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ISSN 2145-5562

Criadero La Caprichosa OPU en yeguas Clonaci贸n equina

Abril - Junio 2010

$17.500

Transferencia de embriones

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SUMARIO Edición N° 1 Abril - Junio 2010 ISSN 2145 - 5562 Edición: Santacruz Editores E.U. NIT: 900 130 461 - 4 Avda Cra 72 N° 152B-90 Int. 2 Apto. 902 Teléfono 3562713 - 310-8692372 geneticaequina.fer@gmail.com Bogotá - Colombia

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PUNTO DE VISTA

Transferir tecnología

Director Fernando Santacruz Hoyos

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COMERCIAL

Exago, lo último en tecnología digital para ecografías

Colaboración Técnica Criadero La Caprichosa Edward Orjuela José Córdoba.

ViaGen

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INSEMINACION ARTIFICIAL

Respuestas inmunológicas al espermatozoide en el tracto genital de la hembra

Claudia Jiménez Escobar Universidad Nacional de Colombia Carlos Danilo Blanco Saleme.

Médico Veterinario, DMV Angela María Mariño Anicam Enterprises INC Fotografía Portada La Caprichosa de Gualanday Fernando Santacruz Hoyos

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TÉCNICAS

Aspiración folicular en yeguas

Fotografías Internas Margarita Nieva Santacruz Fernando Santacruz Hoyos Jaime Ramírez Diseño y Diagramación Gabriel Andrés Gonzalez Hernán Alejandro Carreño Tel. 316 4151374 - 311 8731614

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BIOTECNOLOGÍA

Clonación de equinos

Preprensa e Impresión Cargraphics. S.A. Red de Impresión Digital Comercialización Santacruz Editores E.U. 3562713 - 310 8692372 geneticaequina.fer@gmail.com Bogotá – Colombia

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BIOTECNOLOGÍA

Transferencia de embriones en equinos

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PORTADA

Criadero La Caprichosa

Reg. ICA No 003 DB

El poder del desempeño

Mayor vitalidad y rendimiento.

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PUNTO DE VISTA

Transferir tecnología

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olombia goza del reconocimiento internacional dentro del mundo equino por contar con una serie de razas especializadas que varias veces han conseguido títulos mundiales, y hoy por hoy, nuestros ejemplares son los más buscados por caballistas para conformar sus núcleos genéticos ó para implementar programas de mejoramiento genético, dentro y fuera del país.

En ningún otro sector como el de los caballos la genética cuenta más que cualquier cosa. El origen de la sangre del animal es la clave para el éxito o para el fracaso. A su vez, los avances tecnológicos cada vez están más al alcance de la mano de todos, lo que permite difundir sus genes de forma más segura.

Por esto, el fascinante mundo de los caballos cuenta desde ahora con la revista Genética Equina Colombiana, publicación especializada cuyo objetivo será actualizar a los médicos veterinarios y caballistas, a través de artículos técnicos, los últimos avances en materia genética que se aplican en Colombia como transferencia de embriones, aspiración folicular, producción In vitro de embriones, semen sexado, clonación, entre otros, cubriendo una sentida necesidad dentro del gremio, ante la falta de información profunda de este tipo.

Como complemento a la información técnica, en cada edición de la revista Genética Equina Colombiana, se incluirán reportajes especiales con los principales criaderos de caballos del país, para conocer sus animales más destacados y saber mediante qué herramientas genéticas alcanzaron su desarrollo y posicionamiento en el mercado.

De esta manera Genética Equina Colombiana será una nueva alternativa editorial y comercial para difundir y promocionar los mejores caballos de todas las modalidades, pues la idea es cubrir todo el mercado especializado que se maneja en el país. De igual manera será una nueva alternativa comercial para que la creciente industria farmacéutica involucrada en este importante renglón económico, dé a conocer sus productos y servicios.

Este nuevo proyecto de Santacruz Editores no hubiese visto la luz sin la participación incondicional de amigos como Iván Darío López, Leonardo Escobar, Fabio Gallego, Carlos Julio Mayorga, Hernán Mauricio Giraldo, Jesús Hernando Ramos, Juan Carlos García, Juan Pablo Muriel y Edward Orjuela. A ellos mi total y profundo agradecimiento.

Fernando Santacruz Hoyos Director Genética Equina Colombiana geneticaequina.fer@gmail.com

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SANTACRUZ Editores

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INSEMINACIÓN ARTIFICIAL

Respuestas inmunológicas al espermatozoide en el tracto genital de la hembra La inseminación debe ser considerada como el inicio de la comunicación con el organismo femenino que permite el éxito del embarazo óptimo.

Jesús H Ramos DMV. Msc(c) hramosvet°hotmail.com

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uando los espermatozoides, el plasma seminal y diluyente llegan al útero e interactúan con los leucocitos y las células locales del endometrio, varios mecanismos inmunes se inician con efectos inmediatos, de mediano y largo plazo sobre la ovulación, la selección de células de esperma, la fertilización y el embarazo, asegurando el éxito de la aceptación de los tejidos del feto. Este artículo ofrece una visión general sobre la clave pertinente de los siguientes mecanismos inmunológicos aproximadamente al tiempo después de la inseminación. El conocimiento detallado acerca de estos mecanismos maximiza la eficiencia reproductiva en la producción ganadera.

En el futuro, las muchas especies involucradas requerirán un enfoque más comparativo, puesto que la evidencia es cada vez mayor que la fisiología del endometrio y la respuesta a diferentes cantidades y composiciones de plasma seminal, diluyentes de semen diferente, y un número variable de espermatozoides también provocan diferentes respuestas inmunológicas.

Dependiendo de la especie, variando de la cantidad del eyaculado a llegar al lumen uterino directa o indirectamente, después de pasar por el cuello del útero, el contacto con el semen de los reproductores, los tejidos de útero y cuello uterino se inducen una serie de reacciones y mecanismos inmunológi-

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Genética Equina Colombiana

cos. Dado que el semen es en muchos aspectos un material extraño para el organismo femenino, parece lógico interpretar muchas de las respuestas inmunes como acciones encaminadas a la eliminación de material extraño. Las primeras reacciones inmunitarias tienen una influencia en la proceso de la ovulación, y los acontecimientos posteriores están involucrados en la selección de espermatozoides, la inducción y mantenimiento de la tolerancia inmunológica hacia el origen antigénico paterno, la reestructuración del tejido del endometrio para la implantación y placentación, y por último pero no menos importante, la participación activa apoyo inmunológico de los tejidos del feto durante el embarazo. Por lo tanto, la inseminación debe ser considerada como el inicio de la comunicación con el organismo femenino que permite el éxito del embarazo óptimo.

Efectos inmediatos de la deposición del semen Influencia en el proceso de ovulación del plasma seminal a la hora estimada es en las hembras un número importante de horas. En un modelo quirúrgico en la cual el semen tenía acceso a sólo uno de los cuernos uterinos, una acelerada ovulación se pudo demostrar en el lado infundido, sin influencia detectable sobre el otro ovario.

Dado que el proceso de la ovulación se ha comparado con un reacción inflamatoria que incluye la infiltración de

diferentes poblaciones de leucocitos en y a través de la tejidos de los folículos de Graaf maduros, se ha especulado que el plasma seminal podría inducir el tráfico de las poblaciones de leucocitos de los tejidos del útero y ovario a la migración de los leucocitos que pueden actuar como vectores entre los diversos componentes de la reproducción del sistema. El plasma seminal induce cambios en las poblaciones de células mucosas del útero. Estas diferencias también fueron evidentes entre muestras endometriales de los cuernos uterinos y la unión útero-tubárica.

El mecanismo y la vía de la transferencia de señal del útero con el ovario son esencialmente desconocidos. Señales podría ser implicaciones de citoquinas inducidas a nivel local como factor de neutrofilos y macrófagos estimulantes de colonias, ya sea por las células epiteliales o de otro tipo células presentes en el útero. Estos mediadores pueden llegar al estroma ovárico y de los folículos preovulatorios y se unen a los receptores expresados en la superficie de las células de ovario.

La ruta fisiológica de la información humoral derivados de las células activadas o factor seminal podría ser a través de los conductos linfáticos y una transferencia a contra corriente del sistema de la vena a la arteria uterina útero-ovárico y así el ovario pre-ovulatoria. Éste es similar a la ruta de desplazamiento local como para el útero luteolysin (PGF2a) para el cuerpo lúteo ipsilateral.

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INSEMINACIÓN ARTIFICIAL Interacción con los leucocitos Las células endometriales al igual que sistemas como el digestivo y el tracto respiratorio, el útero tiene características de una mucosa asociada al tejido linfoide, sin embargo, el útero está sujeto a cambios cíclicos. Estos cambios afectan principalmente el endometrio, pero también a los leucocitos en el endometrio y en el lumen uterino. Mientras que los linfocitos predominan en el endometrio durante la primera y mitad de los estadios del ciclo estral, la cuestión cambia hacia finales del estro, causan una migración masiva de neutrófilos en el estroma subepitelial.

