Volumen 7, número 1
Investigación
CIENTIFICA
enero–julio 2013,
issn 1870–8196
Pre–eclampsia y embarazo normal: lipoproteína de baja densidad oxidada, dimetil–arginina– asimétrica y enzima óxido nítrico sintasa inducible
Juan carlos medrano rodrÍgueZ patricia Yahuaca mendoZa rosalinda gutiÉrreZ hernÁndeZ JosÉ l. alVarado acosta Unidad Académica de Medicina Humana Universidad Autónoma de Zacatecas
alvaj@uaz.edu.mx
Investigación
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CIENTIFICA
Resumen El incremento de ldlox y dimetil–arginina–asimétrica coinciden con la severidad de la pre–eclampsia, al igual que la disminución de la óxido nítrico sintasa inducible en placenta. El objetivo del artículo es evaluar la concentración de lipoproteína de baja densidad oxidada (ldlox) y dimetil–arginina–asimétrica durante la pre–eclampsia (pec) y embarazo normal, así como la presencia de óxido nítrico sintasa inducible (inos) en placenta. En el estudio se incluyeron diecinueve embarazadas normales (control) y diecinueve con pec, captadas en Tococirugía del Hospital de la Mujer Zacatecana. Durante el parto y el alumbramiento se recolectaron muestras de sangre y placenta, se calculó la media aritmética (± error estándar) e intervalos de confianza al 95 por ciento, además de análisis de varianza. Los resultados arrojaron que la ldlox (25.5 ± 1.4 nmol/l) en mujeres control no se modificó en pec leve (23.3 ± 1.4 nmol/l), mientras que incrementó hasta 28.15 ± 0.9 nmol/l y 29.54 ± 3.6 nmol/l durante la pec moderada y severa respectivamente (p=0.04). En suero de embarazadas control la adma fue de 0.49 ± 0.06 μmol/l, aumentó de forma gradual en pacientes con pre–eclampsia leve (0.53 ± 0.1 μmol/l), moderada (0.54 ± 0.1 μmol/l) y severa (0.65 ± 0.02 μmol/l). La presencia de inos en placenta de embarazadas control fue mayor en los eritrocitos; en embarazadas con pre–eclampsia moderada fue menor, por lo que se concluyó que el incremento en ldlox y dimetil–arginina–asimétrica, como también la disminución de inos en placenta, se relacionan con el grado de severidad de la pre–eclampsia. Palabras clave: pre–eclampsia, na–asimétrica.
ldlox,
dimetil–argini-
Introducción En países desarrollados, la pre–eclampsia (pec) se manifiesta entre un 7 a un 10 por ciento de los embarazos, siendo la mayor causa de morbilidad y mortalidad materna y perinatal en el mundo [1].
El Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología clasifica la pec en cuatro grupos: Grupo 0, pacientes con factores de riesgo para desarrollar pec; Grupo i, pec leve; Grupo ii, pec moderada; Grupo iii, pec severa o grave [2]. Huppertz [3] señala que la pec es un problema causado por defectos de placentación temprana, sumado a los factores constitucionales maternos. Otros expertos orientan la etiología de la disfunción endotelial a factores presentes en torrente circulatorio [4], incluyendo alteración en lipoproteínas de baja densidad oxidadas (ldlox) [5] y en dimetil–arginina–asimétrica (adma) [6]. Esta última se considera en la actualidad como un marcador biológico de disfunción endotelial [7], la cual actúa interfiriendo en la síntesis de óxido nítrico (no) por competencia con la l–arginina, sustrato de la enzima óxido nítrico sintasa (nos) [8]. Se ha sugerido que la elevación de la concentración plasmática de adma es un factor potencial que contribuye en la aparición de pre– eclampsia [9], a la vez que se asocia con disfunción endotelial en algunas mujeres [10]. Por su parte, la óxido nítrico sintasa inducible (inos), isoforma de la nos, es dependiente de endotoxinas y citoquinas proinflamatorias, expresándose en células nerviosas de la corteza cerebral sometidas a hipoxia, así como en cerebros que han sufrido agresión