Rev_MVZ_Córdoba_18_1 by Revista MVZ Córdoba

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Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba EDITOR

Marco González T. M.Sc. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COEDITOR CO-EDITOR

Salim Máttar V. Ph.D. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

ASISTENTES DEL EDITOR - ASSISTANT EDITORS Luis Carlos Salgado A. Ing. German Arrieta B, M.Sc. Diva Santana C, Lic. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COMITÉ EDITORIAL EDITORIAL COMMITTEE James N. Mills Nelson Alvis G. Raúl Poutou P. Oscar Vergara G.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA U. de Cartagena, Cartagena, Colombia Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá Universidad de Córdoba, Colombia

COMITÉ CIENTIFICO SCIENTIFIC COMMITTEE Nicholas Komar Maria Aguero R. Joaquín Quilez C. Claudio C. Fonseca Priscila V. Logato Marcelo B. Labruna

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA N. Y. Medical College, USA U. de Zaragoza, España U. Fed. de Vioçosa, Brasil U. Fed. de Lavras, Brasil U. de São Paulo, Brasil

Jorge Salazar B. Juan Carulla F. Henry Grajales L. Claudia Jiménez E. Agustin Góngora O. Sandra Pardo C.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

Texas Tech. University U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. de Los Llanos, Colombia U. Nacional, Colombia

Revista MVZ Córdoba La Revista MVZ Córdoba es el órgano oficial de difusión de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba. La revista publica artículos originales de investigación, artículos técnicos, revisiones de literatura, revisiones de tema, comunicaciones breves e informes de casos que a juicio del Comité Editorial sean de interés. Los temas que publica la Revista MVZ Córdoba están relacionados con la medicina veterinaria, zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias. La revista está dirigida a los profesionales de la medicina veterinaria, zootecnia, salud pública humana y animal, acuicultura, biología, ciencias básicas biomédicas y biotecnología. Manuscritos y correspondencia: Enviar por correo electrónico al Editor o Coeditor de la Revista MVZ Córdoba. Correos: revistamvz@gmail.com revistamvz@unicordoba.edu.co Preparación de manuscritos: En la sección instrucciones a los autores, se puede obtener la información al respecto. También el documento se puede conseguir directamente en el sitio web: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Suscripción: La Revista MVZ Córdoba se publica cada cuatro meses y circula los meses de abril, agosto y diciembre. Los números de un año se agrupan en un volumen comenzando por el del mes de abril. La suscripción anual tiene un valor de $20.000 (US $10) para América Latina y el Caribe; US $15 para USA y Canadá; US $25 para otras regiones. Para suscribirse, diligencie el formulario que aparece al final de cada revista. Reproducción e impresos: Se autoriza la fotocopia de artículos para fines de uso académico o interno de las instituciones, citando la fuente. Para impresos dirija la solicitud a Revista MVZ Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Apartado aéreo No 354. Publicidad: La Revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba aclaran que la aceptación de publicidad no compromete la aprobación ni el respaldo de los productos o servicios que contraten pautas comerciales o de difusión. Teléfonos: (57) (4) 7569027, Montería, Colombia. Acceso en línea: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Disponible desde el volumen 5 número 1 enero-junio de 2000, texto completo, instrucciones a los autores y suscripciones.

Journal MVZ Córdoba The Journal MVZ Córdoba is the official diffusion organ of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of the Universidad de Córdoba. The Journal MVZ-Córdoba is devoted to the publication of original research articles, technical articles, literature revisions, especific reviews, short comunications and presentations of cases interest to Editorial Committee. The Journal publishes topics that are related with veterinary medicine, zootechny, aquaculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences and other subjects of interest of the agricultural sciences. The journal is directed to professionals of the veterinary medicine, zootechny, human and animal public health, aquaculture, biology, biomedical basic sciences and biotechnology. Papers and correspondence: Papers should be sent by via e-mail to the Editor or Coeditor of the Journal MVZ Córdoba. e-mails: revistamvz@gmail.com revistamvz@unicordoba.edu.co Preparation of manuscripts: Information can be found in instructions to authors section. The document can be also obtained at following web-site: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Subscription: The Journal MVZ Córdoba is published triannually and circulates the months of April, August and December. The numbers of one year group in a volume beginning with the month of April. The annual subscription has a value of US$10 for Latin America and the Caribbean; US $15 for USA and Canada; US$25 for other regions. To subscribe, obtain the form that appears at the end of each journal. Reproduction and forms: Photocopies of articles is authorized for institutional or academic purposes. To obtain printed copies, please address your request to: Journal MVZ Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Apartado aéreo No 354. Publicity: The Journal MVZ Córdoba and the Universidad de Córdoba clarify that commercial of advertising does not imply the approval nor backing of such respective products or services. Telephones: (57) (4) 7569027, Montería, Colombia. On-line access: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Available from the volume 5, number 1 January-June of 2000, full text, instructions to authors and subscriptions.

Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba

Categoría A1 Impresa desde Volumen 1, número 1, año 1994 Printed effective with Volume 1, issue 1, 1994 Publicación cuatrimestral Published triannualy ISSN 0122-0268 Rev.MVZ Córdoba © 2013 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Financiada por / Sponsored by: Universidad de Córdoba

Revista MVZ Córdoba Volumen 18

ENERO - ABRIL

Número 1

CONTENIDO EDITORIAL Marco González, Salim Mattar

3257

ORIGINAL Comparación de terapias sistémicas e intramamarias para el periodo seco en vacas lecheras Genaro Contreras, Walter Guterbock, Juan Muñoz, Phillip Sears

3259

La harina de cacahuete en el ensilaje de hierba Massai

Luciano Lima, Ronaldo Oliveira, Máikal Borja, Adriana Bagaldo, Edgar Faria, Thadeu Silva, Gleidson Carvalho, Cláudio Ribeiro

Determinación y prevalencia de Mycobacterium spp., en tilapia nilótica (Oreochromis niloticus) cultivada en Campeche, México Maurilio Lara-Flores, Sara Balan-Zetina, Ana Zapata, Karina Sonda-Santos

3265

3273

Leptospirosis porcina: prevalencia serológica en establecimientos productores de la república Argentina Jessica Petrakovsky, Julio Tinao, Jorge Esteves

3282

Parásitos y lesiones histopatológicas en lisa (Mugil incilis) de la Ciénaga del Totumo, norte de Colombia Jesús Olivero, Bárbara Arroyo, Ganivet Manjarrez

Efecto de la congelación y descongelación sobre movilidad espermática en Bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces, Characiformes)

3288

José Martínez, Sandra Pardo

3295

Desempeño reproductivo del bocachico Prochilodus magdalenae inducido dos veces en un mismo año Víctor Atencio, Eduardo Kerguelén, Elkin Naar, Robert Petro

3304

Seroprevalencia y factores de riesgo asociados a Neospora caninum en ganado lechero en el municipio de Pasto, Colombia Darío Cedeño, Bibiana Benavides

3311

Factores que afectan la preñez en vacas Brahman sometidas a inseminación artificial a tiempo fijo Adriana Correa-Orozco, Luis Uribe-Velásquez, Erik Pulgarín-Velásquez

3317

Las proteínas del plasma seminal incrementan la viabilidad espermática postdescongelación del semen de toros Sanmartinero

Fabián Rueda, Tatiana Garcés, Rocío Herrera, Luis Arbeláez, Miguel Peña, Henry Velásquez, Aureliano Hernández, Jaime Cardozo

3327

Revista MVZ Córdoba Volumen 18

ENERO - ABRIL

Número 1

Evaluación de implantes de norgestomet reutilizados en protocolos de sincronización del estro en vacas Brahman Luis Uribe-Velásquez, Adriana Correa-Orozco, Lina Cuartas-Betancurth, Diego Villamizar-Ramirez, Santiago Ángel-Botero

Estructura y diversidad genética en vacas Holstein de Antioquia usando un polimorfismo del gen bGH Juan Rincon, Albeiro Lopez, Julian Echeverri

Estructura genética poblacional del gen lactoferrina bovino en vacas Holstein del departamento de Antioquia Nancy Rodríguez, Albeiro López,Julián Echeverri

Micorrizas arbusculares asociadas al pasto angletón (Dichathium aristatum Benth) en fincas ganaderas del municipio de Tolú, Sucre-Colombia Alexander Pérez, Víctor Peroza

Caracterización del sacrificio de corderos de pelo a partir de cruces con razas criollas colombianas William Albarracín, Iván Sánchez

Expresión de enzimas relacionadas con el metabolismo de glucocorticoides en tejidos ováricos bovinos Michael López, Ayelen Amweg, Matías Stangaferro, Hugo Ortega

Especies promisorias para el ecoturismo en “Campo Aventura Roca Madre”, ToluviejoSucre, Colombia Alcides Sampedro, Angel Álvarez, Luz Domínguez,Ivonne Herrera

Análisis de las universidades colombianas de acuerdo con el ranking SCImago 2010-2012 Salim Mattar, Marco González, Luis Salgado

3336

3346

3355

3362

3370

3379

3387

3399

COMUNICACIÓN BREVE Variaciones hematológicas y de presión sanguínea en perros después de una picadura de abejas Jorge Muñoz, Verónica Arnes, Marcelo Mieres, Mirela Noro

Ingreso de psittacidos al centro de atención de fauna (CAV–CVS), durante los años 2007-2009 Juan Carrascal, Julio Chacón, Vivian Ochoa

3408

3414

CASO CLÍNICO Síndrome de Wooblers en un caballo

José Cardona, César Betancur, Jaime Alvarez

3420

Instrucciones para los autores

3425

Journal MVZ Córdoba Volume 18

JANUARY - APRIL

Issue 1

CONTENTS EDITORIAL Marco González, Salim Mattar

3257

ORIGINALS Comparison of systemic and intramammary dry cow treatments Genaro Contreras, Walter Guterbock, Juan Muñoz, Phillip Sears

3259

Peanut cake concentrations in massai grass silage

Luciano Lima, Ronaldo Oliveira, Máikal Borja, Adriana Bagaldo, Edgar Faria, Thadeu Silva, Gleidson Carvalho, Cláudio Ribeiro

Determination and prevalence of Mycobacterium spp.,in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) cultured in México Maurilio Lara-Flores, Sara Balan-Zetina, Ana Zapata, Karina Sonda-Santos

Swine leptospirosis: Serological prevalence inproducing establishments in Argentina Republic Jessica Petrakovsky, Julio Tinao, Jorge Esteves

Parasites and hepatic histopathological lesions in lisa (Mugil incilis) from Totumo mash, North of Colombia Jesús Olivero, Bárbara Arroyo, Ganivet Manjarrez

Effect of freezing and thawing rates on sperm motility in Bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces, Characiformes) José Martínez, Sandra Pardo

Reproductive performance of bocachico Prochilodus magdalenae induced twice in the same year Víctor Atencio, Eduardo Kerguelén, Elkin Naar, Robert Petro

Seroprevalence and risk factors associated to Neospora caninum in dairy cattle herds in the municipality of Pasto, Colombia Darío Cedeño, Bibiana Benavides

Factors affecting pregnancy in Brahman cows submitted to fixed-time artificial insemination Adriana Correa-Orozco, Luis Uribe-Velásquez, Erik Pulgarín-Velásquez

3265

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3288

3295

3304

3311

3317

Seminal plasma proteins increase the post-thaw sperm viability of Sanmartinero bull’s semen Fabián Rueda, Tatiana Garcés, Rocío Herrera, Luis Arbeláez, Miguel Peña, Henry Velásquez, Aureliano Hernández, Jaime Cardozo

3327

Journal MVZ Córdoba Volume 18

JANUARY - APRIL

Issue 1

Evaluation of reused norgestomet implants in estrus synchronization protocols in Brahman cows

Luis Uribe-Velásquez, Adriana Correa-Orozco, Lina Cuartas-Betancurth, Diego Villamizar-Ramirez, Santiago Ángel-Botero

Structure and genetic diversity of a population Holstein cows of Antioquia department, using a polymorphism of bGH gene Juan Rincon, Albeiro Lopez, Julian Echeverri

Population genetic structure of bovine lactoferrine gene in holstein breed of Antioquia Department Nancy Rodríguez, Albeiro López,Julián Echeverri

Arbuscular mycorrhizae associated to angletón grass (Dichathium aristatum Benth) on livestock farms at the municipality of Tolú, Sucre-Colombia Alexander Pérez, Víctor Peroza

Slaughter characterization of hair lambs from crosses with Colombian landraces William Albarracín, Iván Sánchez

Expression of enzymes related with the metabolism of the glucocorticoids in bovine ovarian tissue Michael López, Ayelen Amweg, Matías Stangaferro, Hugo Ortega

Promising species for the development of ecotourism in “Campo Aventura Roca Madre”, Toluviejo-Sucre, Colombia Alcides Sampedro, Angel Álvarez, Luz Domínguez,Ivonne Herrera

Analysis of the Colombian universities according to SCImago ranking 2010-2012 Salim Mattar, Marco González, Luis Salgado

3336

3346

3355

3362

3370

3379

3387

3399

SHORT COMMUNICATION Hematological and peripheral blood pressure changes in dogs after a bee sting Jorge Muñoz, Verónica Arnes, Marcelo Mieres, Mirela Noro

Entrance of parrots to the center of attention of wildlife (CAV-CVS), during the years 2007-2009 Juan Carrascal, Julio Chacón, Vivian Ochoa

3408

3414

CLINICAL CASE Wooblers syndrome in a horse

José Cardona, César Betancur, Jaime Alvarez

3420

Instructions to the authors

3425

Rev.MVZ Córdoba 18(1):3257-3258, 2013.

EDITORIAL

Universidades colombianas. Ranking Iberoamericano SIR 2012. ¿Para donde vamos? Colombian universities. Latin American Ranking SIR 2012. Where are we going? La calidad de la educación indudablemente tiene que ser evaluada y medida. Sin embargo, al ser objeto de medición se aplican algunos criterios bibliométricos medibles que pretenden ser objetivos pero algunas veces no son del agrado en algunos sectores académicos. El fenómeno de la calidad de la educación superior es complejo y está influenciado por las diferencias sociales y económicas globales, así como también por las condiciones individuales de trabajo y presupuestales de cada universidad en particular (1,2). Las clasificaciones o rankings son criticadas por las metodologías utilizadas y también por las diferencias existentes entre las universidades del mundo. Sin embargo, aunque haya disensión entre la comunidad académica (administradores, investigadores, estudiantes), éstas clasificaciones, finalmente, son interesantes y se utilizan como una herramienta que permite orientar las estrategias a fin de aumentar la visibilidad y competitividad de las universidades (3). Las universidades, por pequeñas que sean, no pueden ignorar esta realidad en un mundo cada vez más globalizado, y por tanto, están llamadas en su conjunto a diseñar estrategias administrativas y académicas que apunten hacia la consecución de los criterios que tienen en cuenta algunos de los rankings de acuerdo con las posibilidades de acceso de cada universidad. Naturalmente, los planes y estrategias deberán estar articulados con los de Ciencia y Tecnología promulgados y financiados por los organismos responsables de este sector. Para el caso del ranking considerado como el más riguroso, el Academic Ranking of World Universities que utiliza criterios tan exigentes como: número de profesores y alumnos que hayan ganado premios Nobel y otros galardones (10%), premios Nobel dentro de la planta docente (20%), menciones a sus investigadores (20%), artículos publicados en revistas científicas de alto factor de impacto (20%), documentos indexados en las mejores bases de datos (20%) y sus resultados per cápita respecto al tamaño de la institución (10%), las posibilidades para nuestras universidades colombianas se tornan un tanto complicadas. De todas maneras, para la realidad colombiana, sea cual fuere, se debe reconocer que finalmente estos rankings ofrecen una clara visión de la educación superior en un país y su lugar en el mundo académico. El Ranking Iberoamericano SCImago (SIR, por su sigla en inglés SCImago Institutions Rankings) (4) es una plataforma que se utiliza como herramienta para analizar la actividad investigadora de las Instituciones de Educación Superior en Iberoamérica. Las clasificaciones incluyen indicadores bibliométricos con el objeto de revelar la magnitud investigadora de las instituciones. Los indicadores utilizados por este ranking para cada institución son cinco. 1. Producción Científica. Número de publicaciones en revistas científicas. 2. Colaboración Internacional. Ratio de publicaciones científicas de una institución elaboradas conjuntamente con instituciones de otros países. 3. Calidad Científica Promedio. Impacto científico de una institución después de eliminar la influencia del tamaño y el perfil temático de la institución. Este indicador permite comparar instituciones de diferentes tamaños y con distintos perfiles de investigación. 4. Porcentaje de Publicaciones en Revistas del Primer Cuartil SJR. Indica el porcentaje de publicaciones que una institución ha publicado en revistas incluidas en el primer cuartil ordenadas por el indicador SJR. (5). 5. Ratio de Excelencia. Indica el porcentaje del output de una institución que se encuentra incluido en el 10% de los trabajos más citados del mundo en sus respectivos campos científicos. Es un indicador de la producción científica de alta calidad que produce una institución. 3257

3258

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

El análisis de los resultados permitirá a los responsables de cada institución (administradores, investigadores, comunicadores de la web institucional) tomar decisiones encaminadas a mejorar o a reorientar la investigación lo que finalmente incrementaría la posibilidad de ascender en la clasificación y en últimas podría mejorar las fuentes de financiación para programas de investigación y extensión. Recientemente, el Ranking Iberoamericano SCImago publicó la medición de 2012 (4). No sorprende que en esta última clasificación en Colombia, los primeros cinco lugares continúen ocupados por las mismas universidades que habitualmente aparecen: Nacional, Antioquia, Andes, Valle y Javeriana. Posteriormente se encuentra la UIS, Rosario, UPB, Norte y Cauca. En el Caribe, la universidad del Norte ocupó el puesto 9, Cartagena el 13 y Córdoba el 17; estas IES mostraron un avance importante pero aun lejos del top de los cinco primeras. En Iberoamérica tampoco hay mayores cambios, la universidad de Sao Paulo (Brasil), la UNAM (México) y la de Campinas (Brasil) superaron a las españolas de Barcelona y Autónoma de Barcelona y Madrid. Estas universidades tienen más estudiantes de postgrado (M.Sc. y Ph.D.) que generan más conocimiento y por lo tanto, la publicación de mayor número artículos, lo que conlleva a incrementar el prestigio de las mismas en el mundo académico. Lo importante de los rankings no es el lugar que las universidades alcancen cada año, lo es en realidad el análisis de los indicadores obtenidos por cada institución, lo cual le permitirá trazar políticas y estrategias para mejorarlos en un futuro a corto o mediano plazo. Teniendo en cuenta los indicadores utilizados por la mayoría de los rankings, básicamente, las universidades colombianas deben apostarle principalmente a: i. Contratar o vincular profesores de tiempo completo con posgrado (M.Sc. y Ph.D.) para realizar investigación. ii. Publicar en inglés en revistas indexadas con alto factor de impacto iii. Buscar alianzas estratégicas internacionales para realizar investigación y publicación de artículos en forma conjunta. iv. Desarrollar una decidida y ambiciosa política de publicación de toda la producción científica (Tesis, proyectos de investigación, libros, textos universitarios, monografías, ensayos, guías, etc.) que se desarrolla al interior de la universidad. v. Fortalecer y modernizar las bibliotecas, incluyendo el desarrollo de las virtuales. vi. Desarrollar una WEB moderna, amigable y fundamentalmente bilingüe para que la comunidad internacional tenga acceso a dicha información. No obstante, no se podrán realizar publicaciones de impacto con investigadores internacionales, sin profesores universitarios altamente calificados. En ese sentido, con solo un 37% de profesores de planta, será muy difícil que la Universidad de Córdoba supere el puesto 341 en Iberoamérica y el 255 en Latinoamérica. Creemos que la cultura de la mampostería y del ciclópeo debería estar limitada a lo imprescindible y más bien apostarle, al menos por un tiempo estratégico, a construir, si a construir, un pensamiento complejo de universidad que incluya la creación de nuevos posgrados en distintas áreas del conocimiento y desde esta plataforma promover una universidad con mayor liderazgo regional, nacional e internacional. Salim Mattar V. Ph.D.

Marco González T. M.Sc.

REFERENCIAS 1.

Vistremundo Águila C. El concepto calidad en la educación universitaria: clave para el logro de la competitividad institucional. [en línea]. Revista Iberoamericana de Educación, OEI. 2005. [fecha de acceso enero de 2013]. URL Disponible en: http://www.rieoei. org/deloslectores/880Aguila.PDF Ximena Cardoso A. Hacia la internacionalización de la educación superior. [en línea]. Colombia. Ministerio de educación. [fecha de acceso enero de 2013]. URL Disponible en: http://www.mineducacion.gov.co/1621/ articles-230245_archivo_pdf_articulo_ internacionalizacion.pdf

Docampo D. “Rankings internacionales y calidad institucional”. Revista de Educación 2008; Número Extraordinario:149-176. URL Disponible http://www.revistaeducacion. mec.es/re2008/re2008_07.pdf

SCImago Institutions Rankings (SIR). [en línea]. España: SCImago Research Group; 2012. [fecha de acceso enero de 2013].URL Disponible en: http://www.scimagoir.com/ pdf/sir_2012_world_report.pdf

SJC. SCImago Journal & Country Rank. [en línea]. España: SCImago Lab; 2013. [fecha de acceso enero de 2013]. URL Disponible en: http://www.scimagojr.com/

Rev.MVZ Córdoba 18(1):3259-3264, 2013. ORIGINAL

Comparison of systemic and intramammary dry cow treatments Comparación de terapias sistémicas e intramamarias para el periodo seco en vacas lecheras G. Andres Contreras B,1* Ph.D, Walter M. Guterbock,2 M.Sc, Juan Muñoz R,1 Ing. Agr, Phillip M. Sears,1 Ph.D. Michigan State University, College of Veterinary Medicine Department of Large Animal Clinical Sciences, East Lansing, Michigan, USA. 2denDulk Dairy, Coopersville, Michigan, USA.*Correspondencia:contrera@ cvm.msu.edu. 1

Recibido: Abril de 2011; Aceptado: Mayo de 2012.

ABSTRACT Objective. To compare four different dry cow treatments (DCT) and establish their effectiveness in reducing intramammary infections (IIM). Materials and methods. DCTs included systemic tylosin (12g) alone or accompanied by cefapirine intramammary infusions and or an internal teat sealant. A total number of 278 cows at the end of lactation period were randomly assigned to one of 4 dry cow treatment groups: CESE Group (n=89), intramammary cephapirin and teat sealant. TYCESE Group (n=84), intramammary cephapirin, tylosin 12 g intramuscular and teat sealant. TYSE Group (n=86), 12 g intramuscular tylosin and teat sealant; TY Group (n=76) 12 g intramuscular tylosin only. Milk samples for culture were collected at dry-off and 1 and 2 weeks after calving. Somatic cell counts (SCC) were taken from Dairy Herd Improvement Association (DHI) tests at dry-off, and the first two test days after calving. Results. Bacteria cure rate for Gram-positive intramammary infections (IMI) for TYCESE group was 93.6%, CESE group 78.9%, TYSE group 88.2%, and TY group 78.1%. All four groups showed a decrease in the SCC upon the first and second test after calving. Conclusions. The use of systemic tylosin in combination with intramammary antibiotics increased DCT effectiveness improving the Gram-positive cure rate IMI. Furthermore, systemic tylosin alone plus teat sealant is as effective as cephapirin plus teat sealant when used as DCT. Key words: Dry period, mastitis, tylosin (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Comparar 4 tratamientos para el periodo seco (TPS) y establecer su efectividad en reducir infecciones intramamarias (IIM). Materiales y métodos. Los TPS incluían tilosina sistémica (12 g) solamente o acompañada con infusiones intramamarias de cefapirina y/o un sellante interno de pezones. Un total de 278 vacas al final de la lactancia fueron asignadas al azar a 1 de 4 grupos de tratamiento. Grupo CESE (n=89), cefapirina y sellante interno de pezones. Gupo TYCESE (n=84), cephapirina intramamaria, tilosina intramuscular y sellador interno de pezones. Grupo TYSE (n=86), tilosina intramuscular y sellante interno de pezones. Grupo TY (n=76) tilosina intramuscular solamente.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

Muestras de leche de cada cuarto productivo fueron tomadas al momento del secado, y 1 y 2 semanas después del parto. Los recuentos individuales de células somáticas (RCS) fueron tomados del control lechero (DHI) en sus pruebas de antes del momento de secado, y las primeras dos pruebas después del parto. Resultados. Las tasa de cura bacteriológica para IIM causadas por Gram positivos en TYCESE fue de 93.6%, para CESE 78.9%, TYSE 88.2% y TY 78.1%. Todos los grupos de tratamiento mostraron una disminución en RCS a la primera y segunda prueba despues del parto en comparación con la de secado. Conclusiones. El uso de tilosina en combinación con cefapirina incremento la efectividad del TPS, mejorando las tasas de cura de IIM por Gram positivos. Además TYSE fue tan efectivo como CESE en la reducción de IIM. Palabras Clave: Mastitis, periodo seco, tilosina (Fuente: CAB).

INTRODUCTION Dry cow therapy (DCT) is defined as the use of antibiotics immediately after the last milking of lactation. There are three different approaches to DCT. First, intramammary dry treatment alone is widely used and very effective in reducing intramammary infections (IMI) (1, 2). However, low efficacy against some coagulase negative staphylococci (CNS) IMI has been demonstrated. (3) Another approach is systemic dry cow therapy, which is relatively inexpensive and easy to use but has been reported to be less effective. For example, Nickerson et al (4) administered tilmicosin subcutaneously and found it to be less effective against IMI caused by Staphylococcus aureus than intramammary infusions of cephapirin or tilmicosin. Finally a combination of systemic and intramammary antibiotics can also be administered. However, its efficacy depends upon the antibiotic class pharmacological characteristics. In fact, Erskine et al (5) reported a low efficacy against Staphylococcus aureus IMI when using oxytetracycline hydrochloride systemically in combination with intramammary cephapirin benzathine. The low efficacy of this treatment could have been related to the poor diffusion of oxytetracycline into the mammary gland. The use of tylosin as systemic DCT was reported to be as effective as intramammary infusion with a preparation with beta lactams and streptomycin against CNS (6). However, combined DCT including systemic tylosin has not been previously reported. This antibiotic belongs to the macrolide family of antibiotics. One of the main advantages of this type of antimicrobials is an excellent diffusion into the mammary gland related to its basic pK (pH at which concentrations of dissociated and undissociated antibiotic are equal), which results in a very high milk to plasma concentration ratio of 5:1 (7,8). Once the macrolides are in milk they are virtually trapped inside the mammary gland.

The objective of this study was to compare four different DCTs and establish the effectiveness of systemic (intramuscular) tylosin therapy as DCT at quarter level when was added to intramammary infusion of cephapirin, a teat sealant, or alone as systemic DCT.

MATERIALS AND METHODS Study site. Cows on a large commercial farm in Michigan were selected. Every week, for two months, and after confirming their gestation to be greater than 150 days, a group of Holstein cows in their second, third or fourth lactation due to go dry were assigned to one of four DCT groups. A completely randomized design that included three treatments and a control was used (Table 1). Table 1. Summary of gram-positive intramammary infections by treatment groups at cow and quarter level. Treatment1 CESE

TYCESE

TYSE

Cows with IMI at dry-off (% cows infected)

30 (40%)

28 (39%)

33 (45%)

32 (53%)

Cow cured after DCT (% cows cured)

20 (66%)ab

21 (75%)a

17 (51%)ab

15 (46%)b

Cows with new IMI after calving

289

271

276

226

Cows Enrolled

Quarters Enrolled Non-functional quarters

Quarters infected at 57 dry-off (% quarters (19.7%)b infected)

47 (17.3%)b

68 (24.6%)a

73 (32.3%)a

Quarters cured after 45 DCT (% quarters cured) (78.9%)b

44 (93.6%)a

60 (88.2%)a

57 (78.1%)b

Treatment designations: CESE cephapirin 300 mg intramammary and Orbeseal® (4 g of internal teat sealant containing 65% bismuth subnitrate); TYCESE: tylosin 12 g intramuscular, cephapirin 300 mg intramammary, and Orbeseal®; TYSE: Tylosin 12 g intramuscular and Orbeseal®; TY: tylosin 12 g intramuscular. abDifferent superscripts within each row differ (p<0.05). 1

Contreras - Comparison of systemic and intramammary dry cow Treatments. Treatment CESE (n=89 cows), reflecting standard practice on the farm, was used as control. After the last milking of lactation, animals were first infused in each productive quarter with a commercial preparation of 300 mg of cephapirin (Tomorrow ®, Fort Dodge, Ft Dodge, Iowa, USA) intramammary and then with 4 g of commercially available internal teat sealant containing 65% bismuth subnitrate (Orbeseal®, Pfizer. New York, New York, USA). Treatment TYCESE (n=84 cows) animals were first infused in each productive quarter with cephapirin intramamary 300 mg, then injected intramuscularly with tylosin (Tylosin, Agripharma. Westlake, Texas, USA) 12 g and finally were infused with teat sealant. Group TYSE (n=86 cows) animals received tylosin 12 g intramuscular and then teat sealant was infused in each productive quarter. Group TY (n=76 cows) animals received 12 g tylosin intramuscularly. Intramammary infusions were administered by the partial insertion technique. Prior to instillation. All teat ends were prepared following the farm’s milking preparation routine that included a predip solution containing 0.1% iodine, after which the dry teat end was disinfected with a cotton pad containing 70% isopropyl alcohol. Intramuscular injections were given in the neck, splitting the dose between two different sites. Tylosin dosage calculation was based in 20 mg/Kg dose for a 600 Kg cow (average weight for mature cows on this commercial farm). Milk samples. Quarter milk samples were taken following National Mastitis Council guidelines (9) from all functional quarters at dry-off and at 1 and 2 wks after calving. Samples were immediately processed at the dairy’s on-farm laboratory. A 10 mL aliquot from each sample was cultured on blood agar containing 0.5% esculin at 37°C for 24 h. Colonies were tentatively identified as CNS, streptococci, Staphylococcus aureus, coliforms or others; a presumptive diagnosis of CNS, streptococci, coliform, or other pathogens was made, based on colony growth, morphology and appearance, pattern of hemolysis, and catalase reaction. Staphylococcal isolates were tested for coagulase production with the tube coagulase test. Gram-negative bacteria were plated on MacConkey agar to facilitate identification. Only CNS, streptococci and S. aureus were included in data analysis. This approach was based on the label use for cephapirin (Tomorrow®) and Tylosin sold in the United States at the time of the trial, not on their antibacterial activity. A cow was considered infected if at least one productive quarter had an

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IMI. A quarter was considered infected if five or more cfu of the same kind were identified, and was considered contaminated if three or more different colony types were present. Post calving samples were used to establish bacterial cure. A cow was considered cured if she had an IMI at dry-off and all productive quarters were negative at both samples post-calving. A cow was not cured if she had an IMI at dry-off and continued with the same quarter(s) infected with the same species at first and second test after calving. A quarter was considered cured if it was positive at dry-off and negative in first and second postcalving samples. It was considered not cured if it was positive to the species found at dry-off and again 1 and/or 2 wk after calving. A quarter was considered newly infected if it was negative at dry-off and positive at 1 and 2 wk after calving. Dairy Herd Improvement (DHI) tests were recorded to monitor SCC. The last test of lactation was considered the drytest, and then linear SCC scores from subsequent monthly tests, were used to determine changes in SCC. Milk production records were collected by DHI personnel and total production was established as projected to 305 days mature equivalent (ME) by a herd management software (DairyComp®, Herd Management software, Valley Agricultural Software, Tulare, California, USA) based on milk production at DHI test taken between 180 and 200 days in milk (DIM) after calving following the DCT assigned. A composite milk sample was taken at calving to perform antibiotic residue test (Delvotest® system, DMS food specialties, Parsippany, New Jersey, USA). Cows with less than 30 d dry were excluded because of antimicrobial residue issues that required milk withdrawal. Cows with more than 100 d dry were also excluded. Of the 335 cows enrolled in the dry cow treatment trial, 278 had complete records and were included in the results. Analysis of results. Culture results were analyzed with the PROC GLIMMIX procedure for binary variables (SAS Inst. Inc., Cary, North Carolina, USA). Results were blocked by sampling date and the random statement was assigned to quarter within cow as experimental unit. The SCC scores were analyzed as repeated measures using a mixed model procedure (PROC MIXED; SAS Inst. Inc., Cary, North Carolina, USA) following the equation: Yijk = µ + Gi + Ij +Gi * Ij + Sk +Sk*Gi + Sk*Ij + Sk*Gi*Ij + Eijk Where Yijk is the dependent variable SCC score for a cow in group i, with infection status j, at

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sample k as repeated measure, and Eijk is the random error assumed to be correlated. The Satterthwaite’s method for estimating degrees of freedom was used. Significance level was set at alpha=0.05.

RESULTS A total of 123 cows (44%) had IMI at dry-off and no differences in infection rate were found when comparing all four groups. Percentages of cows with IMI within each treatment group were as follows CESE 40%, TYCESE 39%, TYSE 45% and TY 53%. Cure rates at cow level were significantly higher for group TYCESE (75%) when compared to group TY (46%). Group CESE had a (66%) cure rate and TYSE (51%) and this difference was not significant. A summary of these results is shown in table 1. Despite of the use of antibiotics, residue tests were negative on all samples taken after calving. A total of 245 quarters (23% overall) were found infected with CNS, streptococci or S. aureus. IMI rates by quarters at dry-off are shown in table 1. Group TY had 32.3% infected quarters and group TYSE had 24.6%, both were significantly higher (p<0.05) than TYCESE 17.3% and CESE 19.7%. Gram-positive bacterial infection results are summarized in table 2. Table 2. Summary of gram-positive culture results by treatment groups at quarter level. Treatment 1 CESE CNS quarters infected at dry41 off (% quarters infected) (72%)a 2

TYCESE

TYSE

27 (57%)b

28 (41%)b

58 (79%)a

CNS % quarters cured after DCT

73%a

92%b

89%b

72%a

Streptococci quarters infected at dry-off (% quarters infected)

14 (24%)

18 (38%)

34 (50%)

14 (19%)

Streptococci quarters cured after DCT

100%

94%

91%

100%

S aureus quarters infected at dry-off

of infections it was not possible to establish differences among groups. Furthermore, IMI with S aureus exhibit intermittent shedding that requires at least 3 multiple samplings to identify a truly infected quarter and this trial only collected 1 sample at dry-off (10). Further studies are needed to evaluate tylosin efficacy alone or in combination with other antibiotics and or teat sealants against S. aureus IMI. Coliform infections were found in 5 quarters from 3 different cows at the moment of dry-of (results not shown). These infections were cleared after parturition. Bacterial cure rates for gram-positive bacteria by quarters are shown in table 2. TYCESE had the highest cure rate (93.6%) and was significantly different (p<0.05) from TY (78.1%) and CESE (78.9%). No difference was found when TYCESE was compared to Group TYSE (88.2%). New infections rates were low, group CESE (1.8%), group TYCESE (2.6%), group TYSE (2.9%) and group TY (3.3%). When comparing cure rates by bacteria type (Table 1) all four treatments had good efficacy against streptococcal infections, but there were differences in cure rates for staphylococcal infections. Group TYCESE had higher cure rates (92.5%) than CESE (73.17%) and TY (72.4%) (p<0.05). All four treatments resulted in a decrease in the SCC at the first and second test after calving and no statistical differences were observed among them (Figure 1). Milk production at test date between 180 to 200 DIM was analyzed using 305 ME value. Milk production for each treatment group was as follows: TYCESE 23.910±5.686 lb, CESE 22.056±5.104 lb, TY 21.900 ± 4.278 lb and TYSE 21.791± 4.086 lb. When the difference between arithmetic mean of previous and current lactations was calculated for all groups, no significant differences were found.

Treatment designations: CESE cephapirin 300 mg intramammary and Orbeseal® (4 g of internal teat sealant containing 65% bismuth subnitrate); TYCESE: tylosin 12 g intramuscular, cephapirin 300 mg intramammary, and Orbeseal®; TYSE: Tylosin 12 g intramuscular and Orbeseal®; TY: tylosin 12 g intramuscular. 2 CNS= coagulase negative staphylococci ab Different superscripts within each row differ (p<0.05). 1

CNS accounted for 62.9% of the infections, streptococci for 32.6% and S. aureus for 4.5%. The staphylococcal infection rate was significantly higher in group TY when compared to TYCESE and TYSE (p<0.05) (Table 1). Infections caused by S aureus were found in 2 quarters of group CESE, 2 quarters of TYCESE, 6 quarters of TYSE and 1 quarter of TY. With such a small number

Figure 1. logSCC at dry-off, first test and second test after calving for each treatment group. Values are means ± SEM.

Contreras - Comparison of systemic and intramammary dry cow

DISCUSSION Bacterial cure rates for systemic tylosin (group TY 78.1%) are similar to those obtained by McDougall et al (11) in New Zealand, who administered tylosin intramuscularly to treat clinical mastitis during lactation and obtained 82% cure rates for Gram-positive infections. Systemic tylosin as DCT alone (TY) or plus teat sealant (TYSE) is as effective as intramammary cephapirin plus teat sealant (Group CESE 78.9%) to reduce IMI. The randomization was effective in distributing IMI among groups at cow level, but was ineffective at quarter level generating a bias, observed in a higher number of quarter infections and a lower cure rate for the TY group. An ideal randomization would have included blocking after culturing quarters but this process would have represented major logistical problems on this commercial farm. However, all four DCTs were effective in reducing IMI. Nickerson et al (4) used a systemic macrolide (tylmicosin) to treat IMI during the dry period reporting low cure rates against staphylococcal infections, however, the dose (1 mg/Kg) used by the authors does not have bacteriocidal activity, and subcutaneous administration could have delayed antibiotic distribution. Tylosin’s effectiveness during this trial could be related to its distribution properties and the fact that a higher than recommended dose with a single injection was used. Tylosin’s peak milk concentration was reported to be 10 µg/ml after a single injection at a dose of 20 mg/Kg b.w. (12) and 18 µg/ml after three repeated injections at a dose of 10 mg/Kg b.w (13). In the present work, tylosin’s dose was based on average calving weight for cows (600 Kg) at 20 mg/Kg. Despite of the relative high dose used, antibiotic residues were not found in the composite samples taken at calving. It is presumable that

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peak milk concentration in tylosin treated animals was higher than previously reported, therefore achieving bactericidal activity, which was observed for macrolides when used in high concentrations (14). When analyzing cure rate by bacteria type, intramammary treatment alone could have been limited in its ability to eliminate infections during the dry period (CESE 73.2%). Similar to what was reported by Bolurchi et al (6) inclusion of systemic tylosin in DCT increased cure rates for CNS IMI. Because CNS could be responsible of nearly half of the IMI during the dry period, an increase in the cure rate towards this bacteria type obtained by the addition of systemic tylosin to the intramammary DCT would have an important economic impact (15). In conclusion, DCT remains a cost-effective measure compared with no treatment at dryoff (3,16,17). The use of systemic tylosin in combination with the intramammary cephapirin increased the effectiveness of intramammary DCT against Gram-positive IMI. Though, inclusion of a combined systemic and intramammary treatment has to be based on an economic analysis of the increased cost of such therapy versus its higher effectiveness. Interestingly, there were no differences between the use of tylosin plus teat sealant and intramammary cephapirin plus teat sealant at dry-off. Therefore the use of these 2 DCT options may be based on the logistical advantages of each treatment protocol. Tylosin may have the advantage of being easier to administer in dairies with confinement housing where headlocks are available to treat large groups of animals. Finally, it is important to mention that adding the teat sealant to the systemic treatment with tylosin at dry-off improved the response of the treatment. Further studies are needed to validate this effect in other dairy herds and to test the use of extended therapy with tylosin particularly when selective DCT is used.