Estas poblaciones celulares pueden variar considerablemente en términos del número y de las subpoblaciones. En el útero se observa antes de la ovulación y puede contener entre 0 y 270 leucocitos, con variables fracciones de las células monocitos y neutrofilos. Aunque sería una suposición razonable, todavía no está claro si estos leucocitos son significativamente involucrados en la señalización inducida por la inseminación. El útero y las células del cuello uterino en contacto con los componentes del semen se activan para sintetizar y para liberar citoquinas, quimioquinas y otros mediadores que en conjunto orquestan la respuesta celular.

La expresión de citoquinas en el endometrio tiene que ser visto como parte de la respuesta inflamatoria al esperma, con una participación en el reclutamiento de leucocitos.

Efectos a mediano y largo plazo del esperma La afluencia de neutrofilos La dinámica celular que se inducen en el tracto genital femenino después de la inseminación se resume como la respuesta de la post-inflamación

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Genética Equina Colombiana

de apareamiento, que se aplica a una amplia variedad de especies de mamíferos. La característica dominante de éste a la respuesta es un flujo de neutrófilos en el lumen del útero, que culmina entre 1 y 12 h después del apareamiento o inseminación.

En las yeguas, un número elevado de leucocitos se observaron incluso hasta 48 h después de la inseminación.

Además los factores moleculares que activan el flujo, la inseminación con cualquier tipo de líquido o de intensificación de la preparación de la afluencia de los neutrófilos en el útero de las hembras. Esto plantea la cuestión de si la inmigración de neutrófilos es solo la consecuencia de la irritación de la mucosa endometrial. El ingrediente plasma seminal, espermatozoides y diluyente participan en la regulación de la afluencia. Por otra parte, la fisiológica situación de la mujer determina la capacidad de respuesta de los tejidos del endometrio frente a los componentes de la inseminación.

El papel del plasma seminal Hay pruebas claras de que la respuesta está mediada por el plasma seminal, y que los espermatozoides desempeñan un papel insignificante. El principio disparador en el plasma seminal parece ser una citoquina. Está muy presente en fluidos seminales en varones una forma precursora latente y se activa en el tracto reproductivo por la plasmina y otras enzimas después inseminación.

Los eicosanoides, como la prostaglandina E2 (PGE2) e interleucina-8, el agente quimiotáctico para los más fuertes neutrófilos, también están presentes en los fluidos seminales de varios, pero no todas, las especies de mamíferos. Cuando los componentes de esta sinergia existen, los efectos se basan en la inducción de citoquinas del endometrio. Los efectos del plasma seminal (con o sin espermatozoides) se reflejan parcialmente por un menor, pero todavía regulación al alza significativa de la interleucina-8 en comparación con el diluyente solo.

También válidos por la transmigración, que plasma seminal con eficacia bloquearon la interleucina-8-inducida y quimiotaxis de neutrófilos. Sin embargo, parece que el efecto del plasma seminal fue más debido a la fuerte inducción por la aglutinación de los neutrófilos que dificulta la migración.

El papel de los espermatozoides y diluyente Inseminar espermatozoides lavados con diluyente inducen una mayor afluencia de neutrófilos que la inseminación de los espermatozoides con plasma seminal y plasma seminal solo. En yeguas, la afluencia inducida por los espermatozoides puede ser tan fuerte como una afluencia bacteriana.

Por otra parte, un alto grado de espermatozoides dañados en la membrana favorece la migración de neutrófilos en humanos y equinos in vitro. Los espermatozoides en sí no son quimiotácticos, inducen quimiotaxis de neutrófilos en vivo, muy probablemente por señalización mediante la unión a las células del endometrio y / o presentar leucocitos. Debido a la variedad de composiciones del diluyente, la influencia sobre la migración de neutrófilos no se puede generalizar. In vitro, la leche descremada con yema de huevo que se utiliza para diluir el semen fresco de caballo, fue fuertemente quimiotáctico para neutrófilos equinos in vitro y resultó en una significativa migración de los neutrófilos en el útero in vivo. Uno de los diluyentes de semen utilizados para semen de verraco (AndrohepTM) inhibió la migración de neutrófilos porcinos in vitro, mientras que causó una afluencia masiva y superior de neutrófilos en comparación con el plasma seminal, que también parece ser independiente de la presencia o ausencia de espermatozoides.

En conjunto, las matrices de componentes seminales activos, espermatozoides dañados y viables, y diluyente actúa en conjunto para inducir y modular principios y mitad de período la respuesta inmune en el tracto genital femenino.

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El papel fisiológico de los neutrófilos Fagocitosis Los neutrófilos son las células fagocíticas, y por lo tanto su papel en el útero se ha reducido de alguna manera a esta función que es necesario para limpiar el medio ambiente después de inseminación. Esto se aplica a aparecer accidentalmente microorganismos en el lumen uterino normalmente estéril, y restos de espermatozoides. Definitivamente la hipótesis de que la edad, espermatozoides muertos o capacitados son preferentemente el blanco de neutrófilos. Esto estaría de acuerdo con la sugerencia de que los neutrófilos participan en la selección de espermatozoides, la eliminación de flujo, los espermatozoides que no tienen movilidad o están dañados. La fagocitosis de células es un proceso selectivo o aleatorio sigue siendo cuestionable.

En ausencia de factores de opsonización (Anticuerpos, complemento), no se observó ninguna fagocitosis por los neutrófilos de espermatozoides porcinos in vitro. Además, los estudios con fluorocromos indicando la viabilidad y motilidad de los espermatozoides indicó que preferentemente las células de espermatozoides viables con potencial de membrana mitocondrial intacta obligado a neutrófilos porcinos in vitro. Este contacto, que podrán reflejar un evento selectivo para ciertas subpoblaciones de espermatozoides también parece ser transitorio. Así, el papel fagocítico de los neutrófilos puede no ser dominante, al menos en la fase inicial después de su aparición en el lumen uterino. Por otra parte, el plasma seminal inhibe significativamente esta función.

Decisión de las células inmunes Los neutrófilos son importantes para contribuir a la contratación, la activación y programación de antígeno de células presentadoras. Los neutrófilos producen quimiotaxis y señales que

atraen a los monocitos y las células dendríticas e influyen en que los macrófagos se diferencian para un predominantemente estado pre o antiinflamatorios. Los neutrófilos secretan menos moléculas de un dado que los macrófagos de citoquinas o linfocitos, neutrófilos, pero a menudo superan en número a los leucocitos mononucleares en los sitios de inflamación, y por lo tanto puede ser una fuente importante de citoquinas. La activación de células T, que es importante para los procesos inflamatorios o la inducción de tolerancia inmunológica, es también más probable guiado por la influencia del plasma seminal. Por ejemplo, la supresión de neutrofilos genera intermediarios reactivos del oxígeno (ROI) y podría atenuar el daño tisular.

Los espermatozoides de selección de células Las interacciones entre los espermatozoides y neutrofilos se han descrito en varias especies, como los cerdos, caballos, rumiantes y los humanos. Se estudiaron principalmente bajo el aspecto de la fagocitosis de espermatozoides y la regulación de este proceso.

Aunque los factores del complemento, antiespermáticos naturales anticuerpos o interacción de proteínas carbohidratos se han sugerido a este respecto, que quedó claro que las moléculas de superficie o esperma y los residuos son reconocidos por neutrófilos, o si la interacción entre ambos tipos de células es debido a la adherencia al azar. En condiciones naturales, cuando los espermatozoides llegan al útero, una mediada por proceso de neutrófilos es selectivo no podrá ser muy pertinentes. Sin embargo, nuevas técnicas de inseminación requieren dosis bajas de esperma y reducen considerablemente la dosis para la YA. Las técnicas de IA así han logrado a la medida alcanzar índices satisfactorios de fertilidad en tales condiciones. Los espermatozoides se entregan cerca o directamente en el oviducto, las tasas de embarazo mejorar considerablemente. Esto justifica que una

más estrecha interacción de esperma con el ambiente uterino y los procesos de selección posible.

En un estudio reciente, se informó que principalmente la membrana intacta de los espermatozoides interactuaban con polimorfonucleares granulocitos (PMN), mientras que la membrana dañada de células de esperma apenas no aparece ningún enlace a PMN. Sin embargo, aproximadamente una tercera parte de los espermatozoides con la membrana intacta, lo que indica que sólo integridad de la membrana puede ser uno de las características clave en las interacciones PMN de espermatozoides. La ausencia de cualquier muestra de suero o de líquido uterino y sus componentes sugirió que el contacto entre los espermatozoides viables y PMN fue directamente mediada por la superficie de la membrana. Interacciones proteína-hidratos de carbono parecía la condición, ya que tanto los espermatozoides, así como PMN lectinas utilizadas como una forma directa de comunicarse con su medio ambiente.

El significado biológico de las interacciones entre espermatozoides intactos con neutrófilos es todavía bastante especulativo. Una de las razones más obvias para interacciones PMN espermatozoides-sería el inicio de la fagocitosis de espermatozoides. Esto podría representar un proceso de selección negativa que incluya subconjuntos de viables de los espermatozoides que carecen de la capacidad de incorporarse a los las células epiteliales y por lo tanto no se consideran aptos para la fertilización.

