Les leishmanioses cutanĂŠes Pr Ag Rym Ben Abdallah Laboratoire Parasitologie-Mycologie Institut Pasteur de Tunis
Introduction
Introduction
Le parasite
Morphologie Forme amastigote • Immobile • Intracellulaire • l'Hôte vertébré
Forme promastigote • Mobile • Extracellulaire • Dans le tube digestif du phlébotome et en culture
•
- La forme amastigote
Noyau Klnétoplaste
Taille : 2 à 6 µ m Macrophage
- La forme promastigote
Noyau
KlnĂŠtoplaste
Flagelle
Taille: 20-25 Âľ m
Cycle hétéroxène
l'insecterégurgite et injecte les formes promastigotes
Absorpt ion du parasite lors d'une piqûre
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-
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EpidĂŠmiologie
Vecteur Classe: 1nsectes Ordre: Diptères Fam ill e: Psychod idae Genr e:
Ph/ebotomus (A.M )
Lutzomi a (N.M ) Espèces: P.
perniciosus
4 stades larvaires Œuf - larve -nymphe - - Adul te Gîtes larvaires: terricol es, sombre, calme et assez humide Creux d'arbres, terriers des rongeurs Adulte ailé, 2-4mm, jaune paille, velu, d'aspect bossu Température extérieure >19°C Activité crépusculaire et nocturne Seule la femelle est hématophage (telmophage) Trompes courtes et t rapus
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RĂŠservoirs Animaux sauvages Rongeurs sauvages (LCZ)
Animaux domestiques chiens
Rép art it io n géographique desleishmanioses cutanées
•
#Il
Leishmaniose cutanée DL uoplco D L troplco/L
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Sud)
L «thlopko -
L major moJO( Espkes du Nouve.iuMonde(duTe><as tusqu'en Aménque du
Situation en Tunisie
Leishmanioses cutanées en Tunisie LCS s po1·a diq u e L. infant11m MON 24
50-100 cas/an
LCZ endé n10-épidé1nique L. 1najor 10 N 25 3 à 5000 cas/an
LCC L. tropica 10 N 8 (L. killicki) 1 0 à 30 cas/an
'
Leishmanioses cutanées en Tunisie LCS
Espèce
L. in fant um MON 24++ L. major MON 25
Phlebotomus
Vecteur
Réservoir
LCZ
perfiliewi
Chien
LCC L. tropica MON 8 (L. ki llicki )
Phlebotomus papatasi
Phlebotomus sergenti
Psammomys obesus Meriones shawi
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Clinique
Leishmanioses cutanées Forme type ulcéro-croûteuse Nodule 2
i
1
ulcération
Papule inflammatoire
'
I nfiltratio n
Indolore Chronique Non prurigineu se Résistante aux antibiotiques Guérison spontanée
Caractéristiques des leishmanioses cutanées en Tunisi
LCS
LCZ
LCC
Localisation
Visage ++
m embr es
Visage ou membre
Nombre
Souvent unique
Souvent multiples
Souvent unique
Nodules ulcérocrouteux humides souvent surinfectés
lésion sèche
7-8 mois
2 -3 ans
Aspect
Evolution
lésion éryt h éma teuse Petite tallle 1 - 2 ans
LC S
LC Z
LC C
LC S
LC Z
LC C
Leishmaniose cutanée-muqueuse
Muqueuse oro-nasale Lésions granulomateuses ulcérées Evolution (à un stade avancé): nécrose et mutilation Grave+++
Diagnostic biologique
Diagnostic biologique Repose sur la mise en évidence: – du parasite par un examen direct / culture – ou de son ADN par PCR
Mise en évidence du parasite ou de son ADN
Prélèvement
La feuille de prescription doit contenir les informations nécessaires pour identifier le client et le prescripteur autorisé. Elle doit également fournir les données cliniques pertinentes
Tous les spécimens reçus doivent être enregistrés dans un registre d'admission, sur une feuille de travail, dans un ordinateur ou tout autre système comparable
La feuille de prescription ou un équivalent électronique doit prévoir suffisamment d’espace pour indiquer, sans s’y limiter, les éléments suivants: a)l’identification du patient, y compris le sexe, la date de naissance, les détails d’emplacement/contact du patient et un identifiant unique; NOTE L’identification unique est composée d’un identifiant alphanumérique et/ou numérique (par exemple numéro d’hôpital ou un Numéro individuel de santé). b)le nom ou l’identifiant unique du clinicien, prestataire de soins ou autre personne légalement autorisée à prescrire des examens ou à utiliser les données médicales, avec le destinataire du compte rendu et les données de contact; c) le type d’échantillon primaire et, le cas échéant, le site anatomique d’origine; d) la nature des examens prescrits; e)les informations cliniques pertinentes concernant le patient et la prescription, pour la réalisation de l’examen et l’interprétation des résultats; NOTE Les informations nécessaires pour la réalisation de l’examen et l’interprétation des résultats peuvent comprendre l’ascendance du patient, les antécédents familiaux, l’historique des voyages et expositions, les maladies contagieuses et toute autre information clinique pertinente. Les informations financières pour les besoins de facturation, la vérification des comptes, la gestion des ressources et les revues d’exploitation peuvent également être collectées. Il convient que le patient soit informé des renseignements collectés et de la raison pour laquelle ils sont rassemblés. f) la date et, le cas échéant, l’heure du prélèvement de l’échantillon primaire; g) la date et l’heure de la réception de l’échantillon.