isquémica intensa por estrés crónico [11]. La producción de no por inos es por tiempo más prolongado y duradero, generalmente por horas o días [12]. Lee et al. [13] comunicaron la disminución de la expresión de nos en tejido placentario en aquellas embarazadas que cursaron con pec hallaron correlación entre la baja de expresión y la edad de la paciente, siendo más importante en mujeres jóvenes. Sin embargo, otros autores [14] han notificado un incremento de la expresión de nos en placentas de embarazadas que desarrollaron pec, debido, tal vez, a mecanismos de adaptación en respuesta al incremento de la resistencia vascular y disminución de la perfusión placentaria. En condiciones normales, la expresión de nos hacia el final del embarazo, tanto antes de iniciar trabajo de parto —en la obtención de la placenta por cesárea así como por parto vaginal— mostró diferencia no significativa. Schäffer et
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al. [15] indujeron hipoxia severa, in vivo, a placenta de ratones, encontraron que la expresión de nos de tipo endotelial se incrementa significativamente. No se ha aclarado la participación de ldlox en la fisiopatología de la pre–eclampsia, además de la posible relación de ésta y la dinámica en plasma de adma, al igual que la actividad de la inos en el tejido placentario, tanto en embarazo normal como en pre–eclampsia. La conjunción de los tres elementos deberá representar un aporte trascendental para el estudio de la pec. El propósito principal del estudio fue evaluar el nivel sérico de ldlox y la concentración plasmática de adma durante la pre–eclampsia y embarazo normal, en el momento mismo de la ocurrencia del parto, así como la presencia de la enzima óxido nítrico sintasa inducible en tejido placentario.
Materiales y métodos Población estudiada y muestra. El permiso para llevar a cabo este estudio transversal, comparativo y analítico fue otorgado por el Comité de Investigación del Hospital de la Mujer Zacatecana de los Servicios de Salud de Zacatecas, México. La selección de voluntarias con embarazo normal y con pre–eclampsia se apoyó en el diagnóstico clínico establecido por el personal médico de la Unidad Hospitalaria, se brindó información a las pacientes sobre la investigación y se les invitó a la firma de la carta–consentimiento para incluirse en el estudio. Una vez aceptada la participación se aplicó cédula de recolección de datos a través de entrevista directa y/o del expediente clínico. El tamaño de la muestra se determinó para población infinita o con reemplazo, para la estimación de diferencia de medias de dos poblaciones; se establecieron diecinueve embarazadas control y diecinueve con la patología. El periodo de estudio fue de junio a agosto del 2008. Obtención de muestras biológicas. Durante el trabajo de parto se obtuvieron muestras de sangre en tubos Vacutainer® con anticoagulante (edta, # cat. 368171), para 4 ml, cerrados al vacío; y un segundo tubo, sin anticoagulante (# cat. 367863), para 6 ml. Se conservaron a 4º c para su traslado y preparación. Las muestras sin anticoagulante fueron centrifugadas a
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2,000 x g, por quince minutos, mientras que las que
