RMCP Vol. 7, Núm. 1 (2016): Enero-Marzo

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Triticale variedad Secano TCL 96.

Fotografía tomada por: Héctor Eduardo Villaseñor Mir. Concurso de fotografía INIFAP 2010.

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REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS La Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias es un Ăłrgano de difusiĂłn cientĂ­fica y tĂŠcnica de acceso abierto, revisada por pares y arbitrada. Su objetivo es dar a conocer los resultados de las investigaciones realizadas por cualquier instituciĂłn cientĂ­fica, relacionadas particularmente con las distintas disciplinas de la Medicina Veterinaria y la Zootecnia.

AdemĂĄs de trabajos de las disciplinas indicadas en su ComitĂŠ Editorial, se aceptan tambiĂŠn para su evaluaciĂłn y posible publicaciĂłn, trabajos de otras disciplinas, siempre y cuando estĂŠn relacionados con la investigaciĂłn pecuaria.

publicar es de $ 5,600.00 por manuscrito ya editado en ambos idiomas.

Se publican en la revista tres categorĂ­as de trabajos: ArtĂ­culos CientĂ­ficos, Notas de InvestigaciĂłn y Revisiones BibliogrĂĄficas (consultar las Notas al autor); la responsabilidad de cada trabajo recae exclusivamente en los autores, los cuales, por la naturaleza misma de los experimentos pueden verse obligados a referirse en algunos casos a los nombres comerciales de ciertos productos, ello sin embargo, no implica preferencia por los productos citados o ignorancia respecto a los omitidos, ni tampoco significa en modo alguno respaldo publicitario hacia los productos mencionados.

La correspondencia relativa a suscripciones, asuntos de intercambio o distribuciĂłn, deberĂĄ dirigirse al Editor en Jefe de la Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias, C obiologĂ­a Animal,

Se autoriza la reproducciĂłn total o parcial del contenido de los artĂ­culos si se cita la fuente.

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Todas las contribuciones serĂĄn cuidadosamente evaluadas por ĂĄrbitros, considerando su calidad y relevancia acadĂŠmica. Queda entendido que el someter un manuscrito implica que la investigaciĂłn descrita es Ăşnica e inĂŠdita.

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V

ArtĂ­culos completos desde el aĂąo 2000 a la fecha y Notas al autor en: http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is a open access peer-reviewed and refereed scientific and technical journal, which publishes results of research carried out in any scientific or academic institution, especially related to different areas of veterinary medicine and animal production. Papers on disciplines different from those shown in Editorial Committee can be accepted, if related to livestock research.

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OUR SITE IN THE INTERNET Full articles from year 2000 to date and Instructions for authors can be accessed via the site http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx II

REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS REV. MEX. CIENC. PECU.

VOL. 7 No. 1

ENERO-MARZO-2016

CONTENIDO ARTÍCULOS

Pág.

Análisis genético para vida productiva en ganado Holstein de México Genetic analysis of productive life in Holstein cattle in Mexico José R. Abadía Rojas, Felipe de Jesús Ruíz López, Vicente E. Vega Murillo, Hugo H. Montaldo ............. 1

Curvas de lactancia individuales en vacas Siboney de Cuba Individual lactation curves in Siboney dairy cows of Cuba Alejandro Palacios Espinosa, Dianelys González-Peña Fundora, Danilo Guerra Iglesias, José Luis Espinoza Villavicencio, Ricardo Ortega Pérez, Ariel Guillén Trujillo, Narciso Ávila Serrano ....... 15

Actividad biológica e inmunológica de las isoformas de carga de la hormona luteinizante bovina Biological and immunological activity in bovine luteinizing hormone charge isoforms Álvaro Ortega, Aleida Olivares, Clara Murcia, Daniel Díaz, Everardo González-Padilla, Arnulfo Montero, Gabriel Gutiérrez Ospina, Gerardo Perera-Marín ..........................................................29

Estudio morfométrico de los epidídimos durante el desarrollo postnatal de corderos Barbados Blackbelly Morphometric study of the epididymides during the postnatal development in Barbados Blackbelly ram lambs Anahy Danae Vargas-Velázquez, Héctor Jiménez-Severiano ...................................................................53

Tipología de las explotaciones ganaderas de bovinos doble propósito en Sinaloa, México Typology of dual-purpose cattle production farms in Sinaloa, Mexico Venancio Cuevas Reyes, Alfredo Loaiza Meza, José Antonio Espinosa García, Alejandra Vélez Izquierdo, María Denisse Montoya Flores .....................................................................69

Propiedades de crecimiento de las líneas celulares DH82 y RF/6A bajo condiciones normales de laboratorio Growth properties of DH82 and RF/6A cell lines under standard laboratory conditions Samara Machuca Figueroa, Gabriela Granjeno Colín, Sergio Darío Rodríguez Camarillo, Carlos Agustín Vega y Murguía ............................................................................................................85

III

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Requerimientos energéticos de ovinos de pelo en las regiones tropicales de Latinoamérica. Revisión Energy requirements of hair sheep in the tropical regions of Latin America. Review Alfonso Juventino Chay-Canul, Juan Gabriel Magaña-Monforte, Mario Luiz Chizzotti, Angel Trinidad Piñeiro-Vázquez, Jorge Rodolfo Canul-Solís, Armin Javier Ayala-Burgos, Juan Carlos Ku-Vera, Luis Orlindo Tedeschi ........................................................................................ 105

NOTAS DE INVESTIGACIÓN Adaptación de Mycobacterium smegmatis ante el agotamiento de nutrientes y su efecto en la expresión de esat-6 Adaptation of Mycobacterium smegmatis to nutrient depletion and its effect on esat-6 expression Héctor M. López-Pérez, Sixto Velarde-Félix, Idalia Enriquez-Verdugo, Rosa Xicotencatl-Palacios, Soila M. Gaxiola-Camacho ................................................................................................................. 127

IV

Actualización: enero, 2016

NOTAS AL AUTOR

La Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias se edita completa en dos idiomas (español e inglés) y publica tres categorías de trabajos: Artículos científicos, Notas de investigación y Revisiones bibliográficas.

extensión máxima de 15 cuartillas y 6 cuadros o figuras. Las Revisiones bibliográficas una extensión máxima de 30 cuartillas y 5 cuadros.

6.

Los autores interesados en publicar en esta revista deberán ajustarse a los lineamientos que más adelante se indican, los cuales en términos generales, están de acuerdo con los elaborados por el Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (CIERM) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437.

1.

Página del título Resumen en español Resumen en inglés Texto Agradecimientos Literatura citada Cuadros y gráficas

Sólo se aceptarán trabajos inéditos. No se admitirán si están basados en pruebas de rutina, ni datos experimentales sin estudio estadístico cuando éste sea indispensable. Tampoco se aceptarán trabajos que previamente hayan sido publicados condensados o in extenso en Memorias o Simposio de Reuniones o Congresos (a excepción de Resúmenes).

2.

Todos los trabajos estarán sujetos a revisión de un Comité Científico Editorial, conformado por Pares de la Disciplina en cuestión, quienes desconocerán el nombre e Institución de los autores proponentes. El Editor notificará al autor la fecha de recepción de su trabajo.

3.

El manuscrito deberá someterse a través del portal de la Revista en la dirección electrónica: http:// cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, consultando el "Instructivo para envío de artículos en la página de la Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias". Para su elaboración se utilizará el procesador de Microsoft Word, con letra Arial a 12 puntos, a doble espacio.

Asimismo se deberá remitir una carta de presentación firmada por todos los autores, aceptando el orden de co-autoría, remitiéndola en forma digitalizada como archivo complementario; en ella se indicará el responsable de la correspondencia con la Revista, indicando dirección (no apartado postal), teléfono y dirección electrónica.

4.

Por ser una revista con arbitraje, y para facilitar el trabajo de los revisores, todos los renglones de cada página deben estar numerados; asimismo cada página debe estar numerada, inclusive cuadros, ilustraciones y gráficas.

5.

Los artículos tendrán una extensión máxima de 20 cuartillas a doble espacio, sin incluir páginas de Título, y cuadros o figuras (los cuales no deberán exceder de ocho). Las Notas de investigación tendrán una

Los manuscritos de las tres categorías de trabajos que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu. deberán contener los componentes que a continuación se indican, empezando cada uno de ellos en página aparte.

7.

Página del Título. Debe contener a) el título del trabajo, que debe ser conciso pero informativo; b) nombre(s) y apellidos completos de cada autor, acompañados de su afiliación institucional; c) nombre del departamento o departamentos y la institución o instituciones a los que se debe atribuir el trabajo; d) nombre y dirección del autor a quien deben dirigirse la correspondencia, y f) origen del apoyo recibido en forma de subvenciones, equipo y otros (opcional).

8.

Resumen en español. En la segunda página se debe incluir un resumen que no pase de 250 palabras.

En él se indicarán los propósitos del estudio o investigación; los procedimientos básicos y la metodología empleada; los resultados más importantes encontrados, y de ser posible, su significación estadística y las conclusiones principales. A continuación del resumen, en punto y aparte, agregue debidamente rotuladas, de 3 a 8 palabras o frases cortas clave que ayuden a los indizadores a clasificar el trabajo, las cuales se publicarán junto con el resumen.

9.

Resumen en inglés. Anotar el título del trabajo en inglés y a continuación redactar el “abstract” con las mismas instrucciones que se señalaron para el resumen en español. Al final en punto y aparte, se deberán escribir las correspondientes palabras clave (“key words”).

10. Texto. Las tres categorías de trabajos que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu. consisten en lo siguiente:

V

a) Artículos científicos. Deben ser informes de trabajos originales derivados de resultados parciales o finales de investigaciones. El texto del Artículo científico se divide en secciones que llevan estos encabezamientos:

referencias; las “observaciones inéditas” y las “comunicaciones personales” no deben usarse como referencias, aunque pueden insertarse en el texto (entre paréntesis).

Introducción Materiales y Métodos Resultados Discusión Conclusiones e implicaciones

Reglas básicas para la Literatura citada Nombre de los autores, con mayúsculas sólo las iniciales, empezando por el apellido paterno, luego iniciales del materno y nombre(s). En caso de apellidos compuestos se debe poner un guión entre ambos, ejemplo: Elías-Calles E. Entre las iniciales de un autor no se debe poner ningún signo de puntuación, ni separación; después de cada autor sólo se debe poner una coma, incluso después del penúltimo; después del último autor se debe poner un punto.

En los artículos largos puede ser necesario agregar subtítulos dentro de estas divisiones a fin de hacer más claro el contenido, sobre todo en las secciones de Resultados y de Discusión, las cuales también pueden presentarse como una sola sección. b) Notas de investigación. Consisten en modificaciones a técnicas, informes de casos clínicos de interés especial, preliminares de trabajos o investigaciones limitadas, descripción de nuevas variedades de pastos; así como resultados de investigación que a juicio de los editores deban así ser publicados. El texto contendrá la misma información del método experimental señalado en el inciso a), pero su redacción será corrida del principio al final del trabajo; esto no quiere decir que sólo se supriman los subtítulos, sino que se redacte en forma continua y coherente.

El título del trabajo se debe escribir completo (en su idioma original) luego el título abreviado de la revista donde se publicó, sin ningún signo de puntuación; inmediatamente después el año de la publicación, luego el número del volumen, seguido del número (entre paréntesis) de la revista y finalmente el número de páginas (esto en caso de artículo ordinario de revista).

c) Revisiones bibliográficas. Consisten en el tratamiento y exposición de un tema o tópico de relevante actualidad e importancia; su finalidad es la de resumir, analizar y discutir, así como poner a disposición del lector información ya publicada sobre un tema específico. El texto se divide en: Introducción, y las secciones que correspondan al desarrollo del tema en cuestión.

En el caso de libros de un solo autor (o más de uno, pero todos responsables del contenido total del libro), después del o los nombres, se debe indicar el título del libro, el número de la edición, el país, la casa editorial y el año.

Puede incluir en la lista de referencias, los artículos aceptados aunque todavía no se publiquen; indique la revista y agregue “en prensa” (entre corchetes).

Cuando se trate del capítulo de un libro de varios autores, se debe poner el nombre del autor del capítulo, luego el título del capítulo, después el nombre de los editores y el título del libro, seguido del país, la casa editorial, año y las páginas que abarca el capítulo.

11. Agradecimientos. Siempre que corresponda, se deben especificar las colaboraciones que necesitan ser reconocidas, tales como a) la ayuda técnica recibida; b) el agradecimiento por el apoyo financiero y material, especificando la índole del mismo; c) las relaciones financieras que pudieran suscitar un conflicto de intereses. Las personas que colaboraron pueden ser citadas por su nombre, añadiendo su función o tipo de colaboración; por ejemplo: “asesor científico”, “revisión crítica de la propuesta para el estudio”, “recolección de datos”, etc.

En el caso de tesis, se debe indicar el nombre del autor, el título del trabajo, luego entre corchetes el grado (licenciatura, maestría, doctorado), luego el nombre de la ciudad, estado y en su caso país, seguidamente el nombre de la Universidad (no el de la escuela), y finalmente el año.

Emplee el estilo de los ejemplos que aparecen a continuación, los cuales están parcialmente basados en el formato que la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos usa en el Index Medicus.

12. Literatura citada. Numere las referencias consecutivamente en el orden en que se mencionan por primera vez en el texto. Las referencias en el texto, en los cuadros y en las ilustraciones se deben identificar mediante números arábigos entre paréntesis, sin señalar el año de la referencia. Evite hasta donde sea posible, el tener que mencionar en el texto el nombre de los autores de las referencias.

Procure abstenerse de utilizar los resúmenes como

Revistas

Artículo ordinario, con volumen y número. (Incluya el nombre de todos los autores cuando sean seis o menos; si son siete o más, anote sólo el nombre de los seis primeros y agregue “et al.”).

VI

I)

Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de grasa o proteína de escape ruminal en el comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

inducción de estro lactacional [resumen]. Reunión nacional de investigación pecuaria. Querétaro, Qro. 1998:13.

XII) Cunningham EP. Genetic diversity in domestic animals: strategies for conservation and development. In: Miller RH et al. editors. Proc XX Beltsville Symposium: Biotechnology’s role in genetic improvement of farm animals. USDA. 1996:13.

Sólo número sin indicar volumen.

II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis, reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet Rec 1988;(122):6-10.

Tesis.

III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status ofthe use of artificial insemination in developing countries.

World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosis y babesiosis bovinas en becerros mantenidos en una zona endémica [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 1989.

No se indica el autor.

XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA: University of California; 1965.

IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15.

Suplemento de revista.

Organización como autor.

V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett SE. Body composition at puberty in beef heifers as influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim Sci 1998;71(Suppl 1):205.

XV) NRC. National Research Council. The nutrient requirements of beef cattle. 6th ed. Washington, DC, USA: National Academy Press; 1984.

XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. Curso de actualización técnica para la aprobación de médicos veterinarios zootecnistas responsables de establecimientos destinados al sacrificio de animales. México. 1996.

Organización, como autor.

VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand.

Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;(164):282-284.

En proceso de publicación.

XVII) AOAC. Oficial methods of analysis. 15th ed.

Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemists. 1990.

VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use of herbicide treated area by cattle. J Range Manage [in press] 2000.

XVIII)SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1988.

Libros y otras monografías

XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.).

Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

Autor total.

Publicaciones electrónicas

VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York, USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder type on growth performance and feeding patterns in growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http:/ /jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accessed Jul 30, 2003.

Autor de capítulo.

IX)

Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor.

Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield, Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicas para estimar la degradación de proteína y materia orgánica en el rumen y su importancia en rumiantes en pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134. h t t p : / / w w w. t e c n i c a p e c u a r i a . o r g / t r a b a j o s / 200212175725.pdf. Consultado 30 Ago, 2003.

Memorias de reuniones.

X)

XI)

Loeza LR, Angeles MAA, Cisneros GF. Alimentación de cerdos. En: Zúñiga GJL, Cruz BJA editores.

Tercera reunión anual del centro de investigaciones forestales y agropecuarias del estado de Veracruz.

Veracruz. 1990:51-56.

XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feeding level on milk production, body weight change, feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions.

Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://

Olea PR, Cuarón IJA, Ruiz LFJ, Villagómez AE. Concentración de insulina plasmática en cerdas alimentadas con melaza en la dieta durante la

VII

i.v.

J kg km L log Mcal MJ m msnm µg µl µm mg ml mm min ng

www.sciencedirect.com/science/journal/03016226.

Accessed Sep 12, 2003.

13. Cuadros, Gráficas e Ilustraciones. Es preferible que sean pocos, concisos, contando con los datos necesarios para que sean autosuficientes, que se entiendan por sí mismos sin necesidad de leer el texto. Para las notas al pie se deberán utilizar los símbolos convencionales.

14 Versión final. Es el documento en el cual los autores ya integraron las correcciones y modificaciones indicadas por el Comité Revisor. Los trabajos deberán ser elaborados con Microsoft Word. Las gráficas y figuras se deberán elaborar en Word, Power Point, Corel Draw y enviadas en archivo aparte (nunca insertarlas como imágenes en el texto). Los cuadros no deberán contener ninguna línea vertical, y las horizontales solamente las que delimitan los encabezados de columna, y la línea al final del cuadro.

15. Una vez recibida la versión final, ésta se mandará para su traducción al idioma inglés o español, según corresponda. Si los autores lo consideran conveniente podrán enviar su manuscrito final en ambos idiomas.

vs

versus

xg

gravedades

P

16. Tesis. Se publicarán como Artículo o Nota de Investigación, siempre y cuando se ajusten a las normas de esta revista.

17. Los trabajos no aceptados para su publicación se regresarán al autor, con un anexo en el que se explicarán los motivos por los que se rechaza o las modificaciones que deberán hacerse para ser reevaluados.

18. Abreviaturas de uso frecuente: cal cm °C DL50 g ha h i.m.

p PC PCR pp ppm % rpm seg t TND UA UI

intravenosa (mente) joule (s) kilogramo (s) kilómetro (s) litro (s) logaritmo decimal megacaloría (s) megajoule (s) metro (s) metros sobre el nivel del mar microgramo (s) microlitro (s) micrómetro (s)(micra(s)) miligramo (s) mililitro (s) milímetro (s) minuto (s) nanogramo (s) probabilidad (estadística) página proteína cruda reacción en cadena de la polimerasa páginas partes por millón por ciento (con número) revoluciones por minuto segundo (s) tonelada (s) total de nutrientes digestibles unidad animal unidades internacionales

caloría (s) centímetro (s) grado centígrado (s) dosis letal 50% gramo (s) hectárea (s) hora (s) intramuscular (mente)

Cualquier otra abreviatura se pondrá entre paréntesis inmediatamente después de la(s) palabra(s) completa(s).

19. Los nombres científicos y otras locuciones latinas se deben escribir en cursivas.

VIII

Update: January, 2016

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is a scientific journal published in a bilingual format (Spanish and English) which carries three types of papers: Research Articles, Technical Notes, and Reviews. Authors interested in publishing in this journal, should follow the belowmentioned directives which are based on those set down by the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437.

1.

Only original unpublished works will be accepted.

Manuscripts based on routine tests, will not be accepted. All experimental data must be subjected to statistical analysis. Papers previously published condensed or in extenso in a Congress or any other type of Meeting will not be accepted (except for Abstracts).

2.

All contributions will be peer reviewed by a scientific editorial committee, composed of experts who ignore the name of the authors. The Editor will notify the author the date of manuscript receipt.

3.

Papers will be submitted in the Web site http:// cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, according the “Guide for submit articles in the Web site of the Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias”. Manuscripts should be prepared, typed in a 12 points font at double space (including the abstract and tables), At the time of submission a signed agreement co-author letter should enclosed as complementary file; co-authors at different institutions can mail this form independently.

The corresponding author should be indicated together with his address (a post office box will not be accepted), telephone and Email.

4.

To facilitate peer review all pages should be numbered consecutively, including tables, illustrations and graphics, and the lines of each page should be numbered as well.

5.

Research articles will not exceed 20 double spaced pages, without including Title page and Tables and Figures (8 maximum). Technical notes will have a maximum extension of 15 pages and 6 Tables and Figures. Reviews should not exceed 30 pages and 5 Tables and Figures.

6.

Title page Abstract Text Acknowledgments References Tables and Graphics 7.

Title page. This section should include: a) Title, which should be concise but informative; b) Each author’s name, accompanied by their institutional affiliation; c) Departments and institutions to whom the work should be attributed; d) Name and address of the author responsible for correspondence related to the manuscript; and f) Origin of funding.

8.

Abstract. On the second page a summary of no more than 250 words should be included. This abstract should start with a clear statement of the objectives and must include basic procedures and methodology.

The more significant results and their statistical value and the main conclusions should be elaborated briefly.

At the end of the abstract, and on a separate line, a list of up to 10 key words or short phrases that best describe the nature of the research should be stated.

9.

Text. The three categories of articles which are published in Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias are the following:

a) Research Articles. They should originate in primary works and may show partial or final results of research. The text of the article must include the following parts: Introduction Materials and Methods Results Discussion Conclusions and implications In lengthy articles, it may be necessary to add other sections to make the content clearer. Results and Discussion can be shown as a single section if considered appropriate.

b) Technical Notes. They should be brief and be evidence for technical changes, reports of clinical cases of special interest, complete description of a limited investigation, or research results which should be published as a note in the opinion of the editors. The text will contain the same information presented in

Manuscripts of all three type of articles published in Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias should contain the following sections, and each one should begin on a separate page.

IX

the sections of the research article but without section titles.

names(s), the number of the edition, the country, the printing house and the year.

c) Reviews. The purpose of these papers is to summarize,

e. When a reference is made of a chapter of book written by several authors; the name of the author(s) of the chapter should be quoted, followed by the title of the chapter, the editors and the title of the book, the country, the printing house, the year, and the initial and final pages.

analyze and discuss an outstanding topic. The text of these articles should include the following sections: Introduction, and as many sections as needed that relate to the description of the topic in question.

10. Acknowledgements. Whenever appropriate, collaborations that need recognition should be specified: a) Acknowledgement of technical support; b) Financial and material support, specifying its nature; and c) Financial relationships that could be the source of a conflict of interest.

f.

In the case of a thesis, references should be made of the author’s name, the title of the research, the degree obtained, followed by the name of the City, State, and Country, the University (not the school), and finally the year.

Examples

People which collaborated in the article may be named, adding their function or contribution; for example: “scientific advisor”, “critical review”, “data collection”, etc.

The style of the following examples, which are partly based on the format the National Library of Medicine of the United States employs in its Index Medicus, should be taken as a model.

11. References. All references should be quoted in their original language. They should be numbered consecutively in the order in which they are first mentioned in the text. Text, tables and figure references should be identified by means of Arabic numbers. Avoid, whenever possible, mentioning in the text the name of the authors. Abstain from using abstracts as references. Also, “unpublished observations” and “personal communications” should not be used as references, although they can be inserted in the text (inside brackets).

Journals

Standard journal article (List the first six authors followed by et al.)

I)

Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de grasa o proteína de escape ruminal en el comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

Issue with no volume

Key rules for references

II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis, reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet Rec 1988;(122):6-10.

a. The names of the authors should be quoted beginning with the last name spelt with initial capitals, followed by the initials of the first and middle name(s).

In the presence of compound last names, add a dash between both, i.e. Elias-Calles E. Do not use any punctuation sign, nor separation between the initials of an author; separate each author with a comma, even after the last but one.

III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status of the use of artificial insemination in developing countries.

World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

No author given

b. The title of the paper should be written in full, followed by the abbreviated title of the journal without any punctuation sign; then the year of the publication, after that the number of the volume, followed by the number (in brackets) of the journal and finally the number of pages (this in the event of ordinary article).

IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15.

Journal supplement V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett SE. Body composition at puberty in beef heifers as influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim Sci 1998;71(Suppl 1):205.

c. Accepted articles, even if still not published, can be included in the list of references, as long as the journal is specified and followed by “in press” (in brackets).

Organization, as author VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand.

Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;(164):282-284.

d. In the case of a single author’s book (or more than one, but all responsible for the book’s contents), the title of the book should be indicated after the

X

In press

XVII) AOAC. Official methods of analysis. 15th ed.

Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemists. 1990.

VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use of herbicide-treated area by cattle. J Range Manage [in press] 2000.

XVIII) SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1988.

XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.).

Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

Books and other monographs

Author(s)

Electronic publications

VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York, USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder type on growth performance and feeding patterns in growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http:/ /jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accesed Jul 30, 2003.

Chapter in a book IX)

Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor.

Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield, Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicas para estimar la degradación de proteína y materia orgánica en el rumen y su importancia en rumiantes en pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134. h t t p : / / w w w. t e c n i c a p e c u a r i a . o r g / t r a b a j o s / 200212175725.pdf. Consultado 30 Jul, 2003.

Conference paper X)

XI)

Loeza LR, Angeles MAA, Cisneros GF. Alimentación de cerdos. En: Zúñiga GJL, Cruz BJA editores.

Tercera reunión anual del centro de investigaciones forestales y agropecuarias del estado de Veracruz.

Veracruz. 1990:51-56.

XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feeding level on milk production, body weight change, feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions.

Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http:// www.sciencedirect.com/science/journal/03016226.

Accesed Sep 12, 2003.

Olea PR, Cuarón IJA, Ruiz LFJ, Villagómez AE. Concentración de insulina plasmática en cerdas alimentadas con melaza en la dieta durante la inducción de estro lactacional [resumen]. Reunión nacional de investigación pecuaria. Querétaro, Qro. 1998:13.

12. Tables, Graphics and Illustrations. It is preferable that they should be few, brief and having the necessary data so they could be understood without reading the text. Explanatory material should be placed in footnotes, using conventional symbols.

XII) Cunningham EP. Genetic diversity in domestic animals: strategies for conservation and development. In: Miller RH et al. editors. Proc XX Beltsville Symposium: Biotechnology’s role in genetic improvement of farm animals. USDA. 1996:13.

13. Final version. This is the document in which the authors have incorporated all the corrections and modifications asked for by the editors. Graphs and figures should be submitted separately in Microsoft Word, MS Power Point, or Corel Draw. Figures must not be inserted as images within the text. In Tables do not use internal horizontal or vertical lines.

Thesis XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosis y babesiosis bovinas en becerros mantenidos en una zona endémica [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 1989.

14. Once accepted, the final version will be translated into Spanish or English, although authors should feel free to send the final version in both languages. No charges will be made for style or translation services.

XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA: University of California; 1965.

15. Thesis will be published as a Research Article or as a Technical Note, according to these guidelines.

Organization as author XV) NRC. National Research Council. The nutrient requirements of beef cattle. 6th ed. Washington, DC, USA: National Academy Press; 1984.

16. Manuscripts not accepted for publication will be returned to the author together with a note explaining the cause for rejection, or suggesting changes which should be made for re-assessment.

XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. Curso de actualización técnica para la aprobación de médicos veterinarios zootecnistas responsables de establecimientos destinados al sacrificio de animales. México. 1996.

17. List of abbreviations: cal cm

XI

calorie (s) centimeter (s)

°C DL50 g ha h i.m. i.v.

J kg km L log Mcal MJ m Âľl Âľm mg ml mm min

degree Celsius lethal dose 50% gram (s) hectare (s) hour (s) intramuscular (..ly) intravenous (..ly) joule (s) kilogram (s) kilometer (s) liter (s) decimal logarithm mega calorie (s) mega joule (s) meter (s) micro liter (s) micro meter (s) milligram (s) milliliter (s) millimeter (s) minute (s)

ng p CP PCR pp ppm % rpm sec t TDN AU IU

nanogram (s) probability (statistic) page crude protein polymerase chain reaction pages parts per million percent (with number) revolutions per minute second (s) metric ton (s) total digestible nutrients animal unit international units

vs

versus

xg

gravidity

P

The full term for which an abbreviation stands should precede its first use in the text.

18. Scientific names and other Latin terms should be written in italics.

XII

ANÁLISIS GENÉTICO PARA VIDA PRODUCTIVA EN GANADO HOLSTEIN Rev Mex DE Cienc MÉXICO Pecu 2016;7(1):1-14

Análisis genético para vida productiva en ganado Holstein de México Genetic analysis of productive life in Holstein cattle in Mexico José R. Abadía Rojasa, Felipe de Jesús Ruíz Lópezb, Vicente E. Vega Murilloc, Hugo H. Montaldod

RESUMEN Se usó la metodología de análisis de supervivencia con un modelo de riesgos proporcionales de Weibull para estudiar la duración de vida productiva funcional (DVPF) de ganado Holstein en México, usando un modelo padre-abuelo materno con el software Survival Kit V3.12. La DVPF se calculó como el número de días entre la fecha de primer parto y la fecha de desecho o censura, con un crédito máximo de 305 días por lactación. Los datos analizados se obtuvieron de la Asociación Holstein de México. El archivo final constó de 36,507 registros para DVPF de vacas que parieron por primera vez entre 1995 y 2008. El modelo incluyó la función de riesgo basal de Weibull y los siguientes efectos fijos: edad al primer parto, número de lactación por fase de lactación con cortes en los días 29, 249 y 305 y nivel de producción estandarizado con 10 clases con cambios en cada lactación, incluidas como variables tiempo dependientes y los efectos aleatorios de hato-año de parto y efectos genéticos de padre y abuelo materno. El porcentaje de censura fue de 25.54 %. Todos los efectos fijos analizados fueron significativos (P<0.0001) y tuvieron una influencia importante en el riesgo de desecho de los animales. Las heredabilidades calculadas en escalas logarítmica, original, efectiva y equivalente resultaron de 0.08, 0.13, 0.12 y 0.10 respectivamente, indicando que este carácter se puede integrar efectivamente a los programas de mejoramiento genético como se ha hecho en otras poblaciones de ganado Holstein.

PALABRAS CLAVE: Análisis de supervivencia, Modelo de Weibull, Variable tiempo dependiente, Heredabilidades.

ABSTRACT Methodology survival analysis model with Weibull proportional hazards was used to study Holstein cattle duration of functional productive life (FPL) in Mexico, using a model sire-maternal grandsire with Survival Kit V3.12 software.

The FPL was calculated as the number of days between the date of first calving and the date of culling or censored, with a maximum credit of 305 d per lactation. The FPL was defined as the length of time between first calving and date of culling or death and a maximum of 305 d lactation. The data analyzed were obtained from the Holstein Association of Mexico. The final file consisted of 36,507 records for FPL of cows that calved for the first time between 1995 and 2008. The model included baseline hazard function of Weibull and the following fixed effects: age at first calving, lactation number by stage of lactation with cuts 29, 249 y 305 and standardized production level, with 10 classes with changes in each lactation period included as dependent variables and random effects of herd-year of calving and genetic effects of sire and maternal grandsire. Percentage of censored data was 25.54 %. All analyzed fixed effects were significant (P<0.0001) and had a significant risk of animal culling influence. The heritability calculated logarithmic, original, effective and equivalent scales were 0.08, 0.13, 0.12 and 0.10 respectively, indicating that this character can effectively integrate breeding programs as has been done in other locations of Holstein cattle.

KEY WORDS: Survival analysis, Weibull model, Variable time dependent, Heritability.

Recibido el 25 de junio de 2013. Aceptado el 15 de agosto de 2013. a

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana. Miguel Ángel de Quevedo s/n esq. Yáñez Col. Unidad Veracruzana, 91710 Veracruz, Ver. México.

b

Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal, INIFAP. México. ruiz.felipe@inifap.gob.mx. Correspondencia al segundo autor.

c

Centro de Investigación Regional Golfo Centro, INIFAP. México.

d

Universidad Nacional Autónoma de México. México.

Este trabajo es parte de la tesis de maestría del primer autor.

Esta investigación fue apoyada por la Asociación Holstein de México, el CONACYT, el CONARGEN y el Programa Nacional de Mejoramiento Genético HolsteinSAGARPA.

1

José R. Abadía Rojas, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):1-14

INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

La longevidad en bovinos lecheros puede medirse como el tiempo que transcurre desde el primer parto hasta el desecho o muerte del animal, lo que también es conocido como duración de vida productiva (DVP). La DVP de una vaca productora de leche puede estar determinada por su nivel de producción, fertilidad, salud, etc. De particular interés es el proceso de desecho involuntario, es decir, el desecho por causas fuera del control del ganadero como son enfermedades o problemas reproductivos, y cuando este proceso incluye el nivel de producción de la vaca en el modelo con el fin de corregir para el desecho voluntario; esta característica es conocida como duración de vida productiva funcional (DVPF)(1,2).

Longevity in dairy cows can be measured as the time from first parturition to animal cull or death, an interval called productive life (PL). In a producing dairy cow, PL is influenced by production level, fertility, health, etc. Of particular interest is involuntary culling, that is, for reasons beyond the control of the farmer (e.g. disease or reproductive problems). This process is known as functional productive life (FPL) when it includes cow production level in the model in an effort to correct for voluntary culling(1,2).

The study of FPL using survival analysis techniques allows incorporation of timedependent covariables, use of incomplete (censured) records, analysis of large data bases and application of mixed models that permit national level genetic evaluations. However, the way these evaluations are done and the models used to do so, can vary depending on circumstances(3,4,5).

El uso de técnicas de análisis de supervivencia para estudiar la DVPF tiene la ventaja de que permite incorporar covariables dependientes del tiempo, utilizar registros incompletos (censurados), analizar grandes bases de datos y aplicar modelos mixtos que permiten a su vez realizar evaluaciones genéticas nacionales, aunque la forma de evaluar y los modelos utilizados varían de acuerdo a las circunstancias de utilización(3,4,5).

Previous studies using data from Mexico have analyzed the effect of milk production level on PL either based on a Kaplan-Meier estimator and a Weibull regression model(6), or using mixed linear models and treating longevity as the ability to remain in the herd at 48 mo of age with a PL extending to the third lactation(7).

No studies have been done, however, addressing the use of survival analysis in predicting genetic values in a Holstein population in Mexico under milk recording. Genetic values are needed to develop effective genetic improvement systems for this trait on artificial insemination bulls used in Mexico. This trait is vital to genetic improvement of dairy cows for reasons of economy (e.g. production system sustainability) and animal health (improved PL reduces risk of disease)(6,7).

En estudios previos a partir de información en México, se analizó el efecto de nivel de producción de leche sobre la DVP, con base en un estimador Kaplan-Meier y un modelo de regresión de Weibull (6), o se analizó la longevidad como la capacidad de permanencia a los 48 meses y como duración de vida productiva hasta la tercera lactación, empleando modelos lineales mixtos(7). Sin embargo, no se han realizado estudios que aborden el uso de técnicas de supervivencia en la predicción de valores genéticos en la población Holstein de México bajo control de producción. Esto resulta necesario para el desarrollo de sistemas eficaces de evaluación genética para esta característica en toros de inseminación artificial usados en

The present study objectives were to estimate heritabilities and predict genetic values for FPL by applying a proportional risk model with a 2

ANÁLISIS GENÉTICO PARA VIDA PRODUCTIVA EN GANADO HOLSTEIN DE MÉXICO

Weibull distribution in a Holstein population in Mexico.

México, dado que se trata de una característica de gran importancia para la mejora genética de los bovinos productores de leche, considerando tanto aspectos económicos, como de la sostenibilidad de los sistemas de producción e incluso del bienestar animal, al contribuir el mejoramiento de la DVP por una reducción de los riesgos de enfermedad(6,7).

MATERIAL AND METHODS Data was for Holstein cows with first parturition between 1995 and 2008, and was provided by the Mexican Holstein Association (Asociación Holstein de México) from official milk recording and genealogical records. Productive life (PL) was calculated as the number of days between date of first parturition and date of culling or censure. Maximum credit for lactation was 305 d and censured animals were defined as records of cows sold to other farms for production, of live cows in a herd when its production stopped being recorded, or of cows with non-consecutive lactations. For greater accuracy, and to ensure model convergence, lactations were eliminated for any one of four reasons: 1) Abnormal standardized milk production, i.e. <2,500 kg (1st percentile) or >17,000 kg (99th percentile); 2) No data for first lactation; 3) First lactation at <17 mo of age; and 4) Daughters of sires with less than five daughters. The final database consisted of 36,507 PL records.

Los objetivos del presente estudio fueron estimar heredabilidades y predecir valores genéticos para DVPF, aplicando una distribución Weibull y utilizando un modelo de riesgos proporcionales en ganado Holstein de México.

MATERIAL Y MÉTODOS Se utilizó información de vacas Holstein que parieron por primera vez entre 1995 y 2008, proporcionada por la Asociación Holstein de México a partir del control lechero oficial y del registro genealógico. La DVP se calculó como el número de días entre la fecha de primer parto y la fecha de desecho o censura, con un crédito máximo de 305 días por lactación y definiéndose como censurados los registros de animales que se vendieron vivos para producción a otros ranchos, aquéllos de vacas vivas cuando el hato dejó de estar en control de producción, o lactaciones no consecutivas de un mismo animal. Para obtener una mejor precisión y asegurar la convergencia de los modelos se eliminaron lactaciones: con producciones de leche estandarizadas fuera del intervalo de 2,500 y 17,000 kg correspondientes a los porcentiles 1 y 99 respectivamente por considerarlas anormales; datos de vacas sin información de primeras lactaciones; datos de vacas con edades al primer parto menores de 17 meses y datos de vacas hijas de sementales con menos de cinco hijas. El archivo final constó de 36,507 registros para DVP.

Parameter estimations and genetic value predictions were calculated with the Survival Kit ver. 3.12 program(8,9). A sire-maternal grandsire proportional risk model was used in which a Weibull distribution was assumed for the basic risk function. The FPL analysis model was: h( t ) =  (  t )  -1 exp {HY j (t ) +AP k ( t) +LP lm (t ) + MPL n (t)+S q +0.5s mg } In this model, h(t ) represents a cow elimination risk in time t . The basic risk function is  ( t )  1 , where  is the distribution shape parameter and  corresponds to the distribution scale parameter. HY j (t ) is the random effect of the j-th herd-year of first parturition. This had a log-gamma function associated with parameter  , included to acknowledge that animal elimination is a decision made by comparing animals within similar or contemporaneous

Las estimaciones de los parámetros y las predicciones de los valores genéticos se calcularon usando el programa Survival Kit V3.12(8,9), empleando un modelo de riesgos 3

José R. Abadía Rojas, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):1-14

groups, the effect of which is not explained in this study(8). APk (t ) is the k-th effect of age at first parturition in months, divided into four categories (1, 23 mo; 2, 24-25 mo; 3, 26-27 mo; and 4, 28 mo). LPlm (t ) is the timedependent effect of the l-th lactation phase, divided into three times (1-29, 30-249 and 250305 d after parturition), within the m-th lactation (i.e. 1, 2, 3 and 4), assuming that risk does not change within each segment.

MPLn (t ) is the effect of the n -th milk production level within herd-year of first parturition; production levels were calculated by organizing production records in ascending order to generate the mean and standard deviation. Finally, deciles were calculated based on normal milk production to represent production level per lactation, divided into ten categories, 1 being the lowest and 10 the highest. Sire ( s q ) and maternal grandsire e ( smg ) were random ancestor effects and were e grouped into one vector ( S ) for analysis, assuming that they followed a normal multivariate distribution with A s2 as the variance - covariance matrix.

proporcionales padre-abuelo materno, en el que se supuso una distribución de Weibull para la función de riesgo basal. El modelo de análisis (DVPF) fue el siguiente: h( t ) =  (  t )  -1 exp {HY j (t ) +AP k ( t) +LP lm (t ) + MPL n (t)+S q +0.5s mg } Donde: h(t ) , representa el riesgo de eliminación de una vaca en el tiempo t.  ( t )  1 es la función de riesgo basal, donde  es el parámetro de forma de la distribución y  corresponde al parámetro de escala de la distribución. HA j (t ) , es el efecto aleatorio del j-ésimo hato-año de primer parto, asociado a una distribución log-gamma con parámetro , incluido para reconocer que la eliminación de un animal es una decisión que se toma al comparar animales dentro de grupos similares o contemporáneos, su efecto no se explica en este estudio (8) . EPk (t ) es el efecto de la k-ésima edad al primer parto en meses con cuatro clases (1 (23 meses), 2 (24,25 meses), 3 (26,27 meses) y 4 (28 meses). FLlm (t ) es el efecto tiempo-dependiente de la l-ésima fase de la lactación con cambios en los tiempos: 1-29, 30-249 y 250-305 días después del parto, dentro de la m-ésima lactación: 1, 2, 3,  4, suponiendo que el riesgo no cambia dentro de cada segmento. NPn (t ) es el efecto del n-ésimo nivel de producción dentro del hato-año de primer parto. Los niveles de producción se obtuvieron ordenando los registros productivos en forma ascendente para que acto seguido, se obtuviera la media y la desviación estándar.

Finalmente con base en la distribución normal se calcularon los deciles que representaron el nivel de producción para cada lactación, con 10 clases, siendo el nivel de producción 1 el más bajo y el nivel 10 el más alto. Padre ( s q ) y abuelo materno ( s am ), son los efectos aleatorios de los ancestros y para su análisis se agruparon en un solo vector S suponiendo que siguen una distribución normal multivariada con matriz de varianzas y covarianzas A s2 .

Heritabilities were calculated on a logarithmic 2 scale ( hlog )(4,9), that is, the transformation of time (T) in a logarithmic scale, and in the original scale ( ho2 ), following Ducrocq(10) as described in Chirinos et al(4): 2 hlog 

4 var(s) 5 2 1 (  h  var(s)  ) 4 6

Where:  1 h , is the trigamma function evaluated in  h ; var(s) is sire’s variance; and

2 6

is the extre eme value distribution’s variance.

 1 h  exp    2 o

4

2

 2 v  hlog 

2

  1  2 h  exp  v  hlog     2 o

ANÁLISIS GENÉTICO PARA VIDA PRODUCTIVA EN GANADO HOLSTEIN DE MÉXICO

Where:  is the negative Euler number;  is 2 the shape of the basic risk function; and hlog is the heritability on a logarithmic scale.

Las heredabilidades sobre una escala logarítmica 2 ( hlog )(4,9), es decir, la transformación de la variable tiempo (T) en una escala logarítmica y en la escala original ( ho2 ) , se calcularon siguiendo la metodología de Ducrocq (10) mencionada por Chirinos et al(4) de la siguiente manera: 2 hlog 

To confirm that the original scale heritability expression depended on the Weibull distribution estimators as reported elsewhere(4,10), effective and equivalent heritability were calculated as follows:

4 var(s ) 5 2 (1 h  var(s )  ) 4 6

hef2 

he2( t ) 

Donde:  1 h , es la función trigamma evaluada en  h , Var (s) es la varianza del padre, y

2 6

extremo.

 1 h  exp   

2

 2 v  hlog 

The reliability of the predicted genetic values for sires was calculated based on records of their daughters(10):

2

  1  2 h  exp  v  hlog     2 o

R. 

Donde:  es la esperanza de la distribución del valor extremo: v= negativo del número de Euler;  es la forma de la función de riesgo 2 basal; hlog es la heredabilidad sobre una escala logarítmica.

e 2 e

4

Model effects were tested with a partial likelihood ratio test, and estimation was done using the maximum likelihood method(8).

RESULTS In the total sample of 36,507 FPL records, censoring rate was 25.5 %, cows had an average of 2.23 lactations, average time to cull/ death was 615 d and average time to censoring was 731 d. The data included the daughters of 1,116 sires and 1,684 maternal grandsires.

4 var(s ) 1 (  h  var(s)  1)

he2( t ) 

2

h ( N  1) h N

Where: R is the genetic value reliability of sires; N is the number of daughters with recorded FPL; and he2 is the equivalent heritability..

Con el objeto de verificar si la expresión de la heredabilidad en la escala original dependía de los estimadores de la distribución Weibull como lo mencionaron Chirinos et al(4) y Ducrocq(10), la heredabilidad efectiva y equivalente se calculó como:

hef2 

4 var( s ) (   h  var( s )  1 / p ) 1

Where p is the proportion of complete records, which is applied in the present study.

es la varianza de la distribución del valor

2 o

4 var(s ) (   h  var(s )  1) 1

4 var( s ) (   h  var( s )  1 / p ) 1

Donde p es la proporción de registros completos; esta última se aplica en este estudio.

In terms of relative risk (average risk= 1) under the influence of environmental and genetic 5

José R. Abadía Rojas, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):1-14

Las confiabilidades de los valores genéticos predichos de los padres se calcularon con base en los registros observados de sus hijas, de la manera siguiente(10):

R. 

2

h ( N  1) h N

effects, the youngest cows (categ. 1, 23 mo) had a greater culling risk than the cows in lactation categories 2, 3 and 4. Age at first parturition apparently had no effect on FPL (Table 1, Figure 1).

e 2 e

4

Cuadro 1. Proporción y número de observaciones por fase dentro de lactación

Donde: R es la confiabilidad de los valores genéticos del padre con N hijas, N es el número de hijas con DVPF observada y he2 es la heredabilidad equivalente.

Table 1. Proportion (%) and number (N) of observations by phase within lactation categories and phases

Los efectos del modelo se probaron por medio del test de razón de verosimilitudes de manera parcial y la estimación se efectuó por el método de máxima verosimilitud(8).

RESULTADOS El porcentaje de censura en los 36,507 registros de DVPF fue de 25.5 % y los tiempos promedio al desecho/muerte o censura fueron de 615 y 731 días, respectivamente, con un promedio de 2.23 lactaciones. Los datos incluyeron información de hijas de 1,116 padres y 1,684 abuelos maternos.

Lactation Category

Phase (days)

%

1

1-29 30-249 250-365

0.67 11.70 22.74

181 3182 6181

2

1-29 30-249 250-365

1.30 18.00 14.18

353 4894 3856

3

1-29 30-249 250-365

1.24 12.12 8.95

337 3296 2434

4

1-29 30-249 250-365

0.77 6.33 1.99

209 1721 541

N

Figura 1. Riesgo relativo de desecho (RR) de la edad al primer parto en meses, con cuatro clases en ganado Holstein de México Figure 1. Relative culling risk (RR) in four categories of age (in months) at first parturition for Holstein cattle in Mexico

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ANÁLISIS GENÉTICO PARA VIDA PRODUCTIVA EN GANADO HOLSTEIN DE MÉXICO

Standardized production level (SPL) data showed the cows in the lowest levels as more likely to be culled than a cow with an average SPL (categ. 6); this was 49 times more probable in SPL 1, 5 times greater in SPL 2 and twice as likely in SPL 3 (Table 2, Figure 2). Risk diminished in levels 7, 8 and 9, and then

Las proporciones y número de muertes detectadas dentro de cada FL y nivel de NPE se muestran en los Cuadros 1 y 2 respectivamente. Para las variables independientes incluidas en el modelo utilizado en este estudio, todos los efectos fueron significativos (P<0.0001).

Para facilitar la interpretación de los efectos, los resultados se expresaron en riesgo relativo, bajo la influencia de efectos ambientales y genéticos, donde el riesgo promedio es 1.

Cuadro 2. Proporción y número de observaciones dentro de cada nivel de producción estandarizado (SPL) Table 2. Proportion (%) and number (N) of observations in each standardized production level (SPL)

Las vacas más jóvenes (clase 1, 23 meses) presentaron un riesgo de desecho mayor que las clases 2, 3 y 4; la edad al primer parto no parece tener un efecto sobre la DVPF (Cuadro 1, Figura 1).

El efecto del nivel de producción estandarizado se muestra en la Figura 2. Las vacas dentro de los niveles de producción 1, 2 y 3 (vacas con menores producciones estandarizadas) tuvieron 49, 5 y 2 veces mayor probabilidad de ser desechadas que una vaca promedio (clase 6) respectivamente, después de este nivel el riesgo tendió a disminuir, habiendo un incremento del

SPL

%

N

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

6.06 5.94 8.95 12.81 15.10 15.98 13.01 9.66 6.62 5.86

1648 1616 2434 3482 4105 4343 3536 2626 1801 1594

Figura 2. Riesgo relativo (RR) de desecho para los niveles de producción estandarizados (SPL), con 10 clases: la clase 1, representa el nivel de producción más bajo y la clase 10 el nivel más alto Figure 2. Relative culling risk (RR) in ten standardized production levels (SPL); 1 is lowest production level and 10 is highest

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José R. Abadía Rojas, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):1-14

riesgo en el nivel 10, que corresponde a los animales más altos productores.

increased in level 10, the most productive animals.

El efecto de la fase de la lactación se muestra en la Figura 3, en una vaca con lactancias consecutivas. Se puede observar que el riesgo de desecho tiende a incrementarse conforme transcurren los días en leche y el número de lactación, alcanzando su máximo a los 305 días después del parto e indicando un desecho intensivo durante la tercera fase.

In cows with consecutive lactations, relative risk of discard tended to increase concurrently with milking days and lactation number, reaching a maximum of 305 d after parturition (Figure 3).

The culling rate was particularly intense during the third lactation phase (LP; 250-305 d).

El parámetro Rho (ñ) de la distribución de Weibull, las varianzas del padre y el parámetro gamma para el efecto hato-año de primer parto, la heredabilidad en las escalas logarítmica, original, efectiva y equivalente se presentan el Cuadro 3.

Cuadro 3. Parámetros genéticos estimados del análisis de supervivencia en ganado Holstein de México Table 3. Estimated genetic parameters values for survival of Holstein cattle in Mexico Parameters

Los estimadores de los valores genéticos predichos variaron de -0.68 a 1.62, con una media de cero. El riesgo relativo de desecho para DVPF de las hijas de los padres estudiados presentó un rango de 0.51 a 5.03. Valores genéticos negativos indicaron bajo riesgo de desecho para las hijas de un semental y por tanto, el incremento de su DVPF.

Values



2.37

 Herd-birth year effect

4.28

 2 variance of father

0.0395

h2 heritability, logarithmic scale h2 heritability, original scale

0.08 0.13

h2 effective heritability

0.12

h2 equivalent heritability

0.10

Figura 3. Riesgo relativo (RR) de desecho en las fases de lactación de un animal con lactancias consecutivas: lactaciones 1, 2, 3 y 4 por tres fases de 0-29, 30-249 y 250-305 días Figure 3. Relative culling risk (RR) in cows with consecutive lactations (1, 2, 3 and 4); each lactation is divided into three phases (0-29, 30-249 and 250-305 d)

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ANÁLISIS GENÉTICO PARA VIDA PRODUCTIVA EN GANADO HOLSTEIN DE MÉXICO

The estimators for the predicted genetic values varied from -0.68 to 1.62, with a mean of zero.

Relative risk of culling for FPL in the daughters of the studied sires ranged from 0.51 to 5.03.

Negative genetic values indicated a low cull risk for the daughters of a sire and consequently higher FPL. Among the 2,800 analyzed sires, genetic value reliability varied from 0 to 0.95, with 179 sires having a level 0.50 (Figure 4).

En los 2,800 padres analizados, la confiabilidad de los valores genéticos osciló entre 0 y 0.95 y 179 padres contaron con una confiabilidad mayor o igual a 0.50. En la Figura 4, se puede observar la distribución de las confiabilidades de los valores genéticos para los machos evaluados.

Las tendencias genéticas para DVPF de sementales Holstein mexicanos de acuerdo con su año de nacimiento se muestran en la Figura 5. Las tendencias mostraron un incremento del riesgo del año 1997 al 2002 y una ligera disminución del riesgo en el 2003.

Genetic tendencies for FPL of the studied Mexican Holstein sires by birth year showed increasing risk from 1997 to 2003, followed by a slight decrease in 2003 (Figure 5).

DISCUSSION

DISCUSIÓN

Lactations per PL was low on average in the present data, suggesting that the cows had not yet expressed their maximum productive potential(11,12,13). This implies that they were discarded shortly after completing two lactations, which coincides with previous reports(14-17).

El bajo promedio de número de lactaciones por vida obtenida en este estudio nos indica que a esta edad las vacas pudieran no haber llegado a expresar su máximo potencial de producción(11,12,13), lo cual implica que son desechadas poco después que éstas han completado dos lactaciones, resultados similares fueron reportados por otros investigadores(14-17).

The 25.5 % censoring rate in the records due to incomplete data is within the 9.4 to 73.4 %

Figura 4. Distribución de las confiabilidades de los valores genéticos (GV) de los sementales en estudio de acuerdo con el número de hijas con observaciones completas Figure 4. Genetic value (GV) reliabilities for studied sires based on number of daughters with complete records

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José R. Abadía Rojas, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):1-14

Figura 5. Tendencias genéticas para los valores genéticos estimados (EGV) para duración de vida productiva funcional en sementales Holstein mexicanos nacidos entre los años 1995 y 2003 Figure 5. Genetic trends of estimated genetic values (EGV) for length of functional productive life in Mexican Holstein sires born between 1995 and 2003

En este estudio, el 25.5 % de los registros no contaba con información completa, es decir son datos censurados, lo cual se encuentra dentro del rango de 9.4 a 73.4 %, que reportan otros trabajos que usaron la misma metodología en poblaciones Holstein(3,4,5).

range reported in other studies using the same methodology in Holstein populations(3,4,5).

All the effects analyzed in the model were significant (P<0.0001), although SPL and LP made the greatest contribution to calculating culling risk. Age at first parturition made a lesser contribution. In other studies, this effect has not demonstrated a clear tendency to explain relative culling risk(4,11). However, in the present data, it did show a slight increase in cows with first parturition at 23 mo. This may be due to the fact that this group includes cows that gave birth at young ages because they were pregnant before 14 mo of age, as well as those that did not complete the full 9 mo of their first gestation, which can cause problems in later parturitions. In older age categories, age at first parturition had no apparent effect on FPL, as has been reported for other Holstein populations(4,8).

Todos los efectos analizados en el modelo fueron importantes, teniendo NPE y FL una mayor contribución a la determinación del riesgo de desecho de un animal que la edad al primer parto, característica que no ha presentado en otras poblaciones una tendencia clara que explique el riesgo relativo de desecho de los animales(4,11).

El efecto de la edad al primer parto mostró un ligero incremento en las vacas con partos 23 meses, lo que se puede deber a que en este grupo se agruparon no sólo los animales que parieron a edades jóvenes por haber quedado gestantes antes de los 14 meses de edad, sino que además incluyó a vaquillas que no completaron los 9 meses en su primera gestación, pudiendo esto provocar problemas en los partos siguientes. Después de este límite, la edad al primer parto no tuvo efecto aparente sobre la DVPF, lo que resulta similar a los

Relative culling risk associated with standardized production levels (SPL) showed the lowest levels (1, 2 and 3) to have the highest risk. Voluntary culling in response to low SPL is clearly significant in this population. Previous studies done with data from the same population and 10

ANÁLISIS GENÉTICO PARA VIDA PRODUCTIVA EN GANADO HOLSTEIN DE MÉXICO

other Holstein populations also documented greater culling risk in less productive animals (4,11) . Risk also increased slightly beginning at SPL 8, suggesting that high producing cows experience more intense physiological stress than lower producers, which can affect their FPL(8,9).

resultados encontrados en otras poblaciones Holstein(4,8).

Al analizar los riesgos relativos asociados con los niveles de producción, los mayores riesgos se presentaron en los niveles más bajos (1, 2 y 3), indicando que el desecho voluntario por baja producción de leche es importante en esta población. Lo anterior coincide con otros estudios realizados anteriormente en la misma población y en otras poblaciones Holstein, donde los animales menos productivos presentaron incrementos en el riesgo de desecho(4,11). Por otro lado, a partir del NPE 8, el riesgo incrementó ligeramente, sugiriendo que vacas altas productoras probablemente estén bajo un manejo fisiológico más intenso que las vacas menos productoras, lo que repercute sobre su DVPF(8,9).