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3265-3272, 2013. ORIGINAL

Peanut cake concentrations in massai grass silage La harina de cacahuete en el ensilaje de hierba Massai Luciano S. Lima,1 M.Sc, Ronaldo L. Oliveira,1 Ph.D, Máikal S. Borja,1* M.Sc, Adriana R. Bagaldo,2 Ph.D, Edgar FS. Faria,1 M.Sc, Thadeu M. Silva,1 M.Sc, Gleidson GP. Carvalho,1 Ph.D, Cláudio VDM. Ribeiro,1 Ph.D. Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Produção Animal, Salvador, Brasil, Areia, Brasil. 2Universidade Federal do Recôcavo da Bahia, Pós Graduação em Ciência Animal, Cruz da Almas, Brasil. *Correspondence: maikalborja@hotmail.com. 1

Recibido: Octubre de 2011; Aceptado: Agosto de 2012.

ABSTRACT Objective. This experiment was conducted to evaluate the best concentration of peanut cake in the ensiling of massai grass of the chemical-bromatological composition, fermentative characteristics, forage value rate, ingestion estimates, and digestibility of dry matter in the silage. Materials and methods. The experiment was carried out at the Experimental Farm of São Gonçalo dos Campos at the Federal University of Bahia, Brazil. The treatments consisted of massai grass that was cut at 40 days and dehydrated, in addition to 0%, 8%, 16%, and 24% peanut cake in the fresh matter and treatment without cake. The material was compressed in experimental silos (7 liter) that were opened after 76 days. Results. The addition of 8-24% peanut cake improved the silage’s chemical-bromatological parameters, increased the dry matter and non-fiber carbohydrates and reduced the fibrous components. There was a linear increase in the estimated values of digestibility and the ingestion of dry matter depending on the levels of peanut cake in the silage. There was an improvement in the fermentative characteristics, with a quadratic effect positive for levels of ammoniacal nitrogen. The forage value rate increased linearly with the inclusion of peanut cake. Conclusions. The inclusion of up to 24% peanut cake during ensiling of massai grass increases the nutritive value of silage and improves fermentation characteristics. Key words: Biofuels, nutrition, ruminants, silage, supplements (Source: CAB).

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RESUMEN Objetivo. Este experimento se realizó para evaluar el mejor nivel de inclusión de harina de cacahuete en el ensilado de hierba massai a través de la composición química-bromatológica, las características fermentativas, la tasa de valor forrajero, las estimaciones de la ingestión y la digestibilidad de la materia seca. Materiales y métodos. El experimento se llevó a cabo en la Granja Experimental de São Gonçalo dos Campos, en la Universidad Federal de Bahía. Los tratamientos fueron hierba massai cortada a 40 días, deshidratada, además de un 8%, 16% y 24% de harina de maní en la materia fresca, además de tratamiento sin harina de cacahuete. El material se comprimió en silos experimentales que se abrieron después de 76 días. Resultados. La adición de harina de cacahuete 24% mejor que el ensilaje de productos químicos bromatológicos parámetros, el aumento de la materia seca y carbohidratos sin fibra, y la reducción de los componentes fibrosos. Hubo un aumento lineal de los valores estimados de la digestibilidad y la ingestión de materia seca en función de los niveles de harina de cacahuete en el ensilaje. Se observó una mejoría en las características fermentativas, con un efecto de segundo grado para los niveles de nitrógeno amoniacal. La tasa de valor forrajero aumentó linealmente con la inclusión de harina de cacahuete. Conclusiones. La inclusión de hasta un 24% de harina de cacahuete durante el ensilaje de pasto massai aumenta el valor nutritivo del ensilaje y mejora las características de la fermentación. Palabras clave: Biocombustibles, ensilaje, nutrición, rumiantes, suplementación (Fuente: CAB).

INTRODUCTION Brazil has emerged as an important global producer of meat and milk. Pasture-raised animals require quality feed throughout the year so that the dairy and meat industries can remain productive. The low availability of fodder during annual months of drought causes seasonal livestock production to be divided into wet and dry seasons. The dry season causes economic losses for producers because in most cases, the revenue from the dry season is lower than that obtained in the wet season Neiva and Vasconcelos (1). Low cattle production in the tropics can be attributed, among other factors, to inadequate nutrition resulting from the seasonality of forage production. In an ongoing livestock production program, it is essential to eliminate this unproductive phase and provide conditions in which the animals can develop normally throughout the year with Reis et al (2).

should be harvested at young stages of maturity (60 to 70 days or less). At this stage of development, the excess moisture (80% or more) in forage increases the risk of the proliferation of undesirable microorganisms, Jobim et al (3). The lower osmotic pressure during this stage may encourage the growth of bacteria of the genus Clostridium and bacteria, which convert sugars, lactic acid, proteins, and amino acids into acetic and butyric acids, ammoniacal nitrogen (NH3-N) and amines, substances that affect silage consumption. In addition to the increased moisture, the tropical grasses also have a low concentration of soluble carbohydrates, which can bring about a rapid decrease in pH and the production of good nutritional quality silage. The soluble portion of forage grasses during ensiling is essential for the fermentation process to develop efficiently Ávila et al (4).

Among the various options to fulfill the animals’ nutritional requirements during periods of low forage production, roughage supplementation through silage is an excellent method for keeping the nutrient supply in balance with the requirements of the livestock. Thus, the surplus fodder from the rainy season can be stored as silage, which is a very important strategy for animal nutrition.

Alternatives of additives in the ensiling of tropical grass, have been utilized to increase the dry matter content of silage Carvalho et al (5); Carvalho et al (6) and to provide nonfiber carbohydrates, Andrade and Melotti (7); Ferreira et al (8). A good additive for ensiling tropical grasses should have high dry matter content, capacity for water absorption, high nutritional value, good flavor, high content of soluble carbohydrates, easy manipulation, Neiva and Vasconcelos (1).

To obtain silage from tropical perennial forage grasses of good nutritional quality, the grasses

The transesterification process is currently the most widely used method for biodiesel

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Lima - Peanut cake concentrations in massai production. It consists of a chemical reaction between vegetable oils or animal fats and rubbing alcohol (ethanol) or methanol, encouraged by a catalyst, which also produces glycerin, a product with various applications in the chemical industry Lima et al (9). In addition to glycerin, the biodiesel production chain generates a number of other by-products such as meal and bran, both of which have a high concentration of nutrients that can be used in animal feed. Due to their nutritional characteristics, the meal and bran that are generated during the production of biodiesel have the potential to be used as additives in the ensiling of tropical grasses. The peanut cake obtained after oil extraction is a by-product of high commercial value, as it has appropriate nutritional characteristics (Nunes et al (10); Correia et al (11); Ribeiro et al (12); Agy et al (13). Peanut cake obtained without shells contains approximately 45% protein, averaging 8.5% EE, at most 9.5% cellulose and approximately 83.5% TDN Santos et al (14); Suarez et al (15). The objective of this work was to determine the best percentage of cake inclusion, derived from the production of biodiesel, in massai grass silage based on chemical-bromatological composition, fermentation characteristics, estimates of consumption and dry matter digestibility, and an forage index value.

MATERIAL AND METHODS Field management and sampling. Experiments were conducted at the experimental Farm at the Federal University of Bahia, located in the municipality of São Gonçalo dos Campos - BA (12° 25’ 58’’ South, 38° 58’ 01’’ West), at a distance of 108 km from Salvador, located in the middle region of north-central Bahia and the microregion of Feira de Santana-BA. After 40 days of regrowth, massai grass was manually cut to 10 cm above the soil and ground into fragments approximately 5 cm long, using a stationary defragmenter. The treatments were a inclusion of massai grass and various levels of peanut cake that, after being homogenized, were ensiled in 15-L plastic buckets with four repetitions per treatment. A total of 0.0, 8.0, 16.0, and 24.0% peanut cake was used in the silage, based on natural matter, which corresponds to 21.28, 27.10, 44.87, and 57.44%, respectively, of a DM of massai grass. The material was compacted manually with the aid of wooden bars and was sealed with

tape and plastic canvas to prevent the entry of air. It was then stored at room temperature and protected from rain and sunlight. After 76 days, the experimental silos were opened and sampled from the center of each bucket. Chemical analyses. The samples were dried in an oven at 55°C for 72 h and then ground into a 1-mm sieve for bromatological analysis of dry matter (DM), crude protein (CP), mineral matter (MM), neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF), ether extract (EE), nonfiber carbohydrates (NFC), hemicellulose (HEM), cellulose (CEL), and lignin (LIG), using the methods described by Silva and Queiroz (16). An analysis of the ingredients before ensiling is shown in table 1. Measurements of ammonia nitrogen levels (NH3-N) were performed as described by Playne and McDonald (17), and pH analysis was carried out using a digital potentiometer at the moment the buckets were opened. Table 1. Chemical composition of massai grass and peanut meal used in the production of silage. Massai grass

Peanut meal

Dry Matter (%)

21.3

90.9

Crude Protein¹

6.40

45.7

Ether Extract¹

0.68

8.66

Neutral Detergent Fiber¹

67.7

15.4

Acid Detergent Fiber¹

48.6

11.8

Lignin¹

10.4

2.00

Cellulose¹

38.2

9.82

Hemicellulose¹

19.1

3.55

Non Fiber Carbohydrates¹

15.9

26.2

Detergent Insoluble in Neutral Nitrogen²

30.0

12.2

Detergent Insoluble in Acid Nitrogen²

5.00

3.50

Cinzas¹

9.28

4.06

Items

¹% of dry matter, ²% of total nitrogen

Measurement the forage value index. The forage value index (FVI) was obtained through the following equations described by Teixeira and Andrade (18): DMI(% of live weight) = 120/%NDF of DM (equation 1); DDM(%) = 88.9-0.779 × ADF% DM (equation 2); FVI = (DMI x DDM) / 1.29 (equation 3); DMI is dry matter intake, NDF is neutral detergent fiber, DDM is digestible dry matter, DM is dry matter, ADF is acid detergent fiber, and FVI is forage value index.

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RESULTS The peanut cake showed potential for moisture absorption because the increasing levels that were added to the ensiling massai grass provided a linear increase (p<0.05) in the silages for DM, thus showing maximum values of 40.4% with the addition of 24% peanut cake. There was a linear increase in the CP content of the silage with the addition of peanut cake. Each 1% inclusion of cake in the silage corresponded to an increase of 0.68 percentage units of CP. The inclusion of levels of peanut cake reduced the levels of MM. The percentage of EE increased with the addition of peanut cake to the silage, thus promoting a linear effect (p<0.05). The NFC content increased with the addition of peanut cake to the silage (p<0.05) at a rate of 0.23 percentage points per 1% addition. The inclusion of peanut cake in the silage promoted a reduction in the NDF and ADF in the silage (p<0.05). For each 1% addition of cake, there was a reduction of 0.87 and 0.57 percentage points in NDF and ADF, respectively. The fractions of HEM, CEL and LIG decreased with the inclusion of peanut cake, demonstrating that the inclusion of this additive could make grass more digestible for livestock. The treatments did not influence the pH levels of the silage (Table 2).

There was an 18% reduction (p<0.05) of NH3-N in the silage with the inclusion of peanut cake, and the lowest level of NH3-N was estimated at 8.1% (Figure 1). 14 Nh3-N (% total N)

Statistical analysis. The experimental design was completely randomized, with four treatments and four replicates per treatment. The data were analyzed using the SPSS® 12.0 for variance analysis and regression, assuming a significance level of 5%.

–0 .6x + 0.01x2 R² = 0.93

13 12 11 10 9 8

Levels of peanut meal (%)

Figure 1. NH3-N of massai grass silage with added peanut cake.

In this work, the estimated intake of DM increased linearly with the inclusion of peanut cake. The massai grass silage without added peanut cake had higher levels of ADF and lignin, with corresponding lower estimates of dry matter digestibility (Table 3). Table 3. Estimates of dry matter intake (DMI), dry matter (DM) and forage value index (FVI) of massai grass silage with levels of peanut cake. Items

With Peanut cake (%)

Regression Equation

DMI (% LW)1

1.74

2.07

2.24

2.56

Ŷ=1.76+0.03x

0.98

DM (%)

51.8

56.9

59.2

62.2

Ŷ=52.51+0.42x

0.96

FVI

70.0

91.7

103

124

Ŷ=71.20+2.17x

0.98

1% Live weight

Table 2. The treatments the pH levels of the silage. Included Peanut meal (%)

Constituents Concentrations of dry matter (%)

22.3

29.8

35.1

40.4

Regression Equation

Ŷ =23+0.74x

0.99

4.09

Crude protein

6.29

13.0

17.0

23.2

Ŷ =6.7+0.68x

0.99

8.32

Mineral matter1

12.6

9.57

7.36

7.35

Ŷ =11.9-0.21x

0.85

5.08

1.30

4.61

5.26

5.69

Ŷ =2.1+0.17x

0.80

12.5

11.0

15.0

16.6

Ŷ =12+0.23x

0.81

12.6

68.8

57.8

53.5

43.9

Ŷ =67.2-0.87x

0.96

3.4

47.6

41.0

38.1

34.2

Ŷ =46.7-0.53x

0.96

3.65

21.2

16.8

15.3

12.6

Ŷ =20.6-0.33x

0.95

7.14

34.5

29.5

27.7

25.0

Ŷ =33.7-0.37x

0.95

4.23

13.1

11.5

10.4

9.2

Ŷ =12.9-0.16x

0.99

4.68

Ether extract

Non-fiber carbohydrates Neutral detergent fiber 1 acid detergent fiber Hemicellulose

Cellulose 1 Lignin

Hydrogen potential

4.43

4.2

4.3

Ŷ=4.31

4.10

N-NH3/N total

13.9

9.14

8.92

8.37

Ŷ=3.69–0.61x + 0.01x2

0.94

15.8

(%DM); ammoniacal nitrogen (NH3-H) from massai grass silage with different levels of peanut meal (% MN)

Lima - Peanut cake concentrations in massai The FVI (Figure 2) was found to be lower for the silage without added peanut cake, which was classified as grade 3 forage based on the work by Teixeira and Andrade (18).

Forage Value Index

130 120

Ĺś= 71,20 + 2,17x RÂ˛ = 0,98

110 100 90 80 70 0

Levels of peanut meal (%)

Figure 2. Forage Value Index In Massai Grass With Peanut Cake Added.

DISCUSSION The treatments with inclusion levels of 16% peanut cake had DM contents of 30-35% above the established parameters for good quality silage according to Jobim et al (3), thus justifying the use of this cake as an efficient means to sequester moisture. The results of this study are in accordance with those obtained by Ribeiro et al (19), who also observed significant increases in the DM of tropical grass silage Tanzania grass when they used similar levels of wheat bran as an additive. The linear increase in CP result was due to the higher CP content of the peanut cake (45.70%) compared to massai grass (6.40%). The CP content of silage exceeds the minimum levels of 6 to 8% that are needed to cause effective microbial fermentation in the rumen. Zanine et al (20) observed an increase of 51.7% in protein value when 15% wheat bran was added to the silage of elephant grass, which is in accordance with the results of this work. The results of this study are similar to studies using other additives such as cocoa bran Carvalho et al (5) and coffee shells Carvalho et al (6) that promote an increase in the protein content of silage. Thus, both the peanut cake and other additives show positive results for improving the protein content of grass silages to meet the nutritional requirements of animals, especially during periods of quality food scarcity. The mineral matter levels in the silages in this work are justified by a lower percentage of MM in peanut cake (4.06%) as compared to the massai grass (9.28%). These results corroborate

3269

those found by Ribeiro et al (19) in the silage of Tanzania grass with high levels of wheat bran. The increased levels of EE in the silages are justified, because cake with a high oil concentration generally varies depending on the quality of the seeds and the method used in the oil extraction. The values of EE in the silages are in agreement with reports in the literature Carvalho et al (6) at levels (5-7% DM) that would not impair animal performance. According to Oliveira et al (21), high levels of fat in the diet of ruminants promote physical involvement of fiber and prevent microbial attack, thus reducing the in vivo digestibility of dry matter. The higher content of NFC in the peanut cake in relation to massai grass (Table 1) at the time of silage explains the high levels of NFC fraction in the silage. The high concentration of CNF in the silage may also be associated with the breaking of chemical bonds in structural carbohydrates, mainly hemicellulose, within the grass Ferreira et al (8). The levels NDF and ADF in the silage decreased with the inclusion levels of peanut cake. These results are associated with lower levels of NDF and ADF in the additive compared to massai grass at ensiling. Fontanelli et al (22) found a mean value of 60.7% of NDF in 246 maize silages from different regions of the state, while Costa et al (23) cite values ranging between 52.1 and 59.5% for corn silage. NRC (24), however, has an average content of 45% NDF in 1033 samples of silage corn analyzed in the U.S. According to Mulligan et al (25), these differences can be attributed to the intrinsic higher content of NDF in grasses of tropical origin and, likely, to inadequate techniques silage existing in Brazil, which lead to greater loss of soluble sugars, thus increasing the level of NDF. The reduction in the NDF of the silages may help to improve the intake and digestibility of DM; however, NDF values greater than 55-60% in DM correlate negatively with food intake NRC (24). The high values of ADF may restrict the quality of the silage and may limit its use for animals with special dietary needs Ribeiro et al (19). With an increase in NFC, the corresponding decrease in lignin content will enhance digestibility. This fact can be explained by the power of recalcitrant lignin, which is mitigated by the lower concentration of the sample and allows for better use of fiber by micro-organisms Mello et al (26). Ferrari and Lavezzo (27) observed a linear reduction in hemicellulose

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when increasing levels of cassava were added to a silage of elephant grass containing 18.7% DM. Carvalho et al (6) also observed a decrease in hemicellulose in elephant grass silage containing levels the coffee. The high pH in conventionally preserved silages is indicative of an increased production of acetic and butyric acid, which is characteristic of fermentation reactions Jobim et al (3). The pH value of silage, taken alone, is not considered to be a good criterion for evaluating fermentation Zanine et al (28) because its antibacterial effects depend on the speed of the reduction of pH. The addition of peanut cake did not contribute to this reduction. With the exception of silage without added peanut cake, values found in this study (Table 2). Were within the range considered to be optimal (between 3.8 and 4.3) for desirable fermentation Jobim et al (3). When grass silage is harvested younger and has higher nutritional value, it favors the development of spoilage microorganisms, mainly clostridial bacteria. Which produce ammonia and butyric acid due to high humidity (over 70%), high buffering capacity, and low soluble carbohydrates (less than 5%, based on MS) Zanine et al (28). Ferreira et al (29) evaluated the chemical composition of silage and obtained values from 48.80 to 39.67% ADF for elephant grass silages containing dehydrated pineapple; these values are close to those found in the present study. The efficiency of additives in improving the quality of fermentation can be explained by the supply of soluble carbohydrates, increases in DM levels, or the reduction of the buffering capacity of forage, all of which are factors that have a direct bearing on reducing the pH of the silage. Ă vila et al (4) concluded that the addition of wheat bran improved the fermentation characteristics of silage of Tanzania grass by increasing the osmotic pressure, rather than only by having higher levels of soluble carbohydrates. There was a reduction of NH3-N in the silage. It is noteworthy that in the highest level of inclusion of peanut cake, there was a trend of increasing NH3-N. It is likely that the high amount of sugar favored the growth of microorganisms that grow in media with very low pH and high concentrations of residual sugar, like some species of yeast, which would instigate the deterioration of silage. Similar results were observed by Zanine et al (28) by including cane sugar, which is an additive with a high concentration of soluble carbohydrates

in Tanzania grass and elephant grass silages, respectively. Consumption of silage is usually lower than the consumption of other forages, such as hay and pasture grass. This is attributed to the presence of fermentation products, such as acetic acid, that lower the pH and degrade protein to ammonia Playne and McDonald (17), which can be reduced when establishing procedures that are appropriate for fermentation. The estimated amount of digestible DM increased linearly with the inclusion of peanut cake, which is explained by the inverse relationship that this variable has with NDF. The higher the levels of NDF, the faster the rumen is filled and the faster the animal stops ingesting forage, often ingesting a smaller amount of DM. These results are consistent with those reported by Mullingan et al (25) when assessing silages of maize and sorghum, who commented on the high negative correlation between lignin content and FDA and this content with digestibility. The FVI tropical forages proposed by Teixeira and Andrade (17) can be used to compare tropical forages and determine equivalent degrees of quality. This index is divided into 6 grades, from IVF> 122, which is considered superior. The IVF was found to be lower for silage without added peanut cake, which was classified as grade 3 forage based on the work by Teixeira and Andrade (17), the same grade that applies to elephant grass in nature IVF:78 and andropogon grass IVF:73, forages widely used in feed for ruminants. The highest forage value index was obtained in silage with the addition of 24% peanut cake to massai grass, which was better than the level found by Ribeiro et al (19), with the addition of 34% bran wheat to Tanzania grass, resulting in an IVF 141.61. However, both results are comparable to alfalfa as fodder in nature, because it is a forage of a higher classification than that of Teixeira and Andrade (17). The increase in IVF from the addition of peanut cake is explained by the low NDF and ADF of this additive. With the addition of the peanut cake, the levels of NDF and ADF in silage are reduced (Table 2), and these fractions have an inverse relationship to IVF. In conclusion, the inclusion of up to 24% peanut cake to the silage of massai grass increases the nutritive value of silage. Higher rates of forage value and estimates of dry matter intake and digestibility are obtained with the addition of up to 24% peanut cake during the ensiling of massai grass.

Lima - Peanut cake concentrations in massai

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3273-3281, 2013. ORIGINAL

Determinación y prevalencia de Mycobacterium spp., en tilapia nilótica (Oreochromis niloticus) cultivada en Campeche, México Determination and prevalence of Mycobacterium spp., in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) cultured in México Maurilio Lara-Flores,1* Ph.D, Sara Balan-Zetina,1 Biol, Ana Zapata,1 Biol, Karina Sonda-Santos,1 Biol. Universidad Autónoma de Campeche,Instituto de Ecología, Pesquerías y Oceanografía del Golfo de México. San Francisco de Campeche, Campeche, México. *Correspondencia:maurlara@uacam.mx. 1

Recibido: Julio de 2011; Aceptado: Agosto de 2012.

RESUMEN Objetivo. Determinar la presencia y prevalencia de Mycobacterium spp., en granjas de tilapia nilótica (Oreochromis niloticus) en el Municipio de Champotón, Campeche, México. Materiales y métodos. La colecta de organismos se realizó en tres granjas de cultivo de tilapia nilótica del municipio de Champotón, Campeche, México. Los organismos se examinaron externa e internamente y se tomó una muestra de riñón la cual fue sembrada en forma de estría en medios de cultivo: LöwesnteinJensen, TCBS, KF y en TSA; las placas fueron incubadas a 35°C de 24 a 48 horas, los órganos fueron fijados en formalina tamponada al 10% para ser procesados para histología de rutina para análisis posteriores. Asimismo, muestras de cultivo bacteriológico y de tejido fueron teñidas con la técnica de Ziel-Neelsen con el fin de observar la presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes. Resultados. Los resultados obtenidos sugieren que la presencia de Mycobacterium spp., es constante y en alta prevalencia y puede ser un factor que este mermando la rentabilidad del cultivo. Conclusiones. La presencia de Mycobacterium spp., representa un riesgo para el cultivo de tilapia en el municipio de Champotón, por ser una enfermedad muy persistente y difícil de erradicar una vez ocurrido e brote de infección, por lo cual es importante llevar estudios más detallados de la presencia de este género bacteriano, así como, medidas de prevención y dispersión de este patógeno en los cultivos adyacentes. Palabras clave: Acuicultura, enfermedades de peces, Oreochromis niloticus, México (Fuente: IEDCYT).

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ABSTRACT Objective. Determine the presence and prevalence of Mycobacterium spp., at tilapia (Oreochromis niloticus) farms in the municipality of Champotón, Campeche, Mexico. Materials and methods. The collection of organisms was conducted in three farms of Nile tilapia at Champotón township, Campeche, Mexico. The organisms were examined externally and internally and a kidney sample was inoculated in different growth media: Löwestein-Jensen, TCBS, KF and TSA. The plates were incubated at 35°C for 24 to 48 hours, the organs were fixed in 10% buffered formalin to be processed for routine histology for further analysis. Likewise, bacterial culture samples and tissue were stained through the Ziel-Neelsen technique to observe the presence of acid-fast bacilli. Results. The results suggest that the presence of Mycobacterium spp., is constant and its high prevalence and could be an undermining issue in the profitability of this culture. Conclusions. The presence of Mycobacterium spp., represents a risk for tilapia culture in the municipality of Champotón, it is a very persistent and difficult to eradicate disease once an outbreak has occurred, reason for which it is important to bring more detailed studies of the presence of this bacterial genus, as well as prevention and spread of this pathogen in adjacent cultures. Key words: Aquaculture, fish diseases, Oreochromis niloticus, Mexico (Source: IEDCYT).

INTRODUCCIÓN Actualmente la acuacultura constituye una actividad que contribuye con la alimentación de muchas comunidades del mundo, ya que la pesca está llegando a sus límites máximos de producción debido a la sobreexplotación de algunas especies, la degradación del ambiente, la contaminación de las aguas y los costos producidos por el alza de los precios de los combustibles (1).

La enfermedad no puede considerarse como un proceso de carácter monofactorial sino de carácter multifactorial lo que lleva a contemplarlo como un proceso dependiente de todo el entorno en que se desarrolla el organismo, incluidos el animal hospedero, el agente etiológico, las características de calidad del medio como las fisicoquímicas, biológicas y la manipulación del hombre (5).

El objetivo principal de la acuacultura es la producción de especies acuáticas, para consumo humano o repoblación de especies amenazadas, manipulando o controlando los ecosistemas de aguas dulces, salobres o saladas, en medios naturales o sistemas artificiales (1).

El estudio de las enfermedades acuáticas se ha enfocado principalmente en cultivos de peces y camarón, donde comienzan brotes que se desarrollan con rapidez ocasionando tasas de mortandad altas y que, en algunos casos, tienden a desaparecer con igual rapidez (enfermedades agudas) o por otro lado, se desarrollan con menor velocidad y menor severidad pero que se encuentran persistentes por largos periodos (enfermedades crónicas) (6).

Una de las principales amenazas a la sustentabilidad de la acuacultura son las enfermedades, por lo que desde inicios de los 80´s, diversas organizaciones han creado comisiones especializadas encargadas de promover la sanidad en animales acuáticos y prevenir la transmisión de enfermedades a través de su comercio nacional e internacional (1). El desarrollo y crecimiento de la acuacultura tecnificada con el consecuente incremento en los niveles de intensificación de los cultivos, enfrenta riesgos cada vez mayores de incidencia y dispersión de enfermedades en las poblaciones acuáticas. La mayor amenaza en los cultivos son las enfermedades por virus, bacterias u otros agentes causales de patologías que dada su rapidez de acción, dispersión y alto grado de afectación, pueden llegar a ser difíciles de eliminar o controlar (2-4).

Las enfermedades bacterianas se caracterizan en: 1) erosión en el cuerpo; 2) daños en los ojos, 3) erosión o fusión de las branquias, 4) petequias, 5) ascitis y 6) adelgazamiento del cuerpo (7,8). Entre los agentes Gram-negativo etiológicos más importantes se encuentran los grupos enterobacteriaceas, vibronaceas, aeromonadáceas y pseudomonadáceas. Por otro lado, entre los Gram-positivos más importantes se pueden mencionar: Streptococcus, Lactococcus, Renibacterium, micobacteriáceas y nocardiáceas (9-12). Buller (12), señala que las enfermedades bacterianas no necesariamente son causadas por un solo género bacteriano, sino por interacciones

Lara - Determinación y prevalencia de Mycobacterium spp en Oreochromis niloticus de entre dos o más especies; estableciendo una relación de concomitancia y así obrar en conjunto para el desarrollo de la enfermedad. Particularmente una enfermedad contagiosa puede ocurrir por la virulencia del patógeno, las condiciones del ambiente y la susceptibilidad del individuo (13). Normalmente el estrés no es siempre el factor decisivo para accionar un brote de infección; muchas bacterias como A. salmonicida y M. marinum son patógenos que pueden presentarse con un mínimo de estrés (13). Actualmente una de las enfermedades que ha aumentado la frecuencia de infección en los cultivos acuícolas de peces tropicales son la micobacteriosis; esta es el resultado de una infección por una de varias especies de Mycobacterium. Jacobs et al (14) mencionan que las infecciones por Mycobacterium spp., deben tratarse diferente a otras enfermedades bacterianas por sus propiedades patógenas, ya que las especies de Mycobacterium han demostrado resistencia al sistema inmunológico del pezy también son resistentes a los antibióticos utilizados habitualmente en acuacultura; son extremadamente resistentes porque tienen una pared celular que impide la penetración de un desinfectante común requiriendo dosis altas. La micobacteriosis se ha descrito en más de 160 especies de peces. Es una enfermedad aguda o crónica, dependiendo de las tasas de crecimiento de la especie y los factores ambientales del medio en que se desarrollan los peces, caracterizada por la presencia de granulomas en los órganos viscerales. Algunos organismos pueden mostrar signos externos de la enfermedad y otros no. Entre los signos que se presentan, tanto internos como externos, se encuentran: granulomas en el exterior (principalmente en la boca), anorexia, inflamación abdominal, deformación en el cuerpo, exoftalmia unilateral o bilateral, cambio de color, descamación, hemorragias en las aletas y órganos internos, granulomas en bazo, riñón e hígado (7,14); lo anterior ocasiona la mortandad masiva de los cultivos y pérdidas económicas importantes para el sector productivo. Cabe destacar que en muchas ocasiones no sepresentan signos clínicos de la enfermedad y es hasta cuando el organismo se expone a algún estres ambiental que la enfermedad se manifiesta; por lo anterior es importante seguir un plan de monitoreo en las granjas para detectar el agente patógeno y poder realizar acciones preventiva y/o correctivas antes que provoque la perdida del cultivo. Por otro lado, algunas de las especies de micobacterias son zoonóticas,

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siendo responsables en el hombre de ocasionar ulceraciones en manos y brazos, las cuales, no son fáciles de erradicar pasando de meses a años; siendo los principales pacientes adultos mayores y que típicamente están relacionados con la manipulación de peces y actividades recreacionales (7,14,15). El objetivo del trabajo fue determinar la presencia y prevalencia de Mycobacterium spp., en granjas de cultivo de tilapia nilótica del municipio de Champotón, Campeche, México.

MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio. El municipio de Champotón se encuentra situado en la zona centro del Estado de Campeche, entre los meridianos 89°32´y 91°08´de longitud oeste y entre los 17°49´y 19°4´de latitud norte. Limita al norte con el municipios de Campeche y Hopelchen, al sur con el municipio de Calakmul y al oeste con el municipio del Carmen y el Golfo de México. Cuenta con una extensión territorial de 6.088 km2 lo que representa el 10.7% del total del Estado. En este municipio se localiza el río Champotón, desde Canasayab hasta Champotón, con una longitud de 47 km. Su cuenca es de 6 080 km2 y su escurrimiento anual asciende a 885 000 m3. El clima es variado, predominan los vientos cálidos provenientes del este y sureste. Con temperaturas máximas de 40°C en el mes de mayo y las mínimas de 10 a 14°C en el mes de enero. Estación de muestreo y tipo de muestreo. El presente estudio se llevó a cabo en complejos acuícolas de las comisarías de Canasayab, El Zapote y Santa Cruz de Rovira. El cultivo se realiza en jaulas para engorda de tilapia nilótica (O. niloticus) pertenecientes a tres líneas genéticas: hibrido de nilótica (O. niloticus x O. mossambicus), tilapia Stirling (O. niloticus) y tilapia brasileña (O. niloticus brasiliencies). Los peces son adquiridos de proveedores locales y de otros estados como Yucatán, Tabasco y Chiapas. De acuerdo a la Office International de Epizooties (OIE) (15), el tipo de muestreo que se llevó a cabo es el de tipo monitoreo o de rutina que recomienda para poblaciones de animales que no presentan registros de enfermedades. La frecuencia del muestreo fue bimestral y los meses se alternaron de acuerdo a las zonas donde se distribuyen los complejos, así como, el ciclo de producción de los mismos. Los organismos fueron colectados al azar con el propósito de determinar si el cultivo se encuentra libre de enfermedades.

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Tamaño de muestra. El tamaño de muestra objetivo fue de 30 organismos, en etapa juvenil y de pre-engorde, por muestreo y está determinado con base a las tablas epidemiológicas (15) con un nivel de confianza del 95% asumiendo una prevalencia del 10% para el muestreo, considerando que la población objetivo fue mayor a los 10,000 individuos por granja. La captura de organismos se llevó a cabo con una red cuchara. Trabajo de campo. Una vez tomada la muestra de organismos, se procedió a examinar la parte externa e interna de los peces capturados con la finalidad de determinar la posible presencia de alguna anomalía obvia de enfermedad. Para llevar a cabo el examen interno se sacrificó al pez por medio de una severación espinal que se realizó haciendo un corte transversal en la parte dorsal-posterior de la cabeza. Los órganos de los peces (dependiendo del tamaño), fueron fijados y preservados en formalina amortiguada al 10% en agua destilada, después de 72 horas, fueron transferidos a etanol al 50% para ser procesados para histología de rutina. Aparte de las muestras tomadas directamente de los órganos, la tinción Ziel-Neelsen (HYCELMR 64293) también se practicó sobre cortes histológicos de ejemplares que presentaron granulomas típicos de micobacteriosis. Análisis bacteriológico. Para determinar la prevalencia de Mycobacterium spp., en las distintas granjas, se procedió a tomar una muestra del riñón. En presencia de signos clínicos externos se tomaron muestras de otros órganos como: bazo, hígado, así como ulceraciones características, y en caso muy particular se tomaron muestras de sangre. Las muestras fueron inoculadas por estría en medios de cultivo sólidos. Se utilizaron por espécimen un medio general de Agar de Soya y Tripticaseína (TSA, BioxonMR 4343986) y medios selectivos: Agar KF (Difco TM 249610), Agar TCBS (DibicoTM 1079R91) y Medio LöwesteinJensen (DifcoTM 244420) este último preparado en tubos inclinados. Las placas sembradas fueron guardadas en bolsas de plástico y a baja temperatura para su transporte al laboratorio. Se incubaron las muestras a una temperatura de 35°C, y cada 24 horas se examinaron. Para diferenciar los grupos bacterianos concomitantes a la infección por Mycobacterium spp., presentes en los cultivos, se realizó una minuciosa observación de la estructura y forma de la colonia. Las colonias fueron visibles

entre 24 y 48 horas, y se tomaron en cuenta las características descritas por Kimberley y Whitman (10). Las bacterias aisladas se tiñeron mediante las técnicas de Gram (HYCELMR 541) y Ziel-Neelsen (HYCELMR 64293). En este estudio, las muestras fueron obtenidas de manera independiente de cada granja,por lo tanto la probabilidad de que Mycobacterium se presente en las tres granjas es independiente, ya que las condiciones de desarrollo en el cultivo son diferentes. En estas condiciones, se calculó la probabilidad condicional de que en cada granja, se presentara Mycobacterium de manera independiente y también que se presente Vibrio y Streptococcus dado que ya existió Mycobacterium. Lo anterior se realizó en virtud de que Mycobacterium es un oportunista y solo se presenta en caso de que se presenten otros agentes patógenos. Análisis estadístico. El análisis de prevalencia cuyo valor se expresó en porcentajes (%), se realizó por el total de organismos colectados en el estudio y el número de organismos colectados por granja; y se calcularon en términos de organismos con lesiones, y el resultado bacteriologico. Para analizar diferencias significativas entre la proporción de los grupos bacterianos presentes en las granjas, se realizó un análisis de c2, empleando una tabla de contingencia de 2x2. Los datos utilizados no fueron convertidos, es decir no se trabajaron con los porcentajes obtenidos, sino que se trabajaron con el número de organismos que presentó cada género bacteriano, el número de organismos que no lo presentó y el total de organismos colectados.