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mettre Ă la disposition du personnel les procĂŠdures et modes opĂŠratoires
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INS TI TUT PASTEUR DE TUNIS LABORATOIRE DE PARASITOLOGIE-1\IT C OLOGIE Classeur : Direct Fichier : Recherche de leishmanies à l' examen direct Version : 2 Rédigé par : A. E. (résidente) Validé par : E. S. (biologiste) Secteur : Hématozoaires Date de rédaction : 07/06/2007 Annrouvé par : K. A. (biolgo iste ) D ate d ' a nn lic.ation : Domame 19/06/2008 l>ga e : 1/ 3 Lésions cutanées (éry1hémateuse, inflammatoire, -crouteuse.. .) évoluant depuis plus d'application : de 10 jours et évoquant une leishmaniose cutanée Recherche de leishmanies à l'examen direct Ponction de moelle osseuse pour suspicion de leishmaniose viscérale
Ptincipe : Recherche de formes amastigotes de leishmanies sur les frottis dermique ou de moelle osseuse
Local : Salle I paillasse 1, 2 et 4
Personnel : Techniciens (es), résidents (es), médecins biologistes
i\,latètiel :
* Prélèvement de leishmaniose cutanée : -
Vaccinostyle (S.P. n°8, tiroir n°1) Pipette pasteur (paillasse n°4) Eau physiologique stérile (paillasse n°4) Coton (S.P. n°1, tiroir n°1) Lame porte objet (paillasse n°4/S.P. n°8, tiroir n°1) Crayon diamant (S.P.N°1, tiroir n°1) Bec bunsen (paillasse n°4) * Coloration : - Papier (S.P. n°4, tiroir n°2) - Bacs de coloration (S. P. n°2)/ crachoirs (S.P. n°6, tiroir n°2) - Porte lame
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INSTITUT PASTEUR DE TUNIS LABORATOIRE DEP ARASITOLOGIE-l\lY COLOGIE Classeur : Direct Fichier : Recherche de leishmanies dans le derme Version : 2 Rédigé par : A. E. (résidente) Validé par : E. S. (biologiste) Secteur : Hématozoaires Date de rédaction : 07/06/2007 rouvé oar : K. A. (bioloeiste) Date d' a lic.ation : 19/06/2008 Paee : 2/3 Recherche de leishman ies à l' examen direct
Réactifs : * Prélèvement : Eau physiologique stérile (paillasse n°4) * Coloration (Salle 2, plac.ard 1) - i\1éthanol fo urnisseur : référence : 65550 - Eosine RAL 555 fournisseur : RAL, référence : 361640 fournisseur : RAL, référence : 361650 - Bleu RAL 555 Solut ions de tra \'ail : (Salle 2, plac.ard 1) -Solution 1 : i\1éthanol 30 % - 70 ml d' eau distillée - 30 ml méthanol -Solution 2 : Eosine -Solution 3 : Bleu I.rigencesparticulières : Il est préférable que la lésion cutanée ne soit pas infectée au moment du prélèvement i\1ode opératoire : * Prélèvement de leishmaniose cutanée : Essuyer la lésion cutanée avec du
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INSTI TUT PASTEUR DE TUNIS LABORATOIRE DEP ARASITOLOGIE-MYCOLOGIE Classeur : Direct Fichier : Recherche de leishmanies dans le derme Rédigé par : A. E. (résidente)
Version : 2
Secteur : Hématozoaires Date de rédaction : 07/06/2007 Approuvé par : K. A. (biologiste) Date d' applic.ation : 19/06/2008 Pga e : 3/ 3
Validé par : E. S. (biologiste)
. Reche r che de leishma n ies. à l ' exame.n di r ect - Les frottis de moelle osseuse sont confectionnes 1mméd1aternent apres le prelevernent . injecter . la moelle osseuse sur la lame, aspirer rapidement le. .sang en laissant les « grumeaux » puis étaler par une deuxiéme lame * Coloration : Plonger la lame une minute dans un bac de méthanol Egoutter sur le papier velin Rincer à l' eau de robinet (bac ou jet faible d' eau de robinet) plonger la lame trois fois pendant une seconde dans le bac d' éosine Egoutter sur le papier wil! et rincer à l' eau de robinet Plonger la lame trois fois pendant une seconde dans le bac de bleu de méthylène Egoutter sur le papier wil! et rincer à l' eau de robinet Sécher à l' étuve à 37°c Lecture : - Mettre une goutte d' huile à immersion sur la lame et lire à l' objectif (xl 00) - Ranger la lame dans la boite correspondante (étagère de la paillasse n°2) Elimination des déchets : Jeter le vaccinostyle et la pipette pasteur dans le ramasse aiguille Les solutions de coloration sont éliminées dans le lavabo après un certain nombre d'utilisations déterminé par la constatation de dépôt de colorant qui gêne la lecture
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Entretien - Nettoyage Nettoyer la paillasse avec de l' eau de javel Nettoyer les objectifs du microscope avec l' alcool 70°
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INSTITUT PASTEUR DE TU1''1S LAB O RA TO IRE DE PARASITOLOGIE-1\<IY CO L OG IE
C la ss e ur : Direct (ré.sidente)
Fichier : Culrure de.s leishmanies Version: 2 Rédigépar : A. E.