Culling risk also increased in the final days of a lactation in cows with consecutive lactations.

This reflects elimination of non-gestating cows at the end of lactation, possibly due to reproductive or health problems(16,17). These tendencies coincide with previous studies reporting increased culling rates at the end of each lactation. The way LP is defined can influence these results since the first LP level will always be more homogeneous than the last ones. At later LP levels, age effects begin to accumulate but this are not included in calculation of the PL by days in lactation beyond 305 d, nor in inter-parturition periods, which are not part of this methodology.

Para las lactaciones analizadas, el riesgo de desecho en los últimos días de la lactación de una vaca con lactaciones consecutivas fue mayor, lo que no es sino un reflejo de las eliminaciones de las vacas no gestantes que ocurren al final de la lactación, lo que a su vez se puede deber a problemas reproductivos o de salud de la vaca(16,17). Estas tendencias de riesgo relativo de desecho son similares a los resultados publicados por Ducrocq(9) y Chirinos et al(4), donde se observó un incremento de desecho al final de cada lactación. Es importante mencionar que por la manera en que se define la FL, los primeros niveles de esta variable serán siempre más homogéneos que los últimos, ya que se van adicionando efectos de edad no contabilizada en el cálculo de vida productiva por los días en lactación superiores a 305 días, o a los periodos interparto que no se contabilizan con esta metodología.

The estimated parameter was 2.37, a value within the 0.36 to 5.0 reported for other Holstein populations(4,9,10). This value supports the recorded data since values greater than 1 indicate increased culling risk as animals age.

The gamma parameter represents the variance within herd-year. Values greater than 1 indicate heterogeneity in culling practices(8).

The 4.28 gamma value in the present study is similar to those reported in other Holstein populations (3,4,13) . Variation in culling practices may be related to varying levels of mechanization throughout Mexico, an aspect requiring further research.

Heritabilities in this study were 0.08 in the logarithmic scale, 0.13 in the original scale, 0.12 in the effective scale and 0.10 for equivalent heritability. All these are within published ranges: 0.02 to 0.11 for the logarithmic scale and 0.038 to 0.22 for the original scale(3,4,8); and 0.048 to 0.108 for the effective and equivalent scales(4,10,18). However, the estimators were higher than reported in a

El parámetro ñ estimado en este estudio fue 2.37 y se encuentra dentro del rango de valores estimados en otras poblaciones Holstein que varían entre 0.36 a 5.0(4,9,10). Este resultado es coherente con lo observado, ya que un valor de  superior a 1, indica que el riesgo de desecho incrementa con la edad del animal.

11

José R. Abadía Rojas, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):1-14

previous study in the same population using linear models (7) . These discrepancies in heritabilities occur because the survival model used in the present study is superior to previous models for explaining environmental effects.

It can consequently isolate the additive genetic effects associated with the trait of interest, and is better for estimating genetic parameters and predicting FPL genetic values. Calculations done using these procedures produced heritability values similar to those reported elsewhere (8,10,18) . Recent research has demonstrated extensions of the formulas to other models for the genetic effects of other animal species(19). These do not depend on ñ or the extreme value distribution, which was not used in the study.

El parámetro gamma corresponde a la varianza dentro de cada hato-año y se considera que un valor mayor a 1 indica que existe heterogeneidad en las prácticas de desecho de los ganaderos(8). En este estudio el valor de gamma fue 4.28, resultado que es similar al reportado en otras poblaciones Holstein(3,4,13).

Este resultado indica que las prácticas de desecho podrían estar relacionadas con diferentes niveles de tecnificación en diferentes partes de México, lo que deberá ser evaluado en futuros trabajos.

Las heredabilidades calculadas en este estudio fueron 0.08 en una escala logarítmica, 0.13 en la escala original, 0.12 en la escala efectiva y 0.10 para la heredabilidad equivalente. Estos valores están dentro del rango de los publicados por otros investigadores, los cuales han oscilado entre 0.02 y 0.11 cuando fueron expresados en una escala logarítmica y de 0.038 a 0.22 sobre una escala original(3,4,8), 0.048 a 0.108 para una escala efectiva y equivalente(4,10,18). Sin embargo, los estimadores obtenidos fueron superiores a los reportados por un trabajo anterior en la misma población utilizando modelos lineales (7). Esta diferencia en las heredabilidades estimadas se debe a que el modelo de supervivencia del presente estudio fue superior para explicar los efectos ambientales, y en consecuencia aislar los efectos genéticos aditivos que están asociados con el carácter de interés, resultando ser mejor para estimar parámetros genéticos y predecir valores genéticos de DVPF. Los cálculos realizados con estos procedimientos dieron como resultado una heredabilidad similar a la que ha sido reportada en otros estudios (8,10,18) . Recientes investigaciones muestran extensiones de las fórmulas a otros modelos para los efectos genéticos de otras especies animales(19), que no dependen del parámetro ñ y del valor extremo de la distribución, y que no se utilizan en este estudio.

Reliability of the sires’ genetic values ranged from 0.0 to 0.96. This variability is caused by the fact that the reliability of genetic predictions made using survival models is calculated based on the number of daughters with complete (observed) records and not a sire’s total number of daughters. Because of this, younger sires may be at a disadvantage since most of their daughters will still be alive at the time of evaluation, substantially lowering prediction reliability(8,9). The same reliability behavior has been reported in countries such as Spain, France and Switzerland(4,10,11), where survival models help produce better predictors of sire FPL genetic values.

Sire FPL genetic values calculated based on daughter longevity in Mexico exhibited an increase in relative culling risk as sire birth year advanced. This increase implies an important decrease in genetic values that may be due to increased selection of sires by breeders for predicted transmission of improved milk production in recent years. Aimed at producing high milk production cows, has affected daughter FPL since high milk production is associated with shorter FPL, probably due to health and fertility problems, as observed in the present study. These genetic tendencies

La confiabilidad de los valores genéticos para los padres varió de 0.0 a 0.96. Esta variabilidad se debe a que la confiabilidad de las predicciones 12

ANÁLISIS GENÉTICO PARA VIDA PRODUCTIVA EN GANADO HOLSTEIN DE MÉXICO

genéticas utilizando modelos de supervivencia se calcula con base en el número de hijas con observaciones completas y no a través del número total de hijas. Lo anterior puede representar una desventaja para los padres jóvenes, ya que es de esperase que la mayoría de sus hijas se encuentren vivas al momento de la evaluación y por ello la confiabilidad de su predicción genética sea muy baja(8,9). Este comportamiento de las confiablidades es similar a lo reportado en otros países como España, Francia y Suiza(4,10,11) donde, como en este estudio, los modelos de supervivencia permitieron obtener mejores predictores de los valores genéticos de los sementales para DVPF.

differ from those reported for countries such as France, Germany and Canada where culling risk has declined over time for the daughters of Holstein sires. Most likely this is in response to inclusion of FPL in genetic improvement programs for many years(9-12).

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS The estimated heritabilities observed in the present study (0.08 for logarithmic scale; 0.13 for original scale; 0.12 for effective scale and 0.10 for equivalent scale) indicate that this trait can be effectively integrated into genetic improvement programs, as has occurred in other Holstein populations. The Weibull distribution and associated regression model adequately represented length of functional productive life for Holstein cattle in Mexico and are useful in calculating heritability and predicting genetic values for this trait.

Los valores genéticos para DVPF de los sementales, calculados con base en la longevidad de sus hijas en México, mostraron un incremento en los riesgos relativos de desecho a medida de que el año de nacimiento de los mismos aumentaba. El incremento en el riesgo relativo implica la disminución de los valores genéticos y puede ser debida a que durante los últimos años, los ganaderos han seleccionado a los sementales por su habilidad de transmisión predicha para producción de leche, con el objetivo de tener vacas con altas producciones, y esto a la vez ha afectado la DVPF de las hijas, debido a que la alta producción de leche está asociada a cortas DVPF probablemente por problemas de salud o fertilidad como lo indican los resultados en este estudio. Estas tendencias genéticas son diferentes a las reportadas para países tales como Francia, Alemania y Canadá, donde se ha encontrado un descenso en el riesgo de desecho para las hijas de los sementales conforme avanza el tiempo, lo que se puede deber a que desde hace varios años, la característica de DVPF se ha incluido en los programas de mejoramiento genético(9-12).

ACKNOWLEDGEMENTS The authors thank the Asociación Holstein de México, and Dr. Vincent Ducrocq and Dr. Zuleima Chirinos for assistance with the Survival Kit program. The research reported here forms part of the project “Aplicación de herramientas genómicas en el mejoramiento genético de la fertilidad del ganado Holstein productor de leche” (No. SIGI: 11402733072).

End of english version

escala efectiva y equivalente, respectivamente, indica que esta característica se puede integrar efectivamente a los programas de mejoramiento genético como se ha hecho en otras poblaciones de ganado Holstein, que pueden ser consideradas como elementos de selección indirecta para la duración de vida productiva

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES La magnitud de las heredabilidades estimadas de 0.08 y 0.13 sobre una escala logarítmica y original, respectivamente, 0.12 y 0.10 para una 13

José R. Abadía Rojas, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):1-14

funcional. La distribución de Weibull y el modelo de regresión asociado son adecuados para representar la duración de vida productiva funcional de ganado Holstein en México, y para calcular la heredabilidad y predecir valores genéticos para este carácter.

en ganado Holstein de registro en México. Téc Pecu Méx 1994;32(3):105-112.

AGRADECIMIENTOS Se agradece el apoyo a la Asociación Holstein de México y al Dr. Vincent Ducrocq y la Dra. Zuleima Chirinos por su ayuda y recomendaciones con el programa “Survival kit”.

El trabajo fue parte del proyecto “Aplicación de herramientas genómicas en el mejoramiento genético de la fertilidad del ganado Holstein productor de leche” No. SIGI: 11402733072.

7.

Valencia MP, Ruiz LF, Montaldo VH. Estimación de parámetros genéticos para características de longevidad y producción de leche en ganado Holstein de México. Interciencia 2004;(29):52-56.

8.

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14

CURVAS DE LACTANCIA INDIVIDUALES EN VACAS SIBONEY Rev Mex DE CUBA Cienc Pecu 2016;7(1):15-28

Curvas de lactancia individuales en vacas Siboney de Cuba Individual lactation curves in Siboney dairy cows of Cuba Alejandro Palacios Espinosaa, Dianelys González-Peña Fundorab, Danilo Guerra Iglesiasc, José Luis Espinoza Villavicencioa, Ricardo Ortega Péreza, Ariel Guillén Trujilloa, Narciso Ávila Serranod

RESUMEN El objetivo fue estudiar y modelar las curvas de lactancia individuales en vacas Siboney, comparando cuatro modelos matemáticos. En total, 31,631 registros de producción de leche del día de control (PDC) de 3,697 lactancias (1 a 5) provenientes de 2,632 vacas Siboney de Cuba (5/8 Holstein 3/8 Cebú Cubano) registrados mensualmente entre 1994 y 2003 se ajustaron mediante las funciones de Wood, Wilmink, Ali-Schaeffer y Polinomios de Legendre. Los parámetros se estimaron usando regresiones no lineales y la bondad de ajuste se midió mediante el coeficiente de determinación ajustado (R2A). Se obtuvieron valores de R2A > 0.75 en 23, 24, 28 y 36 % de las lactancias para los modelos de Wood, Wilmink, Ali-Schaeffer y Polinomios de Legendre, respectivamente. Los modelos de Wood y Wilmink describieron cuatro tipos de curvas; y los modelos de Ali-Schaeffer y los Polinomios de Legendre 17 y 20, de los 32 grupos teóricos posibles. Las correlaciones entre los parámetros para la función de Ali-Schaeffer fueron superiores a las estimadas para los polinomios de Legendre. Las funciones propuestas representaron las diferentes formas entre curvas de lactancia y en especial, los modelos de cinco parámetros detectaron mayor diversidad que el resto de las funciones.

Esto apunta que, aunque formas adicionales pueden considerarse como derivaciones de los dos grupos clásicos de curvas típicas o atípicas, esta práctica podría comprometer la variabilidad entre curvas de lactancia en un hato, por lo que serán necesarios más estudios.

PALABRAS CLAVE: Vacas, Lactancia, Curvas, Modelos matemáticos.

ABSTRACT The objective was to study and to model the individual lactation curves in Siboney cows comparing four mathematical models. In total, 31,631 test day milk production records (TD) of 3,697 lactations (1 to 5) from 2,632 Siboney cows of Cuba (5/8 Holstein, 3/8 Cebu Cuban) monthly recorded between 1994 and 2003 were adjusted using the functions of Wood, Wilmink, Ali-Schaeffer and Legendre polynomials. The parameters were estimated using nonlinear regressions and the goodness of fit was measured by the adjusted coefficient of determination (R 2A). Values of R 2A> 0.75 in 23, 24, 28, and 36 % of the lactations for the models of Wood, Wilmink, Ali-Schaeffer and Legendre polynomials, respectively, were obtained. The models of Wood and Wilmink described four types of curves and the models of Ali-Schaeffer and the Legendre polynomials 17 and 20 for 32 possible theoretical groups. The correlations among the parameters of Ali-Schaeffer function were higher than that estimated for the Legendre polynomials. The proposed functions represented the different shapes among lactation curves and in particular the five parameters models detected higher diversity related to the rest of the function. This pointed that even if additional detected shapes can be considered as derivations of the two classical groups of typical or atypical curves, this practice could compromise the variability among lactation curves inside a herd, therefore further studies are needed.

KEY WORDS: Cows, Lactation curves, Mathematical models.

Recibido el 23 de octubre de 2014. Aceptado el 24 de noviembre de 2014. a

Universidad Autónoma de Baja California Sur, México. Carr. al Sur, km. 5.5, La Paz, B.C.S. CP 23080. México. jlvilla@uabcs.mx. Correspondencia al cuarto autor.

b

Universidad de Illinois, USA.

c

Centro de Investigación para el Mejoramiento Animal de la Ganadería Tropical, La Habana, Cuba.

d

Universidad del Mar, Puerto Escondido, Oaxaca, México.

15

Alejandro Palacios Espinosa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):15-28

INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

La curva de lactancia puede ser definida como un proceso biológico explicado por una ecuación matemática(1), la cual es útil en el pronóstico de la producción total a partir de muestras parciales. La cantidad de leche producida depende de la trayectoria de la curva de lactancia, la cual es influenciada por factores genéticos y ambientales(2). La curva de lactancia es una herramienta que permite entender y evaluar el comportamiento fisiológico de la producción de leche y puede usarse para conocer el potencial genético de un hato o raza de ganado lechero(3). El conocimiento de las curvas de lactancia permite predecir la producción total de leche con una o varias mediciones realizadas los días de control en lactancias tempranas(4). El potencial genético para la producción de leche, así como la forma y altura de la curva son influenciadas por lactancias consecutivas, edad al parto, la estación en que ocurre el parto(5), etapa de la preñez(6) y por la longitud del periodo seco previo(2). Además, los sistemas de manejo y alimentación diferentes en las distintas zonas geográficas, regiones y países influyen de manera importante en la producción de las vacas lecheras(7,8,9).

A lactation curve is the result of an explanation of a biological process with a mathematical function(1), and is useful in predicting total production from partial samples. Milk production is represented by the lactation curve trajectory, and is influenced by genetic and environmental factors(2). Lactation curves help to understand milk production physiological behavior and can be used to research the genetic potential of a dairy cattle herd or breed(3). By applying lactation curves, total milk production can be predicted with one or a number of measurements taken on control days in early lactations(4). Milk production genetic potential and the shape and height of lactation curves are affected by factors such as the number of consecutive lactations, age at parturition, season of calving(5), gestation stage(6), and length of previous dry period(2). The handling and feed systems used in different geographic zones, regions and countries can also have a significant effect on dairy cow milk production(7,8,9).

Many mathematical models have been used to describe lactation and estimate expected milk production(2). Some of these models focus on attaining the best fit for the mathematical equations and give less weight to lactation biology(10), while others aim at improving understanding of biological processes(11).

Se han usado varios modelos matemáticos para describir las curvas de lactancia y estimar la producción de leche esperada(2). Algunos están orientados a un mejor ajuste de las funciones matemáticas con una menor consideración de la biología de la lactación(10) y otros están enfocados a mejorar el entendimiento de los procesos biológicos(11).

When control day production data are fitted using empirical regression equations, different lactation curve shapes can be identified. Some are slight modifications of the standard (typical) curve, for instance, due to the presence or absence of inflection points in the descending portion of a lactation curve. Others can differ notably from the standard curve, such as curves that decline continually and have no lactation peak(12).

Cuando se ajustan las producciones del día de control con ecuaciones de regresión empíricas pueden detectarse varias formas de curvas de lactancia; algunas de ellas consisten en ligeras modificaciones de la curva estándar, por ejemplo, por la presencia o ausencia de un punto de inflexión en la parte decreciente de la lactancia; otras son diferentes, como las curvas que decrecen continuamente y carecen del pico de lactancia(12).

Most studies using lactation curves are focused on identifying the curve with the best fit among average curves. That with the best fit is then used to fit all the lactations in a data set.

Applying these criteria to identify the best model 16

CURVAS DE LACTANCIA INDIVIDUALES EN VACAS SIBONEY DE CUBA

En general, los estudios se han dirigido a curvas promedio para seleccionar aquélla con mejor ajuste, y esta función es adoptada para el ajuste de todas las lactancias en el conjunto de datos.

Estos criterios para seleccionar el mejor modelo muchas veces ignoran los problemas estadísticos o biológicos que pueden ocurrir cuando el ajuste es extendido a lactancias individuales. Las consecuencias pueden ser estimaciones de parámetros irreales(13).

often ignores statistical or biological problems that may occur when the fit is extended to individual lactations. This can result in inaccurate parameter estimation(13).

In milk production genetic models, the primary concept is that animals can differ genetically, both in terms of total milk production and their lactation curve shape(14). Variation in milk production curve shape occurs in different species(5,15). Given this variation, it is vital to find the most appropriate mathematical function that best describes each production situation(16).

El concepto primario de los modelos genéticos para producción de leche se basa en que los animales pueden diferir genéticamente, no solo en la producción de leche total, sino también en la forma de la curva de lactancia(14). Esta variación en la forma de la curva individual de producción de leche se ha investigado en varias especies(5,15). Sin embargo, es importante encontrar para cada circunstancia de producción, la función matemática que mejor describa el fenómeno en cuestión(16). El objetivo de este trabajo fue estudiar y modelar, a partir de cuatro modelos matemáticos, las curvas de lactancia individuales que se presentan en el genotipo Siboney de Cuba.

The present study objective was to apply four mathematical models to analyze and model individual lactation curves in the Siboney genotype of Cuba.

MATERIAL AND METHODS Data analyzed in this study were from Siboney cattle (5/8 Holstein, 3/8 Cuban Zebu) from Pinar del Río province, Cuba. This region has two clearly defined seasons: a rainy season from May to October with 70 to 80 % (960 mm) of yearly rainfall; and a dry season from November to April (240 mm). Average annual temperature is 23.1 °C, relative daytime humidity is 60 to 70 % and relative nighttime humidity is 80 to 90 %(17).

MATERIAL Y MÉTODOS Se utilizó información de ganado bovino Siboney (5/8 Holstein 3/8 Cebú Cubano) de la provincia Pinar del Río, Cuba. En dicha región existen dos estaciones claramente definidas, la de lluvias (verano) de mayo a octubre, con 70 a 80 % de la precipitación (960 mm), y la estación seca (invierno) de noviembre a abril (240 mm). La temperatura media anual es de 23.1 °C, con humedad relativa de 60 a 70 % durante el día y de 80 a 90 % durante la noche(17).

A total of 31,631 test day milk yield (TDMY) records were analyzed from 3,697 monthly controlled lactations (first to fifth) in 2,632 cows born between 1987 and 1999. Feed system was daily grazing for approximately 12 h daily.

Star grass and Guinea grass were the principal feed, although the cows also grazed naturally occurring grasses in the rainy season. The cows were milked twice daily, and provided a 0.45 kg concentrate supplement beginning at the fourth liter of milk produced. The cows were corralled at night and fed king grass (Penisetum purpureum ) and sugar cane ( Saccharum officinarum).

Se analizaron 31,631 registros de producción de leche del día de control (PDC) de 3,697 lactancias (de la primera a la quinta) controladas mensualmente en 2,632 vacas nacidas entre 1987 y 1999. El sistema de alimentación estuvo basado en pastoreo de 12 h al día, aproximadamente. Los pastos utilizados fueron zacate estrella (Cynodon nlemfuensis) y Guinea 17

Alejandro Palacios Espinosa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):15-28

(Panicum maximum), y durante la estación de lluvias las vacas consumieron también pastos naturales. Las vacas se ordeñaron dos veces al día y durante cada ordeño se suplementaron con 0.45 kg de concentrado a partir del cuarto litro de leche producido. Por las noches, los animales se confinaron y se alimentaron con king grass (Penisetum purpureum) y caña de azúcar (Saccharum officinarum).

Lactation curves were modeled using four functions applied previously in this population to model average curves: Wood(10): Yt= a.tb.ect Wilmink(18): Yt= a+be-kt+ct Ali and Schaeffer(19): Yt= a+b(t/330)+c(t/330)2+ dlog(330/t)+k[log(330/t)]2

Para modelar curvas de lactancia se utilizaron las siguientes funciones previamente aplicadas y usadas en la población para modelar curvas promedios:

Fourth order, normalized Legendre orthogonal polynomials(20): Yt= 0xP0+1xP1+2xP2+3xP3 +4xP4 In all four models, Yt is TDMY in time t, corresponding to lactation days at the time of milk weighing. Parameters a, b, and c are associated with production level, and parameter k is linked to time at peak lactation and is usually assumed to be fixed(18,21). In the Wilmink model, k= 0.10 was assumed (22) . Time functions (Pj) included in the models using Legendre polynomials were calculated with values published by Schaeffer(23).

Wood(10): Yt= a.tb.ect Wilmink(18): Yt= a+be-kt+ct Ali y Schaeffer(19): Yt= a+b(t/330)+c(t/330)2+ dlog(330/t)+k[log(330/t)]2 Polinomios de Legendre normalizados de cuarto orden (20) : Y t =  0 xP 0 + 1 xP 1 + 2 xP 2 + 3 xP 3 +4xP4 En todos los modelos, Yt es la PDC en el tiempo t, correspondiente a los días en lactancia al momento del pesaje de la leche. Los parámetros a, b, y c se encuentran asociados al nivel de producción y el parámetro k está relacionado con el tiempo al pico de lactancia y usualmente se asume como fijo(18,21). En el modelo de Wilmink se asumió que k= 0.10 (22) . Las funciones de tiempo Pj de los modelos que utilizan polinomios de Legendre se calcularon con los valores publicados por Schaeffer(23).

Lactation curve classification In the Wood function, b>0 and c<0 corresponded to a standard (typical) curve. In contrast, if b<0 and c>0, the curve was a reverse standard curve with an initially decreasing phase followed by an increase. The b>0 and c>0 combination represents a continuously increasing curve, while b<0 and c<0 describes a continuously decreasing curve(24).

The same four curve shapes can be described by the Wilmink function but with different parameter values: b<0 and c<0 is a typical curve; b>0 and c>0 is a reverse curve with a minimum point; b<0 and c>0 is a continuously increasing curve; and b>0 and c<0 corresponds to a continuously decreasing curve(15).

Clasificación de las curvas de lactancia En la función de Wood, cuando b>0 y c<0 corresponde a una curva estándar (típica). Por el contrario, si b<0 y c>0 se presenta una curva reversa con una fase inicial decreciente, seguida de un incremento. La combinación de b>0 y c>0 representa una curva que aumenta continuamente, mientras que la solución b<0 y c<0 describe una curva que decrece continuamente(24).

The Ali-Schaeffer and Legendre polynomials functions describe 32 possible lactation curve shapes(25).

18

CURVAS DE LACTANCIA INDIVIDUALES EN VACAS SIBONEY DE CUBA

Las mismas cuatro formas de curva pueden ser descritas por la función de Wilmink pero con diferente valor de parámetros, ya que si b<0 y c<0 se presenta la forma típica de la curva, mientras que si b>0 y c>0 la curva es reversa con un punto mínimo. Valores de b<0 y c>0 resultan en una curva que se incrementa continuamente, mientras que b>0 y c<0 corresponde a una curva decreciente en forma continua(15).

Goodness of fit for all four models was calculated with R2A and classified in four levels (1<0.24; 2=0.25-0.49; 3=0.50-0.74; 4>0.75). The resulting categories helped to observe model fit to the different individual lactation curves.

Only individual curves with R2A >0.75 were used. The lactation curves were grouped based on the combination of the values of their parameters, and the correlation between them calculated. All analyses were run with the NLIN procedure in the SAS package(26).

Las funciones de Ali-Schaeffer y polinomios de Legendre describen 32 posibles formas de curvas de lactancia(25).

RESULTS Average TDMY varied from 5.9 ± 3.3 to 3.7 ± 2.0 kg, with an overall mean of 4.9 ± 2.7 kg.

Values for R2A were >0.75 in 23 % of lactations using the Wood function, 24 % using the Wilmink function, 28 % with the Ali-Schaeffer function, and 36 % when using the Legendre polynomials function (Table 1). When R2A curves >0.75 were selected, the three-parameter models identified four types of curves (Table 2).

The Wood model identified more (61 %) standard curves than the Wilmink model (47 %).

La bondad de ajuste de los cuatro modelos utilizados se determinó mediante el R2A y fue clasificado en cuatro niveles (1<0.24; 2=0.250.49; 3=0.50-0.74; 4>0.75) con el objetivo de crear clases que permitieran observar el ajuste de los modelos a las diversas curvas de lactancia individuales.

Sólo se utilizaron las curvas individuales con R2A superiores a 0.75. Las curvas de lactancia se agruparon de acuerdo a la combinación de los valores de sus parámetros, calculándose la correlación entre los mismos. Los análisis se efectuaron con el procedimiento NLIN del SAS(26).

In curves modeled with the Wood function for increasing b values, estimates during the first lactation increased (Figure 1a), whereas in atypical curves increases in b did not persist (Figure 1b). With the Wilmink function, in

RESULTADOS La producción promedio de leche del día de control fluctuó entre 5.9 ± 3.3 y 3.7 ± 2.0 kg con una media general de 4.9 ± 2.7 kg entre las PDC. El 23, 24, 28 y 36 % de las lactancias presentaron R2A superiores a 0.75 para las funciones de Wood, Wilmink, Ali-Schaeffer y polinomios de Legendre (Cuadro 1).

Cuadro 1. Frecuencias absolutas y porcentajes relativos (en paréntesis) de los ajustes en diferentes clases de coeficientes de determinación ajustados (R2A) Table 1. Absolute frequencies and relative percentages (in parentheses) of fits in different classes of fitted coefficients of determination (R2A) Models

Al seleccionar las curvas con R2A superiores a 0.75, los modelos de tres parámetros reconocieron los cuatro tipos de curvas posibles (Cuadro 2). El modelo de Wood detectó un mayor número de curvas estándar (61 %) en comparación con el modelo de Wilmink (47 %).

R2A <0.25

19

Wood

Wilmink

1677 (45.3) 1560 (42.2)

Ali-Schaeffer

Legendre

1367 (36.9)

824 (22.4)

490 (13.2)

563 (15.2)

0.26-0.50

450 (12.1)

545 (14.7)

0.51-0.75

707 (19.1)

714 (19.3)

812 (21.9)

969 (26.2)

>0.76

863 (23.3)

878 (23.7)

1028 (27.8)

1341 (36.2)

Alejandro Palacios Espinosa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):15-28

En las curvas típicas modeladas con la función de Wood para valores que se incrementan de b, existe una tasa de incremento de las estimaciones en la primera parte de la lactancia (Figura 1a), mientras que en las curvas atípicas (Figura 1b) los incrementos de b resultan en una reducida persistencia. En cambio, en las

contrast, the typical curves had a convex shape that was accentuated by negative b values (Figure 1c), whereas in atypical curves positive b values accentuated the curve’s concave shape (Figure 1d). This highlights the difference in meaning of the b parameter between the two curve groups within the same model, and

Cuadro 2. Medias y desviaciones estándar de los parámetros para curvas individuales, clasificados de acuerdo con las cuatro formas detectadas por los modelos de Wood y de Wilmink Table 2. Means and standard deviations of individual curve parameters classified according to the four shapes identified by the Wood and Wilmink models

Shape§

n¶

1 2 3 4

523 199 133 8

Wood Model Log a Log b 3.5±3.7 24.3±20.5 52.9±40.2 1.8±2.7

0.64±0.6 -0.21±0.1 -0.74±0.4 0.28±0.1

Log c

n¶

Wilmink Model Log a

Log b

Log c

-0.01±0.01 -0.01±0.01 0.01±0.01 0.01±0.01

409 380 77 12

11.1±3.7 7.8±3.2 2.1±1.1 4.7±3.1

-8.2±7.9 7.2±6.6 13.9±11 -5.0±6.2

-0.4±0 -0.02±0 0.01±0 0.01±0

§ Lactation curve shapes: 1= typical; 2= continuously descending (atypical); 3= reverse standard; 4= continuously increasing. ¶ sample size.

Figura 1. Formas de curvas típicas (a y c) y atípicas (b y d) detectadas por los modelos de Wood y de Wilmink, seleccionadas para valores crecientes del parámetro b Figure 1. Typical (a and c) and atypical (b and d) lactation curve shapes identified by the Wood and Wilmink models; chosen for increasing b parameter values. DIM= days in milk; TDYM= test day yield milk Wood a)

= 0.09;

= 0.52;

= 2.24

b)

3.0

2.5

TDMY (kg/day)

TDMY (kg/day)

3.0

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

= -0.57;

= -0.200;

= -0.029

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

30

60

90

120 150 180 210 240 270 300 330

30

60

90

120 150 180 210 240 270 300 330

DIM

DIM

W ilmink c)

= -36.97;

= -13.36;

16.0

= -1.2

d)

= 0.09;

= 8.39;

= 16.7

14.0

10.0

TDMY (kg/day)

TDMY (kg/day)

12.0

8.0 6.0 4.0 2.0 0.0

12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0

30

60

90

120 150 180 210 240 270 300 330

30

DIM

60

90

120 150 180 210 240 270 300 330

DIM

20

CURVAS DE LACTANCIA INDIVIDUALES EN VACAS SIBONEY DE CUBA

curvas típicas obtenidas con la función de Wilmink, la forma convexa se acentúa para valores negativos de b (Figura 1c), mientras que en las atípicas, valores positivos de b acentúan la forma cóncava de la curva (Figura 1d). Lo anterior resalta la diferencia en el significado del parámetro b entre los dos grupos de curvas dentro del mismo modelo; confirmando además la relación entre los valores de b y la tasa de variación en la primera parte de la curva.

confirms the link between b values and the variation rate in the first portion of the curve.

Of the 32 theoretically possible groups, the AliSchaeffer model identified 17 curve types and the Legendre polynomials model 20 types.

Nonetheless, each group was essentially the result of a specific deformation of the two basic shapes (typical and atypical). Variability occurred in the form of inflexion points within the two curve groups. The four curve groups with the highest frequencies were included in the analysis (Table 3).

Los modelos de Ali-Schaeffer y Legendre reconocieron 17 y 20 tipos de curvas, respectivamente, de los 32 grupos teóricos posibles. Sin embargo, cada grupo puede ser considerado el resultado de una deformación específica de las dos formas básicas (típica o atípica), presentándose cierta variabilidad en función de la presencia de puntos de inflexión en los distintos grupos de curvas. Se consideraron los cuatro grupos de curvas con mayor frecuencia. Las medias de los valores absolutos para los parámetros de las curvas obtenidas con Ali-Schaffer se presentan en el Cuadro 3.

Estimates for individual curves were generated for each of the four main Ali-Schaeffer model curve groups (Figure 2). In group 1, the increase in parameter b represented a rise in milk production at the beginning of lactation (Figure 2a), whereas in group 2 an increase in b marked the decline rate of the curve’s initial portion.

Inflexion points occurred in both groups at 60 d, a clear consequence of the high flexibility of five-parameter models, which can identify different rates of decreased or increased milk production throughout lactation. However, the opposite sign in the parameters means that the sequence of changes in curvature is the opposite in the two groups. The patterns in groups 3 (Figure 2c) and 4 (Figure 2d) are examples of different consequences in response to an increase in the b parameter. In group 3, the curvature in the second portion increased while in group 4 it tended to decline linearly.

Las curvas individuales estimadas para los cuatro grupos principales con el modelo de Ali Schaeffer se presentan en la Figura 2. En el grupo 1 (Figura 2a) el incremento del parámetro b representa un aumento de la producción de leche al principio de la lactancia. En el grupo 2 (Figura 2b) un incremento en b enmarca la

Cuadro 3. Distribución de los parámetros (media ± desviación estándar) de curvas individuales clasificadas de acuerdo con los cuatro grupos con mayor frecuencia detectados por Ali Schaeffer Table 3. Parameter distribution (mean ± standard deviation) of individual curves classified based on the four groups most frequently identified by the Ali-Schaeffer model Group 1 2 3 4

Frequency 437 387 51 42

a -180.2 ± 25.1 186.0 ± 30.3 -29.1 ± 29.6 4.2 ± 3.5

b

c

296.4 ± 42.0 -290.0 ± 50.9 8.8 ± 12.1 7.2 ± 5.7

21

-131 118 51.9 -18.6

± ± ± ±

21.7 23.2 64.6 14.4

d

e

113.7 ± 15.8 -107.3 ± 18.4 29.4 ± 28.2 3.3 ± 1.8

-19.1 ± 25.2 18.1 ± 31.0 -5.9 ± 6.8 -0.7 ± 0.4

Alejandro Palacios Espinosa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):15-28

Figura 2.

Ejemplos de formas de curvas del grupo 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) detectados por el modelo de Ali Schaeffer seleccionadas para valores que se incrementan del parámetro b

Figure 2.

Examples of curve groups 1(a), 2 (b), 3 (c) and 4 (d) identified using the Ali-Schaeffer model, and selected for increasing b parameter values. DIM= days in milk; TDYM= Test day yield milk Wood 9.0

a)

= 7.0;

= 167.6;

= 187.2

b)

12.0

= -477.8;

= -289.5;

= -99

10.0

7.0

TDMY(log kg/day)

TDMY(log kg/day)

8.0

6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0

8.0 6.0 4.0 2.0 0.0

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

330

30

60

90

120

150

DIM

180

210

240

270

300

330

DIM

W ilmink 12.0

16.0

c)

= 5.0;

= -10.8;

= 30.7

d) TDMY(log kg/day)

TDMY(log kg/day)

14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

= 0.59;

= 3.5;

= 5.3

10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0

330

30

60

90

DIM

120

150

180

210

240

270

300

330

DIM

tasa de declive de la parte inicial de la curva.

En ambos grupos se observan puntos de inflexión ubicados a los 60 días, una clara consecuencia de la alta flexibilidad de los modelos de cinco parámetros, que son capaces de reconocer las diferentes tasas de incremento o descenso en la producción de leche a través de la lactancia. Sin embargo, debido al signo opuesto de los parámetros, la secuencia de los cambios en la curvatura es opuesta en los dos

Among the four groups identified using Legendre polynomials (Table 4), a contrast in signs was present between groups 1 and 2, except for parameter 0, which was positive in both.

Individual curves were generated for the four main groups for increasing values beginning from the term 1 (Figure 3). In group 1, increase in the 1 parameter caused a decrease in curve level and an increase in its curvature, while in group 2 an increase in 1 resulted in

Cuadro 4. Distribución de los parámetros (media ± desviación estándar) de curvas individuales clasificadas de acuerdo con los cuatro principales grupos detectados por los polinomios ortogonales de Legendre Table 4. Parameter distribution (mean ± standard deviation) of individual curves classified based on the four main groups identified by Legendre orthogonal polynomials Group 1 2 3 4

Frequency

0

1

2

3

4

225 217 168 113

6.0 ± 13.2 4.4 ± 3.4 -8.6 ± 13.6 7.4 ± 3.7

7.2 ± 17.8 -7.2 ± 6.0 -1.2 ± 17.4 -2.6 ± 2.1

5.8 ± 12.5 -5.6 ± 8.5 -8.8 ± 12.2 2.5 ± 3.3

2.8 ± 5.3 -4.3 ± 7.4 -41.3 ± 55.0 2.2 ± 3.3

8.2 ± 14.5 -2.1± 2.9 -10.9 ±12.8 1.4 ± 2.0

22

CURVAS DE LACTANCIA INDIVIDUALES EN VACAS SIBONEY DE CUBA

Figura 3. Ejemplos de formas de curvas de los grupos: 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) detectados por los polinomios ortogonales de Legendre seleccionadas para valores que se incrementan del parámetro 1 Figure 3. Examples of curve groups 1(a), 2 (b), 3 (c) and 4 (d) identified using Legendre orthogonal polynomials, and selected for increasing 1 parameter values. DIM= Days in milk; TDYM= Test day yield milk Wood a)

= 0.27;

= 1.09;

14.0

= 5.58

8.0

TDMY (log kg/day)

TDMY (log kg/day)

9.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

330

b)

= -13.6;

= -7.36;

= -0.49

12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 -2.0

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

330

300

330

-4.0

DIM

DIM

W ilmink c)

= -4.25;

= -2.45;

= -0.81

14.0

TDMY (log kg/day)

TDMY (log kg/day)

16.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0

18.0 16.0

d)

= 0.08;

= 0.51;

= 1.12

210

270

14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

330

30

60

90

DIM

120

150

180

240

DIM

a lower slope and a more stable curve. The same behavior in response to increasing 1 values was also observed in groups 3 and 4.

grupos. Los patrones extraídos de los grupos 3 y 4 (Figura 2c y Figura 2d, respectivamente) constituyen ejemplos donde el incremento del parámetro b tiene consecuencias diferentes. En el grupo 3, aumenta la curvatura en la segunda parte mientras que en el 4 muestra una tendencia lineal decreciente.

Of the correlations calculated between estimated parameters for the first two groups classified as typical and atypical curves with the Wood and Wilmink models, most were significant (P<0.05). Of the correlations for the first two groups classified using the Ali-Schaeffer and Legendre polynomials models, significant (P<0.05) correlations were found in all but group 2 of the Legendre curves (Table 5).

Los valores de los parámetros de los cuatro principales grupos de curvas detectadas con polinomios de Legendre se presentan en el Cuadro 4. Se observó un contraste de signos entre el grupo 1 y 2, excepto para el parámetro 0 que fue positivo en ambos grupos.

DISCUSSION

La Figura 3 representa ejemplos de curvas individuales de los cuatro principales grupos, para valores que se incrementan del término 1. En el grupo 1, el incremento del parámetro 1 ocasiona un decremento del nivel de la curva

The TDMY values used in the present study were higher than those reported elsewhere for Siboney Cuba cattle(27,28). In a study of 1,041 lactations in this genotype, R2A values >0.75 23

Alejandro Palacios Espinosa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):15-28

y un aumento de la curvatura, mientras que en el grupo 2, produce menor pendiente y más estabilidad de la curva. Este comportamiento para los valores de 1 que se incrementan es evidente en los grupos 3 y 4.

were found in 21 % of the lactations modeled with the Wood function and 39 % of those modeled with the Ali-Schaeffer function(27).

Goodness of fit increased with the number of parameters included in the function since this is related to model flexibility(21,29). However, the parameters used in polynomial functions do not necessarily have a clear relationship to the basic characteristics of lactation curve shape; this is particularly the case for high order polynomial functions(30). This makes biological interpretation difficult and leads to negative values at curve ends(13).

Las correlaciones entre los parámetros estimados (P<0.05) para los dos primeros grupos clasificados como curvas típicas y atípicas para Wood y Wilmink y los dos primeros grupos para Ali-Schaeffer y Polinomios de Legendre de curvas y en los cuatro modelos estudiados se presentan en el Cuadro 5.

DISCUSIÓN

The a parameter value estimated here with the Wood function for the typical lactation curve was lower than that reported for Holstein cattle(31). This parameter’s scale is directly related to milk production level. The lower value in the present study was expected since, in

Los valores de PDC obtenidos en el presente trabajo fueron superiores a los encontrados en otros estudios en ganado Siboney de Cuba(27,28). En un análisis de 1,041 lactancias de este genotipo, Fernández(27) determinó que

Cuadro 5. Correlaciones estimadas entre los parámetros de los modelos analizados Table 5. Correlations estimated between the parameters of the analyzed models Three-parameter models Standard b c

Parameter

Atypical b

c

Wood

a b

-0.65

0.45 -0.83

-0.79

0.17* -0.30

Wilmink

a b

-0.23

-0.71 0.11*

-0.03

-0.74 0.17*

d/ 3

k/ 4

Five-parameter models b/ 1 Ali-Schaeffer

Legendre

Group 1 c/ 2 d/ 3

k/ 4

b/ 1

Group 2 c/ 2

a b c d

-0.99

0.91 -0.98

-0.99 0.99 -0.94

0.99 -0.97 0.90 -0.99

-0.99

0.97 -0.99

-0.99 0.99 -0.96

0.99 -0.98 0.94 -0.99

0 1 2 3

-0.27

-0.06* -0.13*

0.18* 0.21 -0.20*

0.09* 0.08* 0.16* 0.21

-0.81

-0.53 -0.81

-0.73 -0.53 0.49

-0.31 -0.73 0.47 0.58

* Not significant values (P>0.05).

24

CURVAS DE LACTANCIA INDIVIDUALES EN VACAS SIBONEY DE CUBA

el 21 y 39 % de las lactancias modeladas con la función de Wood y Ali-Schaeffer, respectivamente, presentaron R2A superiores a 0.75.

terms of production traits, the selection program for the Siboney of Cuba genotype was designed to result in low input cattle for a tropical climate.

La bondad de ajuste se incrementa con el número de parámetros de la función, ya que está relacionada con la flexibilidad del modelo(21,29). Sin embargo, el uso de funciones polinomiales puede tener como inconveniente que los parámetros estimados usualmente no posean un significado claro en términos de relación con las características básicas de la forma de la curva de lactancia, especialmente las funciones polinomiales de órdenes elevados(30). Esto implica una interpretación biológica difícil y la presencia de valores negativos en los extremos(13).

Compared to the Wood function, the outstanding element of the Wilmink function is the independence of the first and second portions of the curve. This is confirmed by the lower correlation value between b and c in both the typical and atypical curves. Macciotta et al(22) suggested that interparameter dependence may be the reason the Wood model identifies more standard curves than the Wilmink function.

These two models are known to differ in their ability to describe lactation curve shapes(32).

According to the second derivative of the Wood function, the absolute value of b controls lactation pattern curvature magnitude, which is the deviation of a straight line(24). In other words, when b is positive the curve is concave and when it is negative the curve is convex.

El valor del parámetro a, estimado por la función de Wood para la forma típica de la curva de lactancia fue menor al reportado en estudios con ganado Holstein(31). La escala de este parámetro está relacionada directamente con el nivel de producción de leche. Este resultado era el esperado ya que el genotipo Siboney de Cuba, desde el punto de vista productivo responde a un programa de selección diseñado para una ganadería de bajos insumos en un clima tropical.

Parameters generated with the Wood and Wilmink functions need to be analyzed with caution. A number of authors claim that the occurrence of peak less lactation curves is mainly due to results produced from records with no data for the first days of lactation. For example, the notable presence of negative b parameter values refers to lactations with initial TDMY weighings at 30 d or more after parturition(24).

However, atypical curves are apparently not strictly linked to the day the first TDMY record is made(33).

La característica distintiva de Wilmink con respecto a Wood es la independencia entre la primera y la segunda parte de la curva, confirmado por el valor inferior de correlación entre b y c, tanto para las curvas típicas como las atípicas. Macciotta et al(22) sugirieron que la dependencia entre parámetros puede ser la razón para la cantidad mayor de curvas estándar detectadas por el modelo de Wood, con respecto al de Wilmink.

Peakless lactation curves have been described in dairy cattle(31), sheep(34), lambs(25), and buffaloes(5). This may be a pattern characteristic of certain livestock breeds, including Siboney of Cuba, which has reported average lactation curves exhibiting a slightly flattened shape(28,35).

Landete-Castillejos y Gallego (32) señalan diferencias en la habilidad de los modelos para describir formas de curvas de lactancia. De acuerdo con la segunda derivada de la función de Wood, el valor absoluto de b controla la magnitud de la curvatura del patrón de lactancia,

High correlation between parameters in the AliSchaeffer model means a change in curvature with increases in b, and is a known limitation 25

Alejandro Palacios Espinosa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):15-28

lo cual es la desviación de una línea recta(24), es decir, cuando b es positivo la curva es cóncava y resulta convexa para valores negativos de b.

of this model since it can obscure the estimation process, particularly in genetic analyses. Among other reasons, this has led to abandonment of the Ali-Schaeffer model in favor of Legendre polynomials(23).

Los parámetros obtenidos a través de las funciones de Wood y Wilmink deben ser analizados con precaución. Varios autores sostienen que la ocurrencia de curvas sin pico de lactancia se debe a resultados obtenidos con la ausencia de registros en los primeros días de la lactancia, principalmente. Por ejemplo, en la función de Wood, una presencia relevante de valores negativos del parámetro b ha sido referida para lactancias con los primeros pesajes de PDC a los 30 días o más, después del parto(24). Sin embargo, se ha planteado que las curvas atípicas no parecen estar estrictamente ligadas a los días en que se efectúa el primer registro de PDC(33).

Apparently, an end effect is common in the main groups containing negative estimated TDMY values at the ends of the lactation trajectory(37). As seen in group 2, this edge effect is characteristic of curves modeled with the Ali-Schaeffer and Legendre polynomials functions.

Using the Legendre polynomials model, the correlations between estimated parameters were lower than with the Ali-Schaeffer model.

Schaeffer(23) mentioned this behavior, and considered it difficult to identify the biological reasons explaining why the Ali-Schaeffer and Legendre polynomials functions can detect different types of curves. However, this behavior is particularly useful in random regression analyses searching for individual deviations in an average fixed curve.

Las curvas de lactancia sin pico se han descrito en ganado bovino de leche(31), ovejas(34), cabras(25) y búfalos(5). Algunos autores sugieren que puede ser un comportamiento característico de ciertas razas, y éste parece ser el caso del genotipo Siboney de Cuba, en el cual se han reportado curvas de lactancia promedios con un comportamiento ligeramente aplanado(28,35).

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS Using control day production data for Siboney dairy cows of Cuba, the four main mathematical functions used to predict milk production throughout lactation generated different lactation curve shapes, particularly in the five-parameter models. This shape diversity reflects curve diversity within the herd. Treating them as derivatives of the two classic typical and atypical curve groups could compromise variability among curves, since analyses based on average curves do not reflect the individuality of lactation behavior in a population. Use of three-parameter models as submodels in variance component estimations using control day production data should therefore be done with caution.

La alta correlación entre los parámetros significa un cambio en la curvatura para el incremento del valor de b y es una limitante conocida del modelo de Ali-Schaeffer(36), el cual puede enmascarar el proceso de estimación especialmente en análisis genéticos. Esta, entre otras razones, ha ocasionado el abandono del modelo de Ali-Schaeffer en favor de los polinomios de Legendre(23).

Al parecer, es común que se presente un efecto de borde en los grupos principales donde aparecen valores estimados negativos para las PDC en los extremos de la trayectoria de la lactancia(37). Este efecto de borde, característico de las curvas modeladas con Ali-Sheaeffer y polinomios de Legendre fue visualizado en el grupo 2.

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26

CURVAS DE LACTANCIA INDIVIDUALES EN VACAS SIBONEY DE CUBA

model using cow, goat and sheep data. J Agric Sci 2010;(148):249-262.

Las correlaciones entre los parámetros estimados por los Polinomios de Legendre fueron más bajas que las obtenidas para la función de AliSchaeffer. Este comportamiento fue referido por Schaeffer(23) quien considera difícil encontrar las razones biológicas por las cuales las funciones de Ali-Schaeffer y Polinomios de Legendre pueden detectar disímiles tipos de curvas, sin embargo, este comportamiento es particularmente útil para los análisis de regresión aleatoria, donde se buscan desviaciones individuales de una curva fija promedio.

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CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

10. Wood PDP. Algebraic model of lactation curve in cattle.

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De acuerdo con los resultados de este trabajo se concluye que las funciones matemáticas propuestas para describir la curva de producción de leche a lo largo de la lactancia representaron diferentes formas, en especial los modelos de cinco parámetros. Estas formas adicionales reflejan la diversidad de curvas dentro del hato, por lo que considerarlas derivaciones de los dos grupos clásicos de curvas típicas o atípicas podría comprometer la variabilidad entre curvas.

Por lo tanto, los análisis basados en curvas promedios no reflejan la individualidad del comportamiento en la población. Esto sugiere que el uso de modelos de tres parámetros como submodelos en estimaciones de componentes de varianza usando PDC debe ser efectuado con cautela.

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28

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE Rev Mex CiencBOVINA Pecu 2016;7(1):29-51

Actividad biológica e inmunológica de las isoformas de carga de la hormona luteinizante bovina Biological and immunological activity in bovine luteinizing hormone charge isoforms Álvaro Ortegaa, Aleida Olivaresb, Clara Murciaa, Daniel Díazc, Everardo González-Padillaa, Arnulfo Monteroa, Gabriel Gutiérrez Ospinac, Gerardo Perera-Marína

RESUMEN La hormona luteinizante (LH) sufre modificaciones postraduccionales que dan origen a isoformas de carga. El estudio determinó la actividad biológica (B) e inmunológica (I) de distintas isoformas de LH bovina. Las isoformas se aislaron mediante el cromatoenfoque a partir del extracto glicoprotéico obtenido de lóbulos anteriores de hipófisis de bovino.

La actividad biológica se evaluó en un bioensayo in vitro midiendo la producción de AMPc. La actividad inmunológica se midió con un radioinmunoensayo (RIA) específico para LH. El USDA-bLH-B5 se utilizó como referencia. Las isoformas se agruparon tomando como referencia el rango de pH de elución, en básicas (A, pH, 10.75-9.75; B, pH, 9.58-8.41), neutras (C, pH, 7.98-6.89) y ácidas (D, pH, 6.88-5.41; E, pH, 5.36-3.46). El peso molecular del heterodímero de cada isoforma y del estándar fue similar, estimado en 36.5 kDa. La actividad inmunológica y biológica se comportó de forma dosis-dependiente. Con respecto al estándar, se requirió una mayor concentración de proteína de cada isoforma para obtener el IC50 en la curva de inhibición. En el bioensayo, el valor EC50 para la producción de AMPc fue significativamente diferente entre isoformas; la isoforma neutra mostró un EC50 inferior lo que se interpretó como la proteína más bioactiva, en contraste, la isoforma ácida, mostró un valor de EC50 superior y resultó ser la menos bioactiva; la básica tuvo un comportamiento intermedio (P<0.05). En conclusión, los resultados sugieren un efecto diferenciado de las isoformas de carga, sobre la producción cuantitativa de AMPc por unidad de LH inmunoreactiva.

PALABRAS CLAVE: Hormona luteinizante, Actividad biológica, Actividad inmunológica.

ABSTRACT Luteinizing hormone (LH) undergoes posttranslational modifications that originate different charge isoforms. The study evaluated the differences in biological (B) and immunological (I) activity between isoforms of bovine LH. Isoforms were isolated by chromatofocusing from anterior pituitary glycoprotein extract. The biological activity was evaluated in an in vitro bioassay. Immunological activity was measured with a radioimmunoassay (RIA) specific for LH. The USDA-bLH-B5 standard was utilized as the reference. LH isoforms were grouped by their pH range of elution, in basic (A, pH, 10.75-9.75; B, pH 9.58-8.41), neutral (C pH, 7.98-6.89) and acidic (D, pH, 6.88-5.41; E, pH 5.36-3.46).

The molecular weight of the heterodimer of each isoform was similar to the LH standard, estimated to be 36.5 kDa. Immunological and biological activity behaved in a dose-dependent manner. With respect to the LH standard, all isoforms required higher protein concentration to reach the IC50 of the inhibition curve. In the bioassay EC50 value for cAMP production was significantly different among isoforms; the neutral isoform showed a lower EC50 which was interpreted as more bioactive, the acidic isoform E showed an EC50 being the least bioactive and the basic was intermediate (P<0.05). In conclusion, the results suggest a quantitative effect of LH charge isoforms on the cAMP production, per unit of immunoreactive LH in the bioassay.

KEY WORDS: Luteinizing hormone, Biological activity, Immunological activity.

Recibido el 9 de julio de 2015. Aceptado el 27 de noviembre de 2015. a

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. Circuito exterior de Ciudad Universitaria S/N, CP.04510. México. pererag@unam.mx. Correspondencia al último autor.

b

Unidad de Investigación Médica en Medicina Reproductiva, UMAE Hospital de Gineco Obstetricia no. 4 Luis Castelazo Ayala, IMSS, México.

c

Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México. México.

Esta investigación se realizó con el soporte económico del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CoNaCyT), México, Proyecto Nº 78811. Gracias al NIH y al Dr. Parlow A.F. por proveer la bLH con alta pureza. Álvaro Ortega, Estudiante del posgrado de Ciencias de Producción y Salud Animal, UNAM, México.

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INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

La hormona luteinizante (LH) es una glicoproteína presente en el lóbulo anterior de la hipófisis. La LH participa en la maduración folicular(1), la ovulación(2) y la formación y mantenimiento del cuerpo lúteo(3).

Luteinizing hormone (LH) is a glycoprotein present in the anterior lobe of the hypophysis.

It participates in follicular maturation (1) , ovulation(2), and luteal body formation and maintenance (3) . During LH synthesis, the hormone experiences post-translational modifications such as incorporation of N-type oligosaccharide residues linked to different proportions of sulfate and sialic acid(4). This specific variation is considered the principal biochemical foundation for differentiation between hypophysis and circulating LH charge isoforms(5).

Durante el proceso de síntesis, la LH sufre modificaciones post-traduccionales como la incorporación de residuos de oligosacáridos del tipo N-unidos con diferente porcentaje de sulfato y ácido siálico(4). Esta variación específica se considera la principal base bioquímica de la diferenciación entre las isoformas de carga de la LH intrahipofisaria y circulante(5).

Polymorphism in gonadotropins occurs in ruminants(6,7,8). Using the chromatofocusing protein separation technique, different proportions of LH isoforms have been identified in the serum (9,10) and hypophysis (11,12) .

Indeed, the proportion of these isoforms in circulation differs in the different stages of the estrus cycle(9,10).

El polimorfismo de las gonadotropinas se ha documentado en rumiantes(6,7,8) y mediante el cromatoenfoque se han identificado isoformas de la LH en el suero (9,10) como en la hipófisis(11,12) y cuya proporción relativa es diferente(6). Incluso se sabe que la proporción de estas isoformas en la circulación es distinta en diversas etapas del ciclo estral(9,10).

Variability in the in vivo biological activity of LH isoforms in ruminants is the cause of inconsistent results, although acidic isoforms are regularly reported to have the highest bioactivity(13,14,15).