RESULTADOS Un total de 225 organismos fueron colectados en las granjas de cultivo en nueve muestreos realizados, sin embargo no se obtuvo en la mayoría la muestra mínima establecida anteriormente por falta de cooperación por parte de los productores. Del total de organismos analizados se tiene que 78.2% (176) presentaron una o más lesiones que pudieran estar asociadas a infecciones bacterianas, donde el 29.3% corresponde a la granja de Canasayab, el 27.5% pertenece a la granja de Santa Cruz de Rovira y el 21.3% constituye la granja El Zapote (Tabla 1). Las lesiones internas fueron constantes en las tres granjas, sin embargo, en Santa Cruz de

Lara - Determinación y prevalencia de Mycobacterium spp en Oreochromis niloticus Tabla 1. Porcentaje de organismos que presentaron lesiones asociadas a bacterias por granja. (número de organismos). Organismos con lesiones

Organismos sin lesiones

Total de organismos

Canasayab

29.3% (66)

10.2%(23)

Sta. Cruz de Rovira

27.5% (62)

3.56% (8)

Zapote

21.3% (48)

8% (18)

78.2% (176)

21.8%(49)

225

Granjas

Total

Tabla 3. Porcentaje de organismos con resultado positivo a bacteriología. (número de organismos). Canasayab

Sta. Cruz de Rovira

Zapote

Positivo a bacteriología

76.4% (68)

80.0% (56)

56.1% (37)

Mycobacterium

63.3% (43)

57.1% (32)

97% (36)

Vibrio

47.0% (32)

55.3% (31)

29.7% (11)

Streptococcus

52.9% (36)

33.9% (19)

18.9% (7)

179

138

TOTAL

Rovira las lesiones externas fueron sobresalientes y constantes. Con respecto a los signos externos observados durante los muestreos se exhibieron: necrosis en aletas, ulceraciones en boca, petequia en boca y cuerpo, exoftalmia unilateral, deformidad en cola, boca y opérculo, pérdida de color; por mencionar las más importantes. Internamente se observaron: hepatopáncreas pálido e inflamado, presencia de grasa en la cavidad abdominal, bazo inflamado, branquias pálidas, intestino hemorrágico, inflamación y hemorragias en el riñón (Tabla 2).

Tabla 2. Anomalias y lesiones externas e internas más importantes de acuerdo a la prevalencia en el total de organismos colectados* Lesiones

Casos

Origen

Grasa en la cavidad abdominal

Interno

Aletas escoriadas y necróticas

Externo

Desordenes en el hígado

Interno

Desordenes en el riñón

Interno

Bazo inflamado

Interno

Petequia en boca

Externo

Ulcera en boca

Externo

Ulcera en la piel

Externo

Exoftalmia

Externo

Desordenes en la vesícula biliar

Interno

Necrosis en branquia

Externo

Deformación en boca

Externo

Deformación en opérculo

Externo

Desordenes en el intestino

Interno

Deformación en cuerpo

Externo

Ulcera en la cabeza

Externo

*Por cada organismo analizado se presentaron de uno a más trastornos observados

De los 225 organismos colectados 72% (161) fueron positivos a crecimiento bacteriano, en donde, el 30% fue para Canasayab, 24% para Santa Cruz de Rovira y 17% para El Zapote (Tabla 3). Se identificaron tres grupos bacterianos: Mycobacterium spp., Vibrio y Streptococcus; variando su prevalencia para las tres granjas de cultivo, siendo Canasayab la granja que presentó la mayor proporción de organismos infectados. Mycobacterium spp., fue la bacteria de mayor prevalencia en las tres granjas de

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cultivo, considerándose que esta bacteria podría estar contribuyendo significativamente al cuadro patológico observado. Las proporciones bacterianas fueron estadísticamente comparadas y se observó que estas son diferentes entre las granjas a pesar que los géneros bacterianos aislados fueron los mismos para los tres complejos (Tabla 3). En la tabla 4 se presentan los resultados por granja del porcentaje de asociación de Vibrio y Streptococcus con respecto a Mycobacterium spp., y el número de organismos cuyo grupo bacteriano se presentó de manera independiente. Por otro, lado se realizó un análisis de probabilidad condicional en cada granja para conocer la probabilidad de que exista Mycobacterium spp., de manera independiente y la posibilidad que se presenten conjuntamente los tres géneros. En la granja Canasayab, el 25% de los organismos analizados presentó de manera independiente infección por Mycobacterium spp., el 10.2% por Vibrio y el 13.2% por Streptocossus. Por otro lado, el 13.2% de los organismos infectados por Mycobacterium spp., mostró cierta concomitancia Tabla 4. Prevalencia entre grupos bacterianos aislados en la diferentes granjas del Municipio de Champotón, Campeche. Granja de Canasayab Mycobacterium

Vibrio

Mycobacterium

25.0%

Vibrio

13.2%

10.2%

Streptococcus

14.7%

11.7%

Streptococcus

Relación 3

13.2% 11.7%

Granja de Santa Cruz de Rovira Mycobacterium

25.8%

Vibrio

17.8%

19.6%

5.3%

12.5%

Streptococcus

10.7% 5.3%

Granja El Zapote Mycobacterium

62.1%

Vibrio

16.2%

2.7%

5.4%

0.0%

Streptococcus

0.0% 13.5%

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con Vibrio y el 14.7% con Streptococcus. Sin embargo el 11.7% de los organismos exhibió de manera simultanea los tres géneros aislados. Los resultados del análisis de probabilidad condicional muestraron la posibilidad que e x i s t a M y c o b a c t e r i u m s p p . , d e m a n e ra independiente es del 51%. Por otro lado la probabilidad de que se presente Vibrio es del 62% y para Steptococcuses del 66%, dado que Mycobacterium spp., ya se presentó. En Santa Cruz de Rovira los resultados mostraron que el 28.5% de los organismos presentaron infección de manera independiente por Mycobacterium spp., 19.6% por Vibrio y 10.7% solo por Streptococcus. En cambio el 17.8% de los organismos infectados por Mycobacterium spp., exhibe una relación de concomitancia con Vibrio y el 5.3% con Streptococcus.Observándose que solo el 5.3% de los organismos presentó al mismo tiempo los tres géneros bacterianos. Por otro lado, la probabilidad que se presente Mycobacterium spp., de manera independiente en esta granja es de 48%. Sin embargo, la probabilidad de que se presente Vibrio dado que existe Mycobacterium spp., es del 80%; y la posibilidad que se presente Streptococcus si ya existe Mycobacterium spp., es del 36%. En la granja Zapote se observó que el 62.1% de los organismos presentaron infección de manera independiente por Mycobacterium spp., y el 2.7% por Vibrio. En cambio el 16.2% de los organismos infectados por Mycobacterium spp., exhibió una relación de concomitancia con Vibrio y el 5.4% con Streptococcus; y el 13.5% de los organismos manifestó la presencia de los 3 géneros bacterianos. Por otro lado, el análisis de probabilidad condicional mostró que para esta granja el 95% de los organismos presentan la posibilidad de presentar Mycobacterium spp., de manera independiente. Sin embargo, la probabilidad de que se presente Vibrio dado que existe Mycobacterium spp., es del 84%; y la posibilidad de se presente Streptococcus si ya existe Mycobacterium spp., es de 53%. Los resultados del análisis de probabilidad condicional para las 3 granjas muestran que la posibilidad que exista Mycobacterium spp.,de manera independiente es del 51%. Por otro lado la probabilidad de que se presente Vibrio es del 62% y para Streptococcus es del 66% dado que Mycobacterium spp., ya se presentó.

DISCUSIÓN Actualmente el desarrollo de la acuacultura enfrenta riesgos cada vez mayores de incidencia y dispersión de enfermedades, diversos autores mencionan que la presencia de las enfermedades se debe al incremento en los niveles de intensificación de los cultivos. Una de las especies de mayor importancia en la acuacultura es la tilapia, porque es una especie resistente a enfermedades y por su capacidad de adaptación a ambientes diversos de cultivo (4,17). Sin embargo, estas pueden presentar enfermedades a causa de un estrés ambiental severo como: una baja de temperatura, manipulación, sobrepoblación y una pobre calidad del agua; presentándose principalmente en los alevines. Entre las enfermedades que afectan a esta especie se encuentran: el síndrome de la septicemia hemorrágica bacteriana, streptocosis, micobacteriosis y columnaris (17-19). Por tal motivo, es necesario llevar a cabo estudios que determinen los posibles patógenos en los sistemas de cultivo y así prevenir la dispersión y desarrollo de estas enfermedades. La presencia de micobacterias en granjas de cultivo y en acuarios es de importancia social, ecológica y económica. Esta enfermedad es persistente y difícil de erradicar una vez ocurrida la epizootia (14,15,19), el tiempo de incubación es variable y pueden pasar años para su desarrollo hasta la muerte de los organismos causando deformidades esqueléticas (6,15,20), por su importancia zoonótica en seres humanos, la presencia de este patógeno conduce a la pérdida de su valor comercial (6,15). En el presente estudio se aislaron tres géneros bacterianos de importancia patógena, sin embargo por los análisis de laboratorio realizados, la presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes aislados de cultivo y tejido, y de granulomas presentes; se determinó que la presencia de Mycobacterium spp., puede ser la posible causa de las patologías observadas en las granjas de cultivo de tilapia en el municipio de Champotón, Campeche, México. Aunque la sintomatología observada no permite asegurar que la infección es causada únicamente por Mycobacterium, las lesiones observadas son básicamente similares a las descritas en estudios realizados tanto en peces de agua dulce y marinos, ya sea por inducción experimental o por infecciones espontáneas de micobacteriosis (20-23). Entre los signos descritos por la presencia de Mycobacterium se encuentran: pérdida de peso, necrosis y quistes en órganos internos, exoftalmia, inflamaciones cutáneas, deformaciones esqueléticas

Lara - Determinación y prevalencia de Mycobacterium spp en Oreochromis niloticus especialmente en espina dorsal y mandíbula; y decoloración del cuerpo (6,20,24,25). En este estudio las granjas de Canasayab y Santa Cruz de Rovira se observaron signos externos como: ulceraciones en piel, exoftalmia unilateral o bilateral, inflamación abdominal, anorexia, decoloración del cuerpo, necrosis en aletas, deformación del cuerpo y hemorragias en aletas; sin embargo en El Zapote solo se observaron signos internos. Algunos autores mencionan que la micobacteriosis es una enfermedad crónica progresiva con signos clínicos o asintomática (6,15,23,24,26,27), en este caso podemos señalar que la presencia de la enfermedad fue crónica, con signos clínicos, para el caso de Santa Cruz de Rovira y Canasayab; y asintomática en el caso de la granja El Zapote. Por otro lado, estudios realizados en róbalo rayado expuestos a la presencia de Mycobacterium mencionan que los juveniles no presentaron lesiones internas y externas, mientras que en peces adultos exhiben lesiones externas e infección en los órganos internos (28). Lo anterior podría explicar la ausencia de lesiones externas en los organismos colectados en El Zapote, dado que, estos eran juveniles; en cambio en Canasayab y Santa Cruz de Rovira lo organismos colectados se encontraban en etapas más desarrolladas y por lo tanto, con mayor presencia de lesiones internas y externas. Microscópicamente se identificaron granulomas y bacilos ácido-alcohol resistentes en órganos como branquias, submucosa gástrica, hígado y bazo; en las tres granjas. Las cuales de acuerdo a diferentes autores son una característica típica de la presencia de Mycobacterium spp (22,24,27,29). Aunque estudios realizados por Tavares et al (30) no observaron dichos granulomas en tilapia (O. niloticus) a pesar de detectarse la enfermedad en cultivo bacteriológico, sin embargo, en este estudio se pudieron observar los granulomas característicos a la enfermedad. Pérez et al (31) mencionan que la presencia de Mycobacterium spp., en las instalaciones de cultivo y demás cuerpos de agua representa un alto riesgo ya que puede causar mortalidades superiores al 10%. En Israel la micobacteriosis es una de las enfermedades más devastadoras en los recientes años (32). Conroy (18) reporta importantes infecciones con micobacteriosis en el cultivo de tilapia en países africanos, en la región de América Central y en Cuba. Como se ha mencionado la presencia de Mycobacterium spp., representa un alto riesgo para los cultivos y las especies nativas. Belas et al (25) mencionan que la prevalencia de

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micobacteriosis en especies silvestres es del 62%, observándose el mismo porcentaje en peces de acuario (23). En especies de peces marinos Kattari et al (33) reporta un porcentaje de 75%. En el presente estudio la prevalencia para Canasayab fue de 63.3%, para Santa Cruz de Rovira del 57% y para El Zapote de 97% observando que los porcentajes obtenidos son mayores en comparación con los autores antes mencionados. Por lo tanto, se puede mencionar que las granjas de cultivo estudiadas están siendo afectadas por la presencia de esta bacteria, sin embargo, no se conoce la ruta de infección. Diversos autores mencionan que la presencia de esta enfermedad puede considerarse como una típica afección por manejo inadecuado de los organismos que sólo se presenta bajo condiciones inadecuadas de cultivo (carencia de luz, vitaminas, etc.) o bien por alimento contaminado con el patógeno (24); también hay que considerar que el desarrollo de la enfermedad puede presentarse por la combinación de los factores antes mencionados. A pesar que actualmente nuevas tendencias indican que el desarrollo de las enfermedades en acuacultura es ocasionada por un desequilibrio entre las variables que involucran a un sistema de cultivo, el agente, el hospedero y el medio (11); en este estudio es difícil determinar cual o cuales fueron las rutas de infección, ya que los parámetros ambientales no fueron observados, dado las características no controladas de los sistemas de cultivo. Se puede mencionar que la infección pudo haberse presentado desde que los organismos fueron introducidos a la unidad acuícola, desencadenándose una segunda fase de infección por un estrés ambiental. Por lo anterior, se establece que la micobacteriosis es una enfermedad que limita el desarrollo de la acuacultura, apareciendo a veces en forma periódica, que puede manifestarse en forma asintomática sin ocasionar daños visibles, o bien desarrollar un cuadro clínico específico afectando a los peces, siguiendo un curso crónico, hasta la muerte de los organismos; dando como consecuencia que la granja se vea afectada en un futuro por esta enfermedad y que los organismos silvestres también se vean afectados. Por otro lado, algunas de las especies de micobacterias son zoonóticas, siendo responsables en el hombre de ocasionar ulceraciones en manos y brazos, las cuales no son fáciles de erradicar pasando de meses a años para su completa eliminación. Austin y Austin (8) mencionan que los principales pacientes son personas mayores y que típicamente están relacionados con la manipulación de peces y actividades recreacionales. Por tal motivo la presencia de

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estas bacterias en las granjas de cultivo son de importancia, pues esta actividad se lleva a cabo en jaulas colocadas en el río y laguna de estas comunidades, pudiendo ocasionar en el futuro problemas similares en humanos. Por lo tanto es importante llevar a cabo este tipo de estudios que determinen la presencia de posibles patógenos en los organismos de cultivo y así prevenir la dispersión de enfermedades en los organismos naturales de la región y las de nuevo cultivo; evitando que en un futuro los cultivos se vean afectados por el desarrollo de estas enfermedades y la resistencia de estos patógenos que compliquen su tratamiento; dado que existen reportes que señalan los efectos negativos de las enfermedades tanto a nivel ecológico como económico. Hasta la fecha de elaboración de este trabajo no se encontraron reportes previos de esta enfermedad que afecte a los cultivos en México por lo que podemos considerar este como el primer reporte de este agente patógeno en el país. En conclusión en las tres granjas estudiadas, el género de mayor proporción fue Mycobacterium

spp., a pesar de presentar concomitancia con el género Vibrio y Streptococcus, observándose diferencias entre las proporciones bacterianas encontradas. Por otro lado estas proporciones fueron superiores, lo cual sugiere que la enfermedad puede causar una reducción significativa del producto final en los productores. Finalmente la presencia de Mycobacterium spp., representa un riesgo para el cultivo de tilapia, por ser una enfermedad muy persistente y difícil de erradicar. Es importante llevar acabo estudios más detallados de la presencia de este género bacteriano, así como medidas de prevención y dispersión de este patógeno en los cultivos adyacentes al Municipio de Champotón. Agradecimientos El presente trabajo fue financiado por el Fondo Mixto CONACYT-Gobierno del Estado de Campeche con clave: CAMP2004-C02-1. Al laboratorio de Histopatología del Instituto EPOMEX-UAC por el procesamiento de las muestras. A los productores del municipio de Champotón, México por su participación en el proyecto.

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3282-3287, 2013. ORIGINAL

Leptospirosis porcina: prevalencia serológica en establecimientos productores de la República Argentina Swine leptospirosis: Serological prevalence inproducing establishments in Argentina Republic Jessica Petrakovsky M,1* Lic, Julio Tinao,1 Tec, Jorge Esteves M,1 MV. Laboratorio de Referencia de la O.I.E. en Leptospirosis. Dirección de Laboratorios y Control Técnico, SENASA. Buenos Aires. Argentina. Correspondencia:jpetrako@senasa.gov.ar. 1

Recibido: Enero de 2012; Aceptado: Septiembre de 2012.

RESUMEN Objetivo. Detectar la presencia de anticuerpos contra Leptospira sp en cerdos asintomaticos, pertenecientes a establecimientos de producción porcina ubicados en todo el territorio de la República Argentina. Materiales y métodos. La asignación de predios y muestras se realizó en forma proporcional a los registrados en cada provincia a lo largo de todo el país. En total se estudiaron 1.524 predios, de los cuales se tomaron 19.872 muestras de suero y en la primera etapa se procesaron 3.631 de los mismos. Este estudio tomó en consideración zonas identificadas por provincia, municipio y predios. Los sueros fueron analizados por la técnica de MAT (prueba de microaglutinación). Resultados. El 30% de las muestras resultaron positivas a la prueba tamiz empleada (primera etapa del MAT). La mayoría presentó coaglutininas a dos o tres serovariedades. Al realizar la titulación de los sueros (segunda etapa del MAT), el porcentaje de positividad se mantuvo, siendo los serovares de mayor prevalencia Castellonis e Icterohaemorrhagiae. El 90% de las muestras presentó un título final de 1:200. Conclusiones. La existencia de sueros positivos en todas las provincias indica el contacto de los animales con la leptospira a lo largo de todo el país. Palabras clave: Cerdo, epidemiología, leptospira, leptospirosis (Fuente: Agrovoc).

ABSTRACT Objective. To detect the presence of antibodies to leptospira sp in pigs that didn’t show clinical symptoms, of swine production farms located throughout Argentina. Materials and methods. The location of farms and samples were chosen in proportion to those recorded in each province covering the whole country. The number of farms studied was 1,524, with 19,872 serum samples. This study takes into consideration areas identified by provinces, municipalities and properties. In the first phase 3,631 sera were processed and analyzed by MAT (microscopic agglutination test). Results. The 30% of the samples tested were positive for the screening test (MAT). Most of these samples presented coagglutinins for two or three serovars. In the titration of sera, the percentage of positives was the same, the most prevalent serovars were Icterohaemorrhagiae and Castellonis. The 90% of the samples had a final titer of 1:200. Conclusions. The existence of positive sera in all provinces indicates the contact of animals with leptospira throughout the country. Key words: Epidemiology, leptospira, leptospirosis, pigs (Source: Agrovoc).

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Petrakovsky - Leptospirosis porcina en Argentina

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INTRODUCCION La leptospirosis es una zoonosis infectocontagiosa de nivel mundial producida por cepas patógenas del género Leptospira (1). La enfermedad es más frecuente en regiones de clima tropical o subtropical debido a las altas condiciones de humedad que son necesarias para la supervivencia de las leptospiras. La epidemiología de la leptospirosis ha sido modificada por los cambios en la cría de animales, el clima y el comportamiento humano (2). La enfermedad se mantiene en la naturaleza debido a la infección crónica de los túbulos renales de animales portadores, que excretan el microorganismo en la orina, contaminando el medio ambiente. La infección humana se produce por contacto directo con la orina o los tejidos de animales infectados o, más comúnmente por la exposición indirecta a las leptospiras en el suelo húmedo o agua. Los reservorios más importantes son los roedores y otros pequeños mamíferos, pero los animales de compañia y el ganado, también son fuentes significativas para el contagio de los humanos. La infección de los animales portadores por lo general se produce durante edades tempranas y, una vez infectados, pueden excretar leptospiras en la orina en forma intermitente o continua durante toda la vida (3). Los porcinos criados en sistemas intensivos plantean un problema diferente a los criados a campo o semi intensivos. En los grandes criaderos la posibilidad de infección cruzada es muy importante debido a la alta densidad de población. El movimiento de los animales de un corral a otro y el contacto con desechos de otros corrales son los medios más importantes de diseminación de la enfermedad en estos establecimientos. La introducción de la misma puede ocurrir por la incorporación al plantel de un padrillo que sea portador de leptospira en su aparato genital. Los animales susceptibles adquieren la infección por contacto directo o indirecto (4). El conocimiento de los serotipos prevalentes y de los hospedadores de mantenimiento, es esencial para entender la epidemiología de la enfermedad en cualquier región (5). En Argentina la leptospirosis tiene un impacto económico negativo en las producciones porcinas y bovinas, con formas agudas o crónicas, acompañadas de abortos y muertes perinatales, retención placentaria, infertilidad, anemia hemolítica, ictericia y congestión pulmonar, así como disminución de la producción láctea en bovinos de leche. (6)

Considerando que los servicios veterinarios oficiales tienen un importante rol en el control de la leptospirosis, los laboratorios de referencia les brindan apoyo técnico en el diagnóstico y en la aplicación de distintas medidas de control. A partir de un importante muestreo llevado a cabo por el SENASA, este Laboratorio ha iniciado un estudio de prevalencia en la especie porcina. Los sueros a los que se tiene acceso se encuentran perfectamente identificados por provincia, municipio y predio. El objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia de anticuerpos contra leptospira en cerdos que no presentaban sintomatología clínica, distribuidos en distintos puntos de la República de Argentina.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. Se realizó un estudio descriptivo de corte transversal. La población bajo estudio comprendió una muestra representativa de la totalidad de la población porcina doméstica local. Los sueros analizados provinieron en su origen de un muestreo nacional realizado para determinar la prevalencia de peste porcina. Sitio de estudio. Este muestreo se realizó en el año 2006 y cubrió la totalidad del País. Se tuvo en cuenta la cantidad de predios por provincia y el número de animales contenidos en cada uno de ellos. La asignación de predios o muestras se realizó en forma proporcional a los registrados en cada provincia. Muestra. El total de predios muestreados fue 1.524, donde se obtuvieron 19.872 muestras de suero de los cuales se analizaron 3631. Cada muestra fue georreferenciada teniendo en cuenta provincia, departamento (partido) y predio. Población. Se definió la población como el universo de cerdos existentes en el momento del muestreo antes aludido. Al conglomerado de área como las provincias, departamento (partidos) y predios con existencia de especie porcina. A la variable en estudio como la proporción de cerdos con presencia o ausencia de anticuerpos contra leptospiras, y a la unidad de muestreo como el suero individual de cada cerdo. Determinación del tamaño de la muestra. De acuerdo a lo anterior y tomando en cuenta que los antecedentes de prevalencia de leptospirosis porcina en Argentina son muy variables (7), se calculó el tamaño de la muestra para detectar una

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prevalencia del 50% con un error del 2.5% y una confianza del 95%. El cálculo se realizó mediante el programa Win Episcope 2.0 (8), el cual determinó que se deban tomar al menos 1.427 muestras. Dado que nuestra capacidad operativa permitía aumentar ese número se procesaron, en esta primera etapa, 3.631 muestras a fin de disminuir los errores muestrales (dado las características de la población en estudio). Análisis de los sueros. Con las muestras obtenidas se realizó una búsqueda de anticuerpos contra leptospirosis utilizando la prueba de microaglutinación (MAT) con el uso de una batería de cinco serovariedades de Leptospira interrogans de referencia (Castellonis, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes y Wolffi) que en estudios anteriores mostraron estar presentes en Argentina (7). Estas cepas fueron cultivadas en medio líquido EMJH (Difco, Ref 279410) (9). El procedimiento utilizado en la prueba de microaglutinación (MAT) fue el descrito en el “Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres. OIE. 2008”. El criterio de positividad fue un título mayor o igual a 1:100. En una primera etapa se procesaron los sueros diluidos 1:100 para identificar los positivos, los cuales fueron titulados posteriormente para determinar el serovar presente en ese suero y el valor de su título. Cuando se utiliza la dilución del suero 1:100 pueden detectarse como positivos más de un serovar, debido a la presencia de coaglutininas (10).

Tabla 1a. Cantidad de animales positivos y negativos y sus respectivos porcentajes. Animales muestreados Positivos

Negativos

1.102

2.509

Total 3611

30.35

69.65

100.0

Tabla 1b. Cantidad de serovares hallados por animal y sus respectivos porcentajes. 1

3o más

512

496

8.53

46.46

45.01

Tabla 1c. Frecuencia de aparición de cada serovar analizado, expresada en números absolutos y porcentajes. Los porcentajes suman más de 100 debido a que cada serovar puede aparecer más de una vez en screenig. Serovar de L. Interrogans Icterohaemorrhagiae

Castellonis

Pomona

Pyrogenes

Wolffi

766

494

496

310

541

69.5

44.8

45.0

28.1

49.1

N: Número de muestras; P: PORCENTAJES Los % suman mas de 100% x q se refieren al total de +. Algunos sueros se manifiestan + a mas de un serovar.

Tabla 2. Resultados finales obtenidos en la titulación. Positivos por titulación Serovar de L. Interrogans Castellonis

Icterohaemorrhagiae

Pomona

Pyrogenes

Wolffi

Total

371

260

186

110

175

1.102

33.7%

23.6%

16.9%

10.0%

15.8%

100.0%

de 1:200 (Tabla 3, y Figura 1).

RESULTADOS De los 3.631 animales muestreados, 1.102 resultaron positivos, 30% de las muestras a la dilución 1:100 (Tabla 1a). En esta etapa, la mayoría de los sueros reaccionaron a dos (46%), o a tres serovares (45%) (Tabla 1 b). Los serovares que aparecieron con más frecuencia fueron Castellonis (65%), Wolffi (49.1%) y Pomona e Icterohaemorrhagiae (45%) (Tabla 1c). Los porcentajes obtenidos suman más de 100, debido a que algunos sueros resultaron positivos a más de un serovar.

El porcentaje de positividad de cada provincia fue variable aunque en 20 de las 22 provincias Tabla 3. Frecuencia de aparición de los títulos finales positivos (iguales o mayores a 1:100) expresados en números absolutos y porcentajes. Dilución de suero

1:100

1:200

1:400

1:800

Total

Cantidad

993

1.102

Porcentaje

7.0%

90.1%

2.8%

0.1%

100.0%

En la titulación final se observó que se mantuvo el porcentaje de positividad (30%), siendo los serovares de mayor prevalencia Castellonis con un 33.7% e Icterohaemorrhagiae con el 23.6% (Tabla 2). Los títulos obtenidos fueron bajos, casi la totalidad de las muestras (90%), presentó títulos

Figura 1. Porcentaje y relación de los títulos finales positivos (mayores o iguales a 1:100).

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Petrakovsky - Leptospirosis porcina en Argentina (90%), estuvo comprendido en el rango de 20-40% (Tabla 4, Figura 2). En la figura 3 se observan en cada provincia los serovares detectados en la primera etapa y los confirmados por titulación. El serovar prevalente fue Castellonis. La mayoría de las muestras con serología positiva se concentraban en la región media y norte del país ya que en esas zonas es donde se ubican predominantemente las explotaciones porcinas (Figura 4).

DISCUSIÓN

Tabla 4 . Cantidad de sueros positivos (determinados en la titulación, con título mayor o igual a 1:100) y negativos en cada provincia y sus respectivos porcentajes. Neg

Positivos por titulación

Porcentaje de positivos

Totales

MENDOZA

NEUQUEN

CATAMARCA

ENTRE RIOS

RIO NEGRO

SAN JUAN

SANTA CRUZ

CHACO

CHUBUT

JUJUY

MISIONES

LA RIOJA

110

135

SAN LUIS

150

FORMOSA

136

200

LA PAMPA

169

246

STG. ESTERO

233

122

355

SANTA FE

256

117

373

CORDOBA

478

212

690

BUENOS AIRES

601

251

852

2509

1102

3611

PROVINCIA CORRIENTES

SALTA TUCUMAN

Figura 2. Frecuencia de aparición de sueros positivos y negativos expresados por provincia

Total general

Figura 3. Comparación entre la cantidad de sueros positivos a los distintos serovares que se detectan en el screening y la confirmada posteriormente en la titulación en cada provincia que se detectan en el screening y la confirmada posteriormente en la titulación en cada provincia.

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Figura 4. Mapa de la República Argentina con distribución geográfica de las muestras analizadas y su respectivo serovar.

Petrakovsky - Leptospirosis porcina en Argentina La existencia de anticuerpos en los sueros en todas las provincias muestreadas indica que existe un contacto de los animales con la leptospira en todo el país. A nivel nacional el 30% de los animales muestreados resultaron positivos y a nivel provincial se observó una tendencia similar. El serovar prevalente fue Castellonis, seguido por Icterohaemorrhagiae. Existe un agrupamiento de los animales reaccionantes en la región Central y Norte del País, el cual coincide geográficamente con las áreas donde se encuentran mayor cantidad de explotaciones porcinas. También debe considerarse que en esas regiones geográficas predomina un clima cálido y húmedo propicio para el desarrollo de Leptospira. Es relevante conocer la prevalencia de los anticuerpos correspondientes a cada serovariedad, observar si se mantiene en el tiempo y si se agregan nuevas serovariedades a las ya existentes. Esto se basa en el comportamiento regional de la leptospirosis porcina, influenciada

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directamente por condiciones ambientales, por el tipo de explotación y por la fauna anexa a donde se alojan los animales (11,12). Debido a la información remitida en el presente trabajo sumada a la ya existente, sería necesario realizar otro estudio orientado a zonas que tradicionalmente no se hubieran seleccionado para la búsqueda de anticuerpos de leptospira, realizando el debido doble muestreo y orientado posteriormente a obtener aislamientos de Leptospira sp. Es fundamental contar con datos epidemiológicos en la región para poder implementar medidas de prevención y control adecuadas, ya que la leptospirosis es una enfermedad de muy difícil erradicación debido a que se mantiene en sus reservorios silvestres. En conclusión, la existencia de sueros positivos en todas las provincias indica el contacto de los animales con la leptospira a lo largo de todo el país.

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10. Organización Mundial de la Salud. Anexo 16: Preparación de Medios de Cultivo. En Organización Mundial de la Salud. Leptospirosis Humana: Guía para el Diagnóstico, Vigilancia y Control. Traducción del Centro Panamericano de Fiebre Aftosa. Río de Janeiro: Centro Panamericano de Fiebre Aftosa; 2008. 11. Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). Leptospirosis. En: OIE, editores. Manual de las pruebas de diagnóstico y de las vacunas para los animales terrestres. Sexta edición. Paris: OIE; 2008. 12. Rosa R, Murillo N. Guía para el Control y Manejo de la Leptospirosis. Organización Panamericana de La Salud. OPS/HCP/HCV/ URU.ZOO.01/02. Uruguay: Organización Mundial De La Salud; 2002.

Rev.MVZ Córdoba 18(1):3288-3294, 2013. ORIGINAL

Parasites and hepatic histopathological lesions in lisa (Mugil incilis) from Totumo mash, North of Colombia Parásitos y lesiones histopatológicas en lisa (Mugil incilis) de la Ciénaga del Totumo, norte de Colombia Jesús Olivero V,1 Ph.D, Bárbara Arroyo S,1 M.Sc, Ganivet Manjarrez P,1 M.Sc. University of Cartagena. Faculty of Pharmaceutical Sciences. Environmental and Computational Chemistry Group. Campus of Zaragocilla. Cartagena Colombia. *Corresponding: joliverov@ unicartagena.edu.co. 1

Recibido: Julio de 2011; Aceptado: Diciembre de 2011.

ABSTRACT Objective. To assess the levels of parasitism by nematodes and trematodes, as well as the hepatic histopathological alterations present in Mugil incilis (Lisa) from Totumo marsh, North of Colombia. Materials and methods. Between July 2004 and June 2005, 500 fish were collected at Totumo Marsh (75°16’W and 10°44´N), North of Colombia. Morphometric and parasitic parameters were determined for each specimen, and the hepatic histopathological status of the liver was assessed by analyzing liver slides stained with hematoxylin and eosin. Results. Nematode larvae isolated from Mugil incilis corresponded to Contracaecum spp. Parasite prevalence was 60.49%. Parasitic mean abundance and mean intensity were 4.8±1.05 and 7.02±1.49, nematodes per fish, respectively. The correlation between nematode mean abundance and fish length was significant and positive (r=0.525, p<0.0001), but negative for condition factor (r=-0.109, p=0.014). Hepatic histopathological analysis revealed the presence of encapsulated trematode larvae as the main finding. However, the presence of inflammation, granulomas, steatosis and necrosis, were also registered as secondary alterations. Conclusions. Lisas collected at Totumo Marsh are parasitized with nematodes and trematodes. These fish have different histopathological lesions in the liver tissue, being the most important the presence of trematode encapsulated cyst that generate inflammatory reactions, and negatively correlate with morphometric markers of fish health. Key words: Anisakiasis, fishes, nematode, trematode, zoonoses (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Evaluar los niveles de parasitismo por nemátodos y tremátodos, así como las alteraciones histopatológicas hepáticas presentes en Mugil incilis (Lisa) de la Ciénaga del Totumo, Norte de Colombia. Materiales y métodos. Entre Julio de 2004 y Junio de 2005, 500 peces fueron recolectados en la ciénaga del Totumo (75°16’W y 10°44´N), norte de Colombia. Índices morfométricos y parasitarios fueron determinados para cada espécimen, y el estatus histopatológico hepático fue evaluado analizando cortes de hígado teñidos con hematoxilina y eosina. Resultados. Los nemátodos aislados

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Olivero - Parasites and hepatic histopathological lesions in lisa (Mugil incilis)

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de Mugil incilis correspondieron a Contracaecum spp. La prevalencia del parásito fue 60.49%. La abundancia media y la intensidad media parasitaria fueron 4.8±1.05 y 7.02±1.49, larvas por pez, respectivamente. La correlación entre la abundancia media de nemátodos y la longitud de las lisas fue significativa y positiva (r=0.525, p<0.0001), pero negativa para el factor de condición (r=-0.109, p=0.014). El análisis de la histopatología hepática reveló la presencia de larvas encapsuladas de tremátodos, como el hallazgo principal. Sin embargo, la presencia de inflamación, granulomas, esteatosis y necrosis, también fueron registradas como alteraciones secundarias. Conclusiones. Las Lisas colectadas en la ciénaga del Totumo están parasitadas con nemátodos y tremátodos. Estos peces poseen diversas lesiones histopatológicas en el tejido hepático, siendo la de mayor importancia la presencia de quistes encapsulados de tremátodos los cuales generan reacciones inflamatorias, y correlacionan negativamente con marcadores morfométricos de salud en estos peces. Palabras clave: Anisakiasis, nemátodos, peces, trematodos, zoonosis (Fuente: CAB).

INTRODUCTION Parasites from the Ascaridoidea superfamily (Anisakidae and Raphidascarididae) are common in marine mammals, invertebrates, fish-eating birds (1-3), and teleostean fish worldwide (4,5).

and a drainage area of 2100 ha. Its climate is predominantly tropical sub-humid with an average temperature of 28°C, and a relative humidity of 75%. The average monthly precipitation ranges from 60 to 100 mm (14).

The presence of larval stages of Anisakid nematodes in fish is a problem for commercial fishing industries due to the potential risk of transmission of zoonotic diseases such as anisakiasis (6-8), and foodborne allergenicity (9,10). Currently, fish diseases, in particular those caused by parasites, constitute one of the most important problems and challenges confronting fish farming (11). This occurs because parasitism can be a critical factor contributing to fish mortalities (12), and in less worst case scenarios, it may induce severe histological changes in fish organs such as gills, liver and gonads. These lesions are useful as sensitive and reliable indicators of the health of wild fish populations (13).

Fish collection. A total of 500 specimens of Mugil incilis were captured with the aid of fishermen from July 2004 to June 2005, and transported on ice to the laboratory, where necropsies were immediately performed. The following physicochemical parameters for surface water were registered during sampling campaigns, using a pH-meter, conductimeter and a field thermometer, respectively: pH 7.8±0.2, conductivity 142.7±75.2 µS/cm and temperature 27.8±0.8ºC.

In Northern Colombia, Lisa (Mugil incilis) is an economically important fish species, and it has been found to be parasitized with nematodes in Cartagena Bay, as well as in Totumo marsh (14). Recently, trematodes such as Ascocotyle longa, have also been found infecting the liver of this fish in Cartagena Bay (15). The goal of this research was to document the histopathological lesions found in Mugil incilis from Totumo marsh.

MATERIALS AND METHODS Study area. Totumo marsh is a waterbody considered unpolluted by industrial sources. It is located approximately 60 km north from Cartagena, Colombia (75°16’-W and 10°44’N). It has an average depth of seven inches

Morphometric analysis and larvae identification. Morphometric and parasite infestation measurements were performed for each fish specimen. Total length and weight, organ weight, and number of nematode larvae were recorded. Fish condition factor (CF) was calculated using the formula CF=100×W/L3, where W = total weight (g), L = total length (cm). Liver-, gill- and spleen-somatic indexes (HSI), were obtained as (OW/W) × 100, where OW=organ weight (g), (16). These morphometric parameters are considered markers of general fish health (17,18). Nematodes were recovered, fixed, clarified and preserved. Preliminary nematode identification was based on keys previously published, and on morphological features suggested in the literature (19,20). Prevalence (proportion infected), mean intensity (parasites per infected individual), and mean abundance (parasites per individuals examined) were determined according to methods used by Bush et al (21).

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Histopathogical analysis. Livers were stored in buffered formalin and processed for histopathological examination. From each block, paraffin sections (5 µm) were stained with hematoxylin–eosin. The lesions were recorded including those non-specific related to inflammatory changes (infiltration for inflammatory cells and granulomatosis), steatosis, necrosis and melanomacrophage centers (MMCs), among others (22). The histopathological study was carried out by individually examining each sample under the light microscope, evaluating the prevalence of finding lesions in each sample. Statistical analysis. Data are presented as mean ± standard error. Data were evaluated for normality and variance homogeneity using Kolmogorov-Smirnov and Barlett tests, respectively. Spearman correlations between infection levels and biometric parameters were tested. Analysis of variance (ANOVA) was employed to evaluate differences among means for different months in a particular sampling station. When normality was not achieved, ANOVA was replaced by Kruskal-Wallis test. Differences between means were evaluated by Student’s t-test. For all statistical analysis, the criterion for significance was p<0.05.