Validépar : E. S. (biologiste) Secteur : Hématozoaires Date derédaction : 07/06/2007 Approuvé par : K. A. (biologiste) Date d'application : 19/06/2008 Page: 1/3
Recherche de leishmanies par la cultu re
Domame d ' app lica (érythémateuse, inflammatoire, ulcéro-crouteuse) évoluant depuis plus Lésion cutanée tion . de 10 jours et évoquant une leishmaniose viscérale
Ponction de moelle osseuse ou prélèvement de sang sur tube avec anticoagulant (EDTA) pour suspicion de leishmaniose viscérale Pr incip e :
Recherche de formes gromastigotes de leishmanies Loca l :
Salle 1 paillasse 1 et 2 Personn el :
Techniciens (es), résidents (es), médecins biologistes J\l a té r ie l :
- P i pettes pasteur (S.P. n°1, tiroir n°2 - Lames portes objet (S. P. n°1, tiroir n°1) - Microscope (paillasse n°1) - Bec bunsen Réac tifs :
Milieu NNN Q:io -Nicolle-Mac Neal) (réfrigérateur, salle n°2) Pénicilline (réfrigérateur, salle n°2) Ancotil (réfrigérateur, salle n°2) Urine stérile (congélateur -20°c)
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INSTITUT PASTEUR DE TUl\'IS LABORATOIRE DE PARASITOLOGIE-iMYCOLOGIE
Classeur : Direct A. E. (ré.sidente)
Fichier : Culrure de.s leis hmanie.s
Version : 2 Rédigépar :
Validépar : E. S. (biologiste) Secteur : Hématozoaires Date derédaction : 07/06/2007 Approuvé par : K. A. (biologiste) Date d'application : 19/06/2008 Page : 2/3
Recherche de leishmanies par la culture La culture est touiours r'ealis'ee avant de confecuonner les frottis sur lames Les tubes ne doivent pas être totalement vissés Un délai d 'un mois est nécessaire avant de rendre un résultat négatif Mode opératoire : Mettre quelques gouttes d'eau physiologiquestérile dans le tube du milieu NNN Ensemencer le prélèvement près du bec bunsen : - le suc dermique aspiré par la pipette Pasteur - la moelle osseuse contenue dans la seringue de ponction - la couche leucocytaire sanguine aspirée par la pipette Incuber verticalementles tubes dans le portoir correspondant sur l' étagère de la paillasse n°4 à température ambiante. Au mieux dans une étuve à [22-2 7°c] Remarque: Ajout er quelques gouttes d'urines stériles pour l'i solement de cert.aines espèces difficiles à cultiver (Leishmaniainff?ntwn ) Ajout er quelques gouttes de pénicilline et d ' Ancotil en cas de contamination du prélèvement ou lors des repiquages Lecture : La lecture se fait après une semaine si on suspecte L. major et apr ès deux semaines si on suspecte L. inff?ntwn Aspirer avec une pipette Pasteur en verre, une goutte de la phase liquide Placer la goutte entre lame et lamelle Observer à l' objectif (xi 0) puis (40x) à la recherche de formes gromastigotes mobiles
Effect.ner110 reuinuaee dans110 n 01 1vea11 tube NNN si 1a cu1mre est néeative
Prélèvemen t
Frottis dermique
désinfection raclage du versant interne de l'ulcération à l'aide d'un vaccinostyle après ablation éventuelle de la croûte
Coloration au May GrĂźnwald Giemsa / RA L
\
Examen direct
Examen direct : Les protozoaires apparaissent sous forme amastigote, intra cellulaire à !'intérieur de monocytes mais également en extra cellulaires Noyau7 coloré en rouge pourpre Kinétoplaste7 violet Cyt opl asme7 bleu pâle
Culture
MIiieu NNN
Culture
Objectif X10 - X40
Culture NNN / Sérum lapin coagulé /RPMI 25°C, repiquages, 1 mois intérêt:
augmente la sensibilité de l'examen direct taxonomique Préparation de l'ant igèn e Incon vénient s: Longue, fastidieuse Cont am inat ion s bactériennes et fongiques Addition de Pénicilline, Streptomycine et 5- flucytosine
Biologie molĂŠculaire (PCR)
B1olog1'e molécu air (PC:
·.)