This variability in biological response has been attributed to each isoform's depuration rate, low assay sensitivity (micrograms of protein are required), and biological variability in experimental animals. In in vitro bioassays, the highest biological activity is present in the basic isoforms(16,17). Results are not always consistent due to the origin (rat or mouse) of the Leydig cells, since the question remains of how species specific they can be when ligands from other species are used. A recently developed alternative is bioassays based on gonadotropin receptor cloning(18,19). Using a stable cell line derived from HEK-293 cells transfected with rat LH receptor cDNA, evaluations have been done of cAMP production associated with distinct rat hypophysis extracts at a basic pH(20,21). This same biological model has been used to prove the constant affinity of bovine LH to the rat LH receptor(22).

La actividad biológica in vivo de distintas isoformas de LH de rumiantes ha generado resultados inconsistentes, sin embargo se establece que la mayor bioactividad la presentan las isoformas ácidas(13,14,15). Esta inconsistencia en la respuesta biológica se ha atribuido a la tasa de depuración de cada isoforma, a la baja sensibilidad del ensayo (se requieren cantidades de microgramos de proteína) y a la variabilidad biológica de los animales empleados. En contraste, con el empleo de bioensayos in vitro, la mayor actividad biológica se presenta en las isoformas básicas(16,17), cuyo resultado no siempre es consistente debido al origen de las células de Leydig (rata o ratón) y que cuestiona la especificidad de especie cuando se utilizan ligandos de otras especies. Una alternativa relativamente reciente ha sido el desarrollo de bioensayos basados en la clonación de receptores para gonadotropinas(18,19). Con la línea celular estable derivada de células embrionarias de riñón humano (HEK-293) y 30

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

Over the last decade, our research group has focused on isolating and characterizing different ruminant LH isoforms to study their structurefunction relationship, their secretion patterns in various physiological conditions and their biological activity. Biological characterization has been especially challenging due to low yields of acidic and neutral isoforms. Advent of the LH receptor cloning bioassay has opened the possibility of quantifying bioactivity in these isoform groups, which is difficult to monitor due to their low yield.

transfectada con el cDNA para el receptor de la LH de rata se ha logrado evaluar producción de AMPc asociada con distintos extractos hipofisarios de rata obtenidos a pH básico(20,21); así mismo, con este modelo biológico se ha determinado la constante de afinidad de la LH bovina al receptor de la LH de rata(22).

Durante la última década, nuestro grupo de investigación se ha enfocado a aislar y caracterizar distintas isoformas de la LH de rumiantes para conocer la relación estructurafunción, su patrón de secreción en diferentes estadios fisiológicos y su actividad biológica.

Sin embargo, debido al bajo rendimiento de las isoformas de tipo ácido y neutro, su caracterización biológica ha sido muy limitada.

Es por esto que con la disposición del bioensayo basado en la clonación del receptor para LH, se abre la posibilidad de cuantificar la bioactividad de este grupo de isoformas, que por su bajo rendimiento es difícil de monitorear.

The present study objective was to evaluate cAMP production by HEK-293 cells transfected with rat LH receptor cDNA in response to different bovine hypophysis LH isoforms.

MATERIAL AND METHODS This study involved four main stages: 1) Isolation and purification of sufficient amounts of the different bovine LH isoforms; 2) Identification of each isoform's isoelectric point using chromatofocusing; 3) Quantification of each isoform's molecular weight by SDS-PAGE; and 4) Immunological characterization using a LH-specific immunoassay and immunotransference analysis.

Por lo tanto, el presente estudio se encaminó a evaluar el patrón de producción de AMPc por las células HEK-293 transfectadas con el cDNA para el receptor de LH de rata en respuesta a distintas isoformas de la LH bovina hipofisaria.

MATERIAL Y MÉTODOS

Hypophysis collection

Para el desarrollo de este estudio fue necesario aislar y purificar las distintas isoformas de LH bovina en cantidades suficientes; determinar por medio del cromatoenfoque el punto isoeléctrico de cada isoforma, el peso molecular en SDS-PAGE y su caracterización inmunológica por medio de un radioinmunoensayo específico para LH y mediante el análisis por inmunotransferencia.

Hypophyses were extracted from adult bovines regardless of age, sex and physical condition.

Prior to slaughter, each animal was stunned with a captive bolt gun. Once dead, the head was removed from each animal, the hypophysis extracted and deposited in phosphate buffer (0.05 M, pH 7.2). Excess tissue was removed from the gland, the posterior lobe discarded, and the anterior lobe lyophilized. All gland extraction and LH purification and isoform isolation steps were done at 4 °C.

Colección de hipófisis Se obtuvieron hipófisis de animales adultos sin considerar edad, sexo, ni condición fisiológica.

Antes del sacrificio, cada animal se aturdió con una pistola de perno cautivo y después se separó la cabeza y se extrajo la hipófisis que

Obtaining of glycoprotein extract from the hypophysis anterior lobe An established protocol(13) was used to extract glycoprotein from 375 anterior lobes. Briefly, 31

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lyophilized anterior lobes were hydrated for 48 h with 10% ammonium acetate (pH 7.0) containing 0.001 M phenylsulfonyl methyl fluoride. They were blended and homogenized with the same solution. The resulting extract was kept under constant agitation for 24 h and centrifuged at 10,000 xg for 45 min. The precipitate (R0) was stored. Supernatant was adjusted to pH 7.0 and a volume of ethanol equivalent to 40 % total volume added by drops under constant agitation. After 16 h agitation, the mixture was centrifuged, and the precipitate (protein fraction; R1) was discarded and stored.

A volume of ethanol equal to that in the previous step was added to the supernatant, although in this case it was equal to 85 % of total volume. This mixture remained undisturbed for 48 h and the precipitated proteins recovered by centrifugation. This group of proteins Identified was named glycoprotein extract (GPE), was re-suspended in deionized water, dialyzed (Spectra/Por # 4, 12-14 kDa cut-off) for 24 h with the water changed every 8 h, and lyophilized. A second extraction was done to the R0 precipitate from the first extraction step, following the above process. This second GPE was mixed with the first before purification.

se colocó en amortiguador de fosfatos (0.05 M, pH 7.2). De cada glándula se retiró el exceso de tejido, se descartó el lóbulo posterior y el lóbulo anterior se liofilizó. Cada paso de extracción y purificación de la LH y sus isoformas se realizó a 4 °C. Obtención del extracto glicoprotéico (EGP) del lóbulo anterior de la hipófisis El extracto glicoprotéico se obtuvo de 375 lóbulos anteriores de acuerdo al procedimiento descrito para rumiantes(13). En breve, los lóbulos anteriores liofilizados se hidrataron con acetato de amonio al 10%, pH 7.0 que contenía 0.001 M de fenilsulfonilmetilfluoruro durante un período de 48 h. Al término se licuaron y se homogeneizaron con la misma solución, y el extracto obtenido se conservó en agitación mecánica por 24 h; al término, el extracto se centrifugó a 10,000 xg por 45 min; el precipitado (R0) se almacenó y el sobrenadante se ajustó a pH 7.0 y recibió gota a gota en agitación constante un volumen de etanol que correspondió al 40 % del volumen total. Después de 16 h de agitación, la mezcla se centrifugó y la fracción de proteína presente en el precipitado (R1) se almacenó y el sobrenadante recibió un volumen de etanol de forma idéntica a lo previamente indicado, que correspondió al 85 % del volumen total. Esta mezcla permaneció en reposo por 48 h y al término, las proteínas precipitadas se recuperaron por centrifugación. Este grupo de proteínas se identificó como el extracto glicoprotéico (EGP), que se resuspendió en agua desionizada, se dializó (Spectra/Por # 4, cut off 12-14 kDa) durante 24 h con cambio de agua cada 8 h y después se liofilizó. Una segunda extracción se realizó a partir del R0 de la primera extracción repitiendo el proceso antes descrito.

El segundo extracto glicoprotéico se mezcló con el primero para su purificación.

GPE purification for LH isolation The GPE was purified in an ionic exchanger (CM-Sepharose) to isolate LH(13). One gram GPE containing 256 mg protein was resuspended in 0.005 M ammonium acetate (pH 5.1; elution buffer), agitated for 24 h, and centrifuged (10,000 xg for 30 min). The protein solution was applied to a pre-packed column (27.0 x 1.5 cm i.d.) with the cation exchanger previously adjusted with elution buffer, and stored at 4 °C. The protein fraction was eluted at a 23 ml/h flow through an ammonium acetate gradient (0.005 M, pH 5.1; 0.1 M, pH 6.8; and 1.0 M-glycine 0.1 M, pH 9.5). Two-milliliter fractions were collected during the chromatography run, and the protein elution pattern monitored at 280 nm. When effluent optical density was close to zero, the buffer was changed. After elution, a 1 M NaCl solution was run through the column.

Purificación de EGP para la obtención de la LH La LH se obtuvo por la purificación del extracto glicoprotéico en el intercambiador iónico, CM32

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

Sepharosa (13) . Un gramo de extracto que contenía 256 mg de proteína se resuspendió en acetato de amonio 0.005 M, pH 5.1 (amortiguador de elución), se agitó durante 24 h y se centrifugó (10,000 xg por 30 min).

La proteína en solución se aplicó a una columna (27.0 cm X 1.5 d.i.) pre-empacada con el intercambiador catiónico, equilibrada previamente con el amortiguador de elución y conservada a 4 °C. La fracción de proteína se eluyó con un flujo de 23 ml/h a través de un gradiente de acetato de amonio (0.005 M, pH 5.1; 0.1 M, pH 6.8 y 1.0 M-glicina 0.1 M, pH 9.5) y durante la corrida cromatográfica se colectaron fracciones de 2 ml. El patrón de elución de la proteína se monitoreó a 280 nm. Cada cambio de amortiguador se realizó cuando la densidad óptica del efluente fue cercana a cero. Una vez concluida la elución, la columna recibió una solución NaCl 1 M.

Elution of the GPE produced protein peaks identified based on the buffer. Fractions eluted with 0.005 M ammonium acetate (pH 5.1) were called CM-1ab, CM-1cd and CM-1ef. The protein eluted with 0.1 M ammonium acetate (pH 6.8) was called CM-2ab, and that eluted with 1.0 M ammonium acetate and 0.1 M glycine (pH 9.5), corresponding to raw LH, was called CM-3ab.

The protein peak recovered after the NaCl run was called the salt peak (S). All the protein peaks were dialyzed and lyophilized until analysis.

CM-3ab purification for LH isoform isolation Isolation of LH isoforms was done by purifying the CM-3ab fraction. During GPE purification in CM-Sepharose, CM-3ab stood out for its high LH content and for having an electrophoretic pattern similar to that of the bovine LH standard (USDA-bLH-B5). For this reason, it was processed for separation by electrical charge (8,11) . Briefly, 56 mg protein were resuspended in Pharmalyte (pH 8.0-10.5, Pharmalyte 0.36 meq/ml pH, Pharmacia Biotech Piscataway, NY, USA), diluted to 1:45 with deionized water and HCl added to adjust suspension pH to 7.0. This was then added to a column (27 x 0.7 cm i.d.) prepacked with PBE-118 ionic exchanger (Polybuffer exchanger for chromatofocusing, capacity: 50.4 µmol, pH unit-1 ml-1, Pharmacia, Biotech, Piscataway, NY, USA), balanced with 0.025 M triethylamine-HCl (pH 11.0) and stored at 4 °C. Three milliliters Pharmalyte buffer (pH 7.0) were added to the column before protein elution to prevent exposure of the sample to an extreme pH.

Los distintos picos de proteína en que se distribuyó la elución del extracto glicoprotéico se identificaron de acuerdo a su amortiguador; las fracciones que eluyeron con acetato de amonio 0.005M, pH 5.1 se denominaron CM1ab, CM-1cd y CM-1ef, respectivamente; el pico de proteína que eluyó con 0.1 M, pH 6.8 se denominó CM-2ab y la proteína que eluyó con 1.0 M-glicina 0.1 M, pH 9.5 se identificó como CM-3ab y correspondió a la LH cruda. La fracción de proteína recuperada después de NaCl se denominó pico de sal. Los distintos picos de proteína, se dializaron y liofilizaron para su análisis.

Purificación de la fracción CM-3ab para la obtención de las isoformas de la LH

Protein fraction elution was done at a 7 ml/h flow rate, and 2 ml fractions collected. Each fraction's pH was measured, and when a pH above 7.0 was detected in more than ten consecutive samples the elution buffer was changed to polybuffer 74 (Pharmacia, Biotech).

This was diluted to 1:8 with deionized water, and adjusted to pH 3.5 to elute proteins between pH 7.0 and 3.5. Any protein clinging to the column after elution at pH 3.5 was

Las isoformas de la LH se obtuvieron después de la purificación de la fracción CM-3ab; esta proteína recuperada durante la purificación del EGP en CM-Sepharosa se caracterizó por su alto contenido de LH y un patrón electroforético similar al estándar de LH bovina, USDA-bLHB5. La fracción se sometió a un proceso de separación de acuerdo a carga eléctrica(8,11).

En breve, la proteína (56 mg) se resuspendió 33

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en Pharmalyte (pH 8.0-10.5, Pharmalyte 0.36 meq/ml pH, Pharmacia Biotech Piscataway, NY), diluido 1:45 con agua desionizada, el que se ajustó con HCl a pH 7.0 y a la suspensión se aplicó a una columna (27 cm x 0.7 cm d.i.) pre-empacada con el intercambiador iónico PBE118 (Polybuffer exchanger for chromatofocusing, capacity: 50.4 µmol. pH unit-1 ml-1, Pharmacia, Biotech, Piscataway, NY), equilibrada con 0.025 M trietilamina-HCl, pH 11.0 y conservada a 4 °C. Previo a la elución de la proteína, la columna recibió 3 ml de amortiguador Pharmalyte, pH 7.0 para evitar la exposición de la muestra a un pH extremo.

recovered by adding 1.0 M NaCl. Each fraction was then neutralized based on the pH record and the known protein elution pattern at 280 nm. Fractions collected between pH 11.0 and 7.0 were neutralized with 1.1 M Tris-HCl, and those eluded between pH 6.99 and 3.5, as well as those collected with 1 M NaCl, were neutralized with 1.1 M imidazole. After all fractions were neutralized, they were grouped according to the pH range of the elution protein peak: basic (A, pH 10.75-9.75; B, pH 9.588.41); neutral (C, pH 7.98-6.89); and acidic (D, pH 6.88-5.41; E, pH 5.36-3.46). The different protein peaks were dialyzed separately and then lyophilized.

La fracción de proteína se eluyó con un flujo de 7 ml/h y se colectaron fracciones de 2 ml.

El pH de cada fracción se midió, y cuando se detectó el pH de 7.0 en más de 10 fracciones consecutivas, el amortiguador de elución se cambió por el polybuffer 74 (Pharmacia, Biotech), diluido 1:8 con agua desionizada y ajustado a pH 3.5 para obtener proteínas eluídas entre un pH 7.0 a 3.5. La proteína unida a la columna después de la elución a pH 3.5 se recuperó por la adición de 1.0 M NaCl. Con el registro de pH y conocido el patrón de elución de la proteína a 280 nm, se procedió a neutralizar cada fracción; las fracciones colectadas entre pH 11.0 y 7.0 recibieron TrisHCl, 1.1M, pH 7.4 y las fracciones eluídas entre pH 6.99 y pH 3.5 así como las proteínas colectadas con NaCl 1 M se neutralizaron con Imidazol 1.1 M. Una vez neutralizadas el total de las fracciones de proteína, las fracciones se agruparon en el rango de pH de elución del pico de proteína: básicas (A, pH, 10.75-9.75; B, pH, 9.58-8.41), neutra (C, pH, 7.98-6.89) y ácidas (D, pH, 6.88-5.41; E, pH, 5.36-3.46).

Los distintos picos de proteínas se dializaron de forma independiente y se liofilizaron hasta su análisis.

Electrophoretic (SDS-PAGE) analysis The protein fractions isolated during LH purification and their isoforms were analyzed with SDS-PAGE(23), and their electrophoretic patterns compared to the LH reference (USDAbLH-B5). The resulting gels were stained following manufacturer instructions (Silver Stain Kit, Bio-Rad Laboratories, Inc.). Prestained, low molecular-weight markers were used as references (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Total protein quantification Protein content was quantified in each fraction isolated during the LH purification and their isoforms, according to Bradford method(24).

Bovine serum albumin (BSA) was used as a reference standard.

Immunological analysis of LH and its isoforms Identification of LH-immunoreactive proteins The molecular weight of proteins immunoreactive to the LH was determined through immunoblotting(25) The reference standard (USDA-bLH-B5), a protein fraction, or an isoform were analyzed

by SDS-PAGE at a concentration of 100 ng of protein. At the end of electrophoresis, the proteins present in the gel were transferred (200 mA/75 min: Trans-Blot Semi-Dry, Bio-

Análisis electroforético (SDS-PAGE) El patrón electroforético y el peso molecular se determinaron mediante una electroforesis en placa con geles de poliacrilamida al 12.5 % a 34

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

Rad, USA) to a nitrocellulose membrane (0.45 µm Trans-Blot, Bio-Rad). The membranes were incubated at 4 °C for 16 h with a 1:1000 dilution of rabbit-generated primary antibody (anti-oLH26). They were then incubated for 60 min at room temperature with a 1:20,000 dilution of the secondary antibody (rabbit anti-IgG generated in goat and conjugated to peroxidase; Jackson Immuno Research). The membranes were viewed with chemiluminscence (ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA).

pH 8.6 en presencia de dodecil sulfato de sodio(23) en aquellas fracciones de proteína obtenidas durante la purificación de la LH y sus isoformas. El patrón electroforético se comparó con la LH de referencia (USDA-bLH-B5). Una vez concluida la electroforesis, el gel se tiñó con plata siguiendo las especificaciones del estuche comercial (Silver Stain Kit, Bio-Rad, Laboratories, Inc). Como referencia se utilizaron marcadores preteñidos de bajo peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Inc).

Cuantificación de proteínas totales La concentración de proteína se determinó en cada fracción obtenida durante la purificación de la LH y sus isoformas por el método de Bradford(24). Se utilizó como estándar a la albúmina sérica bovina (BSA).

Quantification of immunoreactive LH Immunoreactive LH was quantified with liquidphase radioimmunoassay (RIA) after validation with bovine LH(11). Each protein fraction from LH purification and their isoforms were analyzed at six doses (0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 and 6.4 ng protein/tube), with four replicates per dose. The LH reference (USDA-bLH-B5) was used as a standard at eight doses (0.01, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 and 10 ng/tube). To create a tracer, NaI125 was incorporated into the USDAbLH-B5 following the IODO-GEN method(11).

Primary antibody (anti-oLH-26) was used at a 1:40,000 dilution in the presence of normal rabbit serum (1:1600). Precipitation of the antigen-antibody complex occurred after 24 h at 4 °C with the secondary antibody (anti-IgG from rabbit generated in burro, 1:80). After addition of 1 ml 0.05 M PBS buffer (pH 7.2) containing 0.1% BSA, the immunoprecipitated fraction was separated from the unbonded fraction by centrifuging at 1,500 xg for 15 min at 4 °C. A gamma radiation counter was used to analyze the immunoprecipitated fraction.

Assay sensitivity was 0.1 ng/tube. Using the reference curve EC50 as the dose value parameter, intra-assay variation was 2 % and interassay variation was 5 %.

Análisis inmunológico de la LH y sus isoformas Identificación de proteínas inmunoreactivas a LH El peso molecular de las proteínas inmunoreactivas a LH se determinó por medio de la inmunotransferencia(25). El análisis se inició después de concluida la electroforesis en placa con geles de poliacrilamida al 12.5% a pH 8.6 en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDSPAGE). En breve, 100 ng de proteína del patrón de referencia USDA-bLH-B5 o de las distintas fracciones obtenidas durante la extracción y purificación de la LH y sus isoformas se transfirieron (Trans-Blot Semi-Dry (Bio-Rad, USA), 200 mA/75 min) a una membrana de nitrocelulosa (0.45 µm trans, blot, Bio-Rad).

Transferidas las proteínas a la membrana de nitrocelulosa se incubó a 4 °C durante 16 h con el anticuerpo primario generado en conejo (antioLH-26) a una dilución 1:1000. Al término, la membrana se incubó durante 60 min a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (anti IgG de conejo generado en cabra y conjugado a peroxidasa, Jackson Immuno Research) diluido 1:20,000. El revelado se realizó por quimioluminiscencia (ImmobilonTM

Quantitative LH concentration was measured by calculating IC50, defined as the protein concentration (ng protein or LH/tube) that caused 50 % inhibition of the %B/Bo response.

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Western Chemiluminescent HRP Sustrate, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA).

This calculation was done using the Prism 6.0 (Graph Pad Software, Inc., USA) program, which includes the Hill equation. The IC50 and Hill slope (h) values were compared with the sumsquared F-test using a null hypothesis of the parameters being identical between each evaluated hormone pair; if a P>0.05 value is generated the parameter is deemed the same for both fits(26). A one-way ANOVA and a Tukey multiple comparison test were applied to identify significant differences (P<0.05) between the tested isoforms(27,28).

Cuantificación de la LH inmunoreactiva (irLH) La determinación cuantitativa de la LH inmunoreactiva se determinó con un radioinmunoensayo (RIA) en fase líquida, validado previamente para la LH bovina(11).

Cada fracción obtenida durante la purificación de la LH y sus isoformas se analizó a las dosis de 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 y 6.4 ng de proteína/ tubo en cuatro réplicas y como estándar se utilizó al USDA-bLH-B5 a las dosis de 0.01, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 y 10 ng/tubo. El trazador se formó con la incorporación del NaI125 al USDA-bLH-B5 mediante el método del IODOGEN(11). El anticuerpo primario (anti-oLH-26) generado en conejo se utilizó a una dilución de trabajo 1:40,000 en presencia de suero normal de conejo, 1:1600 y la precipitación del complejo antígeno-anticuerpo se obtuvo después de 24 h de incubación a 4 °C con el anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo generado en burro, 1:80).

Finalmente, la fracción inmunoprecipitada se separó de la fracción no unida por centrifugación (1,500 xg por 15 min a 4 °C) previa adición de 1 ml de amortiguador PBS 0.05M, pH 7.2 que contenía BSA al 0.1 %. La fracción inmunoprecipitada se analizó en un contador de radiaciones gamma. La sensibilidad del ensayo fue de 0.1 ng/tubo y el coeficiente de variación intra e interensayo tomando como parámetro el valor de la dosis al EC50 de la curva de referencia correspondió al 2 y 5 %, respectivamente.

Measuring LH isoform biological activity Biological activity was quantified by measuring cAMP production in three replicates per dose in three independent assays. HEK-293 cells(20) transfected with rat LH recombinant receptor cDNA (provided by Dr. Mario Ascoli, Iowa University, Iowa City, IA,USA) were stimulated with the reference pattern (USDA-bLH-B5) or one of the isoforms. These were differentiated when their isoelectric points (IEP) were sufficiently separated between proteins, and each represented a LH polymorphism. Based on these criteria, three isoforms were analyzed: basic (B, pH 9.58-8.41); neutral (C, pH 7.986.89); and acidic (E, pH 5.36-3.46).

The HEK-293 cells were cultured in a 162 cm2 culture box (Costar, Cambridge, MA, USA) containing high glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 5 % lamb fetal serum, 0.002 M L-glutamine, 100 µg/ml geneticine, 50 UI/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Cells with 90% confluence were reseeded in 24-well boxes (Gibco, BRL) at a 5 X 104 concentration per well and incubated in a 5% CO2 atmosphere for 24 h at 37 °C. The medium was then removed and the cells exposed for 24 h to increasing doses (6.25, 12.5 25.0, 50.0, 100.0 and 200.0 ng/ml) of immunoreactive LH from USDA-bLH-B5 or an isoform. Each hormone was diluted in culture medium containing 0.0125 M 3-isobutyl-1-methylxantine (phosphodiesterase inhibitor).

La concentración cuantitativa de la LH se determinó a partir del cálculo del parámetro IC50, definido como la concentración de proteína (ng de proteína o LH/tubo) que causó el 50 % de inhibición en la respuesta del %B/Bo. Para lo anterior se utilizó el programa estadístico Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., USA) que incluyó la ecuación de Hill. Ambos parámetros, IC50 y la pendiente de Hill se compararon con la prueba F de la suma de cuadrados, probando como hipótesis nula que estos parámetros son 36

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

idénticos entre cada par de hormonas evaluadas; si se obtiene un valor de P>0.05, se concluye que el parámetro es el mismo para los dos ajustes(26). Adicionalmente, se utilizó ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Tukey para determinar diferencias significativas ( P <0.05) entre las isoformas ensayadas(27,28).

Total cAMP content was measured in the culture medium with liquid phase RIA(21). The cAMP tracer 2-0-monosuccinyl tyrosyl-methyl ester (Sigma) was labelled with Nal125 (Amersham International Limited, UK) following the chloramine-T method(29). The primary antibody (anti-cAMP, CV-27, NIADDK, Bethesda, MD, USA) was used at a 1:70,000 dilution in the presence of 0.005 M sodium and 0.1 % BSA (pH 6.1).

Each reaction tube was incubated for 24 h at 4 °C, and then the bonded antibody separated from the free cAMP by adding cold ethanol, and then centrifuging at 1,500 xg for 30 min at 4 °C. The immunoprecipitated fraction was analyzed in a gamma radiation counter. Assay sensitivity was 2.0 pmol/ml with a 2 % intraassay variation coefficient, and a 5 % interassay variation coefficient. Production of cAMP was calculated by interpolating from the cAMP 2-0monosuccinyl tyrosyl-methyl ester reference curve.

Determinación de la actividad biológica de las isoformas de la LH La actividad biológica se determinó midiendo la producción de AMPc en tres réplicas por dosis en tres ensayos independientes. En breve, las células HEK-293(20) transfectadas con el cDNA del receptor recombinante de LH de rata (proporcionadas por el Dr. Mario Ascoli, Iowa University, Iowa City, IA), se estimularon con el patrón de referencia (USDA-bLH-B5) o con cada isoforma, que por su punto isoeléctrico (pI) representó el polimorfismo de la LH y cuyo pI se encontró lo suficientemente alejado entre proteínas; con base en estos criterios se analizaron las isoformas, básica (B, pH; 9.588.41), neutra (C, pH; 7.98-6.89) y ácida (E, pH; 5.36-3.46).

Each isoform's biological activity was measured by calculating the EC50 parameter, defined as the amount of LH (ng/ml) required to generate a response equal to 50 % of the maximum response under assay conditions(26,27). For this purpose, the experimental data were fitted in four-parameter dose-stimulation response curves in the tested LH immunoreactive dose range for the standard and for each isoform. These calculations were done with the Prism 6.0 program (GraphPad Software, Inc., USA).

Para ello, las células HEK-293 transfectadas se cultivaron en caja de cultivo de 162 cm2 (Costar, Cambridge, MA, EUA) que contenía el medio DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) alto en glucosa, suplementado con 5 % de suero fetal de ternera, 0.002 M de L-glutamina, 100 µg/ml de geneticina 50 UI/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células confluentes en un 90 % se resembraron en cajas de 24 pozos (Gibco, BRL) con una densidad de 5 X 104 células por pozo y se incubaron en una atmósfera de 5 % de CO2 por 24 h a 37 °C. Al término, se retiró el medio y las células se expusieron durante 24 h a dosis crecientes de LH inmunoreactiva del USDAbLH-B5 o de cada isoforma (6.25, 12.5 25.0, 50.0, 100.0 y 200.0 ng/ml). Cada hormona se diluyó en medio de cultivo que contenía 0.0125 M de 3-isobutil-1-metilxantina (inhibidor de la fosfodiesterasa).

Using the fit curves, statistical comparisons were made of the EC50 parameters and Hill slope (h). These comparisons were done with the sum-of-squares F-test, testing the null hypothesis of the parameters being identical between each pair of evaluated hormones; a value of P>0.05 indicated the parameter was the same in both fits(27). A one-way ANOVA and the Tukey multiple comparison test were applied to identify significant differences ( P <0.05) between the relative bioactivity strength of each assayed isoform.

37

Alvaro Ortega, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):29-51

RESULTS

El contenido de AMPc total se midió en el medio de cultivo a través de radioinmunoensayo en fase líquida (21). Para ello el trazador 2-0monosuccinil tirosil-metil éster de AMPc (Sigma) se radiomarcó con Na125I (Amersham International Limite, Reino Unido) mediante el método de la Cloramina-T(29). El anticuerpo primario (anti-AMPc, CV-27, NIADDK, Bethesda, MD, USA) se utilizó a una dilución de 1:70,000 en presencia de acetato de sodio 0.005M y albúmina sérica bovina al 0.1 %, pH 6.1. Cada tubo de reacción se incubó por 24 h a 4 °C y al término el anticuerpo unido se separó del AMPc libre después de agregar etanol frío y seguido de una centrifugación a 1,500 xg durante 30 min a 4 °C. La fracción inmunoprecipitada se analizó en un contador de radiaciones gamma.

La sensibilidad del ensayo fue de 2.0 pmol/ml y el coeficiente de variación intra e interensayo fue de 2 y 5 %, respectivamente. La producción de AMPc se calculó por interpolación de los resultados en la curva de referencia de 2-0monosuccinil tirosil-metil éster de AMPc.

Three fractions were generated during the anterior lobe extraction process. The first fraction, R0, corresponded to 63.2 % (77.16 g) of the original weight. The second, R1, was obtained with 40% ethanol with a 9.03 % (11.02 g) yield. The third was the GPE, recovered using 85% ethanol with a 8.24 % (10.06 g) yield and a 226 µg LH/mg protein concentration.

Five protein fractions resulted from GPE purification in the ionic exchanger (Figure 1(I)).

Fraction CM-3ab exhibited the highest protein content and high immunoreactive LH content (Figure 1(II)). In contrast, fractions CM-1cd and CM-1ef had low LH and protein contents, and were excluded from the analysis.

In the electrophoresis patterns generated under non-reducing (NR) conditions (i.e. absence of β-mercaptoethanol) (Figure 1(II)), CM-3ab exhibited a pattern similar to that of the reference, consisting of two proteins with molecular weights of 36.5 and 23.4 kDa, respectively (Figure 1(III)). Although both these proteins were present in the GPE, as well as CM-1ab and CM-2ab, the pattern in the latter two fractions was more heterogeneous with an additional predominant, higher weight (56.0 kDa) protein. Under reducing (R) conditions (i.e. presence of β-mercaptoethanol), CM-3ab exhibited three proteins with weights of 23.4, 20.8 and 17.0 kDa, respectively. Fractions CM1ab and CM-2ab had a similar pattern, with addition of an even more dominant protein at 72.0 kDa. Based on their patterns, the latter two fractions were excluded, and LH charge isoforms were isolated only from fraction CM3ab (pH 9.5).

La actividad biológica para cada isoforma se determinó a través del cálculo del parámetro EC50, definido como la cantidad requerida de LH (ng/ml) que generó una respuesta al 50 % de la respuesta máxima, bajo las condiciones establecidas en el ensayo(26,27). Para ello, los datos experimentales se ajustaron en curvas dosis-respuesta de estimulación de cuatro parámetros, en el rango de la dosis de LH inmunoreactiva probada del estándar y de cada isoforma, utilizando el programa estadístico Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., USA).

A partir de las curvas de ajuste se realizaron comparaciones estadísticas de los parámetros EC50 y la pendiente de Hill (h). Para lo anterior se utilizó la prueba F de la suma de cuadrados, probando como hipótesis nula que los parámetros son idénticos entre cada par de hormonas evaluadas; si se obtiene un valor de P>0.05, se concluye que el parámetro es el mismo para los dos ajustes(27). Además, se utilizó ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Tukey para

In the PBE-118 ionic exchanger, the CM-3ab elution pattern exhibited five protein peaks along the pH gradient, each peak corresponding to an isoform (Figure 2(I)). Of the total recovered immunoreactive LH, 72.8 % was obtained at a basic pH (≥7.5, fractions A and B), 6.3 % at a 38

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

Figura 1. I) Patrón de elución del extracto glicoprotéico (GPE) en CM-Sepharosa. II) Concentración de proteína (mg) y LH inmunoreactiva para cada fracción. III) Patrón electroforético del USDA-bLH-B5, el (CPE) y de las fracciones con actividad inmunológica de LH. NR, condiciones no reductoras; R, reductoras I) Elution pattern of the glycoproteic extract (GPE) during its cation-exchange chromatography with CMSepharose. II) Table summarizing the protein concentration (mg) and concentration of LH (µg LH/mg protein) of each fraction. III) Electrophoretic pattern of the reference LH (USDA-bLH-B5), the GPE and the fractions with LH immunological activity under non-reducing (NR) and reducing (R) conditions. Arrows indicated at proteins with molecular weights of 72, 60, 36.5, 23.4, 20.8, 17.0 kDa, respectively

I

CM-1ab

4

1

1.0Mam m oniumacetate-0.1Mglycine, pH9.5

2

CM-1cd

CM- 2ab 0.1Mam m oniumacetate, pH6.8

3

0.005Mam m oniumacetate,pH5.1

CM-3ab

O .D.280nm

CM-1ef

NaCl

0 0

100

200 300 Frac tion nu mber

400

500

II Fractions o btained dur ing purification of glycopro tein extract (G PE) t g L H/mg p ro te in **

Fra c tio n

P ro tein (mg ) *

GPE

256.0

226. 0

CM-1ab CM-1cd CM-1ef CM-2ab CM-3ab

26.7 6. 6 0. 8 18.1 55.8

607. 0 20. 0 11. 4 73. 0 727. 5

* E stimated b y Bra dfo rd ** Estimate d b y RIA , equ ivalent to USDA-bLH-B5

III 95 72

b a -2 M C

b a -3 M C

CM- a 3 b

b a -1 M C

CM- a 1 b

E

b a -3 M C

CM- a 3 b

P G

R b a -2 M C

CM- a 2 b

USDA -b LH-B 5

CM- a 1 b

kD a

b a -1 M C

CM- a 2 b

NR GPE

Figure1.

kDa 72 60

55 36. 5

36 28

23. 4 20. 8 17. 0

17

39

Alvaro Ortega, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):29-51

determinar diferencias significativas (P<0.05) entre la biopotencia relativa de las isoformas ensayadas.

neutral pH (7.4 - 6.6, fraction C), and 20.1 % at an acidic pH (≤ 6.5, fractions D and E). Each isoform had different protein and immunoreactive LH contents (Figure 2(II)).

Under NR electrophoretic conditions (Figure 3(I), upper panel), each LH isoform exhibited a homogeneous pattern with two dominant protein bands (36.5 and 23.4 kDa) in a pattern similar to those of USDA-bLH-B5 and CM-3ab. Although the GPE and isoform E (pH; 5.36-3.46) had a pattern similar to those above, they also included

Figura 2. I) Patrón de elución de la fracción CM-3ab en el cromatoenfoque. Cada pico de proteína se identificó con una letra, comenzando con la proteína de elución a pH básico (A) y finalizando con la proteína que eluyó a pH ácido (E). La fracción S se obtuvo con 1.0M NaCl. II) Cuadro de rendimiento y concentración de LH/mg de proteína para cada isoforma Figure 2. I) Elution pattern of the CM-3ab fraction in chromatofocusing. Protein was monitored at 280 nm and each protein peak was identified with a letter, starting with the elution protein at basic pH (A) and ending with the eluted protein at acid pH (E). The protein that did not eluted with the gradient was obtained after, using 1.0M NaCl and was designated as S. II) Table summarizing the protein concentration and LH-specific for each isoform

Figura 3. Patrón electroforético (I) y análisis por inmunotransferencia (II) de cada isoforma de LH bovina.

USDA-bLH-B5, patrón de referencia; GPE, extracto glicoprotéico; fracción CM-3ab; isoformas, A (pH 10.759.75); B (pH 9.58-8.41); C (pH 7.98-6.89); D (pH 6.885.41); E (pH 5.36-3.46) Figure 3. Electrophoretic pattern (I) and immunobloting electrophoretic pattern (II) for the standard bLH (USDAbLH-B5), glycoprotein extract (GPE), CM-3ab fraction, isoform A, pH 10.75-9.75; B, pH 9.58-8.41; C, pH 7.986.89; D, pH 6.88-5.41; E, pH 5.36-3.46 in non-reducing and reducing conditions

I 12

A

0.8

pH 0.D. 280 nm

11

0.6

8

0.4 D

7 S NaCl

6 5

Electrophoresis

I

0.2

C

B 4 20

40

60

80

100

120

N Non-Reducing o n- r e d uc in g

0.0 0

140

Fraction number Purific ation of bovine LH isoforms from the CM-3ab fraction of GPE

Isoform (pH range)

Protein (mg) * 1.0

112.5 t 1 4.1

B (9.58-8.41)

17.9

673.1 t 3 7.7

C (7.98-6.89)

6.9

161.3 t 1 2.9

D (6.88-5.41)

7.9

E (5.36-3.46) S

8.5

232.9 t 13.1 199.3 t 5.3

0.4

16.0 t 0 .6

A (10.75-9.75)

* E sti mated b y B radfo rd

36 28

A B C D E

II kDa 55 36.5 36

LH isoform

A B C D E kDa 36.5

23.4 17

23.4

28

20.8

36 23.4 28

36.5 23.4

20.8 17

20.8

17

t g LH/mg protein **

R eReducing d u c in g

II

kDa 55

LHisoform

Western-Blot U SA D G P E -b L H -B 5 C M -3 a b

E

U SD A G P E -b L H -B 5 C M -3 a b

9

O.D. 280 nm

Elution pH 4°C

10

36 28 17

17.0

** E sti mate d b y RIA

40

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

RESULTADOS

a 55.0 kDa protein. Under R electrophoretic conditions (Figure 3(I), lower panel), all the isoforms exhibited the same pattern as the GPE, CM-3ab and USDA-bLH-B5. Of interest is the presence of a 17.0 kDa protein in CM-3ab and the B, C and D isoforms.

Durante el proceso de extracción de los lóbulos anteriores se generaron tres fracciones. El R0 que correspondió al 63.2 % (77.16 g) del peso original; el R1, que se obtuvo con el 40 % de etanol, con un rendimiento del 9.03 % (11.02 g) y el extracto glicoprotéico (EGP) que se recuperó con el 85 % de etanol, con un rendimiento del 8.24 % (10.06 g) y una concentración de 226 µg de LH/mg de proteína.

Immunotransference analysis under NR conditions (Figure 3(II), upper panel) showed that the different isoforms maintained a LH immunoreactive protein pattern similar to that of USDA-bLH-B5 with the 36.5 kDa protein most notable. Under R conditions, this protein almost disappears while lower weight proteins (23.4 and 20.8 kDa) increase in intensity.

Del EGP purificado en el intercambiador iónico se obtuvieron cinco fracciones de proteína (Figura 1(I)). La fracción CM-3ab mostró el mayor contenido de proteína y un alto contenido de LH inmunoreactiva (Figura 1(II)); en contraste, las fracciones CM-1cd y CM-1ef mostraron un bajo contenido de LH y cantidad

When the LH isoform and CM-3ab fraction are compared to the reference standard in the RIA displacement curves (Figure 4), immunological

Figura 4. Curva dosis-respuesta en el sistema de RIA específico para LH. I) USDA-bLH-B5 y la fracción CM-3ab. II) USDA-bLH-B5 e isoformas básicas (A, pH, 10.75-9.75; B, pH, 9.58-8.41); USDA-bLH-B5 e isoforma neutra (C, pH, 7.98-6.89); USDA-bLH-B5 e isoformas ácidas (D, pH, 6.88-5.41 y E, pH 5.36-3.46). III) Parámetros de análisis de la relación B/Bo vs dosis Figure 4. Inhibitory dose-response curves of a LH-specific RIA for the standard bLH (USDA-bLH-B5) and isoforms.

I) The reference standard and CM-3ab fraction. II) Standard and basic isoforms (A, pH, 10.75-9.75, B, pH, 9.58-8.41); Standard and neutral isoform (C, pH 7.98-6.89); Standard and acidic isoforms (D, pH 6.88-5.41 and E, pH 5.36-3.46). III) Table summarizing the analysis parameters of the B/Bo vs dose

I

III S u m m ary

S ta n d a rd

of th e d o s e -d e p e n d e n t e ffe c t o n th e B / B O p e rc e n ta g e Is ofo rm s

U S D AbLH -B 5

B/B0 (%)

100 80 60

B as ic A

N e utra l B

A cid ic

C

IC 5 0

0 .4 2

0 .4 5

2 .5 4 *,b 0 .6 3 *,a

h

-1.4

-1 .0

-1.6

0 .9 8

0 .9 8

0 .9 5

D

E

1 .9 5 *

1 .4 3 *, a 1 .5 1 *,a

-1 .3

-1 .5

-1. 2

-1.0

0 .9 4

0 .9 6

0 .9 8

0 .9 6

40 20

U SD A -bL H -B 5 C M -3a b

0 0.01

0.1

R 1

10

P ro tei n (ng /tu be )

120

II

60 40 U S D A -bL H -B 5 A B

0 0.01

* In d ic a te s p < 0 .0 5 v s U S DA -bL H- B 5 a,b D if fe ren t lette r su p e rc r ip ts b etw e e n is ofo m s in th e s am e p H ra n ge in d ic a te s ig ni fi c ant diffe ren c e s ( p < 0 .05 )

N e u tra l

80

20

2

B a sic

100

B/B0 (%)

CM -3a

b

120

0.1

120

100

100

80

80

60

60

40

40

20

P ro tei n (n g /tu be )

10

20

C

0

1

A cid ic

120

0 .0 1

D

0 0 .1

1

P ro te in (n g/ tu be )

41

10

E 0 .0 1

0 .1

1

P ro te i n (n g /t ub e)

10

Alvaro Ortega, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):29-51

activity (IC50) is similar between USDA-bLH-B5 and CM-3ab (Figure 4(II)). However, the IC50 for the reference was lower than those of the isoforms, indicating that the standard is immunologically more active versus the antibody used in the assay. The dose-response curve slopes of the standard and the isoforms did not differ, indicating the proteins' identity (Figure 4(III)).

de proteína, por lo que se excluyeron del estudio y no se analizaron electroforéticamente. El patrón electroforético de aquellas fracciones con mayor contenido de proteína y LH se ejemplifica en la Figura 1(II).

De acuerdo al patrón electroforético, en ausencia de β-mercaptoetanol (condiciones no reductoras, NR), la fracción CM-3ab y el patrón de referencia presentaron un patrón similar que consistió de dos proteínas con un peso molecular de 36.5 y 23.4 kDa, respectivamente (Figura 1(III)). A pesar de la presencia de estas dos proteínas en el extracto glicoprotéico y en las fracciones CM1ab, CM-2ab, el patrón electroforético en estas últimas fracciones resultó más heterogéneo, y se observó una proteína predominante de mayor peso molecular (56.0 kDa). En presencia de β-mercaptoetanol (condiciones reductoras, R), el patrón electroforético de la fracción CM-3ab se caracterizó por la presencia de tres proteínas con un peso molecular de 23.4, 20.8 y 17.0 kDa, respectivamente; las fracciones CM-1ab y CM-2ab presentaron un patrón similar, sin embargo en ellas se observó una proteína muy intensa de peso molecular de 72.0 kDa. Con base en este patrón electroforético se decidió que ambas fracciones de proteína se excluyeran del estudio, por lo tanto el grupo de isoformas de carga de LH se aislaron únicamente de la fracción CM-3ab (pH 9.5).

Production of cAMP by HEK-239 cells in response to the immunoreactive LH standard and the LH isoforms was dose-dependent (Figure 5(I)).

Calculation of EC50 as a proxy for biological activity on the normalized dose-response curve showed the standard and the isoforms to differ (Figure 5(II)). The neutral isoform had the lowest EC50 value, meaning it was the most biologically active, whereas the acidic isoform had the highest EC50 value and therefore the lowest bioactivity (Figure 5(III)). For the standard, the Hill slope (h) value differed from those of the basic and acidic isoforms, but not from that of the neutral isoform (Figure 5(III)).

DISCUSSION Polymorphism in mammal LH is reflected in its physicochemical, immunological and biological properties. In vivo(13,14,15) and in vitro(16,17) bioassays have been done of biological activity in different LH isolates from ruminant hypophyses.

The results indicate that basic isoforms are the most bioactive proteins in vitro, whereas acidic isoforms are more active in vivo . Recent developments include bioassays using cell lines that express gonadotropin receptors, which allow study of biologically functional proteins(20,30).

El patrón de elución de la fracción CM-3ab en el intercambiador iónico, PBE118, se distribuyó en cinco picos de proteína a través del gradiente de pH; cada pico correspondió a una isoforma (Figura 2(I)). Del total de LH inmunoreactiva recuperada, el 72.8 % se obtuvo a pH básico (≥7.5, fracciones A y B), mientras que a pH neutro (7.4 a 6.6, fracción C) se recuperó el 6.3 % y a pH ácido (≤6.5, fracciones D y E) el 20.1 %. La cantidad de proteína y de LH inmunoreactiva para cada isoforma se resume en la Figura 2(II).

The present study is the first time an in vitro bioassay using HEK-293 cells transfected with rat LH receptor cDNA has been applied to evaluate biological activity in different charge isoforms of bovine hypophysis(20). Quantitative cAMP production per immunoreactive LH unit differed between isoforms, with the neutral isoform having more activity than the basic and acidic isoforms.

En el patrón electroforético en condiciones no reductoras (Figura 3(I), panel superior) cada isoforma de la LH mostró un patrón homogéneo con dos bandas de proteínas predominantes de 42

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

peso molecular de 36.5 y 23.4 kDa respectivamente, patrón similar al USDA-bLH-B5 y a la fracción CM-3ab. A pesar que el extracto glicoprotéico (EGP) y la isoforma E (pH; 5.36-3.46) mostraron un patrón similar en ellos, se observó una proteína de 55.0 kDa. Asimismo, en condiciones reductoras, cada isoforma mostró el mismo patrón electroforético que el extracto glicoprotéico, la fracción CM-3ab y el USDAbLH-B5. Interesantemente, se presentó una banda de proteína de 17 kDa particularmente en la fracción CM-3ab y en las isoformas B, C y D (Figura 3(I), panel inferior).

Under the studied bioassay conditions, the response patterns for the different bovine LH isolates were dose-dependent between 6.5 and 100 ng immunoreactive LH. Production of cAMP was unaltered at higher doses and even exhibited a decline. This response pattern could indicate desensitizing of the limited number of receptors in the HEK-293 cells through a relatively slow down-regulation process of the

Figura 5. Producción de AMPc por las células HEK-293 con el estímulo de bLH y sus isoformas. I) Dosis-respuesta para la isoforma básica (B), neutra (C) y ácida (E). II) Respuesta normalizada en la producción de AMPc por dosis de LH inmunoreactiva. III) Análisis de las curvas dosis-respuesta. Los resultados presentan el promedio de tres ensayos independientes por isoforma.

Del análisis por inmunotransferencia en condiciones no reductoras (Figura 3(II), panel superior) se desprende que las distintas isoformas conservan un patrón de proteína inmunoreactiva a LH similar al USDA-bLH-B5, siendo la proteína de 36.5 kDa una de las bandas de proteína importantes, que en condiciones reductoras prácticamente desaparece y se incrementan las proteínas de menor peso molecular (23.4 y 20.8 kDa).

Figure 5. AMPc production in HEK-293 cells after stimulation with different isoforms of LH. I) Dose-response pattern isoforms to basic (B), neutral (C) and acidic (E).

II) Normalized response pattern in cAMP production by LH immunoreactive dose. III) Analysis parameters of the dose-response curve. Each point represents the mean of three independent assays for each isoform

II

I cAMP (pmol/ml)

1250 1000 750

USDA-bLH-b5 Basic

cAMP production (%)

Las curvas de desplazamiento que se obtuvieron con el radioinmunoensayo para las diferentes isoformas de la LH y la fracción CM-3ab en comparación con el estándar de referencia se presentan en la Figura 4. La actividad inmunológica referida como el parámetro IC50 mostró un valor similar entre el USDA-bLH-B5 y la fracción CM-3ab (Figura 4(II)). En contraste, el valor de IC50 del estándar fue significativamente menor al de las isoformas, que indica que el estándar es inmunológicamente más activo ante el anticuerpo utilizado. Las pendientes de las curvas dosis-respuesta del estándar y las de las isoformas no fueron estadísticamente diferentes, lo que denota la identidad de las proteínas (Figura 4(III)).

Neutral Acidic

500 250 0

USDA-bLH-b5 Basic Neutral Acidic

100

50

0

0.01 0.1

1

10 100 1000

0.01 0.1

irLH (ng/ml)

III

10 100 1000

Summary ofthe LHdose-dependenteffectoncAMPproduction by HEK-293cells Hormone

La cantidad de AMPc producido por las células HEK-293 después de 24 h de tratamiento con las diferentes dosis de LH inmunoreactiva del estándar o con cada isoforma de LH se ejemplifica en la Figura 5(I). La producción de AMPc fue dependiente de la dosis y el cálculo del parámetro EC50 como indicativo de actividad

1

irLH (ng/ml)

USDA-bLH-b5 Basic Neutral Acidic

EC50

h

R2

9.67 14.01*a 6.63*b 18.96*c

1.24 0.90*a 1.81 2.46*b

0.964 0.980 0.931 0.982

* Indicates p <0.05 vs USDA-bLH-B5 a,b,c Different letter supercripts in the same columns indicate significant differentces (p <0.05)

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number of receptors in each cell(22). However, it could also be a product of the relatively rapid process of a decrease in the LH receptor's capacity to interact with and activate its related G proteins(31). Time-dependent cAMP production was not analyzed in the present study, but 24 h of stimulus allowed an evaluation of differential changes in cAMP production between isoforms.

biológica sobre la curva dosis-respuesta normalizada (Figura 5(II)) resultó diferente entre las isoformas y el estándar, con la isoforma neutra más activa biológicamente con un EC50 menor; en contraste, la isoforma ácida mostró la menor actividad biológica con un EC50 mayor (Figura 5(III)). El valor de la pendiente (h) del estándar con respecto a la isoforma básica y la ácida denotó diferencias significativas, en tanto que al comparar la pendiente del estándar con la isoforma neutra no se observó diferencia (Figura 5(III)).

The greater response of the basic isoform compared to that of the acidic isoform coincided with the biological effect reported after placing different doses of diabetic and obese rat hypophysis eluted at basic and acidic pHs in HEK-293 cells(20,21). It is a response pattern also seen in vitro in primary Leydig cell cultures after stimulus with human(32), rat(33) and ovine(17) LH hypophysis isoforms, as well as with basic isoforms present in circulation(16).

DISCUSIÓN El polimorfismo de la LH de mamíferos se refleja en sus propiedades fisicoquímicas, inmunológicas y biológicas. La actividad biológica de distintos aislados de la LH hipofisaria de rumiantes se ha determinado con bioensayos in vivo(13,14,15) e in vitro(16,17) con resultados que indican que las isoformas básicas son las proteínas más bioactivas in vitro, en tanto que la mayor respuesta in vivo lo generan las isoformas ácidas. En años recientes el desarrollo de bioensayos usando líneas celulares que expresan receptores para gonadotropinas ha permitido evaluar proteínas biológicamente funcionales(20,30).

Why biological activity differed between the tested isoforms is not completely clear. Partial or total removal of some isoform oligosaccharide components by chemical or enzymatic means modifies their activity(34,35), suggesting that one explanation may be the type of oligosaccharides in each isoform(4).

For example, removal of the sulphate group in bovine LH containing only oligosaccharides with sulphated N-acetylgalactosamine terminals (thus exposing the N-acetylgalactosamine) produces greater LH depuration from the blood(36). This occurs due to easy recognition of the desulphated LH by the specific receptor in the liver (Gal/GalNAcspecific receptor), which proportionally reduces this protein's in vivo biological activity(36,37).

El presente estudio evaluó la actividad biológica de distintas isoformas de carga de LH de la hipófisis bovina utilizando por primera vez el bioensayo in vitro de las células HEK-293 transfectadas con el cDNA para el receptor de la LH de rata(20) con resultados que mostraron diferencias significativas en la producción cuantitativa de AMPc por unidad de LH inmunoreactiva, siendo la isoforma de tipo neutro la que resultó la más activa al comparar su efecto con su análoga básica y ácida.

Total removal of the oligosaccharide from LH has shown that deglycosilated hormones can no longer stimulate adenylate cyclase activity, although no apparent change occurs in receptor affinity(38). Deglycosilated hormones exhibit antagonistic functions in second messenger formation and production(39), and therefore on production of steroidal hormones(40). Variation in receptor affinity for each isoform may also have had an effect. Studies of bonding in HEK239 cells transfected with rat LH receptor cDNA have shown that there is a constant association

En este estudio, y bajo las condiciones del bioensayo, el patrón de respuesta con los diferentes aislados de LH bovina fue dependiente de la dosis en el rango de 6.5 a 100 ng de LH inmunoreactiva, mientras que la producción de AMPc a dosis mayores no se modificó, más aún se presentó una caída en la producción. Este 44

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

patrón de respuesta en el bioensayo podría ser un indicativo de la desensibilización del número limitado de receptores presentes en las células HEK-293(22) a través de un proceso relativamente lento de regulación a la baja del número de receptores presentes en cada célula, o bien mediante el proceso relativamente rápido de la disminución en la capacidad del receptor de la LH de interactuar y activar a sus proteínas G afines(31). Aunque en este estudio no se analizó la producción de AMPc dependiente del tiempo, 24 h de estímulo permitió evaluar el cambio diferencial en la producción de AMPc entre isoformas.

at different orders of magnitude between different mammal LHs(22). Bovine LH exhibits the lowest affinity for the LH receptor, even though it has repeated leucine-rich regions (LRR; specifically leucine 3, 7, 8 and 9) in the receptor's extracellular domain that are specifically for recognizing this hormone(22).

It can therefore be inferred that cAMP production after treatment with the different isoforms could also depend on differentiated affinity in the receptor. This makes it highly probable that the LH's glycosylation pattern is what regulates the differential pattern in biological response measured as cAMP production by HEK-239 cells after stimulation with different LH isoforms. Proteins with distinct receptor affinities can be produced as a result, the interaction of which can be reflected in changes in biological response quantified as cAMP production by cells.

El patrón de respuesta mayor entre la isoforma básica con respecto a su análoga ácida de la LH bovina coincidió con el efecto biológico que se generó después de colocar diferentes dosis de extractos de hipófisis de rata diabética y obesa eluídos a pH básico o ácidos en las células HEK-293 (20,21) . Estos resultados también coincidieron con el patrón de respuesta generado in vitro en cultivos primarios de células de Leydig después del estímulo con isoformas hipofisarias de la LH humana(32); de rata(33); ovina(17), así como con las isoformas básicas presentes en la circulación(16).

The present data on isoform biological activity will complement the limited data currently available. To date, the neutral isoform in LH from ruminants and other species has not been immunologically or biologically characterized, possibly because it is difficult to purify and characterize due to its low content in the adenohypophysis(13,40,41) and the blood(6). The bioactivity recorded in the neutral isoform in the present study is a valuable addition to biological evaluation of the bovine LH isoform spectrum. For the basic isoform, the observed biological activity complements previous reports on ovine(17), bovine(13) and rat LH(33) in which the basic isoform exhibits greater in vitro bioactivity than the acidic isoform. Under the in vitro bioassay conditions used here, the isoforms exhibited differential bioactivity, but use of a homologous bioassay is desirable because it would provide superior analysis of LH isoforms in ruminants.