RESULTS Morphometric parameters as well as nematode parasitic infection indices obtained for all sampled specimens are presented in table 1. Table 1. Morphometric parameters and indexes of infection by Contracaecum spp. larvae in Mugil incilis captured from Totumo marsh, North of Colombia Parameter

Totumo marsh

Fish number

500

Length (cm)

11.71 ± 0.24

Weight (g)

30.54 ± 1.63

Condition factor

1.37 ± 0.02

Hepato-somatic index (%)

0.01 ± 0.0006

Spleen-somatic index (%)

0.005 ± 2.5219

Gills-somatic index (%) Nematode prevalence (%)

0.064 ± 0.004 60.49

Nematode mean abundance (%)

4.48 ± 1.05

Nematode mean intensity (%)

7.02 ± 1.49

Besides the relative small fish size (11.71±0.24 cm), nematodes were found in 60.49% of all examined samples. Based on the presence of a prominent intestinal caecum extending near the nerve ring, three lips with a cephalic tooth between them, among other observed

characters (21), the nematode larvae present in Lisa corresponded to the third larval state (L3) of Contracaecum spp. (Nematoda anisakidae) (Figure 1). Parasite size oscillated between 8 and 29 mm in length, with an average of 20.98±0.15 mm. Nematodes larvae were usually found encapsulated below the intestinal mesenteries (51.48%), spine (27.23%), liver (20.43%) and a small proportion within the muscle (0.94%), this last possibly as a result of post-death migration.

C NR

E Ca

M Figure 1. Morphologic characteristics of L3 anisakid larvae extracted of Mugil incilis captured from Totumo marsh, North of Colombia. (A). Anterior view, cuticular tooth (CT). (B). Posterior view, mucron (M). (C). Expanded anterior view showing the nervous ring (NR), the esophagus (E) and the intestinal caecum (Ca). Source: Environmental and Computational Chemistry Group. University of Cartagena.

Seasonal changes in the prevalence, mean intensity and mean abundance of nematodes in Mugil incilis are presented in figure 2. The observed trend is similar for all three parameters, with greater values detected during September-October and May-June, corresponding to the rainy season, whereas the lowest values were obtained for JanuaryFebruary, during the dry season. Correlation analysis for morphometric and parasitic parameters are shown in table 2. As expected, there was a strong and significant correlation between total host weight and length (r=0.935, p<0.001). A positive and significant correlation was detected between nematode mean abundance and host length (r=0.525, p<0.0001) and weight (r=0.547, p<0.0001). Inverse and significant correlations were observed for nematode mean abundance and both host condition factor (r=-0.109, p=0.014) and gill-somatic index (r=-0.123, p=0.014). However, correlations were absent with internal organ somatic factors.

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Olivero - Parasites and hepatic histopathological lesions in lisa (Mugil incilis)

Figure 2. Seasonal prevalence (A), mean intensity and mean abundance (B) for Contracaecum spp. larvae in Mugil incilis. Table 2. Spearman correlation between morphometric parameters and abundance of Contracaecum spp. larvae in Mugil incilis collected from Totumo marsh, North of Colombia. Parameters

Condition factor

Hepato-somatic Index

Spleen-somatic index

Gill-somatic index

Length

Weight

0.935 (p<0.001)

Condition factor

-0.459 (p<0.001)

-0.181 (p< 0.001)

Hepato-somatic Index

0.009 (p=0.858)

0.046 (p=0.357)

0.035 (p=0.486)

Spleen-somatic Index

0.141 (p=0.024)

0.1814 (p=0.004)

-0.0265 (p=0.672)

0.016 (p=0.795)

Gill-somatic Index

0.232 (p<0.001)

-0.363 (p<0.001)

-0.087 (p=0.862)

-0.270 (p<0.001)

-0.062 (p=0.321)

Parasite mean abundance

0.525 (p< 0.001)

0.547 (p< 0.001)

-0.109 (p=0.014)

0.021 (p=0.666)

0.046 (p=0.456)

-0.123 (p=0.014)

Parasite mean abundance

Length

Histopathological findings detected in the liver of Mugil incilis collected in Totumo marsh are presented in table 3 and figure 3. The most distinctive histopathological feature of the liver was the presence of encapsulated trematode cysts. Some of these formed granulome cysts

characterized by the deposition of fibrous connective tissue and collagen. Others liver pathological alterations were infiltration of eosinophyls, inflammation, necrosis, and steatosis (Figure 3).

Figure 3. Paraffin-sections (5 Âľm) of liver tissue of Mugil incilis. (A). Multiple encapsulated cysts of trematodes in hepatics tissue. (B). Trematode cyst showing the oral sucker. (C). Trematode cyst displaying the ventral sucker. (D). Melano-macrophage center partially surrounding a cyst-related granuloma. (E). Eosinophyl infiltration (EF) associated to the connective tissue capsule in a trematode cyst. (F). Hepatic steatosis. Source: Environmental and Computational Chemistry Group. University of Cartagena.

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Table 3. Histophatological lesions in liver of Mugil incilis from Totumo marsh, North of Colombia. PARAMETER Total number of examined fish Total encapsulated cyst counts/field (x 40) Necrosis foci (%)

Sampling Period Jul/Aug

Sep /Oct

Nov/Dec

Jan/Feb

Mar/Apr

N = 16

N =14

N =16

N =8

N =15

May/Jun N =14

3.1 ± 0.7

3.2 ± 0.5

2.8 ± 0.7

3.9 ± 1.1

3.3 ± 0.4

2.4 ± 0.5

6.3

18.8

37.5

13.3

21.4

Steatosis (%)

18.8

14.3

18.8

0.0

7.1

Granuloma (%)

31.3

7.1

18.8

62.5

13.3

7.1

%, Prevalence of histological lesions.

DISCUSSION Prevalence of Contracaecum nematodes in Mugil incilis reported in this study (60.49%) was similar to that published for the same species in Cartagena Bay (74.67%),(14). In México, C. multipapillatum prevalences were found between 14.5% and 30% in Mugil cephalus (23). For Mugil incilis, the positive relationship between intensity of nematode and length and weight found might be the result of a time of exposuredependent process. This observation has also been detected for other parasites infecting different fish species such as Austrodiplostomum compactum (Digenea) in Plagioscion squamosissimus (24), Sphincterodiplostomum musculosum in Cyphocharax gilbert (25), and Spatulifer maringaensis in Sorubim lima (26), among others. Condition factor (CF) and hepato-somatic index are screening indices that provide information about the general condition of fish, and those are useful to identify exposure/effects of potential contaminants, or data on energy reserves. The low negative and significant correlation observed between condition factor and parasite mean abundance could indicate that these nematodes are impacting fish health; perhaps by affecting food metabolism or inducing stress factors on fish. This work has also shown that the liver of Mugil incilis is parasitized with trematode encapsulated cysts. A previous report on this species from Cartagena bay has suggested that this encapsulated trematode larvae is Phagicola longa (15). Histopathological examination revealed that trematodes were encapsulated by connective tissue in association with accumulation of lymphocytes and melanomacrophages, as previously described by others authors (22), with a host reaction to the larval presence characterized by fibroblast

proliferation, which forms a capsule of concentric layers of connective tissue. This phenomenum has also been observed for metacercariae of the digenean Posthodiplostomum minimum in bluegill, Lepomis macrochirus (27). The deposition of collagen layers and fibroblasts in the liver of Mugil incilis, probably is the result of a host defense reaction. In this study, most granulomes were linked to the presence of melano-macrophages centers (MMCs). These histological effects have been suggested as biomarkers for water quality in terms of lack of oxygen and chemical pollution (28). However, this process may also be the result of different stages of chronic inflammatory response to severe tissue damage or to a variety of infections. There are not reported data showing that nematodes, in particular Contracaecum spp., or trematodes, could be producing zoonoses in human beings that eats Mugil incilis, only from Totumo marsh, but also from urban areas such as Cartagena and Barranquilla, where these fish are sold. However, the lack of information regarding fish parasitism, and the health hazards linked with fish consumption, could help to increase the risk of parasitic zoonoses in the area, as has been reported for Peru (29). In addition, although fish-borne parasitic zoonoses have been focused on people from low- and middle-income countries. This problem is rapidly expanding because of globalization and migration, among other factors (30). Therefore, taking into account that these fish are currently used as a protein source for many people, it is suggested to implement sanitary measurements to avoid zoonoses.

Olivero - Parasites and hepatic histopathological lesions in lisa (Mugil incilis)

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3295-3303, 2013. ORIGINAL

Effect of freezing and thawing rates on sperm motility in Bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces, Characiformes) Efecto de la congelación y descongelación sobre movilidad espermática en Bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces, Characiformes) José G. Martínez,1 M.Sc, Sandra Pardo C,2* Ph.D. Universidade Federal do Amazonas, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Evolução e Genética Animal –LEGAL, Manaus, Brasil. 2Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Producción Animal, BIOGEM, Medellín, Colombia. *Corresponding: scpardoc@unal.edu.co. 1

Recibido: Enero de 2011; Aceptado: Agosto de 2012.

ABSTRACT Objective. To determine the freezing and thawing rates necessary to maintain sperm viability during cryopreservation of Bocachico semen. Materials and methods. Four interactional treatments were implemented between two freezing (rapid and slow) and two thawing (rapid and slow) curves, in a 2x2 factorial as follows: rapid freezing-rapid thawing, rapid freezing-slow thawing, slow freezingrapid thawing, and slow freezing-slow thawing. After thawing by Sperm Class Analyzer (SCA) curvilinear velocity (VCL) and straight-line (VSL) (μm sec-1) were analyzed; total, rapid, medium, and slow motility, were compared among treatments. Results. The rapid freezing-slow thawing treatment was lethal for all variables of velocity and motility, causing a significant (p<0.01) postthaw inmotility of 100%. The slow freezing-rapid thawing interaction had a significantly higher effect than the other treatments (p<0.05), particularly on variables such as rapid motility (10.1 ± 1.1%), medium motility (30.16 ± 4.1%), and curvilinear velocity (51.5 ± 4.75 μm sec.-1) also decreased the percentage of sperm with slow motility (41.7 ± 4.45%). Independently of the applied thawing rate, the freezing rate generated the main significant effect on total motility. Conclusions. It is possible to conclude that the interaction effect between freezing and thawing rates is nil (except for slow motility) during cryopreservation process. However, the independent effects of these factors (main effects) on remaining motility variables are positively significant and decisive to the maintenance of these features, especially the freeze factor (when it is slow). This becomes the first successful report of sperm cryopreservation from Bocachico Prochilodus magdalenae in the world and may be used in conservation programs for this endangered species. Key words: Cryopreservation, freezing, motility, sperm, thawing (Source:CAB).

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RESUMEN Objetivo. Determinar la tasa de congelación y descongelación para mantener la viabilidad espermática durante la crioconservación seminal de Bocachico. Materiales y métodos. Fueron implementados cuatro tratamientos de interacción entre dos curvas de congelación (rápida, lenta) y dos curvas de descongelación (rápida, lenta) en un factorial 2x2, así: congelación rápida-descongelación rápida, congelación rápida-descongelación lenta, congelación lenta-descongelación rápida y congelación lenta-descongelación lenta. Posterior a la descongelación espermática y mediante el software Sperm-Class-Analyzer, fueron analizadas la velocidad curvilínea (VCL) y lineal (VSL) (μm sec-1); movilidad total, rápida, media y lenta, y fueron comparadas entre tratamientos. Resultados. El tratamiento congelación rápida-descongelación lenta fue letal para las variables de velocidad y movilidad espermática, causando una significativa (p<0.05) inmovilidad pos-descongelación (100%). La interacción congelación lenta-descongelación rápida tuvo un efecto significativamente mejor (p<0.05) que los demás tratamientos, particularmente sobre variables como movilidad rápida (10.1 ± 1.1%), movilidad media (30.16 ± 4.1%) y velocidad curvilínea (51.5 ± 4.75 μm sec.-1), así mismo, generó una disminución del porcentaje de espermatozoides con movilidad lenta (41.7 ± 4.45%). La tasa de congelación posee un efecto principal significativo sobre la movilidad total. Conclusiones. El efecto de la interacción entre las tasas de congelación y la descongelación es nulo (excepto para la movilidad lenta), sin embargo, los efectos independientes de estos factores (efectos principales) sobre el resto de variables de movilidad son positivamente significativos y determinantes para el mantenimiento de aquellas características, especialmente el factor congelación (cuando es lento). Este es el primer reporte exitoso de crioconservación espermática de Bocachico P. magdalenae en el mundo, pudiendo ser usado en programas de conservación de esta especie en riesgo de extinción. Palabras clave: Crioconservación, congelación, espermatozoides, descongelación, movilidad (Fuente:CAB).

INTRODUCTION The Bocachico P. magdalenae (Steindachner) is a native South American fish belonging to the Prochilodontidae Characiformes that is distributed in the Colombian rivers of Magdalena, Cesar, San Jorge, Cauca, Rancheria, and Sinu (1). Prochilodus spp. is a reopholic fish of economic importance in South America. According to the National Institute of Fishing and Aquaculture (INPA) (2), from 1986 to 1995 its capture by means of extractive fishing decreased its presence from 28501 to 5690 tons. Currently, the Bocachico is an endangered species in Colombia (3). Due to the economic importance and environmental risk for Yamú Brycon amazonicus (Spix & Agassiz) (4), and Cachama blanca Piaractus brachypomus (Cuvier) (5), sperm cryopreservation protocol has been standardized for each species. The development of biotechnology tools, such as sperm cryopreservation, could contribute to the development of gene banks for conservation of this species and improve the reproductive processes in aquaculture, mainly for stock enhancement programs of water bodies from the planting of fingerlings. Cryopreservation affects sperm morphology

and ultrastructure, which lead to damage of the cytosolic and nuclear membrane (6). Its effects have been also documented in genome and proteome (7, 8) and are shown to decrease the quality (such as motility and velocity) and viability of post-thawed spermatozoa, influencing fertilization success (9). Most of the cellular damage occurring during cryopreservation is associated with intracellular crystallization during the reduction of temperature in freezing (10) and/or thawing of cryopreserved spermatozoa due to water bath temperature (11). It is known that formation of ice crystals can be reduced by the addition of chemical factors such as cryoprotectants, which at no toxic concentrations to cell, can lower the internal and external freezing point diminishing the appearance of this phenomenon and increasing cell post-thawing viability. This gives importance to their presence during this process (7). In fact, dimethylsulfoxide (DMSO) is the most widely used cryoprotectant in successful spermatic post-thawing survival among South American Characiformes and other economically important fish (12,13). However, ice crystal formations that cause cellular damage during

Martínez - Effect of freezing and thawing rates on sperm motility freezing-thawing may depend upon the rate of decrease or increase of this temperature (14). Likewise, these velocities must be standardized for each species individually. South American Characiformes such as Curimba Prochilodus lineatus (Valenciennes) and Piracanjuba Brycon orbignyanus (Valenciennes), although phylogenetically close, require rapid freezing rates. However, there is only success in postthawing sperm viability if slow thawing is applied in the case of semen of P. lineatus (15), contrary with B. orbignyanus, which requires a rapid thawing rate in order to acquire the same viability (66-82% of total motility) (16,17). Concerning these results and their variability between species, there are some hypotheses that may be presented for explanation: 1. If freezing is sufficiently slow, the balance is achieved through efflux of water, but if freezing is very rapid, the cell can lose water fast enough to reach the equilibrium potential, which causes intracellular freezing (18-20), 2. Normally, slow freezing rates produce large crystals and injure cellular ultrastructure, however, at rapid freezing rates small intracellular ice formations occur that may become safe, but can potentially grow and unite during thawing by means of recrystallization (11,18), especially if it is slow (14). This process is promoted by an inappropriate thawing velocity, which should correspond to the freezing rate used (21). Thus, for rapid freezing, rapid thawing should correspond and for slow freezing, a slow thawing likewise should correspond. The aim of this study was to determine which of these hypotheses on freezing and thawing rates fulfills or is applicable to preserve post-thawing semen quality in P. magdalenae, assessed by sperm motility. This study becomes the first successful report of Bocachico P. magdalenae sperm cryopreservation in the world.

MATERIALS AND METHODS Animals and gamets collection. Semen from three Bocachico P. magdalenae males (190±10 g) was used separately in this experiment. The semen sample taken from each male was divided into four equal parts (experimental units) and each was randomly assigned to a treatment. All specimens were part of a group of brood fish adapted and kept in captivity in ponds of the Fish Research Center (CINPIC), University of Córdoba, Colombia. The specimens were selected according to their sexual maturity (22), caught, and moved to circular enclosures of managing (6 m3) where

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they remained for 24 hours, in order to accustom them to experimental conditions, reducing the stress intensity generated by manipulation and environmental change. Final maturation of gonads and the spermiation were obtained by an intramuscular injection of carp pituitary extract (CPE), equivalent to 4.5 mg kg-1 of body weight (22). Six hours after hormonal induction, the broodfish were anaesthetized with 2-phenoxyethanol (300 ppm, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Semen was obtained by abdominal cephalocaudal massage, collected in one Eppendorf plastic tube of 1.5 mL, preventing contamination (by a previous process of hand-stripping the coelomic cavity near the intestines, and drying of the urogenital papillae) with traces of water, urine, or feces. The first sperm evaluation was conducted immediately in order to know whether sperm quality was adequate for cryopreservation, taking total and rapid motility (%) as a criterion, and having each sample (1 per male) respectively exceed values of 80% and 75% to be considered qualifiable. Sperm cryopreservation and freezingthawing rate evaluation. Diluent for P. magdalenae was a solution of distilled water with 12% chicken egg yolk (v/v), 6% (333 mM) glucose (w/v) and 10% (1402 mM) dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) (v/v) as internal cryoprotectant. Each of the experimental units (semen subsample) was mixed with the diluents + cryoprotectant at a rate of 1 part of semen to 3 parts diluent + cryoprotectant separately (non pooled), packaged in 0.5 mL straws (IMV, Instrument de Médecine Vétérinaire, Minneapolis, USA), sealed with polyvinyl (powder) and subjected any of the four different freeze-thaw treatments, generating 12 straws, 3 per treatment. For freezing of straws, a programmable freezer (FreezeControl®, CryoLogic Pty. Ltd., Victoria, AU) was used, assisted by CryoGenesis™ software, in whose cryochambers straw groups were located to be frozen according to two different cooling rates undertaken in two steps. Thus, the rapid freezing rate consisted of a decrease of 27.3°C min-1 (28°C to 4°C) and 29.9°C min-1 (4°C to -80°C), while the slow freezing rate consisted of a decrease of 2°C min-1 (28°C to 4°C) and 8.2°C min-1 (4°C to -80°C). Once the curve programming was complete and the temperature reached -80°C, the straws were immediately moved

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to a thermal storage (MVE 24/2V, TO, USA), immersed directly into liquid nitrogen (-196°C) where they remained for three days. They were later extracted and thawed according to the established rates. The thawing was performed by immersing straws in serological bath (Memmert® WNB7, GmbH Co. KG, Germany). Thus, a first group of straws was subjected to immersion in water bath to achieve a rapid thawing rate: 60°C for 8 seconds, while another group was subjected to a slow thawing rate: 30°C for 16 seconds. Straws were dried and semen was extracted and tested for its motile characteristics. Both the velocity of freezing and thawing (rapid and slow) were selected according to their success in closely related species and freshwater such as Curimba Prochilodus lineatus, Yamú Brycon amazonicus, and Striped catfish Pangasius hipophtlamus (Sauvage) (4,15,23), with the intention of trying to fulfill the aforementioned hypotheses (see Introduction). Estimation of motile characteristics. To determine the effectiveness of the treatments motility was tested, considering percentage of spermatozoa with rapid (velocity>100 µm sec.-1), medium (>40 to 100 µm sec.-1), slow (>3 to 40 µm sec.-1), and total motility, as well as curvilinear and straight-line velocity. In all cases, to estimate motilities 0.25 µL of fresh or cryopreserved semen was placed on a Makler counting chamber (Sefi, Medical Instruments Ltd., Israel). Motility for fresh semen was then activated with 75 µL of distilled water to a final semen:water ratio of 1:301 and for cryopreserved semen (Already diluted with cryoprotectant + diluents) with 18.75 µL of distilled water to a final ratio of 1:76 (standardized on the software to capture between 300 and 400 sperm per field), and the sample was analyzed through a phase contrast optical microscope (Nikkon, E50i, Japan) adapted to a seminal analysis system on a computer-assisted Sperm Class Analyzer (SCA VET 01, Microptic SL, Spain), obtaining an average data per sample, product of two field analysis recorded within 4 seconds after sperm motility activation. Statistical analysis. Experiment was conducted according to a randomized complete block design with a 2x2 factorial arrangement for treatments (two freezing rates x two thawing rates), taking males as blockade factor to reduce experimental error generated by their genetic variability. All data are expressed as mean ± standard

deviation. Statistical analyses were carried out using SAS version 9.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). All data of sperm motility characteristics were tested for Brown and Forsythe’s Test (homogeneity of variance) and normal distribution using the KolmogorvSmirnov’s Test. Data were tested for significant effects of factors by two-way ANOVA (GLM Procedure), followed by Tukey test. Differences among interaction treatments and effects of factors were tested at a probability level of 0.05.

RESULTS The Brown and Forsythe’s Test applied to the experimental data revealed that there is homogeneity between variances (p>0.05). Likewise, the Kolmogorv-Smirnov’s Test showed that data obtained of the analyzed variables were normal (p=0.1210). This is sufficient to show that in this particular case n=3 met the requirements for performing the statistical analyses within the experimental design. Freshspermcharacteristicspriortocryopreservation were total sperm volume extracted per male of 0.45, 0.5, and 0.79 mL (Average: 0.58±0.18 mL), and an average of 99.93±0.05% for total motility and 77.36±1.8% for rapid motility, fulfilling the criteria for cryopreservation. These and other variables such as medium motility, slow motility, curvilinear, and linear velocities were significantly higher in fresh sperm (p<0.05) when compared with post-thawed sperm from interaction treatments (data not shown). Evaluation of freezing-thawing rates. There was no interaction effect between the freezing and thawing rates (A*B) on the variables of rapid, medium and total motility, curvilinear and linear velocities (p>0.05), but there was for slow motility (p<0.05). However, an effect of freezing rate (A) (p<0.05) on total motility was found, and there was an effect of both the freezing rate (A) and the thawing rate (B) independently on variables such as rapid and medium motility and curvilinear and linear velocities (p<0.05) (Table 1). In figure 1 (diagram of interaction A*B for slow motility) highlights the fact that when thawing rate becomes slow and interacts with a rapid thawing rate, the result is the annulment of slow motility; however, the interaction with a slow freezing rate, guarantees a significant increase of the same variable. In turn, slow motility could remain practically constant at any level (rapid or slow) of freezing factor whenever thawing was rapid.

MartĂnez - Effect of freezing and thawing rates on sperm motility

3299

Table 1. Analysis of the interaction and main effects of factors A (freezing rate) and B (thawing rate) on motility and spermatic velocity variables. VARIABLE

A factor (freezing rate)

B factor (thawing rate)

A*B (interaction)

F-Value P-value F-value P-value F-value P-value

Rapid motility

8.41

0.0199

8.30

0.0205

4.32

0.0712

Medium motility

14.07

0.0056

9.23

0.0161

0.80

0.3980

Slow motility

5.72

0.0438

0.62

0.4536

6.59

0.0333

Total motility

10.74

0.0112

3.26

0.1088

2.35

0.1638

Curvilinear velocity

32.71

0.0004

11.75

0.0090

1.27

0.2933

Straightline velocity

18.05

0.0028

7.14

0.0283

1.67

0.2322

Independently of the applied thawing rate, the freezing rate (A) most significantly affected total motility (Table 1), increasing the value of this variable especially when freezing rate was slow. When analyzing the main effects of factor A (freezing rate) in each of the levels of factor B (thawing rate), it was found that whenever thawing rate becomes slow, variables such as rapid motility, medium, curvilinear velocity, and straight-line velocity also decrease, more significantly when freezing rate was rapid (Figure 2).

Figure 1. a. Analysis of the main effects of factor A (freezing rate) in B (thawing rate) and b. factor B in A for variables where there was interaction (A * B): Slow motility.

Likewise, when we analyzed the main effects of factor B in each of the levels of factor A, it was found that when freezing rate becomes slow, rapid and medium motility, curvilinear velocity and straight-line velocity also increase, especially when thawing rate become fast. Moreover, when the interaction treatments are compared each other, we found that the slow

Figure 2. Analysis of the main effects of factor A (freezing rate) in B (thawing rate) and of B in A for variables where there was no interaction (A*B): a. Rapid motility, b. Medium motility, c. Curvilinear velocity, and d. Straight-line velocity.

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freezing rate in interaction with rapid thawing rate had a significantly higher effect than the other treatments (p<0.05), particularly on variables such as rapid motility (10.1 ± 1.1%) (Figure 3a), medium motility (30.16 ± 4.1%) (Figure 3b), and curvilinear velocity (51.5 ± 4.75 μm sec.-1) (Figure 3c). Regarding total motility (Figure 3d), the highest values were for treatments where freezing rate was slow (83.63 ± 8.75% and 79.26 ± 6.19%). However, they did not differ statistically from total motility in treatment where freezingthawing were rapid (54.93 ± 5.67%) (p>0.05). Nevertheless, all have a significant difference of the treatment generated by the interaction rapid freeze-slow thaw (0.0 ± 0.0%) (p<0.05).

This same behavior was noted by slow motility (Figure 3e), although the lowest percentage of sperm that showed this type of motility was observed in the treatment of slow freeze-rapid thaw (41.7 ± 4.45%). For its part, straight-line velocity also reached its highest values in the slow freezing–rapid thawing interaction (31.76 ± 2.6 μm sec.-1) being statistically different only from those treatments whose freezing rate was rapid (6.33 ± 1.21 μm sec.-1 and 0 μm sec.-1) (p<0.05) (Figure 3f). For all motility and speed variables, the treatment of interaction between the rapid freezing rate and slow thawing rate generated values of 0.0 ± 0.0% and 0.0 ± 0.0 μm sec.-1, respectively (p<0.05).

Figure 3. Multiple comparisons between treatments of interaction generated from factors of freezing and thawing rate. a. Percentage of spermatozoa with rapid motility post-thaw; b. Percentage of spermatozoa with medium motility post-thaw; c. Curvilinear velocity (µm sec.-1) of spermatozoa post-thaw; d. Total motility (%) of spermatozoa post-thaw; e. Percentage of spermatozoa with slow motility post-thaw; f. Straight line velocity (µm sec.-1) of spermatozoa post-thaw. In all cases results are (means ± standard deviation) from 4 treatments of interaction between two freezing rates (rapid:RF and slow:SF) and two thawing rates (rapid and slow) (n=3). RF: rapid freezing, 27.3°C min-1 (28°C to 4°C) and 29.9°C min-1 (4°C to -80°C), SF: slow freezing, 2°C min-1 (28°C to 4°C) and 8.2°C min-1 (4°C to -80°C), Rapid thawing: water bath at 60°C during 8 sec, Slow thawing: water bath at 30°C during 16 sec. Bars with different letters are different (p<0.05).

Martínez - Effect of freezing and thawing rates on sperm motility

DISCUSSION The decreased motility and velocity reveal that the cryopreservation process generates damage affecting sperm cell performance, and this change results according to the interaction of freeze-thaw velocities, allowing for the inference of the importance of the two events and the need to establish the best for every particular species. This study found that semen subjected to slow freezing and rapid thawing presented higher values for all the variables of motility and velocity. On the contrary, it was found that when semen was frozen with a rapid velocity and was thawed slowly, an immobility of 100% resulted in sperm cells. This could be due to cell damage caused by the interaction of events of freezing and thawing. Pegg (14) mentions that a rapid cooling rate restricts the necessary time to allow the cell to undergo adequate water loss during the freezing process, which facilitates the intracellular crystallization as a result of remaining excess water. This negatively affects cellular ultrastructure and viability. On the contrary, Pegg asserts that water loss is a necessary event during freezing process and is dependent on a slow cooling rate of cells, which diminishes the possibility of core formation and association, leading to the formation of ice crystals that negatively affect the cell and could make it unfeasible.

3301

and African catfish Clarias gariepinus (Burchell). Cryopreserved sperm of these species, reached a peak of survival (20,23) at a slow velocity (5 to 10°C min-1). It suggests that all the assumptions made by Pegg (14) apply perfectly in this experiment to P. magdalenae and some species, for which also the freezing rate proves to be more decisive and influential role in ensuring some kind of cell survival. Although for Bocachico P. magdalenae interaction between slow freezing with rapid thawing is useful, taking into account the results in terms of rapid motility, medium motility, curvilinear velocity, and straight line velocity (10.1±1.1%, 30.1±4.1%, 51.5±4.75% and 31.76±2.6% respectively), it is not equal for some species of freshwater as mandarin fish Siniperca chuatsi (Basilewsky), for whom a relatively rapid two-step freezing rate (18°C min-1 and 39.2°C min-1) in combination with a slow thawing rate (37°C for 60 seconds) results in total motilities up to 91% (24). Characiforme fish response to freezing and thawing rates vary. For example, for Curimba P. lineatus rapid-freezing with slow-thawing as 30°C for 16 seconds generates total motilities up to 87% (15), while for P. magdalenae 0% motilities are reached.

Notwithstanding, one can deduce that the best way to ensure successful survival and viability of a cell subjected to the cryopreservation process would be through the application of a slow freezing curve and a rapid thawing rate. This would generate respective form, adequate dehydration (hence no ice crystal formation), and minimizing recrystallization risks. On the contrary, it is possible to deduce that an interaction between a rapid freezing rate paired with slow thawing would generate greater damage to a cell subjected to the cryopreservation process since under both velocities.

For P. lineatus, thawing velocity is inconsecuential, regardless of rate (60°C for 8 seconds or 30°C for 16 seconds). Both velocities ensure total motility rates of 86.5% on average. Nevertheless, when P. magdalenae had rapid freezing (like P. lineatus) and rapid thawing (60°C for 8 seconds) there were total motilities of up to 54.93% on average, which significantly changed when a slow thawing rate was used (0% of total motility). Similarly, for another Characiforme such as Yamú Brycon amazonicus, a rapid freezing rate with a slow thawing rate generates higher total motilities (35.3%) than those originated when rapid thawing rates were used (7.2%) (25). This is evidently opposite to what results with P. magdalenae, where the rapid thawing always generates the greatest results.

Additionally, when the average percentage of all the variables was compared to the treatment groups, rapid freeze against slow freeze groups (regardless thawing rate), it is observed that the highest average is reached for those with slow freeze, and the lowest for those of rapid freeze. When it slow freezing velocity was implemented, independently of the thaw rate, there was always some kind of sperm survival. The same happens with other freshwater fish, such as striped catfish Pangasius hypophtalmus

It is necessary to study additional research in order to identify the specific mechanisms of every species that give place to such variations, which is generally attributed to intrinsic resistance of cells during this process. According to Kopeika & Kopeika (10), it is possible that sperm cells have attributes that allow them to prevent damages and to develop cold resistance during freezing. In the case of P. lineatus, resistance to rapid freezing rates may be due to evolutionary biological adaptations to distant latitudes of

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Ecuador, which is native to southern Brazil, Uruguay, Argentina, etc., where temperatures vary significantly throughout the year. Thus, water temperatures can reach values under 15°C during winter, and over 30°C during summer (26), which shows a species flexible to changes in temperature. On the contrary, P. magdalenae is a tropical fish that spends its entire life in environments without significant temperature variations. Thus, in the main rivers where it lives (Sinu and Magdalena), the temperature reaches values between 28°C and 30°C maximum (27). The temperature of fish rearing is known to modulate their metabolism and also to contribute to adaptive responses to abrupt temperature changes, as well as those described in organs that perform functions vital to the survival of fish. Thus, it was determined that those answers are found mostly in lipid composition changes in the cell membrane of erythrocytes, brain, liver, or muscle (28). It is possible that these changes in lipid composition also occur in sperm cells, giving greater resistance to those who suffer this type of adaptation. In rainbow trout, fish sperm transferred to a water temperature lower than

its rearing temperature exhibited a different lipid composition of the fish acclimated to warmer waters (29). In turn, post-thaw semen quality was better in the group of fish acclimated to lower temperatures compared to those acclimated to high temperatures. The positive effect of temperature may be due to lipid changes, mainly in cholesterol content (30). It is possible to conclude that the interaction effect between freezing and thawing rates is nil (except for slow motility) during cryopreservation process, however, the independent effects of these factors (main effects) on remain motility variables are positively significant and decisive to the maintenance of these features, especially the freeze factor (when it is slow). Acknowledgments This work was funded by the Research Division of the Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín (DIME) by source project: 20101007633 and the Ministry of Agriculture and Rural Development in Colombia through the project code: MADR- 2007U7723-401.

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3304-3310, 2013. ORIGINAL

Desempeño reproductivo del bocachico Prochilodus magdalenae inducido dos veces en un mismo año Reproductive performance of bocachico Prochilodus magdalenae induced twice in the same year Víctor Atencio G,1* M.Sc, Eduardo Kerguelén D,1 Acuicultor, Elkin Naar,1 Acuicultor, Robert Petro,1 Acuicultor. Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Departamento de Ciencias Acuicultura, CINPIC. Montería, Colombia. *Correspondencia: vatencio@hotmail.com. 1

Recibido: Octubre de 2010; Aceptado: Diciembre de 2011.

RESUMEN Objetivo. Evaluar el desempeño reproductivo del bocachico (Prochilodus magdalenae) sometido a dos inducciones hormonales con extracto pituitario de carpa (EPC) en un mismo año. Materiales y métodos. 23 hembras, en fase de maduración final, fueron inducidas con 5mg EPC/Kg de peso vivo, en dos aplicaciones, inicialmente 10% y doce horas después 90% restante. A los machos fue aplicado 80% de la dosis total de las hembras. Resultados. Después de la primera inducción hormonal, las hembras estuvieron aptas nuevamente a los 97.6±12.4 días. El índice de ovulación en ambas inducciones fue de 0.91 (21/23). La fecundidad absoluta (g-ovocitos/hembra) no presentó diferencias significativa entre la primera y segunda inducción (36.2 y 44.6 g-ovocitos/hembra, respectivamente) (p>0.05); pero cuando se expresó en número de ovocitos/hembra se observó diferencia significativa (p<0.05), siendo mayor en la primera inducción (53535 ovocitos/hembra) que en la segunda (40658 ovocitos/hembra). La fecundidad relativa, expresada tanto en g-ovocitos/Kghembra como ovocitos/Kg-hembra, mostraron diferencia significativa, siendo mayor en la primera inducción (p<0.05). La tasa de fecundación (73.9±19.6%) y eclosión (56.9±17.9%) fueron mayores en la primera inducción, comparadas con la segunda (55.6±21.1% y 35.6±20.7%, respectivamente) (p<0.05). Conclusiones. Después de una inducción hormonal se requiere de aproximadamente tres meses para que una hembra de bocachico alcance nuevamente la maduración final y esté apta para una nueva inducción hormonal. El índice de ovulación no fue afectado por una segunda inducción en un mismo año, pero la fecundidad absoluta y relativa puede disminuirse entre 24 y 66% y las tasas de fecundación y eclosión entre 23 y 36%. Palabras clave: Biopsia, fecundidad, oogenesis, peces, reproducción (Fuente:CAB).

3304

Atencio - Desempeño reproductivo del bocachico Prochilodus magdalenae

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ABSTRACT Objective. To evaluate the reproductive performance of hormonally induced bocachico with carp pituitary extract (CPE) twice in the same year. Materials and methods. 23 females, in their final maturation phase, were induced with 5 mg EPC/Kg of body weight in two applications, initially 10% and 90% twelve hours later. Males was applied 80% of the total female dose. Results. After the first hormonal induction, females were fit again at 97.6±12.4 days. Ovulation rate in both hormonal inductions was 0.91 (21/23). Absolute fecundity (g-oocytes/female) showed no significant differences between the first and second induction (36.2 and 44.6 g oocytes/female, respectively) (p>0.05), but when expressed in number of oocytes per female there was a significant difference (p<0.05), the fertility rate being higher in the first induction (53535 oocytes/female) compared with the second induction (40658 oocytes/female). Relative fecundity, expressed in both g-oocytes/Kg-female and oocytes/Kg-female showed a significant difference, being higher in the first induction (p<0.05). Fertilization rate (73.9±19.6%) and hatching (56.9±17.9%) were higher in the first induction, compared to the second one(55.6±21.1% and 35.6±20.7%, respectively) (p<0.05). Conclusions. After hormonal induction a period of approximately three months is required for a female bocachico to reach final maturation and be suitable for a new hormonal induction. The ovulation rate was not affected by a second induction in the same year, but the absolute and relative fertility can be reduced between 24 and 66% and fertilization and hatching rates between 23 and 36%. Key words: Biopsy, fecundity, fishes, oocyte maturation, oogenesis, reproduction (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN Prochilodus magdalenae es la principal especie de la pesca continental colombiana; aunque se estima que su captura ha disminuido en 90% en los últimos 40 años; por lo que ha sido declarada en peligro crítico de extinción, debido a la sobrepesca y deterioro de su hábitat (1,2). Su cultivo se ha expandido rápidamente, siendo la cuarta especie más cultivada del país; en el año 2000 su producción piscícola se estimó en 1474 ton, mientras que en 2005 su producción alcanzó 2545 ton (3). El bocachico, al igual que las otras especies reofílicas de la cuenca del río Sinú, ha sido afectado por la construcción de la Hidroeléctrica URRA (4). El repoblamiento ha sido una de las acciones impulsadas para atenuar estos impactos; lo cual ha incrementado la demanda de alevinos de esta especie. Como en los otros vertebrados, el ciclo reproductivo de los peces puede ser dividido en dos grandes fases: la primera fase la componen la proliferación, crecimiento y diferenciación de los gametos (espermatogénesis y vitelogénesis); mientras que la maduración y preparación del ovocito y espermatozoide para la liberación y fecundación constituyen la segunda fase (espermiación y maduración final del ovocito) (5). En la mayoría de los peces la espermatogénesis y la vitelogénesis se presenta en cautiverio, cuando las condiciones ambientales y el manejo del cultivo son adecuados (6). La disfunción reproductiva más común ocasionada por el cautiverio en los reproductores machos

es la reducción del volumen y disminución de la calidad seminal; mientras que en las hembras se interrumpe la maduración final y, por tanto, no se presenta ovulación y desove (7); por lo que las inducciones hormonales se utilizan para incrementar el volumen seminal en machos y completar la maduración final y lograr la ovulación en hembras (5). En cautiverio las reproductoras hembras de bocachico, completan la vitelogénesis e interrumpen la maduración final del ovocito, mientras que en los machos se disminuye el volumen seminal (8); por lo que los alevinos utilizados tanto para los cultivos de engorde como para los programas de repoblamientos son obtenidos por reproducción artificial mediante tratamientos hormonales, principalmente con extracto pituitario de carpa (EPC). Para mantener la oferta de alevinos durante gran parte del año algunas estaciones productoras de semilla de bocachico inducen a una misma hembra por lo general dos veces en un año. La segunda reproducción, en especies reofílicas como bocachico, es posible dado que su desarrollo ovocitario ha sido descrito como sincrónico en dos grupos (8); lo cual sugiere que además del lote que están madurando para ser desovado mantienen en sus gónadas un lote de ovocitos pre-vitelogénicos, también conocidos con el nombre de stock de reservas. Una vez que el lote que ha madurado ha sido desovado por inducción hormonal, un nuevo lote del stock de reserva, al recibir las condiciones ambientales adecuadas particularmente de

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calidad del agua y de alimentación inicia el proceso de crecimiento (vitelogénesis). Esta condición es la que hace posible realizar más de una inducción hormonal en un mismo año. Pese lo anterior, no se conocen trabajos que evalúen y comparen el desempeño reproductivo entre la primera y segunda inducción hormonal, por lo que, el objetivo de este estudio fue evaluar el desempeño reproductivo del bocachico sometido a dos inducciones hormonales con EPC durante un mismo año.

de amonio total, alcalinidad y dureza se realizaron al inicio y al final tanto de la inducción hormonal como en la incubación de los huevos. Luego de obtener los productos sexuales, los reproductores fueron devueltos al mismo estanque para su reposo e iniciación de un nuevo ciclo de maduración gonadal, tratándose en lo posible de mantener el mismo manejo antes de ser sometidos a la inducción hormonal. Los animales fueron revisados quincenalmente hasta observar nuevamente las características de maduración final.

