Aislamiento de bacterias ruminales celulolíticas en medios selectivos con base en celobiosa y carboximetilcelulosa. M.C. Paulino Sánchez Santillán1*; Dr. Mario Antonio Cobos Peralta1; Ing. Norberto Elizondo Garza2, Dr. José Refugio Salazar Martínez2, Dr. Alberto Alvaro Iglesias3 1. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Edo. de México. 2. Forrajera Elizondo, Carlos Salinas de Gortari 600, Apodaca, NL. 3. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Argentina. ssantillan@colpos.mx; cobos@colpos.mx
Resumen Ruminococcus albus, Fibrobacter succinogenes y R. flavefaciens son las principales bacterias celulolíticas estudiadas del rumen y representan entre 0.3 4% de la población bacteriana presentes en el rumen. Se extrajo fluido ruminal de una vaca Holsteín como inóculo para asilar seis bacterias celulolíticas. El proceso de aislamiento se inicio realizando dos transferencias en medio de cultivo líquido pasto bermuda-fluido ruminal (PB-FR) y tres transferencias en medio de cultivo líquido celobiosa-carboximetilcelulosa-fluido ruminal (CC-FR), la finalidad fue asegurar el crecimiento de bacterias celulolíticas por los componentes utilizados como sustratos. Para obtener el aislamiento de una colonia se utilizó el medio CCFR solidificado con agar, sembrando de la última transferencia realizada en el medio CC-FR. Se realizaron tres transferencias en medio sólido para asegurar el aislamiento de una colonia pura. La metodología se realizó bajo flujo constante de CO2 para mantener anaerobiosis. Como resultado se aislaron seis bacterias celulolíticas, de las cuales cuatro (A, D, M y R) son cocos positivos, una (B) es un cocultivo de cocos negativos-positivos y un bacilo (C) negativo. Se caracterizaron por tener las mismas características morfológicas coloniales, a excepción del borde de la bacteria B. Palabras claves Aislamiento, Fluido ruminal, Bacteria, Celulolítica, Medio de cultivo. Introducción La población bacteriana oscila entre 1010 a 1011 células g-1 de fluido ruminal, la mayoría son anaerobias obligadas, aunque pueden aparecer anaerobias facultativas (107-108 células g-1 fluido ruminal). Se pueden agrupar de acuerdo a su forma, tamaño o estructuras. El primer método de clasificación de las bacterias en el rumen se basa en el tipo de sustrato que degradan y su producto final (Church, 1993; PSU, 1996). Las actividades metabólicas de las bacterias ruminales se agrupan en dos tipos: a) degradación de polímeros vegetales hasta sus subunidades monoméricas, y b) fermentación subsecuente en la producción
de energía, esqueletos carbonados y amonio para biosíntesis microbiana (Arias, 1982). Las bacterias fibrolíticas importantes son Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens y Ruminococcus albus (Morales y Dehority, 2009; Matsui et al., 2010). Las bacterias fibrolíticas tienden a degradar las estructuras más fácilmente digeribles como las células del mesófilo, aunque F. succinogenes digiere parénquima, las paredes de células epidérmicas y esclerénquima de la hoja, además actúa sinérgicamente con bacterias no celulolíticas durante la digestión del forraje (Shinkai y Kobayashi, 2007). Estas bacterias representan alrededor de 0.3-4% de la población microbiana del rumen (Forsberg et al, 2000). El objetivo del presente trabajo fue aislar y caracterizar microscópicamente al menos una bacteria ruminal celulolítica a partir de una vaca Holsteín provista de cánula ruminal. Materiales y métodos. Se extrajo fluido ruminal (inóculo) de una vaca Holsteín provista de cánula ruminal alimentada previamente en las praderas (Lolium perenne L.) del Colegio de Postgraduados, campus Montecillo. Se preparó un medio líquido selectivo usando pasto bermuda (Cynodon dactylon; PB-FR; Cuadro 1) utilizando la metodología de Cobos y Yokoyama (1995). En tubos de cultivo (18 x 150 mm) se colocó 0.1 g de pasto bermuda (1 mm Ø), se esterilizaron los