La causa de la discrepancia en la actividad biológica entre las isoformas ensayadas no es del todo conocida, sin embargo, el o los mecanismos de esta diferencia biológica, se atribuye en parte al tipo de oligosacáridos que integran a cada isoforma(4), dado que la remoción total o parcial de algunos de los componentes de los oligosacáridos por medios químicos o enzimáticos modifican su actividad biológica(34,35). La LH bovina que contiene únicamente oligosacáridos con terminaciones de N-acetilgalactosamina sulfatada(36), y la remoción del grupo sulfato que expone a la N-acetilgalactosamina resulta en una mayor depuración de la hormona de la sangre, debido a su alto reconocimiento de la LH desulfatada por el receptor específico presente en el hígado (Gal/GalNAc-receptor específico), reduciendo proporcionalmente la actividad biológica in vivo de la proteína(36,37).

Quantitative immunoreactive LH concentration in the LH isoforms isolated from the bovine adenohypophysis was measured using USDAbLH-B5 as a reference. The RIA response 45

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Por otro lado, la remoción total del oligosacárido de la LH, ha confirmado que las hormonas deglicosiladas pierden su acción estimuladora sobre la actividad de la adenilato ciclasa, sin que se aprecie un cambio en su afinidad por el receptor(38). Con ello, se ha observado que las hormonas deglicosiladas presentan funciones antagónicas en la inducción de la formación y producción de segundos mensajeros(39) y por ende sobre la producción de hormonas esteroides (40) . Finalmente, no se puede descartar la posible participación del receptor por diferencias en la afinidad por cada isoforma.

Estudios de unión en células HEK-293 transfectadas con el cDNA para el receptor de la LH de rata(22), demostraron que existe una constante de asociación con diferente orden de magnitud entre distintas LH de mamíferos, siendo la LH bovina la que presentó la menor afinidad por el receptor de LH, a pesar de contar con las regiones repetidas ricas en leucina (LRR) 3, 7, 8 y 9 en el dominio extracelular del receptor, específicas para el reconocimiento de esta hormona(22).

pattern depended in the amount of assayed protein, exhibiting similar values between the slopes, indicating the proteins are analogous.

Values for IC50 were also similar among elution proteins in the same basic pH range (USDAbLH-B5; CM-3ab; and basic isoform B, pH 9.588.41). However, they increased significantly in the neutral and acidic isoforms, suggesting a progressive decrease in LH immunological activity.

Distinct immunological activity between isoforms can be attributed to use of a polyclonal antibody in the RIA which is specifically focused against native oLH (NIDDK-oLH-26), a protein isolated using a procedure similar to that described here.

A number of studies have shown that pure forms of LH contain different components. In a study using Nal125-labelled USDA-bLH-B5 analyzed using chromatofocusing (9) , this reference LH exhibited a basic type distribution pattern in which 80 % of the LH eluted in a basic pH range, while the rest of the labelled protein eluted in neutral and acidic pH gradients.

This may indicate that the antibody generated for oLH, used in the immunodiagnostic, is mostly focused on basic isoforms with little emphasis on neutral and acidic proteins in LH. A clear advantage therefore exists for isoforms recovered at extremely basic pH (e.g. isoform A). Neutral and acid isoforms require more protein for this antibody to identify them.

Con base en este estudio se puede inferir que la producción de AMPc después del tratamiento con los diferentes tipos de isoformas depende también de la afinidad diferenciada del receptor.

Por lo tanto, basados en esta serie de resultados se puede establecer que el patrón diferencial en la respuesta biológica sobre la producción de AMPc por las células HEK-293 a través del estímulo con las distintas isoformas de la LH está regulado por el patrón de glicosilación de la LH, que puede dar origen a proteínas con distinta afinidad por su receptor, y cuya interacción se refleje en un cambio en la respuesta biológica medida como la producción de AMPc por las células.

The increasing amount of protein in each isoform could interfere in their biological response due to possible contamination from proteins structurally related to LH which remain present throughout purification and in the final products. However, this is unlikely since the anti-oLH antibody had been shown to be highly specific in quantifying LH in serum and ruminant hypophysis extracts without generating cross reactions with structurally related proteins such as FSH and TSH(9,11).

Adicionalmente, hasta donde se sabe, la caracterización inmunológica y biológica para la isoforma de tipo neutro en rumiantes y otras especies no se ha reportado, debido posiblemente a su bajo contenido en la adenohipófisis(13,40,41) y en el suero(6), lo que genera dificultad para su caracterización y purificación. Con el resultado

All the isoforms were recognized by the same antibody, although specificity was greatest in the basic isoform group. This was reflected in 46

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

de la bioactividad de la isoforma neutra se complementa la valoración biológica del espectro de isoformas de LH bovina. Por otra parte, el resultado de la actividad biológica reportado en este estudio para la isoforma básica complementa a lo reportado en la LH ovina(17), bovina(13) y de rata(33) en donde la isoforma básica muestra una mayor actividad biológica in vitro con relación a la isoforma ácida. A pesar de que bajo las condiciones de desarrollo del bioensayo in vitro se observó un efecto diferencial en la actividad biológica entre isoformas, es deseable contar con un bioensayo homólogo de este tipo, que permita un mejor análisis para las isoformas de la LH de rumiantes.

the amount of protein required to attain the IC50 dose in the system, which was significantly lower in the other analyzed isoforms. Calculation of each isoform's immunological activity using the LH-specific heterologous assay may be adequate, but more accurate immunological evaluation will require developing a specific homologue system for each isoform.

Glycoprotein extract (GPE) was generated in the extraction process with the hypophysis anterior lobes. Purification of the GPE in the CM-Sepharose exchanger produced CM-3ab, a protein fraction containing the greatest amount of immunoreactive LH. Its physicochemical, immunological and biological characteristics were similar to those of the reference, and its chromatofocusing distribution pattern was similar to that of adenohypophysis tissue in bovines(42,43,44), caprines(14) and humans(45).

Use of the chromatofocusing technique resulted in higher LH yield (µg LH/mg protein) than reported in other species and using other techniques(15,17,44).

La concentración cuantitativa de LH inmunoreactiva se determinó en las distintas isoformas de LH aisladas de la adenohipófisis bovina, tomando como referencia al USDA-bLHB5; el patrón de respuesta en el RIA fue dependiente de la cantidad de proteína ensayada. El valor entre pendientes fue similar, lo que denotó identidad entre proteínas. De forma interesante, el cálculo de la dosis al 50 % de inhibición (IC50) como un referente de la actividad inmunológica fue similar entre proteínas de elución en el rango básico (USDAbLH-B5, fracción CM-3ab y la isoforma básica B, pH 9.58-8.41), en tanto que en la isoforma neutra y las isoformas ácidas, el valor de IC50 se incrementó significativamente, lo que se interpretó como proteínas con menor actividad inmunológica de LH.

Of the isoforms isolated from CM-3ab using chromatofocusing, LH immunoreactive proteins in the basic pH range dominated. Similar distribution patterns have been reported in ovine species(42), and in the elution patterns of ovine(46) and bovine hypophysis extracts(11,47).

It can therefore be assumed that the procedure developed here to isolate isoform groups from bovine LH does not interfere in the isoform distribution patterns of bovine LH.

Esta discrepancia en la actividad inmunológica entre isoformas se puede atribuir a que para el desarrollo del RIA se utilizó un anticuerpo policlonal dirigido específicamente contra la oLH nativa (NIDDK-oLH-26), proteína que se obtuvo con un procedimiento similar al descrito en este estudio. Diversos estudios han demostrado que formas puras de la LH contienen diferentes componentes. El patrón de referencia USDAbLH-B5 radiomarcado con Na125I y analizado en el cromatoenfoque mostró un patrón de distribución de tipo básico, en donde el 80 %

In NR conditions, the isoform group isolated from the hypophysis anterior lobe had the same molecular weight as the reference standard, which corresponds to the 36.5 kDa heterodimer.

Under R conditions, the dominant presence of proteins with 20.8 and 23.0 kDa molecular weights corresponds to alpha- and beta-LH, respectively, and with values reported for native LH and its subunits(13,14,15). Pattern analysis of the acidic isoform under NR conditions showed a series of high molecular weight proteins that disappeared after treatment with the reducing 47

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de la LH eluyó en este rango de pH, y el resto de la proteína radiomarcada eluyó en el rango de pH neutro y ácido del gradiente(9), resultado que puede ser un indicativo que el anticuerpo generado para oLH y que se utilizó para el inmunodiagnóstico está dirigido en su mayoría para isoformas básicas, y escasamente para proteínas neutras y ácidas de la LH, lo que le genera una ventaja de inmunodetección sobre aquellas isoformas recuperadas a pH extremadamente básico, como resulta con la isoforma A, por lo que neutras y ácidas requirieron mayor cantidad de proteína requerida para ser identificadas por el anticuerpo.

agent β-mercaptoethanol. This suggests the presence of molecular aggregates of LH. Electrophoretic analysis under R conditions of CM-3ab, and the C and D isoforms showed them all to be characterized by the presence of a 17 kDa protein, which was absent in isoform A and barely present in isoform B. Because this protein was not identified in the immunotransference analysis, it is probably a contaminating protein concentrated between pH 7.98 and 5.41. It may correspond to one of the isoforms of bovine FSH(11), which elute in this pH range. Another possibility is that it is an immature form of one of the subunits. A protein with a molecular weight similar to that described here was identified in electrophoretic analysis under R conditions of deglycosilated ovine LH(48). Some of the subunits may also have experienced proteolytic breakage, as described for fractionated proteins of human LH with a similar molecular weight(49). Presence of this protein type in some isoform isolates does not correspond to LH, although it could interfere in the interaction between LH and it receptor, thus modifying the strength of its biological activity.

El incremento en la cantidad de proteína para cada isoforma podría interferir en la respuesta biológica debido a la presencia de posibles contaminantes de proteínas estructuralmente relacionadas con la LH, y que como se sabe durante la purificación, están presentes hasta los productos finales; sin embargo, esta posibilidad se puede descartar dado que se demostró previamente la alta especificidad del anticuerpo anti-oLH para cuantificar LH del suero y de extractos de hipófisis de rumiantes sin generar ninguna reacción cruzada con proteínas como la FSH y TSH estructuralmente emparentadas(9,11).

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS Isoforms of bovine luteinizing hormone have differing biological activities. Differences in the strength of in vitro biological activity between LH isoforms suggest that some may experience changes during the isoform synthesis process.

This may represent a fine-tuned regulation mechanism of gonadal function in the adenohypophysis. Isoform biological activity was quantified using an in vitro heterologous bioassay, which does not truly reflect each isoform's physiological response in the organism as a whole. However, this technique did prove the presence of differential biological response among the tested isoforms. Confirming each isoform's affinity and selective specificity will require use of HEK-239 cells transfected with bovine LH (homologue) receptor cDNA.

Todas las isoformas se reconocieron por el mismo anticuerpo, sin embargo, la mayor especificidad se presentó con el grupo de isoformas básicas que se reflejó en la cantidad de proteína requerida para alcanzar la dosis IC50 en el sistema, y que fue significativamente inferior con el resto de las isoformas analizadas.

Aunque podemos inferir que el cálculo de la actividad inmunológica para cada isoforma con el ensayo heterólogo específico para LH es adecuado, se debe considerar que para una mejor valoración inmunológica se requiere del desarrollo de un sistema homólogo y específico para cada isoforma.

Durante el proceso de extracción de los lóbulos anteriores de la hipófisis se generó el extracto glicoprotéico, a partir del cual y después de su

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48

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

purificación en el intercambiador CM-sepharosa dio origen a la fracción CM-3ab, fracción de proteína que agrupó a la mayor cantidad de LH inmunoreactiva. Esta fracción de proteína mostró características fisicoquímicas, inmunológicas y biológicas similares al patrón de referencia, además su patrón de distribución en el cromatoenfoque se asemejó al patrón observado del tejido adenohipofisario de esta especie (42,43,44) , la especie caprina (14) y humana(45). Adicionalmente, con el empleo del cromatoenfoque, el rendimiento de LH (µg de LH/mg de proteína) resultó superior a lo reportado en otras especies que aislaron a esta proteína con diferentes procedimientos(15,17,44).

después del tratamiento con el agente reductor, β-mercaptoetanol, desaparecieron, lo que hace pensar en agregados moleculares de la LH. El análisis electroforético en condiciones reductoras de la fracción CM-3ab, isoforma C e isoforma D se caracterizó por la presencia de una proteína de 17 kDa, ausente en la isoforma A y ligeramente presente en la isoforma B. Esta proteína durante el análisis por inmunotransferencia no se identificó, lo que sugiere que se trata de una proteína contaminante que se concentró entre el pH 7.98 a 5.41 y que puede corresponder a alguna de las isoformas de la FSH bovina(11), que eluyen en este rango de pH. La otra posibilidad es que se trate de una forma inmadura de alguna de la subunidades.

Estudios electroforéticos en condiciones reductoras con LH ovina deglicosilada(48) han identificado una proteína con un peso molecular similar al descrito en este estudio. No se descarta la posibilidad de un rompimiento proteolítico de alguna de las subunidades, como se ha descrito para proteínas fraccionadas de LH humana que presentan un peso molecular similar (49) . Por lo tanto, aunque existe la presencia de este tipo de proteína en aislados de determinadas isoformas, su presencia no corresponde a LH, aunque probablemente pueda interferir en la interacción de la hormona con su receptor, modificando la estimación de su potencia biológica.

Las isoformas aisladas a partir de la fracción CM-3ab mediante el cromatoenfoque representaron diferentes proporciones, donde predominaron las proteínas inmunoreactivas a LH que eluyeron en el rango de pH básico.

Este patrón de distribución resultó similar aunque no idéntico al observado en la especie ovina(42), así como al patrón de elución que se observó durante el análisis de extractos hipofisarios ovinos(46) y bovinos (11,47), en donde las isoformas aisladas de tipo básico predominaron. Por lo tanto, se puede asumir que el procedimiento desarrollado para la obtención del grupo de isoformas de la LH bovina no interfiere en el patrón particular de distribución de isoformas que muestra la LH en esta especie.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

El grupo de isoformas aisladas del lóbulo anterior de la hipófisis tuvo el mismo peso molecular que el estándar de referencia en condiciones no reductoras, correspondiente al heterodímero de 36.5 kDa. La presencia de proteínas predominantes con peso molecular de 20.8 kDa y 23.0 kDa en el gel electroforético en condiciones reductoras, corresponde a las subunidades alfa y beta de la LH, respectivamente, lo que coincide con los valores reportados para la forma nativa de esta hormona y sus subunidades(13,14,15).

El análisis del patrón electroforético en condiciones no reductoras de la isoforma ácida, presentó una serie de proteínas con alto peso molecular, que

Los resultados de este estudio indican que las isoformas de la hormona luteinizante bovina tienen diferente potencia biológica. El hallazgo de un cambio en la potencia biológica in vitro entre isoformas de la LH sugiere la posibilidad que durante el proceso de síntesis de las isoformas en la especie bovina, ocurran cambios para una mayor o menor proporción de algunas de ellas, y que éste pueda representar un mecanismo fino de regulación a nivel de la adenohipófisis sobre la función gonadal. Aunque en este estudio la actividad biológica de las isoformas de la LH bovina se determinó con un 49

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bioensayo heterólogo in vitro, que no es el verdadero reflejo de la respuesta fisiológica de cada isoforma en un organismo entero, se pudo constatar que la respuesta biológica a las distintas isoformas es diferencial; sin embargo, es necesario contar con células HEK-293 transfectadas con el cDNA para el receptor de la LH bovina (homólogo) y confirmar la afinidad y especificidad selectiva de cada isoforma.

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ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

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Alvaro Ortega, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):29-51

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ESTUDIO MORFOMÉTRICO DE LOS EPIDÍDIMOS DURANTE EL DESARROLLO DE CORDEROS Rev POSTNATAL Mex Cienc Pecu 2016;7(1):53-68

Estudio morfométrico de los epidídimos durante el desarrollo postnatal de corderos Barbados Blackbelly Morphometric study of the epididymes during the postnatal development in Barbados Blackbelly ram lambs Anahy Danae Vargas-Velázqueza, Héctor Jiménez-Severianob

RESUMEN Para caracterizar el desarrollo de los epidídimos, se castraron corderos Blackbelly al nacimiento y cada tres semanas hasta la 21 (n=4 a 6 por grupo). Se registró el peso de los epidídimos y de las tres regiones anatómicas y se tomaron muestras para morfometría. Se calculó el porcentaje de tejido tubular, el diámetro tubular, el grosor y área de la capa muscular, la altura y área del epitelio, y el diámetro y área de la luz tubular. El mayor crecimiento del epidídimo se observó entre las semanas 9 y 18; la cola comenzó a desarrollarse antes que las otras regiones; el peso de ésta fue mayor entre el nacimiento y la semana 12, pero de la semana 15 a la 21 no difirió de la cabeza. En general, el diámetro tubular, el grosor y área de la capa muscular y el diámetro y área de la luz fueron mayores en la cola. La altura del epitelio fue mayor en la cola hasta la semana 9, pero la situación se invirtió a partir de la semana 12. De acuerdo a lo que se conoce de esta raza, la cola comenzó a desarrollarse antes de aparecer la luz de los túbulos seminíferos y del aumento de las concentraciones de testosterona, mientras que el desarrollo de la cabeza y el cuerpo coincidió con el aumento de la capacidad esteroidogénica y la secreción del fluido tubular. Tales hallazgos sugieren diferentes requerimientos de estimulación endocrina y lumicrina para el desarrollo normal de las diferentes regiones del epidídimo.

PALABRAS CLAVE: Epidídimo; Desarrollo sexual; Ovinos tropicales; Corderos Blackbelly.

ABSTRACT To characterize the development of the epididymides, Barbados Blackbelly ram lambs were castrated at birth and every three weeks until wk 21 (n=4 to 6 per group). The individual epididymal weight was recorded; the three anatomical regions (caput, corpus and cauda) of the left epididymis were weighed, and samples taken for morphometric studies. The percentage of tubular tissue was calculated, as well as the tubular diameter, the width and area of the muscular layer, the height and area of the epithelium, and the diameter and area of the tubular lumen. Data were analyzed to determine differences among the anatomical regions and ages. The greatest growth of the whole organ was observed between 9 and 18 wk; the cauda started developing earlier than the other anatomical regions; the cauda was heaviest between birth and wk 12, but from 15 to 21 wk the caput and cauda weights were similar to each other. Overall, tubular diameter, width and area of the muscular layer, and luminal diameter and area were greatest in the cauda epididymidis. The epithelium height was greatest in the cauda until wk 9, but the situation reversed from wk 12 onwards. According to previous information for this breed, cauda started developing before the increase of circulating testosterone concentrations, and before the seminiferous tubule lumen appeared, whilst the caput and corpus development coincided temporally with the increase of testicular steroidogenic capacity and tubular fluid secretion. Such findings suggest differential requirements of endocrine and lumicrine stimulation for the normal development of the various anatomical regions of the epididymis.

KEYWORDS: Epididymis; Sexual development; Tropical sheep; Blackbelly lambs.

Recibido el 19 de marzo de 2015. Aceptado el 23 de abril de 2015. a

Licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma Metropolitana, Xochimilco, DF, México.

b

Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal, INIFAP, Ajuchitlán, Querétaro, México. jimenez.hector@inifap.gob.mx correspondencia al segundo autor.

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INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

Barbados Blackbelly es una raza de ovinos de pelo ( Ovis aries) desarrollada en latitudes tropicales y bien adaptada a esas condiciones climáticas. Las hembras son precoces y prolíficas, con una larga estación reproductiva(1,2).

Los estudios sobre el desarrollo sexual y capacidad reproductiva de los machos Blackbelly son escasos, pese a que esta información es importante para la evaluación, selección y uso de sementales jóvenes. El desarrollo testicular es importante, ya que la capacidad reproductiva y la fertilidad de los sementales dependen principalmente de una adecuada función testicular; sin embargo, la producción espermática debe completarse con la maduración celular, la cual se realiza durante el transporte de los espermatozoides por los epidídimos(3); cualquier falla del desarrollo de los epidídimos o en su función puede conducir a problemas de fertilidad, como consecuencia de trastornos en la maduración, incluso con una producción espermática adecuada (4) . La maduración espermática es adquirida progresiva y simultáneamente, conforme los espermatozoides recorren la cabeza y el cuerpo del epidídimo(5), mientras que la cola sirve principalmente como lugar de almacenamiento de los espermatozoides funcionalmente maduros, ya que proporciona el ambiente óptimo para mantener su viabilidad durante varios días(4,5,6).

Barbados Blackbelly is a hair breed of sheep (Ovis aries), developed in tropical latitudes and is well adapted to tropical conditions. Ewes are precocious and highly prolific, having a long breeding season (1,2) . Studies of sexual development and reproductive capacity of Blackbelly males are scarce, albeit the importance of this information for the evaluation, selection and usage of young sires. Testis development is important, as the reproductive capacity and fertility of sires depends primarily on a satisfactory testicular function; however, adequate sperm production must be completed with cell maturation, which is achieved during sperm transit through the epididymis(3); any failure during the epididymal development or function might lead to fertility problems, as consequence of maturation disorders, even with adequate sperm production (4) . Sperm maturation is acquired progressively and simultaneously as the sperm travel through the caput and corpus epididymidis(5), whilst the cauda serves primarily as a storage site for functionally mature sperm, since it provides the optimal environment to maintain sperm viability for several days(4,5,6).

The functional importance of the anatomical regionalization of the epididymis has been further recognized(7), as the several anatomical regions have different patterns of gene and protein expression, in agreement with the different functions relative to sperm maturation and storage. It is expected that the functional differences among the anatomical regions in the adult epididymis are also present in the morphometric characteristics during the development of the epididymal anatomical regions, which could suggest differential requirements and stimulatory mechanisms during their development. Previous information suggests that such differences exist (8,9) ; however, in the first study the only variable studied was the epididymal epithelium, whilst in the last study, the authors used lambs at an age when important developmental changes

La importancia funcional de la regionalización anatómica del epidídimo ha sido reconocida(7), ya que las diversas regiones anatómicas tienen diferentes patrones de expresión génica y proteica, acordes con las diferentes funciones en la maduración y almacenamiento de los espermatozoides(7). Es de esperarse que estas diferencias funcionales en los adultos, también estén presentes en las características morfométricas de las regiones anatómicas en etapas inmaduras, lo que podría sugerir diferentes requerimientos y mecanismos estimulatorios durante su desarrollo. Información previa sugiere que existen tales diferencias(8,9); sin embargo, en el primer estudio(8) la única variable evaluada 54

ESTUDIO MORFOMÉTRICO DE LOS EPIDÍDIMOS DURANTE EL DESARROLLO POSTNATAL DE CORDEROS

fue el epitelio del epidídimo, mientras que en el segundo(9), los corderos utilizados eran de una edad tal, que muchos de los cambios importantes en el desarrollo gonadal seguramente ya habían ocurrido. Una descripción anatómica detallada sería útil para responder preguntas importantes, no resueltas en los estudios anteriores; por lo tanto, el presente es un estudio exploratorio, donde se utilizaron técnicas de morfometría cuantitativa para caracterizar el desarrollo de las regiones anatómicas del epidídimo, entre el nacimiento y las 21 semanas de edad, en corderos Barbados Blackbelly.

must have already occurred. A detailed anatomical description would be useful to answer important questions do not solved in the previous studies; therefore, the present is an exploratory study, where quantitative morphometric techniques were used to characterize the development of the several anatomical regions of the epididymides, between birth and 21 wk of age, in Barbados Blackbelly ram lambs.

MATERIAL AND METHODS Animals and experimental design All the experimental procedures were performed according to the “International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals” (available at: http://www.cioms.ch/images/ stories/CIOMS/IGP2012.pdf). The study was conducted in the state of Queretaro, Mexico (20º 43’ N, 100º 15’ W). Forty-three summerborn (July to September) Barbados Blackbelly ram lambs were used. Lambs were always housed in outdoor pens; before weaning, lambs were creep fed with a diet containing 14 % crude protein (78 % sorghum, 20 % canola meal and 2 % minerals); after weaning at 75 d of age, lambs were offered alfalfa hay and a concentrate as described above, water was always available ad libitum. Lambs were allotted into eight experimental groups, each group were surgically castrated under local anesthesia either, at birth (before 3 d of age), or when they were 3, 6, 9, 12, 15, 18 or 21 wk of age (n= 4 to 6 per group), within each group the difference in age was never greater than 3 d. All castrations were performed during September to December.

MATERIAL Y METODOS Animales y diseño experimental Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con “International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals” (disponible en: http://www.cioms.ch/ images/stories/CIOMS/IGP2012.pdf). El estudio se realizó en el estado de Querétaro, México (20° 43’ N, 100° 15’ O). Se utilizaron 43 corderos de la raza Barbados Blackbelly nacidos en verano (julio a septiembre). Los corderos se alojaron en corrales al aire libre; antes del destete, a los corderos se les ofreció una dieta que contenía 14 % de proteína cruda (78 % de sorgo, 20 % de harina de canola y 2 % de minerales); después del destete a los 75 días de edad, se alimentaron con heno de alfalfa y el concentrado ya descrito, el agua siempre estuvo ad libitum. Los corderos se asignaron a ocho grupos experimentales; los corderos de cada grupo se castraron quirúrgicamente bajo anestesia local, al nacer (antes de 3 días de edad), o bien cuando tenían 3, 6, 9, 12, 15, 18 o 21 semanas de edad (n= 4 a 6 por grupo); dentro de cada grupo la diferencia de edad nunca fue mayor a 3 días. Todas las castraciones se realizaron durante septiembre a diciembre.

Tissue collection and processing Both epidi d y m i d e s w e re t r i m m e d o ff extraneous tissue and weighed separately. The left epididymis was divided in its three anatomical regions, caput, corpus and cauda(5). Each region was weighed and the percentage accounted for each region to the whole organ weight was calculated, these percentages were then used to estimate the

Recolección y procesamiento de los tejidos A ambos epidídimos se les retiró todo el tejido adyacente y se pesaron por separado. El epidídimo izquierdo se dividió en sus tres 55

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regiones anatómicas, cabeza, cuerpo y cola(5).

Cada región se pesó y se calculó el porcentaje que representaba cada una respecto al peso total del órgano; estos porcentajes se utilizaron para estimar el peso conjunto de ambos lados para cada región. Se obtuvieron muestras del epidídimo izquierdo, de las zonas 2 (cabeza), 5 (cuerpo) y 8/9 (cola), de acuerdo con Gatti et al (5) , y fueron fijadas y procesadas para histología(10). Se tomaron tres a cuatro cortes (5 µm) de cada muestra, se montaron en portaobjetos recubiertos con gelatina y se dejaron secar durante toda la noche a 37 °C; los cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina y se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se llevó a cabo el análisis.

paired weight of each region. Samples were obtained from the left epididymis, from the zones 2 (caput), 5 (corpus) and 8/9 (cauda)(5), and were fixed and processed for histology(10).

Three to four sections (5 µm) were made from each sample, mounted onto gelatin-coated glass slides and dried overnight at 37 °C. Sections were stained with hematoxylin-eosin and stored at room temperature until quantitative morphometric analysis was conducted.

Morphometric evaluation of epididymal sections One or two sections from each epididymal region and ram were randomly chosen and observed under a bright field microscope (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Mexico DF); digital images were obtained at 100x or 200x magnifications (depending on the age of the lamb and the variable to be recorded) with a digital camera (Color View II, Soft Imaging System, Lakewood CO) attached to the microscope. Image acquiring and processing were performed using image analysis software (AnalySIS Opti Basic, Soft Imaging System). The percentage of the epididymal parenchyma composed of tubular tissue in each region was determined in images taken at a magnification of 100x. Each section was divided in quadrants, a field from each quadrant was randomly chosen and a square (945.5 x 945.5 µm) was applied; then, all tube sections inside the square were delimited and the software calculated the total tubular area inside the square, which was used to calculate the corresponding percentages. Tubular variables of the epididymal tissue were obtained by tracing outlines of 10 rounded tube sections in every region for each ram lamb, including and not including the muscular layer, also by tracing the tubular lumen. The analysis software calculated several variables, such as tubular area, perimeter and diameter. Such data were used to calculate the tubular diameter, the thickness and area of the muscular layer, the height and area of the epithelium, and the diameter and area of the tubular lumen in every epididymal region in each lamb.

Evaluación morfométrica de los cortes de epidídimo De cada cordero se eligieron al azar uno o dos cortes de cada región del epidídimo para ser observados bajo un microscopio de campo claro (Axiostar Plus, Carl Zeiss, México DF); se obtuvieron imágenes digitales a 100x o 200x (dependiendo de la edad del cordero y la variable evaluada) con una cámara digital (Color View II, Soft Imaging System, Lakewood CO) acoplada al microscopio. Las imágenes fueron adquiridas y procesadas utilizando un software de análisis de imágenes (AnalySIS Opti Basic, Soft Imaging System). El porcentaje de parénquima epididimal compuesto por tejido tubular en cada región se determinó en las imágenes tomadas a 100x. Cada corte se dividió en cuadrantes, un campo de cada cuadrante se eligió al azar y se le colocó un cuadrado de dimensiones conocidas (945.5 x 945.5 µm); a continuación, todos los tubos dentro del cuadrado se delimitaron y el software calculó el área tubular total en el interior del cuadrado, la cual se utilizó para obtener el porcentaje de tejido tubular. Para obtener las variables del componente tubular del tejido epididimal, se trazó el contorno de 10 cortes tubulares redondos en cada región epididimal de cada cordero, incluyendo y sin incluir la capa muscular; además, se trazó el contorno de la 56

ESTUDIO MORFOMÉTRICO DE LOS EPIDÍDIMOS DURANTE EL DESARROLLO POSTNATAL DE CORDEROS

Statistical Analyses

luz tubular. El software de análisis calculó diferentes variables, tales como el diámetro, área y perímetro tubular. Además, estos datos se utilizaron para calcular el grosor y el área de la capa muscular, la altura y el área del epitelio, y el diámetro y el área de la luz tubular en todas las regiones del epidídimo en cada cordero.

The 10 values for each epididymal region within a lamb were averaged; in this way a single value for a particular epididymal region and lamb was obtained for the statistical analysis.

Data were analyzed as a completely randomized design with a factorial arrangement, using the GLM procedure of SAS (SAS Institute Inc., Cary NC, USA). The age of the animals, the anatomical region and the interaction age by region were included in the model; the PDIFF option of SAS was used to compare least square means among age groups and among regions. In order to meet the assumptions of the analysis of variance, percentage data, expressed as proportions (p), were transformed to arc-sine squared root of p; all the other variables were logn transformed.

After analysis, data were transformed back to actual values for tables and figures.

Análisis estadístico Los 10 valores de cada región del epidídimo de cada cordero se promediaron, de esta manera, para cada cordero se obtuvo un valor único para cada región del epidídimo para el análisis estadístico. Los datos se analizaron como un diseño completamente al azar con arreglo factorial, utilizando el procedimiento GLM de SAS (SAS Institute Inc., Cary NC, USA). La edad de los animales, la región anatómica y la interacción edad por región se incluyeron en el modelo; la opción PDIFF de SAS se utilizó para comparar las medias de mínimos cuadrados entre los grupos de edad y entre las regiones.

Para cumplir con los supuestos del análisis de varianza, los datos porcentuales, expresados como proporciones (p), se transformaron al arco-seno de la raíz cuadrada de p; todas las demás variables se transformaron a log n .

Después del análisis, los datos se retransformaron a los valores reales para los cuadros y figuras.

RESULTS Epididymal weight Differences between ages for paired epididymis weight were always significant (P<0.05), except for 0 vs 3, and 18 vs 21 wk. At birth, the weight of paired epididymides was 0.93 ± 0.07 g (Figure 1), during the first 9 wk increased 5.4 fold (5 ± 0.49 g); the greatest growth rate was observed between 9 and 18 wk (4.7 fold), until reaching 25.6 ± 2.5 g on wk 21. The interaction age x region was significant (P<0.001); paired weight of each epididymal region followed a similar trend, yet with some differences among regions. Corpus epididymidis was always lighter than cauda (P<0.01), and lighter than caput from wk 6 onwards (P<0.01), from 0.14 ± 0.01 g at birth to 4.6 ± 0.31 g at wk 21. At birth, the weight of caput (0.34 ± 0.03 g) and cauda (0.44 ± 0.03 g) were not different to each other, as well as by 3 wk. Between 6 and 12 wk, the cauda weight increased faster and was greater than caput (P<0.01). After wk 12, the caput weight started increasing, in such a way that by 15 to 21 wk no differences were detected between the two regions (caput 10.7 ± 1.03 g; cauda 10.3 ± 0.89 g at wk 21).

RESULTADOS Peso de los epidídimos La siguiente descripción considera el peso de ambos epidídimos. Las diferencias entre edades para el peso de los epidídimos siempre fueron significativas (P<0.05), excepto 0 vs 3, y 18 vs 21 semanas. Al nacimiento, el peso de los epidídimos fue de 0.93 ± 0.07 g (Figura 1), durante las primeras 9 semanas aumentó 5.4 veces (5 ± 0.49 g); La mayor tasa de crecimiento se observó entre las semanas 9 y 18 (4.7 veces), hasta llegar a 25.6 ± 2.5 g en la semana 21. La interacción región x edad fue significativa (P<0.001); el peso de cada región 57

Anahy Danae Vargas-Velázquez, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):53-68

Figura 1.

Desarrollo del peso total y de cada región anatómica de ambos epidídimos, del nacimiento a 21 semanas de edad de corderos Barbados Blackbelly

Figure 1.

Development of paired epididymal weight and paired weight of each anatomical region, from birth to 21 wk of age in Barbados Blackbelly ram lambs

Each time point represent the mean ± SE for 4 to 6 rams. *Corpus weight was smaller than caput from 6 wk onwards (P<0.01), and smaller than cauda at every age evaluated (P<0.01). **Cauda weight was larger than caput at 6, 9 and 12 wk of age (P<0.01). The arrow indicates the age when sperm first appeared in the tubular lumen of the three epididymal regions.

del epidídimo siguió una tendencia similar (Figura 1), pero con algunas diferencias entre regiones. El cuerpo del epidídimo siempre fue más ligero que la cola (P<0.01), y más ligero que la cabeza de la semana 6 en adelante (P<0.01), de 0.14 ± 0.01 g al nacer a 4.6 ± 0.31 g en la semana 21. Al nacimiento, el peso de la cabeza (0.34 ± 0.03 g) y de la cola (0.44 ± 0.03 g) no fueron diferentes entre sí, al igual que en la semana 3. Entre las semana 6 y 12, el peso de la cola aumentó más rápido y fue mayor que la cabeza (P<0.01). Después de la semana 12, el peso de la cabeza aumentó, de tal manera que en las semana 15 a 21 no se detectaron diferencias entre las dos regiones (cabeza 10.7 ± 1.03 g; cola 10.3 ± 0.89 g en la semana 21).

The differential development of the epididymal regions was also evident on the percentage that each region accounted to the total organ weight (interaction age x region, P<0.001; Figure 2). The proportion accounted by the caput decreased between birth (36.7 %) and wk 9 (28 %; P<0.001), then increased until wk 15 (P<0.05), with no further changes thereafter until wk 21 (41.7 %). The cauda followed an opposite trend, increasing from birth (47.8 %) to wk 6 (58.5 %; P<0.001), decreasing from wk 9 to 15 (P<0.001), with no further changes thereafter until wk 21 (40.3 %). Cauda was greater than the other regions from birth to wk 12 (P<0.001), and not different from caput at wk 15, 18 and 21; corpus accounted always the smallest percentage (P<0.001).

El diferente desarrollo de las regiones del epidídimo también fue evidente en el porcentaje que cada región aportó al peso total del órgano (interacción edad x región, P<0.001; Figura 2).

La proporción aportada por la cabeza disminuyó entre el nacimiento (36.7 %) y la semana 9

Characteristics of the epididymal tissue

Tubular tissue percentage and tubular diameter.

The interaction age by region was significant (P<0.05) for the percentage of tubular tissue; this variable had an increasing trend in the three epididymal regions until wk 15 (Table 1); 58

ESTUDIO MORFOMÉTRICO DE LOS EPIDÍDIMOS DURANTE EL DESARROLLO POSTNATAL DE CORDEROS

Figura 2.

Desarrollo del porcentaje aportado por cada región anatómica del epidídimo al peso total del órgano, del nacimiento a 21 semanas de edad de corderos Barbados Blackbelly

Figure 2.

Development of the percentage accounted by each epididymal region to the total epididymal weight, from birth to 21 wk of age in Barbados Blackbelly ram lambs

Each time point represents the mean ± SE for 4 to 6 rams. *Cauda was greater than caput from 0 to 12 wk of age (P<0.001); corpus always accounted for the smaller percentage to the total epididymal weight (P<0.001). The arrow indicates the age when sperm first appeared in the tubular lumen of the three epididymal regions.

(28 %, P<0.001), después aumentó hasta la semana 15 (P<0.05), sin más cambios a partir de entonces hasta la semana 21 (41.7 %). La cola siguió una tendencia opuesta, aumentó entre el nacimiento (47.8 %) y la semana 6 (58.5 %; P<0.001), con una disminución entre las semanas 9 y 15 (P<0.001), sin más cambios a partir de entonces hasta la semana 21 (40.3 %).

La cola fue mayor que las otras regiones desde el nacimiento hasta la semana 12 (P<0.001), y no fue diferente de la cabeza en las semanas 15, 18 y 21; el cuerpo siempre aportó el menor porcentaje (P<0.001).

then, it did not change (caput and corpus) or decreased (cauda) by wk 21. Overall, the percentage of tubular tissue was greatest in the cauda and lowest in the caput (P<0.05), except for wk 3, 18 and 21, when no differences among regions were detected; corpus was intermediate, but not always different from the other regions. The increasing rate (percentage of each age, related to wk 21) was different among regions (Figure 3a); by wk 6, corpus and cauda had reached, respectively, 93 and 88 % of the final value, whilst caput had reached only 68 %, such trend was maintained until wk 15. For tubular diameter, the interaction age by region was not significant (P=0.13; Table 1).

This variable increased (P<0.05) until wk 15 (caput and corpus) or 12 (cauda), with no changes thereafter. The greatest diameter was always observed in the cauda, and the smallest in the caput (P<005); corpus was not different from caput, except for wk 3 and 6, when all regions were different to each other. Regarding the increasing rate (Figure 3b), by wk 6, caput,

Características del tejido epididimal

Porcentaje de tejido tubular y diámetro tubular.

La interacción edad por región fue significativa (P<0.05) para el porcentaje de tejido tubular; esta variable tuvo una tendencia creciente en las tres regiones del epidídimo hasta la semana 15 (Cuadro 1); después, no cambió (cabeza y cuerpo) o disminuyó (cola) hacia la semana 21.

En general, el porcentaje de tejido tubular fue 59

Anahy Danae Vargas-Velázquez, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):53-68

mayor en la cola y menor en la cabeza (P<0.05), a excepción de las semanas 3, 18 y 21, cuando no se detectaron diferencias entre las regiones; el cuerpo fue intermedio, pero no siempre fue diferente de las otras regiones. La tasa de incremento (porcentaje de cada edad, con

corpus and cauda had reached 38, 47 and 55 % of their final values, respectively; similar differences were maintained until wk 12, at that age cauda had reached 92 %, whilst similar percentages (90 %) were not reached in caput and corpus until 18 wk of age.

Cuadro 1. Medias (± EE) del porcentaje de tejido tubular y del diámetro tubular promedio en las diferentes regiones anatómicas del epidídimo de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad Table 1. Mean (± SE) of the percentage of tubular tissue and the average tubular diameter in the several epididymal anatomical regions in Barbados Blackbelly ram lambs, from birth to 21 wk of age Age (wk) 0 3 6 9 12 15 18 21

Tubular tissue (%) Caput Corpus a38.6 ± 3.4y

a34.6 ± 3.4y

ab42.5 ± 3.49z abc52.3 ± 3.82y

b51.7 ± 3.4z c64.7 ± 3.82z

Tubular diameter (µm) Caput Corpus

Cauda a50.2 ± 3.4z a50 ± 3.4z

Cauda

a90 ± 15y

a101 ± 15y

a149 ± 15z

ab92 ± 15x b107 ± 16x

b120 ± 15y bc136 ± 16y

a162 ± 15z b227 ± 16z

bc52.7 ± 4.27y

c64.8 ± 4.27yz

b68.4 ± 3.82z b66.1 ± 4.27z

cd56.9 ± 3.49y e74.6 ± 3.49y

c64.4 ± 3.49y d77.8 ± 3.49y

b76.9 ± 3.49z c86.8 ± 3.49z

de66.8 ± 3.49z e76.6 ± 4.27z

bc60.2 ± 3.49z

b70.1 ± 3.49z

e248 ± 15y

e275 ± 15y

d421 ± 15z

cd69.7 ± 4.27z

b77.6 ± 4.27z

e283 ± 18y

e291 ± 18y

d405 ± 18z

c134 ± 18y

c157 ± 18y

c299 ± 18z

d192 ± 15y e248 ± 15y

d223 ± 15y de249 ± 15y

d380 ± 15z d396 ± 15z

a-e Means within a column without a common superscript are different (P<0.05). x,y,z Means within a row and variable without a common superscript are different (P<0.05).

Figura 3. Tasa de incremento relativo del porcentaje de tejido tubular (panel a), diámetro tubular (panel b), altura del epitelio (panel c) y área del epitelio (panel d) en corderos Barbados Blackbelly Figure 3. Relative increase of the epididymal tubular tissue percentage (panel a), tubular diameter (panel b), epithelium height (panel c) and epithelium area (panel d) in Barbados Blackbelly ram lambs

Data are the percentage of the values at each age as compared with the value at 21 wk of age for each variable (panels a, b, d). * For epithelium height (panel c), the percentage value at each age is relative to the maximum value reached in each region (21 wk for caput and corpus, and 9 wk for cauda).

60

ESTUDIO MORFOMÉTRICO DE LOS EPIDÍDIMOS DURANTE EL DESARROLLO POSTNATAL DE CORDEROS

Epididymal muscular layer. The interaction age by region was significant (P<0.01) for both variables of the muscular layer. The thickness of the muscular layer in caput did not change between birth and wk 6 (Table 2), increased 35 % by wk 9 (P<0.05) and then, did not change or had a descendent trend until wk 21.

In the cauda, the muscular thickness did not change between birth and wk 6, increased 119 % by wk 9 (P<0.05), with no change by wk 15 and a descendent trend thereafter (P<0.05). In the corpus epididymidis there were no changes between 3 and 21 wk. When comparing the muscular layer thickness in wk 0 vs wk 21, no differences were observed in the caput and corpus, but in the cauda, it was 48 % greater on wk 21 (P<0.05). The muscular layer area (Table 2) increased until wk 12 (caput and corpus) and 9 (cauda), with no significant changes thereafter. The maximum area observed in each region, as compared to value at birth, was 3.8-, 3.8-, and 5.5-fold, for caput (wk 18), corpus (wk 18) and cauda (wk 15), respectively.

Comparisons among regions were similar for both variables, the greatest values were observed in the cauda (P<0.05), followed by the corpus and caput; however, differences between the last two were significant (P<0.05) only at 3 and 6 wk.

relación a la semana 21) fue diferente entre las regiones (Figura 3a); en la semana 6, el cuerpo y la cola habían alcanzado, respectivamente, el 93 y el 88 % del valor final, mientras que la cabeza alcanzó sólo el 68 %, tal tendencia se mantuvo hasta la semana 15. Para el diámetro tubular, la interacción edad por región no fue significativa (P=0.13; Cuadro 1). Esta variable aumentó (P<0.05) hasta la semana 15 (cabeza y cuerpo) o 12 (cola), sin cambios a partir de entonces. El mayor diámetro siempre se observó en la cola, y el menor en la cabeza (P<0.05); el cuerpo no fue diferente de la cabeza, a excepción de las semanas 3 y 6, cuando todas las regiones fueron diferentes entre sí. En cuanto a la tasa de incremento (Figura 3b), en la semana 6, la cabeza, el cuerpo y la cola habían alcanzado, respectivamente, 38, 47 y 55 % de sus valores finales; diferencias similares se mantuvieron hasta la semana 12; a esa edad la cola había alcanzado el 92 %, mientras que porcentajes similares (90 %) no se alcanzaron en la cabeza y el cuerpo hasta las 18 semanas de edad.

Capa muscular del epidídimo. La interacción edad por región fue significativa (P<0.01) para ambas variables de la capa muscular. El grosor

Cuadro 2. Medias (± EE) del grosor y área de la capa muscular del tubo en las diferentes regiones anatómicas del epidídimo de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad Table 2. Mean (± SE) of the thickness and area of the tubular muscular layer in the several epididymal anatomical regions in Barbados Blackbelly ram lambs, from birth to 21 wk of age Age (wk) 0 3 6 9 12 15 18 21

Thickness of muscular layer (µm) Caput Corpus Cauda a17.3 ± 2.4y a17.3 ± 2.2x ab17.3 ± 2.6x c23.4 ± 2.9y bc21.4 ± 2.4y c22.1 ± 2.4y abc21.2 ± 2.4y a16.9 ± 2.9y

a19.2 ± 2.4y ab22.9 ± 2.4y ab22.8 ± 2.7y ab21.6 ± 3.0y b23.5 ± 2.4y ab23.1 ± 2.4y b24.5 ± 2.4y ab20.9 ± 3.0y

Caput

Area of muscular layer (µm2) Corpus Cauda

a27.4 ± 2.4z a29.1 ± 2.4z

a4,847 ± 3,392y a4,798 ± 3,392x

ab34.7 ± 2.6z d59.2 ± 2.9z

a4,798 ± 3,716x b9,261 ± 4,155y

cd51.8 ± 2.4z cd50.7 ± 2.4z

c13,276 ± 3,392y c16,998 ±3,392y

b37.9 ± 2.4z bc41 ± 2.9z

c17,510 ± 3,392y c16,085 ± 4,155y

a5,870 ± 3,392y b8,028 ± 3,392y

a12,096 ± 3,392z a14,210 ± 3,392z

b8,003 ± 3,716y

b21,775 ± 3,716z c50,836 ± 4,155z

b10,676 ± 4,155y c16,698 ± 3,392y c18,365 ± 3,392y c21,037 ± 3,392y c20,638 ± 4,155y

c66,328 ± 3,392z c64,453 ± 3,392z c51,495 ± 3,392z c56,418 ± 4,155z

a-e Means within a column without a common superscript are different (P<0.05).x,y,z Means within a row and variable without

a common superscript are different (P<0.05).

61

Anahy Danae Vargas-Velázquez, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):53-68

Epididymal epithelium. The interaction age by region was significant (P <0.001) for both variables of the epithelial layer. In the caput and corpus, the epithelium height did not change between birth and wk 6, then increased until wk 12 (caput) or 15 (corpus), with no further changes (Table 3); in the cauda, an increasing trend was observed from birth to wk 9, then, decreased on wk 12, with no more changes until wk 21. Comparison between regions had two different phases, from birth to wk 9, the epithelium was highest in the cauda and lowest in the caput (P<0.05), but from 12 to 21 wk the situation reversed, as the lowest values were observed in the cauda (P<0.05) and the greatest in the caput and corpus with no differences between the last two. Regarding the increasing rate (Figure 3c), at birth, cauda had over 45 % of their maximum value, which was reached at wk 9; caput and corpus, at birth had reached, respectively, 20 and 25 % of the value at wk 21, and did not reach over 90 % until wk 15. The epithelial area (Table 3) did not change between birth and wk 6 (caput and corpus) or 3 (cauda), then, it increased until wk 15 in the three regions (P<0.05), with no further changes (Table 3). Between birth and wk 12, the greatest values were observed in the cauda, with the smallest values in the caput ( P <0.05); from wk 15 onwards no differences among regions were detected. The increasing rate was always greater for cauda (Figure 3d), by wk 6 it had reached 31 %, as compared with 5 and 8 % for caput and corpus, respectively; such differences were maintained until wk 18.

de la capa muscular en la cabeza no cambió entre el nacimiento y la semana 6 (Cuadro 2), aumentó 35 % en la semana 9 (P<0.05), posteriormente no cambió o tuvo una tendencia descendente hasta la semana 21. En la cola, el grosor de la capa muscular no cambió entre el nacimiento y la semana 6, aumentó 119 % en la semana 9 (P<0.05), sin cambios hacia la semana 15 y una tendencia descendente a partir de entonces ( P <0.05). En el cuerpo del epidídimo no hubo cambios entre la semana 3 y 21. Al comparar el grosor de la capa muscular en la semana 0 vs 21, no se observaron diferencias en la cabeza y cuerpo, pero en la cola fue 48 % mayor en la semana 21 (P<0.05).

El área de la capa muscular (Cuadro 2) aumentó hasta la semana 12 (cabeza y cuerpo) y 9 (cola), sin cambios significativos a partir de entonces; El área máxima observada en cada región, en comparación con el valor al nacimiento, fue 3.8, 3.8 y 5.5 veces, para cabeza (semana 18), cuerpo (semana 18) y cola (semana 15), respectivamente. Las comparaciones entre regiones fueron similares en ambas variables, los mayores valores se observaron en la cola (P<0.05), seguido por el cuerpo y la cabeza; sin embargo, las diferencias entre los dos últimos fueron significativas (P<0.05) solamente en las semanas 3 y 6.

Epitelio del epidídimo. La interacción edad por región fue significativa (P<0.001) para ambas variables de la capa epitelial. En la cabeza y cuerpo, la altura del epitelio no cambió entre el nacimiento y la semana 6, luego aumentó hasta la semana 12 (cabeza) o 15 (cuerpo), sin más cambios (Cuadro 3); en la cola, se observó una tendencia creciente desde el nacimiento hasta la semana 9, seguido de una disminución en la semana 12, sin más cambios hasta la semana 21. La comparación entre regiones tuvo dos fases diferentes, del nacimiento a la semana 9, el epitelio fue más alto en la cola y más bajo en la cabeza (P<0.05), pero de la semana 12 a la 21 la situación se invirtió, ya que los valores más bajos se observaron en la cola (P<0.05) y los mayores en la cabeza y cuerpo, sin diferencias entre estos dos. En cuanto a la tasa

Epididymal tubular lumen. The interaction age by region was not significant (P≥0.25) for both variables of the tubular lumen, but the effect of region was (P<0.001). The lumen diameter and area did not increase or increased very little in all three regions until wk 6; then, increased steadily until wk 15 (caput and corpus) or 12 (cauda), with no further changes thereafter (Table 4). The greatest relative augment was observed between 9 and 12 wk (0.5- to 1.2-fold in the lumen diameter, and 62

ESTUDIO MORFOMÉTRICO DE LOS EPIDÍDIMOS DURANTE EL DESARROLLO POSTNATAL DE CORDEROS

Cuadro 3. Medias (± EE) de la altura y el área del epitelio tubular en las diferentes regiones anatómicas del epidídimo de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad Table 3. Mean (± SE) of the tubular epithelium height and area in the several epididymal anatomical regions in Barbados Blackbelly ram lambs, from birth to 21 wk of age Age (wk) 0 3 6 9 12 15 18 21

Epithelium height (µm) Caput Corpus a9.8 ± 2.4x a10.3 ± 2.4x a10.4 ± 2.6x b16.2 ± 2.9y c37 ± 2.3yz c44.8 ± 2.3z c42.6 ± 2.3z c47.5 ± 2.8z

a14.2 ± 2.4y a14.9 ± 2.4y a15.2 ± 2.6y b32.1 ± 2.9z bc42.4 ± 2.3z c50.4 ± 2.3z c47.1 ± 2.3z c54.6 ± 2.8z

Epithelium area (µm2) Caput Corpus

Cauda a19.9 ± 2.4z ab24.6 ± 2.4z cd32.1 ± 2.6z

Cauda

a1,616 ± 2,218x a1,719 ± 2,218x

a2,330 ± 2,218y a3,180 ± 2,218y

a5,182 ± 2,218z a7,337 ± 2,218z

a1,720 ± 2,430x b3,800 ± 2,717x

a3,221 ± 2,430y b9,987 ± 2,717y

b11,986 ± 2,430z c21,483 ± 2,717z

d43.1 ± 2.9z c31 ± 2.3y

c16,910 ± 2,218y

c31.2 ± 2.3y bc28 ± 2.3y

d26,545 ± 2,218z d26,288 ± 2,218z

d32,374 ± 2,218z d31,905 ± 2,218z

c31.8 ± 2.8y

d36,119 ± 2,717z

d40,755 ± 2,717z

c22,105 ± 2,218yz cd29,720 ± 2,218z d33,531 ± 2,218z d33,766 ± 2,218z d37,240 ± 2,717z

a-d Means within a column without a common superscript are different (P<0.05). x,y,z Means within a row and variable without a common superscript are different (P<0.05).

1.3- to 5.2-fold in the lumen area), with the greatest increase in the cauda; both variables were greatest in the cauda at all ages (P<0.05), with no differences between caput and corpus.

The maximum lumen diameter observed in each region (caput, corpus and cauda, respectively) corresponded to 3.7-, 3.5- and 5.2-fold increase, as compared to wk 0. Similarly, the increase in

de incremento (Figura 3c), al nacer la cola tenía más del 45 % de su valor máximo, que se alcanzó en la semana 9; la cabeza y el cuerpo al nacer habían alcanzado, respectivamente, el 20 y 25 % del valor de la semana 21, y no rebasaron el 90 % hasta la semana 15. El área epitelial (Cuadro 3) no cambió entre el nacimiento y la semana 6 (cabeza y cuerpo) o

Cuadro 4. Medias (± EE) del diámetro y área de la luz tubular en las diferentes regiones anatómicas del epidídimo de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad Table 4. Mean (± SE) of the tubular lumen diameter and area in the several epididymal anatomical regions in Barbados Blackbelly ram lambs, from birth to 21 wk of age Age (wk) 0 3 6 9 12 15 18 21

Caput

Lumen diameter (µm) Corpus

Cauda

Caput

Lumen area (µm2) Corpus

Cauda

a36 ± 14.5y ab37 ± 14.5y

a35 ± 14.5y ab44 ± 14.5yz

a58 ± 14.5z a54 ± 14.5z

a1,524 ± 6,372y ab1,455 ± 6,372y

a1,385 ± 6,372y b2,346 ± 6,372yz

a4,152 ± 6,372z a3,309 ± 6,372z

ab36 ± 15.9y bc50 ± 17.7y

b53 ± 15.9yz b50 ± 17.7y

ab73 ± 15.9z b94 ± 17.7z

ab1,755 ± 6,980y b2,544 ± 7,804y

b2,994 ± 6,980yz b2,411 ± 7,804y

ab5,629 ± 6,980z b8,929 ± 7,804z

c216 ± 14.5z c232 ± 14.5z

c6,432 ± 6,372y

c8,489 ± 6,372y

c57,784 ± 6,372z c64,620 ± 6,372z

c75 ± 14.5y

c91 ± 14.5y

d114 ± 14.5y d121 ± 14.5y

cd102 ± 14.5y cd132 ± 14.5y

d154 ± 17.7y

d140 ± 17.7y

d13,803 ±6,372y cd12,507 ± 6,372y d16,138 ± 6,372y cd19,469 ± 6,372y d26,890 ± 7,804y d20,791 ± 7,804y

c289 ± 14.5z c260 ± 17.7z

a-d Means within a column without a common superscript are different (P<0.05). y,z Means within a row and variable without a common superscript are different (P<0.05).