MATERIALES Y MÉTODOS

Desempeño reproductivo. El desempeño reproductivo se determinó mediante el índice de ovulación, fecundidad absoluta, fecundidad relativa, tasa de fecundación y tasa de eclosión. Se consideró como índice de ovulación, la fracción de las hembras ovuladas del total de hembras inducidas hormonalmente. Para determinar el momento de la ovulación, las hembras fueron revisadas cada media hora a partir de las cinco horas post-inducción. Se consideraron ovuladas aquellas hembras que al ser sometidas a ligera presión en el abdomen los ovocitos fluyeron libremente por el orificio genital. Los productos sexuales tanto de hembras como de machos se obtuvieron por masajes en el abdomen en sentido cráneo-caudal. El peso del desove fue medido con ayuda de una balanza Precisa (5000D-12000G, ±0.01 g, Dinamarca). La fecundidad absoluta se expresó tanto en gramos de ovocitos/hembra como ovocitos/ hembras. Para calcular esta última se tomó una muestra de 1 g de ovocitos, se contaron y luego se aplicó la siguiente fórmula (11):

Sitio de estudio. El estudio se realizó en el Centro de Investigación Piscícola de la Universidad de Córdoba (CINPIC). Se utilizaron 23 hembras (pesos entre 152 y 618 g) y 20 machos (pesos entre 130 y 250 g), con edades entre uno y dos años, mantenidos en un estanque en tierra de 400 m2 (1pez/8 m2), con reposiciones del volumen de agua entre el 20 y 30% cada 15 días. Previo a la siembra de los reproductores, el estanque fue preparado mediante secado (una semana), encalado (100 g cal agrícola/m2) y abonado (150 g de vacaza/m2) con el fin de estimular la productividad natural para favorecer la alimentación de los reproductores. Durante el estudio el agua del estanque donde se mantuvieron los reproductores presentaron valores promedio de oxígeno disuelto (4.5 1.9 mg/L), pH (6.8±0.4), temperatura (28.8±1.1°C), dureza (94.7±24.4 mg CaCO3/L), alcalinidad (118.4±42.0 mg CaCO3/L) y amonio total (0.3±0.2 mg/L).   Las hembras fueron seleccionadas, inicialmente, mediante el diagnóstico presuntivo utilizando señales externas tales como abultamiento del abdomen, enrojecimiento y dilatación de la papila genital (8). Luego, mediante biopsia ovárica, se verificó el inicio de la maduración final, observando la posición de la vesícula germinal (núcleo) del ovocito (8, 9). Los machos fueron seleccionados cuando al hacer ligera presión abdominal fluyó semen (10). Los reproductores seleccionados para inducción hormonal fueron pesados, marcados y mantenidos en piletas circulares de 2.1 m3 con flujo constante de 2 a 3 L/min. Las hembras fueron inducidas con 5 mg de EPC/Kg de peso dosificada en dos aplicaciones, la primera equivalente al 10% de la dosis total y doce horas después el 90% restante. A los machos se les aplicó el 80% de la dosis total de las hembras, en una aplicación única, conjuntamente con la segunda aplicación de las hembras. Durante la inducción hormonal como durante la incubación, la temperatura y pH del agua de las incubadoras fueron medidas cada dos horas; mientras que, las mediciones

F = n x G/g Donde: F = Fecundidad (número de huevos desovados por hembra) n = Número de ovocitos en la muestra G = Peso (g) de los ovocitos desovados por hembra g = Peso (g) de la submuestra La fecundación fue realizada en seco (in vitro) y la incubación se llevó a cabo en incubadoras cilindro-cónicas de 60 L de volumen y flujo de agua ascendente continúo de 2 a 3 L/min. Después de cuatro horas post-fecundación se determinó la tasa de fecundación, tomando tres muestras de cien huevos en cada incubadora. Se consideraron como huevos fecundados aquellos cuyos embriones tenían aspecto transparente; mientras que como embriones no viables se consideraron aquellos que presentaron color opaco o blancuzco. De

Atencio - Desempeño reproductivo del bocachico Prochilodus magdalenae la misma manera se determinó la tasa de fecundación, aproximadamente a las 11 horas post-fecundación. Análisis de los datos. Todas las variables para evaluar el desempeño reproductivo (índice de ovulación, fecundidad absoluta, fecundidad relativa, tasa de fecundación y eclosión) y los parámetros de calidad de agua se analizaron mediante la prueba t student con un nivel de significancia del 95%. El análisis estadístico se realizó en el programa Statgraphics Plus 5.0 (12).

Tabla 2. Valores de peso, fecundidad absoluta y relativa y biopsia ovárica de hembras de bocachico Prochilodus magdalenae inducidas dos veces en un mismo año con extracto pituitario de carpa (EPC).

Peso (g)

Biopsia ovárica (posición núcleo, %)

RESULTADOS Los valores promedios de las principales variables físicas y químicas del agua utilizada en la inducción hormonal e incubación de los huevos se muestran en la tabla 1, tanto en la primera como en la segunda inducción del bocachico con EPC. La temperatura, la dureza y la alcalinidad total no presentaron diferencias significativas en las dos inducciones realizadas (p>0.05). Los valores promedios del pH oscilaron entre 7.5 y 7.7 para la primera y segunda inducción respectivamente, encontrándose diferencia significativa (p<0.05) entre estos valores. El valor promedio del amonio total osciló entre 0.08 mg/L para la primera inducción y 0.1 mg/L para la segunda, observándose diferencia significativa (p<0.05).

Tabla 1. Valores promedios de parámetros del agua utilizada en la inducción hormonal con EPC e incubación de huevos de bocachico Prochilodus magdalenae. Parámetro Temperatura (°C) pH

1 inducción

2 inducción

27.8 ±0.8a

28.0±0.8a

7.5±0.4a

7.7±0.4b

75.1±3.0a

77.6±4.1a

Dureza Total (mg CaCO3/L)

126.2±6.3a

126.5±5.5a

Amonio Total (mg/L)

0.08±0.005a

0.1±0.01b

Alcalinidad total (mg CaCO3/L)

La tabla 2 presenta las características de peso y los resultados de las biopsias ováricas (posición de la vesícula germinal); así como los valores promedio de la fecundidad absoluta y relativa de hembras de bocachico inducidas dos veces con EPC. Para la primera inducción el peso promedio fue de 287.4 g, mientras que para la segunda inducción se registró un leve incremento (310.9 g) sin observarse diferencia significativa (p>0.05). La biopsia ovárica mostró que tanto en la primera como en la segunda inducción predominaron los ovocitos en maduración final, caracterizados por presentar

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1 inducción n=23

2 inducción n=23

Prom±d.e.

287.4±93.4a

310.9±88.2a

Mínimo

152.0

191.0

Máximo

603.0

618.0

Céntrico

18.9±4.3a

19.1±3.5a

Migrando

27.6±5.0a

27.4±4.6a

Periférico

41.2±4.8a

40.6±4.3a

Atrésico

12.4±9.0a

12.6±6.9a

Tiempo de maduración (días)

Fecundidad absoluta

Fecundidad relativa

g ovocitos/ hembra ovocitos/ hembra

97.6±12.4

44.6±15.2a

36.4±15.5a

53535±20185a

40658±19001b

g ovocito/ Kg hembra

160.5±51.0a

118.0±49.4b

ovocitos/ Kg hembra

192058±65531a

59416±62010b

Valores promedios con letras diferentes en la misma fila indican diferencia significativa (p<0.05)

la vesícula germinal migrando hacía el micrópilo; observándose que los núcleos en posición migrando más los periféricos sumaron más del 68% de los ovocitos analizados; sin observarse diferencia significativa en los porcentajes de las diferentes posiciones del núcleo de los ovocitos entre la primera y la segunda inducción (p>0.05). Los resultados de la biopsia ovárica, permiten señalar que las hembras tanto en la primera como en la segunda inducción hormonal habían completado la vitelogénesis e iniciado la maduración final y se encontraban aptas para recibir los tratamientos hormonales para inducir la reproducción. Luego de la primera inducción con EPC las hembras en promedio se demoraron 97.6±12.4 días para alcanzar nuevamente la maduración final y estar lista para una nueva inducción hormonal. La fecundidad absoluta, expresada en g ovocitos/ hembra, no presentó diferencia significativa entre la primera y segunda inducción, oscilando entre 36.2 y 44.6 g/ovocitos hembra (p>0.05). Sin embargo, al expresar esta fecundidad en términos de número de ovocitos por hembra (ovocitos/hembras) se observó diferencia significativa (p<0.05), siendo mayor esta fecundidad en la primera inducción (53535 ovocitos/hembra) al ser comparada con la segunda inducción (40658 ovocitos/hembra). Los valores de la fecundidad relativa (g ovocitos/Kg hembra) y número de ovocitos por

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Kg de hembra (ovocitos/Kg hembra) también mostraron diferencia significativa. En ambas magnitudes la fecundidad relativa fue mayor en la primera inducción al ser comparada con los valores obtenidos en la segunda inducción (p<0.05). La tabla 3, muestra los valores del índice de ovulación, tasa de fecundación y de eclosión de las hembras de bocachico inducidas dos veces en un mismo año con EPC. De las 23 hembras tratadas tanto en la primera como en la segunda inducción, solo respondieron 21 (0.91). Tabla 3. Tasa de fertilización y tasa de eclosión del bocachico Prochilodus magdalenae inducidos dos veces en un mismo año con Extracto Pituitario de Carpa (EPC). 1 inducción n=23

2 inducción n=23

21/23 (0.91)a

Prom±d.e.

73.9±19.6a

56.9±17.9b

Índice de ovulación

Tasa de fertilización (%)

Tasa de eclosión (%)

Mínimo

29.0

26.0

Máximo

96.5

89.0

Prom±d.e.

55.6±21.1a

35.6±20.7b

Mínimo

15.0

0.0

Máximo

80.5

80.0

Valores promedios con letra diferentes en la misma fila indican diferencia significativa (p<0.05).

La tasa de fecundación mostró diferencia significativa (p<0.05); siendo mayor en la primera inducción (73.9%) al ser comparada con el valor registrado en la segunda (56.9%). Igual comportamiento mostró la tasa de eclosión, la cual presentó diferencia significativa (p<0.05) entre la primera (55.64 ± 21.13%) y segunda inducción (35.6 ± 20.7%).

DISCUSIÓN La eficiencia en los procesos de reproducción inducida depende en gran parte de ofrecer condiciones ambientales adecuadas de manejo y calidad del agua durante la inducción hormonal y el proceso de incubación (5,8,13,14). En el presente estudio la calidad de agua en que fueron realizadas tanto la primera como la segunda reproducción artificial para las mismas hembras de bocachico oscilaron dentro de los rangos normales para la inducción hormonal e incubación de los huevos de esta especie neotropical (8). A pesar que las condiciones de pH y amonio total presentaron diferencia significativa entre la primera y segunda inducción, ambas variables se mantuvieron

dentro de valores normales (14), por lo que biológicamente no representaron ninguna diferencia y por tanto no pueden considerarse como las causas de las diferencias en el desempeño reproductivo entre la primera y segunda inducción hormonal. El pH se mantuvo ligeramente básico entre 7.5 y 7.7; mientras que, el amonio total en ninguno de los casos fue superior a 0.1 mg/L. Además, en ningún momento la temperatura de incubación fue superior a los 29°C, por lo que esta variable no afectó negativamente las tasas de fecundación y eclosión. Se ha reportado que temperaturas de incubación por encima de 29°C afectan la tasa de fecundación y de eclosión (15). En general, los parámetros evaluados en el presente estudio sugieren que la calidad del agua en que fueron realizadas las reproducciones de bocachico y la incubación de los huevos no afectó el desempeño reproductivo de esta especie, ni en la primera ni en la segunda inducción hormonal. Los resultados demostraron que el bocachico es posible reproducirlo más de una vez en un mismo año, en virtud de su desarrollo ovocitario sincrónico en dos grupos; el cual se caracteriza en que además, del lote de ovocitos que está madurando para ser desovado, mantienen un lote en reserva (pre-vitelogénicos, stock de reservas) (8). Al igual que en bocachico, se ha reportado que la cachama blanca Piaractus brachypomus y la cachama negra Colossoma macropomum pueden ser inducidas más de una vez en un mismo año, en un periodo entre 98 y 111 días (16). Tanto el bocachico como las cachamas (blanca y negra) son peces reofílicos, presentan un desarrollo ovocitario sincrónico en dos grupos y no se reproducen en cautiverio; ya que la principal disfunción reproductiva ocasionada por el cautiverio es la interrupción de la maduración final y por tanto no ovulan ni desovan; por lo cual requieren de inducciones hormonales para finalizar la maduración final, lograr que ovulen y desoven. Después de la ovulación y desove, obtenidos en la primera inducción hormonal, las hembras entraron en un proceso de reposo, iniciaron y completaron una nueva vitelogénesis, seguidamente iniciaron e interrumpieron la maduración final. Este estudio encontró que las hembras de bocachico después de ser sometidas a la inducción hormonal y devueltas al estanque alcanzan nuevamente la maduración final, por tanto aptas para inducción, aproximadamente en tres meses (97.6 días). Es importante considerar que el tiempo entre la primera y la segunda inducción obtenido en el presente estudio (97.6 días) podría variar

Atencio - Desempeño reproductivo del bocachico Prochilodus magdalenae dependiendo de las condiciones ambientales a las que sean sometidas las hembras, particularmente en términos de calidad de agua, alimentación y densidad de siembra (5,8,13,14). Sin embargo, en el presente estudio las condiciones en que fueron mantenidas las hembras antes de la primera inducción podrían considerarse similares a las condiciones en que desarrollaron la segunda maduración final; en virtud que el manejo fue realizado en el mismo estanque bajo las mismas densidades de siembra y calidad del agua. Este manejo se reflejó en que los pesos promedios de las hembras antes de ser sometidas a la primera (287.4 g) y segunda inducción (310.9 g) no mostraron diferencia significativas (p>0.05), sugiriendo que las condiciones de manejo ofrecidas antes de las inducciones fueron similares. Entre la primera y segunda inducción hormonal del bocachico no se registraron diferencias en el índice de ovulación (hembras ovuladas/ hembras tratadas = 0.91), indicando que esta variable no fue afectada por la segunda inducción hormonal con EPC. Cordero y Pertuz (17), reportaron un índice de ovulación similar (0.92) para esta especie cuando fue inducida con el mismo protocolo de reproducción utilizado en el presente estudio (0.91); lo cual permite sugerir que las hembras estaban aptas para recibir el tratamiento hormonal y la efectividad del EPC para inducir la ovulación y el desove del bocachico; cuando el bocachico se ha intentando inducir con 0.5 mL de Ovaprim®/ Kg de peso se han obtenidos bajos índices de ovulación (menores de 0.42) (17). Sí bien el índice de ovulación no fue afectado en las hembras de bocachico en la segunda inducción hormonal, variables como la fecundidad, medida en términos absoluto y relativo, así como la tasa de fertilización y de eclosión, mostraron un decrecimiento. La fecundidad absoluta, medida en gramos de ovocitos por hembra, decreció en 24.0%, la fecundidad relativa, medida en gramos de

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ovocitos por Kg de hembra, disminuyó en 26.5%; pero expresada en términos de número de ovocitos por Kg de hembra cayó 65.9%. Igual comportamiento sufrieron la tasa de eclosión y fecundación las cuales decrecieron en la segunda inducción hormonal en 23.0 y 36.0%, respectivamente, como consecuencia de la segunda inducción hormonal. Cordero y Pertuz (17), utilizando el mismo protocolo de inducción con EPC, registraron valores de fecundidad relativa (142.0 g de ovocitos/Kg hembra), tasa de fertilización (89.2%) y de eclosión (63.1%) similares a los resultados obtenidos en la primera inducción en el presente estudio. Si bien es cierto, el desempeño reproductivo puede ser afectado por las condiciones ambientales (5,8,13,14) los resultados del presente estudio sugieren que entre la primera y la segunda inducción hormonal hay una pérdida del desempeño reproductivo en términos de la fecundidad, tasa de eclosión y tasa de fecundación que pueden ser atribuidos al efecto de la segunda inducción a que fueron sometidas las hembras. Los resultados del presente estudio permiten concluir que el bocachico puede ser inducido dos veces en un mismo año o temporada reproductiva, debido a que presenta un desarrollo ovocitario sincrónico en dos grupos. Esta doble inducción de una hembra de bocachico, en un mismo año o temporada reproductiva, no afecta el índice de ovulación en la segunda inducción hormonal cuando es comparado con el obtenido en la primera inducción. Sin embargo, la fecundidad puede disminuirse entre 24 (absoluta) y 66% (relativa); mientras que las tasas de fecundación y eclosión pueden disminuirse entre 23 y 36% en la segunda inducción con relación a los valores obtenidos en la primera inducción hormonal; además es preciso un periodo de aproximadamente tres meses para alcanzar nuevamente la maduración final y estar listas para una nueva inducción hormonal.

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3311-3316, 2013. ORIGINAL

Seroprevalence and risk factors associated to Neospora caninum in dairy cattle herds in the municipality of Pasto, Colombia Seroprevalencia y factores de riesgo asociados a Neospora caninum en ganado lechero en el municipio de Pasto, Colombia Darío Cedeño Q,1* M.Sc, Bibiana Benavides B,1 M.Sc. Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Pecuarias, Programa Medicina Veterinaria, Grupo de investigación de Buiatria, Pasto, Colombia. *Correspondencia: dcedeno@udenar.edu.co. 1

Recibido: Agosto de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

ABSTRACT Objective. To determine seroprevalence and risk factors associated to Neospora caninum in nonvaccinated dairy cattle against infectious agents of reproductive syndrome in the municipality of Pasto, Colombia. Materials and methods. Farms over 2527 meters over sea level were selected, a total of 238 serum samples of Holstein cows were collected and analyzed using the indirect ELISA test to determine N. caninum seropositivity. An epidemiological survey was realized in each herd which included variables related to health and management measures of cattle. A multivariate analysis of binary logistic regression was used with a confidence interval of 95% (p<0.05) using SPSS19® program. Results. The estimated prevalence of N. caninum was 76.9%. The risk factors associated to neosporosis infection in the analyzed farms are as follows: residues of abortions generally left outdoors and not buried (OR 3.81, 95% CI 1.5 - 9.6); dogs fed with leftovers (OR 15.44 IC 95% 1.94-123.22) and bulls allowed to mate with cows (OR 19.68, 95% CI 2.34 - 165.52). Conclusions. The high prevalence of N. caninum and the low abortion rate in dairy herds of the municipality of Pasto corroborated no existence of the disease in all animals serologically positive, but it did suggest that at some point in their lives they were exposed to N. caninum. From the identified risk factors in this study, recommendations can be provided for an effective control of reproductive diseases like Neosporosis present in this region. Key words: Abortion, fetal death, parasites, serology (Source: CAB).

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RESUMEN Objetivo. Determinar la seropositividad de N. caninum en bovinos no vacunados contra el síndrome reproductivo y los factores de riesgo asociados a la presentación de esta enfermedad en los hatos lecheros del municipio de Pasto, Nariño. Materiales y métodos. Se seleccionaron fincas sobre los 2527 msnm. Se analizaron muestras de suero de 238 vacas Holstein mediante la prueba de ELISA indirecta para determinar la seropositividad a N. caninum y se realizó una encuesta epidemiológica incluyendo variables sobre el ganado como: medidas sanitarias y de manejo. Se realizó un análisis multivariado mediante regresión logística binaria con un intervalo de confianza del 95% (p<0.05) utilizando el programa SPSS19®. Resultados. La prevalencia estimada para N. caninum fue de 76.9%. Los factores de riesgo asociados a Neosporosis en las fincas estudiadas son los residuos de abortos, que no se entierran y se dejan a la intemperie (OR 5.49; IC 95% 1.7-17.7), alimentar los perros con desperdicios (OR 15.44 IC 95% 1.94-123.22) y la monta directa (OR 14.62 IC 95% 1.55-137.53). Conclusiones. La elevada prevalencia de N. caninum y la tasas bajas de abortos en el municipio de Pasto, confirma que la enfermedad no se presenta en todos los animales positivos serológicamente, pero sugiere que en algún momento de su vida fueron expuestos al agente causal. A partir de los factores de riesgo identificados en este trabajo se pueden establecer recomendaciones para un control efectivo de enfermedades reproductivas como la Neosporosis presentes en la región. Palabras clave: Aborto, muerte fetal, parásitos, serología (Fuente: CAB).

INTRODUCTION Bovine neosporosis is a parasitic disease caused by the protozoan Neospora caninum (N. caninum) and it is considered one of the main causes of abortion in cattle worldwide (1). Abortions due to Neosporosis infection have been reported as a substantial financial loss in livestock industry (2). The transmission from an infected cow to its offspring has been identified as the main route of infection. Elimination of N. caninum in aborted fetuses is considered one of the most relevant ways to maintain the infection in herds (3). Dogs have been identified as definitive hosts, where the sexual stage of protozoa develops in the gut forming oocysts eliminated with the feces and then ingested by cattle (4). The asexual phase starts in cows with the formation of tissue cysts and tachyzoites in the intermediate host or fetus. The completion of the epidemiological cycle occurs when dogs ingest infected tissues- aborted fetus or placenta tissue- forming oocysts all over again (5). Drinking water and food, contaminated by dogs or any other carriers not yet identified can cause this infection (6,7). Abortions can occur sporadically or in outbreaks at any time of gestation (8), but it is more common between the 4th and 6th month of pregnancy (6). It has been reported that there is a higher prevalence in dairy cattle than in beef cattle because of management factors facilitating the spread of the disease (9).

Seroprevalence of N. caninum has been reported as follows: in Argentina 64.5% in cows with clinical history of abortion (10), in Paraguay a seroprevalence of 29.8% was detected by ELISA and it was identified as the major cause of abortions in meat and milk cattle (11). In Parana, Brazil 15.1% was found in dairy Holstein breed (12). In Aguascalientes, México 57.5% seroprevalence was found in cows with a clinical history of abortion (13), similar to those found in dairy herds in Tulcán-Ecuador 51.64 % (14). In northwestern United States a 24% of seroprevalence was found; which increases during the winter, attributed to the high density of cattle (15). In Colombia, 54.1% of seroreactivity was reported in 357 animals with a history of abortion (16). In Nariño, there have been no epidemiological studies on patterns of N. caninum; therefore the objective of this study was to determine the prevalence and risk factors associated with this parasite.

MATERIALS AND METHODS A cross-sectional study was conducted to determinate the seroprevalence of N. caninum in the municipality of Pasto. The difference among exposed animals and non-exposed animals with the analyzed variables was found as a risk factor. Study site. This research was conducted in 10 dairy farms in the rural municipality of Pasto,

Cedeño - Seroprevalence and risk factor associated to Neospora caninum located nearby the Galeras Volcano, which belongs to an ecosystem of Lower Mountain according to the Holdridge classification. The ecosystem is characterized by 700 mm annual precipitation, average temperature of 13.3°C and humidity of 60% to 88%. These farms were extensively managed; cows remain most of the time within fenced pastures, with no physical separation between heifers and adult cows. Cattle population. The sample size was determined by a simple random sampling strategy, based on cow population in dairy farms according to the 2010 Census Foot and Mouth disease (FMD) vaccination in the municipality of Pasto:

Where: N: Number of dairy cows in the municipality (3489) P: Expected prevalence (40%) e: Accepted error (5%) Z: Confidence level (90%) A total of 238 Holstein cows were sampled, these animals had never been vaccinated against Neosporosis and other reproductive diseases. These animals were in small size herds with and a moderate level of milk production (15 kg/ cow/day), that corresponds with traditionally managed herds. These farms have information systems about reproductive events and animal identification. The inclusion criteria were: nursing cows (>2 years old) with more than 6 months of permanence in the farms. Variables. Epidemiological data were collected through a structured survey obtained by a direct interview with the cattle farmer. The included variables were: 1. Reproductive Management— synchronization, culling, and type of reproduction (natural or artificial insemination). 2. Animal Health— annual abortion, deworming, and vaccination; 3. Pasture Management— organic fertilizer and manure as fertilizer. 4. Origin of Replacements Cows (external, same farm or mixed). 5. Biosecurity— water source, elimination of fetuses and placentas. 6. Presence of animals— sheep, horses, pigs, cats, and dogs. Sample collection and serological examination. Blood samples (10 ml) were collected by venipuncture of coccygeal vein using sterile tubes without anticoagulant (Vacutainer) which were subsequently taken to the Clinical Veterinarian Diagnostic Laboratory

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at “Universidad de Nariño”. These blood samples were centrifuged (1500 rpm / 5 min) in order to obtain the serum which was finally stored at -20°C until it was analyzed. The presence of antibodies against Neospora caninum were tested using a commercial indirect Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit (Uppsala, Sweden, Svanova Biotech®), following the manufacturer’s specifications. The ELISA equipment for the kit was: 1. a lector STAT FAX 3200, 2. Washing equipment STAT FAX 2600 and 3. Incubator Stat Fax 2200. N. caninum iscom ELISA Kit is designed to detect bovine Neospora-specific antibodies (Immunoglobulin G-IgG) in serum. The kit procedure is based on a solid phase indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). In this procedure, serum samples were exposed to noninfectious Neospora antigen incorporated into iscoms coated onto wells of micro titer strips. Neospora antibodies (if present in the serum sample) bind parasite antigen in the wells. The HRP conjugate added subsequently forms a complex with these N. caninum antibodies. Unbound material is removed by rinsing before the addition of substrate solution. Subsequently a blue color develops which is due to the conversion of the substrate by the conjugate. A positive result is indicated by development of a blue color. The reaction is stopped by addition of the stop solution; the color changes to yellow. The result can be read visually or by a microplate photometer, where the optical density (OD) is measured at 450 nm. The sensitivity and specificity of the test was 99% and 96% respectively. The plates were read at 450nm and the results were given in optical density values expressed in percentage of positivity for antibodies to N. caninum. The used formula was:

The control values were within the following limits: positive control optical density (OD)>0.8 and OD negative control <0.15. To ensure validity, the duplicate of the OD values should not differ more than 25% from each other. This information was obtained from the Diagnostic Instructions Kit. Data analysis. The prevalence of antibodies to N. caninum was estimated from the ratio of positive results to the total number of examined cattle (17). The association between

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seroprevalence and risk factors was quantified using a multivariate binary logistic regression with a confidence interval of 95%. The significance of the association was estimated by determining Odds Ratio (OR) of each factor with a p<0.05. The adjustment of the test was assessed with statistics Hosmer-Lemeshow. Calculations were performed using SPSS 19® with the next steps: Analyzer>regression>logistic binary; where the dependent variable was positive or negative to N. caninum and variables like risk factors were analyzed as the covariate.

RESULTS Percentage of abortions in this study was 7%, but only 2% were attributed to N. caninum infection. The other animals which aborted were positive to other infectious agents such as Brucella abortus, Herpesvirus bovino tipo I and virus of diarrhea bovine. Medical records of the farms reported placental retention and return to estrus after artificial insemination, increasing the mating per conception; which directly affects open days (140±20 days). These farms only had records of vaccination against FMD and brucellosis. The prevalence for N. caninum in the municipality of Pasto was of 76.9% (183 cows seropositive). In nine farms, the seropositivity was over to 60% and it was lower only in one farm (Farm D.) The results of seroprevalence in each farm are described in table 1. Table 1. Prevalence of antibodies (IgG) to N. caninum in Holstein cows in dairy farms in the municipality of Pasto. Farm

Number of cows

Number of positive cows to Neospora

Number of negative cows to Neospora

Prevalence (%) Neospora

81.5

60.0

68.4

37.5

77.3

86.7

63.2

91.3

89.4

92.9

TOTAL

238

183

76.9

Three variables were associated with seropositivity to Neosporosis: residues of abortions generally left outdoors and not buried, dogs fed with leftovers and bulls allowed to mate with cows (Table 2).

Table 2. Risk factors associated with seropositivity of Neospora caninum in dairy farms in the municipality of Pasto. Variable Bulls allowed to mate with cows

14.62

IC 95% Lower

Upper

P-Value

1.55

137.53

0.012

Abortion Residues

5.49

1.7

17.7

0.003

Feeding dogs with leftovers

15.44

1.94

123.22

0.006

Confidence interval 95%, 2Odds ratio, 3P‹ 0.05

Other variables showed co linearity or low association such as: management and the serologic results of cattle, presence of other animals (sheep, horses, pigs, cats, and dogs), pasture management (organic fertilizer, manure as fertilizer), and origin of replacements cows (external, same farm or mixed).

DISCUSSION The seroprevalence of N. caninum within this region is high compared to other parts of the country. In Monteria 10.2% seropositivity was found in cows with reproductive problems (18) Other studies in Colombia by Zambrano et al (16) reported 54.1% of seroreactivity in 357 animals with a history of abortion, using the same diagnostic technique ELISA in Antioquia, the prevalence found in Holstein cattle was of 39.9% and in Brangus cows was 2% (19). Abortion is the most commonly reported event in cases of Neosporosis (20); however in this study, the abortion rate was 7% and it was related to the N. caninum infection. This research has questioned the association between infertility or sub fertility and seropositivity to the agent. The majority of these farms have eventually had reproductive problems. The most common issue was the high range of open days exceeding the estimated range and repetition of heats. It also states that the fetal mummification is a common event in cases of neosporosis described in cases of natural and experimental infections (21), only one farm reported this situation. The presence of dogs was common in all farms, which cannot be determined statistically as a risk factor because of the co-linearity. However, in a study in Brazil, no association between the presence of dogs in farms with N. caninum seropositivity was found (12). Other authors describe a strong association between the existence of canine defecation in pastures, presence of street dogs and other wild animals (foxes) with the presentation of N.

Cedeño - Seroprevalence and risk factor associated to Neospora caninum caninum (22,23). Moreover, feeding dogs with leftovers and residues of abortions represent a risk factor, because the food is contaminated with tachyzoites; starting the cycle in definitive hosts (24). The elimination of aborted material becomes a major risk factor in this sampled region; contrary to those reported in Aguascalientes, México (13) where no association was found between the provision of aborted fetuses and placental debris with seroprevalence. Fetuses and/or stillbirths, and poor provision of these materials in the farm are conducive to a proliferative environment of this parasite in pasture water and facilities. Animals found within the premises that entered in the parasite cycle may contaminate them because oocysts are environmentally resistant (25). Mating among cows and bulls is a common practice in this region, which has become a risk factor even though, artificial insemination is allowed in cows during repeats estrus. Experiments conducted in the U.S. showed that venereal transmission is possible with a large number of tachyzoites (26). In this study, two out of three bulls sampled were seropositive for antibodies

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to N. caninum. Benavides et al, consider that there is a strong association between abortions and absence of drainage systems and septic tanks in the Department of Nariño, in regards to the management of wastewater and storm water because this improves the maintenance of N.caninum and Leptospira sp (27). However, in these farms there were no risk factors for the disease studied. In terms of the replacements management of farm raised or purchased cattle, there were no risk factors associated with seropositivity of N. caninum. Farmers breeding their own replacement cattle are one relevant mechanism in order to maintain a high prevalence (28). In conclusion, the results obtained in this research do not show the existing disease in animals that were positive to the serologic test. This suggests that these animals were eventually exposed to the causal agent causing the formation of specific antibodies to the parasite. Finally, it is important to mention that the poor management of aborted animals, feeding dogs with leftovers, and cattle mating are risk factors associated with the seropositivity of N. caninum

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3317-3326, 2013. ORIGINAL

Factores que afectan la preñez en vacas Brahman sometidas a inseminación artificial a tiempo fijo Factors affecting pregnancy in Brahman cows submitted to fixed-time artificial insemination Adriana Correa-Orozco,1* M.Sc, Luis Uribe-Velásquez,2 Ph.D, Erik Pulgarín-Velásquez,1 MVZ. Universidad de Caldas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Grupo de Investigación CIENVET. Manizales, Colombia. 2Universidad de Caldas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Salud Animal. Manizales, Colombia. *Correspondencia: adrianacorreao@hotmail.com. 1

Recibido: Agosto de 2011; Aceptado: Enero de 2012.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la relación entre la condición corporal (CC), la manifestación de estro, las concentraciones plasmáticas de estradiol, el diámetro del folículo mayor y la preñez, en vacas Bos indicus amamantando, sometidas a un protocolo de inseminación artificial a tiempo fijo (IATF). Materiales y métodos. Treinta y ocho vacas Brahman recibieron un dispositivo intravaginal de progesterona + benzoato de estradiol en el día 0; retiro del dispositivo + dinoprost + gonadotropina coriónica equina en el día 9 y la IATF en el día 12. La preñez fue diagnosticada 90 días después de la IATF. Resultados. No hubo efecto de la CC sobre la manifestación de estro, las concentraciones plasmáticas de estradiol o el diámetro del folículo mayor (p>0.05). El diámetro del folículo mayor no influenció las concentraciones plasmáticas de estradiol (p>0.05). El diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de estradiol no influenciaron la manifestación de estro (p>0.05). La tasa de preñez por IATF no fue afectada (p>0.05) por la CC, la manifestación de estro o las concentraciones plasmáticas de estradiol. Hubo una tendencia (p=0.10) de una relación directa entre el diámetro del folículo mayor y la tasa de preñez por IATF. Conclusiones. La CC, las concentraciones plasmáticas de estradiol y la manifestación de estro no influenciaron la tasa de preñez por IATF en vacas Brahman sometidas a un protocolo de sincronización basado en progesterona. Sin embargo, el diámetro del folículo mayor presentó tendencia al impacto positivo sobre la tasa de preñez por IATF. Palabras clave: Condición corporal, estradiol, folículos ováricos, ganado de carne (Fuente: Agrovoc).

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ABSTRACT Objective. To examine the relationship between body condition score (BCS), the occurrence of estrous, estradiol plasma concentrations, diameter of largest ovarian follicle (LF) and pregnancy rate in suckled Bos indicus cows submitted to a fixed-time artificial insemination (FTAI) protocol. Material and methods. Thirty eight Brahman cows received an intravaginal device of progesterone + estradiol benzoate on Day 0, device withdrawal + dinoprost + equine chorionic gonadotropin on Day 9, and FTAI on Day 12. Pregnancy was diagnosed 90 days after FTAI. Results. There was no effect of BCS on the occurrence of estrous, estradiol plasma concentrations or diameter of the LF (p>0.05). The diameter of LF did not influence (p>0.05) estradiol plasma concentrations. The diameter of the LF and estradiol plasma concentrations did not influence the occurrence of estrous (p>0.05). Pregnancy rate per FTAI was not affected (p>0.05) by BCS, the occurrence of estrous or plasma concentrations of estradiol. There was a tendency (p=0.10) of a direct relationship between diameter of the LF and pregnancy rate FTAI. Conclusions. BCS, plasma concentrations of estradiol and occurrence of estrous did not influence pregnancy rate per FTAI in Brahman cows submitted to progesterone-based protocol. However, the diameter of LF had a tendency to positive impact on pregnancy rate per FTAI. Key words: Beef cattle, body condition, oestradiol, ovarian follicles (Source: Agrovoc).

INTRODUCCIÓN Existen diferencias en la dinámica folicular de las hembras Bos taurus y Bos indicus, lo que sugiere la importancia de conocer las particularidades del desarrollo folicular en las especies bovinas, con el fin de implementar protocolos de manejo reproductivo distintos para mejorar la eficiencia reproductiva (1). Según Baruselli et al (2), se sugiere que los tratamientos con dispositivos liberadores de progesterona (P4) y benzoato de estradiol, pueden mejorar el desempeño reproductivo en vacas Bos indicus con cría, debido a su efecto favorable sobre la frecuencia pulsátil de la hormona luteinizante, el crecimiento del folículo y la ovulación. Además, el uso de la gonadotropina coriónica equina (eCG) al momento del retiro del dispositivo de P4 en un programa de inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) mejora la tasa de preñez (2-4). Sin embargo, la variabilidad en la respuesta a los tratamientos hormonales, el tiempo requerido para los mismos y la detección del estro, particularmente en ganado Bos indicus, limitan la aplicación y el éxito de esas tecnologías (5). La ovulación de folículos pequeños produce baja fertilidad debido posiblemente, al desarrollo de un cuerpo lúteo de tamaño menor, alterando las concentraciones circulantes de P4 (6). Además, de aumentar la tasa ovulación, otros factores tales como la producción de estradiol (E2) endógeno, la competencia del oocito, el diámetro del cuerpo lúteo y la concentración de P4 en el ciclo estral siguiente, también resultan de la ovulación de un folículo más grande, el cual finalmente puede beneficiar la fertilidad en vacas de carne después de un protocolo de IATF (7).