tubos y adicionaron 8 mL del medio PB-FR bajo flujo constante de CO2 e incubaron 38 ºC / 24 h en una incubadora marca Riossa modelo EO-71 para comprobar esterilidad. La inoculación se realizó con 0.1 mL de inóculo bajo flujo continuo de CO 2 e incubaron 72 h / 38 ºC. Después de la incubación se transfirió 1 mL a otro tubo de cultivo con medio PBFR, e incubó 72 h / 38 ºC; realizando en total 2 transferencias sucesivas de los medios inoculados. Se preparó otro medio líquido selectivo con base en celobiosa, carboximetilcelulosa y fluido ruminal (CC-FR; Cuadro 1) utilizando la misma metodología que en los medios PB-FR. La inoculación del medio CC-FR se hizo con 1 mL de la 2da transferencia del medio PB-FR bajo flujo continuo de CO2 e incubaron 72 h / 38 ºC. Se realizaron 3 transferencias sucesivas en medio CC-FR según lo descrito en el párrafo anterior. Se preparó medio sólido anaerobio selectivo (CC-FRS; Cuadro 1) en tubos de cultivo (18 X 150 mm) para el aislamiento de bacterias celulolíticas. En cada tubo se depositaron 9 mL de medio CC-FRS bajo flujo constante de CO2 e inclinó 10º hasta su solidificación (variante a la técnica de Hungate, 1950). Se incubaron 48 h / 38 ºC para comprobar esterilidad. La inoculación del medio CC-FRS se hizo con la 3ra transferencia del medio CC-FR usando una asa bacteriológica, bajo flujo continuo de CO2 e incubó 7 d / 38 ºC. El proceso se repitió 3 veces para obtener colonias bien definidas y aisladas para realizar una caracterización microscópica. Las inoculaciones y transferencias se realizaron por triplicado. A la bacteria
aislada se le determinó tinción Gram, caracterización morfológica colonial y celular con ayuda de un microscopio de contraste. Cuadro 1. Composición de los medios anaerobios selectivos utilizados en el aislamiento de baterías celulolíticas. Componente (100 mL) Agua destilada (mL) Líquido ruminal clarificado1 (mL) Solución mineral I2 (mL) Solución mineral II3 (mL) Resazurina 0.1%4 (mL) Peptona de soya (g) Cisteina-sulfido5 (mL) Extracto de levadura (g) Carbonato de sodio, sol a 8%6 (mL) Celobiosa (g) Carboximetilcelulosa (g) Agar (g)
CC-FR 52.6 30.0 5.0 5.0 0.1 0.2 2.0 0.1 5.0 0.1 0.1 -
CC-FRS 51.1 30.0 5.0 5.0 0.1 0.2 2.0 0.1 5.0 0.1 0.1 1.5
PB-FR 52.6 30.0 5.0 5.0 0.1 0.2 2.0 0.1 5.0 -
1
Líquido ruminal fresco, se filtró con manta de cielo, centrifugado a 23,000 g (unidades de gravedad relativa) por 15 min y esterilizó durante 20 min a 15 PSI y 121 ºC. 2 Contiene (1000 mL) KH2PO4, 6g. 3 Contiene (1000 mL) KH2PO4, 6g; (NH4)2SO4, 6 g; NaCl, 12 g; MgSO4, 2.45g; CaCl-2H2O, 1.6 g. 4 Agregar 0.1 mL de solución (1%) en agua destilada, aforar a 100 mL. 5 2.5 g de L-cisteína (disuelta en 15 mL de 2N NaOH), más 2.5 g de Na 2S-9H2O; la mezcla se aforó a 100 mL con agua destilada. 6 8 g de carbonato de sodio en 100 mL de agua destilada.
Se realizó una liofilización para la conservación de las bacterias aisladas para posteriores estudios. Se prepararon viales serológicos (100 mL) con 50 mL de medio CC-FR bajo flujo constante de CO2. La inoculación se realizó con 1 colonia bien formada y aislada de los tubos con medio CC-FRS e incubó 72 h / 38 ºC. A continuación, los viales se metieron a un congelador de rodillo marca Labconcon modelo Shell Freezar durante 40 min para obtener una temperatura de -38 ºC. Inmediatamente se guardaron en un ultracongelador marca ThermoScientific modelo Revco (-54 ºC) hasta su liofilización. Los viales se liofilizaron durante 24 h en una liofilizadora marca Labconco modelo Freezone 4.5 L en modo automático (condiciones: temperatura de -50 ºC y presión de 0.24 mBar). Resultados En el proceso de aislamiento se obtuvieron seis bacterias celulolíticas que no se identificaron genéticamente para establecer su nombre científico. Sin embargo, se identificaron asignándoles una letra del alfabeto para su caracterización morfológica colonial (Cuadro 2) y tinción Gram (Cuadro 3).