contenían anticoagulante se hicieron a 1,000 x g, por diez minutos; ambos procedimientos a 4º c. El suero y plasma respectivos fueron separados en alícuotas de 0.5 ml y conservados a –70º c, hasta su procesamiento final. Inmediatamente a la expulsión de la placenta se tomó una muestra de tejido de 1x1x0.5 cm, el cual fue depositado en solución de formaldehído al 10 por ciento. Técnicas de laboratorio. ldlox. El suero fue precipitado para conseguir el complejo inmune, se combinaron volúmenes 1:1 de suero con polietilenglicol 6,000 (peg) al 5 por ciento; se incubó en baño maría a 18º c por dieciocho horas, sedimentado por centrifugado a 6,000 rpm durante treinta minutos; se lavó tres veces consecutivas con peg al 2.5 por ciento; se resuspendió el precipitado en 10μl del reactivo de colesterol, spinreact®, incubando por 5 minutos a temperatura ambiente; la lectura se realizó en espectrofotómetro a 505 nm. adma. La determinación de la concentración plasmática de adma se efectuó mediante técnica de elisa, equipo proveído por alpo diagnostics® (número catálogo 30–7814, Frankfurt, Alemania). Se utilizó lector de placas stat fax® 2100 (Awareness Technology, Inc. Miami fl. u.s.a.) para hallar la densidad óptica y concentración, a 450 nm contra 620 nm. inos. Una vez obtenida la placenta se procedió a cortar un fragmento de 1x1x0.4 cm, se depositó en formaldehído al 10 por ciento, fue incluido en parafina, se hicieron cortes de 5 µm, se fijó el tejido con silano en el porta objetos, se lavó con solución pbs (7.2 ph) por dos minutos, se sumergió en agua oxigenada al 3 por ciento con metanol por quince minutos, se volvió a lavar con pbs, se cubrió el tejido con suero de cerdo (rockland, Código d305, lote #421) al 10 por ciento con solución pbs estéril, por treinta minutos, se lavó nuevamente con pbs, se cubrió el tejido con solución conteniendo anticuerpos anti–inos (calbiochem, Cat. No. 48–2728, anti–inos Rabbit pab), dilución 1:500 con solución pbs estéril, se volvió a lavar con pbs, se cubrió el tejido con streptavidin–fluoresceína (calbiochem, cat. No. 189734), dilución 1:100 con solución pbs estéril, por treinta minutos, se protegió de la luz y se lavó nuevamente. La presencia de inos se visualizó por
Investigación
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CIENTIFICA Resultados
medio de microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss), todo el procedimiento se realizó a temperatura ambiente. Análisis de datos. Para las variables no categóricas se calculó promedio (± error estándar), con intervalo de confianza del 95 por ciento, además de análisis de varianza, con p ≤ 0.05, por medio del programa statgraphics plus 5.1.
Según la clasificación del Colegio Americano de Ginecología y Obstetricia [2], el grupo de embarazadas con pec se subdividió en tres categorías: 6 leve, 8 moderada y 5 severa. Con relación a la edad es evidente la homogeneidad entre los grupos, no existen diferencias importantes, al igual que el número de consultas prenatales recibidas. Respecto a
tabla 1 caracterÍsticas
generales de embaraZadas control
Y grupos de muJeres Que desarrollaron la patologÍa
Características
Grupos con PEC
Control Media
Edad
25
Leve
ic95%
(22–28)
Media 26
moderada ic95%
(22–29)
Media 25
Severa
ic95%
(21–29)
Media 22
ic95%
(18–26)
pam
Diagnóstico pec
87
(83–91)
107
(103–111)
115
(113–117)
127
(122–132)
Ingreso estudio
87
(83–91)
107
(103–111)
110
(104–110)
116
(109–123)
imc
Inicio embarazo
24
(22–26)
25
(22–28)
28
(22–37)
25
(22–28)
Final embarazo
28
(26–30)
30
(29–31)
30
(26–34)
31
(26–36)
(155–163)
158
(151–165)
Estatura C. Prenatales
160 7
No.
(157–163)
153
(6–8) %
6
No.
(150–156) (5–7)
159 8
%
No.
(6–10) %
7
No.
(6–8) %
Escolaridad Primaria
8
42
2
33
2
25
2
40
Secundaria
8
42
2
33
4
50
1
20
2
40
Preparatoria
3
16
1
17
2
25
Profesional
–
–
1
17
–
–
19
100
6
100
8
100
5
100
Solteras
2
11
2
33
4
50
1
20
Casadas
13
68
3
50
2
25
3
60
Unión libre
4
21
1
17
2
25
1
20
Total
19
100
6
100
8
100
5
100
Hogar
19
100
6
100
7
88
4
80
Total
–
–
Estado civil
Ocupación Estudiante
–
–
–
–
1
12
1
20
Total
19
100
6
100
8
100
5
100
pec= Pre–eclampsia; ic 95%= Intervalo al 95% de confianza; pam= Presión arterial media; imc= Índice de masa corporal; c= consultas prenatales.