Sensilb _e (<1 pa rasit
e/µ11) Spécifique
i 1 : AIDNkIT. S 7 SL
(dg+ et id e n · ifi ca·lon d' es1p,êce] 1
1
1
1
PCR conventionnelle
PCR quantitative
HRM (High Resolution Melting): technique de Fusion Haute -RĂŠsolutior
Diagnostic positif Diagnostic d'espèce
-
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-
L. infantum
Dtfterenet! Curve 0';
Malade
En résumé: le diagnostic biologique Frottis dermique: examen direct: formes amastigotes Culture NNN: formes promastigotes PCR: diagnostic positif + diagnostic d’espèce
Traitemen t
Traitement de la leishmaniose cut anée: 3 attitudes Thérapeutiques sont possibles Traitement parentéral Traitement local Abstention thérapeutique
--·
Glucantime
1,5 5
GlucantimeR Antimoniés pentavalents
Mode d'action Inhibition de la glycolyse et de la
oxydation
des acides gras des leishmanies.
Présentation Ampoule de 5 ml contenant 1,5 g de Glucantime
Modes d'administration -lntralésionnelle -Intramusculaire
-o
Glue.intime
Modes d'administration -Nombre de lésions
>5
-Diamè tre > 4 cm -Siège pèriorificielle ou pèriart iculair e -Diffusion ly mp hat ique
GlucantimeR par voie intramusculaire -70mg / kg/ j -durée : 15 jours
-Nom bre de lésions < 5 -Diamèt re < 4 cm -Loin des orifices et des art iculations -Sans diffusion lym hatique
1,S. S.
,
-
_
GlucantimeR en infiltration péri-lésionnell e - 1 ml / 1cm 2 - sans dépasser 100 mg/ kg/ j -2 infiltrations/ semaine/ 2 semaines
In jection aux quatre points cardinaux com p let de La base de la lĂŠsion.
- 1bl anchissement
GlucantimeR Signes de st ib io -in t o lé ra nce : apparaissent dès les --injections et régressent à l'arrêt et sont de type anaphylactique prem hyperthermie, frissons, ar t hro-myalgies, éruption cutanée, Tachycardie, toux, hémorragies, troubles digestifs Les signes de st ib io -i nt o xicatio n, en fin de cure et traduisent un surdosage: hyperthermie, art h ralgies, myalgie s, troubles cardiaques, Atteintes hépatiques, atteintes pancréatiques, rénales, hématologiques
Moyens physiques Cryothérapie :+++ • -Azote liquide -Neige carbonique • 1 Application de 15 à 20 sec, 1 fois/ semaine/ 3-6 sem • Effets indésirables : hypopigmentation ou hyperpigmentation Thermothérapie : • Lumière infrarouge, ultrasondes, laser.... • Procédure douloureuse nécessité d'un anesthésique local • Effets indésirables : réaction bulleuse sévère
Prophylaxie
MESURES INDIVIDUELLES Éviter les piqûres de phlébot ome par l'utilisation de répulsifs et de moustiquaires à mailles fines imprégnées d' insecticides MESURES COLLECTIVES • Lutt e contre le vecteur (les phlébotomes) par pulvérisation d' insect icid es • Lut t e cont re le réservoir de parasites :
Animal Do m est iq ue: • Abattage des chiens errants en zone d'endémie • Diagnostic et traitement des chiens parasit és • Port de coll ier s imprégnés de deltam ét h rin e pour les chiens pendant toute la saison de transmission • L'immunisation des chiens reste une voie de recherche: un premier vaccin polyproteique a été autorisé au Brésil après avoir montré 90% d'efficacité (la vaccination canine s'est accompagnée d'une diminution de l' incidence des cas humains
Sauvage s
• Destruction des terriers par labourage des terres et élimination des plantes chénopodiacés nourriture des Psammomys • Autour des zones urbanisées, création d'une ceinture par élimination mécanique des plant es et substitution par des arbres et plantes inhospitalières pour Psammomys obesus • utilisation d'appâts empoisonnés pour lesmérions
Conclusion Leishmaniose est un problème de santé publique Pour y remédier, des efforts doivent principalement porter: Pour la LCZ sur la prophylaxie qui doit être adapter à chaque situation épidémiologique En attendant la mise en place d’un vaccin