63

c89,408 ± 6,372z c82,177 ± 7,804z

Anahy Danae Vargas-Velázquez, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):53-68

3 (cola), seguido de un incremento hasta la semana 15 en las tres regiones (P<0.05), sin más cambios posteriores (Cuadro 3). Entre el nacimiento y la semana 12, los mayores valores se observaron en la cola, con los menores valores en la cabeza (P<0.05); desde la semana 15 en adelante no se detectaron diferencias entre las regiones. La tasa de incremento fue siempre mayor en la cola (Figura 3d), hacia la semana 6 ya había alcanzado el 31 %, en comparación con el 5 y 8 % de la cabeza y el cuerpo, respectivamente; estas diferencias se mantuvieron hasta la semana 18.

the lumen area represented 21.8-, 21.2- and 24.9-fold, as compared to wk 0, for caput, corpus and cauda, respectively. Sperm first appeared in the tubular lumen of the three epididymal regions by wk 18 (arrows in Figures 1 and 2), which indicate that by that age the lambs had already reached or were very close to reach puberty.

DISCUSSION Epididymal growth followed a parallel trend to testis development, as reported previously for Blackbelly ram lambs(10); the greatest relative epididymal growth was observed between 9 and 18 wk, which agrees temporally with the greatest rate of testicular growth in this breed(10,11).

During that stage of development, the absolute increase of the interstitial tissue in the testis is associated with increased number of Leydig cells and with the development of their steroidogenic capacity(12). This, in turn, leads to increased plasma concentrations of testosterone(10,13) and, therefore, to greater stimulation to the epididymides, as the development and function of these organs depend on adequate androgen contribution(14,15).

Luz tubular del epidídimo. La interacción edad por región no fue significativa (P≥0.25) para ambas variables de la luz tubular, pero sí el efecto de la región (P<0.001). El diámetro y el área de la luz no aumentaron o aumentaron muy poco en las tres regiones hasta la semana 6; a partir de entonces, aumentaron constantemente hasta la semana 15 (cabeza y cuerpo) o 12 (cola), sin más cambios (Cuadro 4). El mayor aumento relativo se observó entre las semanas 9 y 12 (0.5 a 1.2 veces en el diámetro de la luz, y 1.3 a 5.2 veces en el área de la luz), con el mayor aumento en la cola; ambas variables fueron mayores en la cola en todas las edades (P<0.05), sin diferencias entre cabeza y cuerpo. El máximo diámetro de la luz observado en cada región (cabeza, cuerpo y cola, respectivamente) correspondió a un aumento de 3.7, 3.5 y 5.2 veces, en comparación con la semana 0. Del mismo modo, el aumento en el área de la luz representó 21.8, 21.2 y 24.9 veces, en comparación con la semana 0, para la cabeza, cuerpo y cola, respectivamente. Los espermatozoides aparecieron por primera vez en la luz tubular de las tres regiones del epidídimo en la semana 18 (flechas en las Figuras 1 y 2), lo cual indica que a esa edad los corderos ya habían alcanzado o estaban muy cerca de alcanzar la pubertad.

The functional component of the epididymis is the tubular tissue, as all the changes related to sperm maturation and storage during their transit through the epididymis take place in the luminal compartment, under a highly specialized microenvironment consequence of the epithelial activity(4,5). To accomplish this task, the epithelium must be structured in a way such that prevent and regulate the entry of substances into the lumen, it has the ability of synthesize, secrete and absorb components, and it is arranged so that the sperm come into contact with the appropriate environment at the appropriate time(16). It is, therefore, reasonable to consider the variables related to tubular tissue and epithelial layer as the most appropriate to evaluate the epididymal development at the microscopic level; such variables have been used to evaluate epididymal function in several experimental models(15,17,18).

DISCUSIÓN El crecimiento de los epidídimos siguió una tendencia paralela al desarrollo de los testículos, 64

ESTUDIO MORFOMÉTRICO DE LOS EPIDÍDIMOS DURANTE EL DESARROLLO POSTNATAL DE CORDEROS

de acuerdo a lo publicado para corderos Blackbelly(10); el mayor crecimiento relativo de los epidídimos se observó entre las 9 y 18 semanas de edad, lo que coincide con la mayor tasa de crecimiento testicular en esta raza(10,11).

Durante esa fase de desarrollo, el aumento absoluto del tejido intersticial en los testículos se asocia con aumento en el número de células de Leydig y con el desarrollo de su capacidad esteroidogénica(12); esto, a su vez, conduce a un aumento en las concentraciones plasmáticas de testosterona(10,13) y por lo tanto a una mayor estimulación de lo epidídimos, ya que el desarrollo y la función de estos órganos depende del aporte adecuado de andrógenos(14,15).

At the macroscopic level (weight and relative contribution to the whole organ weight), the development of the several anatomical regions of the epididymides followed a different trend to each other; the cauda epididymidis began to develop at a very early age (wk 6), whereas the greatest development of the caput and corpus started by wk 12. The findings in the present study, at both, the macroscopic and microscopic levels, suggest that the postnatal development of the epididymides goes from the cauda towards the caput, which agrees with data reported for other species, such as cattle(19), goats(17) and rats(16). In sheep there is some discrepancy in this matter; whereas some authors reported a trend similar to that observed in the present study(8), others(9) found a maturation process advancing from caput to cauda. It is highly probable that the age of the experimental animals used in the different studies in lambs had accounted for the variation of the results observed among studies. In the study of Bielli(9), ram lambs were older (90 to 180 d-old, that is, 12.9 to 25.7 wk), as compared with lambs in the study of Nilnophakoon (8) (1 to 18 wk) and ours (birth to 21 wk). This fact determines important differences in the stage of physiological maturity of the lambs at the beginning of those studies, as important anatomical and physiological changes occur in the testes and epididymides before 12 wk of age(10,13).

El componente funcional del epidídimo es el tejido tubular, ya que todos los cambios relacionados con la maduración y almacenamiento de los espermatozoides durante su tránsito por el epidídimo se llevan a cabo en el compartimiento luminal, dentro de un microambiente altamente especializado, consecuencia de la actividad epitelial(4,5). Para lograr esta tarea, el epitelio debe estar estructurado de tal manera que pueda prevenir y regular la entrada de sustancias a la luz, además de tener la capacidad de sintetizar, secretar y absorber componentes, permitiendo que los espermatozoides entren en contacto con el entorno adecuado y en el momento exacto(16). Por lo tanto, es razonable considerar las variables relacionadas con el tejido tubular y la capa epitelial como las más convenientes para evaluar el desarrollo epididimal a nivel microscópico; tales variables se han utilizado para evaluar la función del epidídimo en varios modelos experimentales(15,17,18).

Epididymal function does not depend only on the endocrine stimulation received from testosterone in blood; even more important might be the lumicrine system(7,15), given by testosterone and other factors(15,16). Testosterone, bound to the androgen binding protein (ABP), reaches the epididymides via the efferent ducts, where it is converted into dihydrotestosterone(20).

In addition, several growth factors contained in the tubular fluid have important effects on epididymal function(15,16,21); these factors are produced by the Sertoli cells in the seminiferous tubules(22), and carried towards the epididymides via the excurrent duct system. Then, fluid composition undergoes modifications as travels

A nivel macroscópico (peso y contribución relativa al peso total del órgano), el desarrollo de las diversas regiones anatómicas de los epidídimos siguieron una tendencia diferente entre ellos; la cola del epidídimo comenzó a desarrollarse a una edad muy temprana (semana 6), mientras que el mayor desarrollo de la cabeza y el cuerpo inició en la semana 12. Los hallazgos en el presente estudio, tanto en el 65

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through the epididymal duct (5,16) . Such lumicrine regulation is feasible only after the seminiferous tubule lumen appears, as result of increased fluid secretion by Sertoli cells, when they initiate the maturation process to acquire their functional capacity as adult cells(22). In Blackbelly ram lambs the lumen of the seminiferous tubules appears after 9 wk of age, and by wk 12 lumen is present in 80 % of the tubules (10) . This finding also coincides temporarily with the greatest increase in epididymal weight, and with the greatest increase of the epithelium height in the caput and corpus epididymidis observed in the present study, which is in agreement with previous reports in sheep(8) and goats(23).

nivel macroscópico como en el microscópico, sugieren que el desarrollo posnatal de los epidídimos va en dirección de la cola hacia la cabeza, lo cual coincide con lo publicado para otras especies, tales como bovinos(19), cabras(17) y ratas(16). En los ovinos existe cierta discrepancia en este asunto; mientras que algunos autores observaron una tendencia similar a la encontrada en el presente estudio(8), otros(9) reportaron que el proceso de maduración avanzó en dirección de la cabeza a la cola. Es muy probable que la edad de los animales experimentales utilizados en los diferentes estudios explique la variación de los resultados observados. En el estudio de Bielli(9), los corderos eran mayores (90 a 180 días de edad, es decir, 12.9 a 25.7 semanas), en comparación con los corderos del estudio de Nilnophakoon(8) (1 a 18 semanas) y el presente (nacimiento a 21 semanas). Este hecho determina diferencias importantes en el estado de madurez fisiológica de los corderos al inicio de los estudios, ya que entre el nacimiento y 12 semanas de edad se producen cambios anatómicos y fisiológicos muy importantes en los testículos y epidídimos(10,13).

Cauda epididymidis began to develop before the accelerated growth of the testes(10). At that time, there is still no contribution of tubular fluid via the testicular excurrent duct system, because the lumen of the seminiferous tubules has not formed yet(10). Such findings suggest that the initial development of the cauda epididymidis could not depend on the presence of testosterone or other luminal factors coming from the testicular tubular system. Additional evidences supporting this possibility have been presented in studies with mature goats, whose efferent ducts had been ligated(23); in these goats, it was evident the lack of morphologic and functional dependence of the cauda epididymidis towards the secretions coming from the testis, via the extra testicular excurrent duct system(23).

When cauda epididymidis began to develop, plasma concentration of testosterone must have been still very small(10,13); therefore, initial caudal development might not depend on high testosterone concentrations, or depend on other predominant steroids different from testosterone, such as androstenedione, whose circulating concentrations are larger at that age(24,25,26). Another possibility is that the threshold of the caudal response to testosterone and other circulating androgens might be lower at that age.

La función del epidídimo no depende únicamente de la estimulación endocrina recibida por la testosterona sanguínea; aún más importante podría ser el llamado sistema lumicrino(7,15), dado por la testosterona y otros factores(15,16).

La testosterona, unida a la proteína ligadora de andrógenos (ABP), llega a los epidídimos vía los conductos eferentes, donde se convierte en dihidrotestosterona(20). Adicionalmente, varios factores de crecimiento contenidos en el fluido tubular tienen efectos importantes sobre la función del epidídimo(15,16,21); estos factores se producen en las células de Sertoli, dentro de los túbulos seminíferos(22) y son transportados a los epidídimos a través del sistema de conductos. Posteriormente, la composición del fluido sufre modificaciones conforme viaja por el epidídimo(5,16). Tal regulación lumicrina es posible sólo después de que aparece la luz de los túbulos seminíferos, como resultado del aumento de la secreción de líquido por las células de Sertoli, cuando inician el proceso de 66

ESTUDIO MORFOMÉTRICO DE LOS EPIDÍDIMOS DURANTE EL DESARROLLO POSTNATAL DE CORDEROS

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS

maduración para adquirir la capacidad funcional como células adultas(22). En corderos Blackbelly la luz de los túbulos seminíferos aparece después de las 9 semanas de edad, y hacia la semana 12 ya está presente en el 80 % de los túbulos evaluados(10). Este hallazgo coincide con la etapa de mayor aumento en el peso de los epidídimos, y con el mayor aumento de la altura del epitelio en la cabeza y el cuerpo, observado en el presente estudio, lo cual concuerda con hallazgos anteriores en ovinos(8) y caprinos(23).

In conclusion, data of the present study indicate that the pattern of development of the epididymis in sheep is regionalized, going from cauda to caput, that is, the cauda started developing earlier than the other anatomical regions. The development of cauda epididymidis should have started before the increase of testosterone concentration in blood plasma, and before the seminiferous tubule lumen appeared; in contrast, the caput and corpus development should have coincided temporally with the increase of the testicular steroidogenic capacity and tubular fluid secretion. Such findings suggest that the various anatomical regions of the epididymis have differential requirements of endocrine and lumicrine stimulation for their normal development.

La cola del epidídimo comenzó a desarrollarse antes del acelerado crecimiento de los testículos(10). En ese momento todavía no existe una contribución del fluido tubular a través del sistema de conductos, debido a que la luz de los túbulos seminíferos no se ha formado todavía(10). Tales hallazgos sugieren que el desarrollo inicial de la cola del epidídimo podría no depender de la presencia de testosterona u otros factores procedentes del sistema tubular testicular. Evidencias adicionales que apoyan esta posibilidad se han presentado en estudios con machos cabríos adultos, cuyos conductos eferentes fueron ligados(23); en estos animales fue evidente la falta de dependencia morfológica y funcional de la cola del epidídimo hacia las secreciones procedentes de los testículos, a través del sistema de conductos extra testiculares(23). Cuando la cola del epidídimo comenzó a desarrollarse, la concentración plasmática de testosterona debió haber sido muy baja(10,13); por lo tanto, el desarrollo inicial de la cola puede no depender de concentraciones altas de testosterona, o bien, depender de otros esteroides predominantes diferentes a la testosterona, como la androstenediona, cuyas concentraciones circulantes son mayores a esa edad(24,25,26). También existe la posibilidad de que el umbral de respuesta de la cola del epidídimo a la testosterona y a otros andrógenos circulantes sea menor a esa edad.

ACKNOWLEDGEMENTS To the “Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología”, México, for financing the project (39290-B); Víctor Robledo and Adolfo Paulín, from the “Universidad Autónoma de Querétaro” (UAQ), for providing with, and caring for the lambs; Jesús Herrera for helping in tissue collection; Miguel Silva and Mary Guerrero (UAQ) for tissue processing. AD Vargas-Velázquez is a former student, under the supervision of the last author (HJS).

End of english version

es regionalizado, en dirección de la cola a la cabeza, es decir, la cola comenzó a desarrollarse antes que las otras regiones anatómicas. Es probable que el desarrollo de la cola del epidídimo debió haber comenzado antes del aumento de las concentraciones de testosterona en el plasma sanguíneo, y antes de la aparición de la luz de los túbulos seminíferos; en contraste, el desarrollo de la cabeza y el cuerpo

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES En conclusión, los datos del presente estudio indican que el desarrollo del epidídimo en ovinos 67

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debió coincidir en tiempo, con el aumento de la capacidad esteroidogénica de los testículos y con la secreción de los fluidos tubulares. Estos hallazgos sugieren que las diversas regiones anatómicas del epidídimo tienen diferentes requisitos de estimulación endocrina y lumicrina para su desarrollo normal.

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Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México, por el financiamiento recibido (proyecto 39290-B); a Víctor Robledo y Adolfo Paulín, de la Universidad Autónoma de Querétaro (UAQ), por proporcionar y cuidar a los corderos; a Jesús Herrera por su ayuda en la obtención de los tejidos; a Miguel Silva y María Guerrero (UAQ) por el procesamiento de los tejidos.

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TIPOLOGÍA DE LAS EXPLOTACIONES GANADERAS DE BOVINOSRev DOBLE Mex PROPÓSITO Cienc Pecu 2016;7(1):69-83

Tipología de las explotaciones ganaderas de bovinos doble propósito en Sinaloa, México Typology of dual-purpose cattle production farms in Sinaloa, Mexico Venancio Cuevas Reyesa, Alfredo Loaiza Mezab, José Antonio Espinosa Garcíac, Alejandra Vélez Izquierdoc, María Denisse Montoya Floresc

RESUMEN El objetivo del presente estudio consistió en realizar una tipología de las explotaciones ganaderas de bovinos de doble propósito en el estado de Sinaloa, usando variables sociales, económicas y tecnológicas. Se analizó información de 1,165 productores del sistema de producción de doble propósito que participaron en el programa Soporte de SAGARPA 2010-2011. A través del uso de componentes principales, análisis cluster y análisis de varianza fueron identificados y caracterizados cuatros tipos de explotaciones ganaderas; pequeñas explotaciones ganaderas (67 %), explotaciones ganaderas medianas (24 %), explotaciones ganaderas grandes (7 %), y explotaciones ganaderas grandes con potencial empresarial (2 %). La tipología obtenida puede ser útil para generar políticas públicas diferenciadas que incrementen el uso de innovaciones tecnológicas que incidan en una mayor eficiencia y productividad del sistema bovinos de doble propósito en Sinaloa.

PALABRAS CLAVE: Políticas diferenciadas, Variables, Componentes principales, Análisis cluster, Innovaciones.

ABSTRACT The aim of this study was to conduct a typology of dual purpose cattle farms in the state of Sinaloa, using social, economic and technological variables. Information of 1,165 system producing dual purpose of Sinaloa who participated in the support program SAGARPA 2010 to 2011 were analyzed. Through the use of principal component analysis, cluster analysis and variance analysis were identified and characterized four types of farms; small farms (67 %), medium farms (24 %), large livestock farms (7 %), and large farms with business potential (2 %). The typology obtained can be useful for generating differentiated public policies that increase the use of technological innovations to obtain greater efficiency and productivity of dual cattle purpose in Sinaloa.

KEY WORDS: Differentiated policies, Principal components, Cluster analysis, Innovations.

INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

La producción de leche en México se lleva a cabo en todos los Estados y bajo diferentes sistemas de producción, identificándose cuatro sistemas predominantes: especializado, semiespecializado, doble propósito y familiar, aportando el 50.6, 21.3, 18.3 y 9.8 % respectivamente (1) . Estos sistemas están

Milk production in Mexico is carried out in all States and under different production systems.

Four predominant systems have been identified: skilled, semi-skilled, dual-purpose and family run farms, contributing 50.6, 21.3, 18.3 and 9.8 % respectively(1). These systems are associated with agro-ecological regions; intensive system,

Recibido el 10 de marzo de 2015. Aceptado el 17 de abril de 2015. a

Programa de Socioeconomía. Campo Experimental Valle de México-INIFAP. México. cuevas.venancio@inifap.gob.mx. Correspondencia al primer autor.

b

Campo Experimental Valle de Culiacán. INIFAP. México.

c

CENID Fisiología. INIFAP. México.

69

Venancio Cuevas Reyes, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):69-83

asociados a regiones agroecológicas; el sistema intensivo, predominante de la zona árida y semiárida, los sistemas familiar y semiespecializado con predominio en la zona templada y el de doble propósito en la región tropical(2), el cual se caracteriza por tener unidades de producción cuya finalidad es producir y vender leche o queso artesanal y animales para rastro, becerros destetados y hembras de desecho(3).

prevalent in the arid and semi-arid zone, are family-based and semi-specialized systems that are predominantly found in temperate zones and are dual-purpose in the tropical regions(2), they are characterized by production units aimed at producing and selling milk or animals for artisanal cheese or animals for slaughter, as weaned calves and as worn-out cows(3).

One of the representative states with dual-purpose cattle systems is Sinaloa. The state contributed 1.2 % on average to the national production of bovine milk during the period 1980-2013; however, in 2013 this contribution was only 0.85 %(4). A situation that reflects that the pace of growth in the state is lower than the national average, despite the potential of production in tropical regions, because of the low levels of productivity and profitability, as well as low levels of technology use(5,6,7). Therefore, it becomes important to identify the different strata and characteristics of the producers of these production systems, in order to generate greater impact in the use of innovations through differentiated strategies tailored to the type and level of resources available in the dual-purpose cattle farms.

Uno de los estados representativos del sistema de bovinos doble propósito es Sinaloa, que durante el periodo 1980-2013 aportó en promedio 1.2 % de la producción nacional de leche de bovino; sin embargo, en 2013 este aporte sólo fue de 0.85 %(4), situación que refleja que el ritmo de crecimiento en el estado es menor que el promedio nacional, a pesar del potencial que representa la producción en regiones tropicales, por los bajos niveles de productividad y rentabilidad, así como bajos niveles de uso de tecnología(5,6,7). Por lo anterior, cobra importancia identificar los diferentes estratos y características de los productores de estos sistemas productivos, con el fin de generar un mayor impacto del uso de innovaciones a través de estrategias diferenciadas al tipo y nivel de recursos de las explotaciones pecuarias de bovinos de doble propósito.

A classification or typology serves to establish categories of actors, so that they can analyze the characteristics of each one and identify specific solutions to problems that are also specific(8). Thus, the typology of producers relates to the identification and development of various groups or strata, which are obtained through the selection of variables representing the observed reality. Hence, the classification provides some notion that summarizes a variety of characteristics, conditions, events or individuals that or who share some obvious or evident and identifiable characteristic that will allow for a differentiated model(9).

Una clasificación o tipología sirve para constituir categorías de actores, de tal forma que se puedan analizar las particularidades de cada una e identificar soluciones específicas para problemas que también son específicos(8). De esta forma, la tipología de productores se refiere a la identificación y elaboración de diferentes grupos o estratos, que se obtienen a través de la selección de variables representativas de la realidad observada. Es decir, la tipificación tiene una connotación con la que se alude a alguna noción que resume una diversidad de características, situaciones, fenómenos o individuos que comparten algún carácter más evidente o notorio y que puede identificarse como modelo diferenciado(9).

The use of multivariate methods for classification and identification of production units in the agricultural field has been recurring; several authors(10-14) have used multivariate analysis techniques to identify homogeneous groups in farms.

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TIPOLOGÍA DE LAS EXPLOTACIONES GANADERAS DE BOVINOS DOBLE PROPÓSITO

El uso de métodos multivariados para la clasificación y caracterización de unidades de producción en el ámbito agropecuario ha sido muy recurrente, diversos autores(10-14) han utilizado técnicas de análisis multivariante para identificar grupos homogéneos en explotaciones agropecuarias.

In Mexico, there are studies that have classified and typified domestic agriculture. These have been conducted at a disaggregated level based on census data(15,16). Several authors have used multivariate analysis to identify factors that limit the development of the family system of milk production(17), to characterize sheep production farms(18), to analyze and characterize sheep production associated with rainfed agriculture(19) and to classify dairy production systems(20), among others.

En México existen trabajos que han clasificado y tipificado la agricultura nacional, realizados a nivel desagregado con base a información censal(15,16). Diversos autores han utilizado el análisis multivariado para identificar los factores que limitan el desarrollo del sistema familiar de producción de leche (17) , caracterizar las explotaciones ovinas(18), analizar y caracterizar la producción ovina asociada a la agricultura de temporal(19), y tipificar sistemas de producción lecheros(20), entre otros.

In Sinaloa there is no information of this nature; therefore the objective of this study was to conduct a typology of dual-purpose cattle production farms in the state of Sinaloa, using social, economic and technological variables.

MATERIAL AND METHODS Study area

En Sinaloa no existe un estudio de esta naturaleza, por lo tanto el objetivo del presente estudio consistió en realizar una tipología de las explotaciones ganaderas de bovinos doble propósito en el estado de Sinaloa, usando variables sociales, económicas y tecnológicas.

The study was conducted in the state of Sinaloa, in a region located in the northwestern of Mexico at 27° 07' and 22° 20' N, and 105° 22' and 109° 30' W. About 48 % of the state has a warm humid climate, while 40 % is dry and semidry, 10 % is very dry, and the remaining 2 % is temperate sub-humid. The average annual temperature is 25 °C, with minimum of 10.5 °C in January and maximum may be higher at 36 °C for May to July(21).

MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio El estudio se realizó en el estado de Sinaloa, ubicado en la región Noroeste de México a 27° 07' y 22° 20' N y 105° 22' y 109° 30' O. El 48 % del estado presenta clima cálido subhúmedo, 40 % clima seco y semiseco, 10 % es muy seco, y el restante 2 % es clima templado subhúmedo.

La temperatura media anual es 25 °C, con mínimas de 10.5 °C en enero y las máximas pueden ser mayores a 36 °C durante mayo a julio(21).

Data and variables Information of 1,165 dual-purpose cattle production systems (DCPS) that participated in the 2010-2011 SAGARPA funded program was analyzed(22). The Sinaloa program began in July 2010 and ended in March 2011. During this period an online baseline survey of the production units (PU) participating in the program was carried out. The survey was structured into eight sections: general information of the producer group, general information about the PU, social and economic producer aspects, characteristics of the PU, inventories (livestock, land, plant, machinery and equipment), management practices and

Datos y variables Se analizó información de 1,165 explotaciones ganaderas del sistema bovinos de doble propósito (SBDP) que participaron en el programa Soporte de SAGARPA 2010-2011(22).

El programa en Sinaloa inició en julio de 2010 y culminó en marzo de 2011. Durante este 71

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technological components, marketing and investment. With this information, a database was constructed in Excel.

periodo se realizó una encuesta de línea base a las unidades de producción (UP) participantes en el programa. La encuesta estaba estructurada en ocho apartados: información general del grupo de productores, información general de la unidad de UP, aspectos sociales y económicos del productor, características de la UP, inventarios (semovientes, tierras, instalaciones, maquinaria y equipo), prácticas de manejo y componentes tecnológicos, comercialización e inversiones. Con esta información se diseñó una base de datos en Excel.

To classify producers a great number of variables and methods can be used(8,9). The selection of variables for this study was carried out based on the identification of those factors that have been important in the characterization and typology of livestock production(12,23), and based on the analysis of technological indicators on the use and adoption of innovations and practices in PU(24,25). The technological indices were obtained following the procedure of authors who have worked on this issue of DCPS in Mexico(26), in this manner the following indices were considered as analysis variables: general management, genetic improvement, reproductive management, feeding forages, concentrate feeding, health, milking management, facilities and finally use rate of machinery and equipment. The indices obtained reflect the proportion of adoption and implementation of technology innovations in each of the production units; this was based on the frequency of use for the year the information was captured.

Para clasificar productores se pueden utilizar una gran cantidad de variables y métodos(8,9).

La selección de variables para el presente estudio se realizó con base a la identificación de aquellos factores que han sido relevantes en la caracterización y tipologías de explotaciones ganaderas(12,23), y con base al análisis de indicadores tecnológicos sobre el uso y adopción de innovaciones y prácticas en las UP(24,25). El procedimiento de obtención de los índices tecnológicos utilizados que se siguió, fue el descrito por autores que han trabajado este tema en SBDP en México(26), de esta forma, los siguientes índices se consideraron como variables de análisis: manejo general, mejoramiento genético, manejo reproductivo, alimentación con forrajes, alimentación con concentrado, sanidad, manejo de la ordeña, instalaciones y, finalmente índice de uso de maquinaria y equipo. Los índices obtenidos reflejan la proporción de adopción y aplicación de innovaciones tecnológicas en cada una de las unidades de producción, esto con base a la frecuencia de uso para el año en que fue capturada la información.

Subsequently, variables that have been considered in other studies of stratification of producers were selected, these were social variables(10,19) such as: age, number dependent children and dependent adults, economic variables such as size of the herd(17), number of hectares devoted to livestock(14) and number of adult cows(12,23).

Statistical analysis The selection of variables was performed using descriptive statistics and correlation analysis(13).

The social and economic variables along with variables related to technological aspects were applied to a correlation analysis to select those with greater representation in the DCPS. Variables that were significantly correlated (P<0.05) were identified, thus reducing from 15 variables to just 5, which grouped

Posteriormente se seleccionaron aquellas variables que han sido consideradas en otros estudios de estratificación de productores: variables sociales (10,19) (como la edad, número dependientes menores y dependientes mayores de edad; variables económicas tales como tamaño del hato(17), número de hectáreas dedicadas a la ganadería(14) y número de vacas adultas(12,23).

72

TIPOLOGÍA DE LAS EXPLOTACIONES GANADERAS DE BOVINOS DOBLE PROPÓSITO

Análisis estadístico

representative characteristics of the study population such as age of the producer, number of animal units, machinery and equipment index, general management index and a forage feed index.

La selección de las variables se realizó con uso de estadística descriptiva y análisis de correlación (13) . A las variables sociales y económicas en conjunto con las variables relacionadas con aspectos tecnológicos se les aplicó un análisis de correlación, para seleccionar aquéllas con mayor representación en el SBDP. Así, se identificaron variables que estuvieran correlacionadas de forma significativa (P<0.05), reduciéndose de 15 a sólo 5 variables, las cuales agrupan características representativas de la población a estudiar: edad del productor, número de unidades animal, índice de maquinaria y equipo, índice de manejo general e índice de alimentación con forrajes.

Multivariate analysis includes a set of methods and techniques that enables studying a block of a set of variables that are measured or observed in a population of individuals(8,9,27).

The selected variables were analyzed with the following methods of multivariate analysis: principal component analysis (PCA) and cluster analysis for classifying and further characterization of the PU(11,13,14). Principal component analysis allowed to reduce the variables that identify producer groups and generate new variables (factors or components).

Cluster analysis, meanwhile, was used to perform a grouping between production units with similar characteristics. To obtain conglomerates Ward’s method and Euclidean distance squared was applied(17,20).

El análisis multivariado incluye un conjunto de métodos y técnicas que permiten estudiar en bloque un conjunto de variables medidas u observadas en una población de individuos(8,9,27).

Las variables seleccionadas se analizaron con los siguientes métodos de análisis multivariado: análisis de componentes principales (ACO) y análisis cluster para la clasificación y posterior caracterización de las UP(11,13,14). El análisis de componentes principales permitió reducir las variables que identifican a los grupos de productores, además de generar nuevas variables (factores o componentes). El análisis cluster, en tanto, se utilizó para realizar una agrupación entre las unidades de producción con características homogéneas. Para la obtención de los conglomerados se aplicó el método de Ward y la distancia euclidiana al cuadrado(17,20).

Finally, the analysis and description of the groups was performed using analysis of variance to compare means. Statistical tests were performed using SPSS (27) and V16 Matlab statistical package.

RESULTS AND DISCUSSION Identify relevant factors and types of producers The principal component analysis(28) allowed explanatory factors in order to extract quantitative variables. The factors obtained were named as: social dimension (component 4), availability of resources (component 2), infrastructure and management (component 1) and livestock feed (component 3), which account for 86.8 % of the original variation (Table 1).

Finalmente, el análisis y descripción de los grupos se realizó mediante un análisis de varianza para comparación de medias. Las pruebas estadísticas se realizaron con el paquete estadístico SPSS(27) y Matlab V16.

The Kaiser-Meyer-Olkin (KMO) statistic obtained presented a value of 0.568, indicates a good fit in sampling adequacy for factor analysis. For the Barlett test of sphericity(29) a value of 0.000 was obtained, thus the null hypothesis can be rejected and the variables

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Factores relevantes e identificación de tipos de productores El análisis de componentes principales (28) permitió extraer factores explicativos de las 73

Venancio Cuevas Reyes, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):69-83

Cuadro 1. Matriz de componentes rotados de explotaciones ganaderas* Table 1. Rotated components matrix of cattle production farms* Variable* Age InventaryAU IndMaqyEq IndMGral IndAliForr Actual value Variance, % Accumulated, %

Component 1

Component 2

Component 3

-.012 .028 .602 .921 .075 1.5 29.9 29.9

-.031 .957 .392 -.075 -.003 1.0 21.1 51.0

.021 -.017 .312 -.023 .974 0.9 18.5 69.6

Component 4 .998 -.038 .037 -.032 .020 0.8 17.1 86.8

* Extraction method: Principal component analysis. Rotation method: Varimax with Kaiser Normalization.

The rotation converged in 5 iterations.

InventaryAU= herd; IndMaqyEq= machinery and equipment; IndMGral= general management; IndAliForr= feeding forages.

variables cuantitativas. Los factores obtenidos se denominaron como: dimensión social (componente 4), disponibilidad de recursos (componente 2), infraestructura y manejo (componente 1) y alimentación del ganado (componente 3), los cuales explican el 86.8 % del total de la variación original (Cuadro 1).

can be considered by a suitable factor analysis.

Cluster analysis of the factors obtained clearly identified four clusters or groups of farms (Figure 1).

Cluster 1 consists of 778 PU, and was defined as small cattle farms (SCF). They represent 67 % of the production farms, it is the most representative and among its relevant group

El estadístico Kaiser-Meyer-Olkin (KMO) obtenido presentó un valor de 0.568, lo que indica una buena adecuación muestral. Con la prueba de esfericidad de Barlet(29) se obtuvo un valor de 0.000, por lo que se puede rechazar la hipótesis nula considerando el ajuste de las variables, mediante el análisis factorial idóneo. El análisis de conglomerados de los factores obtenidos identificó claramente cuatro cluster o grupos de explotaciones ganaderas (Figura 1).

Figura 1. Dendograma de clasificación de las explotaciones ganaderas en Sinaloa Figure 1. Dendogram classification of production cattle farms in Sinaloa

El Cluster 1 se compone de 778 UP, y se definió como pequeñas explotaciones ganaderas (PEG).

Representan el 67 % de las explotaciones, es el grupo más representativo y entre sus características relevantes, es que cuentan con un promedio de edad de 51.5 ± 14.4 años.

Cuentan con 21.4 ± 10.1 unidades animal y 26.9 ± 16.0 ha dedicadas a la producción ganadera. Es el grupo mayoritario en el estado y presenta bajos índices de innovaciones, infraestructura y manejo.

74

TIPOLOGÍA DE LAS EXPLOTACIONES GANADERAS DE BOVINOS DOBLE PROPÓSITO

El Cluster 2 agrupa 83 UP, y fue definido como explotaciones ganaderas grandes (EGG).

Representan el 7 %, es un grupo relativamente pequeño pero destaca por contar con más de 115 unidades animal (115.4 ± 19.8); por su escala, utilizan una gran cantidad de superficie agrícola, más de 100 ha, la edad de los productores es de 50.4 ± 12.8 años.

characteristics is that they have an average age of 51.5 ± 14.4 yr. They have 21.4 ± 10.1 units of animals and 26.9 ± 16.0 ha are dedicated to livestock production. It is the largest group in the state and has low levels of innovation, infrastructure and management.

Cluster 2 groups consisted of 83 PU, and these were defined as large cattle farms (LCF). The represented just 7 %, which is a relatively small but stands out for having more than 115 animals units (115.4 ± 19.8); in scale, they use a lot of agricultural land, more than 100 ha, the age of the producers is 50.4 ± 12.8 yr.

El Cluster 3 se integra por 285 UP, y se definió como explotaciones ganaderas medianas (EGM).

Representan 24 % de las explotaciones, cuentan con un promedio de edad de 57.2 ± 11.8, con 55.0 ± 13.9 unidades animal y 38.5 ± 24.2 ha dedicadas a la producción ganadera. En conjunto con el grupo PEG representan 91 % del total de UP.

Cluster 3 was comprised of 285 PU, and was defined as medium-sized cattle farms (MCF).

They represent 24 % of farms with an average age of 57.2 ± 11.8, with 55.0 ± 13.9 animal units and have 38.5 ± 24.2 ha dedicated to livestock production. In conjunction with the SCF group they represent 91 % of PU.

Las pequeñas y medianas explotaciones ganaderas identificadas en el presente estudio coincide con los resultados del estudio sobre tipología de productores para el sur de Sinaloa(5); dichos autores señalan que el tamaño de la UP típica en la región es de 20 ha y el 80 % de los productores cuentan con un hato de bovinos de entre 21 y 42 cabezas.

The small and medium farms identified in this study is consistent with the results of the study on typology of producers for southern Sinaloa(5); these authors point out that the size of the PU typically in the region is 20 ha and 80 % of producers have a herd of cattle of between 21 and 42 heads.

Finalmente, el cluster 4 está constituido por 19 explotaciones y representa el 2 %. Se definió como explotaciones ganaderas grandes con potencial empresarial (EGGPE) por el nivel de recursos con los que cuenta (242.5 ± 76.5 unidades animal y 174.3 ± 246.6 ha dedicadas a la ganadería). Son productores que destacan por la escala de las unidades de producción y por tener una edad menor a 50 años (47.3 ± 14.2).

Finally, the cluster 4 consisted of 19 farms and represented 2 %. They were defined as large cattle farms with business potential (LCFBP) due to the level of resources that they have (242.5 ± 76.5 animal units with 117.5 ± 91.1 ha dedicated to cattle ranching). They are producers that stand out for the scale of the production units and younger age of less than 50 yr (47.3 ± 14.2).

Una vez identificados los tipos de productor, se procedió a caracterizarlos de acuerdo a los componentes identificados, ya que como señalan algunos autores, la identificación de las características que determinan la heterogeneidad al interior de los sistemas de producción es el punto de partida para buscar su desarrollo(14).

Once the types of producer identified, they were characterized according to the identified components, because as reported by some authors, identifying the characteristics that determine the heterogeneity within production systems is the development starting point(14).

Dimensión social El número de dependientes mayores de 18 años (cercano a dos dependientes) presenta 75

Venancio Cuevas Reyes, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):69-83

Social dimension

similitudes. La edad promedio de los productores fluctúa entre 47.3 y 57.2 años. Es relevante señalar que se identificaron diferencias significativas (P<0.05) entre PEG y EGGPE para la variable edad (51.5 ± 14.4 vs 47.3 ± 14.2 años) y para la variable número de dependientes menores (un miembro menor de edad en comparación con aproximadamente dos miembros menores de edad en las EGGPE) (Cuadro 2).

The number of dependents over 18 yr (close to two dependents) has similarities. The average age of producers fluctuated between 47.3 and 57.2 yr. It is worth noting that significant differences (P<0.05) between SCF and LCFBP for the variable age (51.5 ± 14.4 vs 47.3 ± 14.2 yr) and the variable number of dependent children (one minor in comparison to two members being minors for LCFBP) (Table 2).

Los resultados encontrados contrastan con lo informado por otros autores(30) quienes no encontraron diferencias significativas en la edad del productor en fincas de doble propósito en Venezuela, mientras otro estudio(7) en Sinaloa encontró que la variable edad tampoco presentó diferencias significativas.

The results contrast with those reported by other authors(30) who found no significant differences in the age of the producer in dual-purpose farms in Venezuela, while another study(7) in Sinaloa found that the age variable also showed significant differences.

En contraste, otros estudios encontraron que la edad del productor tiene significancia (P<0.05) para la adopción de innovaciones tecnológicas(25).

En este sentido, el hecho de que los productores de las EGGPE sean menores de 50 años pudiera influir en su receptividad hacia propuestas de cambio tecnológico, capacitación y uso de innovaciones.

In contrast, other studies found that the age of the producer has significance (P<0.05) in terms of adopting technological innovations(25). In this sense, the fact that the producers of the LPFBP are under 50 might influence their receptivity to proposals of technological change, training and use of innovations.

Availability of resources

Disponibilidad de recursos

The variables of number of animal units and area devoted to raising livestock farms was significant ( P<0.05), indicating that these variables may be important for the classification of types of producers in dual-purpose production cattle systems; in other words the level of financial resources (herd size and agricultural

Las variables número de unidades animal y superficie dedicada a la ganadería de las explotaciones ganaderas resultó significativa (P<0.05), lo cual indica que estas variables pueden ser importantes para la clasificación de tipos de productores en sistemas de producción

Cuadro 2. Características sociales de los tipos de productores en Sinaloa Table 2. Social characteristics of the types of producers in Sinaloa Variable Age Dependent children Dependent adults

SCF

MCF

LCFBP

F value

51.5±14.4ac

57.2±11.8ab

LCF 50.4±12.8ab

47.3±14.2b

1.3±1.3ac 1.6±1.3a

1.0±1.3ab 1.7±1.2a

1.4±1.4ab 1.8±1.5a

1.8±1.3b 1.8±1.4a

14.344 3.786 0.833

SCF= Small catlle farms; MCF= Medium catlle farms; LCF= Large cattle farms; LCFBP= Large cattle farms with business potential. abc Dissimilar letter in the same row indicate difference (P<0.05).

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TIPOLOGÍA DE LAS EXPLOTACIONES GANADERAS DE BOVINOS DOBLE PROPÓSITO

de bovinos doble propósito, es decir, el nivel de recursos económicos (tamaño del hato y superficie agrícola) resulta determinante en la diferenciación de los productores de este sistema de producción (Cuadro 3).

area) is decisive in differentiating producers of this production system (Table 3).

The selection of the total herd size as a variable differentiate producer groups is consistent with a study on the family system of milk production in Michoacan(17), since the total number of animals in the herd and cows in production were the most important variables leading to the formation of clusters of these systems studied by these authors.

La selección del tamaño total del hato como variable que diferencia grupos de productores concuerda con un estudio realizado en el sistema familiar de producción de leche en Michoacán(17), ya que el total de animales en el hato y las vacas en producción fueron las variables más importantes para la formación de conglomerados de los sistemas estudiados por estos autores.

LCFBP were defined as large farms with business potential due to the large amount of resources that they have for production; a herd average of 242.5 ± 76.5 with an agricultural area devoted to livestock production of 174.3 ± 246.6. That is, they have a high potential to have closer links with the market and improve their competitiveness through potential increases in production of calves and milk, given its level of resources; improving the competitiveness of milk production systems in tropical Latin America regardless of the location of the farms is directly related to the size of the herd(31).

Las EGGPE se definieron como explotaciones grandes con potencial empresarial, por la gran cantidad de recursos con los que cuenta para la producción; un hato promedio de 242.5 ± 76.5 y una superficie agrícola destinada a la producción ganadera de 174.3 ± 246.6. Es decir, tienen un alto potencial para lograr una mayor vinculación al mercado y mejorar su competitividad a través de potenciales incrementos en la producción de becerros y leche, dado su nivel de recursos; el mejoramiento de la competitividad de los sistemas de producción de leche en el trópico latinoamericano independientemente de la ubicación de las fincas, tiene una relación directa con el tamaño del hato(31).

Infrastructure and management The indices related to infrastructure of livestock farms show differences (P<0.05) between the LCFBP compared with SCF. Small farms have a rate of 0.09 ± 0.09 facilities compared to farms with business potential (0.18 ± 0.22). This same behavior occurs in the index of machinery and equipment, general management and health.

Infraestructura y manejo Los índices relacionados con la infraestructura de las explotaciones ganaderas muestran diferencias ( P <0.05) entre las EGGPE en

Cuadro 3. Disponibilidad de recursos por tipo de explotaciones ganaderas Table 3. Availability of resources by type of livestock farms Variable Average herd, AU Adult cows, n Surface area, ha

SCF

MCF

21.4±10.1a 18.0±19.0a 32.2±83.9a

55.0±13.9b 29.0±21.0a 44.3±82.6b

LCF 115.4±19.8c 46.0±34.0b 104.6±167.7b

LCFBP 242.5±76.5d 88.0±61.0c 174.3±246.6c

F value 2239.663 103.657 26.207

SCF= Small catlle farms; MCF= Medium catlle farms; LCF= Large cattle farms; LCFBP= Large cattle farms with business potential. abc Dissimilar letter in the same row indicate significant difference (P<0.05).

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comparación con las PEG. Las pequeñas explotaciones ganaderas tienen un índice de instalaciones de 0.09 ± 0.09 en comparación con las explotaciones ganaderas con potencial empresarial (0.18 ± 0.22). Este mismo comportamiento se presenta en el índice de maquinaria y equipo, el de manejo general y el de sanidad. Los índices relacionados con el manejo genético, manejo reproductivo y manejo de ordeña no presentaron diferencia significativa (Cuadro 4).

The indices related to genetic management, reproductive management and handling of milking did not show significant difference (Table 4).

There are many studies examining the use of technological components or factors that limit the application of innovations in livestock production systems(32-34). In the present study, we identified that the use of technological innovations is low and very similar between producers (innovations related to food and use fodder less than 16 %, using concentrate was less than 11 %, milk management practices was between 22 and 11 %, innovations related to reproductive management was less than 6 %; Tables 4, 5). The differences in terms of infrastructure correspond to the size of the farms than to differentiation by level of innovation adopted. In this regard, the Agricultural Census VIII, Livestock and Forestry(35) indicates that there are 27,022 production units farming in Sinaloa, of which 22,535 use some form of technology. The technology component that is applied to a greater extent is vaccination (1.8 %), followed by ticks baths (1.7 %), deworming (46.2 %), use of mineral salts (0.8 %) and purchase of balanced diets (0.5 %). This shows enormous potential for the promotion and implementation of technological innovations related to aspects of nutrition, reproductive handling, health and milking in these farms

Existe una gran cantidad de estudios que analizan el uso de componentes tecnológicos o los factores que limitan la aplicación de innovaciones en sistemas de producción pecuarios(32-34). En el presente estudio se identificó que el uso de innovaciones tecnológicas es bajo y muy parecido entre los productores (innovaciones relacionadas con alimentación y uso de forrajes menor a 16 %, uso de concentrado menor a 11 %, prácticas de manejo de ordeña entre 22 y 11 %; innovaciones relacionadas con manejo reproductivo menor a 6 %, (Cuadros 4, 5). Las diferencias encontradas en cuanto a la infraestructura corresponden más bien al tamaño de las explotaciones que a una diferenciación por nivel de adopción de innovaciones. Al respecto, el análisis de uso de tecnología con base al VIII Censo Agrícola, Ganadero y

Cuadro 4. Uso de infraestructura y manejo del ganado por tipo de explotación Table 4. Use of infrastructure and management of livestock by type of farm Variable Facilities Machinery and equipment General management Genetic management Reproductive management Health Milking management

SCF 0.09±0.09a 0.14±0.11a 0.25±0.17ab 0.24±0.27a 0.05±0.11a 0.62±0.16ab 0.15±0.26a

MCF 0.12±0.11a 0.16±0.11ab 0.25±0.15ac 0.26±0.28a 0.05±0.11a 0.63±0.16ab 0.11±0.21a

LCF 0.15±0.15ab 0.21±0.15ab 0.26±0.15ab 0.29±0.33a 0.06±0.14a 0.66±0.13b 0.12±0.22a

LCFBP 0.18±0.22bc 0.27±0.16c 0.34±0.23b 0.22±0.29a 0.06±0.15a 0.57±0.25ac 0.22±0.37a

F value 11.202 15.439 1.728 1.050 0.581 2.168 2.673

SCF= Small catlle farms; MCF= Medium catlle farms; LCF= Large cattle farms; LCFBP= Large cattle farms with business potential. abc Dissimilar letter in the same row indicate difference (P<0.05).

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TIPOLOGÍA DE LAS EXPLOTACIONES GANADERAS DE BOVINOS DOBLE PROPÓSITO

Forestal(35) indica que en Sinaloa existen 27,022 UP con actividad agropecuaria, de las cuales 22,535 utilizan algún tipo de tecnología. El componente tecnológico que se aplica en mayor medida es la vacunación (1.8 %), seguido del baño garrapaticida (1.7 %), la desparasitación (46.2 %), uso de sales minerales (0.8 %), y compra de alimento balanceado (0.5 %). Esto muestra un enorme potencial para la promoción e implementación de innovaciones tecnológicas relacionadas con aspectos de alimentación, manejo reproductivo, sanidad y ordeña en las explotaciones de este sistema de producción de carne y leche en Sinaloa.

with these systems of production of meat and milk in Sinaloa.

Livestock feed The variables analyzed regarding the nutritional management showed significant differences (P<0.05) with LCP compared to LCPBP in terms of use of feed, large farms have a rate of 0.16 ± 0.09 compared to 0.11 ± 0.09 of LCFBP; one possible explanation is that the later have large areas of rangeland where to send their cattle to graze. It is worth noting that in this aspect it was found that the use of concentrate showed no significant differences (Table 5).

Alimentación del ganado

The main problems facing dual-purpose cattle producers in Sinaloa are lack of fodder during the dry season, livestock malnutrition, degradation (erosion and compaction) of agricultural land and rangeland, and low efficiency of rainwater(5). In this sense, the results show that the use of technological innovations to solve this problem is limited for all the farms, hence it is necessary to generate mechanisms and strategies for dissemination and technology transfer for producers to know related innovations in the use and conservation of fodder.

Las variables analizadas referentes al manejo alimenticio mostraron diferencias significativas (P<0.05) para EGG en comparación con EGGPE, en el uso de forrajes, las explotaciones grandes tienen un índice de 0.16 ± 0.09 en comparación con 0.11 ± 0.09 de las EGGPE; una posible explicación sea el que estas últimas cuenten con grandes áreas de agostadero en donde envíen su ganado a pastar. Es relevante señalar que en el aspecto de uso de concentrado no se encontraron diferencias significativas (Cuadro 5).

Los principales problemas que enfrentan los productores de doble propósito en Sinaloa son: la falta de forraje durante la época seca del año, la desnutrición del ganado, la degradación (erosión y compactación) de las tierras de uso agrícola y de agostadero, y la baja eficiencia en el uso del agua de lluvia(5). En este sentido,

The results obtained allow authorities, researchers, professional service providers and decision makers to know the different types and characteristics that differentiate livestock producers in the dualpurpose cattle production systems of Sinaloa.

This can positively impact the definition and

Cuadro 5. Índices de manejo de la alimentación por tipo de explotación Table 5. Indices of feeding management by type of farm Variable Fodder Concentrate

SCF 0.13±0.09ab 0.09±0.07a

MCF 0.14±0.08ab 0.10±0.06a

LCF

LCFBP

F value

0.16±0.09b 0.11±0.06a

0.11±0.09ac 0.09±0.07a

4.427 1.604

SCF= Small catlle farms; MCF= Medium catlle farms; LCF= Large cattle farms; LCFBP= Large cattle farms with business potential. abc Dissimilar letter in the same row indicate significant difference (P<0.05).

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los resultados obtenidos muestran que el uso de innovaciones tecnológicas para solucionar esta problemática son limitadas para el total de las explotaciones ganaderas, por lo que se requiere generar mecanismos y estrategias de difusión y transferencia de tecnología para que los productores conozcan innovaciones relacionadas con el uso y conservación de forrajes.

development of public policies targeted by type of producer through: planning and implementation of programs for technology transfer, investment and reorientation of state and federal support, defining actions and lines of research, implementation of outreach and training that is “tailored to fit”, i.e., with differentiated policies for each group of producers (individual or organized).

It is recommended that state institutions of development and support establish development strategies for livestock depending on the different types and characteristics of producers.

In this sense, the generation of technological packages by type of producer can enable greater efficiency of the involved resources; it is clear that there is a common problem in this production system, feeding during the dry season. However, to achieve a greater impact it is advisable that intervention strategies be differentiated by type of producer, which have the potential to develop and adopt technological innovations. This can allow for targeting and design strategies that are specific to the type of technology transfer based on the level of resources the livestock rancher has, as well as his problems and requirements, and can enhance regional development. For example, the inclusion of strata with business potential with strategies of territorial development through integration with other links in the beef production chain can be used for generating poles of regional development through the creation of a cluster for production of feeder calves, a product in which Mexico has a deficit.

In summary, the results obtained can be used to improve dual-purpose cattle production systems in Sinaloa, as well as in other states and developing countries with similar conditions.

The use of typology for producers in the agricultural sector is a necessary tool for defining public policies that consider the various actors in the rural territory.

Los resultados obtenidos permiten tanto a autoridades, investigadores, prestadores de servicios profesionales y tomadores de decisión conocer los diferentes tipos, así como las características que diferencian a los productores pecuarios en el sistema bovinos doble propósito en Sinaloa. Lo anterior puede impactar positivamente en la definición y elaboración de políticas públicas focalizadas por tipo de productor a través de: la planificación e implementación de programas de transferencia tecnológica, reorientación de inversiones y apoyos estatales y federales, definición de acciones y líneas de investigación, implementación de actividades de extensión y capacitación con “trajes a la medida”, es decir, con políticas diferenciadas para cada grupo de productores (individuales u organizados).

Se recomienda que las instituciones de fomento y apoyo estatal establezcan estrategias de desarrollo de la ganadería en función de los diferentes tipos y características de los productores. En este sentido, la generación de paquetes tecnológicos por tipo de productor puede permitir una mayor eficiencia de los recursos involucrados; es claro que existe una problemática común en este sistema de producción, la alimentación en época seca. Sin embargo, para alcanzar un mayor impacto es recomendable que las estrategias de intervención sean diferenciadas por tipo de productor, lo que puede potencializar el desarrollo y adopción de innovaciones tecnológicas, puede permitir la focalización y diseño de estrategias de transferencia tecnológica específicas al nivel de recursos con los que cuenta el ganadero, su problemática y

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS Using multivariate analysis techniques clearly identified four types of producers in the cattle 80

TIPOLOGÍA DE LAS EXPLOTACIONES GANADERAS DE BOVINOS DOBLE PROPÓSITO

sus requerimientos, y puede potenciar desarrollos regionales. Por ejemplo, la inclusión del estrato con potencial empresarial en estrategias de desarrollo territorial mediante la integración con otros eslabones de la cadena productiva de carne de bovino puede servir para la generación de polos de desarrollo regional a través de la generación de un cluster para la producción de becerros en pie, producto en el que México tiene déficit. En síntesis, los resultados obtenidos pueden ser utilizados para el mejoramiento de la ganadería de doble propósito en Sinaloa, en otros estados y países en desarrollo con condiciones similares. El uso de una tipificación de productores en el sector agropecuario es una herramienta necesaria para la definición de políticas públicas que consideren los diversos actores del territorio rural.

production system dual-purpose: small farms (67 %), medium-sized farms (24 %), large livestock farms (7 %), and livestock farms with great business potential (2 %). The variables that were relevant to its stratification were, herd size (measured in number of animal units), the area devoted to livestock, the rate of general management and rate of use of forages in animal feed. The typology of the farms can be useful for decision-making and differentiated support strategies and contribute to the definition of public policies. It was observed that there is a low level of use and adoption of technology, so there is great potential work in promoting extension models that consider the resources and characteristics of each type of producer to increase the use and adoption of technological innovations that affect and improve welfare of the families that make up the dualpurpose cattle farms in Sinaloa.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES El uso de técnicas de análisis multivariado permitió identificar claramente cuatro tipos de productores en el sistema de producción bovinos doble propósito: pequeñas explotaciones ganaderas (67 %), explotaciones ganaderas medianas (24 %), explotaciones ganaderas grandes (7 %), y explotaciones ganaderas grandes con potencial empresarial (2 %). Las variables que resultaron relevantes para su estratificación fueron, el tamaño del hato (medido en número de unidades de animal), la superficie dedicada a la ganadería, el índice de manejo general y el índice de uso de forrajes en la alimentación animal. La tipología de las explotaciones ganaderas puede ser útil para la toma de decisiones y estrategias diferenciadas de apoyo, así como contribuir a la definición de políticas públicas. Se observó que existe un bajo nivel de uso y adopción de tecnología, por lo que existe un gran potencial de trabajo en la promoción de modelos de extensión que consideren los recursos y características de cada tipo de productor para incrementar el uso y adopción de innovaciones tecnológicas que incidan en un mayor bienestar de las familias que integran el sistema bovinos de doble propósito en Sinaloa.

ACKNOWLEDGMENTS Thanks to the Specialized Technical Unit for Livestock at INIFAP in Sinaloa for the information provided during the 2010-2011 evaluation cycle of the Funding Program, it served as the basis for this study. As well as the project: Adoption and impact assessment of the technology implemented in dual-purpose cattle systems in Mexico. INIFAP fiscal funds, project number 21541832011.

End of english version

AGRADECIMIENTOS Se agradece a la Unidad Técnica Especializada Pecuaria del INIFAP en Sinaloa por la información proporcionada durante el ciclo de evaluación 2010-2011 del Programa Soporte que sirvió de base para este estudio. Así como al proyecto: La adopción y evaluación del impacto de la tecnología implementada en sistemas 81

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bovinos de doble propósito en México. Fondos Fiscales de INIFAP, número de proyecto 21541832011.

