorios solubles, bien podría modular la replicación lentiviral y consecuentemente iniciar, extender y/o producir signos clínicos evidentes asociados con infección lentiViral.
Inmunopatología producida por el Lentivirus Ovino Los ovinos infectados por lentivirus logran desarrollar respuesta inmune pero no controlan la infección viral. La persistencia de anticuerpos incapaces de eliminar virus, no solamente corrobora la habilidad viral para evadir la inmunidad, también sugiere que estos anticuerpos lejos de eliminar la infección viral produzcan lesiones en el hospedero a través de mecanismos inmunopatológicos. La incapacidad citotóxica de la respuesta inmune tal vez sea consecuencia de la inadecuada expresión viral producto de la restricción génica a nivel transcripcional. En este estado, sólo se detecta genoma viral en distintos órganos infectados sin detectarse expresiones de proteína viral (Haase, et al., 1977). Este fenómeno denominado "bloqueo a nivel de transcripción", se caracteriza por el desbalance en el número de copias de ARN y ADN en las células infectadas (Brahic, et al., 1981; Haase, et al., 1982). El fenómeno de restricción en la replicación viral detectado en los macrófagos alveolares (Geballe, et al., 1985) también ocurre en sus respectivas células precursoras, como promonocitos y monocitos a nivel de médula ósea (Gendelman, et al., 1985). Controlando la expresión viral, el virus no solamente elude la producción de anticuerpos, sino también utiliza estas células claves en las respuesta inmune como verdaderos reservorios virales en el hospedero con capacidad de difundir el virus a distintos órganos potenciales de infección. Los lentivirus persisten, además, formando anticuerpos con poca capacidad neutralizante, y paralelamente produciendo variantes antigénicas durante el curso de la infección. En ovinos se ha identificado la presencia de anticuerpos neutralizantes que varían durante el curso de la infección (Narayan, et al., 1977). Estas variantes se originan por mutaciones puntuales en una base nueleíca del genoma produciendo un desconocimiento "inmunológico" de los anticuerpos neutralizantes presentes (Clements, et al., 1980). Estas mutaciones genéticas se
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producen constantemente en el hospedero infectado y al parecer subsisten y coexisten con las cepas originales (Thormar, et al., 1983). En ovinos, se conoce muy poco sobre la importancia biológica de estas variaciones, pero si son cruciales en infecciones por el lentivirus productor de la anemia infecciosa equina (MeGuire y Crawford, 1979). Estudios experimentales con el LvOv han demostrado que la duración y el tipo de respuesta humorales, parcialmente, cepa dependiente. La producción de anticuerpos fijadores de complemento se detectan muy tempranamente hasta las tres primeras semanas después de la inoculación con la cepa islándica (Maedi/Visna, cepa 1514) (Gudnadottir, 1981), mientras que la cepa noruega de Maedi produjo estos mismos anticuerpos después de 15-19 semanas (Larsen, et al., 1982). Por otro lado, Cutlip, et al. (1977b) reporta que corderos, de 1 día a 10 meses de edad, inoculados experimentalmente con cepa americana (neumonía progresiva crónica), producen anticuerpos precipitantes 4 meses después de la inoculación. Estudios comparativos sobre la respuesta inmunitaria entre cepas islándica y la americana, demuestran que la cepa islándica produce, experimentalmente, anticuerpos fijadores de complemento, anticuerpos neutralizantes, y anticuerpos precipitantes a títulos bajos (Klein, et al., 1985), mientras que ovinos americanos enfermos naturalmente producen consistentemente anticuerpos precipitantes y raramente anticuerpos neutralizantes y fijadores de complemento. Por regla general, una vez iniciada la producción de anticuerpos, éstos permanecen de por vida en infecciones naturales (Gudnadottir, 1981). En base a estos resultados se ha propuesto la existencia de varias cepas de LvOv, unas cepas con características líticas en el laboratorio (cepa americana) caracterizadas por respuestas de anticuerpos rápidas dirigidas contra la glicoproteína, y cepas no líticas (grupo Maedi/Visna) con respuesta débil de tipo neutralizante a los epítopes de la glicoproteína viral. Se conoce, además, que los anticuerpos neutralizantes del virus (cepa islándica) son restringidos a la clase de IgG1 (Petursson, et al., 1985), y que el virus elude la neutralización compitiendo por los receptores celulares (Kerinedy-Stoskopf y Narayan, 1986). El mecanismo de neutralización observada en la cepa islándica es diferente y depende de la clase de célula involucrada, así por ejemplo, el bloqueo de la neutralización en células tipo fibroblasto (plexo coroideo) es a nivel de membrana celular, mientras que en las céjulas linfoides (macrófagos) ocurren a nivel intracelular, después que el virus se haya desnudado y antes que se inicie el proceso de transcripción (Kennedy-Stoskopf y Narayan, 1986). Este último mecanismo sugiere que los anticuerpos neutralizantes débiles, lejos de neutralizar al virus, ayudarían a la adherencia, penetración y desnudamiento bajo un fenómeno denominado ayuda inmunológica ("enhancement") por el cual el virus penetra a células que poseen receptores para las fracciones Fe de las inmunoglobulinas (principalmente macrófagos). Existen evidencias clínicas y experimentales que aseguran que las lesiones patológicas producidas por los lentivirus provienen de mecanismos inmunopatológicos. En estudios de reproducción experimental de lesiones nerviosas por vía intracerebral realizado con la cepa islándica demostraron que los animales inmunocomprometidos mediante inoculación de ciclofósfamidas o suero conteniendo antitimocitos sufrieron lesiones mínimas frente a los animales que no recibieron dosis inmunosupresoras (Nathanson, et al., 1976; Panitch, et al., 1976). Por otro lado, animales hiperinmunizados experimentalmente desarrollan mayores lesiones patológicas cuando se les vuelve a administrar el virus (McGuire, et al., 1986). El mecanismo desencadenante de este tipo de lesiones no está del todo claro, pero al parecer sería consecuencia de las alteraciones directas de la función del macrófago o efectos indirectos entre el macrófago y los linfocitos infectados. El corolario de estos hallazgos demuestra que las vacunas lejos de proteger a los animales, lo sensibilizan y son capaces de producir mayores lesiones si experimentan posteriores infecciones naturales.
1. Ph. D., UNMSM-FMV-IVITA, Apdo. 41-0068 Lima-Perú, Fax: (51-1) 435 3064 y 435 3189. E.Mail: rrosadio@computextos.com.pe
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