La activación de la tolerancia inmune y remodelación tisular En cuanto a las necesidades durante la implantación, el desarrollo de las células del trofoblasto fetal y, finalmente, el embarazo, es obvio que potencialmente difieren mecanismos inmunes materno contra paternalmente epítopos antigénicos SANTACRUZ Editores

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INSEMINACIÓN ARTIFICIAL

La inseminación es seguida en muchas especies por la atracción y la activación de células inmunes

10 Genética

Equina Colombiana

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derivados y deben ser controlados.

La tolerancia inmunológica término que se aplica a complejos mecanismos, que van desde la inducción y apoptosis a la inducción activa de una variedad de células T reguladoras. Lo más importante parece ser un cambio de un tipo de reacción pre-inflamatorias dentro de los tejidos del útero hacia un estado anti-inflamatorio. Una vez más los ingredientes de plasma seminal, así como con el aumento de las concentraciones de progesterona, desempeñan un papel decisivo en este período. Si factores de esta citoquina, son regulados a la baja en la tarde las fases posteriores a la inseminación, favorece la generación de células T antígeno-específicas regionales en los ganglios linfáticos de drenaje.

Por lo tanto, la contratación de semen inducida por los macrófagos y las células dendríticas en el tejido del estroma endometrial sirve al menos una doble función. En primer lugar, la incorporación de material extraño por estas células presentadoras de antígeno es obligatoria para la generación de antígeno específico paterno.

En segundo lugar, en etapas posteriores, estas células inducida por el antígeno específico de células T reguladoras y hay pruebas irrefutables de que el plasma seminal tiene un papel muy importante en la iniciación de estos eventos. Por otra parte, los experimentos en roedores y cerdos con claridad demostraron que el plasma seminal de los efectos inducidos por (Expresión de citoquinas, la producción de eicosanoides) persistieron durante el embarazo temprano y tuvo efectos positivos en el desarrollo del embrión, se manifestaron como un aumento del número de embriones y en su viabilidad después del tratamiento con plasma.

Cabe mencionar, sin embargo, que los mecanismos y en su momento acontecimientos que condujeron a las células de reacción inmunológica facilitaron el desarrollo de la pla-

centa temprana y el mantenimiento del embarazo y no son claros para todas las especies. Recientemente, se ha resumido que la estructura de la placenta y sus variaciones en diferentes especies afectan en gran medida el tipo de respuesta inmune materna. Por ejemplo, una respuesta inmune a las diferentes placentas se produce en las especies que utilizan placenta epitheliochorial que en aquellas especies que son de células del trofoblasto invasión.

Conclusión La concepción exitosa y el embarazo no sólo requiere un número suficiente de espermatozoides para llegar al ovocito en el oviducto, sino también de un mecanismo de apoyo inmunológico que garanticen un resultado exitoso. La inseminación es seguida en muchas especies por la atracción y la activación de células inmunes, con gran alcance de consecuencias biológicas. Aunque muchos detalles han sido revelados, la investigación en curso aún se centra en los detalles moleculares y los mecanismos que regulan esta reacción inflamatoria después de apareamiento. Con el fin de maximizar la eficiencia reproductiva en la producción ganadera, las muchas especies involucradas requieren un enfoque más comparativo, puesto que la evidencia es cada vez que la fisiología del endometrio y la respuesta de las cantidades variables seminales y la composición de plasma, diferentes diluyentes de semen, y un número variable de espermatozoides, también provocan diferentes respuestas inmunológicas.

Bibliografía: Immunological responses to semen in the female genital tract H.J. Schuberth a,1,*, U. Taylor b,2, H. Zerbe c,3, D. Waberski d,4, R. Hunter d,4, D. Rath b,2. Theriogenology 70 (2008) Science Direct.

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TÉCNICAS

Aspiración folicular en yeguas Primer caso del procedimiento de aspiración folicular en yeguas en el país adelantado en la Universidad Nacional de Colombia.

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Equina Colombiana

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Ruiz J1 y Jiménez C2 Aspirante a Médico Veterinario 2 Profesor Asociado Clínica de Reproducción Animal, Departamento de Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia.

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(Tomado con autorización de la revista “Referencia para consultorio MV”, No 25. T.M. Editores e Impresores)

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a aspiración folicular es una biotecnología enfocada a varias especies animales con el fin de obtener una preñez en hembras (yeguas), las cuales no pueden quedar gestantes por problemas reproductivos, cuando no se quiere hacer gestar la yegua por diferentes razones o para donar embriones. Esta técnica involucra la colecta del oocito de la donadora y su transferencia a una receptora. Esta tecnología inicio como método de investigación pero luego tomó un rumbo clínico y/o comercial.

Las técnicas más usadas son la aspiración transvaginal guiada por ultrasonido (US) y la punción por el flanco. Para esta práctica se usan hormonas como la hCG y/o GnRH, teniendo en cuenta que el intervalo completo entre la administración de hCG y la transferencia usualmente es de 36 a 40 horas. La transferencia debe realizarse a través de laparotomía por el flanco.

La aspiración y transferencia de oocitos involucra la colecta del oocito de una donadora y su transferencia al oviducto de una receptora. Esta última es inseminada y la fertilización y el desarrollo del embrión ocurren dentro del tracto reproductivo de la receptora. Esta técnica viene siendo una alternativa a la transferencia de embriones (ET) para yeguas que tienen patologías reproductivas, como problemas ovulatorios, infección uterina persistente, piómetra, y/o rupturas o adherencias cervicales.

La transferencia de oocitos también ha sido usada para obtener preñeces de yeguas en las cuales la transferencia de embriones ha sido poco exitosa.

La tecnología para colecta y transferencia de oocitos, inició como método para estudiar la interacción entre oocito, esperma y oviducto con propósitos de investigación. Los resultados de los estudios sugirieron que la transferencia de oocitos puede ser usada para evaluar fertilización y el desarrollo de oocitos madurados in vitro. Posteriormente, se uso como procedimiento clínico en yeguas subfértiles.

La fertilización in vitro y el cultivo de embriones no es muy efectiva para los equinos. Por lo tanto, la transferencia de oocitos ha sido usada para determinar la habilidad de los oocitos, su maduración in vitro y generar fertilización y desarrollo embrionario.

La aspiración de oocitos previene la exposición de gametos a condiciones patológicas del tracto genital, aunque algunas donadoras tienen luteinizaciones repetidas e intermitentes o folículos no ovulados.

Según McKinnon et al., 1988, el primer potro nacido de una transferencia de oocitos fue a finales de 1980 y el procedimiento solo fue usado con fines comerciales hasta el final de la década de 1990s (Hinrichs et al., 2000a; Carnevale et al., 2001b) y ya hacia el año 1999 se realizó para transferir oocitos colectados de ovarios de yeguas valiosas, las cuales han sido sacrificadas o han muerto. Otro avance importante según lo reportó Carnevale et al. en el 2003 es que el primer potro que se obtuvo de ovarios transportados entre un país fue en el año 2002.

Patologías El tracto reproductivo de la receptora debe proveer un ambiente

para el transporte de esperma, fertilización y desarrollo del embrión.

La transferencia de oocitos ha sido utilizada para obtener crías de yeguas con problemas reproductivos los cuales evitan obtener una preñez o donar embriones.

Los problemas reproductivos más comunes incluyen, fallas en la ovulación como oclusiones oviductales, infecciones uterinas como endometritis severas, laceraciones cervicales, adhesiones cervicales y/o uterinas, urovagina y anomalías no diagnosticadas.

Aunque se podría clasificar de forma que las patologías de las donadoras sean divididas en tres categorías generales: patologías uterinas y cervicales, fallas en la ovulación y fallas reproductivas no diagnosticadas.

Las anormalidades y/o patologías oviductales son poco comunes y difíciles de diagnosticar, sin embargo estudios sugieren que la selección espermática y la colecta del oocito por el oviducto pueden ser mejoradas en algunas yeguas; como lo reportó Carnevale et al. en 2001, Algunas yeguas, en especial las de mayor edad, parecen tener fallas repetidas en la ovulación y según Carnevale, en el año 1999, la tasa de desarrollo embrionario fue significativamente más baja cuando los oocitos de yeguas viejas (20 años) vs. oocitos de yeguas jóvenes (10 años) fueron transferidos.En cuanto a las patologías uterinas estas si son comúnmente diagnosticadas pero el tratamiento de infecciones uterinas puede ser costoso y poco efectivo para algunas yeguas.

La transferencia de embriones (ET) es una herramienta clínica, para obtener crías de yeguas que no pueden llevar una gestación a término. Sin embargo algunas yeguas no pueden mantener el crecimiento de un embrión debido patologías que podrían afectar el potencial de una yegua como SANTACRUZ Editores

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TÉCNICAS

La transferencia de oocitos ha sido utilizada para obtener crías de yeguas con problemas reproductivos.

donadora de embriones, aunque las yeguas pueden producir oocitos normales, los cuales podrían ser transferidos a receptoras para ser fertilizados. Sin embargo en muchos de estos casos la transferencia de oocitos proporciona un método viable para la obtención de crías.