En Colombia, para el año 2005 se estimó un hato de 23 millones de bovinos, de los cuales el 72% corresponde a ganado Bos indicus (8). Debido a la predominancia de este tipo de ganado en el país, es importante contribuir al desarrollo e investigación en explotaciones dedicadas a la cría de ganado de carne con razas Bos indicus. El desafío más importante para este tipo de animales en climas tropicales, es el anestro posparto prolongado; por lo tanto, los tratamientos que mejoren esta condición, tienen impactos positivos sobre las ganaderías de carne (9). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la relación existente entre la condición corporal (CC), la manifestación de estro, el diámetro del folículo mayor, las concentraciones plasmáticas de E2 y la tasa de preñez, en vacas Bos indicus sometidas a un protocolo de IATF.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización. El experimento se realizó entre el mes de junio y el mes de octubre de 2010 en la Hacienda La Indiana, ubicada en el municipio de Buenavista, Departamento de Córdoba, Colombia (8º03’25.40”N/75º29’19.95”O, 68 msnm). El clima se caracteriza por ser cálido húmedo según la clasificación de Holdridge, con una precipitación anual entre 2000 a 2500 mm, temperatura media de 27ºC y humedad relativa entre 80 – 85% (10). Animales. Se utilizaron 38 vacas Brahman (Bos indicus) en amamantamiento, normales al chequeo reproductivo transrectal (cuatro de primer parto y 34 multíparas) y con 126.6 ± 4.4

Correa-Orozco - Factores que afectan la preñez en vacas Brahman días de posparto. Las vacas fueron mantenidas en pasturas de Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola y Brachiaria dictyoneura, con libre acceso al agua y sal mineralizada (8% fósforo). La CC fue evaluada el primer día del protocolo de sincronización del estro, utilizando una escala de 1 a 5 (1= emaciada, 5= obesa) (11). También se registró el peso corporal (PC) de cada animal. La CC fue categorizada como ≤3.25 ó >3.25, con el fin de analizar su relación con el diámetro del folículo mayor, las concentraciones de estradiol, la manifestación del estro y con la tasa preñez por IATF. Protocolo de sincronización del estro. Independiente del día del ciclo estral (inicio del tratamiento = día 0), las vacas recibieron un dispositivo intravaginal que contenía 1.3 g de progesterona (CIDR®, Pfizer Inc, New Zealand) y una inyección intramuscular (im) de 2.5 mg de benzoato de estradiol (BE; 1.0 ml Estro-Zoo®, Laboratorios Zoo Ltda, Bogotá, Colombia). Al día 9, el dispositivo intravaginal fue retirado y las hembras fueron tratadas con 25 mg de dinoprost como trometamina im (PG; 5.0 ml Lutalyse®, Pfizer Inc, Kalamazoo, USA) y 400 UI de gonadotropina coriónica equina im (eCG; 2.0 ml Folligon®, Intervet International, Booxmeer, Holanda). Las vacas fueron inseminadas con semen congelado de fertilidad probada, 56 a 60 horas después de retirar el dispositivo de progesterona (Figura 1). Además, 20 días después de la IATF, dos grupos de vacas (n=18 y n=20), estuvieron cada uno en pastoreo con un toro de raza Brahman para monta natural. Detección del estro. El estro fue determinado en un subgrupo de vacas (n=20) mediante un adhesivo (Estrotect, IVP, Spring Valley, Wiscosin, USA), el cual fue colocado entre la cadera y la base de la cola el día del retiro del CIDR. La manifestación de estro se estableció el día de la IATF por la activación de cada adhesivo.

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Ecografía ovárica y clases de folículos. Los ovarios fueron examinados por ecografía transrectal (6/8 MHz, Aquila Pro, Esaote Europe B.V., Maastricht, The Netherlands), con el objetivo de medir el diámetro del folículo mayor en el momento de la IATF. Los folículos fueron clasificados en cuatro categorías basadas en la media y la desviación estándar (DE) del diámetro (7). Por lo tanto, los folículos fueron categorizados como <8.0 mm; 8.1 a 10.9 mm; 11.0 a 16.7 mm y >16.7 mm. Determinación de las concentraciones plasmáticas de estradiol por radioinmunoanálisis. Se tomó una muestra de sangre de cada vaca por venopunción coccígea en tubo Vacutainer® con EDTA el día de la IATF. El plasma se obtuvo por centrifugación (1178 × g por 5 min) y fue almacenado en microtubos a –20°C. Las concentraciones plasmáticas de 17 β-estradiol fueron determinadas por radioinmunoanálisis en fase sólida utilizando el kit comercial ImmuChemTM Coated Tub 17 β-Estradiol® (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA), en el Laboratorio de Radioinmunoanálisis de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá. Cada muestra fue medida en duplicado y la media fue usada como el valor. Todas las muestras fueron incluidas en un sólo ensayo y se obtuvo un coeficiente de variación intra-ensayo de 15.7% y una sensibilidad de 0.3 pg/ml. Diagnóstico de preñez. Se realizó por palpación transrectal 90 días después de la IATF y se registró el tiempo de la preñez. Se consideró que las hembras con 90 días de gestación concibieron en la IATF y aquellas que tenían 70 días concibieron en la monta natural. La tasa de preñez por IATF fue calculada como la proporción de vacas preñadas dividida por el número de vacas inseminadas. La tasa de preñez por monta natural, que fue definida como el número de vacas preñadas por monta natural dividido entre el número de vacas sometidas a monta natural. Diseño experimental y análisis estadístico. Se realizó un diseño de estimación de parámetros, con los ajustes pertinentes para el efecto de bloque, en el cual las vacas fueron bloqueadas de acuerdo al día de inicio del protocolo de sincronización del estro (Grupo 1, n=18; Grupo 2, n=20).

Figura 1. Protocolo de sincronización del estro y actividades realizadas durante el experimento.

Mediante análisis de varianza se evalúo: (a) el efecto de la categoría de CC; la categoría del diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de estradiol sobre la manifestación de estro (variable binaria); (b) el efecto de la categoría del diámetro del folículo mayor y de la categoría de la CC sobre

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las concentraciones plasmáticas de estradiol y tasa de preñez por IATF; (c) el efecto de la manifestación de estro sobre la tasa de preñez por IATF. Se determinaron los coeficientes de correlación de Pearson entre la condición corporal (CC), el peso corporal (PC), el diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de estradiol. Además, se determinó por análisis de regresión la relación entre el diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de estradiol. La tasa de preñez por IATF (variable binaria) fue analizada mediante regresión logística, considerando como factores en el modelo la CC, el diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de estradiol. El modelo final sólo conservó el diámetro del folículo mayor, debido a que mostró una tendencia (p=0.10). La curva de regresión logística para la tasa de preñez por IATF y diámetro del folículo mayor fue creada con el coeficiente suministrado por el análisis de datos del programa SAS (12) y la formula Pi=e(ni)/1+e(ni), en la cual la pi es la probabilidad estimada, la n es el intercepto y la i es el estimador del punto. Los efectos de la CC y del PC al inicio del protocolo sobre la categoría del diámetro del folículo mayor también fueron determinados por regresión logística. Se obtuvo de cada variable incluida en el modelo estadístico el odds ratio (OR) y el intervalo de confianza (IC) al 95%. Se consideraron diferencias significativas cuando p≤0.05 y tendencias cuando p≤0.10. Los resultados se presentan como medias de mínimos cuadrados ± error estándar (EE). Los análisis estadísticos fueron realizados con el programa SAS (12).

RESULTADOS La media ± EE y el intervalo de las variables estudiadas, se presentan en la tabla 1. Se encontró una correlación positiva (0.60) y significativa (p<0.0001) entre la CC y el PC (Tabla 2). Manifestación de estro. En el subgrupo de vacas que fue determinado el estro mediante adhesivo (n=20), sólo siete de ellas mostraron estro (35.0%). La categoría de la CC (Tabla 3) y la categoría del diámetro del folículo mayor (Tabla 4), no afectaron (p>0.05) la manifestación de estro. Tampoco se encontró asociación entre

Tabla 1. Media ± error estándar (EE) y el intervalo de la condición corporal (CC), el peso corporal (PC), el diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de estradiol (E2), en vacas Brahman amamantando sometidas a un protocolo de IATF basado en progesterona/estradiol. Variable

Media ± EE

3.45 ± 0.06

2.5 a 4.0

522.20 ± 9.81

357 a 648

Diámetro del folículo mayor, mm

13.76 ± 0.47

8.30 a 19.10

Concentraciones plasmáticas de E2, pg/ml

23.99 ± 0.96

15.01 a 36.90

PC, kg

Intervalo

Tabla 2. Correlaciones de Pearson entre la condición corporal (CC), el peso corporal (PC), el diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de estradiol (E2), en vacas Brahman amamantando sometidas a un protocolo de IATF basado en progesterona/estradiol. Variable

PC 0.60*

0.60*

Diámetro del folículo mayor

-0.12

0.11

Concentraciones plasmáticas de E2

0.09

-0.18

Diámetro Concentraciones del folículo plasmáticas de E2 mayor -0.12

0.09

0.11

-0.18 0.09

0.09

*p<0.0001

Tabla 3. Manifestación de estro, concentraciones plasmáticas de estradiol (E2) y tasa de preñez por IATF de acuerdo a la categoría de condición corporal (CC), en vacas Brahman amamantando sometidas a un protocolo de IATF basado en progesterona/ estradiol. Variable

Categorías de CC ≤3.25

Número de vacas Manifestación de Estro, %

33.5

33.7

0.99

23.08 ± 1.40

0.70

11.9

0.52

Concentraciones plasmáticas de 22.25 ± 1.77 E2, pg/ml Tasa de preñez por IATF, %

>3.25

19.8

las concentraciones plasmáticas de E 2 y la manifestación de estro (p>0.05). Diámetro del folículo mayor en el momento de la IATF. El diámetro del folículo mayor no presentó correlación (p>0.05) con la CC ni con el PC (Tabla 2). La categoría del folículo mayor tampoco se relacionó con la CC o el PC (p>0.05). Concentraciones plasmáticas de estradiol (E2) en el momento de la IATF. No se demostró correlación (p>0.05) de las concentraciones de

Correa-Orozco - Factores que afectan la preñez en vacas Brahman

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E2 con la CC ni con el PC (Tabla 2). La categoría de la CC (Tabla 3) tampoco afectó esta variable (p>0.05). No se encontró asociación significativa entre el diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de E2 (Tabla 2), en el momento de la IATF (p>0.05). La categoría del diámetro del folículo mayor (Tabla 4) no influenció las concentraciones plasmáticas de E2 (p>0.05). Tabla 4. Manifestación de estro, concentraciones plasmáticas de estradiol (E2) y tasa de preñez por IATF de acuerdo a la categoría del diámetro del folículo mayor en el momento de la IATF, en vacas Brahman amamantando sometidas a un protocolo de IATF basado en progesterona/estradiol. Variable

Categorías del diámetro del folículo mayor 8.1 a 10.9 mm

11.0 a 16.7 mm

>16.7 mm

Número de vacas

Manifestación de Estro, %

49.7

50.8

0.16

Concentraciones 21.33 ± 2.42 plasmáticas de E2, pg/ml Tasa de preñez por IATF, %

Figura 2. Probabilidad de preñez por IATF en vacas Brahman amamantando (n=38), según el diámetro del folículo mayor en el momento de la IATF [probabilidad de preñez por IATF = e(-7.3648 + 0.3715 × el diámetro del folículo mayor en el momento de la IATF)/1 + e(-7.3648 + 0.3715 × el diámetro del folículo mayor en el momento de la IATF); p=0.10)].

25.18 ± 1.21 21.49 ± 2.43 0.19

13.5

34.8

0.23

Tasa de preñez por IATF. La tasa de preñez por IATF fue de 13.2% (5/38). No se encontró asociación (p>0.05) entre la CC y la tasa de preñez por IATF y en el análisis por categoría de CC (Tabla 3), tampoco se estableció efecto de esta variable sobre la tasa de preñez por IATF (p>0.05). No se halló efecto de la manifestación de estro sobre la tasa de preñez por IATF (p>0.05), con valores de 7.7% (1/13) para vacas que no mostraron estro y 28.6% (2/7) para las vacas detectadas en estro. Se determinó una tendencia de relación positiva entre el diámetro del folículo mayor y la tasa de preñez por IATF (p=0.10; OR=1.450; IC=0.933 a 2.252), en la cual el aumento en el diámetro del folículo mayor en el momento de la IATF incrementa la probabilidad de preñez por IATF (Figura 2). Es interesante que, en el análisis adicional por categoría del diámetro del folículo mayor (Tabla 4), no se evidenció el efecto de esta variable sobre la tasa de preñez por IATF (p>0.05). No se halló relación (p>0.05) entre las concentraciones plasmáticas de E2 y la tasa de preñez por IATF.

Tasa de preñez por monta natural. La tasa de preñez por monta natural después del protocolo de IATF (20 días) fue de 36.8% (14/38).

DISCUSIÓN En esta investigación, en el subgrupo de vacas que fue determinado el estro, la categoría de la CC no afectó la manifestación de estro. De forma contraria, en otros estudios, a medida que se aumentaba la CC, se incrementaba el porcentaje de vacas inseminadas a estro detectado (13) y la manifestación de estro en vacas sometidas a IATF (7). La categoría del diámetro del folículo mayor tampoco afectó la manifestación de estro en este experimento. De forma diferente, en hembras Angus x Nelore en anestro (13) y en vacas Nelore y Nelore x Angus en amamantamiento sincronizadas con P4 o progestágenos (7), las vacas con folículos más grandes tuvieron una mayor probabilidad de mostrar estro. En el presente estudio, las concentraciones plasmáticas de E2 no afectaron la manifestación de estro. Por el contrario, en vacas de carne cruzadas, sometidas a IATF con GnRH+PG+GnRH y a IA a estro detectado, las concentraciones de E2 en suero fueron mayores en vacas detectadas en estro en comparación con aquellas no detectadas en estro (14).

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La ausencia de efecto de la categoría de la CC, de la categoría del diámetro del folículo mayor y de las concentraciones plasmáticas de E2 sobre la manifestación de estro en esta investigación, se puede deber a que, como consecuencia de la falta de correlación de la CC con las concentraciones de E2, y a su vez de ésta variable con el diámetro del folículo mayor y la tasa de preñez por IATF, fue probable la falta de asociación con la manifestación de estro, debido a que este comportamiento depende fisiológicamente en gran parte de las concentraciones de E2. En la presente investigación, no se encontró relación del diámetro del folículo mayor en el momento de la IATF o de sus categorías, con la CC ni con el PC. Resultados similares fueron reportados en vacas Nelore sometidas a IATF (15). Contrariamente, otros autores encontraron que las vacas con mejor CC, tuvieron folículos más grandes (13,16,17). No obstante, Meneghetti et al (9) obtuvieron resultados contradictorios en varios experimentos. En el estudio de Sá Filho et al (18), el tratamiento con eCG provocó incrementos en la fertilidad debido, principalmente, al aumento en las tasas de preñez de vacas posparto no cíclicas o vacas con baja CC. Además, bajo esas circunstancias, el tratamiento con eCG al momento de retirar el progestágeno puede proporcionar un soporte gonadotrópico adicional, al aumentar la tasa de crecimiento del folículo. Ésto podría explicar en parte, la ausencia de efecto de la CC sobre el diámetro del folículo mayor en la presente investigación, en donde la eCG pudo haber aumentado el diámetro del folículo mayor en vacas con CC ≤3.25, de tal forma que aquellas hembras lograron alcanzar un diámetro folicular similar al de vacas con CC >3.25. En este experimento, las concentraciones plasmáticas de E2 en el momento de la IATF no se correlacionaron con el PC, la CC o sus categorías. Resultados similares fueron reportados en vacas Angus x Hereford multíparas (16) y en novillas de carne Bos taurus (19). La falta de relación entre la CC y las concentraciones plasmáticas de E2 en el presente estudio fue, probablemente, una consecuencia directa de la ausencia de asociación entre la CC y el diámetro del folículo de mayor tamaño, debido a que las concentraciones de esta hormona dependen de la producción por parte del folículo. En el presente estudio, no hubo relación entre el diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de E2. De forma similar, en vacas Angus cruzadas multíparas inducidas a ovular con GnRH+PG+GnRH, el tamaño del folículo

ovulatorio no influenció las concentraciones sanguíneas de E2 (14). Contrario a esto, en novillas (19) y en vacas de carne (20,21), las concentraciones de E 2 en sangre fueron correlacionadas positivamente con el tamaño del folículo dominante. Una sola dosis de eCG es suficiente para estimular el crecimiento de múltiples folículos (15). En la presente investigación, la aplicación de eCG pudo haber estimulado el desarrollo de varios folículos ováricos en algunos animales, lo cual incrementó la secreción de E2 no sólo del folículo de mayor tamaño sino también de otros folículos en desarrollo, razón por la cual, probablemente, no se pudo correlacionar las concentraciones plasmáticas de E2 con el diámetro del folículo de mayor en el momento de la IATF. Con el fin de correlacionar las concentraciones endógenas de E2 con el tamaño del folículo mayor en el momento de la IATF, no se aplicó una segunda dosis de un éster de E2 (BE o cipionato de estradiol) como inductor de la ovulación, lo cual posiblemente, puede afectar la tasa de preñez por IATF (13.2%). Según Sá Filho et al (22), es importante resaltar que la eficacia de los protocolos basados en P4 puede ser influenciada por la condición ovárica al momento de iniciar el protocolo. En las hembras que presentan concentraciones de P4 bajas en el momento de colocar los dispositivos de P4, posiblemente el tratamiento con P4/E2 no induzca consistentemente la regresión del folículo dominante, con la posterior ovulación de un oocito viejo al momento de retirar el dispositivo, provocando reducidas tasas de preñez en la IATF (23). La variabilidad en el inicio de una nueva onda en los protocolos de sincronización, genera en los folículos que van a ser inducidos a ovular al final del programa de sincronización, variaciones en el tamaño, la madurez y la capacidad esteroidogénica (24). Los folículos con perfiles de crecimiento prolongados (folículos persistentes), y sus efectos negativos sobre las tasas de preñez, ya han sido descritos ampliamente en la literatura. La condición reproductiva de las vacas (ciclicidad o anestro) y la sincronización de una nueva onda folicular al inicio del protocolo, con la posibilidad de dar origen a folículos persistentes, son factores que pudieron afectar la tasa de preñez por IATF obtenida en el presente experimento. Asimismo, existen fallas propias de los protocolos de IATF, en los cuales se ha reportado diferentes respuestas ováricas debidas al día del ciclo estral en el cual se inicia el protocolo de sincronización.

Correa-Orozco - Factores que afectan la preñez en vacas Brahman En este experimento, la CC no afectó la tasa de preñez por IATF. Varios autores han reportado resultados similares en hembras bovinas tratadas con protocolos basados en P4/E2 (25,26,27). Sin embargo, Meneghetti et al (9) encontraron resultados contradictorios en vacas Bos indicus tratadas con un protocolo de IATF similar, en donde en tres de cuatro experimentos, no hubo asociación entre la CC y la tasa de preñez, y en el cuarto, la tasa de preñez fue afectada positivamente por la CC. En un estudio realizado en Brasil, se concluyó que, la CC fue un factor de confianza para predecir la tasa de preñez en vacas Nelore sometidas a un protocolo de IATF basado en P4/E2 y destete temporal (15). Asimismo, varias investigaciones realizadas en Brasil con vacas Nelore y Nelore x Angus tratadas con diferentes protocolos de sincronización del estro y la ovulación, han reportado que una mayor CC al inicio del protocolo fue asociada con un aumento en la tasa de preñez (7,13,18). En vacas de primer parto Nelore y Nelore x Angus Rojo sometidas a un protocolo de IATF basado en P4/E2 y destete temporal, Meneghetti y Vasconcelos (17) encontraron que, el incremento promedio en la tasa de concepción fue de 6% por cada aumento de 0.25 puntos en la CC (escala de 1 a 5). Sá Filho et al (4) concluyeron que, los resultados contradictorios obtenidos acerca del efecto de la CC sobre la tasa de preñez en vacas Nelore de Brasil, pudieron deberse al estado reproductivo de las hembras (anestro o ciclicidad), el amamantamiento y la severidad del balance energético negativo. En la presente investigación, cabe anotar que, la gran mayoría de las vacas se encontraba en una CC≥3.25 (n=24). Esto podría explicar en parte, la falta de relación entre la CC y la tasa de preñez por IATF, la cual pudo deberse, probablemente, a un menor balance energético negativo de las vacas, lo cual les permitió mantener o recuperar rápidamente la CC después del parto, sin cambios agudos y/o importantes que pudieran afectar su desempeño reproductivo posparto. Asimismo, el tratamiento con eCG potencialmente causa un mayor crecimiento folicular y proporciona un ambiente endocrino más adecuado durante el proestro (grandes concentraciones de E2 en sangre) y el diestro (grandes concentraciones de P4 en sangre), el cual es favorable para la fertilidad (4). De esta forma, puede contribuir a aumentar las tasas de ovulación y las tasas de preñez en vacas (18), principalmente, cuando se encuentran en anestro, con baja CC (28) o ambos. Es probable que en la presente investigación, la eCG hubiera mejorado las tasas

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de ovulación y de preñez en las vacas con baja CC, razón por la cual al compararlas con las vacas de buena CC, no se logró establecer un efecto de la CC sobre la tasa de preñez por IATF. En el presente estudio, la manifestación de estro no afectó la tasa de preñez por IATF. Contrario a ésto, en varias investigaciones hechas con novillas y vacas, tratadas con diferentes hormonas para sincronizar el estro y la ovulación, las hembras que manifestaron estro tuvieron una mayor tasa de preñez que aquellas que no lo mostraron (3,7,14,29). En esta investigación, se determinó que, a medida que se incrementó el diámetro del folículo mayor en el momento de la IATF, hubo una tendencia a aumentar la probabilidad de preñez por IATF. Resultados similares se han obtenido en estudios previos realizados con hembras bovinas tratadas con varios protocolos hormonales (3,7,9,14,15,30,31). Sin embargo, en este experimento, no se estableció efecto de la categoría del diámetro del folículo mayor sobre la tasa de preñez por IATF. Contrariamente, en novillas Nelore, al clasificar los animales de acuerdo al diámetro del folículo mayor en el momento de la IATF (clase 1:≤8.5 mm; clase 2: entre 8.5 y 10 mm y clase 3:>10 mm), se encontró que la tasa de concepción incrementó con cada clase de tamaño del folículo (25). Asimismo, en búfalas, en el análisis por categorías del diámetro del folículo preovulatorio, la tasa de concepción aumentó con cada categoría folicular (32). Las concentraciones plasmáticas de E 2 no influenciaron la tasa de preñez por IATF en el presente estudio. En vacas (14) y novillas de carne Bos taurus (19) se encontraron resultados similares. De forma opuesta, en vacas Holstein (30) y en búfalas (32), las concentraciones de E2 en plasma el día de la inseminación artificial influyeron positivamente sobre la preñez. Bridges et al (24) concluyeron que, la madurez folicular no se pronostica de forma precisa por una sola característica, sino que, muy probablemente, sea producto de los efectos acumulativos de muchos factores, como la duración del proestro y la producción de E2 durante el mismo; el diámetro y la edad del folículo y la producción de P4 por el cuerpo lúteo resultante. En el presente trabajo, es posible que, las altas concentraciones de E2 en plasma (23.99±0.96 pg/ml) no fueran representativas de la madurez del folículo, por lo cual no se encontró relación de esta variable con la tasa de preñez por IATF.

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En las vacas del presente experimento, la tasa de preñez por monta natural en el ciclo estral siguiente al protocolo de IATF (20 días) fue de 36.8%. Sá Filho et al (4) reportaron en vacas Nelore de primer parto, que el CIDR pero no la eCG, afectó la tasa de preñez al día 30 de la estación de reproducción (detección de estro dos veces al día después del retiro del CIDR, día 0 hasta el día 60). Esto se pudo deber a que la mayoría de los animales estaban en anestro, así que el tratamiento con CIDR combinado con destete temporal redujo el intervalo al estro y estimuló el inicio de ciclos estrales, mejorando el porcentaje de vacas exhibiendo estros durante la estación de reproducción. En vacas Bos indicus cruzadas en amamantamiento, la aplicación de eCG aumentó las concentraciones de P4 en plasma 12 días después de la terminación del tratamiento (2). Es posible que, algunos animales del presente estudio se encontraran en anestro y, por tanto, respondieron mejor en el ciclo estral siguiente, al reiniciar su ciclicidad ovárica por efecto del tratamiento con CIDR y eCG.

de animales homogéneos en cuanto a edad, número de partos, tiempo posparto, entre otras características, lo cual permitiría controlar de manera más confiable las variables que pueden afectar los resultados esperados.

En Colombia existen inconvenientes para ejecutar proyectos científicos a nivel de campo, debido a la difícil consecución de ganaderos dispuestos a prestar sus animales para investigación, lo cual implica para ellos movilización de los animales y estrés por manejo, con la consecuente disminución de la producción. Asimismo, para el investigador es complicado encontrar grupos

A la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas por la financiación del proyecto, a los propietarios y empleados de la Hacienda La Indiana por la colaboración en la realización del estudio, al Dr. Diego Villamizar Ramírez y a Miryam Vélez Marín por el apoyo en el trabajo de campo y al Dr. Henry Mesa Echeverri, por la asesoría en el diseño experimental y en el análisis estadístico.

Bajo las condiciones de la presente investigación, se puede concluir que, no hubo relación de la categoría de la CC, la categoría del diámetro del folículo mayor y las concentraciones de E2 con la manifestación de estro. El diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de E2 en el momento de la IATF, no mostraron correlación con la CC. No se encontró relación entre el diámetro del folículo mayor y las concentraciones plasmáticas de E2. Se determinó una tendencia de una relación positiva entre el diámetro del folículo mayor y la tasa de preñez por IATF. Sin embargo, no se observó asociación de la CC, las concentraciones de E2 y la manifestación de estro con la tasa de preñez por IATF. Agradecimientos

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3327-3335, 2013. ORIGINAL

Las proteínas del plasma seminal incrementan la viabilidad espermática post-descongelación del semen de toros Sanmartinero Seminal plasma proteins increase the post-thaw sperm viability of Sanmartinero bull’s semen Fabián Rueda A,1 Lic Quím, Tatiana Garcés P,2 Biól, Rocío Herrera L,1 Zootec, Luis Arbeláez R,2 Ph.D, Miguel Peña J,3 MVZ, Henry Velásquez P,3 M.Sc, Aureliano Hernández V,4 Ph.D, Jaime Cardozo C,1* Ph.D. Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria CORPOICA. Centro de Biotecnología y Bioindustria. Laboratorio de Microbiología Molecular. Cundinamarca, Colombia. 2Universidad de Pamplona. Laboratorio del Grupo de Investigación en Química. Ciudad universitaria. Pamplona, Norte de Santander, Colombia. 3CORPOICA. Centro de Reproducción Integral Animal (CRIA). Centro de Investigación La Libertad. Km 21 vía Pto. López, Villavicencio, Colombia. 4Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Bogotá, Colombia. *Correspondencia: jcardozo@corpoica.org.co. 1

Recibido: Mayo de 2011; Aceptado: Enero de 2012.

RESUMEN Objetivo. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la adición de proteínas del plasma seminal sobre el porcentaje de espermatozoides bovinos viables post-descongelación. Materiales y métodos. Los espermatozoides se congelaron usando dos medios (citrato-fructosa-yema y Bioxcell®) y la obtención de proteínas de plasma seminal de bajo peso molecular se realizó por medio de cromatografía líquida de baja presión. Las proteínas de interés eluyeron en las fracciones 21-25 y se sometieron a electroforésis en una y dos dimensiones. Los espermatozoides se incubaron a 37°C durante una hora, con 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg de la fracción 21-25. Se incluyeron dos tratamientos adicionales: uno con proteínas totales del plasma seminal y otro sin proteína. Resultados. La electroforésis bidimensional de las fracciones confirmó la presencia de siete puntos de proteína de bajo peso molecular (14-16 kDa y punto Isoeléctrico de 5.0 - 5.5). La adición de estas proteínas aumentó 20% (p<0.05), el porcentaje de espermatozoides viables post-descongelación en muestras congeladas en medio citrato-fructosayema (con dosis de 1 ó 1.5 mg de proteína/106 espermatozoides), y 25% (p<0.05) en muestras congeladas en medio Bioxcell® (con dosis de 0.5 mg de proteína/106 espermatozoides). Conclusiones. Los resultados de esta investigación sugieren el posible uso de proteínas de bajo peso molecular del plasma seminal, para disminuir el efecto deletéreo de la criopreservación en los espermatozoides. Palabras clave: Capacitación espermática, criopreservación, espermatozoide, plasma seminal, proteínas de choque térmico (Fuente: DeCS).

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ABSTRACT Objectives. This study was performed to evaluate the effect of the addition of proteins on the postthawing viability of spermatozoa. Materials and methods. Spermatozoa were frozen with two different media: Citrate-fructose and Bioxcell®. The isolation of seminal plasma proteins of low molecular weight was performed through low pressure liquid chromatography. It was determined that the proteins of interest eluted in fractions 21-25, and two dimensional electrophoresis was performed. Thawed sperm was incubated at 37°C for one hour with 0.5, 1, 1.5 and 2.0 mg of 21-25 fraction protein. Two additional treatments were included: one with seminal plasma total protein, and another one without protein. Results. Two dimensional electrophoresis of protein confirmed the presence of two bands of 14 and 16 kDa and seven spots with iso-electric points between 5.0 - 5.5 respectively. Incubation of the spermatozoa with the 21-25 fraction showed that sperm viability increases by 20% with doses of 1 and 1.5 mg of protein/106 spermatozoa in the citrate-fructose medium, and 25% with 0.5 mg of protein/106 spermatozoa in Bioxcell® medium. A positive effect in sperm viability was demonstrated although it depends on the doses of protein and the cryopreservation medium used. Conclusions. This investigation suggests that the use of seminal plasma proteins can be useful for reducing the harmful effect on sperm cryopreservation. Key words: Cryopreservation, heat shock proteins, seminal plasma, sperm capacitation, sperm (Source: DeCS).

INTRODUCCION El plasma seminal (PS) es una mezcla de secreciones de diferentes partes del aparato reproductor masculino. Componentes del PS como carbohidratos, lípidos, proteínas y minerales, influyen en la capacidad fecundante de los espermatozoides (spz). El estudio de las funciones de las proteínas del PS, ha permitido su uso en el proceso de criopreservación, con el fin de incrementar la viabilidad espermática post-descongelación (1,2). Durante la criopreservación, la distribución de fosfolípidos y proteínas en la membrana plasmática se altera y provoca una capacitación prematura del spz, disminuyendo su viabilidad. Los estudios revelan que los cambios de temperatura afectan la integridad de las células en niveles estructurales por la rotura mecánica de la membrana y por la redistribución de los fosfolípidos en la misma (3,4). Estos daños se han intentado disminuir mediante el uso de diferentes crio-protectores. El más empleado ha sido la yema de huevo por su contenido de lipoproteínas de baja densidad (LDL), la cual es la responsable del efecto crioprotector (5,6). Sin embargo, el uso de yema de huevo puede incrementar el riesgo de contaminación microbiana y reducir la capacidad fecundante de los spz. En vista de lo anterior, se ha propuesto el uso de diluyentes que no contengan yema de huevo, como el caso de aquellos a base de lecitina de soya. El uso de estos diluyentes ha evidenciado incrementos

importantes en la viabilidad post-descongelación en semen bovino (7,8). Se ha descrito un grupo de proteínas ácidas del PS de bajo peso molecular (13-16 kDa), las cuales se adsorben a la membrana plasmática del spz y desempeñan un papel crucial en la regulación de la capacitación (9,10). Estas proteínas, son secretadas por las vesículas seminales (11-13), y se han empleado para proteger al spz contra el estrés térmico y oxidativo (14,15). Igualmente, se ha demostrado que la incubación de spz in vitro con proteínas de PS, puede contrarrestar los daños ocasionados a las células espermáticas sometidas a choques térmicos (1,13). Pérez-pé et al en 2000 (14), y Colás et al en 2009 (15), demostraron que una fracción de proteínas de bajo peso molecular del PS ovino, podía restaurar la estructura de la membrana de forma cercana a las células intactas en spz sometidos a choque térmico por frío. Según lo anterior, es posible que el uso de aditivos basados en proteínas del PS, logre revertir parcialmente los daños causados por los procesos de criopreservación en spz de toros. El objetivo del presente estudio fue estimar el efecto de la incubación de spz de toros Sanmartinero, con proteínas de bajo peso molecular del PS, aisladas por cromatografía de exclusión, sobre el porcentaje de spz viables post-descongelación.

Rueda - Las proteinas del plasma seminal incrementan la viabilidad espermática

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio y unidades experimentales. Esta investigación se realizó con semen congelado de 10 toros de la raza criolla Sanmartinero, usando 3 pajillas de cada toro. Los animales, de entre 3 y 4 años de edad, permanecieron en el centro de investigación La Libertad de CORPOICA en condiciones adecuadas de salud, bajo pastoreo en praderas de Brachiaria decumbens. El semen se colectó por electroeyaculación y se determinaron los parámetros convencionales de calidad seminal: viabilidad (integridad de la membrana), motilidad y concentración espermática al momento de la eyaculación. Esta última se determinó con un Spermacue Minitube®. La viabilidad espermática se determinó mediante recuento de spz con tinción diferencial Carboxifluoresceína-ioduro de propidio (16), para lo cual la muestra de semen descongelado se diluyó en mHTF (1:35), posteriormente se le adicionó 5µl de diacetato de carboxifluoresceína (10 µM en agua destilada), 5µl de ioduro de propidio (7.3 µM en DMSO) y 5µl de formaldehído 1.7 mM, para inmovilizar las células con objeto de lograr una mejor observación. La muestra se incubó a 37°C durante 15 minutos, al cabo de los cuales se colocaron 8 µl de la muestra sobre una lámina portaobjeto. Se contaron 200 células por alícuota con un objetivo 40x en un microscopio con iluminación epifluorescente, la viabilidad se determinó como se mencionó anteriormente en la cual los spz con membrana íntegra toman un color verde y los que presentan daño, un color rojo. La motilidad individual se determinó por análisis visual de una alícuota de 8 μl bajo un microscopio óptico con objetivo de 40x, teniendo en cuenta sólo los spz con movimiento progresivo en varios campos ópticos. Criopreservación del semen. La criopreservación se realizó con dos diluyentes diferentes: Citrato-fructosa con yema de huevo (CFY) y un medio comercial para congelación (Bioxcell®, IMV Francia). El medio de criopreservación CFY se preparó usando citrato de sodio 29 g/L, fructosa 12.5 g/L, penicilina 100 UI/ml, 1 mg de estreptomicina y yema de huevo 20% (fracción A del diluyente), mientras la fracción B se preparó con 86% de la fracción A y 14% de glicerol. La disminución de la temperatura de la muestra seminal en el medio crioprotector se hizo de forma progresiva de 37 a 5°C a razón de 0.5°C por minuto aproximadamente. Alcanzada la temperatura de 5°C, se adicionó la fracción B (en la misma cantidad de la mezcla entre la fracción A y semen), y se mantuvo el semen

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a esta temperatura durante 4-6 horas. La congelación con el medio comercial Bioxcell® se realizó de la misma forma que con el medio citrato-fructosa, reemplazando las fracciones A y B por las 1 y 2 del Bioxcell®. El semen se llevó a una concentración de 70 x 106 spz por ml, se empacó en pajillas de 0.5 ml, las cuales se sellaron por ultrasonido y se llevaron a vapores de nitrógeno líquido durante 10 min hasta alcanzar -120°C. Posteriormente el semen se introdujo en nitrógeno líquido para alcanzar una temperatura de -196°C. Sólo se usaron las pajillas con motilidad individual progresiva postdescongelación ≥40 %, después de 48 horas. Colección de PS y cuantificación de proteínas. El PS se obtuvo por centrifugación del semen a 10.500 x g durante 5 min a 4ºC dos veces sucesivas. El sobrenadante obtenido se filtró mediante una membrana Millipore 6 V de 0.22 μm. Al filtrado se le adicionó fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) 5 µM (1.0 µl por cada ml de PS) disuelto en dimetilsulfoxido (DMSO), como agente inhibidor de serinoproteasas y se guardó a -20ºC hasta su uso. Posteriormente se realizó la cuantificación de proteínas de las muestras de PS mediante espectrofotometría A280. Se usó el coeficiente de absortividad molar (ε1%=6.67 M-1cm-1) de la albúmina sérica bovina BSA. Separación de fracciones proteícas por cromatografía de exclusión por tamaño. Las proteínas del PS fueron separadas por cromatografía de exclusión, en el Laboratorio del Grupo de Investigación en Química de la Facultad de Ciencias Básicas, de la Universidad de Pamplona. Para esta separación se utilizó el cromatógrafo BioLogic de Bio-rad y una columna de 1 x 120 cm, con 79 ml de Sephacryl S-200 HR (Amersham Biosciences) como fase estacionaria, que se lavó previamente con 100 ml de NaOH 0.1 M y 2 litros de agua destilada. La matriz se equilibró con tampón fosfato 0.05 M, pH 8.0 a una velocidad de 0.25 ml/min. Se aplicó 1 ml de PS (170 mg de proteína), posteriormente se eluyó con 200 ml de la misma solución tampón y a la misma velocidad que la de equilibrio, y se recogieron fracciones de 4 ml por tubo. En cada tubo se determinó la concentración de proteínas espectrofotométricamente a A280 nm, empleando el coeficiente de absorción molar de 0.667. Los picos obtenidos fueron colectados y concentrados a través de una celda de ultrafiltración Amicon (Millipore). Una vez concentrados, se filtraron de nuevo en microfiltros de 3 kDa para eliminar las sales y se sometieron a liofilización durante 24 horas, luego de las cuales se almacenaron a -20°C hasta su uso.