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Figura 1. Concentración de ldlox en suero, entre embarazadas control y las que desarrollaron la patología, * p < 0.05.
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5
Figura 2. Concentración de colesterol en plasma, entre embarazadas control y las que desarrollaron la patología, * p < 0.05. % 35
incremento
la estatura, las embarazadas sin pec se distinguen del primer grupo de pre–eclámpticas, las cuales registraron un promedio menor (tabla 1). En el estudio de la presión arterial media (pam), las cifras fueron obtenidas durante el diagnóstico de pec y al momento de ingreso al estudio. Se encontró divergencia significativa entre el grupo de embarazadas sin pec y las que desarrollaron la enfermedad, en ambos momentos de la toma de presión arterial (tabla 1). El índice de masa corporal (imc) registrado entre los grupos, al inicio del embarazo, no mostró diferencias significativas, sin embargo, al concluir el embarazo el imc se modificó entre las mujeres con embarazo normal y el grupo de pec leve (tabla 1); es relevante destacar que once de las diecinueve embarazadas con pec concluyeron el periodo gestacional clasificadas en el rubro de obesidad. Lipoproteína de baja densidad oxidada. La concentración elevada de ldlox constituye uno de los mayores factores de riesgo para la ateroesclerosis, relacionado con el alto nivel de colesterol en sangre. Los resultados manifiestan desemejanzas estadísticamente significativas (anoVa, p < 0.5) entre los distintos grupos, siendo más evidente entre el grupo sin pec y el de pec moderada, el de pec leve y moderada, así como pec leve y severa; la ldlox incrementó según el grado de desarrollo de la pec (figura 1). Similar tendencia de incremento mostró la concentración de colesterol en plasma, con diferencia significativa (anoVa, p < 0.5) entre las mujeres sin pec y las de pec severa (figura 2).
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32,65%
30 25 20 15 8,16%
10 5 0
10,2%
(0.490 µmol/L)
CONTROL
PEC LEVE
PEC MODERADA
PEC SEVERA
GRUPOS DE EMBARAZADAS
Figura 3. Porcentaje del incremento de la concentración de adma en plasmaen mujeres embarazadas que desarrollaron pec, tomando como fundamento la concentración del grupo control.
Dimetil arginina asimétrica. La concentración de este compuesto se evaluó en plasma. Se distribuyeron los grupos de embarazadas de la misma manera que para el análisis de las variables anteriores. Es notable el incremento de la concentración del compuesto en plasma, según la pertenencia a cada grupo de pre–eclámpticas, siendo mayor en el grupo de mujeres con pec severa (figura 3). Estadísticamente no se encontró diferencia significativa entre los grupos comparados. Óxido nítrico sintasa inducible (inos) en placenta. Los cortes histológicos de placenta fueron analizados con base en la captación de fluoresceína. La captación del compuesto fue más notable en el citosol de los eritrocitos, principalmente en embarazadas control, comparada con embarazadas con pec leve, las cuales también indicaron menor captación en la capa más interna de los vasos (figura 4, panel a y b); esto representó menor presencia de la enzima.
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a.
Control
10x
b. pec
leve
10x
c. pec
moderada
d. pec
severa
Figura 4. Cortes histológicos de tejido placentario, marcados con fluoresceína, con diferente nivel de captación del compuesto, a nivel eritrocitario y tejido endotelial. Panel a) Embarazada control, eritrocitos con fluoresceína y halo endotelial (flechas amarillas); b) pre–eclámptica leve, eritrocitos con el compuesto y halo endotelial, en menor grado que embarazada sin pec (flechas rojas); c) pec moderada, menor captación eritrocitos y reducción halo endotelial (flechas azul); d) pec severa, mayor reducción de captación del compuesto por los eritrocitos, así como mayor captación en las capas vasculares más internas, único caso con estas características (flechas blancas).
Según la gravedad de la pre–eclampsia la captación de fluoresceína fue menor, tanto en eritrocitos como en la capa interna de los vasos (figura 4, panel c); sólo una embarazada con pec severa reveló mayor presencia del compuesto, principalmente en la capa más interna de los vasos, lo que denota mayor presencia de la enzima.