Técnicas usadas Los oocitos han sido colectados de folículos de yeguas usando laparotomías, colpotomías, punciones por el flanco y aspiraciones foliculares guiadas por ultrasonido, de las cuales estas dos últimas son los métodos más comunes de colección de oocitos.

La aspiración transvaginal se puede dificultar por melanomas o severas descargas uterinas, por lo cual su alternativa es la punción por el flanco.

14 Genética

Equina Colombiana

hCG y/o GnRH La hCG y/o GnRH son usadas para generar la maduración folicular y las colectas se realizan a las 22 y 30 h para hCG y GnRH respectivamente.

La colecta de oocitos está basada en el tiempo de administración de hCG o un análogo de la GnRH a la donadora.

Los criterios usados para el uso de hCG son: 1) un folículo > de 35mm de diámetro, 2) relajación cervical y poco tono uterino y 3) edema uterino o estro mínimo de 2 días.

En el laboratorio del Departamento de Ciencias Biomédicas, de la Universidad Estatal de Colorado (USA) los oocitos son colectados de folículos preovulatorios entre 24 y 36 horas después de la administración de hCG (1500-2500 IU, IV) a la donadora o entre 14 y 0 horas antes de la ovulación y los oocitos colectados deben estar entre metafase 1 y 2.

Usualmente se le administra hCG a la donadora y receptora al mismo tiempo y si la colecta de la donadora es exitosa, la colecta del oocito de la receptora puede realizarse al mismo tiempo que se expone el ovario para la transferencia.

También se ha usado bromuro de propantelina en dosis de 0.04 a 0.07 mg/kg, IV, para disminuir el tono y las contracciones del recto. Aunque en nuestro país no se consigue.

Otros autores recomiendan el uso de lidocaína intrarectal.

Descripción de la técnica La colecta de oocitos por la técnica de punción por el flanco, se realiza por palpación manual sin ayuda de un ecografo por vía transrectal.

Esta técnica requiere de un trocar para ser ubicado por la musculatura del flanco, ipsilateral al folículo preovulatorio y a una posición

TÉCNICAS

aproximada del ovario. El ovario es manipulado por el recto y el folículo preovulatorio es ubicado hacia el final de la cánula. Una aguja calibre 12 a 15 es ubicada a través de la cánula y entrando en el antro folicular, y el liquido folicular y el oocito son removidos por una succión suave y relavando el folículo.

Para la técnica de aspiración transvaginal guiada por ultrasonido, el transductor es ubicado en una cubierta que contenga una aguja guía y se posiciona dentro de la vagina anterior, lateral al cérvix posterior e ipsilateral al ovario que contenga el folículo preovulatorio. Se realiza manipulación transrectal para posicionar el ovario contra el transductor y la aguja guía. Una aguja calibre 12 de doble lumen avanza dentro de la aguja guía hasta puncionar la vagina y la pared folicular. El líquido folicular es aspirado usando una presión de 150 mmHg o también se usan jeringas grandes.

Después de remover el liquido folicular el lumen puede ser lavado con 50 a 100 ml de medio, el más usado es una solución Dulbecco’s fosfato buferada o una solución de lavado de embriones que contenga suero fetal, y heparina (10 UI/ml) para prevenir la coagulación. Algunos autores recomiendan el uso de antibióticos como 1000 U/ml de penicilina y 1 mg/ml de estreptomicina.

La tasa de recuperación de oocitos varía con la experiencia del clínico.

Durante 3 años en el Laboratorio del Departamento de Ciencias Biomédicas, de la Universidad Estatal de Colorado (USA), la tasa de colecta de oocitos de donadoras comerciales fue de 98% (331/339) por ciclo y 76% (331/434) por folículo.

El medio y el equipo para manipular el oocito deben ser mantenidos a 38-39◦C. Además el medio obtenido, luego del aspirado no se filtra ya que el cúmulus del oocito es pegajoso y podría adherirse al filtro.

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Equina Colombiana

Debido a que el oocito es rodeado por células del cúmulus en expansión, el complejo cúmulus oocito es usualmente mayor a 1 mm, es translucido y fácil de identificar con un estereoscopio, pero la evaluación del oocito es difícil debido a las células que lo rodean.

Luego de la identificación, el cúmulus del oocito debe ser lavado en medio para remover sangre y detritos.

El ovario y el oviducto se exponen por el flanco a través de laparotomía. Antes de la cirugía para transferir el oocito, las células de la granulosa y algunas células del cúmulus son removidas y los oocitos son transferidos con una pipeta de vidrio al infundíbulo en el oviducto profundizando aproximadamente 2 a 3 cm. Los ovarios de las receptoras son seguidos por US cada 8 a 12 horas para determinar el tiempo de ovulación.

Ultrasonido y transductores Un equipo de ultrasonido es usado para ver el procedimiento durante las aspiración folicular guiada, ya sea transvaginal o a través de punción por el flanco. También pueden ser usados transductores de tipo lineal, curvilíneo o sectorial.

Cultivo de oocitos Los oocitos colectados 36 h post hCG a la donadora, son inmediatamente transferidos al oviducto de la receptora. Oocitos colectados 24 h post hCG a la donadora, frecuentemente son cultivados in vitro entre 12 y 16 horas antes de la transferencia.

Para el cultivo se usa medio TCM (Tissue Culture Medium) 199 con 10% de suero fetal bovino, 0.2mM de piruvato, y 50 mg/ml de Gentamicina. Este ha sido establecido como un medio aceptable para el cultivo de maduración de oocitos.

Los oocitos deben ser cultivados de 38.2 a 39 ◦C en atmósferas de 5

o 6% de CO2 y aire. Según Carnevale en 2004, el momento de colecta de oocitos (24h Vs 36 h post hCG a las donadoras) no afecta las tasas de preñez.

La maduración de los oocitos in vitro es únicamente necesaria si el oocito requiere madurez para fertilización y desarrollo embrionario.

Aunque en el estudio de Scott en 2001, los resultados indicaron que algunos oocitos equinos pueden completar el estado final de maduración dentro del oviducto, potencialmente el oviducto puede no proveer el ambiente necesario para completar la maduración.

Transferencia de oocito Las yeguas con flancos cortos y gruesos y/o ligamentos anchos cortos son más difíciles de utilizar como receptoras, porque la exposición del ovario puede ser difícil.

Se han utilizado yeguas cíclicas y no cíclicas como receptoras. Cuando las yeguas cíclicas son usadas, las receptoras se sincronizan con las donadoras y el oocito de la receptora es removido post aspiración de la donadora para prevenir su fertilización (2, 4, 7). Aunque en el estudio de Coutinho da Silva en 2002, reportan que el GIFT (Gamete Intrafallopian Transfer) puede ser usado en receptoras cíclicas, sin aspirar el folículo preovulatorio de la receptora.

Las yeguas no cíclicas o con baja actividad folicular, tratadas con hormonas, son muy buenas receptoras de oocitos, lo cual hace de esta técnica una alternativa viable a la transferencia de embriones en prácticas especializadas en equinos. Además por que elimina la posibilidad de aspirar el oocito de la receptora y la sincronización se realiza por medio de hormonas exógenas, como la GnRH a dosis de 4.2 mg o un periodo de progesterona y estrógenos a dosis de 150

GEC n Edición 1

mg de P4 y 10 mg E2 diariamente por 10 días seguidos; estos van disminuyendo el desarrollo folicular.

Se han transferido oocitos a yeguas cíclicas y no cíclicas; las receptoras no cíclicas se tratan con estradiol (2–5 mg diario por 3–7 días) antes de la transferencia y mantenidas con progesterona (150–200 mg diarios) después de la transferencia.

En el estudio de Carnevale en 2004, las tasas de preñez en transferencias comerciales resultaron similares para receptoras cíclicas y no cíclicas (8/15, 53% y 37/93, 39%).

Las transferencias de oocitos se realizan por laparotomía por el flanco, y exponiendo el ovario a través de la incisión.

Si los oocitos son colectados con mas de 30 horas post hCG o si el folículo parece estar a pocas horas de la ovulación, los oocitos pueden ser transferidos inmediatamente en el oviducto de las receptoras.

Tiempo de inseminación El mejor tiempo para inseminar a la receptora es probablemente entre 32 y 36 horas post hCG a la donadora, permitiendo que el oocito madure a metafase II antes de la fertilización.

Como el oocito equino mantiene una elevada fertilidad por aproximadamente 12 h después de la ovulación natural (Ginther, 1992), las receptoras pueden ser inseminadas antes o directamente después de la transferencia.

Scott en 2001 y MacLellan en 2002 afirmaron que las preñeces se obtuvieron solamente cuando las receptoras fueron inseminadas antes de la transferencia mientras que Carnevale, en el 2000, afirmó que también se obtenían buenos resultados después de la transferencia del oocito, es decir que usando la inseminación antes y después, se asegura que un numero adecuado de espermatozoides, estén disponibles para la fertilización.

