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Manutenção de cepas para controle de qualidade em microbiologia clinica Carmen Paz Oplustil Agosto 2011 carmen.oplustil@formatoclinico.com.br

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Objetivo • Manter as diversas cepas para o controle de qualidade interno de forma segura para garantir a qualidade dos processos.

Tipos de Cepas vamos manter • Cepas de coleções conhecidas de referência • Cepas isoladas no laboratório • Cepas recebidas como controle externo da qualidade

Muitos nomes, mesmo significado • • • • • • •

Culturas padrão Cepas padrão ATCC Cepas controle Cepas de referência Culturas de referência Cepas de teste Cepas de controle de qualidade

Cepas da rotina

Manutenção de cepas por curto período de tempo •

Meios mais utilizados para a manutenção: Tryptic Soy Broth (TSB), caldos nutrientes (BHI, Brucella) ou somente água destilada estéril, podendo ou não conter crioprotetores.

•

Subcultivos periódicos - Cepas de enterobactérias, Staphylococcus spp. e Enterococcus spp. se mantém viáveis por este método por aproximadamente 6 meses Óleo mineral estéril – associado a um meio Freezer - 20°C – meio é importante Disco de papel-filtro estéril – fungos e bactérias esporuladas Água mineral sem gás estéril – Microrganismos como Legionella spp e bacilos gram-negativos não fermentadores, preservam bem nessas condições por aproximadamente 1 ano Solução fisiológica estéril - Cepas de EPEC, EIEC, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. empregadas no controle de qualidade dos antisoros

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Manutenção de cepas por longos períodos de tempo • Liofilização • Temperaturas ultra-baixas • Crioprotetores – glicerol e DMSO, 5 -10% v/v do meio

Tabela 29.1 – Procedimentos utilizados para a manutenção de microrganismos.

Microrganismos

Métodos de estocagem

Crioprotetores

Temperatura de estocagem

Tempo aproximado de preservação do

Freezer

Glicerol ou skim milk

– 20°C

1 - 3 anos

Freezer

Skim milk, glicerol

– 70 a –196°C

1 a 30 anos

Liofilização

Skim milk

2 a 8°C

30 anos

Subcultivos

Nenhum

2 a 8°C

2 a 3 meses

Freezer

Glicose

– 20°C

1 a 2 anos

Freezer

Skim milk, glicose

– 70 a –196°C

3 a 30 anos

Liofilização

Skim milk + lactose

2 a 8°C

30 anos

Freezer

Skim milk

– 20°C

2 meses

Freezer

Skim milk

– 70 a –196°C

2 meses a 1ano

Liofilização

Skim milk

2 a 8°C

6 meses a 30 anos

Freezer

Skim milk

– 20°C

3 a 5 anos

Freezer

Skim milk

– 70 a –196°C

3 a 5 anos

Liofilização

Skim milk

2 a 8°C

16 a 30 anos

Freezer

Sacarose, lactose

– 20°C

1-2 anos

Freezer

Sacarose, lactose, glicerol ou skim milk

– 70 a –196°C

2 a 30 anos

Liofilização

Skim milk, lactose, sacarose

2 a 8°C

30 anos

Subcultivo

Nenhum

TA

1-3 meses

Leveduras

Água destilada

Nenhum

TA

1-2 anos

Fungo filamentoso

Subcultivo

Nenhum

4 a 25°C

2 a 10 anos

Freezer

Glicerol, DMSO

–70 a –196°C

2 a 30 anos

Liofilização (formadores de esporos)

Glicerol, DMSO, sacarose, skim milk

2 a 8°C

2 a 30 anos

microrganismo Bactérias gram-positivas

Bactérias esporuladas

Streptococcus

Mycobacterium

Bactérias gram-negativas

Adaptada de: PETTI, CA. Procedures for the Storage of Microrganisms. In: Manual of Clinical Microbiology / editor in chief, Patrick R. Murray; editors, Ellen Jo Baron[et al], 9th Edition, v. 1, 2007. DMSO = dimetil-sulfóxido; TA = temperatura ambient

Livro: Procedimentos básicos em Microbiologia Clínica 3ed. 2010

Cepas de referência • As mais conhecidas são as cepas ATCC (American Type Culture Collection)

Apresentação das cepas de referência • Em swab • Liofilizados

Manuseio das cepas Definições • Cepas ATCC – subcultivadas para criar as culturas de estoque • Culturas de estoque são subcultivadas para criar as culturas de trabalho • Culturas de trabalho são mantidas em tubos com meio de cultura para os testes do dia a dia • Subcultura – é 1 passagem • Passagem – transferência de bactérias de uma cultura fresca para um novo meio de cultura. Cada transferência é um subcultivo que corresponde a uma passagem

Manuseio das cepas Definições • Uma passagem é definida como o crescimento do microrganismo em meio de cultura sólido ou líquido.

• Ressuscitar um microrganismo congelado ou liofilizado por descongelamento ou hidratação não é considerado uma passagem.

• Subcultivar um microrganismo ATCC congelado ou liofilizado para fazer a cultura estoque é considerado a primeira passagem.

• Subcultivar esta cultura de estoque é considerada a segunda passagem • Subcultivos subsequentes são consideradas passagens.

Esquema de manuseio das cepas de ReferĂŞncia

1 passagem

0 passagem 3 passagem

2 passagem 2 passagem 3 passagem

4 passagem

2 passagem

Microbiologics

1 geração

2 geração

3 geração

4 geração

Importante • ATCC recomenda que as cepas sejam utilizadas atÊ 5 passagens a partir da cepa ATCC.

Empresas com licença para comercializar cepas ATCC • www.atcc.org • Microbiologics (PlastLabor)

Pontos importantes • Cepas ATCC comercializadas por empresas que não a própria ATCC estão em geral, a 1 ou 2 passagens da cepa de referência.

• Verificar cuidadosamente a bula do produto adquirido.

• Sempre verificar se a cepa adquirida é da ATCC • Não existe “similar a ATCC” como sendo ATCC.

Outras cepas de referĂŞncia www.ukcc.co.uk

www.wfcc.info

DĂşvidas ?

Obrigada pela oportunidade!

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