Discusión y conclusiones Diversos investigadores [5, 16, 17, 18, 19] han vinculado la dislipidemia, la obesidad y el aumento de los niveles de colesterol con el desarrollo de pre–eclampsia, también se atribuye a esos factores
el incremento de ldlox [20, 21, 22]. La concentración de ldlox registrada en suero en los distintos grupos de pre–eclámpticas, el nivel de dimetil– arginina–asimétrica en plasma y la presencia de inos en tejido placentario parecen ser elementos directamente involucrados en la fisiopatología de la pre–eclampsia; es evidente el incremento de los dos primeros compuestos según el estadio de la pre–eclampsia, así como la disminución de la inos respecto a la gravedad de la patología. La trascendencia de lo anterior estriba en la relación establecida entre los niveles de ldlox y la concentración de dimetil–arginina–asimétrica, debido al aumento directamente proporcional entre ambos compuestos; asimismo, se han aportando elementos hacia
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la acción inhibidora de la adma para la producción de no [23]. A la adma se le atribuye un papel fisiológico durante el embarazo normal, debido a la disminución de la concentración plasmática, lo que genera vasodilatación [24]. Sin embargo, en la pre–eclampsia parece que se invierte la función, ya que hay un incremento en la concentración plasmática del compuesto; esto constituye un posible elemento generador de la vasoconstricción durante la pre–eclampsia y, como consecuencia, un aumento en las cifras de presión arterial sistémica, causada por la inhibición de la síntesis de óxido nítrico. Sumado a ello se encuentra la reducción de la inos en tejido proveniente de placenta. La síntesis de no es importante para la hipertensión inducida por el embarazo. Las distintas isoformas de nos se han estudiado de manera parcial respecto a la pec, la inos estaba involucrada en la fisiopatología de la enfermedad. Los factores que incrementan la actividad de la inos son los estímulos inmunológicos o inflamatorios, hay dependencia a partir de la presencia de endotoxinas y citoquinas, elementos mencionados en las distintas propuestas teóricas sobre la pec [25]. Otros autores [11, 12] señalan que esa isoforma se encuentra en macrófagos y tejido endotelial, pero no existen referencias de que se presente en el citosol de eritrocito; hallazgo relevante en este trabajo, ya que la disminución de la inos es más intensa según el grado de gravedad de la pre–eclampsia, por consecuencia es más evidente la disminución en la pec severa. La escasa información relativa a la participación de la inos en la fisiología del embarazo normal y la fisiopatología durante la pre–eclampsia, manifiesta la relevancia de los resultados obtenidos a través de determinar la presencia de la enzima por medio de inmunofluorescencia. En conclusión, es posible que haya relación directa entre la elevación de la ldlox y dimetil–arginina–asimétrica en la pre– eclampsia; se encontró una concordancia franca con la severidad de la patología, además se mostró una relación paralela con las cifras de presión arterial diastólica en el grupo de pre–eclámpticas. Si se consideran los parámetros estudiados como marcadores de daño endotelial, agregando la disminución de la inos en tejido placentario, serían factores
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determinantes en la elevación de la presión arterial durante el embarazo. Puede verse a los marcadores biológicos analizados como predictores de la patología, por lo que en futuros estudios deberá pensarse en incluirlos, antes del embarazo y en su desarrollo; además del periodo del puerperio tardío, por la posibilidad de desarrollar hipertensión arterial en forma crónica. De la misma manera, deben cuantificarse durante y posterior a la pre–eclampsia, lo cual contribuirá al conocimiento sobre la fisiopatología de la enfermedad. Se agradece a Manuel Presno Bernal y Oscar Pérez Veyna por sus valiosas aportaciones en Histología y Bioestadística, respectivamente. Al Gobierno del Estado de Zacatecas por el apoyo financiero, a través de proderic–2007–2, al Hospital de la Mujer Zacatecana por la autorización, a través de su Comité de Investigación, para la realización del estudio y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología.
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Investigación
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