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PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES Y RF/6A Rev DH82 Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

Propiedades de crecimiento de las líneas celulares DH82 y RF/6A bajo condiciones normales de laboratorio Growth properties of DH82 and RF/6A cell lines under standard laboratory conditions Samara Machuca Figueroaa, Gabriela Granjeno Colínb, Sergio Darío Rodríguez Camarillob, Carlos Agustín Vega y Murguíab

RESUMEN La línea celular RF/6A ha sido utilizada en estudios de corto plazo evaluando fármacos o infecciones experimentales con Anaplasma marginale; en contraste, DH82 es utilizada para la multiplicación de Ehrlichia canis. No obstante, se desconocen condiciones específicas de su crecimiento, por lo que se diseñaron varios experimentos para resolver interrogantes de su propagación. Ambas líneas, se adquirieron de la American Type Culture Collection, mantenidas en Medio Mínimo Esencial suplementado con suero fetal bovino, piruvato de Na y NaHCO3 e incubadas en atmósfera de 5% de CO2 en aire, a 37 °C. Los primeros ensayos, en placas de 24 pozos, esclarecieron los valores de dosis mínima inicial, que fueron 62,500 y 8,836 células/pozo para DH82 y RF/6A; así como los de densidad de siembra; cultivos con concentraciones de 5, 10, 20 y 40 células por mm2, cosechados con solución Tripsina-EDTA al alcanzar >95% de confluencia. Los índices estimados fueron: 3,319.32, 1,956.70, 870.73 y 422.14 para DH82 y 62.38, 63.51, 25.31 y 12.16 veces con RF/6A. La cinética del crecimiento, en cajas de Petri de 35 mm Ø, incluyó la siembra de 20 células/mm2, cambio del medio cada 63 h y cosecha cada 21 h para DH82; para RF/6A; la siembra fue 10 células/ mm2, cambio de medio cada 45 h y cosecha cada 15 h. El máximo crecimiento se observó hasta las 336 y 315 h con tiempos de duplicación de 42.9 y 36.9 h respectivamente para DH82 y RF/6A. Los datos permitieron proponer un modelo patrón de cultivo, para estudios futuros.

PALABRAS CLAVE: Cultivo celular, DH82, RF/6A, Intervalo de duplicación.

ABSTRACT DH82 Cell line has been utilized to grow Ehrlichia canis and RF/6A for drug evaluation in short-term cultures, as well as for replicating Anaplasma marginale. However, specific in vitro culture development conditions are unknown.

Several experiments were designed to solve inquiries of such procedure. Both cell lines were acquired from ATCC and put into culture. Na Pyruvate, NaHCO3 and fetal calf serum were used to enrich MEM culture media and incubated at 37 °C on 5% CO2 - air humid mixture atmosphere. First assays used 24 well plates and were focused on determination of a minimum initial cell concentration and cell density. In the former, averages of 62,500 cell/well for DH82 & 8,836 for RF/6A; were found. Later, experiments to identify a minimum cell density started with 5, 10, 20 & 40 cells/mm2, harvesting with a EDTA-Trypsin solution when confluence be reached. Growth indexes of 3,319.32, 1,956.70, 870.73 & 422.14 times and of 62.38, 63.51, 25.31 & 12.16 times, were respectively found for DH82 & RF/6A cell lines. For kinetics studies, 35 mm Ø sterile Petri dishes were used. Cultures were set with 20 cell/mm2 seed density for DH82 and 10 cell/mm2 for RF/6A. Dishes were randomly separated into two groups, with and without culture media periodical replacement. Maximum growth was observed at 336 and 315 h with 42.9 and 36.9 h doubling time in culture, respectively for DH82 & RF/6A cell lines. Generated data provided a model to define an in vitro growth pattern for future studies.

KEY WORDS: Cell culture, DH82, RF/6A, Doubling time.

Recibido el 19 de diciembre del 2014. Aceptado el 6 de mayo de 2015. a

Universidad Politécnica del Estado de Morelos. México.

b

Unidad de Anaplasmosis, CENID Parasitología Veterinaria / INIFAP. Carretera Federal Cuernavaca-Cuautla No. 8534, Col. Progreso, C.P. 62550; Jiutepec, Morelos.

México. vega.carlos@inifap.gob.mx. Correspondencia al último autor.

Resultados parciales para titulación como Ingeniero en Biotecnología del primer autor.

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Samara Machuca Figueroa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

El cultivo celular se precisa como la forma de propagar y mantener fuera del organismo, en condiciones in vitro, células de origen animal o vegetal; que pueden formar monocapa o mantenerse en suspensión manteniendo sus funciones(1). Las líneas celulares son aquellas células que lograron diferenciarse genética y morfológicamente de las estirpes de las que se derivaron, se han mantenido en cultivos continuos y pueden crecer de manera indefinida(2). La línea celular RF/6A(3) cuyo origen es el mono Macaca mulatta ha sido ampliamente utilizada tanto en estudios toxicológicos para evaluar la efectividad de algunos fármacos(4), así como en infecciones con la rickettsia Anaplasma marginale debido a sus propiedades de células endoteliales(5). No obstante, los datos publicados son insuficientes debido a que no se indican condiciones y características específicas de las células en cultivo, los ensayos son de corto plazo y sus datos no son homogéneos o sólo muestran el número de pases(6). La línea DH82 se deriva de un perro (Canis lupus familiaris) de raza Labrador dorado (Golden retriever) de 10 años de edad que padecía histiocitosis maligna(6,7,8) y ha sido utilizada para la multiplicación del microorganismo Ehrlichia canis(9,10) y en su interacción con eritrocitos infectados con Anaplasma marginale(11); recientemente se describió una caracterización inmunológica parcial de la línea celular DH82, en la que se acentuaba la necesidad de generar más información relativa a las propiedades de las líneas celulares(12).

Cell culture is the process by which animal or plant origin cells are propagated and maintained under in vitro conditions. Once they have been removed from an organism they may form a monolayer or remain in suspension keeping their functions(1). Cell lines are those that become genetically and morphologically differentiated from lineages they were derived and are maintained in continuous culture where they can grow indefinitely (2) . Monkey ( Macaca mulatta) RF/6A cell line(3) has been widely used in toxicological studies for the evaluation of the effectiveness of several drugs(4), as well as in infections caused by rickettsia Anaplasma marginale , due to its endothelial cell properties(5). However, the published data are insufficient because they do not indicate specific conditions and characteristics of the cell lines, assays are short-term and their data are not homogeneous or they only show the number of passages(6). The DH82 cell line, which derives from a 10-year-old male Golden Retriever (Canis lupus familiaris) with malignant histiocytosis(6-8), has been used for the multiplication of Ehrlichia canis (9,10) and for its interaction with erythrocytes infected with Anaplasma marginale(11). Recently, a partial immunological characterization of cell line DH82 was described, which accentuated the need to generate further information concerning the properties of cell lines(12).

The interest of the Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias to know about the propagation characteristics of these cell lines lies in establishing a study model for in vitro culture of rickettsia Anaplasma marginale, causative agent of bovine anaplasmosis, disease that has a negative effect on livestock economy in tropical zones of Mexico and worldwide(13,14). In that matter, its purpose is to carry out experiments that allow studying the behaviour of DH82 and RF/6A cell lines before being infected with the microorganism.

The objective of the study was to know how both cell lines grow and develop under standard

El interés que tiene el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias de conocer las características de propagación de estas líneas celulares en cultivo, radica en establecer un modelo de estudio para el cultivo in vitro de la rickettsia Anaplasma marginale, agente causal de la anaplasmosis bovina, enfermedad que representa un impacto negativo para la economía ganadera de zonas tropicales de México y el mundo(13,14). Ocupados en dicha 86

PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6A

problemática se plantea la realización de experimentos que nos permitirán estudiar el comportamiento de las células de las líneas DH82 y RF/6A en cultivo antes de la infección con el microorganismo. El objetivo de la investigación fue conocer el crecimiento y desarrollo de ambas líneas celulares en condiciones normales de laboratorio, para definir un patrón de su comportamiento.

laboratory conditions, in order to define their behaviour pattern.

MATERIAL AND METHODS Cell lines: Both lines, DH82 ( Canis lupus familiaris) and RF/6A (Macaca mulatta), used in this study were commercially obtained in a frozen form from “American Type Culture Collection” (ATCC), CRL-10389 and CRL-1780™, respectively. Each was quickly thawed in water bath at 37 °C and suspended in Eagle’s minimum essential medium (MEM), with 2.0 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich Química, SA de CV Edo. de México; México. No. de Cat. MO64310x1L) supplemented with 1.0 mM sodium pyruvate, 1.5 g/L of NaHCO3 and 15 % (v/v) inactivated fetal bovine calf serum at 56 °C for the DH82 cell line (MEM 15i), and for RF/6A, 10 % (v/v) normal fetal calf serum (MEM 10) was used. Both cell lines were added onto a column of 2 mm height, equivalent to a volume of 2 µl/mm2 and maintained by successive passages in 25 cm2 flasks (CORNING Inc, Corning, NY; EE.UU.; No. of Cat. 430372) with loosen caps, until experimentally used. In the process of maintenance and in the experimental assays, both cultures were incubated at 37 °C in 5.0 CO2 in air(v/v) atmosphere under saturated humidity(15).

MATERIALES Y MÉTODOS Líneas celulares: Ambas líneas, DH82 (Canis lupus familiaris) y RF/6A (Macaca mulatta), utilizadas en esta investigación se obtuvieron comercialmente en forma congelada de “American Type Culture Collection” (ATCC), CRL10389™ y CRL-1780™, respectivamente. Cada una fue rápidamente descongelada en baño maría a 37 °C y suspendida en medio mínimo esencial (MEM) según formulación de “Eagle”, con 2.0 mM L-glutamina (Sigma-ALDRICH QUÍMICA, SA. de CV Edo. de México; México. No. de Cat. MO643-10x1L) suplementado con 1.0 mM piruvato de Na, 1.5 g/l de NaHCO3 y 15 % (v/ v) suero fetal bovino inactivado a 56 °C para la línea DH82 (MEM 15i); para RF/6A se utilizó 10% (v/v) de suero fetal bovino sin inactivar (MEM 10). Ambas líneas celulares se adicionaron en una columna de 2 mm de altura, equivalente a un volumen de 2 µl/mm2 y mantenidas por pases sucesivos en botellas de 25 cm 2 (CORNING Inc. Corning, NY; EE.UU.; No. de Cat. 430372), con tapón flojo, hasta el momento de su uso experimental. Tanto en el proceso de su mantenimiento como en los ensayos experimentales, los cultivos se incubaron a 37 °C en una atmósfera de 5.0 % (v/v) de CO2 en aire, saturado de humedad(15).

Minimum seed initial dose for DH82 cell line assay For determining the minimum number of cells required to start cultures, a concentration of 5.0 × 105 cells (third passage), suspended in 350 µl of MEM15i complete cell culture media, was used; performing two-fold dilutions for reducing the inoculum to 2.5 × 105, 1.25 × 105 and 6.25 × 104 cells suspended in 350 µl of MEM15i. Cells were seeded in quadruplicate, inoculating 350 µxl/well, using two 24-well plates (CORNING Inc. Corning, NY; EE.UU. No of Cat. 35249). Cell culture media exchange was performed every 72 h until harvest. which occurred when any of the wells of any treatment reached ≥ 95% confluence, collecting the

Experimento de la dosis mínima inicial de DH82 Para dilucidar la cantidad mínima de células requeridas para iniciar los cultivos, se partió de una concentración de 5.0 x 105 células en su 3er pase, suspendidas en 350 µl de medio de cultivo completo MEM15i; realizando diluciones 87

Samara Machuca Figueroa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

dobles, para reducir el inóculo a 2.5 x 105, 1.25 x 105 y 6.25 x104 células suspendidas en 350 µl de MEM15i. Las células se sembraron por cuadruplicado inoculando 350 µl/pozo, utilizando dos placas de 24 pozos (CORNING Inc. Corning, NY; EE.UU. No. de Cat. 35249).

El cambio del medio se realizó cada 72 h, hasta el momento de la cosecha. Ésta tendría lugar cuando cualquiera de los pozos de cualquier tratamiento llegara a ≥ 95 % de confluencia, cosechándose la totalidad de los pozos mediante disgregación enzimática con 180 µl/pozo de solución 1X de Tripsina-EDTA (SIGMA-ALDRICH QUÍMICA, S.A. DE C.V. Toluca, Edo. de México.

No. de Cat. 3924) parando la reacción con un volumen igual de medio completo con suero, transfiriendo las células a un microtubo eppendorf de 1.5 ml estéril. Se realizó un lavado por centrifugación a 250 xg durante 15 min a temperatura ambiente (microcentrífuga HERMLE Mod. Z230MA), decantando el sobrenadante y resuspendiendo el paquete celular en un volumen de 180 µl de medio completo, empleando un agitador de vórtice. La concentración y viabilidad celular se midió utilizando una muestra de 20 µl adicionada con 20 µl de una solución 0.15 % (p/v) de azul de tripano estéril en solución 0.11 M de NaCl; empleando la cámara de Neubauer®.

Para el conteo celular se utilizó un microscopio Leica® de campo claro bajo el objetivo 40X, determinándose los valores promedio, error estándar e intervalo de confianza al 95 %, aplicando el programa Microsoft Office Excel 2007(16).

contents of all wells by enzymatic dissagregation using 180 µl/well of Trypsin/EDTA 1X (SigmaAldrich Química, S.A. de C.V. Toluca, Edo. de México. No of Cat. 3924), stopping the reaction with an equal volume of complete medium with serum and transferring the cells into a sterile 1.5 ml Eppendorf tube. Subsequently, they were washed by centrifugation at 250 xg for 15 min at room temperature (microcentrifuge HERMLE Model Z230MA), decanting the supernatant and resuspending the cell pellet in a volume of 180 µl of complete medium, using a Vortex Agitator.

Cell viability and concentration was measured using a sample of 20 µl mixed with 20 µl of 0.15 % (p/v) sterile trypan blue solution in a 0.11 M NaCl solution; using the Neubauer® chamber, in a 40X bright-field Leica® microscope. Mean values, standard error and 95 % confidence interval, were determined using Microsoft Office Excel 2007(16) program.

Minimum seed initial dose for RF/6A assay For the determination of the minimal number of cells required to start RF/6A culture, 5.0 × 105 cells in passage 543, suspended in 350 µl of complete culture medium MEM, were counted; performing two-fold serial dilutions to obtain a cell suspensions of 2.5 × 105, 1.25 × 105 and 6.25 × 104, in a first trial. For a second trial, the experiment began with a cellular concentration of 7.07 × 104 cells in passage 551, also performing two-fold serial dilutions to obtain cellular suspensions of 3.53 × 104, 1.77 × 104 and 8.84 × 103 in 350 µl of MEM10, already described. For both trials, cells in two 24-well plates were inoculated in duplicate with 350 µl/ well of cell suspension. Cell culture media exchange was performed each 48 h, until harvest, which occurred when cells reached ≥95 % confluence in any well and then the totality of wells of each phase was collected.

For cell count, the monolayer of confluent cells was disaggregated by enzyme action, using 200 µl/well of 1X Tripsyn-EDTA solution. After washed by centrifugation, cell viability and concentration were determined by trypan blue

Experimento de la dosis mínima inicial de RF/ 6A Para identificar la cantidad mínima de células requeridas para iniciar un cultivo de RF/6A, se contaron 5.0 x105 células en su pase 543, suspendidas en 350 µl de medio de cultivo completo MEM10; realizando diluciones dobles seriadas, para tener una suspensión celular de 2.5 x 105, 1.25 x 105 y 6.25 x 104, en una primera fase. Para la segunda fase, el experimento se inició con una concentración celular de 7.07 x 104 células en su pase 551, 88

PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6A

realizando igualmente diluciones dobles seriadas para obtener una suspensión celular de 3.53 x 104, 1.77 x 104 y 8.84 x 103 en 350 µl del medio MEM10, previamente descrito. En ambas fases, las células se inocularon por duplicado en dos placas de 24 pozos de 350 µl/pozo de la suspensión celular. El cambio del medio se realizó cada 48 h, hasta el momento de la cosecha, misma que se realizó al observarse ≥95% de confluencia en algún pozo, cosechándose la totalidad de los pozos de cada fase. Para realizar el conteo de células, la monocapa de células confluente se disgregó por acción enzimática utilizando 200 µl/pozo de la solución 1X de Tripsina-EDTA. Después de un lavado por centrifugación, se determinó la concentración y viabilidad celular por la exclusión de azul de tripano, registrándose la descripción y los valores obtenidos, según lo descrito para el primer ensayo.

exclusion, recording obtained values as described in the first assay.

Seed density for DH82 assay The aim was to know the time interval for reaching maximal growth, initiating the cultures with different cell concentrations. Fourth-passage cells were grown in two 24-well plates in duplicate, adding 350 µl/well of cell suspension, with density of 5, 10, 20 and 40 cells/mm2. As in the first assay, cell culture media exchange was performed every 72 h, until all treatments were harvested (≥ 95 % confluence). Cell viability and concentration were determined by trypan blue exclusion, as already described and mean values, standard error and 95 % confidence interval were recorded.

Seed density for RF/6A assay After 547 passages, cells were grown in two 24-well plates using the same volume, with densities of 5, 10, 20 and 40 cells/mm2 in duplicate. Cell culture media exchange was performed each 48 h, until harvested, using the same criterion for reaching ≥95% confluence. The enzyme disaggregation was performed using 200 µl/well of 1X Tripsyn-EDTA solution, washing the cells by centrifugation.

Similarly, viability and number of cells were measured by trypan blue exclusion.

Experimento de la densidad de siembra de DH82 El objetivo fue conocer el intervalo de tiempo para alcanzar el máximo crecimiento, iniciando los cultivos con diferentes concentraciones celulares. Las células en el 4° pase se crecieron por duplicado en dos placas de 24 pozos adicionando 350 µl/pozo de la suspensión celular, con una densidad de 5, 10, 20 y 40 células/mm2. Como en el primer experimento, el cambio del medio se realizó cada 72 h, hasta el momento de la cosecha (≥95 % de confluencia) en cada tratamiento. La concentración y viabilidad celular se determinaron por exclusión del azul tripano, de acuerdo a lo ya descrito y se registraron los valores promedio, error estándar e intervalo de confianza al 95 %.

Kinetics of DH82 cell line development Cells were expanded up to passage 6. For this purpose, a cell suspension was prepared for seeding 64 Costar® Petri dishes - 35 mm Ø × 10 mm height (Corning Inc. Bellerica, NY, EE.UU. No of Cat. 14831), in volumes of 2,000 µl/dish, with a seed density previously determined in the second assay or third trial(15); in terms of 20 cells/mm2 each, and two groups were formed.

No cell culture media exchange was done to half of the dishes (32 units), whereas cell culture media exchange was performed in the remaining 32 dishes, at regular intervals of 63 h. Each 21 h and until 336 h of initiation of cultures, two dishes of each group were taken at random,

Experimento de la densidad de siembra de RF/ 6A Las células del pase 547 se crecieron en dos placas de 24 pozos empleando el mismo volumen, con densidades de 5, 10, 20 y 40 células/mm2 por duplicado. El cambio del medio se realizó cada 48 h hasta el momento de la 89

Samara Machuca Figueroa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

cosecha, con el mismo criterio de alcanzar ≥95 % de confluencia. La disgregación enzimática se realizó con 200 µl/pozo de la misma solución 1X de Tripsina-EDTA, lavando las células por centrifugación. En forma similar, se midió la viabilidad y número de células, mediante el método de exclusión de azul tripano.

harvesting its content as it has already been described. Finally, cell pellets were resuspended in 300 µl of complete medium and concentration and viability were determined, as previously stated; tabulating results as mean values.

Kinetics of RF/6A cell line growth Cells were expanded up to passage 551. In the same way as the previous trial, enough cellular suspension was prepared for seeding 94 Petri dishes – dimension 35 mm Ø with the same passage, in volumes of 2000 µl/dish, with seed density determined in the fourth trial, as well as in cells/mm2 and divided into two groups of 46 dishes each. No cell culture media exchange was done to one group. Cell culture media exchange at regular intervals of 45 h were performed in the other half of the dishes. A pair of dishes from each group was randomly harvested each 15 h and until 345 h of initiating the culture, culture was processed according to the aforementioned for harvesting RF/6A cell line, resuspending cell pellet in 300 µl of complete medium, determining its concentration and viability and tabulating results as mean values according to the stated.

Ensayo de cinética de desarrollo de DH82 Este experimento se inició con una expansión celular que alcanzó al pase 6. Para ello, se preparó una suspensión celular suficiente para sembrar con el mismo lote 64 cajas Petri de 35 mm Ø x 10 mm alto, marca Costar® (Corning Inc. Bellerica, NY, EE.UU. No. de Cat. 14831), en volúmenes de 2,000 µl/caja, con una densidad de siembra previamente determinada en los ensayos del tercer experimento(15), en términos de 20 células/mm2 c/u y se formaron dos grupos. A la mitad de las cajas, 32 unidades, no se les hizo cambio de medio alguno, mientras que a las 32 unidades restantes el cambio de medio se realizó a intervalos regulares de 63 h.

Cada 21 h y hasta las 336 h de iniciados los cultivos, se tomaron aleatoriamente dos cajas de cada grupo, cosechando su contenido de la misma manera ya descrita. Al finalizar, se resuspendió el paquete celular en 300 µl de medio completo y determinando su concentración y viabilidad, según lo indicado previamente, tabulando los resultados como valores promedio.

Doubling time determination Using data from earlier trials, doubling time formula was applied (DT), suggested by ATCC(17), which considers the log phase: DT = T In2 / In(Xe/Xb)

Ensayo de cinética de crecimiento de RF/6A

Where T= incubation period= interval [final T – initial T] in hours; Xb= initial value of cell number; Xe= final value of cell number.

Este experimento se inició con una expansión celular hasta el pase 551. De la misma manera que en el experimento previo, se preparó una suspensión celular suficiente para sembrar 92 cajas Petri de 35 mm Ø con el mismo pase, en volúmenes de 2,000 µl/caja, con una densidad de siembra determinada en el cuarto experimento, igualmente en células/mm2 y divididos en dos grupos de 46 cajas c/u. A un grupo no se le hizo cambio de medio. A la otra mitad de las cajas, se realizó el cambio de medio a intervalos regulares de 45 h.

RESULTS There were no contamination problems due to strict management of asepsis, antisepsis and sterilization of components used in the culture of both cell lines. The morphology observed under the phase contrast microscope was apparently normal. Cell number was determined by total count of live and dead cells.

90

PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6A

Minimum seed initial dose for DH82 cell line

Aleatoriamente se cosecharon un par de cajas de cada grupo, cada 15 h y hasta las 345 h de iniciados los cultivos, procesando su contenido según lo señalado anteriormente para cosechar la línea RF/6A, resuspendiendo el paquete celular en 300 µl de medio completo y determinando su concentración y viabilidad, tabulando los resultados como valores promedio según lo mencionado.

This trial lasted 7 d from day zero, same time period that took the first treatment to reach ≥95 % confluence, which corresponded to the one started with 5.0 × 10 5 cells, whose maximum average concentration reached 1.07 × 10 7 cells, a growth 20.4 times the initial concentration. The maximum average concentrations for the remaining treatments were: 4.5 × 106, 2.49 × 106 and 7.38 × 105 cells, which is equivalent to a growth of 18, 19.9 and 11.8 times, respectively, for cultures started with 2.5 × 105, 1.25 × 105 and 6.25 × 104 cells/well. None of them demonstrated to be statistically significant. Table 1 shows values obtained for growth, standard deviations and upper and lower limits at 95% confidence interval (CI95%).

Determinación del intervalo de duplicación Con los datos de los dos experimentos anteriores, se aplicó la fórmula de intervalo de duplicación (DT) sugerida por el ATCC(17) que toma en consideración la fase de crecimiento logarítmico: DT = T ln2 / ln(Xe/Xb), Donde T= tiempo de incubación= intervalo [T final - T inicial] en horas; Xb= valor inicial del número de células; Xe= valor final del número de células.

Minimum seed initial dose for RF/6A The assay had a duration of 10 d in any of the two trials, in which the first phase of treatment 1

Cuadro 1. Valores obtenidos del ensayo para la determinación de dosis mínima inicial de la línea celular DH82 Table 1. Minimum seed initial dose values determined for the DH82 cell line Treatments*

1

2

3

4

n Initial count§ Final count† SD (±) α** SE (±) Lower limit Upper limit Increment Growth rate Harvest§§

4 5.00 x105 1.07 x107 9.82 x106 0.05 4.91 x106 1.08 x106 2.03 x107 1.02 x107 20.40 7

4 2.50 x105 4.75 x106 3.82 x106 0.05 1.91 x106 1.01 x106 8.49 x106 4.50 x106 18.00 NA

4 1.25 x105 2.61 x106 2.69 x106 0.05 1.35 x106 -2.73 x104 5.25 x106 2.49 x106 19.90 NA

4 6.25 x104 8.00 x105 8.46 x105 0.05 4.23 x105 -2.87 x104 1.63 x106 7.38 x105 11.80 NA

* Started with 5.00x105, 2.50x105, 1.25x105 y 6.25x105 cells/well, respectively. §

Total cells/well.

† Average total cells/well.

SD= Standard deviation; SE= Standard error. ** Alpha value for 95 % confidence interval. §§ Day to reach > 95 % confluence; NA= Not applicable.

91

Samara Machuca Figueroa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

RESULTADOS

and the second phase of treatment 5 reached ≥95% confluence. It was evident that there was a decrease in all first phase treatments.

The biggest fall, represented by a reduction in cell number, occurred in treatment 1, reaching a value of -4.21 × 105 cells, followed by treatments 2, 3 and 4, with reductions of 1.7 × 105, 5.8 × 104 and 4.5 × 103 total cells. These data, together with statistical variables are shown in Table 2.1. Cell harvesting in the first assay reached a total of 7.9, 8.0, 6.7 and 5.8 × 104 average cells for treatments 1, 2, 3 and 4, respectively. The second experimental phase implemented with lower cell concentration, gave positive results. The maximum cell concentration was obtained in treatment 8, reaching on average 1.12 × 105 total cells. Treatments 7, 5 and 6 followed the performance of the cell concentration, obtaining on average 1.03 × 105, 8.48 × 104 and 8.35 × 104 total cells. The 95 % CI together with the statistical evaluation, which did not result significant, are shown in Table 2.2.

No se presentaron problemas por contaminación debido al estricto manejo de la asepsia, antisepsia y esterilidad de los componentes utilizados en el cultivo de ambas líneas celulares.

La morfología observada al microscopio de contraste de fases fue aparentemente normal.

El número de células se determinó por el conteo total de células vivas y muertas.

Dosis mínima inicial de DH82 Este experimento tuvo una duración de siete días a partir del día 0, mismo periodo que tuvo el primer tratamiento en llegar a ≥95 % de confluencia, que correspondió al iniciado con 5.0 x 105 células; cuya concentración máxima promedio alcanzada fue 1.07 x 107 células, esto es un crecimiento de 20.4 veces la concentración inicial. Las concentraciones máxima promedio para los tratamientos restantes fueron: 4.5 x 106, 2.49 x 106 y 7.38 x 105 células, lo que equivale a un crecimiento de 18, 19.9 y 11.8

Cuadro 2.1. Valores obtenidos del primer ensayo para la determinación de dosis mínima inicial de la línea celular RF/6A Table 2.1. Minimum seed initial dose values determined for the RF/6A cell line in first assay Treatments*

1

2

3

4

n Initial count§ Final count† SD (±) α** SE (±) Lower limit Upper limit Increment Growth rate Harvest§§

4 5.00 x105 7.90 x104 6.29 x104 0.05 3.14 x104 1.74 x104 1.41 x105 -4.21 x105 -0.84 10

4 2.50 x105 8.00 x104 8.23 x104 0.05 4.12 x104 -6.54 x102 1.61 x105 -1.70 x105 -0.68 NA

4 1.25 x105 6.70 x104 5.29 x104 0.05 2.65 x104 1.52 x104 1.19 x105 -5.80 x104 -0.46 NA

4 6.25 x104 5.80 x104 4.59 x104 0.05 2.29 x104 1.30 x104 1.03 x105 -4.50 x103 -0.07 NA

* Started with 5.00x105, 2.50x105, 1.25x105 y 6.25x105 cells/well, respectively. §Total cells/well. † Average total cells/well.

SD= Standard deviation; SE= Standard error. ** Alpha value for 95 % confidence interval. §§ Day to reach > 95 % confluence; NA= Not applicable.

92

PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6A

Seed density for DH82 cell line

veces, respectivamente para los cultivos iniciados con 2.5 x 105, 1.25 x 105 y 6.25 x 104 células/ pozo. Ninguno de ellos demostró ser estadísticamente significativo. En el Cuadro 1 se muestran los valores de crecimiento obtenidos, las desviaciones estándar y los límites superior e inferior del intervalo de confianza al 95 % (IC95 %).

Fourteen days after culture started, the first well that reached ≥95 % confluence corresponded to the inoculum of 40 cells/mm2, followed by the inoculum of 20 cells/mm2 on d 15; d 16 corresponded to the inoculum of 10 cells/mm2 and the inoculum of 5 cells/mm2 on d 17. The highest average cell concentration at the moment of cell harvesting was obtained with the inoculum of 10 cells/mm2, reaching a value of 3.46 × 106 on d 17, followed by the inoculum started with 20 cells/mm2 with 3.08 × 106 on d 15, whereas for inocula of 40 and 5 cells/mm2, counts of 2.9 × 106 were obtained in both on d 14 and 17, respectively.

The resulting values of this assay are shown in Table 3, where the standard error and 95 % CI are sown, since the average values of each treatment resulted to be statistically non-significant.

Dosis mínima inicial de RF/6A El ensayo tuvo una duración de 10 días en cualquiera de sus dos fases, en que el tratamiento 1 de la primera fase y el tratamiento 5 de la segunda fase, alcanzaron ≥95 % de confluencia. Fue notorio que en todos los tratamientos de la primera fase, hubo un decremento. La mayor caída representada con una reducción del número de células se dio en el tratamiento 1 alcanzando un valor de -4.21 x 105 células seguido de los tratamientos 2, 3 y 4 con reducciones de 1.7 x 105, 5.8 x 104 y 4.5 x 103 células totales. Estos datos, junto

Seed density for RF/6A Cultures began to reach progressive confluence in direct relation to the inoculum density on

Cuadro 2.2. Valores obtenidos del segundo ensayo para la determinación de dosis mínima inicial de la línea celular RF/6A Table 2.2. Minimum seed initial dose values determined for the RF/6A cell line in a second assay Treatments*

5

6

7

8

n Initial count§ Final count† SE (±) α** SE (±) Lower limit Upper limit Increment Growth ratio Harvest§§

4 7.07 x104 8.48 x104 5.20 x104 0.05 2.60 x104 3.39 x104 1.36 x105 1.41 x104 0.20 10

4 3.53 x104 8.35 x104 5.11 x104 0.05 2.55 x104 3.34 x104 1.34 x105 4.81 x104 1.36 NA

4 1.77 x104 1.03 x105 4.55 x104 0.05 2.27 x104 5.81 x104 1.47 x105 8.50 x104 4.81 NA

4 8.84 x103 1.12 x105 4.93 x104 0.05 2.46 x104 6.34 x104 1.60 x105 1.03 x105 11.64 NA

* Started with 7.07x104, 3.53x104, 1.77x104 y 8.84x103 cells/well, respectively. § Total cells/well. † Average total cells/well.

SD= Standard deviation; SE= Standard error. ** Alpha value for 95 % confidence interval. §§ Day to reach > 95 % confluence; NA= Not applicable.

93

Samara Machuca Figueroa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

d 8, 9, 10 and 11, after culture of inocula of 40, 20, 10 and 5 cells/mm2 were initiated. The value of the maximum average cell concentration was 1.04 × 105 and it was obtained in the inoculum of 10 cells/mm2; the minimum average value of 5.6 × 104 was obtained with 5 cells/ mm2, whereas the remaining inocula of 20 and 40 cells/mm2 both reached, on average, the intermediate concentration of 9.3 × 104. As in the previous assay, the resulting values of this experiment, were statistically non-significant, as shown in Table 4.

con las variables estadísticas pueden observarse en el Cuadro 2.1. La cosecha en el primer ensayo, alcanzó un total de 7.9, 8.0, 6.7 y 5.8 x 104 células totales promedio, respectivamente para los tratamientos 1, 2, 3 y 4. La segunda fase experimental implementada con una concentración menor de células, arrojó resultados positivos. La máxima concentración celular obtenida fue con el tratamiento 8, alcanzando un total de 1.12 x 105 células promedio.

Siguieron en rendimiento, los tratamientos 7, 5 y 6, obteniendo respectivamente en promedio 1.03 x 105, 8.48 x 104 y 8.35 x 104 células totales. El IC95 % junto con la evaluación estadística, que no resultó significativa, aparecen en el Cuadro 2.2.

Kinetics of DH82 cell line growth This assay had a duration of 336 h or 14 d.

The lag or adaptation phase lasted 126 h in both groups. In the first, without cell culture media exchange, it reached an average cell concentration of 47,025; whereas in the second group, with a periodic cell culture media exchange, 59,875 total cells, equivalent to a

Densidad de siembra de DH82 A los 14 días de iniciado el cultivo se obtuvo el primer pozo que llegara a confluencia ≥95 %, que correspondió al inóculo de 40 células/mm2,

Cuadro 3. Valores obtenidos del ensayo para la determinación de densidad de siembra de la línea celular DH82 Table 3. Seed density values determined for the DH82 cell line Treatments*

1

2

3

4

N Initial count§ Final count† SD (±) α** SE (±) Lower limit Upper limit Increment§§ Growth ratio Harvest††

4 5 16,602 1,124.52 0.05 562.26 15,499.56 17,703.62 16,596.59 3,319.32 17

4 10 19,577 3,341.18 0.05 1,670.59 16,302.64 22,851.36 19,567.00 1,956.70 16

4 20 17,435 5,650.17 0.05 2,825.09 11,897.47 22,971.81 17,414.64 870.73 15

4 40 16,926 1,422.65 0.05 711.33 15,531.36 18,319.76 16,885.56 422.14 14

* Started with 8.84x102, 1.77x103, 3.53x103 y 7.07x103 cells/well, respectively. § Total cells/well. † Average total cells/well.

SD= Standard deviation; SE= Standard error. ** Alpha value for 95 % confidence interval. §§ In number of cells/mm2. †† Day to reach > 95 % confluence.

94

PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6A

Cuadro 4. Valores obtenidos del ensayo para la determinación de la densidad de siembra de la línea celular RF/6A Table 4. Seed density values determined for the RF/6A cell line Treatments*

1

2

3

4

N Initial count§ Final count† SD (±) α** SE (±) Lower limit Upper limit Increment§§ Growth ratio Harvest††

4 5 317 118.34 0.05 59.17 200.92 432.87 311.89 62.38 11

4 10 645 223.70 0.05 111.85 425.88 864.33 635.11 63.51 10

4 20 526 187.00 0.05 93.50 343.01 709.53 506.27 25.31 9

4 40 526 431.21 0.05 215.61 103.68 948.86 486.27 12.16 8

* Started with 8.84x102, 1.77x103, 3.53x103 y 7.07x103 cells/well, respectively. § Total cells/well. † Average total cells/well.

SD= Standard deviation; SE= Standard error. ** Alpha value for 95 % confidence interval. §§ In number of cells/mm2. ††Day to reach > 95 % confluence.

density of 49 and 62 cells/mm2, respectively.

Log phase lasted until 315 h with a value of maximum average cell concentration of 538 250 cells per well in the group without cell culture media exchange; but in the second one, the log phase lasted up to 336 h, when a maximum average cell concentration reached 1.77 × 106 (1’774,750 cells) and the assay was finished.

Maximum densities reached were 559 and 1,845 cells/mm2 for treatments with and without cell culture media exchange. Figure 1 shows growth differences between both groups, as well as the log phase and time in culture medium.

seguido del inóculo de 20 células/mm2 en el día 15; el día 16 lo fue para el inóculo de 10 células/mm2 y el de 5 células/mm2, el día 17.

La mayor concentración celular promedio, al momento de la cosecha se obtuvo con el inóculo de 10 células/mm2 alcanzando un valor de 3.46 x 106 al día 17, seguido del inóculo iniciado con 20 células/mm2 con 3.08 x 106 al día 15, mientras que para los inóculos de 40 y 5 células/ mm2 se obtuvieron cuentas de 2.9 x 106 en ambos, a los 14 y 17 días respectivamente. Los valores resultantes de este experimento se resumen en el Cuadro 3, en el que aparecen el error estándar y el IC al 95%, ya que los valores promedio de cada tratamiento resultaron ser no significativos estadísticamente.

Kinetics of RF/6A cell line growth This assay lasted 345 h, a little bit more than 14 d. For both treatments, with or without cell culture media exchange, the adaptation period had a duration of 90 h, from which log phase was observed. This was mild in the first case, reaching its maximum average value of 8.4 ×

Densidad de siembra de RF/6A Los cultivos fueron alcanzando confluencia progresivamente en relación directa a la densidad del inóculo, en los días 8, 9, 10 y 11 95

Samara Machuca Figueroa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

Figura 1. Crecimiento celular comparativo de la línea celular DH82 de origen canino, con y sin cambio de medio de cultivo, habiendo iniciado el día 0* Figure 1. Comparative cell growth of DH82 cell line of canine origin, with or without cell culture media exchange, having started on day 0*

Average cell concentration (Cells/mm2)

DH82 Line 2,000 1,500 1,000 500 0 0

21

42

63

84

105

126

147

168

189

210

231

252

273

294

315

336

Hours of culture With

Without

*Cultures started with a density of 20 cells /mm2. Maintained in minimum essential medium (Eagle formulation), with 2.0 mM L-glutamine supplemented with 1.0 mM sodium pyruvate, 1.5 g/l of NaHCO3 and 15 % (v/v) inactivated fetal bovine serum at 56 °C. Cell culture media was exchanged every 63 h. The exponential growth time period occurred between 126 and 336 h after culture.

después del inicio del cultivo a los inóculos de 40, 20, 10 y 5 células/mm2 . El valor de concentración celular máxima promedio fue de 1.04 x 105 y se obtuvo en el inóculo 10 células/ mm2; el valor mínimo promedio de 5.6 x 104 se obtuvo con 5 células/mm2, mientras que los inóculos restantes de 20 y 40 células/mm2, alcanzaron ambos la concentración intermedia de 9.3 x 10 4 en promedio. Como en el experimento anterior, los valores resultantes de este experimento, mismos que resultaron ser estadísticamente no significativos se resumen en el Cuadro 4.

104 (83,950 cells) after 300 h culture started, equivalent to an average density of 87 cells/ mm2. In a similar way, the second treatment reached its maximum value after 315 h with a maximum average concentration of 6.52 × 105 (651,600 cells), equivalent to an average density of 677 cells/mm2. Further measures revealed gradual decrease in cell number.

Figure 2 shows growth differences between both groups, as well as log phase and time in culture medium.

Cinética de crecimiento DH82

Based on data obtained from our experiments, results were tabulated, and shown in Table 5, as follows:

Doubling time

Este experimento tuvo una duración de 336 h o 14 días. La fase de latencia o adaptación tuvo una duración de 126 h en ambos grupos.

En el primero sin cambio de medio, alcanzó una concentración celular promedio de 47,025; mientras que en el segundo grupo, con cambio de medio periódico, 59,875 células totales,

DT DH82 = 42.95 h, equivalent to 42 h 56’ real-time.

DT RF/6A = 37.00 h, equivalent to 36 h 59’ real-time.

96

PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6A

Figura 2. Crecimiento celular comparativo de la línea celular RF/6A de origen mono Rhesus con y sin cambio de medio de cultivo habiendo iniciado el día 0* Figure 2. Comparative cell growth of RF/6ª cell line derived from Rhesus monkey, with or without cell culture media exchange, having started on day 0* RF/6A Line 800

Average cell concentration (Cells/mm2)

700 600 500 400 300 200 100 0 0

15

30

45

60

75

90

105

120

135

150

165

180

195

210

225

240

255

270

285

300

315

330

345

Hours of culture Without

With

* Cell cultures started with a density of 10 cells /mm2. Maintained in minimum essential medium (Eagle formulation), with 2.0 mM L-glutamine supplemented with 1.0 mM sodium pyruvate, 1.5 g/l of NaHCO3 and 10 % (v/v) fetal bovine serum. Cell culture media was exchanged every 45 h. The exponential growth time period occurred between 90 and 315 hours after culture.

DISCUSSION

equivalentes a una densidad de 49 y 62 células/ mm 2 , respectivamente. El crecimiento logarítmico duró hasta las 315 h con un valor de concentración celular promedio máxima de 538,250 células por pozo en el grupo sin cambio de medio; pero en el segundo, la fase logarítmica continuó hasta las 336 h, cuando se alcanzó una concentración celular máxima promedio de 1.77 x 106 (1’774,750 células) y se dio por terminado el experimento. Las densidades máximas alcanzadas fueron de 559 y 1,845 células/mm2 para los tratamientos sin y con cambio de medio.

La Figura 1 ilustra las diferencias de crecimiento entre los dos grupos, así como la fase logarítmica y el tiempo en cultivo.

Characteristics and properties of DH82 cell line of canine origin and RF/6A line, derived from Rhesus monkey, were defined. Additionally, both lines behaved very different from each other, which increases the value of this study by highlighting their inequality. This is to be expected, since DH82 is myeloid origin, monocyte-macrophage type(6,7), in contrast to RF/6A which is endothelial type(2,5).

For the first DH82 cell line assay, a first dose of 5.0 × 105 cells was established, which is two times less than 1.0 × 106, with which cultures are traditionally started in 25 cm2 flasks at the laboratory. For the determination of a dose of 6.25 × 104, it was established that cell cultures can be started even at doses 16 times lower.

Moreover, cultures started in flasks with the highest dose of 1.0 × 106 have a density of 400 cells per unit area (mm2); in contrast, the ones that are started with a lower dose of 6.24 × 104, the

Cinética de crecimiento RF/6A Este experimento tuvo una duración de 345 h, un poco más de 14 días. Para ambos tratamientos, sin y con cambio de medio, el intervalo de adaptación tuvo una duración de 90 h, a partir del cual se observó el crecimiento 97

Samara Machuca Figueroa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

Cuadro 5. Valores del desarrollo celular de ambas líneas, empleadas en la fórmula para la determinación del intervalo de duplicación (DT)§ [16] Table 5. Cell development values of both cell lines, used in the doubling time (DT) determination formulae [16]

Cell line

Initial*

Time (h) Final§§

DH82Ψ

126 90

336 315

RF/6A**

Total 210 225

Cell densityϕ (Xb) Initial (Xe) Final 62 10*

1,845 677

Doubling time (DT) 42.95 37.00

Real time 42h56' 36h59'

§DT= T ln2/ln(Xe/Xb). ϕ= Cells/mm2.

* Time; hours of culture when log phase initiated. §§ Time; hours of culture when log phase ended. Ψ Isolated canine cell line (Canis lupus familiaris).

** Derived from Rhesus monkey fetus (Macaca mulatta).

logarítmico. Éste fue muy leve en el primer caso, alcanzando su valor máximo promedio de 8.4 x 104 (83,950 células) a las 300 h de iniciado el cultivo; equivalentes a una densidad promedio de 87 células/mm2. En forma similar, el segundo tratamiento alcanzó su valor máximo a las 315 h con una concentración máxima promedio de 6.52 x 105 (651,600 células) equivalentes a una densidad promedio de 677 células/mm2.

Mediciones posteriores, revelaron una disminución paulatina en el número de células.

En la Figura 2 se ilustran las diferencias de crecimiento entre los dos grupos, así como la fase logarítmica y el tiempo en cultivo.

density is 354 cells per unit area, which is not a great difference; but that is not indicative of the advantage for initiating cultures with comparatively high doses. This led to the conclusion that cell lines, once adapted to laboratory conditions, should be started based on a density determination, which will indicate the dose to be used independently of the container size.

Although in the case of RF/6A cell line, whose initial assay had the same expectation as the earlier trial, the results were very different. First of all, the concentrations previously defined and considered high, resulted in limited assay conditions and that is why none of the established treatments managed to increase their values; on the contrary, they decreased.

According to these results, the second phase was defined, reducing even more the total initial cell concentration to just over 141 times. This result proves that for this cell lineage, the initial dose of seeding inoculum can start from smaller quantities than the traditionally recommended.

Likewise, in this assay it is shown that possibly large amounts of inoculum failed to adapt under culture conditions, which can be associated with lack of nutrients, enough to satisfy requirements for the total population. Although this should rather be referred to some key nutrient at the moment of adhesion to the container walls . It should be remembered that the selection

Intervalo de duplicación Con base en los datos obtenidos de los dos experimentos anteriores, se tabularon los resultados, como se muestra en el Cuadro 5, quedando como sigue: DT DH82 = 42.95 h equivalentes en tiempo real a 42 h 56’.

DT RF/6A= 37.00 h equivalentes en tiempo real a 36 h 59’.

DISCUSIÓN Se cubrió la expectativa de definir características y propiedades de cultivo de las líneas celulares 98

PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6A

DH82 de origen canino y la línea RF/6A, derivada de un mono Rhesus. Aunado a ello, ambas líneas se comportaron de manera muy diferente entre sí, lo que incrementa el valor de este trabajo, al destacar sus desigualdades. Esto es conforme a lo esperado, ya que DH82 es de origen mieloide, tipo monocito-macrófago(6,7), en contraste con RF/6A que es de tipo endotelial(2,5).

criterion to define the end of the experiment is almost complete confluence. This is a subjective visual measurement and it will not always give the same results, specifically based on its degree of subjectivity. Areas near the border of the wells seemed not to have same cell density, in comparison to the central areas, where cells appeared to have more contact between them and more uniform in appearance. As a disparity reflex, the reported by Kasai et al(18) and Shen et al was performed, using 4.8 × 103 and 1.0 × 105 cells per well, in 96-well plates to start RF/6A cell culture, respectively. This represents a difference, with respect to each other, of 20 times the concentration. As a result of this, the reliability of the results is in doubt, because at the moment of starting the cultures with high cell concentrations, these conglomerations will be sub-optimal for a cell-based assay, because instead of growing and multiplying, their concentration decreases.

Para el primer experimento con la línea DH82, se estableció una primera dosis de 5.0 x 105 células, que es dos veces menor a la de 1.0 x 106 con la que tradicionalmente se inician cultivos en botellas de 25 cm2 en nuestro laboratorio. Con la determinación de la dosis de 6.25 x 104, se resolvió que se pueden iniciar cultivos aún a dosis que son 16 veces menores.

Es más, los cultivos que se inician en botellas de cultivo con la dosis mayor 1.0 x 106, tiene una densidad de 400 células por unidad de superficie (mm2); en contraste las que se inician con la dosis menor 6.24 x 104 la densidad es de 354 células por unidad de superficie, lo que no es en sí, una gran diferencia. Ello tampoco es indicativo de la ventaja de iniciar cultivos con dosis tan altas, comparativamente. Ello condujo a definir que las líneas celulares, una vez adaptadas a las condiciones del laboratorio, los cultivos deberán iniciarse con base en una determinación de su densidad, la cual indicará la dosis a utilizar independientemente del tamaño del contenedor.

Based on the experience of the previous assays, seed density trials were designed, initially aiming at determining whether the closeness of the cells to each other could be a conditioning factor for their growth. The initial concentration of 1.0 × 106 cells in culture flasks surface area 25 cm2, is equivalent to a density of 400 cells/mm2. So the following pair of trials would be started with quantities varying from 80 times less, which means 5 cells/mm2, recorded as treatment 1, up to 10 times less, which is equivalent to 40 cells/mm2, described as treatment 4. For the case of DH82 line, it was found that the maximum growth values reached, in each of the treatments, were not statistically different between them, which is interpreted as uniform but not equal. Partly because the subjective criterion of confluence for their harvesting coincided in all cases with the discrepancy of interval that corresponds to the incubation period that was indeed different.

Aunque en el caso de la línea celular RF/6A, cuyo experimento inicial tenía las mismas expectativas del ensayo anterior, los resultados resultaron ser muy diferentes. Para empezar las concentraciones antes definidas y consideradas altas, resultaron ser limitativas, para las condiciones ensayadas, y es por ello que ninguno de los tratamientos establecidos consiguió incrementar sus valores, al contrario, disminuyeron. Con esos resultados, entonces se definió la segunda fase, reduciendo aún más la concentración celular inicial total, hasta poco más de 141 veces. Con ese resultado se comprueba que para esta estirpe celular, la dosis

With respect to seed density of RF/6A cell line results were discordant with the canine origin line. Values were much lower, both in cell 99

Samara Machuca Figueroa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

performance and the required interval to reach confluence. A simple explanation is that the size of the cells tended to be greater, indicated by the density obtained, that in no case it was on average higher than 645 cells/mm2. Likewise, they reached confluence in shorter incubation intervals, because the maximum value reached was 11 d. The average growth differs with the inoculum of 5 cells/mm2, although the obtained with the other three treatments is not statistically significant. Considering, as a simple explanation, the necessity of cell proximity, being a cell line of epithelial origin, it would be easier to understand that it is a tissue that requires a certain degree of organization and structure to operate efficiently(17,18), speculating that the communication between cells is favored by being physically closer tog e t h e r. M o n o c y t e s / macrophages expressed in DH82 cell line tend to function individually and cell-cell interactions are rather with other cell lineages, as antigenpresenting cells would be in the immune response. However, this study does not pretend to compare cell lines used, but rather discover differences with the aim to find their properties.

inicial de inóculo de siembra puede partir de cantidades menores a las recomendadas tradicionalmente. Igualmente en este experimento se refleja que posiblemente cantidades de inóculo tan grandes, fallen en su adaptación a las condiciones de cultivo, que pudiesen estar asociadas a una insuficiencia de nutrientes para satisfacer a la totalidad de la población. Aunque esto más bien debería referirse a algún nutriente clave para el momento del adosamiento o anclaje a la pared del contenedor. Cabe recordar que el criterio de elección para definir el término del experimento es la confluencia casi total. Ello es una medida subjetiva visual y no siempre arrojará los mismos resultados, basados precisamente en su grado de subjetividad. Áreas cercanas a los bordes de los pozos, parecían no tener la misma densidad celular, en comparación con las áreas centrales, en las que las células aparecen con mayor contacto entre sí, y más uniformes en apariencia. Como reflejo de la disparidad, tomamos lo indicado por Kasai et al(18) y Shen et al(19), quienes utilizaron 4.8 x 103 y 1.0 x 105 células por pozo, en placas de 96 pozos, para iniciar cultivo con la línea celular RF/6A, respectivamente. Ello representa una diferencia entre sí de 20 veces la concentración. Derivado de lo anterior, queda la duda de la confiabilidad de esos resultados, ya que al iniciar cultivos con altas concentraciones celulares, estas conglomeraciones no serán óptimas para un ensayo celular, pues en lugar de estar creciendo y multiplicándose, su concentración está disminuyendo.

Kinetic assay of DH82 cell line was based on the use of specific cell density of 20 cells/mm2, which was associated with certain expectations, foreseen beforehand, in terms of reaching the expected confluence after 15 d in culture. This would confirm our speculation of obtaining a pre-established growth, independently of the container’s size. The intermediate sampling interval of 21 h was based on an arithmetic estimation of generation time, according to the data calculated (not shown) in the first assay; and based on that estimation, cell culture media exchange was proposed every 63 h, which is three times that period of time. In compliance with the premise of reaching confluence after 15 d, representing 360 h in culture and having fallen short for one day, since biological material prepared for it ran out. The individual observation of the graphs allows to distinguish

Con base en la experiencia de los ensayos previos, se diseñaron los experimentos de densidad de siembra, en principio orientados a dilucidar si la cercanía entre sí de las células, pudiera ser una condicionante para su desarrollo. La concentración inicial de 1.0 x 106 células en botellas de cultivo de 25 cm2, equivale a una densidad de 400 células/mm2. Así que para el siguiente par de experimentos se iniciarían con cantidades que variaban desde 80 veces menos, esto es 5 células/mm2, anotado como tratamiento 1; hasta 10 veces menos, lo que es igual a 40 100

PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6A

células/mm2, descrito como tratamiento 4. Para el caso de la línea DH82 se encontró que los valores máximos de crecimiento alcanzados en cada uno de los tratamientos no son diferentes estadísticamente entre sí, lo que se interpreta como que fueron uniformes aunque no iguales.

En parte, porque el criterio subjetivo de confluencia para su cosecha, fue coincidente en todos los casos, con la discrepancia del intervalo que corresponde al tiempo de incubación, que sí fue diferente.

that the adaptation time period coincided between both treatments, only highlighting the log phase, while it decreased in the group without culture media exchange, the same did not occurred in the group with cell cultured media exchange, which would appear to be growing although not in the same reproductive rate.

Following the same reasoning for the kinetic assay for the development of RF/6A line derived from Rhesus macaque, initial seed density of 10 cells/mm2 was established to reach the expected confluence after 10 d or 240 h, independently of the size of the container. As in the previous assay, the interval of 30 h was calculated (data not shown), which corresponds to a generation time period, based on data obtained in the second phase of the initial seeding dose assay. Samplings were programmed every 15 h, considering it as half of the time between generations. For cell culture media exchange, the interval of 45 h was considered, 1.5 times the calculated for the generation time period, but very similar to the 48 h used in continuous cultures and previous assays. Now, the experience was different, since cell growth exceeded the expected time period of 10 d by extending the log phase up to 315 h, equivalent to 13.125 d. Cell density reached at that date was 677 cells/mm2, similar or closer to 645 cells/mm2 obtained in the seed density assay after 10 d. This phenomenon is biologically compatible with the functionality of the cell line, considering that it is not likely that only one layer is formed but several layers will pile up, characteristic of the tissue from where this cell line derived(8).

En lo que respecta a la densidad de siembra de la línea RF/6A los resultados fueron discordantes con los de la línea celular de origen canino. Los valores fueron mucho menores, tanto en rendimiento celular, como en el intervalo requerido para alcanzar la confluencia. Una explicación simple es que el tamaño de las células tiende a ser mayor, indicado por la densidad obtenida, que en ningún caso fue en promedio mayor a las 645 células/mm2. De la misma manera, alcanzaron confluencia en intervalos de incubación más cortos, pues el máximo valor alcanzado fue de 11 días.

El crecimiento promedio alcanzado con el inóculo de 5 células/mm 2 difiere, aunque no es estadísticamente significativo del obtenido con los otros tres tratamientos. Considerando, como explicación igualmente sencilla, la necesidad de proximidad en las células, ya que esta línea es de origen endotelial, lo que contribuiría a pensar que es un tejido que requiere cierto grado de organización y estructura, para operar eficientemente (17,18) , especulando que la comunicación entre las células se favorece por estar más cercanas entre sí, físicamente. Los monocitos-macrófagos, que se expresan en la línea celular DH82, tienden a operar en forma individual, y sus interacciones célula-célula son más bien con otras estirpes celulares, como lo serían células presentadoras de antígeno en la respuesta inmune. Sin embargo, este trabajo no pretende comparar las líneas celulares utilizadas, sino descubrir sus diferencias para encontrar sus propiedades.

It is globally accepted that in every cell culture there are adaptation and log phase time periods(1). One point this paper emphasizes is that in both cell lines these assays have demonstrated a similar behavior on what the adaptation time period refers to, regardless of whether or not they received fresh media culture, the intervals coincide, since the ups and downs shown (data not shown) at the

Los experimentos de cinética de la línea DH82 se basaron en el uso de una densidad celular 101

Samara Machuca Figueroa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

específica de 20 células/mm 2, que estaba asociada a una expectativa determinada, en términos de alcanzar la confluencia esperada en un plazo de 15 días, previsto de antemano.