SANTACRUZ Editores

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TÉCNICAS

Por lo cual, Carnevale en 2001, anunció que obtuvo buenos resultados, inseminando las receptoras 12 h antes 2 h después de la transferencia; usando aproximadamente 2x 109 espermas mótiles para la inseminación.

En el estudio de Scott en 2001, se obtuvieron tasas de preñez elevadas con inseminaciones antes de la transferencia del oocito indicando que la inseminación post-transferencia puede no ser necesaria.

Sin embargo, en este estudio usaron semen fresco de sementales de buena fertilidad, por lo que la inseminación después de la transferencia del oocito puede ser más importante cuando se usa semen de machos con pobre calidad seminal.

Cuando el semen es ubicado junto con el oocito en el oviducto de la receptora, el procedimiento se denomina GIFT (Gamete Intrafallopian Transfer) y puede ser usado con sementales de pobre calidad seminal. Esta técnica (GIFT), también ha servido para usar semen congelado y sexado.

Tasas de recuperación En el estudio de Hinrichs en 1997, la tasa de recuperación de folículos maduros 24 h después de la administración de hCG fue de 10/15 (66%) y se afirma que un incremento en el tiempo de maduración de 36 a 42 h post hCG no parece ser un factor asociado con las tasas de preñez.

Para el estudio de Carnevale en 1999, la tasa de colecta de oocitos de folículos preovulatorios fue elevada, con oocitos recuperados en el 85% de los ciclos. Se obtuvieron tasas de preñez del 23%.

La tasa de preñez con transferencias comerciales, usando donadoras viejas y semen de variable calidad se encuentran en un rango de 27 a 40% por transferencia. En contraste, bajo las mismas condiciones usando oocitos de yeguas jóvenes y machos fértiles, resultaron en ta18 Genética

Equina Colombiana

sas de preñez entre 54 and 83% por transferencia.

El primer reporte de tasas elevadas de efectividad con transferencia de oocitos fue en 1995 con Carnevale y Ginther. En ese estudio, la transferencia de oocitos de yeguas donadoras jóvenes, resultó en una tasa de desarrollo embrionario del 92%.

En el estudio de Scott en 2001, las tasas de recuperación de oocitos de folículos preovulatorios fue de 43%.. 82% de los oocitos preovulatorios formaron vesícula embrionaria después de la transferencia, lo que confirma la efectividad de la maduración in vivo. Los estudios iníciales en los cuales oocitos equinos fueron transferidos directamente al oviducto de receptoras, obtuvieron relativamente bajas tasas de preñez (0 a 13%;). Sin embargo, se han reportado tasas de preñez del 44%, colectados 35 h después de la administración de hCG y transferidos a receptoras dentro de 1 h.

En el estudio de Scott en 2001, las receptoras ovularon su folículo preovulatorio, lo que contrasta con otros estudios en los cuales el folículo de las receptoras es aspirado. Por lo que en este artículo afirman que la aspiración folicular de las receptoras puede generar irritación en el tracto reproductivo o deteriorar las contracciones uterinas, resultando en bajas tasas de preñez, aunque esto no se afirma en ningún otro articulo evaluado para este caso.

Se ha utilizado oocitos colectados 12 h antes del tiempo esperado de ovulación y ubicados en el oviducto de las receptoras, las cuales fueron inseminadas 12 a 14 h después de la transferencia; se observo que un 43% de los oocitos desarrollaron a vesícula embrionaria.

Factores que afectan las tasas de éxito Un factor importante, para el éxito de la transferencia, es la edad de la donadora, ya que al observar tasas de preñez entre yeguas viejas y

jóvenes, las últimas presentan una tasa más elevada.

La disminución en la fertilidad de yeguas viejas (20 años), ha sido asociada con una disminución en la viabilidad del oocito. La transferencia de oocitos de donadoras viejas o de jóvenes a receptoras jóvenes, resultó en una diferencia significativa en la tasa de desarrollo embrionario (31% para donadoras viejas Vs. 92% en donadoras jóvenes), además se observaron anormalidades morfológicas en los oocitos de yeguas viejas.

Algunos factores que afectan la tasa de éxito en la transferencia son: (a) una estricta sincronización del crecimiento folicular entre donadora y receptora; (b) recuperación del oocito de folículos tanto de donadora como de receptora (para prevenir una inadvertida fertilización del oocito de la yegua receptora); y (c) suave y rápida transferencia del oocito al oviducto de la receptora.

La edad, etapa del ciclo, preñez, y condición corporal de la donadora puede afectar la fertilidad del oocito.

Reporte de caso En la Clínica de Reproducción Animal de la Universidad Nacional de Colombia, se presentó el caso de un equino, hembra, de raza Paso Fino Colombiano, de 6 años de edad, color alazán, de nombre Alborada.

Como historia, la paciente presentó una distocia en agosto del 2008 y a causa de esto se le realizó fetotomía, sufriendo necrosis de los labios vulvares, pérdida de patencia del esfínter vestíbulovaginal, neumovagina, pérdida de patencia cervical y quedando con endometritis persistente.

Luego de la evaluación reproductiva, se decide realizar una aspiración folicular, debido a que con estas afecciones era imposible generar un ambiente uterino adecuado para mantener una gestación

GEC n Edición 1

y/o donar un embrión; para lo cual se llevo a cabo un seguimiento reproductivo.

Al determinar los parámetros requeridos para la administración de hCG (edema II, folículo 41x38cm y 70% de relajación) , a la paciente se le administran 500 UI IV (28 h antes de la aspiración).

Para el procedimiento se evacuó el recto y se ubicó el folículo preovulatorio por US y se determinó su posición;, luego se sedó la paciente con xilazine a 0.3 mg/kg IV, anestesia local con 20 ml de lidocaína sobre el flanco en la pared abdominal ipsilateral al folículo preovulatorio y lidocaína (20 ml) mas lubricante (CMC) intrarectal.

Luego se procedió a ubicar el folículo preovulatorio por US percutáneo a nivel del flanco, la punción se realizó varias veces con un catéter número 14, hasta llegar al antro del folículo preovulatorio y aspirar el contenido folicular con una jeringa, la cual contenía 30 ml de SRL + Holding + heparina.

Obtenido el líquido folicular se procedió a ubicar en éste, el oocito pero no fue encontrado.

Resultados No se obtuvo el oocito de la yegua, aunque si se logró obtener el líquido folicular, lo cual es un gran avance para la Universidad ya que es la primera vez que se realiza este procedimiento.

Discusión La colecta y transferencia de oocitos permite obtener descendientes de yeguas con variedad de condiciones patológicas reproductivas, como las presentadas en Alborada, las cuales podrían prevenir la producción de embriones o crías de esta yegua.

Se utilizó a Alborada para realizar aspiración folicular, debido a las anormalidades reproductivas que esta presenta y a su gran valor genético.

Las causas uterinas que presenta Alborada disminuyen la fertilidad ya que al ser infecciosas y/o inflamatorias, son dañinas para los espermatozoides y el embrión, debido a que afectan el ambiente uterino necesario para el mantenimiento de una gestación.

Con la colecta y transferencia del oocito en alborada, las condiciones patológicas de su tubo genital serían evitadas.

El tamaño folicular, relajación cervical y edema uterino, presentados en alborada, fueron los adecuados para determinar la administración de hCG y acelerar su proximidad a la ovulación.

La dosis mínima de hCG reportada es de 750 UI, aunque en la práctica se han obtenido buenos resultados con 500 UI. Aunque la colecta de oocitos entre 24 y 36h post hCG, no afecta las tasas de preñez, en nuestro caso se realizó a las 28 h y no antes, para evitar el proceso de maduración in vitro y tener más facilidad al momento de la aspiración ya que el complejo cúmulus-oocito de un folículo inmaduro tiene una amplia base de adherencia y proyecciones celulares entre la teca interna.

Se realizó, aspiración folicular por el flanco en alborada ya que al presentar afecciones vaginales y uterinas, no estaba indicada la técnica de aspiración transvaginal guiada por US y además se evitaron los altos costos en equipos.

Durante el procedimiento, se dificultó la manipulación del ovario, debido a las contracciones generadas por alborada y a la ubicación del folículo en el ovario (medial).

Ubicar la aguja dentro del folículo fue muy difícil, lo que generó varias punciones sobre la yegua, debido a esto, al puncionar el folículo, se aspiró el líquido y aunque se reporta hacerlo lentamente y relavar, no fue posible hacerlo de esta manera, evitando una contracción inesperada, dolor en el animal y/o generar una infección de tipo iatrogénico.

En esta ocasión solo se obtuvo líquido folicular, posiblemente por no haber relavado la cavidad folicular y aunque no se obtuvo el oocito, la obtención del líquido es un gran avance al ser la primera vez que esta técnica se realiza en la Universidad.

Conclusiones El desarrollo de procedimientos para la colecta y transferencia de oocitos ha resultado en nuevas posibilidades clínicas y de investigación para los equinos.