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Electroforesis unidimensional (SDS-PAGE). Las fracciones de proteínas obtenidas por cromatografía, se sometieron a electroforésis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), de acuerdo con el método de Laemmli (17). Los geles se elaboraron a una concentración de poliacrilamida del 15%; Se utilizaron 5 μg de proteína de las fracciones 21-25, y se diluyeron 1:1 (v/v) con la solución tampón de muestra (20% Glicerol, 2% SDS, 0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 10% β-mercaptoetanol, y 0.05% de azul de bromofenol). Las muestras se desnaturalizaron incubando 5 minutos a 100ºC y la electroforesis se realizó a 250 V, 0.04 Ω. . Las bandas se visualizaron por tinción con Azul brillante de Comassie. Electroforesis bidimensional (2D PAGE). Las fracciones (21-25) con proteínas del PS de bajo peso molecular, se sometieron a electroforésis bidimensional. La separación electroforética se llevó a cabo primero por puntos isoeléctricos, en una cámara de isoelectroenfoque IEF protean de Bio Rad, utilizando tiras de poliacrilamida en gradientes de pH inmovilizado (IPGs) de 8 cm de largo, y un rango de pH de 4 a 7. Las tiras se hidrataron de forma pasiva (toda la noche) para lo cual se adicionaron 100 µg de proteína total a una solución tampón compuesta por Urea 8M, CHAPS 4% p/v, Ditiotreitol (DTT) 50 mM y anfolitos 2% v/v, al que se adicionó 2 µl de tributilfosfina (TBP) y 0.75 µl de anfolitos en el momento de colocar la tira. Las tiras enfocadas se sometieron a equilibrio en dos pasos, cada uno de 15 min. En el primer paso se sumergieron en un tampón con urea 6 M, Tris 0.375 M, pH 8.8, SDS 2%, glicerol 20%, DTT 2% (w/v), y en el segundo paso se sumergieron en un tampón que difiere del primero en la sustitución de DTT por Iodoacetamida 2.5% (w/v). La segunda dimensión se realizó en minigeles de poliacrilamida en gradiente de concentración lineal de 10% a 20%. Las tiras se fijaron a los geles mediante agarosa al 1% y azul de bromofenol a 2%. La separación por peso molecular se realizó en una cámara de electroforesis Miniprotean cell de Bio Rad® a 85 voltios durante 180 min. La visualización de los puntos de proteína se efectuó de la misma manera que los geles en una dimensión. Documentación de los geles y análisis de imágenes. Todos los geles se digitalizaron en un documentador Gel Doc XR (Bio Rad®). El análisis de las imágenes de los geles en una dimensión se realizó con el programa Quantity One (Bio Rad®) y los geles en dos dimensiones con el programa PD Quest (Bio Rad®).

Adición de las proteínas separadas por cromatografía al semen descongelado. Para evaluar el efecto de la adición de proteínas de bajo peso molecular, en el porcentaje de spz viables post-descongelación, de cada pajilla se separaron alícuotas de un millón de spz y se asignaron a uno de los siguientes tratamientos: T1 (control negativo sin adición de proteínas), T2 (1.0 mg de proteínas totales del PS, control positivo) y las siguientes con distintas cantidades del concentrado de proteínas obtenido de las fracciones 21-25 resuspendidas en Human Tubular Fluid médium (mHTF): T3 (0.5 mg), T4 (1.0 mg), T5 (1.5 mg), T6 (2.0 mg). Todas las muestras se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Finalizada la incubación, se determinó la viabilidad espermática mediante el método del ioduro de propidio-diacetato de carboxifluoresceína (16). El incremento porcentual en la viabilidad espermática por efecto de la incubación con proteínas, se determinó con respecto al control negativo. El efecto de la adición de proteínas del PS en la reversión del daño de la membrana espermática, se estimó por la fórmula desarrollada por Barrios et al (1): % reversión = (Vp60 − Vc60) x 100 Donde:

(Vw − Vc60)

Vw = viabilidad de la muestra fresca antes de la congelación Vc60 = viabilidad de la muestra control al cabo de una hora Vp60 = viabilidad de la muestra con proteínas al cabo de una hora Este porcentaje representa la relación entre las células con viabilidad recuperada y las teóricamente recuperables. Análisis estadístico. Se empleó un diseño completamente al azar con arreglo factorial (4x2) para el análisis de los datos, de acuerdo con el siguiente modelo: Yij= µ + αi + βj+ (αi βj)+Eij Donde: Yij= Porcentaje de recuperación de la viabilidad en las pajillas descongeladas µ= Media total αi:= Efecto de la dosis de fracción 21-25 obtenida por exclusión βj = Efecto del medio de criopreservación (αi βj) = Efecto de la interacción Eij= Error experimental

Rueda - Las proteinas del plasma seminal incrementan la viabilidad espermática Adicionalmente se realizó un análisis de varianza para determinar el efecto de los tratamientos y una prueba de comparación LS MEANS para evaluar las diferencias en el porcentaje de reversión del daño ocasionado por la criopreservación en la membrana espermática.

RESULTADOS Separación parcial de las proteínas del plasma seminal por cromatografía de exclusión y electroforesis Uni-Bidimensional. En el cromatograma de exclusión (Figura 1), se visualizan 2 picos, el primero constituido por el contenido de los tubos 10 al 20 (que se denominarán fracciones) y el segundo de los tubos 21 al 25. Se valoraron midiendo la concentración de proteínas a una longitud de onda de 280 nm, utilizando un coeficiente de absorción de 6.67 M-1/cm-1.

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El contenido proteico de cada uno de los tubos que se encuentran en estos picos se analizó electroforéticamente por medio de SDS-PAGE al 15% (Figura 2), para identificar las bandas de proteínas contenidas en cada fracción. Desde la fracción F10 hasta la F25, se identificaron proteínas de pesos moleculares, entre 12 y 72 kDa. El concentrado de las fracciones 2125 fue identificado como la fracción donde se encuentran las proteínas de bajo peso molecular (entre 14 y 16 kDa) (Figura 2). Este concentrado de proteínas se sometió a electroforésis bidimensional en rango de pH de 4 a 7. Se evidenció la presencia de 2 puntos en la banda de 14 y 5 puntos en la de 16 kDa (Figura 3) lo que podría indicar que ambas bandas comprenden proteínas con diferencias post-traduccionales, como ya se ha descrito en ovino (13,18)

Figura 1. Fraccionamiento de proteínas del plasma seminal mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se señala el pico que comprende las fracciones 21 a 25

Figura 2. SDS-PAGE de las proteínas obtenidas en las fracciones separadas mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Carril 1: Marcador de peso molecular (MP), Carril 2: Plasma seminal completo (PSC), Carril 3: Fracción 11, Carril 4: Fracción 13, Carriles 5 a 7: fracciones 15, 17 y 19, Carril 8: fracción 21 y Carriles 9 y 10: fracciones 23 y 25. Los últimos tres carriles constituyen las proteínas de 14 a 16 kDa, de interés en este trabajo.

Figura 3. Electroforésis bidimensional de proteínas del PS de Sanmartinero con rango de separación de pH 4 a 7. A. Gel bidimensional de plasma seminal completo. B. Gel bidimensional de la fracción 21-25, se señalan los 7 puntos presentes en las bandas de 14 y 16 kDa

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Efecto de la incubación de los espermatozoides con la fracción 21 a 25 obtenida por cromatografía de exclusión. La adición de la fracción 21-25, evidenció efectos que difieren de acuerdo con la dosis y al medio de criopreservación empleados. El porcentaje de spz viables postincubación, en el tratamiento control sin proteínas adicionadas fue de 39.8±8.2%, a partir del cual se calculó el incremento en viabilidad en los demás tratamientos. El mayor porcentaje de incremento en la viabilidad post-incubación fue 22.0±6.5% (p<0.05) y se consiguió con dosis de 1.0 y 1.5 mg mg/106 spz, de la fracción proteica en estudio, cuando los espermatozoides se criopreservaron con medio CFY (Figura 4).

se utilizaron dosis superiores a 0.5 mg/106 spz (entre 1.0 y 2.0 mg/106 spz) se evidenció una disminución significativa (p<0.05) de la viabilidad espermática postincubación (Figura 4). La viabilidad espermática de las muestras frescas, medida a través de la tinción carboxifluoresceinaioduro de propidio, fue en promedio de 70.7±6.1%, superior a la viabilidad postdescongelación promedio de todas las pajillas la cual fue de 28.0±5.2% (Tabla 1). Tabla 1. Porcentaje de viabilidad espermática en semen fresco y post-descongelación con medio Bioxcell®, e incubado con 1 mg de proteínas totales (PT) y diferentes dosis de la fracción 21-25 Viabilidad (%) Semen (mHTF sin 1 mg 0.5 1 1.5 2 fresco proteínas) PT del mg/106 mg/106 mg/106 mg/106 PS spz spz spz spz 70.70

27.91b

19.94e

32.32a

25.73bc

23.51cd

22.20de

±6.13

±5.16

±5.66

±6.55

±6.32

±6.38

±6.69

*Medias con diferente letra son estadísticamente diferentes (p<0.05)

Cuando los valores de incremento porcentual de la viabilidad espermática, se incluyeron en la fórmula propuesta por Barrios et al (1) para estimar el % de recuperación de la viabilidad de los espermatozoides, se evidenció que el único tratamiento que tuvo un claro efecto de reversión del daño por criopreservación es aquel que empleó una dosis de 0.5 mg/106 spz (15.23%, p<0.05), en espermatozoides congelados con el medio comercial Bioxcell® (Figura 5).

Figura 4. Incremento porcentual de la viabilidad postdescongelación de 106 espermatozoides criopreservados con: A) yema de huevo (CFY) y B) Bioxcell® comercial. El incremento se calculó teniendo como base la viabilidad del control (mHTF sin proteínas). Los espermatozoides se descongelaron e incubaron durante 1 hora a 37 C° con 1 mg de proteínas totales del plasma seminal (PPS) y diferentes concentraciones de proteínas contenidas en la fracción 21-25.

Por otra parte, el incremento en el porcentaje de spz viables post incubación fue mayor (25.2±5.3% p<0.05) a una dosis de 0.5 mg/106 spz., cuando los spz se criopreservaron en el medio comercial Bioxcell®. Sin embargo, cuando

Figura 5. Porcentaje de recuperación de la viabilidad de la membrana espermática en espermatozoides, congelados con Bioxcell®, descongelados e incubados con la fracción F21-25. El porcentaje de recuperación se evaluó mediante la fórmula [(Vp60-Vc60)/(Vw-Vc60)] x 100.

Rueda - Las proteinas del plasma seminal incrementan la viabilidad espermática

DISCUSIÓN El análisis electroforético unidimensional evidenció dos bandas de 14 y 16 kDa, que se encuentran en las fracciones 21 a 25. La cantidad relativa de cada banda (entre 26 y 22%) y su aparición en todas las fracciones, demostrada en la electroforesis unidimensional, indicó que estas proteínas son las más abundantes dentro del PS. En este sentido se ha evidenciado que las proteínas BSP, son las más abundantes en el PS bovino (2,19,22,23). La concentración de estas proteínas en el PS está entre 20 y 40 mg/ml, lo que corresponde a una concentración de entre el 30 y el 60% de las proteínas totales del PS. La banda de 14 kDa coincide con el peso molecular de las proteínas PDC 109 y aunque dicha banda puede contener más proteínas de peso molecular igual o cercano, es muy posible que el concentrado de fracciones 21 a 25 obtenido en la presente investigación, contenga cierta cantidad de estas proteínas. El análisis electroforético bidimensional evidenció la presencia de varios puntos, dentro de los cuales podrían estar las proteínas PDC-109; sin embargo es necesario llevar a cabo más estudios encaminados a la identificación de estos puntos. Por otro lado, Barrios et al (1) lograron separar fracciones similares a partir de PS ovino. En las fracciones que separaron se encontraron dos bandas de proteína de 14 y 20 kDa en lo que denominaron fracción 6. Estas dos bandas representaron cerca del 70% de las proteínas totales del PS ovino. La fracción 6 se seleccionó para ser usada en pruebas de reversión de daño en membrana de spz sometidos a choque térmico por bajas temperaturas. La adición de la fracción cromatográfica 21-25 evidenció que existe un aumento en la viabilidad post incubación de alrededor del 20% cuando se usa entre 1 y 1.5 mg de la fracción proteica por cada millón de spz descongelados. Esta dosis es adecuada cuando se usa un crioprotector con yema de huevo. Además, se observó un aumento similar con una dosis menor de proteína de las fracciones 21-25 (0.5 mg/millón de spz) cuando se usa medio comercial Bioxcell® en la congelación. Esto último sugiere la posibilidad de que el medio comercial contenga algún componente que pueda tener interacción con las proteínas contenidas en las fracciones 21-25. Por otro lado, el tratamiento con el conjunto de proteínas del PS, evidenció un efecto contrario, disminuyendo la viabilidad del semen luego de ser incubado con ellas. Asimismo se ha demostrado que el PS completo en exceso tiene un efecto

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nocivo para la viabilidad espermática (22). Por su parte, Barrios et al (1), describió, en ovinos, que la adición del conjunto de proteínas de PS, aunque no disminuye la viabilidad después de someter los spz a choque térmico por frío, tiene un efecto de recuperación de la viabilidad menor que el ejercido por la adición de la fracción 6 (con proteínas de 14 y 20 kDa), y que la adición de fracciones de PS, que contienen proteínas con pesos moleculares superiores a 60 kDa, no tiene mayor efecto en la recuperación de la viabilidad del semen ovino. Los resultados de la presente investigación sugieren la posibilidad de que sean las proteínas de bajo peso molecular presentes en la fracción 21-25 del PS, las que intervienen en la recuperación de la membrana del spz bovino sometido a criopreservación. Cuando en el análisis de los datos se tiene en cuenta el descenso de la viabilidad desde el momento de la recogida de la muestra, se logra apreciar una recuperación de la viabilidad espermática post incubación de alrededor de 15%, con una dosis de 0.5 mg de la fracción 21-25 por millón de spz, previamente congelados en medio Bioxcell®. Dosis más altas parecen no tener mayor efecto, e incluso algunas son nocivas para la viabilidad post incubación. El trabajo reportado por Barrios et al (1) para semen ovino, indica que la dosis mínima para obtener un efecto de reversión significativo (p<0.05), corresponde a 0.5 mg/106 spz de la denominada “Fracción 6”. Sin embargo, observaron un efecto reparador dosis dependiente hasta 2.5 mg/106 spz. Es posible que el efecto negativo evidenciado en la presente investigación sea debido a una interferencia del medio comercial empleado para la congelación del semen. Se ha descrito que el proceso de congelación - descongelación tiene un efecto negativo en la integridad y la funcionalidad de la membrana espermática. Esta membrana es fundamental para el metabolismo espermático y para que el spz lleve a cabo varios procesos involucrados en la fecundación (24). Se ha demostrado que el PS puede suprimir y revertir la capacitación(decapacitar spz previamente capacitados) (12). Por tanto, los presentes resultados podrían deberse al efecto de adsorción a la membrana espermática que presentan proteínas específicas del PS. Proteínas como las BSP (posiblemente contenidas en la fracción 21-25), poseen la capacidad de adsorción a la membrana plasmática por su interacción con los fosfolípidos de la misma (9,19,22,23), lo que permite explicar en parte,

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el efecto de recuperación de la viabilidad espermática evidenciada por la fracción. El efecto decapacitante de éstas proteínas se encuentra asociado a su cantidad. Es posible que dosis más altas de la fracción, capaciten a los spz en lugar de inhibir su capacitación, lo que podría explicar el efecto negativo observado cuando se adicionaron dosis de la fracción, superiores a 0.5 mg/106 spz. De esta manera, aunque existe recuperación de la viabilidad espermática, al adicionar proteínas semi-purificadas contenidas en la fracción 21-25, el efecto de recuperación post incubación, depende también de la cantidad adicionada y del medio de congelación empleado. El medio Bioxcell® es un crioprotector comercial fabricado a base de lecitina (fosfatidilcolina) de soya. La fosfatidilcolina se compone de ácidos grasos poliinsaturados de 18 carbonos y colina; este compuesto está presente en las bicapas lipídicas de las membranas celulares. Se ha determinado que las proteínas BSP A1/ A2 interactúan con la colina de los fosfolípidos presentes en la membrana espermática durante la eyaculación (9). Dado que las proteínas BSP estimulan la salida de fosfolípidos, es posible que la fracción 21-25, añadida a spz descongelados (criopreservados con Bioxcell®), presente una fuerte interacción con el medio de criopreservación, razón por la cual la adición de la fracción en cantidades superiores a 0.5 mg/106 spz, posiblemente desencadene procesos de capacitación espermática, disminuyendo el porcentaje de spz viables. Sin embargo, cuando se empleó el medio citrato-fructosa-yema de huevo, la cantidad de la fracción que incrementó los porcentajes de viabilidad espermática fue mayor que cuando se empleó Bioxcell© en la congelación. A diferencia del Bioxcell © , la yema de huevo contiene lipoproteínas de baja densidad (LDL) además, de fosfatidilcolina. En este sentido, Manjunath et al (24) demostraron que el efecto protector de la yema de huevo se debe a la interacción

entre las proteínas BSP y las LDL de la yema. El hecho de que la cantidad de proteínas que resultó eficaz cuando los spz se congelaron con el medio que contenía yema de huevo sea mayor podría deberse a la interacción de las LDL presentes en la yema de huevo con las proteínas adicionadas en la fracción. Estos resultados abren camino a nuevas investigaciones que permitan ratificar el efecto de las proteínas del plasma seminal sobre espermatozoides descongelados. Los datos obtenidos permiten concluir que la adición de las fracciones 21-25, de PS que contienen proteínas de bajo peso molecular, revierte en parte el efecto deletéreo ocasionado en la membrana espermática, por la criopreservación. La incubación de spz, con las fracciones proteicas 21-25 incrementó la viabilidad espermática post descongelación de eyaculados criopreservados en diferentes medios. Este incremento en el porcentaje de spz viables post incubación, varió dependiendo de la cantidad de proteína de la fracción 21-25 utilizada en la incubación. Se evidenció una disminución en la viabilidad post incubación, cuando los spz congelados en medio comercial, se incubaron con dosis mayores a 0.5 mg/106 spz de la fracción proteica 21-25. Los resultados de este trabajo, sugieren la realización de nuevas investigaciones, que involucren el uso de proteínas extraídas y purificadas del PS en los protocolos de criopreservación, con el fin de aumentar las tasas de fertilidad del semen críopreservado. Agradecimientos Este trabajo hizo parte del proyecto “Desarrollo de alternativas para mejorar la viabilidad del semen en los procesos de criopreservación de toros Sanmartinero y Cebú” financiado por el Ministerio de Agricultura, IICA y FEDEGAN. Fue posible gracias a Eliana Neira, Gustavo Quijano, Samuel Correa, Guillermo Onofre y Yolmar Zorro.

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3336-3345, 2013. ORIGINAL

Evaluación de implantes de norgestomet reutilizados en protocolos de sincronización del estro en vacas Brahman Evaluation of reused norgestomet implants in estrus synchronization protocols in Brahman cows Luis Uribe-Velásquez,1* Ph.D, Adriana Correa-Orozco,2 MVZ, Lina Cuartas-Betancurth,1 MVZ, Diego Villamizar-Ramirez,1 MVZ, Santiago Ángel-Botero,3 M.Sc. Universidad de Caldas, Departamento de Salud Animal, Grupo de Investigación CIENVET. Manizales, Colombia. 2Universidad de Caldas, Maestría en Ciencias Veterinarias. Manizales, Colombia. 3 Corporación Universitaria del Huila, Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Neiva, Colombia. *Correspondencia: lfuribe@ucaldas.edu.co. 1

Recibido: Febrero de 2011; Aceptado: Diciembre de 2011.

RESUMEN Objetivo. Evaluar las concentraciones de progesterona, la manifestación de estro y las tasas de preñez en vacas Bos indicus sometidas a varios protocolos de sincronización del estro con un implante de norgestomet usado previamente. Materiales y métodos. Sesenta vacas recibieron un implante auricular de norgestomet reutilizado y fueron distribuidas en uno de cuatro protocolos: (1) benzoato de estradiol (BE) + progesterona (P4) + prostaglandina F2α (PG) (BE+P4+PG); (2) valerato de estradiol (VE) + norgestomet (NG) (VE+NG); (3) el mismo protocolo BE+P4+PG, asociado con 400 UI de gonadotropina coriónica equina (eCG) (BE+P4+PG+eCG); (4) el mismo protocolo VE+NG, asociado con 400 UI de eCG (VE+NG+eCG). El implante fue removido el día 9, con inseminación artificial (IA) 12 horas después de la detección del estro. La preñez fue diagnosticada 45 días después de la IA. Las muestras de sangre fueron tomadas los días 0, 4 y 9 (después de colocar el implante) para el análisis de progesterona por RIA. Resultados. En el día 4, las concentraciones de progesterona fueron menores en vacas tratadas con BE+P4+PG (0.90 ± 0.73 ng/ml; p<0.01). Las vacas que recibieron VE+NG+eCG tuvieron mayor concentración de progesterona en plasma (p<0.05) en el día 9 (4.72 ± 0.79 ng/mL) que otros protocolos. Hubo mayor porcentaje de detección de estro (p<0.05) en vacas tratadas con VE+NG+eCG (66.7%). Las tasas de preñez no fueron afectadas por los protocolos (p>0.05). Conclusiones. Los implantes de norgestomet reutilizados fueron eficaces para sincronizar el estro y alcanzar tasas de preñez adecuadas en vacas Brahman. Palabras clave: eCG, estradiol, ganado de carne, progesterona, prostaglandinas (Fuente: Agrovoc).

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Uribe-Velásquez - Evaluación de implantes de norgestomet

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ABSTRACT Objective. To evaluate progesterone concentrations, occurrence of estrus and pregnancy rates in Bos indicus cows submitted to several estrous synchronization protocols with previously used Norgestomet implants. Materials and methods. Sixty cows were given a reused Norgestomet ear implant on Day 0 and were assigned to receive one of four protocols: (PROT 1) estradiol benzoate (EB) + progesterone (P4) + prostaglandin F2α (PG) (EB+P4+PG); (PROT 2) estradiol valerate (EV) + norgestomet (NG) (EV+NG); (PROT 3) same as EB+P4+PG protocol, plus a 400 UI equine chorionic gonadotropin (eCG) (EB+P4+PG+eCG); (PROT 4) same as EV+NG protocol, plus a 400 UI eCG (EV+NG+eCG). The implant was removed on Day 9, with artificial insemination (AI) 12 h after detection of estrus. Pregnancy was diagnosed 45 d after AI. Blood samples were collected on Day 0, 4 and 9 (after ear implant was placed), for progesterone analysis by RIA. Results. On day 4, progesterone concentrations were lower in cows treated with EB+P4+PG (0.90 ± 0.73 ng/ml; p<0.01). Cows receiving EV+NG+eCG had greater plasma progesterone concentration (p<0.05) on Day 9 (4.72 ± 0.79 ng/ml) than other treatments. There were greater (p<0.05) percentages of estrous detection in cows treated with EV+NG+eCG (66.7%). Pregnancy rates were not affected by the treatment protocols (p>0.05). Conclusions. Reusing Norgestomet implants was effective for synchronizing estrus and promote satisfactory pregnancy rates in Brahman cows. Key words: eCG, beef cattle, estradiol, progesterone, prostaglandins (Source: Agrovoc)

INTRODUCCIÓN La mayor parte del ganado bovino está localizado en áreas tropicales, donde las razas Bos indicus predominan debido a su tolerancia a la temperatura, a la humedad alta, y la resistencia a infecciones parasitarias (1). En regiones tropicales, los períodos de anestro posparto prolongados (más de 150 días) son característicos de ganado Bos indicus y cruces B. taurus/B. indicus; originando pérdidas económicas debido al fracaso en alcanzar el intervalo deseable de 12 meses entre partos (2). Por lo tanto, el desafío más importante en los hatos de las vacas de carne en amamantamiento, principalmente en ganado Bos indicus, es lograr la fecundación durante el anestro posparto.Por esta razón, los tratamientos que inducen los ciclos de fertilidad y permiten la inseminación artificial a tiempo fijo (IATF), tienen un impacto positivo en hatos de carne (3). La IATF viene siendo ampliamente utilizada en ganado Bos taurus y Bos indicus, y provee un enfoque organizado para aumentar el uso de inseminación artificial (IA) y mejorar la eficiencia reproductiva en hatos de carne (4). El desarrollo de protocolos que reduzcan los problemas asociados a la sincronización de la ovulación y la IA, proporcionan a los productores de ganado, herramientas para mejorar la genética. Sin embargo, las variables como la alimentación, la composición racial, la condición corporal, el intervalo posparto, el clima y la localización geográfica, pueden afectar el éxito de los protocolos IATF (5). Otras consideraciones a tener en cuenta con los protocolos son los costos, el tiempo previsto para realizar la aplicación de hormonas y la inseminación artificial, así como también la mano de obra requerida (6).

Dentro de los programas de IATF basados en progesterona y estrógenos, se encuentran métodos que aumentan la manifestación de estro y el diámetro del folículo dominante, los cuales son importantes para mejorar la fertilidad de vacas Bos indicus en amamantamiento (4). Se ha reportado que cuando hay altas concentraciones circulantes de progesterona, al retirar el dispositivo intravaginal (CIDR), se reduce el diámetro del folículo al momento de la IATF, la detección del estro y la tasa de sincronización, así como las tasas de concepción y de preñez en novillas pospubertales y en vacas no lactantes Nelore (Bos indicus) (7). Después de sincronizar el reclutamiento de una nueva onda folicular, el segundo paso de un protocolo de sincronización de la ovulación es disminuir las concentraciones de progesterona para el inicio del proestro y el desarrollo del folículo ovulatorio (3). Se ha descrito que la reutilización de los CIDR ayuda a reducir las concentraciones circulantes de progesterona al momento de retirarlo (3, 7, 8). Además de las ventajas fisiológicas mencionadas, la posibilidad de la reutilización constituye una alternativa interesante en la reducción de costos de los protocolos que utilizan implantes de norgestomet (9, 10) o dispositivos intravaginales de progesterona, y en consecuencia, los hace más accesibles para los productores. Así como se ha investigado la reutilización de dispositivos intravaginales de progesterona en protocolos de sincronización del estro y de la ovulación (3,7,8,11,12), también se ha estudiado la reutilización de implantes de norgestomet. Algunos trabajos de investigación demostraron que no hay diferencias significativas en las tasas

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de preñez entre protocolos de IATF que incluyeron implantes de norgestomet nuevos o reutilizados (9,10). Con el fin de obtener mayor información acerca del desempeño de los implantes de norgestomet reutilizados, como una alternativa para disminuir el costo de los protocolos de sincronización del estro y para utilizarlo en novillas o en especies (Bos indicus) sensibles a las altas concentraciones de P4 exógena, se desarrolló la presente investigación. El objetivo fue evaluar las concentraciones de progesterona, la manifestación de estro y la tasa de preñez en vacas Brahman, sometidas a cuatro protocolos de sincronización del estro con implantes de norgestomet reutilizados.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización y animales. El trabajo se realizó en la Hacienda Abastecedora Brahman Internacional, ubicada en Planeta Rica, Departamento de Córdoba, Colombia (8°24’0.49”N/75°34’54.83”O), con una altitud de 80 msnm, temperatura promedio de 30ºC y una precipitación de 2000 mm/año. Se seleccionaron 60 vacas Brahman (Bos indicus) puras multíparas (entre 2 y 4 partos) con

amamantamiento restringido y una condición corporal entre 5 y 6 en una escala de 1 a 9 (13). Las vacas fueron mantenidas en una pradera mixta de Urochloa humidicola, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa mutica y Urochloa plantaginea con acceso al agua ad libitum y sal mineralizada (8% de fósforo). Además, se suministró un bloque alimenticio de 15 Kg por cada 15 animales (175 a 300 g/animal/ día), el cual contenía 3.8% de proteína; 1.7% de grasa; 6.5% de fibra; 43.2% de cenizas; 4.5% de fósforo; 7.4% de calcio; 13.7% de cloruro de sodio; 0.9% de magnesio y 15.0% de humedad. Tratamiento hormonal. Los implantes de norgestomet (Crestar ® , Intervet Colombia LTDA), un progestágeno, habían sido usados una vez durante 9 días. Posteriormente, fueron lavados con agua destilada, empacados en papel de aluminio y refrigerados a 4ºC durante dos semanas. Todas las vacas (n=60) recibieron un implante de norgestomet reutilizado, en la oreja vía subcutánea, en el día 0 del protocolo y luego fueron distribuidas en uno de los siguientes tratamientos (Figura 1): 1) vacas que recibieron una inyección intramuscular (im) de 2.0 mg de benzoato de estradiol (BE; 2.0 mL de Benzoato de estradiol Syntex, Syntex, Argentina) y otra de 25.0 mg de progesterona (P4; 1.0 mL de Gestavec, Vecol, Colombia) en el día 0 y la aplicación im de 150 µg de cloprostenol (PG;

Figura 1. Representación esquemática de los protocolos de sincronización del estro en vacas Brahman, con implantes de norgestomet reutilizados.

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Uribe-Velásquez - Evaluación de implantes de norgestomet Ciclase DL, Syntex, Argentina) el día del retiro del implante (día 9) (BE+P4+PG; n=15);2) vacas que recibieron una inyección im de 5.0 mg de valerato de estradiol y 3.0 mg de norgestomet (VE+NG; 2 mL Crestar ®, Intervet Colombia LTDA) en el día 0 (VE+NG; n=15);3) vacas que recibieron el mismo tratamiento 1, asociado con la aplicación im de 400 UI de gonadotropina coriónica equina (eCG; 2.0 mL de Folligon, Intervet Colombia LTDA) el día del retiro del implante (día 9) (BE+P4+PG+eCG; n=15);4) vacas que recibieron el mismo tratamiento 2, asociado con la aplicación im de 400 UI de eCG el día del retiro del implante (día 9) (VE+NG+eCG; n=15). Después de retirar el implante, se realizó destete temporal por 72 horas. La detección de la conducta de estro se realizó de forma visual, teniendo en cuenta signos como el edema vulvar, el flujo cristalino, el reflejo de quietud, la monta activa y la conducta homosexual. La observación empezó 24 horas después de finalizados los protocolos, en la mañana y en la tarde durante una hora cada uno. La IA se realizó 12 horas después de la detección del estro. Adicionalmente, en el ciclo estral siguiente se realizó observación del estro en todas las vacas del estudio y aquellas que manifestaron estro, fueron inseminadas artificialmente. El diagnóstico de preñez fue realizado por palpación transrectal 45 días después de la IA. Para cada protocolo se analizó la tasa de inseminación, la cual fue calculada al dividir el número vacas inseminadas por el número de vacas tratadas. También se estimaron dos tasas de preñez: la primera fue calculada al dividir el número de vacas preñadas entre el número de vacas inseminadas y la segunda, dividiendo el número de vacas preñadas por el número de vacas tratadas. Muestras de sangre. Las muestras de sangre fueron colectadas de la vena coccígea en tubo vacutainer® de 10 mL con heparina los días 0, 4 y 9 del protocolo de sincronización, para establecer la concentración de progesterona por radioinmunoanálisis (RIA). Las muestras fueron centrifugadas a 1000 x g por 10 min y el plasma conservado a -20ºC. Posteriormente, las concentraciones plasmáticas de progesterona fueron determinadas mediante kits comerciales (Coat-a-count progesterone; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, EUA) en el Laboratorio de Radioinmunoanálisis de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. La sensibilidad del ensayo fue de 0.02 ng/ml. Todas las muestras fueron procesadas en un solo ensayo.

Análisis estadístico. Las variables dependientes estro a las 48 y 56 horas, tasa de inseminación, proporci ón de vacas preñadas/hembras inseminadas y proporción de vacas preñadas/ hembras tratadas, la proporción de vacas preñadas/hembras tratadas, se codificaron en una escala binaria de 0 (ausencia) y 1 (presencia), para obtener estimaciones de variabilidad del error estándar. Por tanto, para las variables categóricas y para la concentración plasmática de progesterona, se evalúo el efecto del protocolo, del día, y su interacción lineal, usando el análisis de varianza del programa SAS (14). Las comparaciones múltiples se ajustaron mediante el método de Tukey-Kramer. Con este mismo tipo de análisis, se evalúo el efecto del tipo de estradiol (valerato vs. benzoato) y de progesterona (progesterona vs. norgestomet) utilizados y de la aplicación de prostaglandina y eCG sobre todas las variables dependientes. Los resultados se presentan como medias de mínimos cuadrados ± el error estándar.

RESULTADOS Concentraciones plasmáticas de progesterona. Hubo diferencia significativa en las concentraciones de P4 entre los protocolos (p<0.0001), entre los días (p<0.05) (Tabla 1) y en la interacción protocolo y días (p<0.01). En el día 0 del programa de sincronización, los niveles plasmáticos de P4 en el protocolo BE+P4+PG+eCG fueron más altos en comparación con los otros protocolos (p<0.01). En el día 4 después de colocar el implante de norgestomet, las concentraciones de P4 fueron menores (p<0.01) en las vacas del protocolo BE+P4+PG. Al momento de retirar el dispositivo (día 9), hubo diferencias significativas en los niveles de P4 del tratamiento VE+NG+eCG en comparación con BE+P4+PG y Tabla 1. Concentración plasmática de progesterona (ng/mL) en los días 0, 4 y 9 después de colocar el implante reutilizado de norgestomet en vacas Brahman sometidas a sincronización del estro. Protocolo

Concentraciones de progesterona ± error estándar (ng/mL) Día 0

Día 4

Día 9

BE+P4+PG

2.96 ±0.73 a, xz

0.90 ± 0.73 a, yz

1.74 ± 0.79 a, xyz

VE+NG

2.58 ±0.73 a, xyz

3.51 ± 0.76 b, xy

1.08 ± 0.73 a, xz

BE+P4+PG+eCG

6.21 ±0.76 b, xy

6.24 ± 0.79 c, xy

3.08 ± 0.76 a, z

VE+NG+eCG

2.97 ±0.73 a, xz

5.83 ± 0.73 c, yz

4.72 ± 0.79 b, xyz

BE: Benzoato de estradiol; P4: Progesterona; PG: Prostaglandina; VE: Valerato de estradiol; NG: Norgestomet; eCG: Gonadotropina coriónica equina. a,b,c Medias con letras diferentes en la misma columna son estadísticamente diferentes (p<0.05; Tukey-Kramer). x,y,z, Medias con letras diferentes en la misma fila son estadísticamente diferentes (p<0.05; Tukey-Kramer). x(día 0), y(día 4) y z(día 9).

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VE+NG (p<0.05). No se encontró ningún efecto del tipo de estradiol (BE o VE) o progesterona (P4 o NG) utilizado sobre las concentraciones de P4. Manifestación del estro. En las primeras 24 horas después de finalizar los protocolos, ninguna vaca mostró signos de estro. La manifestación de estro a las 48 horas fue similar entre protocolos (p>0.05). El protocolo afectó la presentación de estro a las 56 horas (p<0.0001), en el cual el protocolo BE+P4+PG+eCG presentó un mayor número de vacas en estro (Tabla 2). La aplicación de eCG en las hembras de los protocolos BE+P 4 +PG+eCG y VE+NG+eCG (n=30), incrementó la manifestación de estro a las 56 horas (p<0.0001), con una proporción de 9/30 (30.0%) con eCG y de 1/30 (3.3%) sin eCG. La presentación de estro a las 48 horas fue menor (p<0.05) en las hembras de los protocolos 1 y 3 (n=30), las cuales fueron tratadas con BE+P4+PG (7/30; 23.3%) en comparación con las hembras de los protocolos 2 y 4 (n=30), sincronizadas con VE+NG (12/30; 40.0%). Tabla 2. Manifestación de estro y tasa de inseminación en vacas Brahman sometidas a sincronización del estro con implante reutilizado de norgestomet. Estro 48 h Proporción (%)

Estro 56 h Proporción (%)

Tasa de inseminación1, Proporción (%)

BE+P4+PG

4/15 (26.7) a

0/15 (0.0) a

4/15 (26.7) a

VE+NG

5/15 (33.3) a

1/15 (6.7) ac

6/15 (40.0) ab

BE+P4+PG+eCG

3/15 (20.0) a

6/15 (40.0) b

9/15 (60.0) bc

VE+NG+eCG

7/15 (46.7) a

3/15 (20.0) c

10/15 (66.7) c

Protocolo

BE: Benzoato de estradiol; P4: Progesterona; PG: Prostaglandina; VE: Valerato de estradiol; NG: Norgestomet; eCG: Gonadotropina coriónica equina. Medias con letras diferentes en la misma columna son estadísticamente diferentes (p<0.05; Tukey-Kramer) 1 Proporción de vacas inseminadas comparadas con todas las vacas tratadas

Tasa de inseminación. El protocolo VE+NG+eCG presentó la mayor tasa de inseminación (p<0.05) (Tabla 2). La aplicación de eCG aumentó el número total de vacas que entraron en estro y fueron inseminadas (p<0.001), con una proporción de 19/30 (63.3%), comparado con 10/30 (33.3%) de los protocolos sin eCG. Sin embargo, el tipo de estradiol (BE o VE), progesterona (P 4 o NG) y la aplicación de PG no afectaron esta proporción (p>0.05). E n e l c i c l o e s t ra l s i g u i e n t e , l a t a s a d e inseminación no fue influenciada por el

protocolo (Tabla 4) ni por el efecto individual de cada hormona empleada (p>0.05). Tasas de preñez. Entre los protocolos evaluados, no fueron observadas diferencias significativas (p>0.05) en la proporción de vacas preñadas/vacas inseminadas y en la proporción de vacas preñadas/vacas tratadas (Tabla 3). El tipo de estradiol (BE o VE), progesterona (NG o P4), la aplicación de PG y el tratamiento con eCG tampoco afectaron las tasas de preñez (p>0.05). Tabla 3. Tasas preñez en vacas Brahman sometidas a sincronización del estro con implante reutilizado de norgestomet. Vacas preñadas vs vacas inseminadas1 Proporción (%)

Vacas preñadas vs vacas tratadas2 Proporción (%)

BE+P4+PG

2/4 (50.0) a

2/15 (13.3) a

VE+NG

4/6 (66.7) a

4/15 (26.7) a

BE+P4+PG+eCG

7/9 (77.8) a

7/15 (46.7) a

6/10 (60.0) a

6/15 (40.0) a

Protocolo

VE+NG+eCG

BE: Benzoato de estradiol; P4: Progesterona; PG: Prostaglandina; VE: Valerato de estradiol; NG: Norgestomet; eCG: Gonadotropina coriónica equina. Proporciones con letras diferentes en la misma columna son estadísticamente diferentes (p<0.05; Tukey-Kramer) 1 Proporción de vacas preñadas comparadas con las vacas inseminadas 2 Proporción de vacas preñadas comparadas con todas las vacas tratadas

La proporción de vacas preñadas/vacas inseminadas en el siguiente ciclo estral no fue influenciada por el protocolo (p>0.05) (Tabla 4). Sin embargo, la aplicación de eCG si afectó esta proporción (8/9; 88.9% con eCG vs 5/8; 62.5% sin eCG; p<0.05). Tabla 4. Tasa de inseminación y tasa de preñez en vacas Brahman en el ciclo estral siguiente a la sincronización del estro con implante reutilizado de norgestomet. Tasa de inseminación1 Proporción (%)

Vacas preñadas vs vacas inseminadas2 Proporción (%)

BE+P4+PG

4/15 (26.7) a

2/4 (50.0) a

VE+NG

4/15 (26.7) a

3/4 (75.0) a

BE+P4+PG+eCG

3/15 (20.0) a

3/3 (100.0) a

VE+NG+eCG

6/15 (40.0) a

5/6 (83.3) a

Protocolo

Vacas que repitieron inseminación

BE: Benzoato de estradiol; P4: Progesterona; PG: Prostaglandina; VE: Valerato de estradiol; NG: Norgestomet; eCG: Gonadotropina coriónica equina. Proporciones con letras diferentes en la misma columna son estadísticamente diferentes (p<0.05; Tukey-Kramer) 1 Proporción de vacas detectadas en estro e inseminadas comparadas con todas las vacas tratadas 2 Proporción de vacas preñadas comparadas con las vacas inseminadas

Uribe-Velásquez - Evaluación de implantes de norgestomet

DISCUSIÓN Concentraciones plasmáticas de progesterona. Las concentraciones de P 4 fueron diferentes entre protocolos, entre días y en la interacción protocolo y días. Las diferencias de esta variable en el día 0, se explican porque posiblemente las hembras al inicio del experimento no estaban en la misma fase del ciclo estral. La presencia o ausencia de un cuerpo lúteo funcional al momento de insertar un CIDR, determina el nivel de aumento inicial de la concentración plasmática de progesterona (12). En novillas Nelore tratadas con un CIDR usado previamente por 18 días, las concentraciones de progesterona al momento del retiro del implante (día 9) fueron de 2.53 ± 0.09 ng/ml (7).