Ello confirmaría lo especulado de obtener un crecimiento preestablecido, sin importar el tamaño del contenedor. El intervalo de muestreos intermedio cada 21 h se basó en una estimación aritmética de periodo generacional, según los datos calculados (no mostrados) del primer ensayo; y, con base en esa estimación se propuso el recambio de medio cada 63 h, que es tres veces ese periodo. El cumplimiento de la premisa de alcanzar confluencia a los 15 días, representaba 360 h en cultivo, habiendo quedado cortos por un día, cuando se agotó el material biológico dispuesto para ello. La observación individual de los gráficos permite distinguir que el periodo de adaptación fue coincidente entre ambos tratamientos, sólo destacando la fase de crecimiento logarítmico, que mientras en el grupo sin recambio de medio, fue declinando, no sucedió lo mismo, para el grupo con cambio de medio, que pareciera seguir creciendo aunque ya no a la misma tasa reproductiva.

beginning of the previous cultures, on the definition of intervals confirm this.

The results of the DT determination were surprising, because they give the appearance of being too high. The DT for DH82 of almost 43 h, as well as 37 h for RF/6A seem to coincide given the culture conditions used. Likewise, they differ from the initially calculated doubling time periods of 21 and 30 h, respectively. This verified information could give rise to studies for decreasing or even increasing its efficiency, using new culture medium formulations. MEM is one of the most commonly used of all cell culture media; it has a very simple formulation, compared to the components of other media chemically defined, such as Medium 199 or RPMI 1640, commercially available, for which it would be interesting to perform assays to identify some growth-restricting components.

Indirect inference obtained by preparation and staining of imprints (data not shown) allows to assert that cells from RF/6A lineage are polymorphic, in contrast to the description of cells reported by Luna Castro et al(14), who mentioned that RF/6A cells present a mosaic shape. Additionally, it was observed that cells from this cell lineage show different sizes.

Nonetheless, cells in general are very big, in comparison with other cell lines, such as BUVEC E6E7(15,20) and DH82(7,8), cell lines that are uniform in shape and have an inferior size, in contrast to RF/6A cell line.

Siguiendo el mismo raciocinio para el ensayo de la cinética de desarrollo de la línea RF/6A derivada del mono Rhesus, se estableció como densidad inicial de siembra 10 células/mm2, para alcanzar la confluencia esperada a los 10 días o 240 h, igualmente independientemente del tamaño del contenedor. Como en el ensayo previo, se calculó (datos no mostrados) el intervalo de 30 h, que corresponde al periodo de una generación, con base en los datos obtenidos en la segunda fase del experimento de dosis inicial de siembra. Los muestreos se programaron cada 15 h, considerando como la mitad del tiempo entre generaciones. Para el recambio de medio, se consideró el intervalo de 45 h, 1.5 veces el calculado para el periodo generacional, pero muy similar al de 48 h empleado en cultivos continuos y experimentos previos. Ahora, la experiencia resultó diferente, puesto que el crecimiento celular rebasó el periodo esperado de 10 días, al extenderse la

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS Data obtained allowed to generate a cell culture pattern model for further studies. In this way it will be more practical and simple to predict times and dates, for eventually obtaining cell cultures with high degree of confluence on a particular day. Equally relevant is the finding of cell cultures that have little growth when they are started with large number of cells, in contrast to the widespread view that cell cultures should be started with the largest number of cells as possible.

102

PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6A

ACKNOWLEDGEMENT

fase de crecimiento logarítmico hasta las 315 h, equivalente a 13.125 días. La densidad celular alcanzada en esa fecha fue de 677 células/ mm2, cantidad similar o cercana a los 645 células/mm2 obtenidas en el ensayo de densidad de siembra a los 10 días. Este fenómeno es biológicamente compatible con la funcionalidad de la línea celular, considerando que posiblemente no se forme una sola capa, sino un poliestrato; característica ésta, del tejido de donde se derivó esta línea celular(8).

Special thanks to INIFAP-Recursos fiscales for the financing of Project No. 14531319812.

End of english version

contraste a la descripción de las células reportada por Luna Castro et al.(14), quienes mencionan que las células RF/6A presentan formas de “mosaico”. Adicionalmente se observó, que las células de esta línea celular muestran diversos tamaños. No obstante, las células en general son muy grandes, en comparación con otras líneas celulares, como lo son BUVEC E6E7(15,20) y DH82(7,8), mismas que tienen una forma uniforme y un tamaño inferior al de las células de la línea RF/6A.

Es universalmente aceptado que en todo cultivo celular existen los periodos de adaptación y de crecimiento logarítmico(1). Este estudio destaca que ambas líneas celulares hayan mostrado un comportamiento similar en lo que al periodo de adaptación se refiere, pues independientemente de que hayan recibido o no, medio de cultivo fresco, los intervalos coinciden, ya que los altibajos mostrados (datos no presentados) al principio de los cultivos previos, a la definición del intervalo, así lo confirman.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES Los datos obtenidos permitieron generar un modelo patrón de cultivo, para estudios futuros.

De esta manera será más práctico y sencillo, el predecir tiempos y fechas, eventualmente para obtener cultivos con alto grado de confluencia en un día determinado. Igualmente relevante es el hallazgo de cultivos celulares que tienen poco crecimiento cuando se inician con cantidades grandes de células, en contraste con la opinión generalizada de iniciar con el mayor número posible de células.

Los resultados de determinación del DT resultaron sorprendentes, pues dan la apariencia de ser muy altos. El DT para DH82 de casi 43 h, así como el de 37 h para RF/6A, parecen ser coincidentes dadas las condiciones de cultivo empleadas. Igualmente difieren de los periodos de duplicación de 21 y 30 h respectivamente, calculados inicialmente. Con esta información verificada se daría pie a estudios para disminuirlos e inclusive incrementar su eficiencia, mediante el ensayo con nuevas fórmulas de medios de cultivo. El medio utilizado, MEM, es de los que tiene la formulación más sencilla, comparados con los componentes de otros medios químicamente definidos, como el Medio 199 o el RPMI 1640, accesibles comercialmente; por lo que sería hasta deseable realizar los ensayos para identificar algunos componentes que pudieran ser limitantes para su crecimiento.

AGRADECIMIENTOS Financiado por: INIFAP – Recursos Fiscales, Proyecto No. 14531319812

Inferencias indirectas obtenidas mediante la obtención y tinción de improntas (datos no presentados), permiten aseverar que las células de la estirpe RF/6A son polimórficas; en

LITERATURA CITADA 1.

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REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES Rev TROPICALES LATINOAMÉRICA Mex CiencDEPecu 2016;7(1):105-125

Requerimientos energéticos de ovinos de pelo en las regiones tropicales de Latinoamérica. Revisión Energy requirements of hair sheep in the tropical regions of Latin America. Review Alfonso Juventino Chay-Canula, Juan Gabriel Magaña-Monforteb, Mario Luiz Chizzottic, Angel Trinidad Piñeiro-Vázquezb, Jorge Rodolfo Canul-Solísd, Armin Javier Ayala-Burgosb, Juan Carlos Ku-Verab, Luis Orlindo Tedeschie

RESUMEN Los ovinos de pelo juegan un papel importante en la producción animal en las regiones tropicales; sin embargo, sus requerimientos nutricionales no se han determinado en la misma medida que los de las razas de lana. Debido a las condiciones ambientales de las regiones tropicales (clima, calidad y disponibilidad de alimentos), es razonable la hipótesis de que los requerimientos de energía metabolizable (EM) y la eficiencia de utilización de la EM pueden ser diferentes entre los ovinos de razas de pelo y de lana. La información disponible en ovinos de pelo muestra una gran discrepancia en cuanto a las necesidades de energía. Con base en datos de la literatura disponible para hembras ovinas, el requerimiento de EM para mantenimiento (EMm) fue de 419±129 kJ/kg PC0.75 (media ± desviación estándar) y para machos fue 388±123 kJ/kg BW0.75. El requerimiento de energía neta para la ganancia de peso (ENg) varió de 8.75 a 14.06 kJ/g (11.63±1.86 kJ/g). Las eficiencias de utilización de la EM para el mantenimiento (km) y la ganancia de peso (kg) fueron de 0.66±0.023 y 0.42±0.044, respectivamente. Esta revisión también indicó que la información es escasa para ovejas adultas en diferentes etapas fisiológicas (mantenimiento, lactancia y gestación).

Se requiere más trabajo de investigación con relación a la estimación de las necesidades de energía de los ovinos de pelo, con el fin de hacer ajustes a los modelos existentes de alimentación, con el objetivo de predecir la respuesta de los animales con la condición que prevalece en los trópicos (tipo de animal, medio ambiente y alimentos disponibles).

PALABRAS CLAVE: Ovinos de pelo, Requerimientos de energía, Trópicos, Mantenimiento, Ganancia, Eficiencia.

ABSTRACT Breeds of hair sheep play an important role in animal production in tropical regions; however, their nutrient requirements have not been determined to the same extent as those of wool breeds. Due to the environmental conditions of the tropical regions (climate, quality and availability of feedstuffs), it is reasonable to hypothesize that energy requirements and efficiency of utilization of metabolizable energy (ME) may be different between hair and wool breeds of sheep. Information available on hair sheep shows a large discrepancy regarding energy requirements.

Based on available literature data for female sheep, ME requirement for maintenance (MEm) was 419±129 kJ/ kgBW0.75 (mean ± standard deviation) and for the male 388±123 kJ/kg BW0.75. The requirement of net energy for gain (NEg) ranged from 8.75 to 14.06 kJ/g (11.63±1.86 kJ/g). The efficiency of ME utilization for maintenance (km) and gain (kg) were 0.66±0.02 and 0.42±0.04, respectively. This review indicated also that information is scarce for adult ewes at different physiological stages (maintenance, lactation, or pregnancy). More work is required regarding estimates of nutrient requirements of hair sheep in order to develop adjustments to existing nutrition models to predict animal’s response under the conditions prevailing in the tropics (animal type, environment and feedstuffs available).

KEY WORDS: Hair sheep, Energy requirements, Tropics, Maintenance, Gain, Efficiency.

Recibido el 23 de enero de 2015. Aceptado el 17 de abril de 2015. a

División Académica de Ciencias Agropecuarias, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. Carretera Villahermosa-Teapa, km 25, CP 86280. Villahermosa, Tabasco, México. aljuch@hotmail.com; ajchc19@yahoo.com.mx. Correspondencia al primer autor.

b

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán. Mérida, Yucatán, México.

c

Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG 36571. Brazil.

d

Instituto Tecnológico de Tizimín. Departamento de Investigación y Posgrado. Tizimín, Yucatán, México.

e

Department of Animal Science, Texas A&M University, College Station. USA.

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Alfonso Juventino Chay-Canul, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

La producción ovina en las regiones tropicales de América Latina y el Caribe ha aumentado en los últimos años. Los sistemas de producción en estas regiones se caracterizan por baja productividad y las razas empleadas son en su mayoría ovinos de pelo. Desde un punto de vista comparativo con razas de lana, las razas de pelo son pequeñas, con una tasa de crecimiento lenta y mala conformación muscular, por lo tanto, éstas se han cruzado para mejorar la tasa de crecimiento(1). Razas de pelo como Dorper y Katahdin muestran altas tasas de crecimiento y se han introducido en sistemas de cría con las razas Pelibuey y Blackbelly utilizadas en México(2).

Sheep production in the tropical regions of Latin America and the Caribbean has increased during recent years. Production systems in those regions are characterized by low-inputs, and breeds employed are mostly hair sheep. From a comparative standpoint with wool breeds, breeds of hair sheep are small, with a slow growth rate and poor muscular conformation, therefore, these have been crossed to improve rate of growth(1). Hair breeds such as Dorper and Katahdin show high rates of growth and have been introduced in breeding schemes with the Pelibuey and Blackbelly breeds commonly used in Mexico(2).

In spite of the importance of hair breeds in tropical and world sheep production, only few experiments have been carried out to assess their energy requirements(3,4,5). Knowledge of nutrient requirements and efficiency of utilization of feed resources is important to optimize productivity and achieve expected (5,6,7) performance . However, frequently published values and prediction models of requirements, are based on breeds from temperate environments(5,7,8,9) with results in animal performance different from what is expected and the inability to predict animal performance. In this sense (10) recently demonstrated the importance of using specific equations to local conditions to ensure that accurate and reliable predictions of dry matter intake by Santa Inês sheep are made. Also, some studies have stated that hair sheep breeds have different energy requirements compared to wool breeds, but this assertion has been based on limited experimental data(11).

A pesar de la importancia de las razas de pelo en la producción ovina tropical y del mundo, sólo pocos experimentos se han realizado para determinar sus requerimientos de energía(3,4,5).

Conocer las necesidades de nutrientes y la eficiencia de utilización de los recursos alimenticios es importante para optimizar la productividad y lograr el comportamiento productivo esperado(5,6,7). Sin embargo, con frecuencia se publican valores y modelos de predicción de requerimientos, basados en razas de clima templado(5,7,8,9) con resultados en la producción animal diferentes de lo esperado, así como la incapacidad para predecir el comportamiento productivo del animal. En este sentido(10) recientemente en ovejas Santa Inês se ha demostrado la importancia de la utilización de ecuaciones específicas a las condiciones locales para asegurar que se realicen predicciones precisas y confiables de consumo de materia seca. Además, algunos estudios han indicado que las razas ovinas de pelo tienen diferentes requerimientos de energía en comparación con las razas de lana, pero esta afirmación se ha basado en datos experimentales limitados(11).

On the other hand, energy intake by sheep is considered to be the first limiting nutrient for growth(12). Moreover, insufficient energy supply to the animal results in slow growth, older age at puberty, reduced fertility, decreased milk production and greater susceptibility to nematodes. In adult animals, when energy intake is lower than that required for

Por otro lado, el consumo de energía por los ovinos se considera como el primer nutriente limitante para el crecimiento(12). Además, el 106

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICA

suministro de energía insuficiente se refleja en lento crecimiento, mayor edad a la pubertad, reducción en fertilidad, menor producción de leche y una mayor susceptibilidad a los nematodos. En animales adultos, cuando la ingesta energética es menor que la necesaria para el mantenimiento, el animal utiliza sus reservas corporales de energía (13) , especialmente de grasa, y cuando esto ocurre en exceso, enfermedades metabólicas como cetosis pueden surgir. Al final de la gestación y principio de la lactancia, también se puede presentar un desequilibrio energético, que induce al animal a utilizar sus reservas energéticas corporales para producción de leche(14).

maintenance, the animal uses its own body energy reserves(13), particularly fat and when this occurs in excess, metabolic diseases such as ketosis may arise. At the end of pregnancy and beginning of lactation, there may also occur an energy unbalance which induces the animal to use its own body energy reserves for milk production(14).

At present, due to the fact that the main resources for animal production (land, feed, water) are more limited in some regions of the world, precise determination of nutrient required by the animals is of paramount importance to avoid waste of these resources(12). The NRC(15) includes hair sheep in the database used to predict daily weight gain (DWG). The Cornell Net Carbohydrate and Protein System for sheep (CNCPS-S) or Small Ruminant Nutrition Systems (SRNS)(12,16) have been evaluated for the prediction of DWG in Pelibuey sheep(6,17) and DWG and dry matter intake in Santa Inês sheep(18,19,20), and adjustments to such models have been proposed to make them comparable to those of Pelibuey sheep(6,17). Costa et al(21) reported that it is necessary to have a database which can be updated frequently, by means of a meta-analysis in such a way that models developed have recent data incorporated.

Tedeschi et al(12) concluded that it is necessary more data which allow an improvement to be realized in the precision of prediction models based on the SRNS under different production conditions. However, the available information for hair sheep is scattered and outdated. Very littlle is known in Mexico regarding metabolizable energy (ME) requirements of hair sheep for maintenance and weight gain and the efficiency with which ME is utilized for both physiological functions. The knowledge of such information may help to improve the efficiency of sheep production under practical conditions in sheep farms thus improving farm profitability.

En la actualidad, debido a que los principales recursos para la producción animal (tierra, agua) están más limitados en algunas regiones del mundo, la determinación precisa de nutrientes requeridos por los animales es de suma importancia para evitar la pérdida de estos recursos(12). El NRC(15) incluye ovinos de pelo en la base de datos para predecir la ganancia diaria de peso (GDP). El sistema Cornell de carbohidratos y proteína netos para ganado ovino (CNCPS-S, por sus siglas en inglés) o el sistema de nutrición de pequeños rumiantes (SRNS, por sus siglas en inglés)(12,16) han sido evaluados para la predicción de GDP en ovinos Pelibuey(6,17) y GDP y consumo de materia seca en ovinos Santa Inês(18,19,20) y ajustes a dichos modelos han sido propuestos para que sean comparables a los de Pelibuey(6,17). Costa et al(21) informaron que es necesario tener una base de datos que pueda ser actualizada con frecuencia, por medio de meta-análisis, de tal manera que los modelos desarrollados tengan incorporados datos recientes. Tedeschi et al(12) concluyen que se requieren más datos que permitan una mejora en la precisión de los modelos de predicción basados en el SNRS bajo condiciones de producción diferentes. Sin embargo, la información disponible para ovinos de pelo es escasa y sin actualizar. En México se conoce poco con respecto a sus requerimientos para mantenimiento y ganancia de peso y la

The aim of the present review was to analyze available information on ME requirements and efficiency of its utilization for maintenance and weight gain in hair sheep kept under tropical 107

Alfonso Juventino Chay-Canul, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

eficiencia con la que la energía metabolizable (EM) se utiliza para ambas funciones fisiológicas.

El conocimiento de tal información puede ayudar a mejorar la eficiencia de la producción ovina bajo condiciones prácticas en las explotaciones ovinas, mejorando la rentabilidad de la explotación.

conditions in Latin America, in order to visualize potential areas of research which may lead towards a better understanding of nutrient requirement by hair sheep.

Situation of hair sheep production In the main sheep producing countries in Latin America and the Caribbean, the phenotypes and breeds of sheep are diverse and they are generally described as “Creole”, and receive different names depending on where they are located and in some cases the same breed is named in different ways, for example the Pelibuey or Tabasco breed in Mexico, in the Virgin Islands the Pelo Blanco or Saint Croix breed, in Tobago West African or Roja Africana breed are the same. In Brazil there are three breeds of hair sheep: Morada Nova, Somali Brasileño and Santa Inês. Table 1 shows the breeds of hair sheep and their distribution in Latin America. Mature weight by sex of each breed was taken from the “Breeds of Livestock” website (www.ansi.okstate.edu/breeds/) of the Animal Science Department at Oklahoma State University(15). According to NRC(15), in order to obtain a more precise prediction of energy requirements, it is necessary to consider mature weight of the animals, as this is associated

El objetivo de la presente revisión fue analizar la información disponible sobre los requerimientos de EM y la eficiencia de utilización para mantenimiento y ganancia de peso en ovinos de pelo mantenidos bajo condiciones tropicales en América Latina, con el fin de visualizar las áreas potenciales de investigación que puedan llevar hacia un mejor conocimiento de los requerimientos nutricionales de estos ovinos.

Situación de la producción de ovinos de pelo En los principales países productores de ovinos de América Latina y el Caribe, las razas de ovinos y fenotipos son diversos, y se describen generalmente como “Criollos”, recibiendo diferentes nombres dependiendo de donde estén ubicados, y en algunos casos la misma raza se nombra de diferentes maneras; por ejemplo el Pelibuey o Tabasco se cría en México, en las

Cuadro 1. Razas de ovinos de pelo y su distribución en América Latina Table 1. Breeds of hair sheep and their distribution in Latin America Breed

Other names

MW (kg) Male

Distribution

Female

Africana

Pelona, Camura, Red African, Rojo Africana, Colombian Wooless, West African

Blackbelly

Barriga negra

Dorper

-

Katadhin

-

70-90

55-70

Morada Nova

-

40

30

Brazil

Pelibuey

Carnero de pelo de buey, Cuban hairy, Cubano rojo, Peligüey, Tabasco

54

34

Cuba, Mexico and Caribbean

Rabo largo

-

-

-

Brazil

Santa Inês

-

80-100

60-70

Brazil

Somali Brasileño

Somali Brasileiro, Rabo gordo

-

-

Brazil

St. Croix

Virgin Island White, White Virgin Islander, White Virgin Island

100

35-45

MW= Mature weight, taken from the web site: www.ansi.okstate.edu/breeds/.

108

-

-

60

32-44

Colombia and Venezuela Mexico, Caribbean

60

Mexico and Brazil Mexico, Dominican Republic, Haiti

British Islands, Virgin Islands, in the Caribbean

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICA

Islas Vírgenes las razas Pelo Blanco o Saint Croix, en Tobago la raza Roja Africana y West African son las mismas. En Brasil hay tres razas de ovinos de pelo: Somalí Brasileño, Morada Nova y Santa Inês. El Cuadro 1 muestra las razas de ovinos de pelo y su distribución en América Latina. El peso adulto por sexo de cada raza se tomó de la página Web de “Razas de ganadería” (del www.ansi.okstate.edu/ breeds/) del Departamento de Ciencia Animal de la Universidad del estado de Oklahoma(15).

Según la NRC(15), para obtener una predicción más precisa de las necesidades energéticas, es necesario considerar el peso adulto de los animales, ya que éste está asociado con la composición del tejido retenido según el porcentaje de peso adulto del animal, que varía entre razas y genotipos. En ovinos, se ha reportado que los requerimientos de EM para mantenimiento disminuyen conforme el animal va creciendo, que está relacionado con la proporción obtenida del peso adulto(15).

Requerimientos de energía mantenimiento y crecimiento

with composition of the retained tissue depending on the percentage of mature weight of the animal, which varies among breeds and genotypes. In sheep, it has been reported that ME requirements for maintenance decrease as the animal gets older, which is related with the proportion achieved of mature weight(15).

Data on energy requirements for maintenance and growth of hair sheep A literature review using the Science Direct (http://www.sciencedirect.com/), and Google Scholar (http://scholar.google.com/) search engines was conducted to create a database, and papers published in the scientific literature were obtained from journals such as: Tecnica Pecuaria en Mexico, Brazilian Journal of Animal Science, Ciência Agrotecnica, Small Ruminant Research, Semina: Ciências Agrárias and Italian Journal of Animal Science. The method by means the ME requirement for maintenance and growth was estimated is also presented in Table 2. It can be appreciated that the work carried out with hair sheep was performed with regression and comparative slaughter techniques; different to what has been done

para

Para la creación de la base de datos, se realizó una revisión de literatura con Science Direct

Cuadro 2. Descripción de la base de datos utilizada en esta revisión Table 2. Description of the database used in this review Author

N

Breed

Method

Country

Sex and physiological stage

Range LW (kg)

(3) (40) (4) (38) (8) (32) (32) (7) (31) (18,22) (34) (20) (30) (26)

24 40 17 13 30 1112 192 32 22 24 48 35 84 48

Pb Ra x Pb SI SI MN Pb Pb SI Pb SI MN SI 1/2 Do × 1/2 SI BS

CS REG2 CS CS CS REG1 REG1 CS CS CS CS CS CS CS

Mexico Mexico Brazil Brazil Brazil Mexico Mexico Brazil Mexico Brazil Brazil Brazil Brazil Brazil

Male, growing Castrated male and growing ewes, grazing Castrated male, growing lambs Male, growing Male, growing Male, growing Female, growing and beginning of pregnancy.

Castrated male, growing, grazing Adult females Male, growing Male, growing Male, growing Male growing lambs Male growing lambs

29.6 ± 1.58 13.5 ± 0.80 20 to 35 15 to 45 15 to 25 21.6 to 34.9 27.7 to 34.0 15.8 to 30 35 to 37 12.35 to 30.30 12.5 to 25.9 14.77 to 28 18.0 to 45 13.47 to 28.71

Pb= Pelibuey; Ra= Rambouillet; SI= Santa Inês; MN= Morada Nova; Do= Dorper; BS= Brazilian Somali.

CS= Comparative slaughter; REG 1= Regression of ME intake on changes in live weight, in experiments published in the literature; REG 2= Regression of ME intake on changes in live weight (with original data from the experiments).

109

Alfonso Juventino Chay-Canul, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

(en http://www.sciencedirect.com/) y motores de búsqueda de Google Scholar (del http:// scholar.google.com/) así como artículos publicados en la literatura científica de revistas tales como: Técnica Pecuaria en México, Revista Brasileña de Zootecnia, Ciência Agrotecnica, Small Ruminant Research, Semina: Ciências Agrarias y Revista Italiana de Ciencia Animal.

El método por el cual se estimó la EM requerida para mantenimiento y crecimiento también se presenta en el Cuadro 2. Se aprecia que el trabajo realizado con ovinos de pelo se ha realizado con regresión y técnicas de sacrificio comparativo; lo que difiere a lo realizado con ovinos de lana, en los cuales sus necesidades de energía se han obtenido básicamente con técnicas calorimétricas(23-26). Hay que iniciar trabajos calorimétricos con ovejas de pelo en las regiones tropicales para validar los datos obtenidos por regresión y técnicas de sacrificio comparativas.

with wool sheep, since the energy requirements of these sheep has been obtained basically with calorimetric techniques(23-26). There is a need to initiate calorimetric work with hair sheep in tropical regions to validate the data obtained by regression and comparative slaughter techniques.

Energy requirements and efficiency of ME utilization for maintenance (km) Energy costs for maintenance represent between 60 and 80 % of total energy consumed by ruminants (25). Energy requirements and in particular those for maintenance (Em), as well as the efficiency of feed utilization and the energy contained in tissues (adipose, muscular) in cattle has been a research subject during several decades(25,27). The requirement of metabolizable energy (ME) for maintenance (MEm), can be equated to the so-called “basal metabolism” (mostly used in human nutrition) and is defined as the amount of energy that the animal needs in order to maintain vital processes (basic functions [heart, lung, kidney, nervous, “work”] and cellular functions [fat and protein turnover; Na/K ion pump]) of the body under normal conditions. In a practical way, the MEm could be defined as the state in which the animal does not suffer changes in its body composition(9,23). It has also been defined as the state in which ME intake (MEI) will not result in loses or gains of energy (RE) in the animal body tissues; Ferrell and Oltjen(28) define this unit as, MEm= MEI at which RE= 0; or HP (heat production)= MEI.

Requerimientos de energía y eficiencia en la utilización de EM para mantenimiento Los costos de energía para el mantenimiento representan entre el 60 y el 80 % del total de energía consumida por rumiantes (25). Los requerimientos de energía y en particular los de mantenimiento (Em), así como la eficiencia de utilización del alimento y la energía contenida en los tejidos (adiposo, muscular) en el ganado, ha sido un tema de investigación durante varias décadas(25,27). El requerimiento de EM para mantenimiento (EMm), puede ser comparado al llamado “metabolismo basal” (en su mayoría utilizado en la alimentación humana), y se define como la cantidad de energía que el animal necesita para mantener los procesos vitales (funciones [corazón, pulmón, renal, nervioso, “trabajo”] y las funciones celulares [grasa y proteína; intercambio de iones de Na/K]) del cuerpo en condiciones normales. En la práctica, el EMm podría definirse como el estado en el que el animal no sufre cambios en su composición corporal (9,23). También se ha definido como el estado en que el consumo de EM (CEM) no resultará en pérdidas o ganancias

Among the factors which influence Em: body weight (BW), breed, sex, physiological condition, nutritional level, environmental conditions, stress, exercise, or physical activity and parasitism can be listed(9,15). The efficiency of utilization of MEm (km) represents that fraction of ME which can be converted to net energy (NE), to support maintenance requirements of the ruminant. The fraction which is no converted to NE is lost as heat increment including 110

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICA

de energía (ER) en los tejidos del cuerpo animal; Ferrell y Oltjen(28) definen esta unidad como, EMm= CEM en el que ER= 0; o PC (producción de calor) = CEM.

fermentation in the gastrointestinal tract and biochemical reactions at the cellular level(29).

The efficiency of energy utilization of feedstuffs has an economic impact, and the best way to determine it is by means of feed conversion efficiency(27,30).

Entre los factores que influyen en el Em se pueden mencionar: peso corporal (PC), raza, sexo, estado fisiológico, nivel nutricional, condiciones ambientales, estrés, ejercicio o actividad física y parasitismo(9,15). La eficiencia de la utilización de EMm (Km) representa la fracción de EM que se puede convertir en energía neta (EN), para soportar los requerimientos de mantenimiento de los rumiantes. La fracción que no se puede convertir a EN se pierde como el incremento de calor incluyendo fermentación en el tracto gastrointestinal y reacciones

Table 3 shows estimations of ME and NE requirements for maintenance (MEm and NEm respectively) and Table 4 shows efficiencies of ME utilization for maintenance (km) estimated in hair sheep of different breeds under tropical conditions of Latin America.

It is important to point out that for the case of ewes, in the present review only two experiments were found which were related to

Cuadro 3. Requerimientos energéticos para mantenimiento estimados en ovinos de pelo en condiciones tropicales de América Latina Table 3. Energy requirements for maintenance estimated in hair sheep in tropical conditions of Latin America Sex, breed and physiological stage

Relationship BW/EBW

Requirement MEm (kJ/kg EBW0.75) MEm (kJ/ kg BW0.75)

NEm (kJ/ kg EBW0.75) NEm (kJ/ kg BW0.75)

Reference

Females: Pb growing ewes and at early pregnancy Pb adults ewes Mean Minimum value Maximum value Standard deviation CV, %

1.19 1.19 -

606 606 -

327 510 419 327 510 129 30.9

-

-

(32) (31)

Males: Growing Pb Growing SI castrated Growing MN Growing Pb Growing SI Growing SI castrated MN SI growing males 1/2 Do × 1/2 SI BS lambs Mean Minimum value Maximum value Standard deviation CV, %

1.18 1.27 1.24 1.23 1.23 1.18 1.27 0.04 3.04

328 365 329 363 343 328 365 19.0 5.53

490 465 258 598 294 470 270 267 471 295 388 258 598 123 31.78

220 257

308

(3) (4) (8) (32) (18) (7) (34) (20) (30) (26)

Pb= Pelibuey; Ra= Rambouillet; SI= Santa Inês; MN= Morada Nova; Do= Dorper; BS= Brazilian Somali.

CV= Coeficient of variation.

111

219 240 234 219 257 18.34 7.84

310 300 306 300 310 5.3 1.73

Alfonso Juventino Chay-Canul, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

this information(31,32) and the mean value (± standard deviation) for MEm was 419 ± 129 kJ/kg BW0.75. This information must be taken with reserve since it comes from a reduced number of observations. In this sense, Chávez et al(33), found that supplying 506 kJ/kg BW0.75 to Pelibuey ewes during the first 100 d of pregnancy and 700 kJ/kg BW0.75 during the last 50 d of pregnancy was enough for the ewes to gain weight (36 g/d approximately).

Along with this, they reported that for lactation, the supply of 1,000 kJ/kg BW0.75 was enough for the ewes to gain 4 to 20 g/d, producing 700 to 800 ml of milk and be able to sustain a weight gain by their lambs of 200 g/d.

bioquímicas a nivel celular(29). La eficiencia de utilización de la energía de los alimentos tiene un impacto económico, y la mejor manera de determinarla es por medio de la eficiencia de la conversión alimenticia(27,30).

El Cuadro 3 muestra las estimaciones de requerimientos de EM y EN (EMm y ENm respectivamente) y el Cuadro 4 muestra las eficiencias de utilización de EM para mantenimiento (Km) en ovejas de pelo de diferentes razas en condiciones tropicales de América Latina. Es importante señalar que para el caso de las ovejas, en la presente revisión sólo se encontraron dos experimentos que estaban relacionados con esta información(31,32) y la media (± desviación estándar) de EMm fue 419 ± 129 kJ/kg PC0.75; esta información debe tomarse con reserva, ya que proviene de un número reducido de observaciones. En este sentido, Chávez et al(33), encontraron que suministrando 506 PC0.75 kJ/kg para ovejas Pelibuey durante los primeros 100 días de gestación y 700 kJ/kg PC0.75 durante los últimos 50 días de gestación era suficiente para que las ovejas aumentaran de peso (36 g/día aproximadamente). Junto con esto, informaron que para la lactancia, el suministro de 1,000 kJ/kg PC0.75 fue suficiente para que las ovejas obtuvieran 4 a 20 g/día, producción de 700 a 800 ml de leche y ser capaces de sostener un aumento de peso en sus corderos de 200 g/día.

For growing male sheep, data from nine experiments were used which involved Pelibuey (3,32) , Santa Inês (4,18,20) , Morada Nova(8,34), 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês(30) and Brazilian Somali lambs(26). The mean value found in the present experiment for MEm was 388 ± 123 kJ/kg BW0.75; however, this data showed a relatively high coefficient of variation of 31.8 %, this variation can be attributed to differences between experiments, genotypes, and crosses, among several other factors.

In several experiments(8,20,22,26,34) the values for MEm (kJ/kg BW0.75) were derived from the relation of BW/EBW and using the km reported by these authors. In relation to MEm, in growing Santa Inês sheep, some authors(4,20) report a mean value for MEm of 342 (±107) kJ /kg BW0.75. For Morada Nova sheep(8,34) an average MEm of 264 (±8.23) kJ/kg; for Pelibuey(3,32), a mean value of 544 (±76.4) kJ/kg. While others(26,30) reported only values available for 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês and Brazilian Somali lambs (Table 3).

Para machos en crecimiento, se utilizaron datos de nueve experimentos que involucraban las razas Pelibuey(3,32), Santa Inês(4,18,20), Morada Nova(8,34), 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês(30) y Somalí Brasileño(26). El valor medio encontrado en el presente experimento para EMm fue 388 ± 123 kJ/kg PC0.75; sin embargo, estos datos mostraron un relativamente alto coeficiente de variación de 31.8 %, el cual puede atribuirse a diferencias entre experimentos, genotipos y cruces, entre otros factores.

In relation to km, it was found an average value of 0.70(18). An average value of 0.67 was reported(8) when estimating km in diets with forage proportions of 40, 55 and 70(4,7,20); in Santa Inês growing males reported a km value of 0.66. Recently(30) it was found a km of 0.63 in 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês lambs. The

En varios experimentos(8,20,22,26,34) los valores de EMm (kJ/kg PC0.75) se derivan de la relación 112

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICA

entre PC/PCV y usando el Km reportado por estos autores. En relación con el EMm, en ovejas Sa n t a In ê s e n c re c i m i e n t o, a l g u n o s autores(4,20) informan un valor medio de EMm de 342 (±107) kJ/kg, y para Morada Nova 264 (±8.23) kJ/kg (8,34) . En el caso de Pelibuey (3,32), un valor medio de 544 (±76.4) kJ/kg. Mientras que otros autores (26,30) informan sólo valores disponibles para corderos 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês y Somalí Brasileño (Cuadro 3).

mean value for km in the present review was 0.66. In this respect, even when ME of diets of medium quality (such as those commonly used in the tropics) is utilized with a low efficiency for maintenance and gain, km is re l a t i ve l y h i g h e r c o m p a re d t o k g ( 2 9 ) .

Furthermore, this author reported that km could be considered on average as 0.60 independently of the diet. This approximates to that found in this work, where an average km value of 0.66 was obtained (Table 4).

En relación con K m, se encontró un valor promedio de 0.70(18). Un valor promedio de 0.67 fue reportado(8) cuando Km se estimó en dietas con proporciones de forraje de 40, 55 y 70 %(4,7,20); en machos en crecimiento Santa Inês se registró un valor de 0.66. Recientemente(30) se encontró un Km de 0.63 en corderos 1/2 Dorper x 1/2 Santa Inês. El valor medio de Km en la presente revisión fue de 0.66. En este respecto, cuando la EM de las dietas de calidad media (como los utilizados en los trópicos) se utiliza con una baja eficiencia para mantenimiento y ganancia, Km es relativamente mayor en comparación con Kg(29). Además, este autor reportó que Km podría considerarse en promedio como 0.60 independientemente de la dieta; esto se aproxima al valor promedio de este trabajo, que fue de 0.66 (Cuadro 4).

Lack of information is more evident for the case of ewes, for which there are very few reports regarding determination of energy requirements in their different physiological stages (maintenance, pregnancy, lactation), being these fundamental components of the production systems. Furthermore, it is known that feeding of ewes before and after parturition has an effect on survival and growth of the offspring. It is thus necessary to continue with work focused on the determination of the nutrient requirements of hair sheep and develop a feeding system based on characteristics of the ration, breed and environmental conditions prevailing in Latin American tropics. Ration formulation with precise knowledge of the energy requirements of hair sheep and the concentration of ME (and its efficiency of utilization), of the feedstuffs available in the

La falta de información es más evidente para el caso de las ovejas, ya que existen muy pocos informes sobre la determinación de las necesidades energéticas en sus diferentes etapas fisiológicas (mantenimiento, gestación, lactancia), siendo estos componentes fundamentales de los sistemas de producción.

Además, se sabe que la alimentación de las ovejas antes y después de parto tiene un efecto sobre la supervivencia y crecimiento de las crías.

Por lo tanto, es necesario continuar con los trabajos que se centren en la determinación de las necesidades de nutrientes de ovinos de pelo y desarrollar un sistema de alimentación basado en las características de la ración, raza y condiciones ambientales que prevalecen en los

Cuadro 4. Eficiencia de utilización de la EM para mantenimiento (km) en ovinos de pelo Table 4. Efficiency of utilization of ME for maintenance (km) in hair sheep Breed or genotype Morada Nova growing males Santa Inês growing males Santa Inês growing males Santa Inês castrated males, growing, grazing Santa Inês growing males 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês Mean SD CV (%) SD= Standard deviation; CV= Coefficient of variation.

113

km

Reference

0.67 0.70 0.66 0.66 0.66 0.63 0.66 0.023 3.39

(8) (18) (4) (7) (20) (30)

Alfonso Juventino Chay-Canul, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

tropics, will have an influence on improvement in sheep production, by giving sheep the precise amount of feed that require without over or under estimating its requirements nor the energy value of feedstuffs. Ration formulation for sheep based on the precise knowledge of their requirement for maintenance and production, will contribute to reduce production costs, since there would probably be a lower waste (as heat increment) arising from ME absorbed from the GIT. Knowledge of energy requirements of hair sheep for the different physiological stages (maintenance, growth, pregnancy and lactation), is of paramount importance since these could be readily incorporated in different programs for ration formulation (CNSPS-S/SRNS) and with these, formulates rations that will satisfy the energy requirements of hair sheep kept under tropical conditions.

trópicos de América Latina. La formulación de dietas con conocimiento preciso de las necesidades de energía de ovinos de pelo y la concentración de EM y la eficiencia de utilización, de los alimentos disponibles en los trópicos, tendrá una influencia en la mejora en la producción, dándole a los ovinos la cantidad exacta de alimento que requieren sin sobreestimar o subestimar sus necesidades ni el valor energético de los alimentos.

La formulación basada en el conocimiento preciso de sus necesidades de mantenimiento y producción, contribuirá a reducir los costos de producción, ya que probablemente habría menor residuos (como el incremento de calor) derivados de la EM absorbida desde el tracto gastrointestinal.

El conocimiento de las necesidades energéticas de las oveja de pelo para las diferentes etapas fisiológicas (mantenimiento, crecimiento, embarazo y lactancia), es de suma importancia, ya que estos podrían incorporarse fácilmente en los diferentes programas de formulación de dietas (CNSPS-S/SRNS), para satisfacer los requerimientos de energía de los ovinos de pelo, en condiciones tropicales.

Energy requirements for weight gain and estimated kg The energy requirement for growth or weight gain (MEg or NEg), corresponds to the caloric value or gross energy of the protein and fat stored in the bodyl(23). The ARC(23) mentioned that rate of growth affects protein deposition which in turn affects NE requirements.

Composition of weight gain, expressed as empty body weight (EBW), is the main determinant of energy requirements for weight gain, which is estimated from energy retained in the body(15).

Moreover, the main factor determining the composition of gain in the mature stage, in which as the animal is closer to its adult weight, more fat (and energy) is stored in the gain.

Requerimientos de energía para ganancia de peso y Km estimado El requerimiento de energía para crecimiento o ganancia de peso (EMg o ENg), corresponde al valor calórico o energía bruta de la proteína y grasa almacenadas en el cuerpo del animal(23).

El ARC(23) menciona que la tasa de deposición de proteína afecta el crecimiento, que a su vez afecta los requerimientos de EN. La composición de la ganancia de peso, expresado como aumento de PCV (ganancia de PCV), es el principal factor determinante de las necesidades energéticas de ganancia de peso, que se estima de la energía retenida en el cuerpo(15). Por otra parte, el principal factor para la determinación de la composición de la ganancia en la etapa de madurez, en la que el animal está más cercano de su peso adulto, más grasa (y energía), es almacenamiento en la ganancia.

Ferrell and Oltjen(28) reported that ME in the ration is used with different efficiencies depending on the type of ration (ingredients), level of intake and the physiological function for which it is being utilized by the animal.

Tolkamp(29) reported that kg for rations of low to medium quality (such as those of tropical forages), is expected to be low. Tedeschi et al(35) mentioned that there are factors which may affect kg, pointing out that ration (energy density

Ferrell y Oltjen(28) informaron que la dieta se utiliza con diferente eficiencia dependiendo del tipo de ración (ingredientes), nivel de consumo 114

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICA

and volatile fatty acids molar proportions) and the composition of the weight gain are the most important issues; these authors concluded that the use of a combination of chemical composition of the body and energy concentration of the ration may be a better approach for the assessment of efficiency of utilization of ME for maintenance and growth.

Indeed, some authors(36,37) demonstrated that the main factor affecting kg is the composition of gain in the EBW; even when the level of ME interferes with kg, a ration with a high ME concentration, will induce a high fat content in the gain, therefore, the effect of the energy content of the ration is considered in the composition of the gain.

y la función fisiológica en que está siendo utilizada por el animal. Tolkamp(29) informó que para raciones de baja a mediana calidad (como los de forrajes tropicales), se espera una Kg baja. Tedeschi et al(35) mencionan que hay factores que pueden afectar Kg, señalando que la ración (densidad de energía y proporción molar de los ácidos grasos volátiles) y la composición de la ganancia de peso, son las cuestiones más importantes; estos autores concluyeron que el uso de una combinación de la composición química del cuerpo y la concentración de energía de la ración, puede ser un mejor enfoque para la evaluación de la eficiencia de la utilización de EM para el mantenimiento y crecimiento. Al respecto, algunos investigadores, demostraron que el factor principal que afecta Kg es la composición de la ganancia en la PCV(36,37); incluso cuando el nivel de EM interfiere con Kg, una ración con una alta concentración de EM inducirá un contenido alto de grasa en la ganancia.

On the other hand(36,37) these same authors did not find evidence of genetic background on NE requirements for weight gain, concluding that the effect of breed or genotype on NE for gain can be attributed to the different mature weights and to the precocity of fat deposition in the different breeds of cattle. Different mature weights of breeds, may determine different degrees of maturity in animals with the same absolute weight and the same rate of gain, high energy concentrations are expected in the gain of animals of breeds with low weight at maturity compared to that of late maturity breeds. In the present review, works with Morada Nova lambs(8,21) estimated values of 13.8 to 17.9 kJ NE/g gain and 7.0 to 9.2 kJ NE/g gain respectively, in animals weighing from 15 to 30 kg. Regadas-Filho et al(22) in Santa Inês growing male lambs reported values of 10.0 to 14.5 kJ NE/g gain in animals between 15 and 30 kg. Nonetheless, in Santa Inês growing male lambs found values of 6.0 to 9.0 kJ NE/g gain(7,20). Galvani et al(30) and Pereira et al(26) reported values of 9.3 to 14.7 and 9.2 to 11 kJ NE/g gain in 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês and Brazilian Somali lambs, respectively.

Using the values described above, it was found a mean value of 8.75 to 14.06 kJ NE/g gain in hair sheep of different breeds under tropical conditions of Latin America. Table 5 shows NE requirements for daily weight gain (MJ/animal/d)

En otros trabajos (36,37) estos autores no encontraron evidencia genética de requerimientos de EN para ganancia de peso, concluyendo que el efecto de la raza o genotipo en EN para ganancia puede ser atribuido a los diferentes pesos a la madurez, y a la precocidad en la deposición de grasa en las distintas razas de ganado. Diferentes pesos a la madurez de las razas, pueden determinar diferentes grados de madurez en los animales con el mismo peso absoluto y la misma tasa de ganancia; en la ganancia de peso de los animales de razas con bajo peso a la madurez en comparación con las razas de madurez tardía se esperan altas concentraciones de energía. En la presente revisión, trabajos con corderos Morada Nova(8,21) estiman valores de ganancia de 13.8 a 17.9 kJ EN/g y 7.0 a 9.2 kJ EN/g, en animales de peso comprendido entre 15 y 30 kg, respectivamente. Regadas-Filho et al(22) en corderos machos Santa Inês en crecimiento, reportaron de 10.0 a 14.5 kJ EN/g en animales entre 15 y 30 kg. Sin embargo, con este mismo tipo de animales, se encontraron valores de 6.0 a 9.0 kJ EN/g(7,20). Galvani et al(,30) y Pereira 115

Alfonso Juventino Chay-Canul, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

Cuadro 5. Requerimientos de EN para ganancia de peso (MJ/animal/d) en ovinos Santa Inés, Morada Nova, 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês y Somalí Brasileño con pesos entre 15 y 45 kg Table 5. NE requirements for weight gain (MJ/sheep/d) of Santa Inés, Morada Nova, 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês and Brazilian Somali hair heep weighing between 15 and 45 kg BW

ADG

(kg)

(g/d)

(8)

(7)

(18)

(34)

(20)

(30)

(26)

Mean

SD

CV

15

100 150 200 250 300

1.38 2.08 2.76 -

0.65 0.97 1.30

1.00 1.49 1.99 2.49

0.71 1.05 1.42 1.76 2.09

0.69 1.04 1.04 1.73

0.94 1.41 1.88 2.35 2.82

0.93 1.39 1.85 2.31 2.78

0.90 1.35 1.75 2.13 2.56

0.25 0.42 0.62 0.40 0.51

28.2 31.1 35.4 18.6 20.1

20

100 150 200 250 300

1.60 2.40 3.21 -

0.86 1.29 1.72

1.16 1.74 2.33 2.91

0.79 1.17 1.59 1.97 2.34

0.77 1.15 1.53 1.91

1.05 1.57 2.09 2.62 3.14

1.00 1.51 2.01 2.51 3.01

1.03 1.55 2.07 2.38 2.83

0.32 0.48 0.63 0.49 0.56

30.6 30.8 30.6 20.6 19.9

25

100 150 200 250 300

1.79 2.69 3.58 -

1.05 1.58 2.11

1.31 1.97 2.62 3.28

0.84 1.30 1.72 2.13 2.55

0.82 1.23 1.64 1.64

1.13 1.70 2.27 2.84 3.41

1.07 1.60 2.13 2.67 3.00

1.15 1.72 2.30 2.51 2.99

0.36 0.53 0.71 0.73 0.60

31.6 31.0 31.1 28.9 20.2

30

100 150 200 250 300

-

2.11 1.85 2.47

1.45 2.17 2.90 3.62 -

0.92 1.38 1.80 2.26 2.72

0.87 1.30 1.74 2.17

1.21 1.82 2.43 3.03 3.64

1.10 1.65 2.20 2.75 3.30

1.28 1.70 2.26 2.77 3.22

0.50 0.36 0.49 0.69 0.65

39.4 21.3 21.8 24.8 20.2

35

100 150 200 250 300

-

-

1.28 1.92 2.57 3.21 3.85

1.28 1.92 2.57 3.21 3.85

-

100 150 200 250 300

-

-

-

-

1.35 2.02 2.69 3.37 4.05

1.35 2.02 2.69 3.37 4.05

-

100 150 200 250 300

-

-

1.41 2.11 2.81 3.52 4.22

1.41 2.11 2.81 3.52 4.22

-

40

45

Reference

-

BW= Body weight; ADG= Average daily gain; SD= Standard deviation; CV= Coefficient of variation.

et al(26) informaron de 9.3 a 14,7 y 9.2 a 11 kJ EN/g para ganancia en corderos 1/2 Dorper x 1/2 Santa Inês y Somalí Brasileño, respectivamente. Utilizando los valores descritos anteriormente, se encontró un valor promedio de 8.75 a 14.06 kJ EN/g para ganancia en ovinos de pelo de diferentes razas en condiciones tropicales de América Latina. El Cuadro 5 muestra los requisitos de EN para

of hair sheep according to live weight and expected weight gain.

As regard to the efficiency of ME utilization for growth, it has been reported that in growing Pelibuey sheep, this value varies according to age and weight, being higher during the first stages of growth and decreasing as the animal approaches mature weight, due to a greater 116

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICA

fat deposition in body tissues(32). However, those authors also suggested that the greater demand may be due to the higher requirement of energy per unit weight gain. Table 6 shows estimations of kg in hair sheep. The kg reported for hair sheep ranged from 0.38(8) to 0.48(38).

The average kg value obtained for the purpose of this review was 0.42 ± 0.04.

ganancia de peso (MJ/animal/día) de ovinos de pelo según su peso vivo y ganancia de peso esperada.

Con respecto a la eficiencia de la utilización de EM para el crecimiento (Kg), se ha informado que en ovinos Pelibuey, este valor varía según la edad y peso, siendo mayor durante las primeras etapas de crecimiento y disminuyendo a medida que el animal se acerca a su peso maduro, debido a una mayor deposición de grasa en los tejidos del cuerpo(32). Sin embargo, estos autores también sugirieron que la mayor demanda puede ser debida al mayor requerimiento de energía por unidad de peso.

El Cuadro 6 muestra las estimaciones de Kg en ovinos de pelo. La Kg reportada para ovinos de pelo osciló entre 0.38 (8) y 0.48 (38), y el promedio obtenido con el propósito de esta revisión fue 0.42 ± 0.04.

Based on the data obtained in this review regarding the energy requirement of weight gain (MJ NE/animal/d) and kg (0.42), it was found that the energy requirements for weight gain (kJ ME/g gain) ranged from 20.8 to 33.5 (mean: 27.7). Similarly, it was reported that the mean values for the energy requirements for gain (MJ ME/animal/d) derived, were higher by 26 % than those previously reported for growing Pelibuey sheep(39), nonetheless, it is important to emphasize that the data of the present review and from others(39), average daily gain were closer of 100 g (5 % higher on average), compared to higher rates of gain.

Con base en los datos obtenidos en esta revisión, respecto a las necesidades de energía para ganancia de peso (MJ EN/animal/día) y Kg (0.42), se encontró que los requerimientos de energía para la ganancia de peso (kJ EM/g) oscilaron entre 20.8 y 33.5 (media: 27.7); Asimismo, se informó que los valores medios para las necesidades de energía para ganancia (MJ EM/animal/d) derivados, fueron superiores en un 26 % a los reportados previamente para ovinos Pelibuey en crecimiento(39), sin embargo, es importante destacar que los datos del presente trabajo, y de otros (39) , fueron cercanos, con ganancias de 100 g (5 % más en promedio), en comparación con mayores tasas de ganancia.

Energy requirements of grazing sheep In tropical regions, sheep production systems are usually mixed, where in most cases, animals (ewes mainly) are maintained grazing with or without supplementary feed. Feeding is based on the use of native and introduced grasses and shrubs; sheep farms have low production

Cuadro 6. Eficiencia de utilización de la EM para ganancia de peso (kg) en ovinos de pelo Table 6. Efficiency of utilization of ME for weight gain (kg) in hair sheep

Requerimientos de energía para ovinos en pastoreo En las regiones tropicales, los sistemas de producción ovina generalmente son mixtos, donde en la mayoría de los casos, los animales (ovejas principalmente) se mantienen en pastoreo con o sin alimentación suplementaria.

La alimentación se basa en el uso de gramíneas nativas e introducidas y arbustos; las

Breed or genotype

kg

Reference

Santa Inês males

0.43

(18)

Morada Nova, sheep

0.38

(8)

Santa Inés growing males

0.48

(20)

1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês

0.39

(30)

Mean

0.42

SD

0.044

CV (%)

10.82

SD= Standard deviation; CV= Coefficient of variation.

117

Alfonso Juventino Chay-Canul, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

explotaciones ovinas tienen bajos parámetros de producción y rentabilidad y baja tasa de adopción de nuevas tecnologías. Por esa razón es primordial la estimación de los requerimientos nutricionales de ovinos en pastoreo; sin embargo, hay pocos reportes de experimentos donde se hayan determinado. En este contexto, se menciona (40) , con corderos destetados Rambouillet x Pelibuey de 13.5 kg en pastoreo de Buffel (Cenchrus ciliaris), un requerimiento de energía para mantenimiento de 359 kJ EM/kg PC0.75/día. En otro trabajo(7) considerando un Km de 0.66, informaron una EMm de 470 kJ EM, por lo tanto ENm fue 310 kJ/kg PC0.75.

Asimismo, encontraron que en corderos de 3 a 4 meses de edad (machos castrados) de la raza Santa Inês de 15 a 30 kg de peso en pastoreo de buffel tenían un requerimiento de 18.2 kJ EM/g para ganancia de peso en corderos de 15 kg. En corderos de 20 kg, el requerimiento fue 24 kJ, en corderos de 25 kg el requerimiento fue 30 kJ y en los animales de 30 kg de 35 kJ. El valor estimado para Kg fue 0.42 al evaluar todos los pesos.

and profitability parameters and low rate of adoption of new technologies. For that reason estimation of nutrient requirement of grazing sheep must be of paramount importance.

However, there are few reports of experiments where nutrient requirements of grazing sheep have been determined. In this context(40), with Rambouillet × Pelibuey sheep recently weaned of 13.5 kg grazing Buffel (Cenchrus ciliaris) grass, found an energy requirement for maintenance of 359 kJ ME/kg BW0.75/d. On the other hand(7) considering a km of 0.66, reported a MEm of 470 kJ ME/kg, therefore NEm was 310 kJ/kg BW0.75. Similarly, reported that in lambs of 3 to 4 mo old (castrated males) of the Santa Inês breed of 15 to 30 kg live weight grazing buffel grass had a requirement of 18.2 kJ ME/g weight gain in lambs of 15 kg.

In lambs of 20 kg, the requirement was 24 kJ, in lambs of 25 kg the requirement was 30 kJ and in animals of 30 kg it was 35 kJ. The estimated kg value was 0.42 for all weights evaluated.

Empty body weight (EBW)

Peso corporal vacío (PCV)

Marcondes et al(36) suggested that the first step in the determination of energy requirements of ruminants is the conversion of shrunk BW (SBW) to EBW. Also, some authors mention(30), that the energy concentration in the body has usually been expressed as a function of EBW rather than SBW because interference by the gastrointestinal content is completely eliminated.

The EBW is equivalent to SBW minus the weight of the gastrointestinal contents. SBW is also defined as 96 % of full BW (kg) and defines EBW as: EBW = 0.85 × SBW (kg)(12,16,30).