El desarrollo de procedimientos para la colecta y transferencia de oocitos, no se había realizado en la UN, por lo cual abre una puerta para la práctica y posterior estandarización de la técnica en nuestra Universidad.

A pesar de que no se obtuvo el oocito en esta primera aspiración, es necesario realizar más prácticas, para poder tomar un nivel adecuado y poner esta clase de biotecnología como servicio a pacientes de la Universidad que presenten afecciones de tipo reproductivo y que se ajusten a los parámetros requeridos para una aspiración folicular.

Este tipo de biotecnologías aunque iniciaron como métodos de investigación, hoy día se usan para obtener descendientes de yeguas valiosas, de las cuales no se logran obtener gestaciones ni embriones, debido a diferentes condiciones de índole reproductivo.

Los resultados obtenidos muestran que aun falta profundizar en la técnica de aspiración folicular, la cual con tiempo se logrará estandarizar y aplicar de forma clínica.

Bibliografía disponible en: geneticaequina.fer@gmail.com y en tmeditores@hotmail.com

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BIOTECNOLOGÍA

José Córdoba.

Director de ViaGen Latino América. jose.cordoba@viagen.com

L

Clonación de equinos Es una herramienta de reproducción avanzada para la preservación y multiplicación de ejemplares de valor de desempeño superior.

20 Genética

Equina Colombiana

a clonación es una avanzada técnica de reproducción asistida que trata de producir un gemelo genético en tiempo posterior.

En esta técnica se produce un embrión que lleva el mismo genotipo (conformación genética) que el donante genético (animal original). El embrión clonado se transfiere a una hembra receptora como en la transferencia embrionaria convencional, y le siguen una gestación y nacimiento normales.

Es herramienta que enriquece los programas de reproducción. En un hato, siempre hay ejemplos de animales específicos que representan los atributos más deseados y de mejor manera. Hasta el punto en que dichos atributos puedan heredarse, tales animales representan una oportunidad para mejorar la calidad de la siguiente generación.

Los criadores experimentados siempre deben trabajar hacia delante yendo más allá del “horizonte” para producir los animales que tienen más demanda y que mejoren los objetivos de la raza. Existen ejemplos en los que los programas de reproducción se han olvidado de los atributos claves para tener éxito, y la clonación les ofrece a estos programas la oportunidad de agregar algunos genotipos claves que mejor representan las necesidades que no se han satisfecho, como por ejemplo la durabilidad.

En lo que estamos equivocados es en asumir que la clonación se convertirá en el único método reproductivo utilizado. La clonación debe considerarse dentro del contexto de todos los métodos reproductivos existentes y se debe usar como se desee para mejorar los objetivos.

Probablemente la clonación continúe siendo muy costosa, por tanto, quizá sólo se usará para los genotipos de mejor producción que merezcan la inversión. No obstante, la clonación podría hacer que la tan deseada in-

GEC n Edición 1

formación genética sea más costeable y esté más disponible para la industria. Esto sería posible si la información genética del animal clonado estuviera disponible por medio de las herramientas reproductivas actuales, como la inseminación artificial y la transferencia de embriones.

Claro, podría ser más sencilla, pero ¿estaríamos mejorando nuestro rendimiento?

El objetivo de las disciplinas más competitivas es el de avanzar por medio de los mejores atletas equinos.

Los avances en genética nos permiten mejorar la capacidad de nuestros animales para que su desempeño sea a niveles cada vez más elevados.

Cuando se usan adecuadamente, las tecnologías de clonación nos permiten producir caballos con mejores niveles de desempeño, que disfruten su trabajo y que nos proporcionen nuevos niveles de emoción.

Se trata de una poderosa herramienta de reproducción que abre un nuevo nivel de posibilidades en la reproducción de caballos. Algunas de estas posibilidades no están reguladas por las leyes y reglamentos actuales en los registros. Debido a la aceptación general del semen congelado, un semental ahora tiene una vida reproductiva más larga si el dueño actuó proactivamente y preservó el semen durante la vida del animal.

Un semental se puede clonar (mientras aún vive) y el semen del semental clonado podría sustituirse como semen del animal original. Los resultados de las pruebas a las crías demostrarían la ascendencia con el animal original, y ninguna prueba actual sería capaz de diferenciar entre las crías de un semental clonado y las crías del animal original (puesto que el ADN mitocondrial sólo lo proporciona la yegua). Una prueba de ADN de la muestra del semen congelado podría identificar una diferencia en el ADN mitocondrial (si existiera una prueba de ADN mitocondrial), pero esta prueba incluso no es 100 por ciento eficaz, puesto que en ocasiones el ADN mitocondrial del aniSANTACRUZ Editores

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BIOTECNOLOGÍA

mal original se convierte en la fuente dominante de ADN mitocondrial del animal clonado.

El semental clonado tiene el mismo valor reproductivo que el semental original. Por consiguiente, si las crías del semental clonado pueden registrarse en la organización deseada, entonces el incentivo para burlar el sistema se reducirá drásticamente. Las nuevas tecnologías nos continuarán ofreciendo oportunidades para mejorar nuestros sistemas de reproducción. Es nuestra entera responsabilidad crear sistemas que promuevan el uso productivo de las tecnologías innovadoras en vez de intentar construir barreras que creen incentivos para los criadores sin escrúpulos.

La propuesta no es la de clonar caballos para producir campeones en serie - aunque lo anterior pudiera ser posible pues no hay individuo en el mundo que se le parezca a otro que su propio clon - sino la de preservar y

multiplicar la capacidad reproductiva de ejemplares equinos superiores logrados a través de muchos años de dedicación por criadores, propietarios, entrenadores y jinetes, y cuyo valor de desempeño ha demostrado ser de lo mejor, justificando así la inversión.

El valor de desempeño de un caballo está determinado por sus genes y por la interacción de éstos con el medio ambiente que se le ha dado, tal como las técnicas de crianza y de entrenamiento, así como la experiencia en competencia. Estos ejemplares superiores además de que cumplen con las características morfológicas de la raza, también han demostrado ser productores de crías de alto desempeño, o bien han competido logrando la categoría de campeón.

En la industria de los equinos existen caballos y yeguas de éste nivel que han perdido su capacidad de reproducción ya sea porque han sido

castrados, están en el ocaso de su capacidad reproductiva por su edad, o bien padecen de alguna enfermedad ó lesión. La capacidad de continuar reproduciendo estos genotipos es ahora posible recuperarla gracias a nuestro servicio de Clonación.

También se logra asegurar a caballos, que hoy en día están activos ya sea como reproductores o como competidores y que en algún momento de su vida dejarán de estarlo, mediante el aprovechamiento de un Banco de Genes congelando sus células. Al perder el propietario un ejemplar de éstos, que ciertamente tiene asegurado económicamente, además de que obtiene el beneficio económico del seguro también tiene la oportunidad de clonarlo a partir de una de los millones de células conservadas en el Banco de Genes, y así poder preservar en el tiempo la tan preciada genética que costó tanto tiempo y esfuerzo obtener.

El embrión clonado se transfiere a una hembra receptora como en la transferencia embrionaria convencional, y le siguen una gestación y nacimiento normales.

22 Genética

Equina Colombiana

AVISO VIAGEN

BIOTECNOLOGÍA

Transferencia de embriones en equinos Luis Losinno, MV, PhD Laboratorio de Reproducción Equina, Cátedra de Producción Equina, Universidad Nacional de Río Cuarto, Argentina. llosinno@gmail.com

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a técnica de transferencia de embriones en equinos es el procedimiento por el cual se recolecta uno o más embriones a 24 Genética

Equina Colombiana

través de un lavado uterino transcervical de una yegua donante inseminada o servida por monta natural, 6 a 10 días post-ovulación, y se transfiere de manera no quirúrgica al útero de otra yegua receptora sincronizada previamente.

En 1974, simultáneamente y de manera independiente Oguri en Japón y Allen en Cambridge fueron los primeros en reportar una preñez por TE en equinos. Desde

entonces y coincidentemente con el desarrollo de la ultrasonografía reproductiva, a partir de los primeros reportes a comienzos de los 80’s, esta técnica ha crecido sostenidamente durante las últimas tres décadas, instalándose como una de las herramientas de biotecnología de más alto impacto en sistemas de producción de equinos de alta performance o valor genético.

GEC n Edición 1

Indicaciones La transferencia embrionaria es una técnica de reproducción asistida que tiene el potencial de aumentar la eficiencia reproductiva de la especie, pero es conveniente y necesario remarcar sus limitaciones, dado que a veces las expectativas puestas sobre ellas son infundadas.

Las principales indicaciones incluyen: • Aumentar el número de potros por año en yeguas seleccionadas. En promedio, en su vida reproductiva una yegua de cría puede producir entre 5 y 7 potros de manera natural. Con la TE es posible multiplicar por 10 estos valores en programas de producción continua.

• Producir potros de yeguas en competición para polo.

• Producir potros en yeguas que no puedan gestar por problemas no reproductivos.

• Investigaciones sobre las relaciones materno-embrionarias.