Cuadro 2. Caracterización morfológica de las colonias aisladas de bacterias celulolíticas Bacteria A B C D M R
Forma Circular Circular Circular Circular Circular Circular
Borde Entero Ondulado Entero Entero Entero Entero
Elevación Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa
Textura Membranosa Membranosa Membranosa Membranosa Membranosa Membranosa
Color Blanco-cremosa Blanco-cremosa Blanco-cremosa Blanco-cremosa Blanco-cremosa Blanco-cremosa
Cuadro 3. Tinción Gram y forma de las bacterias celulolíticas aisladas Bacteria
Tinción Gram
Forma de la bacteria
A B C D M R
Positiva Positiva-Negativa Negativa Positiva Positiva Positiva
Cocos Cocos Bacilos Cocos Cocos Cocos
Discusión Hungate (1950) publicó la primera técnica de aislamiento de bacterias celulolíticas que se caracterizaba por usar gases sin presencia de oxigeno como el dióxido de carbono, hidrogeno o nitrógeno para mantener condiciones de anaerobiosis. Además, consideró que la concentración final de nutrientes inorgánicos no es un factor crítico; así como el uso de CO2 y 0.5% de bicarbonato de sodio como buffer y el clorhidrato de cisteína como agente reductor. La diversidad de bacterias celulolíticas aisladas de diferentes animales se basan en los principios desarrollados por Hungate (1950); con la característica de que cada autor trata de darle las condiciones nutricionales y ambientales del hábitat natural de la bacteria aislada; por lo que la técnica descrita por Hungate en 1950 ha sido modificada en muchos aspectos con la finalidad de adaptarse a las necesidades de ciertos tipos de estudio y las particularidades de cada científico (Bryant, 1972). Chakraborty et al. (2000) aisló un Cellulomonas sp del fluido intestinal de grillos utilizando la técnica del tubo rodado, repitiendo la siembra en los tubos rodados para purificar la bacteria aislada. El medio de cultivo utilizado se caracterizaba por el uso de dietil-aminoetil celulosa como fuente de carbono. En contraste, Mateo et
al. (2002) aisló una Bacteroides stercorys en cocultivo con un cocobacilo a partir de fluido ruminal fresco de un vaca, utilizando un medio de cultivo anaerobio usando aserrín como fuente de carbono y fluido ruminal. Por último, Ramin et al. (2009) aislaron Bacillus cereus, Enterobacter aerogenes y E. cloacae de los intestinos de termitas (Coptotermes curvignathus), donde las termitas se alimentaron durante una semana con papel filtro para estimular el desarrollo de las bacterias celulolíticas intestinales para después aislarlas en medio con agar y carboximetilcelulosa como fuente de carbono. Obteniendo como en el presente estudio un aislamiento de bacterias celulolíticas. Conclusiones 1. Se aislaron cuatro cocos (A, D, M, R) con tinción Gram positiva y un cocultivo (B) con tinción Gram negativa-positiva del fluido ruminal de una vaca Holsteín provista de cánula ruminal. 2. Se aisló un bacilo (C) de tinción Gram negativo del fluido ruminal de una vaca Holsteín. 3. A excepción de la bacteria B en la forma de su borde, las demás características coloniales de las bacterias aisladas son las mismas. Reconocimiento El presente estudio se realizo con recursos provenientes del proyecto CONACYTProinnova núm: 158791 titulado “Diseño y desarrollo de un nuevo sistema sustentable de alimentación para ovinos” Literatura citada Arias, J. L. 1982. Aspectos generales de la biología del rumen. Monografías de Medicina Veterinaria. 4(1):1-19. Bryant, M. P. 1972. Commentary on the Hungate technique for culture of anaerobic bacteria. The American Journal of Clinical Nutrition. 25:1324-1328. Chakraborty, N., G. M. Sarkar and S. C. Lahiri. 2000. Cellulose degrading capabilities of cellulolytic bacteria isolated from the intestinal fluids of the silver cricket. The Environmentalist. 20:9-11. Church, D. C. 1993. El Rumiante: Fisiología Digestiva y Nutrición. Zaragoza, España. Ed. Acribia. 641 p. Cobos, M. A. and M. T. Yokoyama. 1995. Clostridium paratrificum var. ruminantium: colonization and degradation of shrimp carapaces in vitro observed by scanning electron microscopy. In: Rumen Ecology Research Planning. Wallace R. J. and Lahlou-Kassi (eds). Proceedings of a wokshop held at the International Livestock Research Institute (ILRI), Addis Ababa, Ethiopia. P. 151-161. Forsberg, C. W., E. Forano and A. Chesson. 2000. Microbial adherence to the plant cell wall and enzymatic hydrolysis. In: Ruminant Physiology. Digestion,
Metabolism, Growth and Reproduction. P. B. Cronje, editor. CABI publishing. Pretoria, South Africa. P. 79-97. Hungate, R. E. 1950. The anaerobic mesophilic cellulolytic bacteria. Bacteriology Reviews. 14:1-49. Morales, M. S. and B. A. Dehority. 2009. Ionized calcium requirement of rumen cellulolytic bacteria. Journal of Dairy Science. 92(10):5079-5091 Matsui, H., T. Ban-Tokuda and M. Wakita. 2010. Detection of fiber-digesting bacteria in the ceca of ostrich using specific primer sets. Current Microbiology. 60:112-116. PSU. 1996. From Feed to Milk: Understanding Rumen Function. Extension circular 422. Pennsylvania State University. Ramin, M., A. R. Alimon and N. Abdullah. 2009. Identification of cellulolytic bacteria isolated from the termite coptotermes curvignathus (holmgren). Journal of Rapid Methods & Automation in Microbiology. 17(01):103-116. Shinkai, T. and Y. Kobayashi. 2007. Localization of ruminal cellulolytic bacteria on plant fibrous material as determined by fluorescence in situ hybridization and real-time PCR. Applied and Environmental Microbiology. 73(5):1646-1652.