Marcondes et al(36) sugirieron que el primer paso en la determinación de las necesidades energéticas de los rumiantes es la conversión de PC encogido (PCE, con ayuno de 16 a 24 h) a PCV. También se ha informado(30), que la concentración de energía en el cuerpo generalmente ha sido expresada como una función de PCV en lugar de PCE, debido a que la interferencia del contenido gastrointestinal es eliminada completamente. El PCV es equivalente a PCE menos el peso del contenido gastrointestinal. Según algunos autores(12,16,30), el PCE se define como el 96 % de PC lleno (kg) y definen PCV como: PCV= 0.85 × PCE (kg).

Nonetheless, to determine the EBW, sheep have to be slaughtered; for this reason, regression equations have been developed to estimate EBW from BW or SBW and include this information and thus contribute to updating with the data for estimation of some parameters required by nutritional models such as SRNS in order to predict the performance of hair sheep breeds(11,32).

Sin embargo, para determinar el PCV, los animales tienen que ser sacrificados; por esta razón, han desarrollado ecuaciones de regresión para estimar PCV a partir del PC o PCE, e incluir esta información, y así contribuir a la actualización con los datos para la estimación 118

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICA

Based on data reported(8,22,26,30,34,38), a linear regression equation was fitted.

de algunos parámetros requeridos por los modelos nutricionales como SRNS para predecir el desempeño de razas de ovejas de pelo(11,32).

(Equation 1): EBW= -1.80(±0.59***) + 0.89 (±0.02***) × SBW (R2= 0.98; MSE= 1.669; RSD= 1.292; P<0.0001; n= 51).

Basados en datos reportados en la literatura(8,22,26,30,34,38), se ajustó una ecuación de regresión lineal.

It was found that gastrointestinal fill was 10 % and the EBW was 90 % of BW in male animals.

The values found in the present work as regard to BW corresponding to EBW were higher to those reported in the literature(16,32). Also it was found that the relation BW/EBW was on average 1.23 for males.

(Ecuación 1): PCV= -1.80 (±0.59***) + 0.89 (±0. 02***) × PCE (R2= 0.98; MSE= 1.669; RSD= 1.292; P<0.0001; n= 51).

Se encontró que el contenido gastrointestinal fue 10 % y la PCV 90 % del PC en animales machos. Los valores encontrados en el presente trabajo en cuanto a PC correspondiente a PCV fueron superiores a los reportados en la literatura(16,32). También se encontró que la relación PC/PCV fue en promedio de 1.23 para los machos.

Regarding females, in adult Pelibuey ewes at different physiological stages the weight of the gastrointestinal content was approximately 19 % of SBW(11). Recently, (Chay-Canul, unpublished data) used a data set of 28 adult Pelibuey ewes with different BW and body condition score and when analyzed, the data conformed an equation:

Con respecto a las hembras, en ovejas Pelibuey adultas en diferentes estados fisiológicos, el peso del contenido gastrointestinal fue aproximadamente un 19 % de PCE(11). Recientemente, (Chay-Canul, datos inéditos) utilizando datos de 28 ovejas Pelibuey adultas con diferentes pesos y condicion corporal, se conformó la siguiente ecuación:

(Equation 2): EBW= -3.82 (±0.93***) + 0.92 (±0.02***) × SBW (R2= 0.96, MSE= 2.183, RSD= 1.477, P<0.0001; n= 71).

The EBW corresponded to 92 % of BW. Moreover, the relation BW/EBW was on average 1.22 for ewes.

(Ecuación 2): PCV= -3.82 (±0.93***) + 0.92 (±0.02***) × PCE (R2= 0.96, MSE= 2.183, RSD= 1.477, P<0.0001; n= 71).

Body composition and its relationship with energy requirements In order to estimate nutrient requirements it is important to know body composition and weight gain of sheep because these are directly related.

Fernandes et al(41) suggested that knowledge of body composition of the animals is of great relevance in studies of animal nutrition to determine nutrient requirements. Costa et al(21) and Maia et al(19) reported that the first step for determining nutritional requirements is to measure the body composition of the sheep, which may be obtained by direct or indirect methods. Although the direct determination of body composition by grinding and analyzing all body tissues is the most reliable method, it is expensive, time consuming, and laborious.

La PCV correspondió al 92 % de PC. Por otra parte, la relación PC/PCV fue en promedio 1.22 para ovejas.

Composición corporal y su relación con los requerimientos de energía Para estimar las necesidades de nutrientes es importante saber el aumento de peso y la composición corporal, porque estos están directamente relacionados. Fernandes et al(41) afirman que el conocimiento de la composición corporal de los animales es de gran relevancia en estudios de nutrición animal para determinar necesidades de nutrientes. Costa et al(21) y 119

Alfonso Juventino Chay-Canul, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

Maia et al(19) informan que el primer paso para la determinación de los requerimientos nutricionales es medir la composición corporal de los ovinos, que puede obtenerse por métodos directos o indirectos. Aunque la determinación directa de la composición corporal por molienda y análisis de todos los tejidos del cuerpo es el método más confiable, es caro, lento y laborioso.

Sheep body composition is an important factor when determining nutritional requirements, since the body is basically composed of water, protein, fat and minerals, in proportions that vary according to breed, age, rate of growth, sex and nutrition, among others(34).

In Morada Nova lambs weighing 15.23 to 25.43 kg, reported that the body composition (% EBW) varied from 70.14 to 64.61 % water, 18.14 to 18.17 % crude protein, 6.7 to 12.1 % fat and 7.28 to 9.50 MJ/kg EBW(8). Those authors also reported that the concentration of crude protein was reduced from 181.76 to 178.74 g/kg EBW when the BW of animals increased from 15 to 25 kg. Others(34), informed that the energy and fat contents of the EBW increased from 6.86 MJ/kg and 79.38 g/kg EBW, to 8.83 MJ/kg and 123.73 g/kg of EBW, respectively, as the BW of the animals increased from 15 to 30 kg; a quadratic effect was also observed for the concentrations of water and fat with increasing EBW and the percentage of protein showed a tendency to decrease linearly, representing a decrease of 0.10 percentage points for each kilogram increase in EBW.

La composición corporal de los ovinos es un factor importante para determinar los requerimientos nutricionales, ya que el cuerpo se compone básicamente de agua, proteína, grasa y minerales, en proporciones que varían según la raza, edad, tasa de crecimiento, el género y nutrición, entre otros(34).

En corderos Morada Nova de 15.23 a 25.43 kg se reportó que la composición corporal (% PCV) varió de 70.14 a 64.61 % agua, 18.14 a 18.17 % de proteína cruda, de 6.7 a 12.1 % grasa y 7.28 a 9.50 MJ/kg PCV (8) . Los autores informaron también que la concentración de proteína bruta se redujo de 181.76 a 178.74 g/kg PCV cuando el PC de los animales aumentó de 15 a 25 kg. Asimismo, otros autores(34), informaron que el contenido de energía y grasa en el PCV aumentó de 79.38 g/kg PCV, a 8.83 MJ/kg, 6.86 MJ/kg y 123,73 g/kg, respectivamente, conforme el PV de los animales aumentó de 15 a 30 kg; también se observó un efecto cuadrático para las concentraciones de agua y grasa con el aumento de PCV, y el porcentaje de proteínas mostró una tendencia a disminuir linealmente, presentando una disminución de 0.10 puntos porcentuales por cada kilo de incremento de PCV.

In Santa Inês lambs(22), reported that the energy and fat contents of the EBW of the sheep increased from 7.99 MJ/kg and 85.16 g/kg of EBW, respectively, to 11.63 MJ/kg and 221.23 g/kg, as the BW increased from 15 to 30 kg; they also observed a quadratic effect for the concentrations of water, fat, and energy with increasing EBW and informed that the percentage of crude protein showed a tendency to decrease linearly, representing a decrease of 0.12 percentage points for each kilogram increase in EBW, from 15 to 30 kg. Those authors, concluded that the net energy requirement for EBW gain increased with increasing body weight, due to a parallel increase in the quantity of fat deposited per kilogram gained. Correspondingly, some authors(38), found that the crude protein content of the body decreased but fat and energy body content increased as the EBW increased from 15 to 45 kg. Similar results(7) mention that the

En corderos Santa Inês(22), se encontró que el contenido de energía y grasa del PCV aumentó de 7.99 MJ/kg y 85.16 g/kg de PCV, respectivamente, a 11.63 MJ/kg y 221.23 g/kg, conforme el PV aumentó de 15 a 30 kg; también se observó un efecto cuadrático para las concentraciones de agua, grasa y energía con el aumento de PCV; mencionan que el porcentaje de proteína cruda mostró una tendencia a disminuir linealmente, de 0.12 120

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICA

puntos porcentuales por cada kilogramo de incremento de PCV, de 15 a 30 kg. Los autores concluyeron que los requerimientos de energía neta para PCV aumentaron con el aumento de peso corporal, debido a un aumento paralelo en la cantidad de grasa depositada por kilogramo de ganancia. En consecuencia, algunos autores(38), mencionan que el contenido de proteína cruda del cuerpo disminuyó, pero el contenido de grasa y energía del cuerpo aumentaron conforme el PCV aumentó de 15 a 45 kg. Resultados similares mencionan que los niveles de suplementación y valores PCV afectaron positivamente contenidos de MS en la PCV de 31.15, 35.18 y 36.19 %(7). Sin embargo, el contenido de proteína cruda en la PCV disminuyó con la suplementación. Esto puede explicarse por la mayor ganancia de PC y los depósitos de grasa con el aumento en nivel de suplementación. El contenido de energía en el PCV varió de 6.23 a 8.66 MJ/kg PCV. La concentración de proteína cruda disminuyó de 212 a 180 g/kg PCV cuando el PC aumentó de 15 a 30 kg. El contenido de grasa en corderos de 15 a 30 kg osciló entre 17.3 y 103.2 g/kg PCV. Estos autores concluyeron que el requisito de proteína disminuyó y el requerimiento de energía aumenta con el aumento de peso corporal.

supplementation levels and EBW values affected positively DM content in the EBW from 31.15 to 35.18 and to 36.19 %. However, the crude protein content in the EBW decreased with supplementation ( P <0.05). This can be explained by the higher BW gain and fat deposition with the increase in supplementation level. The energy content in the EBW ranged from 6.23 to 8.66 MJ/kg EBW. The crude protein concentration decreased from 212 to 180 g/kg EBW when the body weight increased from 15 to 30 kg. The fat contents in 15 to 30 kg BW lambs ranged from 17.3 to 103.2 g/kg EBW. These authors concluded that the protein requirement decreased and the energy requirement increased with the increase in body weight.

Galvani et al (30) encontraron que la concentración de grasa en la ganancia (g/kg de ganancia del PCV), aumentó con el aumento en el PV de los corderos, y que la cantidad de proteína cruda en la ganancia no fue afectada por el peso al sacrificio. Pereira et al(26) con corderos Somalí Brasileño, informaron que la energía del animal y el contenido de grasa del PCV aumentaron de 11.20 MJ/kg y 208.54 g/kg a 13.54 MJ/kg y 274.95 g/kg de PCV, respectivamente, conforme el PV aumentó de 13.0 a 28.70 kg.

Figure 1. Body composition of male hair sheep as a function of empty body weight (EBW)

Galvani et al(30) found that fat concentration in the gain (g/kg EBW gain), increased with an increase in the BW of the lambs and that the amount of crude protein in the gain was not affected by slaughter weight. Pereira et al(26) with Brazilian Somali lambs, reported that the animal’s energy and EBW fat contents increased

Figure 1. Composición corporal de ovinos de pelo machos como función del peso corporal vacío (EBW)

80

C o n ce n tra tio n in E B W (% )

60

Water (%) Fat (%) Protein (%) Ash (%) Energy (MJ)

40

20

0

Con los datos obtenidos en la presente revisión, la composición corporal de ovinos de pelo se relacionó con el PCV y se ajustaron tres ecuaciones para predecir la composición corporal (Figura 1). Las ecuaciones ajustadas fueron:

5

10

15

20

25

EBW (kg) (Data from references: 7, 8, 22, 30, 34 and 38)

121

30

35

40

45

Alfonso Juventino Chay-Canul, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

Ecuación (3): % agua= 72.881 (±1.022***)0.385 (±0.044***) × PCV (R2= 0.67; CME= 5,558; DER= 2.357; P<0.0001; n= 39).

from 11.20 MJ/kg and 208.54 g/kg to 13.54 MJ/kg and 274.95 g/kg of EBW, respectively, as the BW increased from 13.0 to 28.70 kg.

Ecuación (4): % grasa= 3.62 (±1.22***) + 0.460 (±0.05***) × PCV (R2= 0.67; CME = 7.929; DER= 2.815; P<0.0001; n= 39).

Using the data obtained in the present review, the body composition of hair sheep was plotted against the EBW, and three equations were fitted to predict body composition (Figure 1). The equations fitted were:

Ecuación (5): Energía (MJ/kg PCV)= 3.322 (±1.108***) + 0.449 (±0.098***) × PCV-0.006 (±0.002***) × PCV2 (R2= 0,71; CME= 0.976; DER= 0.988; P<0.0001; n= 39). Sin embargo, no se ajustaron ecuaciones para proteína cruda y cenizas del cuerpo.

Equation (3): % Water= 72.881 (±1.022***) 0.385 (±0.044***) × EBW (R2= 0.67; MSE= 5.558; RSD= 2.357; P<0.0001; n= 39).

Equation (4): % Fat= 3.62 (±1.22***) + 0.460 (±0.05***) × EBW (R2= 0.67; MSE= 7.929; RSD= 2.815; P<0.0001; n= 39).

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES GENERALES

Equation (5): Energy (MJ/kg EBW)= 3.322 (±1.108***) + 0.449 (±0.098***) ×EBW -0.006 (±0.002***) ×EBW2 (R2= 0.71; MSE= 0.976; RSD= 0.988; P<0.0001; n= 39). Nonetheless, for body crude protein and ash, no equations were adjusted.

Existen pocos estudios disponibles sobre la evaluación de los requerimientos nutricionales de los ovinos de pelo. Los estudios encontrados muestran gran variación con respecto a los requerimientos de energía para los ovinos, siendo el promedio de EMm para hembras de 419 ± 129 kJ/kg PC0.75 y para machos 388 ± 123 kJ/kg PC0.75. La eficacia de la utilización de EM para mantenimiento (Km) y ganancia ( K g) fueron 0.66 ± 0.02 y 0.42 ± 0.04, respectivamente.

GENERAL CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS There are few studies available concerning the assessment of the nutrient requirements of hair sheep. Those studies show great variation regarding the energy requirements for ewes, being the average MEm 419 ± 129 kJ/kg BW0.75 and for the male 388 ± 123 kJ/kg BW0.75. The efficiency of ME utilization for maintenance (km) and gain (kg) were 0.66 ± 0.02 and 0.42 ± 0.04, respectively.

Algunos autores han informado que estos requerimientos son en algunos casos superiores en comparación con los reportados previamente en sistemas energéticos de América del Norte y Europa para razas de lana(15,23,24,42). Sin embargo, otros autores han reportado que estos requerimientos son más bajos en comparación con esos sistemas. Información con respecto a requerimientos de EM para mantenimiento y producción, y la variación existente en esas estimaciones es escasa para las razas de ovinos de pelo. Se ha informado que es probable que existan diferencias en los requisitos de EM para mantenimiento en ovinos de diferentes razas y tipos (de pelo vs lana); si esto es así, entonces habria una oportunidad para seleccionar las ovejas con el más bajo requerimiento de EM para mantenimiento y con ello, aumentar la

Some authors have reported that such requirements are in some cases higher compared to those previously reported in North American and European energy systems(15,23,24,42) for wool breeds. However, other authors have reported that these requirements are lower compared to those systems. Information regarding ME requirements for maintenance and production and the variation existing in such estimates is scarce for the breeds of hair sheep.

122

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICA

eficiencia de la producción de corderos. Por lo tanto, es importante determinar las necesidades de energía de diferentes razas de ovinos de pelo y la eficiencia con la que utilizan la EM absorbida desde el tracto gastrointestinal. Para desentrañar algunas de los cuestionamientos anteriores, será necesario construir una unidad calorimétrica en México con la infraestructura adecuada y equipos para medir indirectamente el calor resultante de las diferentes fuentes en el animal. Esta instalación no necesariamente ha de ser extremadamente costosa, las cajas de cabeza para mediciones calorimétricas en cabras del Instituto de investigación en la Universidad de Langston “Kika de la Garza”, Estados Unidos, son un buen ejemplo de una unidad calorimétrica de bajo costo, eficiente, para pequeños rumiantes.

It has been reported that it is likely that differences exist in the ME requirements for maintenance in ewes of different breeds and type (hair vs wool); if this is so, then there would be an opportunity to select those ewes with the lowest ME requirement for maintenance and with this, increase the efficiency of mutton production. Thus, it is important to determine the energy requirement of different breeds of hair sheep and the efficiency with which they utilize ME absorbed from the gastrointestinal tract. To unravel some of the questions above, it will be required to build a calorimetric unit in Mexico with the appropriate infraestructure and equipment to measure indirectly heat arising from the different sources within the animal.

This facility has not necessarily be extremely expensive, the head-boxes for calorimetric measurements in goats at the “Kika de la Garza” Research Institute in Langston University, United States, are a good example of a low-cost, efficient, calorimetric unit for small ruminants.

Esta revisión intentó identificar las áreas potenciales de investigación donde se requieren los conocimientos fundamentales para aumentar la eficiencia energética de producción de ovinos de pelo en las regiones tropicales de América Latina. Parece evidente que debe hacerse hincapié en enfoques experimentales que permitan la identificación de animales con el más bajo consumo residual y requerimientos de energía para mantenimiento, así como la mayor eficiencia de utilización de EM para mantenimiento, aumento de peso, gestación y lactancia. El conocimiento de estos valores puede ayudar a los nutricionistas a formular raciones prácticas con una mejor base científica que en la actualidad. La identificación e incorporación de las ovejas más eficientes en los sistemas de producción puede eventualmente, causar un aumento en la productividad y rentabilidad para los agricultores de los países en desarrollo de las regiones tropicales del mundo.

This review attempted to identify potential areas of research where fundamental knowledge is required in order to increase energetic efficiency of hair sheep production in the tropical regions of Latin America. It seems apparent that emphasis must be given to experimental approaches which allow identification of animals with the lowest residual feed intake and energy requirement for maintenance as well as the highest efficiency of ME utilization for maintenance, weight gain, pregnancy and lactation. The knowledge of those values may help nutritionists to formulate practical rations with a better scientific base than at present.

The identification and incorporation of the most efficient sheep in production systems may eventually lead to an increase in productivity and profitability for farmers in developing countries of the tropical regions of the world.

End of english version

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ADAPTACIÓN DE M. SMEGMATIS Y SU EFECTO EN LA EXPRESIÓN DE ESAT-6 Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):127-139

Adaptación de Mycobacterium smegmatis ante el agotamiento de nutrientes y su efecto en la expresión de esat-6 Adaptation of Mycobacterium smegmatis to nutrient depletion and its effect on esat-6 expression Héctor M. López-Péreza,d, Sixto Velarde-Félixb, Idalia Enriquez-Verdugoa, Rosa Xicotencatl-Palaciosc,d, Soila M. Gaxiola-Camachoa

RESUMEN Cuando los recursos son escasos, las micobacterias detienen su crecimiento para dar paso a los genes de la adaptación.

Contrariamente, cuando el crecimiento continúa bajo condiciones de estrés, se activan genes específicos de redes metabólicas para su protección. En este sentido, la proteína codificada por esat-6 (por sus siglas en inglés: early secretory antigenic target, 6 kDa) en Mycobacterium tuberculosis, actúa en la lisis del epitelio alveolar y membranas de los macrófagos para escapar e invadir otras células. Pero puede tener otras funciones, tales como interferir en el contacto célula-célula y transferir su ADN. En M. smegmatis, el sistema ESX-1 (por sus siglas en inglés: Secretion Ejectosoma BOX) facilita la secreción de la proteína ESAT-6, probablemente es sensible a uno o más nutrientes del medio de cultivo. Por lo que en el presente estudio se evalúan las condiciones de cultivo limitantes en nutrientes para el crecimiento de M. smegmatis y su relación con la expresión del gen esat-6. Los medios de cultivos probados fueron Hartmans de Bond medio mínimo (HdB), limitado en carbono (HdB<C), nitrógeno (HdB<N) y fosfato inorgánico (HdB<Pi). M. smegmatis se adapta a HdB medio mínimo, HdB<C y HdB<N y reanuda su actividad metabólica en medio fresco, pero no se expresa esat-6. En HdB<Pi M. smegmatis pierde su capacidad metabólica respecto a la resistencia alcohol-ácido y expresa esat-6. Por lo tanto, se proponen los medios de cultivo probados como modelo para la expresión génica bajo limitación por nutrientes.

PALABRAS CLAVE: Metabolismo, Aletargamiento, Adaptación, Estrés, Agotamiento de nutrientes, Mycobacterium smegmatis, esat-6.

ABSTRACT When resources are scarce, mycobacteria stop growing to make way for genes adaptation allow. Conversely, when growth continues under stress conditions, specific genes metabolic networks for protection are activating. In this sense, the protein encoded by esat-6 (early secretory antigenic target, 6 kDa) gene in Mycobacterium tuberculosis, acting in the lysis of alveolar epithelial and macrophage membranes to escape and invade other cells. But it can have other functions, such as interfering with cell-cell contact and transfer their DNA. In M. smegmatis, the ESX-1 (Secretion Ejectosoma BOX) system that facilitates secretion of ESAT-6 protein, probably it is sensitive to one or more nutrients of the culture medium. So it in the present study culture conditions limiting nutrient for growth of M. smegmatis are evaluated and relate the expression of esat-6. Culture media tested were minimal medium Hartmans Bond (HdB), carbon-limited (HdB<C), nitrogen (HdB<N) and inorganic phosphate (HdB<Pi). M. smegmatis HdB adapted to minimal medium, HdB<C and HdB<N and resume its metabolic activity in fresh medium, but not expressed esat-6. In HdB <Pi M. smegmatis loses its metabolic capacity for resistance acid-alcohol and expressed esat-6. Therefore, the culture media tested as a model for gene expression under nutrient limitation is proposed.

KEY WORDS: Metabolism, Dormancy, Adaptation, Stress, Nutrient depletion, Mycobacterium smegmatis, esat-6.

Recibido el 14 de mayo de 2014. Aceptado el 9 de septiembre de 2014. a

Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Autónoma de Sinaloa, Boulevard San Ángel S/N, Fraccionamiento San Benito, Predio las Coloradas, Culiacán, Sinaloa, México.

b

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias. México. velarde.sixto@inifap.gob.mx. Correspondencia al segundo autor.

c

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. México.

d

Centro de Innovación y Desarrollo Educativo. México.

Esta investigación fue financiada con recursos del Programa de Fomento y Apoyo a Proyectos de Investigación de la Universidad Autónoma de Sinaloa.

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Héctor M. López-Pérez, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):127-139

Mycobacterium tuberculosis complex is a genetically related group of Mycobacterium species that can cause tuberculosis. It characterizes for its ability to survive and grow within macrophages, in a stress environment provided with nutrient limitation and acidification(1-3). Its adaptation takes place through mechanisms that allow to detect its environment, regulating gene expression or repression during growth and reproduction(4), favoring its persistence in the host(5).

El agente causal de la tuberculosis está conformado por el complejo M. tuberculosis, capaz de sobrevivir y crecer dentro de los macrófagos, un ambiente hostil por la limitación de nutrientes y acidificación(1-3). Su adaptación se efectúa a través de mecanismos que le permiten detectar su entorno, regulando los genes que se expresan o reprimen durante su crecimiento y reproducción(4), que favorecen su persistencia en el hospedero(5).

Las células pueden responder a estímulos externos al iniciar un proceso que se da a partir de la unión de un efector a un receptor unido a la membrana. Este es un mecanismo de transducción, en el que los factores estresantes desencadenan una respuesta a través de la expresión de los genes, que preparan a las bacterias durante el agotamiento de los recursos(6,7). Hecho que se puede observar in vitro en la fase exponencial y son decisivos para la adaptación a las condiciones que se presenten en la fase estacionaria y sobrevivir(8).

Lo anterior, implica que la célula acumule protones del medio para mantener la homeostasis del pH en el citoplasma (9) , polifosfatos para la conversión en fuentes de energía(10). En M. tuberculosis y M. smegmatis, además se acumula el glutamato(11) y la asparagina(12) que se relaciona con la inducción del aletargamiento de M. tuberculosis(13).

The cells can respond to external stimuli by initiating a process derived from the binding of an effector to a receptor joined with the membrane. This is a transduction mechanism in which stress factors can trigger a response through gene expression, preparing the bacteria during nutrient depletion(6,7). A fact that can be observed in vitro during the exponential phase and is decisive for adaptation to conditions present in the stationary phase and survival(8). This involved that the cell accumulate protons from the environment to maintain pH homeostasis in the cytosol(9) and polyphosphate to sustain energy(10). In addition, glutamate also accumulates in M. tuberculosis and M. smegmatis(11) and asparagine(12), which is associated with induction dormancy of M. tuberculosis(13).

The bacilli respond to stress conditions due to nutrient depletion, acid pH, and reactive oxygen and nitrogen species, caused by their growth in macrophages(7,8,14). In order to respond to these stimuli, mycobacteria secrete enzymes, such as ESAT-6 and CFP-10(2,15), which in the cells of the host, act in necrosis processes, such as lysis of alveolar epithelium and membranes of macrophages, induction of DNA fragmentation and permeability of mitochondrial membranes(15).

Among the metabolic functions of mycobacteria, they regulate the transfer of DNA(16).

Los bacilos tuberculosos responden a situaciones de estrés por agotamiento de nutrientes, pH ácido, especies reactivas de oxígeno y nitrógeno causado por su crecimiento en los macrófagos(7,8,14). Para responder a estos estímulos, las micobacterias secretan enzimas como ESAT-6 y CFP-10(2,15), que en las células del hospedero, actúan en los procesos de necrosis, tales como la lisis del epitelio alveolar y membranas de los macrófagos, induce la fragmentación del ADN y la permeabilidad de la membrana de las mitocondrias(15). Entre las funciones metabólicas de las micobacterias, se propone que regulan la transferencia de ADN(16).

M. smegmatis mc2155, mutant of M. smegmatis wild-type strain, is 10 to 100 times more efficiently transformed with plasmid vectors, for use in the analysis of mycobacteria function(17).

M. smegmatis mc2155, mutante de la cepa silvestre M. smegmatis, es 10 a 100 mil veces 128

ADAPTACIÓN DE M. SMEGMATIS Y SU EFECTO EN LA EXPRESIÓN DE ESAT-6

más eficiente transformada con plásmidos, utilizada en el análisis de la función de las micobacterias(17). Por su rápido crecimiento se ha propuesto como modelo para entender los cambios que promueven la adaptación(18) y la persistencia de las micobacterias patógenas(19).

Comparte 12 de 19 genes de virulencia con M. tuberculosis(20), entre los que se encuentran los genes esat-6 y cfp-10, que codifican para las proteínas correspondientes secretadas por el sistema ESX-1 (por sus siglas en inglés: Secretion Ejectosoma BOX)(21). Converse y Cox(22) observaron el efecto de los medios de cultivo en el sistema de secreción ESX-1, por lo que proponen que este sistema puede ser sensible a uno o más nutrientes del medio de cultivo.

Because of its fast growing, it has been proposed as model for understanding the changes that promote adaptation (18) and persistence of pathogenic mycobacteria(19). It shares 12 out of 19 virulence genes with M. tuberculosis(20), among them are esat-6 and cfp-10 genes, which encode corresponding proteins secreted by the Secretion Ejectosoma BOX(21). Converse and Cox(22) observed the effect of culture media in the ESX-1 secretion system, for which they suggest that this system can be sensitive to one or more culture media nutrients.

During the adaptation process, genes related to specific metabolic functions are expressed as a response to stress caused by nutrient depletion (23) . The adaptation of cultured mycobacteria can be observed after the stationary phase, changing to fresh culture medium where they resume their activity; therefore, in the present study, the limiting nutrient conditions for the growth of M. smegmatis and its relationship with esat-6 gene expression was evaluated.

Durante el proceso de adaptación, los genes relacionados con redes metabólicas específicas se expresan como una respuesta al estrés ocasionado por la privación de nutrientes(23).

La adaptación de las micobacterias cultivada se puede observar después de la fase estacionaria, al cambiarse a un medio de cultivo fresco reinician su actividad. Por lo que en el presente estudio se evalúan las condiciones de cultivo limitantes de nutrientes para el crecimiento de M. smegmatis y su relación con la expresión del gen esat-6.

M. smegmatis mc2155, was grown at 37 °C in Middlebrook 7H11 agar. The initial aliquots of test culture and untreated control cultures were obtained by inoculum of a M. smegmatis colony in 10 ml of liquid Middlebrook 7H9 medium and was grown for 24 h until mid-log phase (0.8-1.0 DO at 600 nm).

M. smegmatis mc2155, se creció rutinariamente a 37 ºC en Middlebrook 7H11. Las alícuotas iniciales de los medios de cultivo testigos y probados, se obtuvieron por inóculo de una colonia de M. smegmatis en 10 ml de medio líquido Middlebrook 7H9 y se creció por 24 h hasta media fase logarítmica (0.8-1.0 DO a 600 nm).

The culture media used as control for comparing the metabolic behavior of bacilli and expression of esat-6 gene and Sauton’s medium without zinc, both supplemented with 0.5 and 6% of glycerol, respectively, and 0.05 % of Tween 80, for being media in which esat-6 gene expresses(22). The initial inoculation was carried out using 100 µl of the initial culture in 225 ml flasks with 150 ml of liquid medium and were incubated at 37 °C and agitated at 250 rpm.

Los medios de cultivo utilizados como control para comparar el comportamiento metabólico de los bacilos y expresión del gen esat-6 fueron 7H9 y Sauton sin zinc, suplementados ambos con 0.5 y 6 % de glicerol respectivamente y 0.05 % de Tween 80, por ser medios en los que expresa el gen esat-6(22). La inoculación inicial se efectuó con 100 µl del cultivo inicial en frascos de 225 ml con 150 ml de medio

All assay culture media for nutrient limitation derived from HdB minimal medium; pH 7 was adjusted and 0.2 % of glycerol and 0.05 % of 129

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líquido, se incubaron a 37 ºC, en agitación a 250 rpm.

Tween 80 were added, except for depletion of C (HdB<C) to which glycerol was limited to 0.08 % (v/v). For the experiments in which nitrogen depletion was required (HdB<N), (NH4)2SO4 was used at a concentration 100 times lower (0.15 mM) than the utilized for HdB minimal medium. For the experiments limited 100 times lower in Pi (HdB<Pi), K2HPO4 was added at a final concentration of 0.089 mM (0.0155 g L -1 ) and NaH 2 PO 4 , at a concentration of 0.0708 mM (0.085 g L-1), for replacing the loss of buffer capacity, 3-(Nmorpholino) propanesulfonic acid (MOPS) 50 mM was added(24). The growth and stationary phases of all cultures were monitored at 600 nm (OD600), until 144 h and final pH was recorded.

Todos los medios de cultivo probados para la limitación de nutrientes se derivan del medio mínimo HdB, se ajustó el pH 7, se adicionó, 0.2 % de glicerol, 0.05 % de Tween 80(24), excepto para provocar el agotamiento de C (HdB<C) al que se limitó el glicerol a 0.08 % (v/v). Para los experimentos en los que se requirió el agotamiento de nitrógeno (HdB<N), se usó (NH4)2SO4 a una concentración 100 veces menor (0.15 mM) que el usado para el medio mínimo HdB. Para los experimentos limitados 100 veces menos en Pi (HdB<Pi), se adicionó K2HPO4 a una concentración final de 0.089 mM (0.0155 g L-1) y NaH2PO4 a una concentración de 0.0708 mM (0.085 g L-1), para reemplazar la pérdida de capacidad amortiguadora se agregó ácido propanosulfónico 3-(Nmorfolino) (MOPS) 50 mM(24). La fase de crecimiento y estacionaria de todos los cultivos se monitoreó a 600 nm DO, hasta las 144 h y se registró el pH final.

The predicted fragment incorporating esat-6 gene was obtained by amplification of M. smegmatis genomic DNA, using primers: F-5’ACAGGTATGGA ATTTCGCCG-3’, R-5’-CAGGCAAACATTCCCGTGA-3’, which were designed using the Oligo TM Software DNA Star Program. For conducting the identification by enzymatic sequencing, the amplified product was purified by a protocol based on silica columns (QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN®); the amplified fragment was observed in agarose gel at 1.2 % through a UV- light transilluminator and it was cut with a sterile scalpel, carrying out the aforementioned protocol. The quality and quantity of purified DNA was observed by agarose gel and this amplified sample was sent for sequencing. This process was carried out at the Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO) of the Centro de Investigación y Estudios Avanzados (CINVESTAV), Unidad Irapuato, Guanajuato, México, of the Instituto Politécnico Nacional (IPN), based on the ddNTPs method(25), using the 3730 XL DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA) and the kit Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

El fragmento predicho del gen esat-6 se obtuvo por amplificación del ADN de M. smegmatis a partir de los iniciadores: F-5’ACAGGTATGGAAT TTCGCCG-3’, R-5’-CAGGCAAACATTCCCGTGA-3’, los cuales se diseñaron con el programa Oligo TM Software DNA Star Program. Para llevar a cabo la identificación mediante secuenciación enzimática, el producto amplificado se purificó mediante un protocolo a base de columnas de silica (QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN®), para ello, el fragmento amplificado se visualizó en el gel de agarosa al 1.2 % a través de un transiluminador de luz UV y se cortó mediante un bisturí estéril, llevando a cabo el protocolo mencionado. La calidad y la cantidad de ADN purificado se observó mediante un gel de agarosa y se procedió a enviar esta muestra amplificada para su secuenciación. El proceso de secuenciación se realizó en el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO) del Centro de Investigación y Estudios Avanzados (CINVESTAV), Unidad Irapuato, Guanajuato, México, del Instituto

For RNA extraction, M. smegmatis culture was adapted to the corresponding culture media until the beginning of the stationary phase (96 h).

130

ADAPTACIÓN DE M. SMEGMATIS Y SU EFECTO EN LA EXPRESIÓN DE ESAT-6

Politécnico Nacional (IPN), basado por el método ddNTPs(25), utilizando un secuenciador 3730 XL DNA, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y el kit Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

In this phase, 30 % of cells were cultured, washed with PBS and placed in 150 mL of fresh culture medium under the same nutritional conditions and they were incubated for 14 h.

RNA was extracted using TRlzol (Invitrogen®); it was observed by electrophoresis in agarose gels (1.2 %) using MOPS X (200 mM of MOPS, 50 mM of sodium acetate and 10 mM of EDTA, pH 7), and 3.15 % of formaldehyde.

Electrophoresis was ran in TAE buffer solution (40/1 mM pH 8.0).

Para la extracción de ARN el cultivo de M. smegmatis se adaptó en los medios de cultivo correspondientes hasta el inicio de la fase estacionaria (96 h). En esta fase se cosechó el 30 % de las células, se lavaron con PBS y se colocaron en 150 ml de medio de cultivo fresco con las mismas condiciones nutritivas, se incubaron por 14 h. El ARN se extrajo mediante el uso de TRIzol (Invitrogen®). Se observó por electroforesis en geles de agarosa (1.2 %) con MOPS X (200 mM de MOPS, 50 mM de acetato de sodio, y 10 mM de EDTA, pH 7) y 3.15 % de formaldehído. La electroforesis se corrió en una solución amortiguadora TAE (40/1 mM pH 8.0).

Northern blot hybridization was performed starting from 8 to 12 ng of extracted RNA, capillary transferred onto nylon membranes, sodium citrate and sodium chloride 20X. DNA was fixed using ultraviolet light for 5 min. The probe was derived from fragments of esat-6 gene, amplified by PCR and labelled as biotinylated alkaline phosphatase (Gene Images Alkphos Direct Labelling and Detection SystemGE Health Care®). Hybridization was performed all night and was revealed by autoradiography (Hyperfilm-MP autoradiography, Amersham Pharmacia Bioscience®)(26).

La hibridación Northern se efectuó a partir de 8 a 12 ng del ARN extraído, transferido por capilaridad descendente en membranas de nailon, en citrato de sodio y cloruro de sodio 20X. El ARN se fijó con luz ultravioleta durante 5 min. La sonda se elaboró a partir del fragmento del gen esat-6 amplificado por PCR y marcada con biotina acoplada a fosfatasa alcalina (Gene Images Alkphos Direct Labelling and Detection System-GE Health Care®). La hibridación se efectuó durante toda la noche y se reveló por autoradiografía (Hyperfilm-MP autoradiography, Amersham Pharmacia Bioscience®)(26).

The growth and pH data were obtained from six repetitions and Student’s t- test was used to express the results of the mean, standard error of the mean and corresponding comparisons between all M. smegmatis cultures(27).

In the testing culture media, M. smegmatis was observed with lower growth in HdB<N, HdB<C (0.659 and 1.697) media, in comparison to HdB minimal culture and HdB<Pi (2.170 and 1.982) (P<0.05). In addition, M. smegmatis in HdB<Pi has similar growth in HdB minimal culture (P>0.05) (Figure 1). This is indicative of a continuous growth in spite of stress conditions due to a decrease 100 times Pi. With the exception of HdB<Pi culture, in the rest of the testing and control media used, M. smegmatis resume its growth while changing it to a fresh culture medium, after 144 h of culture.

Los datos obtenidos del crecimiento y pH, se obtuvieron de seis repeticiones y se aplicó la prueba t de student, para expresar los resultados de la media, el error estándar de la media y las correspondientes comparaciones entre ellas de todos los cultivos de M. smegmatis(27).

En los medios de cultivo probados, se observó a M. smegmatis con crecimiento más bajo en los medios HdB<N, HdB<C (0.659 y 1.697)

In HdB<Pi culture medium, a relationship between growth, loss of acid-alcohol resistance 131

Héctor M. López-Pérez, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):127-139

Figura 1.

M. smegmatis crecido a 144 h en los medios de cultivo usados para el experimento HdB<N (0.659±0.12), Sauton (1.559±0.03), HdB<C (1.697±0.07), HdB<Pi (1.982±0.11) HdB mínimo (2.170±0.12) y 7H9 (2.638±0.12)

Figure 1.

M. smegmatis grown until 144 h in culture media used for experiments: HdB<N (0.659±0.12), Sauton (1.559±0.03), HdB<C (1.697±0.07), HdB<Pi (1.982±0.11) HdB minimal (2.170±0.12) and 7H9 (2.638±0.12)

of M. smegmatis, and pH was observed. That is, by higher number of culture hours (144), pH was decreased (5.4 ± 0.16), and the mycobacteria showed incapacity to recuperate its metabolic activity when the culture was changed to a fresh medium. This was observed in cumulus cells stained with the characteristic color of Ziehl-Neelsen technique, which disappeared from 100 h, until all cells were stained blue-colored (Figures 2a and 2b).

respecto al medio de cultivo HdB mínimo y HdB<Pi (2.170 y 1.982) (P<0.05). Además, M. smegmatis en HdB<Pi tiene un crecimiento similar al cultivo en HdB mínimo (P>0.05) (Figura 1). Lo que es indicativo de un crecimiento continuo a pesar de las condiciones de estrés por la disminución de 100 veces Pi. Con excepción del cultivo en HdB<Pi, en los demás medios de cultivo probados y los usados como controles, M. smegmatis reanuda su crecimiento al cambiarlo al medio de cultivo fresco correspondiente, después de 144 h de cultivo.

With the exception of HdB<Pi culture medium, mycobacteria in limited nutrient culture media have a slow growth until they reach the stationary phase. Additionally, bacteria grown in HdB<P gradually lose their resistance to acidalcohol from 96 h, not recovering it until 144 h of culture, when bacteria were changed to fresh medium. For which the 96 h were taken into consideration for changing M. smegmatis to fresh culture media, extract total RNA after 12 ± 1 h (Figure 3A) and perform Northern hybridization. This assay reveals that M. smegmatis cultured in HdB<C, HdB<N and HdB

En el medio de cultivo HdB<Pi se observó una relación entre el crecimiento de M. smegmatis, el pH y la pérdida de resistencia alcohol-ácido.

Es decir, a mayor número de horas de cultivo (144 h), se disminuyó el pH (5.4 ± 0.16), aunado a la incapacidad de recuperar su actividad metabólica cuando se cambia el cultivo a medio fresco. Esto se observó por los cúmulos de células teñidas con el color característico de la técnica Ziehl-Neelsen desaparecen partir de 132

ADAPTACIÓN DE M. SMEGMATIS Y SU EFECTO EN LA EXPRESIÓN DE ESAT-6

Figura 2. M. smegmatis a) Pérdida de resistencia alcohol-ácido en cultivo HdB<Pi a 96 horas. b) mismo cultivo cambiado a medio fresco 1 hora después, en el que se observa la recuperación de la capacidad de respuesta al alcohol-ácido Figure 2. M. smegmatis a) Loss of acid-alcohol resistance in HdB<Pi culture medium through 96 h. b) Same culture changed to fresh medium 1 h after, where recovery of capacity of response to acid-alcohol is observed a

b

minimal medium, does not express esat-6 gene.

However, the culture limited 100 times in Pi (Figure 3B, lane 7) did showed the expression, in a similar way as the culture media used as control (7H9 and Sauton, lanes 1 and 3, Figure 3B).

las 100 h hasta teñirse todas las células de color azul (Figuras 2a y 2b).

Con excepción del medio HdB<Pi, las micobacterias en los medios de cultivo restringidos en nutrientes tienen un menor crecimiento hasta la fase estacionaria. Además, las bacterias crecidas en HdB<Pi pierden paulatinamente su capacidad de resistencia al alcohol-ácido a partir de las 96 h, para no volver a recuperarla después de 144 h de cultivo, cuando las bacterias se cambiaron a medio fresco. Por lo que las 96 h se tomaron en cuenta para hacer los cambios de M. smegmatis a medios de cultivo fresco de todas las pruebas, extraer el ARN total 12 ± 1 h después (Figura 3A) y llevar a cabo la hibridación Northern.

Esta prueba revela que M. smegmatis cultivado en HdB<C, HdB<N, y HdB medio mínimo, no expresa el gen esat-6. Sin embargo, el cultivo limitado 100 veces en Pi (Figura 3B carril 7) si

The probe elaborated from esat-6 fragment was sequenced and was referred to GeneBank number SeqID KR363260. The homology comparison consulted on the database corresponds to esat-6 gene and is located in site 87 387 to 87 604 pb of the complete genome sequencing of M. smegmatis strain MC2155 (ID: gb|CP000480.1).

The mycobacterial capacity to accumulate energy sources, allows them to in vivo persist the infection phase(28). In this sense, in vitro mycobacteria achieve to adapt to nutrient depletion and survive for more than 650 d(24), due to energy accumulation of the stored 133

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se observó la expresión, de manera similar a los medios de cultivo usados como control (7H9 y Sauton carriles 1 y 3 de la Figura 3B).

compounds and degradation of unnecessary proteins and bacterial RNA(6). This can cause an emergency situation, where mycobacteria respond to the environment through genes which regulate adequate changes to the conditions imposed. Thus, the model of the present study allows to observe esat-6 gene expression of M. smegmatis in HdB<Pi.

La sonda elaborada a partir del fragmento de esat-6, se secuenció y se remitió al GeneBank con el número SeqID KR363260. La comparación homológica consultada en la base de datos corresponde al gen esat-6, y se localiza en el sitio del 87,387 a 87,604 pb de la secuencia del genoma completo de M. smegmatis cepa MC2155 (ID: gb|CP000480.1).

The adaptation of M. smegmatis for up to 144 h is evident in all culture media, with the exception of the mycobacteria grown in HdB<Pi (Figure 1).

For which it poses instability of the bacteria to the culture, because of its continuous growth with respect to the HdB minimal medium (P>0.05) and its inactive metabolism after 144 h when changing the mycobacteria to a fresh culture, where the loss of acid-alcohol capacity is observed (Figure 2: a and b); similar results in M. tuberculosis were obtained by Rifat et al(29), when limiting Pi in 7H9 medium.

La capacidad que poseen las micobacterias para acumular las fuentes de energía, les permiten persistir in vivo durante la fase de infección(28).

En este mismo sentido, las micobacterias in vitro logran adaptarse al agotamiento de los nutrientes y sobrevivir por más de 650 días(24), debido a la acumulación de energía de los compuestos almacenados y de la degradación de proteínas innecesarias y ARNm bacteriano(6).

Esto puede provocar una situación emergente, en la cual las micobacterias responden al

This suggests, under the proposed conditions, the existence of a state of emergency, in which

Figura 3.

M. smegmatis A) ARN total de la bacteria en los medios de cultivo: 1) 7H9, 2) HdB medio mínimo, 3) Sauton sin Zinc, 4) variable no controlada 5) HdB<N, 6) HdB<C, 7) HdB<Pi. B) Mismos carriles con los resultados de la hibridación Northern para el gen esat-6

Figure 3.

M. smegmatis A) Total RNA of the bacteria in culture media: 1) 7H9, 2) HdB minimal culture, 3) Sauton without zinc, 4) not controlled variable 5) HdB<N, 6) HdB<C, 7) HdB<Pi. B) Same lanes with the results of Northern hybridization for esat-6 gene 1

2

3

4

5

A)

B)

134

6

7

ADAPTACIÓN DE M. SMEGMATIS Y SU EFECTO EN LA EXPRESIÓN DE ESAT-6

M. smegmatis can have different forms of adaptation, where several signal transduction pathways are involved by which mycobacteria detect and give response to the environment.

These pathways can be associated with alarmone, which triggers the stringent response.

An indispensable mechanism for bacterial adaptation during the transition of the exponential phase to the stationary phase(30-32).

In this regard, in E. coli, lack of amino acids, carbon or Pi, is followed by an increase in ppGpp levels and polyphosphate accumulation(33,34).

ambiente a través de los genes que regulan los cambios adecuados a las condiciones impuestas.

De esta manera, el modelo del presente estudio permite observar la expresión del gen esat-6 de M. smegmatis en HdB<Pi. La adaptación de M. smegmatis hasta por 144 h es evidente en todos los medios de cultivo, excepto para las micobacterias crecidas por en HdB<Pi (Figura 1). Por lo cual se plantea la inestabilidad de la bacteria al cultivo, por su crecimiento continuo con respecto al cultivo en HdB mínimo (P>0.05) y su metabolismo inactivo después de 144 h al cambiar las micobacterias a un medio de cultivo fresco, en donde se observa la pérdida de la capacidad alcohol-ácido (Figura 2: a y b), resultados similares a los de Rifat et al(29) al restringir Pi en medio 7H9 en el crecimiento de M. tuberculosis.

Under limiting conditions of Pi and a sustained growth very near to HdB minimal medium (Figure 1), M. smegmatis apparently finishes the external sources and the internal energy reserves. In order to avoid this wear down of energy reserves, the stringent response has been proposed, which is characterized by ppGpp regulation that increases cyclopropanation(35), inhibition and synthesis of fat acids and phospholipids(36). Although the proposal of the stringent response is associated with the possibility of stabilization of the metabolism for adaptation of mycobacteria to stress conditions, that is, under conditions of abundance, polyphosphates can be used as donors of ADP, GDP and other reactions in which the Rel enzyme is involved, acting in the synthesis and hydrolysis of ppGpp(5,37). However, when there are not enough Pi reserves and energy reserves are minimal, it is probable that the stringent response fails so that M. smegmatis adapts and its metabolic state does not let it respond immediately to favorable changes to renew its growth, as it happened in the present study.

Esto hace suponer bajo las condiciones propuestas, la existencia del estado de emergencia, en el cual M. smegmatis puede tener diferentes formas de adaptación, donde se comprometen diversas rutas de transducción mediante los cuales las micobacterias detectan y dan una respuesta al medio. Estas rutas, pueden estar relacionados con la alarmona ppGpp que desencadena la respuesta estricta.

Un mecanismo indispensable para la adaptación de las bacterias durante la transición de la fase exponencial a la fase estacionaria(30-32). Al respecto, en E. coli, la carencia de aminoácidos, carbono, o Pi, se acompaña por el incremento de los niveles de ppGpp y se observan acumulaciones de polifosfatos(33,34).

Bajo las condiciones limitantes de Pi y un crecimiento sostenido muy cercano al HdB medio mínimo (Figura 1), M. smegmatis aparentemente termina los recursos externos y las reservas de energía interna. Para evitar este desgaste de las reservas de energía se ha propuesto la respuesta estricta, que se caracteriza por la regulación de ppGpp, que incrementa la ciclopropanación(35), la inhibición y síntesis de los ácidos grasos y los fosfolípidos(36). Aunque la propuesta de la respuesta estricta está

An increase in ppGpp levels and polyphosphates induces the transcription of 150 genes involved in the slowdown of growth and metabolism(38).

Rather, what has been found in this study with respect to Pi limitation in HdB, is that growth is maintained similar to HdB minimal medium (P<0.05), where Pi is not limited. Conversely, the esat-6 gene expression in HdB<Pi that occurred at mRNA level (Figure 3B), which is comparable to 7H9 and Sauton, although the 135

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protein encoded by this gene is only secreted in Sauton medium (22) , it is necessary to determine whether under HdB<Pi culture conditions, esat-6 protein is secreted. This protein has also been proposed as an ATPase(39), which modifies the properties of the phagosome compartment, where M. tuberculosis reside, as evidenced by aberrant retention or imperfect acquisition of a range of proteins of the host, including Rab GTPases(40,41) and vacuolar (H+)-ATPase(42).

relacionada con la posibilidad de la estabilización del metabolismo para la adaptación de la micobacteria a las condiciones de estrés, es decir, bajo condiciones de abundancia, los polifosfatos pueden servir como donadores de ADP, GDP, y otras reacciones en las que se involucra la enzima Rel que actúa en la síntesis e hidrólisis de ppGppp(5,37). Pero cuando no hay suficientes reservas de Pi y las reservas de energía son mínimas, es probable que la respuesta estricta falle para que M. smegmatis se adapte, y su estado metabólico no le permita responder de inmediato a los cambios favorables para reanudar su crecimiento, como lo sucedido en el presente estudio.

In M. smegmatis and M. tuberculosis , polyphosphates regulate ppGpp synthesis through transcriptional control of relA via mprAsig E- rel A pathway (37,43) . There are other systems of the two components that can contribute to the regulation of rel A. Consequently, it is proposed as prospect to study the relationships between regulators of Pidependent gene expression, including SenX3RegX3 and its relationship with genes that regulate the ESX-1 system and secretion of the proteins in M. smegmatis(44). Pang et al(45) confirm that in M. tuberculosis, esat-6 is not regulated by MprAB under growth in standard 7H9. Therefore, it is important to understand whether esat-6 of M. smegmatis is regulated by this system under Pi-limiting conditions. The studies of Rifat et al(29), focused on Pi limitation, show that esat-6 does not express in M. tuberculosis , when they limited Pi in 7H9 medium with L-glutamate as source of organic nitrogen; however, in this model, Pi is limited and the nitrogen source is inorganic. Pang et al(45) also report that at least there is an indirect regulation of ESX-1 by PhoPR. Thereon, it is suggested to research the relationships between Pi limitation and PhoPR, under the proposed model in this research.

Un incremento en los niveles de ppGpp y polifosfatos induce la transcripción de 150 genes involucrados en la disminución del crecimiento y el metabolismo (38) . Por el contrario, lo encontrado en la presente investigación respecto a la limitación de Pi en HdB, es que se mantiene el crecimiento, similar al del medio HdB mínimo en el que no se restringe el Pi (P<0.05). Por otra parte, la expresión de gen esat-6 en HdB<Pi que se dio a nivel de los ARNm (Figura 3B), que es comparable a 7H9 y Sauton, aunque la proteína codificada por este gen, se secreta sólo en el medio Sauton(22), lo que falta por determinar es si bajo las condiciones de cultivo HdB<Pi se secreta la proteína ESAT-6. Esta proteína, también se ha propuesto como una ATPasa(39), que modifica las propiedades del compartimiento del fagosoma donde reside M. tuberculosis , como lo evidenciado por la retención aberrante o adquisición defectuosa de un rango de proteínas del hospedero, entre las que se incluyen las Rab GTPasas(40,41) y la protón-ATPasa de la vacuola(42).

En M. smegmatis y M. tuberculosis , los polifosfatos regulan la síntesis de ppGpp a través del control de la transcripción de relA vía la ruta mprA-sigE-relA (37,43) . Existen otros sistemas de los dos componentes que pueden contribuir a la regulación de relA. Por lo que se plantea como perspectivas, estudiar las relaciones entre los reguladores de la expresión

In conclusion, M. smegmatis adapts to HdB minimal medium, HdB<C and HdB<N, and resumes its metabolic activity in fresh medium, but it does not express esat-6 gene. However, in HdB<Pi medium, M. smegmatis shows a continuous exponential growth phase, statistically similar to HdB medium (P<0.05), 136

ADAPTACIÓN DE M. SMEGMATIS Y SU EFECTO EN LA EXPRESIÓN DE ESAT-6

de los genes que dependen de Pi. Entre ellos, está SenX3-RegX3 y su relación con los genes que regulan el sistema ESX-1 y las proteínas de secreción en M. smegmatis(44). Pang et al(45), confirman que en M. tuberculosis, esat-6 no es regulado por MprAB bajo crecimiento en 7H9 normal. Por lo que se debe entender si esat-6 de M. smegmatis es regulado por este sistema en condiciones limitantes de Pi. Al respecto, los estudios de Rifat et al(29), enfocados a la restricción de Pi, demuestran que no se expresa esat-6 en M. tuberculosis, cuando restringieron el Pi en medio 7H9 con L-glutamato como fuente de nitrógeno orgánico; sin embargo, en este modelo se limita el Pi y la fuente de nitrógeno es inorgánico. Pang et al(45) también indican que al menos indirectamente hay una regulación del ESX-1 por PhoPR. Por lo que se propone investigar las relaciones entre la limitación de Pi y PhoPR, bajo el modelo propuesto en esta investigación.

manifesting a metabolic state in which it loses resistant-acid capacity in the stationary phase and expresses the esat-6 gene after changing the culture medium to 96 h into the corresponding fresh culture medium.

Consequently, the model of research for genetic expression under nutrient stress conditions is proposed.

ACKNOWLEDGEMENTS Special thanks to Dr. Clara Espitia Pinzon at the Instituto Nacional de Investigaciones Biomédicas of the UNAM for the contribution of M. smegmatis strain mc2155 and to the community of the Centro de Innovación y Desarrollo Educativo and Centro de Estudios Justo Sierra, Sinaloa State.

End of english version

En conclusión, M. smegmatis se adapta a HdB medio mínimo, HdB<C y HdB<N y reanuda su actividad metabólica en medio fresco, pero no expresa el gen esat-6. En cambio el medio de cultivo HdB<Pi, M. smegmatis presenta una fase de crecimiento exponencial continuo, estadísticamente similar al de HdB medio mínimo (P<0.05), manifiesta un estado metabólico en el cual pierde su capacidad ácido-resistente en la fase estacionaria y expresa el gen esat-6 después del cambio del medio de cultivo a 96 h al medio de cultivo fresco correspondiente. Por lo anterior se propone al modelo de investigación para la expresión génica en condiciones de estrés por nutrientes.

LITERATURA CITADA

AGRADECIMIENTOS A la Dra. Clara Espitia Pinzón del Instituto Nacional de Investigaciones Biomédicas de la UNAM por la aportación de la cepa M. smegmatis mc2155. A la comunidad del Centro de Innovación y Desarrollo Educativo y el Centro de Estudios Justo Sierra.

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