• Disminuir el intervalo generacional en la especie.

• Eliminar los riesgos de gestación y parto en yeguas de alto valor.

• Pruebas de progenie

Procedimientos Para maximizar el éxito de los programas de transferencia embrionaria, deberían ser usados tanto yeguas como reproductores fértiles, pero esto en general no es una opción del veterinario dado que en general son los clientes los que proponen los cruzamientos. De todos modos lo que sí es una opción del profesional es realizar un informe de aptitud reproductiva potencial de los animales basado en un exhaustivo examen clínico, que determine: a) si el animal (yegua o reproductor) es apto para ingresar a un programa de TE y; b) su pro-

ducción potencial en el programa, basado en datos estadísticos. Las yeguas donantes deberían estar en excelente condición corporal, ovulatorias, reproductivamente aptas y deberían ser inseminadas con una adecuada cantidad de espermatozoides motiles precediendo a la ovulación en caso de semen fresco o refrigerado, o post-ovulación en el caso de semen congelado, dependiendo del protocolo utilizado.

El período estral de receptividad sexual de la yegua promedia los 7-8 días; de esta manera, el estro y el diestro deben ser manejados para sincronizar de forma efectiva las yeguas donantes y receptoras. Es muy importante determinar para cada individuo el Intervalo Interovulatorio (IIO), es decir el periodo entre una ovulación y la siguiente, como base para un programa de sincronización de ovulaciones. El examen regular del tracto reproductivo de la yegua por tacto rectal y ultrasonografía, representa una ventaja en cuanto al monitoreo preciso del crecimiento folicular y la detección de la ovulación. El día en que la ovulación es detectada se considera el día 0 del ciclo.

Recolección de embriones La recolección de embriones consiste en realizar un lavado (flushing) del útero de la yegua donante con un volumen total de 2 a 3 litros (de a uno por vez), de una solución de PBS (Buffer Fosfato Salino) o Ringer Lactato, sin agregado de Suero Fetal Bovino, para luego recuperar el efluente en un sistema cerrado de dos vías, filtrarlo e identificar el embrión. El útero es lavado íntegramente sabiendo que el embrión equino en este periodo se mueve debido a contracciones del miometrio y puede ser encontrado en cualquier área, dentro del lúmen uterino.

Para el lavado se utiliza un catéter semirígido tipo Foley especifico para yeguas, de 80 cm de longitud,

con un balón inflable de 30-60 cc. El extremo anterior de este catéter es pasado a través del cérvix hacia el cuerpo uterino y se llena el balón con el medio usado para el lavaje -o con aire- para evitar el reflujo del medio hacia la vagina. El extremo posterior se conecta a un circuito intermediario interconectado al recipiente con medio de lavaje y al filtro. Tan pronto el efluente esté recolectado, el filtro cerrado es llevado al laboratorio donde los 20-30 ml residuales del filtro, son transferidos a cápsulas de Petri estériles donde se realiza la búsqueda del embrión en una lupa estereoscópica y bajo estrictas condiciones de higiene ambiental y operacional.

Tasa de recuperación La tasa de recuperación de embriones por cada intento de colecta varía entre un 20% a un 160%.

La variabilidad de estas obtenciones se debe, entre otros factores, a la cantidad y calidad del semen utilizado, la edad y estado reproductivo de la donante, el día postovulación en el que se intente obtenerlo, el número de ovulaciones, la técnica de lavado utilizada y el entrenamiento del operador. En estudios controlados, las tasas de recuperación de embriones para yeguas viejas subfértiles (31%) fueron aproximadamente la mitad de las correspondientes a yeguas jóvenes fértiles (71%). Además, las yeguas subfértiles producían una alta proporción de embriones anormales versus los producidos por las yeguas normales. El día más temprano de recuperación del embrión es determinado por el tiempo en que éste demora en pasar desde el oviducto al útero. La mayoría de los embriones llegan al útero al día 5.5 post-ovulación.

Los intentos para recuperar los embriones en el día 6 resultan en tasas de recuperación ligeramente más bajas comparadas con las del día 7, 8 ó 9. El día 8 ó 9 el embrión SANTACRUZ Editores

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BIOTECNOLOGÍA

es de 1-2 mm. de diámetro lo cual permite que éste muchas veces pueda ser visualizado macroscópicamente. Los embriones del día 10 son más difíciles de manejar y requieren de entrenamiento y materiales apropiados, de lo contrario resultan en menores tasas de éxito posttransferencia.

Considerando todo esto, el día de preferencia de recuperación de embriones es el día 7,5; el día 8 es la segunda alternativa, pero también hay que considerar que en las yeguas viejas es recomendable realizar el lavado al día 9 o 10 debido a que posiblemente su tiempo de transito tubarico sea mayor y la tasa de crecimiento del embrión, menor. Las yeguas donantes con ovulaciones dobles espontáneas son las de preferencia ya que reportamos que las tasas de recuperación de sus embriones son significativamente mayores 106% vs.

53% y 160% vs. 87%.

Las recolecciones pueden ser hechas en la misma yegua donante, en promedio, cada 14 días durante la temporada de reproducción fisiológica. Si una yegua donante tiene múltiples folículos mayores de 30 mm, puede optarse por la utilización de un inductor de la ovulación como la gonadotropina coriónica humana (hCG) o análogos sintéticos de GnRH (Deslorelina) para aumentar el número de ovulaciones así como también para sincronizar las múltiples ovulaciones potenciales. Las yeguas que están en estro con folículos mayores a los 35 mm., se espera que ovulen dentro de las 48 hs. de haber sido tratadas con 1.500 U.I. de hCG IM o 1,5 mg IM de Deslorelina de acción controlada (LAD). Las tasas de ovulación y de recuperación embrionaria en programas comerciales de producción de embriones en yeguas de Polo en Argentina difieren significativamente en relación a la edad de las donantes y a la droga utilizada. Es importante considerar que las tasas de recu26 Genética

Equina Colombiana

peración embrionaria pueden ser expresadas considerando: a) número de embriones recuperados/ ciclo y b) número de embriones recuperados/ovulación detectada.

Ambos valores difieren significativamente en yeguas de polo donde la tasa de ovulaciones múltiples es de aproximadamente 30%.

El segundo es el índice más preciso y el mejor indicador de eficiencia y/o pericia del operario pero es el menos utilizado.

Receptoras Las yeguas que se seleccionan como receptoras deberían ser jóvenes (3-12 años), estar en excelente estado de salud, condición corporal y aptitud reproductiva. Como condición esencial, su score de biopsia endometrial grado 1 o 2A (máximo) según la escala propuesta por Kenney (1978).

Resultados de trabajos realizados en nuestro laboratorio en los últimos años, han demostrado que la diferencia en tasas de pérdida embrionaria en yeguas receptoras seleccionadas utilizando, además de los parámetros mencionados, la biopsia endometrial, es significativamente menor.

No se han reportado diferencias significativas en cuanto a tasas de preñez cuando las yeguas receptoras ovularon entre el día -1 a +3 días en relación a la ovulación de la donante. Sin embargo, recientemente, Wilsher y col (2008) reportaron que embriones de día 10 post-ovulación pueden ser transferidos a receptoras ovuladas -5 a +2 días en relación a la donante sin disminución significativa en los índices de preñez. (Wilsher, 2008) El ciclo estral de las yeguas donante y receptora puede ser sincronizado mediante administración de prostaglandinas F2 alfa (PGF2 alfa) o progesterona la cual mantiene la fase luteal, induciendo luego luteólisis con prostaglandina (y ovulación con hCG o LADes). Se

espera que las yeguas ovulen 7-10 días posteriores a la suspensión de progesterona o a la inyección de PGF2 alfa.

Las yeguas receptoras anovulatorias o que han sido ovariectomizadas, mantenidas bajo tratamiento con progesterona y a las que luego se les transfirió un embrión, han concluido su gestación con el nacimiento de potrillos vivos y es una herramienta muy importante en el manejo de las receptoras durante los periodos transicionales y anovulatorio anual en el extremo del hemisferio sur.

Transferencia quirúrgicas o no quirúrgicas Los embriones equinos pueden ser transferidos quirúrgica o no quirúrgicamente. Las transferencias no quirúrgicas de embriones producen más altas tasas de preñez comparadas con las transferencias quirúrgicas y es el método más difundido en el mundo. En la técnica no quirúrgica transcervical, una pajuela de 0.25 o 0.5 ml conteniendo el embrión y una pequeña cantidad de medio de transferencia es cargada en una pipeta de inseminación estéril y transferido a través del cerviz. El extremo de la pipeta es colocado dentro del cuerpo uterino donde es depositado el embrión. El uso de una vaina de plástico estéril como técnica protectora para cubrir la pipeta durante la transferencia mejoró las tasas de preñez (45% vs. 19%; técnicas resguardadas y no resguardadas, respectivamente).

Es necesario tomar recaudos especiales respecto a la higiene del área perineal y en cuanto a la habilidad en la manipulación del cérvix. La viabilidad de los embriones equinos en medio holding puede ser de hasta 8 horas en condiciones controladas de laboratorio dependiendo de la calidad del embrión y las condiciones ambientales.

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Entre los factores más importantes que pueden condicionar los resultados de un programa de TE merecen destacarse: 1. Fertilidad del semental 2. Dificultad en superovular las donantes 3. Edad y condición reproductiva de la donante 4. Correcta detección de la ovulación 5. Condición reproductiva/nutricional/sanitaria y edad de la receptora 6. Entrenamiento del operador 7. Calidad del embrión (Losinno y Alvarenga, 2006).

Una de las mayores limitantes en la yegua, en comparación con otras especies domésticas, es la dificultad de inducir una respuesta superovulatoria efectiva, en términos de número de embriones recuperados, con la consiguiente limitante en las posibilidades de obtener más de un embrión y el mayor costo operativo por cada intento. Desde comienzos de los 80’s se han ensayado experimentalmente protocolos superovulatorios con extractos crudos o purificados de hipófisis equinas, FSH equina purificada, FSH equina recombinante; Gonadotrofina Menopausica Humana (hMG); GnRH natural y análogos, y anticuerpos anti-inhibina. En algunos casos se obtuvieron incrementos en la tasa ovulatoria (1.7 a 3.6 ovulaciones/ ciclo) y en otros casos un leve aumento en la tasa de recuperación embrionaria, pero los protocolos aun no están estandarizados como para ser comercialmente aplicables.

La inconsistencia de los resultados y la ausencia de estudios científicos controlados multicentricos independientes determinan, en mi opinión que no hay hasta la fecha un protocolo recomendable para inducción de ovulaciones múltiples en la yegua.

La yegua es considerada en general una hembra monovular, pero la in-

La recolección de embriones consiste en realizar un lavado (flushing) del útero de la yegua donante con un volumen total de 2 a 3 litros.

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BIOTECNOLOGÍA

cidencia espontánea reportada de ovulaciones múltiples varía entre 2 y 43 %. La gran diferencia entre los reportes considera factores como raza, edad, época del año, estado reproductivo, factores genéticos y estación del año.

En programas comerciales de TE conocer la incidencia, repetibilidad, probablemente la heredabilidad de las ovulaciones múltiples y los factores intrínsecos (edad, pedigree) y extrínsecos (mes, hs. luz, alimentación) que pueden afectarlas, podría ser un elemento muy importante en la programación de los trabajos, expectativas de número de embriones obtenidos, número de lavados necesarios por yegua por temporada, etc, que se traducirían en una mayor

eficiencia global y por consiguiente produciría un impacto económico positivo sobre el sistema.

Recientemente Mortensen et al (2008) reportaron tasas de recuperación significativamente más bajas, calificación embrionaria de mayor grado y alteraciones en el intervalo interovulatorio en yeguas sometidas a programas de entrenamiento (ejercicio) en condiciones de altas temperaturas y humedad ambientales.

Resultados esperados Bajo condiciones ideales (donantes, receptoras, padrillos fértiles y personal capacitado), es posible esperar una tasa de recuperación de embrio-

nes de 50 a 80 % y una tasa de preñez de 50 a 80 %, lo que determinaría una tasa de eficiencia total del 25 al 65 %. Tanto la tasa de recuperación como la de preñez post-transferencia de yeguas subfértiles son significativamente más bajas comparadas con yeguas normales (20-30% vs 6080%).

Por ésta técnica es posible obtener, en promedio, 4 ó más potros por año hijos de la misma yegua, pero existen evidencias (en Argentina) de una yegua de polo de la que se obtuvieron 14 preñeces en la misma temporada reproductiva (2004/5) sin utilizar protocolos superovulatorios.

Bibliografía disponible en: geneticaequina.fer@gmail.com

Las recolecciones pueden ser hechas en la misma yegua donante, en promedio, cada 14 días durante la temporada de reproducción fisiológica.

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BARÚ F.C. X OVACIÓN V-8

Foto: Julián Lineros

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mundial como el Congreso de las Asociaciones de Veterinarios Equinos Franceses (Avef) que tendrá lugar en Burdeos, Francia del 7 al 9 de octubre; en Al Fares International Equine Exhibition de Dubai, Emiratos Arabes Unidos del 29 de noviembre al 1 de diciembre y; en Estados Unidos en la Annual Convention of American Association of Equine Practitioners (AAEP) que se llevará a cabo en Baltimore, Maryland.

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AVISO ANICAM

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Criadero La Caprichosa La casa de los diagonales

A pesar de llevar tan sólo siete años, este criadero cuenta entre sus animales con la sangre más selecta en los andares de trocha colombiana, trote y galope.

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La Caprichosa de Gualanday, principal n煤cleo gen茅tico del criadero.

Es un ejemplar perfectamente armonioso en toda su conformaci贸n.

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La Caprichosa junto a su hermana completa Tete de los Limoneros.

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Criadero La Caprichosa A

pesar de llevar tan sólo siete años, este criadero cuenta entre sus animales con la sangre más selecta en los andares de trocha colombiana, trote y galope. Su núcleo genético fue conformado con la compra de la yegua La Caprichosa de Gualanday, especialista en trote y galope, que a la fecha ha conseguido 14 Grandes Campeonatos en Ferias Grado A, 15 en Grado B, 9 Grandes Campeonatos Reservados en Grado A y, fue seleccionada como Gran Campeona en 2007 y Ejemplar del Año en ese mismo año.

Junto a La Caprichosa de Gualanday se adquirió a su hermana completa, Tete de los Limoneros, especial en trocha, cuyos padres son Barú y La Rondadora. Es una magnífica reproductora de diagonales y tiene el poder de transmitir sus virtudes a su progenie. Barú, seleccionado como fuera de concurso, es hijo de Electrón de los Naranjos con Chola. Por su parte, La Rondadora es hija de Destellos de los Naranjos y Su Reinita, que es hija de Don Danilo, uno de los mejores ejemplares en toda la historia equina de Colombia; Destellos es hijo de Don Daly de los Naranjos en Linda Rosa.

Fue entonces con la compra de estos dos excelentes ejemplares que se dio inició a las actividades del Criadero La Caprichosa, localizado en plena Sabana de Bogotá, en cercanías del municipio de Tenjo, Cundinamarca. Sus instalaciones están diseñadas para brindar tranquilidad y seguridad a cada uno de sus ejemplares equinos. Sus potreros están distribuidos según las etapas de crecimiento y desarrollo de los animales.

Otra parte de su núcleo genético se conformó al adquirir la trochadora Juana de Sierra Morena hija de Ruiseñor de Chihuahua, declarado fuera de concurso, en la yegua Siria de Sierra Morena. Actualmente ostenta entre sus triunfos 7 Grandes Campeonatos en Ferias Grado A, 2 en Grado B, 6 Grandes Campeonatos Reservados en Grado A y fue seleccionada Gran Campeona Nacional en 2003.

A través de inseminación artificial o por transferencia de embriones se mezclaron estas yeguas con caballos élites cabezas de familia seleccionados entre los mejores del país como Maracanazo y Tango de la Perla. Sus crías ya cuentan con 24 a 30 meses y están en proceso de arreglo, es decir preparándose para ser montadas.

A principios de 2009 se adquirió al caballo Cónsul de Gran Dinastía, especial en trocha colombiana, declarado Campeón Mundial, fuera de concurso en 5 oportunidades y Mejor Jefe de Raza en 3. Es hijo de Tayrona con Juguetona. El objetivo de adquirir este reproductor es para sacar crías por transferencia de embriones con las mejores yeguas del criadero. Actualmente hay alrededor de diez ejemplares nacidos que ya se encuentran ganando en pistas en las modalidades de trocha pura colombiana y trote y galope.

Otro de los ejemplares destacados del criadero La Caprichosa, es el trochador Don Jaime hijo de Tango de la Perla, considerado uno de los mejores reproductores de la raza y Juana de Sierra Morena. Su potencial genético ya se está viendo en sus crías. Su color moro hace que sea un ejemplar bastante llamativo visualmente; sus hijos salen con color castaño o zaino. Los clientes del criadero que han comprado su semen están satisfechos con este ejemplar pues es muy buen reproductor. Es hermano completo con Travesura otra de las yeguas trochadoras superiores del criadero.

Superiores, imponentes, rítmicos en su andar, herencia de lo mejor de lo mejor, así son los ejemplares del criadero La Caprichosa, un criadero orgullosamente colombiano.

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Cónsul de Gran Dinastía, cinco ratificaciones como fuera de concurso hacen de este ejemplar uno de los más importantes exponentes de la raza trocha colombiana.

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Cónsul de Gran Dinastía, mejor jefe de raza en tres ocasiones.

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Don Jaime, transmite a sus cr铆as todo el temperamento, nobleza y fenotipo heredado de su padre Tango de la Perla, uno de los mejores trochadores en la historia equina colombiana.

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Don Jaime, hijo de Tango de la Perla x Juana de Sierra Morena.

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Cónsul de Gran Dinastía, la calidad está en sus crías.

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