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LH y finalmente la ovulación. Estas condiciones aumentan la posibilidad de manifestación de estro. Probablemente, en el presente estudio, las vacas tratadas con eCG presentaron un mayor tamaño del folículo ovulatorio y una tasa de ovulación más alta debido al estimulo de esta gonadotropina, lo cual les permitió presentar una mejor conducta de estro en comparación con las vacas sin eCG. Contrario a lo encontrado en el presente estudio, en novillas Nelore sincronizadas con CIDR nuevo o de tercer uso, BE, PG, cipionato de estradiol (CE) y con o sin eCG, no se encontró un efecto de la eCG sobre el porcentaje de hembras detectadas en estro en las 48 horas siguientes al retiro del dispositivo (7).

A pesar de las altas concentraciones de progesterona al momento de retirar los implantes, las cuales tienen efectos negativos sobre el diámetro del folículo dominante, la detección de estro, las tasas de concepción y preñez (7), algunas hembras del presente estudio respondieron al protocolo de sincronización y quedaron preñadas. En un experimento previo (7), se concluyó que el tratamiento con eCG al momento de retirar el CIDR, minimizó cualquier efecto negativo de concentraciones de P4 altas en ese día sobre el tamaño del folículo en el momento de la IATF y sobre la tasa de concepción, mediante un aumento en el diámetro del folículo y un incremento en las concentraciones séricas de P4 siete días después de la IATF. Ésta podría ser parte de la explicación acerca de las adecuadas tasas de preñez obtenidas en los protocolos 3 y 4 (Tabla 3), los cuales presentaron las concentraciones de P4 más altas al momento de retirar el implante de norgestomet (Tabla 1).

En este experimento, los protocolos que incluyeron VE+NG, presentaron mayor número de hembras que manifestaron estro a las 48 horas en comparación con los protocolos con BE+P4+PG. El tratamiento con el implante de NG de 6 mg y la inyección de NG+VE indujo una alta receptividad sexual en vacas Nelore (10/11), pero sólo el 66% de ellas ovularon (17). Se ha reportado que el uso de VE+NG puede generar manifestación del estro independiente de la actividad ovárica, posiblemente por la sensibilización de la hembra al estrógeno extraovárico y a la presencia de metabolitos derivados del tratamiento; además se menciona inducción de estro en ausencia de ovulación (9). Según Galina y Orihuela (18), las vacas pueden manifestar comportamiento de monta sin un aparente soporte folicular, incluso con un implante de progesterona. Esto puede depender del efecto sobre la emergencia de una nueva onda folicular que tienen los ésteres del estradiol (9).

Se han encontrado diferencias entre animales, en las concentraciones séricas de progesterona inducidas por CIDRs nuevos o reutilizados, lo cual aparentemente está asociado a una capacidad diferente para metabolizar la P4 (12, 15).

Otros autores (19), encontraron que un mayor número de vacas Brahman mostraron actividad de monta cuando el VE fue usado con NG (4/6 NG+VE vs. 1/6 NG, respectivamente). Sin embargo, la tasa de ovulación correspondió al 16% (1/6) para ambos tratamientos. Los investigadores mencionan que parece ser que el estrógeno aplicado es necesario para preparar la sincronización del estro y aumentar el número de vacas con manifestación del estro, pero el NG puede ser necesario para que el estro sea acompañado de ovulación. Lo anterior podría explicar parcialmente, la mayor tasa de preñez encontrada cuando se insemina en el estro natural del ciclo siguiente al tratamiento de sincronización (20). La aplicación de estrógenos es una parte necesaria del tratamiento con Norgestomet, para alcanzar el mayor número de animales expresando comportamiento estral, pero puede no ser necesaria para alcanzar las

Manifestación del estro. En el presente estudio la eCG aumentó el número total de vacas en estro a las 56 horas. En vacas Nelore, también se encontró que la eCG aumentó el porcentaje de vacas detectadas en estro después de sincronizar con CIDR+PG (16). Otros investigadores en Brasil, encontraron que vacas Nelore sometidas a sincronización con el implante de NG de silicona, la inyección de NG+VE y de eCG, presentaron un mayor diámetro del folículo dominante y una tasa de ovulación más alta (1). Un folículo de mayor tamaño puede producir mayor cantidad de estradiol, por lo cual es factible que se genere el pico preovulatorio de

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tasas de concepción máximas si ésta no mejora las tasas de ovulación (19). Por otro lado, en un programa de transferencia de embriones con vacas Brangus en México, la cantidad de usos del CIDR (nuevo, usado una o dos veces) no afectó el porcentaje de estro por día (24 a 80 horas post-retiro del CIDR) (12). Tasa de inseminación. El mayor número de vacas inseminadas se presentó en el protocolo VE+NG+eCG. De forma similar, vacas Hereford – Angus tratadas con VE+NG+eCG presentaron alta tasa de estro (67.86%; 21/28), en un periodo de observación de 96 horas siguientes al retiro del implante (20). En el presente estudio, hubo un mayor porcentaje de animales manifestando estro y mayor tasa de inseminación en las vacas tratadas con eCG. También las vacas Nelore de primer parto, en amamantamiento y sincronizadas con CIDR+PG o CIDR+PG+eCG, mostraron altos porcentajes de inseminación y preñez en los primeros 4 días (96 horas) de la estación reproductiva en Brasil, cuando fueron tratadas con eCG (16). En vacas Brahman en Australia, sincronizadas con dos aplicaciones de PG o con NG+NV y monitoreadas cada 6 horas para la detección del estro, se encontró que la aplicación de eCG disminuyó la variación en el intervalo de tiempo entre el final del tratamiento y el estro (NG+VE+eCG: 30.8 a 57.0 horas) en comparación con vacas sin eCG (PG: 41.2 a 155.6 horas; NG+NV: 37.3 a 86.3 horas y NG+PG: 32.0 a 121.0 horas) (21). Contradictoriamente, en vacas de carne tratadas con el implante de NG de silicona y la inyección de NG+VE, no fue observado efecto de la eCG sobre la manifestación de estro (22). Igualmente, en novillas Nelore sometidas a sincronización del estro con CIDR de primer, segundo o tercer uso y BE+PG+eCG, con detección del estro desde el día del retiro del CIDR (día 9) hasta el día 15 del protocolo e IA 12 horas después, no se encontró efecto del CIDR, PG o eCG sobre la tasa de estro (8). El intervalo de tiempo entre el retiro del implante de NG y la presentación de estro, puede variar entre diferentes estudios, debido a factores como el número de animales estudiados, la edad, el genotipo, las condiciones de cada sistema productivo, la frecuencia de la detección del estro, la duración del tratamiento con progestágeno y a la fase del ciclo estral en el momento de iniciar el tratamiento (21). La eCG tiene la capacidad de unirse a receptores de LH y FSH y posee una vida media para la fase de eliminación de 121 horas en la vaca (23). El

tratamiento con eCG puede causar un mayor crecimiento folicular y proporciona un ambiente endocrino más adecuado durante el proestro (altas concentraciones de E2 en sangre) y el diestro (altas concentraciones de P4 en sangre), los cuales son favorables para la fertilidad (16). En este estudio, en los protocolos en los cuales se aplicó eCG (3 y 4), el incremento en la tasa de inseminación se pudo deber, probablemente, a que esta gonadotropina puede estimular el desarrollo del folículo dominante, al aumentar su tasa de crecimiento (1) y su tamaño (1, 7); además, este estimulo puede darse por un amplio periodo de tiempo debido a su vida media larga. En consecuencia, se pudo presentar un aumento en las concentraciones de E2 que permitieron una mayor manifestación de estro hasta las 56 horas después de la aplicación de esta gonadotropina. En el ciclo estral siguiente de las vacas del presente experimento, no hubo efecto del protocolo o de las hormonas aplicadas sobre la tasa de vacas inseminadas. Vacas Nelore primíparas en amamantamiento sincronizadas con CIDR+PG o CIDR+PG+eCG, no mostraron efecto de la eCG sobre el porcentaje de vacas inseminadas en los primeros 30 días de la estación reproductiva en Brasil (16). Tasa de preñez. En este estudio, los protocolos usados y las hormonas aplicadas (BE, VE, P4, NG, PG o eCG) no afectaron las tasas de preñez. Del mismo modo, en vacas Hereford – Angus (20) y en novillas Nelore (24), tratadas con VE+NG y con dispositivo de progesterona+PG, respectivamente, tampoco fueron encontrados efectos de la eCG en las tasas de concepción y de preñez. Adicionalmente, en vacas Nelore sincronizadas para IATF con dispositivo intravaginal de progesterona+BE+PG+BE+eCG, los investigadores encontraron que la tasa de preñez (vacas preñadas/vacas tratadas) no fue afectada por el tratamiento con eCG (25). En vacas Nelore sometidas a un protocolo de sincronización de la ovulación con CIDR+BE+PG+CE, los tratamientos con 200 o 400 UI de eCG tampoco mejoraron las tasas de preñez (vacas preñadas/vacas tratadas) en vacas destetadas temporalmente (26). Según los autores, ello indica que el destete temporal probablemente estimuló adecuadamente la secreción de LH de tal manera que, un soporte gonadotrópico adicional pudo no haber sido requerido para el desarrollo folicular final, lo cual podría explicar parcialmente la ausencia de un efecto significativo de la eCG sobre la preñez de las vacas del presente estudio, las cuales fueron sometidas a destete temporal por 72 horas.

Uribe-Velásquez - Evaluación de implantes de norgestomet En novillas Nelore sometidas a sincronización del estro con CIDR de primer, segundo o tercer uso y BE+PG+eCG, con detección del estro desde el día del retiro del CIDR (día 9) hasta el día 15 del protocolo e IA 12 horas después, no se encontró efecto del CIDR, PG o eCG sobre las tasas de concepción y de preñez (8). No obstante, otros estudios describen efectos positivos de la eCG sobre la preñez. El tratamiento con eCG mejoró la tasa de preñez en novillas Nelore (7, 27), en vacas Nelore no lactantes (7), en vacas Nelore en amamantamiento (1) y en vacas Nelore y Brangus (28). Sá Filho et al (1), indican que los efectos de la eCG sobre la tasa de preñez después de la IATF en ganado, han sido inconsistentes. Los autores concluyen que los incrementos en la fertilidad inducidos por eCG fueron debidos principalmente a aumentos en las tasas de preñez en vacas posparto no cíclicas o bajo estrés nutricional (baja condición corporal). En esas circunstancias, el tratamiento con eCG al momento de retirar la progesterona puede proveer soporte gonadotrópico adicional, incrementando el crecimiento del folículo preovulatorio. En un estudio previo con implantes de norgestomet reutilizados (9), se concluyó que los implantes nuevos o reutilizados, asociados a P4+BE o a NG+VE en un protocolo de IATF, presentaron tasas de preñez similares en vacas Nelore (48.3% vs. 48.7%, respectivamente). Otros investigadores (10), tampoco determinaron diferencia significativa en la tasa de preñez en vacas Nelore y mestizas con cría que recibieron un implante nuevo (44.0%), un implante reutilizado (35.7%) o dos implantes reutilizados (32.0%), asociado a P 4+BE+PG+BE en un protocolo de IATF. Aunque en el presente experimento no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las tasas de preñez (vacas preñadas/vacas tratadas) de los cuatro protocolos empleados, cabe anotar que, si se observó una diferencia numérica notable entre los protocolos 1

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y 3, con valores de 13.3% (2/15) y 46.7% (7/15), respectivamente (Tabla 3). Estos resultados pueden ser importantes en términos económicos para las empresas ganaderas, porque obtener 7 preñeces de 15 vacas Brahman sincronizadas con BE+P4+PG+eCG, bajo estas condiciones experimentales, es un logro destacable no solo por la dificultad para obtener resultados satisfactorios en programas de sincronización del estro con este tipo de ganado (Bos indicus), sino también por la relación costo beneficio para el sistema de producción. En este experimento, la proporción de vacas preñadas/vacas inseminadas en el siguiente ciclo estral, no fue influenciada por el protocolo pero si por la aplicación de eCG. Se ha descrito que, vacas Nelore primíparas en amamantamiento sincronizadas con CIDR+PG o CIDR+PG+eCG, no presentaron efecto de la eCG sobre la tasa de concepción (vacas preñadas/vacas inseminadas) entre el día 5 y 30 después de finalizado el protocolo (16). En un estudio con vacas Bos indicus cruzadas en amamantamiento, se demostró que la aplicación de eCG aumentó las concentraciones plasmáticas de progesterona 12 días después de la terminación del tratamiento (29). La progesterona producida durante la fase luteal corta, puede ser necesaria para el establecimiento de la función luteal normal en el siguiente ciclo estral (2). Por tanto, el efecto de la eCG sobre la preñez del siguiente ciclo estral en el presente estudio, pudo estar asociado con la recuperación de la ciclicidad de animales en anestro, al estimular la producción de progesterona y de esta forma producir una fase luteal de duración normal en el ciclo estral siguiente a la aplicación del protocolo de sincronización. En conclusión, la aplicación de VE+NG aumentó la manifestación de estro a las 48 horas y el tratamiento con eCG incrementó la manifestación de estro y la tasa de inseminación. Sin embargo, las tasas de preñez no fueron afectadas por la eCG, y tampoco por los protocolos utilizados. Por el contrario, se observó un efecto positivo de la aplicación de eCG sobre la preñez de vacas inseminadas en el siguiente ciclo estral.

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3346-3354, 2013. ORIGINAL

Estructura y diversidad genética en vacas Holstein de Antioquia usando un polimorfismo del gen bGH Structure and genetic diversity of a population Holstein cows of Antioquia department, using a polymorphism of bGH gene Juan Rincon F,1* M.Sc, Albeiro Lopez H,1,2 Ph.D, Julian Echeverri Z,1,3 Ph.D. Grupo BIOGEM. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Calle 59 A Nº 63-20, Medellín, Colombia. 2Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Medellín, Colombia. 3Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Medellín, Colombia. *Correspondencia: jcrincon@unal.edu.co. 1

Recibido: Mayo de 2011; Aceptado: Junio de 2012.

RESUMEN Objetivo. Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas del polimorfismo del intrón 3 del gen bGH y estimar algunos parámetros de estructura poblacional en ganado Holstein. Materiales y métodos. El estudio se realizó con 1366 vacas Holstein en 120 hatos de 11 municipios del departamento de Antioquia. Se extrajo DNA por el método de Salting out y la genotipificación se realizó usando la técnica de PCR-RFLPs. La diversidad genética se determinó mediante la comparación de las heterocigosidades, El equilibrio de Hardy-Weinberg (HW) y la diferenciación genética entre las poblaciones se realizó usando el software Arlequín 2.0 Las frecuencias alélicas y genotípicas se evaluaron mediante el paquete estadístico SAS®. Resultados. Las frecuencias genotípicas encontradas fueron 0.764 (+/+), 0.223 (+/-) y 0.013 (-/-) y las frecuencias alélicas 0.876 (+) y 0.124 (-). No se encontraron desviaciones del Equilibrio de Hardy Weinberg en ninguna de las subpoblaciones. La diversidad genética determinada mediante la comparación de las heterocigosidades fue relativamente baja entre poblaciones pero al interior de estas no. El valor de FST de toda la población fue de 0.0068 y significativo (p<0.05), algunos FST pareados también lo fueron, tomando valores desde 0.0 a 0.13. Los estadísticos FIT y FIS no fueron significativos. Conclusiones. El gen bGH es un candidato interesante para evaluar características de importancia económica ya que no parece haber sido sometido a selección directa, presenta una variabilidad media en las poblaciones, observándose diferenciación genética significativa entre distintos municipios, producto de los diferentes sistemas de producción y acceso a las biotecnologías. Palabras clave: Ganado lechero, genética de poblaciones, marcadores moleculares, polimorfismo (Fuente:AGROVOC).

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Rincon - Estructura y diversidad genética en vacas Holstein

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ABSTRACT Objective. To determine the allele frequencies and genotypic polymorphism of the intron 3 of gene bGH and estimate structural parameters in Holstein cattle populations. Materials and methods. The study was conducted with 1366 Holstein cows belonging to 120 herds in 11 municipalities of the department of Antioquia. DNA was extracted by the Salting out method and genotyping was carried out using PCR-RFLP. Genetic diversity was determined by comparing the heterozygosities, Hardy-Weinberg (HW) and genetic differentiation between populations was performed using the Arlequin software 3.0. The allelic and genotyping frequencies were assessed using the SAS statistical software. Results. The genotype frequencies found were 0.764 and 0.013 (+/-) 0.223 (+/+), (-/-) and allele frequencies were 0.876 (+) and 0124 (-). There was no unbalance for Hardy Weinberg in the subpopulations. The genetic diversity determined by comparison of the heterozygosity was low among populations but within them it was not. The FST value of the entire population was 0.0068 and significant (p<0.05), FST also matched some were values ranging from 0.0 to 0.13. The statistical FIT and FIS were not significant. Conclusions. The gene bGH is an interesting candidate to economically evaluate important traits because it does not seem to have been subject to direct selection, has a mean variability in populations, showing significant genetic differentiation between several municipalities, resulting from the different production systems and access to biotechnologies. Key words: Dairy cattle, molecular markers, polymorphism, population genetics (Source: AGROVOC).

INTRODUCCIÓN El ganado Holstein en Antioquia ha sufrido cambios genéticos diversos en diferentes poblaciones, debido principalmente a la selección indirecta y a las diferencias en el tipo de producción y uso de tecnologías reproductivas como la inseminación artificial, por tanto es necesario determinar el efecto generado por dichos factores sobre la estructura genética poblacional. En la actualidad se conocen un amplio número de marcadores genéticos que pueden ser usados para evaluar la diferenciación poblacional (1). Entre estos marcadores se encuentran algunos relacionados con parámetros productivos en ganado de leche (2), como es el caso del polimorfismo en un solo nucleótido o SNP que son marcadores polimórficos que pueden ser reconocidos mediante varias técnicas (3), entre las cuales se encuentra la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) asociada a RFLP (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción) (4). Uno de estos marcadores es un SNP del gen de la Hormona del crecimiento Bovina (bGH) que permite la amplificación de un segmento que contiene un sitio polimórfico que puede ser reconocido por la endonucleasa MspI, generando 3 genotipos diferentes (+/+,+/- y -/-) (4).

bGH (7,8). Actualmente se conocen múltiples polimorfismos al interior del gen o en regiones reguladoras (9). Una de estas variantes reportadas corresponde a un sitio que puede ser reconocido por la endonucleasa de restricción MspI (10), el cual fue localizado como un polimorfismo en el intrón 3 en la posición 1547, que se debe a la transición de Timina, T a Citosina, C (11).

El gen de bGH contiene 1800 pb, con 5 exones y 4 intrones (5), localizados en el cromosoma 19 que produce una proteína compuesta de 190 a 191 aminoácidos con un peso molecular aproximado de 22 KDa (6) que contienen Ala o Phe en el extremo N-terminal debido a un procesamiento alternativo de los precursores de

Los parámetros de estructura poblacional describen el grado de reducción de heterocigosidad en una población, con base en el equilibrio de Hardy-Weinberg, lo cual faculta la comparación entre grupos a diferentes escalas jerárquicas y determinar el grado de diferenciación entre ellos (12), de tal forma

Algunos parámetros poblacionales estimados usando el gen de bGH, permiten calcular las frecuencias genotípicas, alélicas y el flujo de genes entre las poblaciones para determinar su grado de diversidad y diferenciación (1). La determinación del equilibrio de Hardy-Weinberg (HW), la estimación de las frecuencias alélicas y genotípicas, posibilitan no solo determinar el comportamiento poblacional, sino que de acuerdo a las frecuencias de los alelos en la población permiten determinar la importancia de dicho polimorfismo en un programa de mejoramiento genético, ya que aquellos alelos que se encuentran casi fijados en una población tendrían diferente respuesta a la selección que aquellos alelos que se encuentran en proporciones intermedias.

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que posibilitan valorar el modo de acción y la intensidad con que se debe actuar para aumentar la presencia de un alelo especifico dentro de un programa de selección asistida por marcadores moleculares. El objetivo de la presente investigación fue determinar los parámetros de estructura poblacional, las frecuencias alélicas y genotípicas del gen de bGH en vacas Holstein del departamento de Antioquia, como aporte para la implementación de programas de selección asistida por marcadores moleculares (MAS).

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. La presente investigación se llevó a cabo en el trópico alto de la región norte y oriente del departamento de Antioquia, e incluyó 1366 vacas de la raza Holstein, localizadas en 120 hatos de lechería especializada, pertenecientes a 11 municipios (subpoblaciones) del departamento. Los municipios evaluados fueron San Pedro de los Milagros (Altura: 2.475 m.s.n.m; Tº: 14ºC), Belmira (Altura: 2.550 m.s.n.m; Tº: 14ºC), Entrerrios (Altura: 2.300 m.s.n.m; Tº: 16ºC), La Unión (Altura: 2.500 m.s.n.m; Tº: 13ºC), Envigado (2000-2300 m.s.n.m; Tº: 16ºC), Bello (Zonas entre los 2000 a 2400 m.s.n.m; Tº: 16ºC), Medellín (Zonas entre los 2000 a 2500 m.s.n.m; Tº:15ºC), Santa Rosa de Osos (2581 m.s.n.m; Tº: 14ºC), Don Matías (2200 m.s.n.m; Tº: 16ºC), Marinilla (2150 m.s.n.m; Tº: 17ºC) y Rionegro (2150 m.s.n.m; Tº: 17ºC) (Tabla 1). Tabla 1. Número de vacas por Municipio. Número de hatos

Número de animales

Medellín

Belmira

Bello

121

Don Matías

Entrerrios

317

Envigado

La Unión

126

Marinilla

Rionegro

121

419

Municipio

San Pedro de los Milagros Santa Rosa de Osos Total

1366

Extracción del DNA. Para la toma de las muestras de sangre se utilizó BD vacutainer de 5ml con EDTA como anticoagulante, con agujas número 18 (BD VacutainerTM). Los tubos fueron homogenizados por inversión, rotulados para su identificación y refrigerados con hielo durante su transporte hasta el laboratorio de Biología

Celular y Molecular de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, para realizar la extracción del DNA. A partir de estas muestras se realizó el protocolo de extracción de DNA basado en el método de “salting out” modificado (13) y el DNA se almacenó en Buffer TE 1X (tris-EDTA) a 4ºC hasta el momento del análisis. La cantidad y calidad del ADN extraído se evaluó en gel de agarosa al 0.8% teñido con bromuro de etidio, y se semicuantificó con el transiluminador (Biometra®). La pureza del DNA genómico se determinó mediante un análisis de absorbancia en dos longitudes de onda. Sólo el ADN genómico con una pureza entre 1.8-2.0 se consideró para los estudios a realizar. Amplificación de la región polimórfica del gen bGH. Con base en las secuencias del gen bGH y a los reportes de Dybus (14), se sintetizaron 2 oligonucleotidos de 22 pares de bases que permitieron amplificar el fragmento de 329 pb que presenta el sitio de restricción para la endonucleasa MspI. Los cebadores sintetizados fueron: F 5`- CCCACGGGCAAGAATGAGGC-3` R 5`- TGAGGAACTGCAGGGGCCCA-3` Se realizó una amplificación por PCR individual para cada región específica en un volumen final de 25 μL, que contenía 30-60 ng de DNA genómico, 2.5 μL de buffer PCR 10X (1.0 -1.5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, 10 mM de TrisHCl, pH de 8.3), 2 mM de MgCl2, 0.2 μM de cebadores; 0.4 mM de cada dNTP y 0.5-1 unidad de taq polimerasa (Bioline®). Las condiciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Fueron: 1. Desnaturalización a 95ºC por 6 min, 2. Desnaturalización a 95ºC por min, 3. Temperatura de alineamiento (anneling) de 60ºC por 30 seg, 4. Extensión a 72ºC por 40 seg, 5. Se repitió desde el paso 2 durante 39 ciclos para finalizar con una extensión por 5 min a 72ºC. La PCR se llevó a cabo en un termociclador (Biometra®). Los productos de PCR fueron resueltos mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% (Amresco®), teñido con bromuro de etidio (Promega®). En cada pozo se sirvieron 5 μl del producto de PCR diluidos en 2 μl de buffer carga 1X (fermentas®) y se utilizaron 2 μl de marcador de peso molecular (low range Fermentas ®). Los geles fueron visualizados mediante un fotodocumentador (BiometraTM®) de geles

Rincon - Estructura y diversidad genética en vacas Holstein para tomar evidencia fotográfica. En todos los casos en la PCR se utilizó un control negativo sin DNA y un control positivo que poseía un DNA previamente amplificado con éxito. Digestión con enzimas de restricción (PCRRFLP). Una vez se comprobó la amplificación del fragmento de 329 pb, los productos de PCR fueron almacenados y posteriormente sometidos a digestión con la endonucleasa de restricción MspI, la cual cortó el fragmento en presencia de un sitio especifico, generando un patrón de bandas que permiten clasificar los alelos como (+) cuando presentaron corte y como (-) cuando no presentaron corte (14), de tal forma que los individuos de las poblaciones tuvieron genotipos (+/+), (+/-) y (-/-) de acuerdo al patrón de bandas generado. El alelo (–) no presentó sitio de corte, por tanto su fragmento fue de 329 pb, el alelo (+) generó 2 fragmentos de 224 y 105 pb (Figura 1). Para la digestión se utilizaron 2 μl de buffer Tango 10X para obtener una concentración final de 1X y un volumen de reacción de 20 μl, se adicionó 5 unidades de enzima, se completó con agua ultrapura hasta 15 μl y se utilizaron 5 μl del producto de PCR obtenido. Una vez realizada la mezcla esta se sometió a digestión durante 3 horas a 37ºC. La enzima en esta reacción se utilizó en exceso para evitar la formación de falsos heterocigotos, debido a digestiones parciales del producto de PCR. En todas las digestiones se incluyó un control positivo que presentaba el sitio de restricción en ambos alelos, y de esta manera se procuraba evitar la generación de falsos positivos o negativos. Los productos de la digestión fueron resueltos por electrofóresis en gel de agarosa al 2.5% (Amresco®) en buffer TBE 1X (EDTA 0.05M, Tris base 0.089 M y Acido bórico 0.089 M), teñido con Bromuro de Etidio (Promega®). En cada pozo se sirvieron 15 μl del producto de la digestión diluidos en 5 μl Buffer de carga 1X (Fermentas®) y se utilizaron 2 μL de un marcador de peso molecular de muy bajo rango (Low Range Fermentas®). Los geles fueron visualizados bajo luz ultravioleta en un equipo de fotodocumentación de geles (BiometraTM®) con el cual se obtuvo una fotografía digital. Frecuencias alélicas y genotípicas. La frecuencia de los diferentes alelos se realizó determinando la proporción de cada forma del gen entre el número de copias totales de la población en estudio. Se identificaron los homocigotos (dos copias del mismo alelo) y los

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heterocigotos (una copia de cada alelo) y se calculó la frecuencia F de cada alelo contando los homocigotos y añadiendo la mitad de los heterocigotos, con el método descrito por Hartl, (15). La frecuencia genotipica se calculó como la sumatoria de cada genotipo sobre el total de la poblacion (15). Ambas frecuencias se determinaron usando el programa SAS® (16). Diversidad genética. La diversidad genética de la población fue determinada mediante la comparación de la Heterocigosidad observada (Ho) y la Heterocigosidad esperada (He). Este análisis se llevó a cabo usando el software Arlequín v 3.0 (17), Que utiliza el método de la cadena de Markov (18). Estructura genética. El equilibrio de Hardy-Weinberg se calculó con base en las frecuencias alélicas y genotípicas esperadas y observadas mediante el uso del software Arlequín v 3.0 (17). Los parámetros de estructura poblacional, se calcularon utilizando el método Propuesto por Wright que parte el coeficiente de endogamia de una población subdividida (FIT), entre el componente debido a apareamientos no aleatorios dentro de una población (FIS) y las subdivisiones entre poblaciones FST (19) teniendo en cuenta dos niveles jerárquicos que incluyen a Antioquia como la población total y los municipios actuando como subpoblaciones. Teniendo en cuenta lo anterior se determinó el parámetro FIT= HT-Hi/HT, que corresponde a la endogamia total, el parámetro FIS= HS-HI/HS que mide la subdivisión intrapoblacional y el FST=FIT-FIS/1-FIS que mide la subdivisión poblacional (19); donde HT se refiere a la heterocigosidad esperada en la población total, HI es la heterocigosidad promedio observada en un grupo de poblaciones y HS es la heterocigosidad promedio esperada de cada población. Los cálculos fueron realizados con el uso del software Arlequín v 3.0 (17), utilizando para ello el análisis de varianza molecular (AMOVA) que permite analizar la variación entre y dentro de poblaciones, con su significancia estadística, bajo la hipótesis nula “los alelos o genotipos tienen la misma distribución en todas las poblaciones”, pero sin requerir equilibrio de Hardy Weinberg. El flujo génico expresado como el numero de migrantes (Nm) por generación, se calculó con base a la siguiente expresión derivada de los estadísticos de Wright (19).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

RESULTADOS Determinación de las frecuencias alélicas y genotípicas. Los fragmentos del gen bGH de 329 pb fueron amplificados exitosamente en 1366 muestras. La digestión del fragmento de DNA amplificado fue digerido correctamente con la enzima de restricción MspI. Las muestras fueron catalogadas como (+/+, +/- y -/-) de acuerdo a los tamaños de los fragmentos generados (figura. 1).

Diversidad genética. La Heterocigosidad observada y esperada tuvo una variación de 0.063 a 0.310 y de 0.061 a 0.348, respectivamente, lo que sugiere que hay una variación genética considerable entre las poblaciones, pero, al interior de las mismas no se percibe evidencia de que estas hayan estado sometidas a alguna fuerza genética como selección, mutación, u otra (Tabla 3). Tabla 3. Frecuencias alélicas y genotípicas para el gen bGH en algunos Municipios del Departamento de Antioquia. N

Valor P

Medellín

Municipio

0.211

0.189

0.593

Belmira

0.194

0.199

1.000

121

0.306

0.260

0.297

0.083

0.081

1.000

Entrerrios

317

0.167

0.174

0.507

Envigado

0.063

0.061

1.000

La Unión

126

0.198

0.204

0.665

Marinilla

0.310

0.348

0.595

Rionegro

121

0.281

0.253

0.470

San Pedro de los Milagros

419

0.251

0.247

1.000

0.214

0.191

1.000

1366

0.223

0.218

0.713

Bello Don Matías

Figura 1. Fragmento amplificado y digestión con enzima de restricción MspI, de una región del gen de la hormona de crecimiento bovino bGH. Carril X, marcador de peso molecular; carril 1 control negativo; carril 2, 3 y 4 tres muestras de DNA amplificadas para el gen bGH; carril 5, patrón de restricción para genotipo homocigoto (+/+); carril 6, patrón de restricción para genotipo heterocigoto (+/-) y carril 7, patrón de restricción para genotipo homocigoto (-/-).

Las frecuencias de los alelos + y – en la población total fueron 0.876 y 0.124 respectivamente. La frecuencia de los genotipos +/+, +/- y -/fueron 0.764, 0.223 y 0.013 respectivamente. Las frecuencias alélicas y genotípicas por municipios y la total se presentan en la tabla 2.

Tabla 2. Frecuencias alélicas y genotípicas para el gen bGH en algunos Municipios del Departamento de Antioquia. Población

Frecuencias genotípicas Observadas

Frecuencias alélicas

+/+

+/-

-/-

Medellín

0.789

0.211

0.000

0.895

0.106

Belmira

0.792

0.194

0.014

0.889

0.111

Bello

0.694

0.306

0.000

0.847

0.153

Don Matías

0.917

0.083

0.000

0.959

0.041

Entrerrios

0.820

0.167

0.013

0.903

0.097

Envigado

0.937

0.063

0.000

0.969

0.031

La Unión

0.786

0.198

0.016

0.885

0.115

Marinilla

0.621

0.310

0.069

0.776

0.224

Rionegro

0.711

0.281

0.008

0.851

0.149

San Pedro de los Milagros

0.730

0.251

0.019

0.856

0.144

Santa Rosa de Osos

0.786

0.214

0.000

0.893

0.107

Total

0.764

0.223

0.013

0.876

0.124

Santa Rosa de Osos Total

*p<0.05, Ho: Heterocigosidad Observada, He: Heterocigosidad esperada, N: Tamaño Muestral.

En ninguno de los municipios evaluados se encontraron evidencias suficientes para suponer desvíos significativos (p>0.05) en el equilibrio de Hardy Weinberg, por lo tanto no hay evidencias para suponer cambios en las frecuencias genotípicas de una generación a otra (Tabla 3). Estructura y diferenciación genética de las poblaciones. El estadístico FST para la población total fue 0.0068 con un valor de significancia p=0.0107, indicando que algunas de las poblaciones se han diferenciado, aunque la magnitud de la diferenciación genética es baja según los rangos propuestos por Wright (19). Los FST pareados por municipios, estuvieron entre 0.00 y 0.130, con algunos valores significativos (Tabla 4); indicando diferenciación baja ó media en algunos casos, y ausencia de significancia en la diferenciación de algunas poblaciones pareadas. Los valores de FST pareados entre las poblaciones Marinilla-Envigado (0.11) y Marinilla-Don Matías (0.13) presentaron una diferenciación Media y significativa según los rangos propuestos por Wright (19). El valor de FIS promedio obtenido fue de -0.02527, pero no fue significativo (p>0.05), del mismo modo los valores de FIS por municipio carecieron de significancia (p>0.05), por lo

Rincon - Estructura y diversidad genética en vacas Holstein

3351

Tabla 4. Estadístico FST calculado entre diferentes pares poblaciones del Departamento de Antioquia. Población

Medellín

Belmira

Bello

Don Matías

Entrerrios

Envigado

La Unión

Marinilla

Rionegro

San pedro

Medellín Belmira

-0.0060

Bello

0.0052

Don Matías

0.0155

0.0194

0.045*

Entrerrios

-0.0030

0.013*

0.0102

Envigado

0.0135

0.0171

0.0427

-0.0216

0.0085

La Unión

-0.0042

-0.0054

0.0021

0.0210

-0.0008

0.0192

Marinilla

0.048*

0.039*

0.0075

0.130*

0.072*

0.1102*

0.0391*

Rionegro

0.0037

0.0005

-0.0041

0.043*

0.011*

0.0400*

0.0009

0.0100

S. Pedro

0.0032

0.0005

-0.0024

0.0361

0.0093

0.0356

0.0010

0.0156

-0.0026

S. Rosa

-0.0209

-0.0217

-0.012*

0.013*

-0.0183

0.0122

-0.0199

0.0182

-0.0131

0.0018

-0.013

*: p<0.05.

tanto no es posible asumir tendencias a la endogamia, ni a la exogamia en la mayoría de los municipios analizados, a excepción del Municipio de Don Matías que fue el único que presentó un FIS significativo, con un valor de -0.0294, indicando una pequeña tendencia a la exogamia en esta población (Tabla 5). Tabla 5. Índice FIS para cada una de las poblaciones y el valor promedio para la población total (1023 permutaciones). FIS

Valor P

Medellín

Municipio

-0.1124

1.0000

Belmira

0.0226

0.6119

Bello

-0.1765

1.0000

Don Matías

-0.0294

0.0450**

Entrerrios

0.0402

0.3578

Envigado

0.0000

1.0000

La Unión

0.0298

0.4956

Marinilla

0.1250

0.4311

Rionegro

-0.1054

0.9501

San Pedro de los Milagros

-0.0130

0.6627

Santa Rosa de Osos

-0.0833

0.1144

Promedio

-0.02635

0.8758

FIT

-0.01964

0.8182

El estadístico FIT obtenido fue de -0.0207, pero no fue significativo (p>0.05) y por tanto no se tienen argumentos suficientes para suponer una tendencia a la exogamia en la población total (tabla 5). Flujo génico. El valor medio de flujo de genes representado como Nm (Numero de migrantes) fue de 36, un valor muy alto considerando que la tasa efectiva de migración de más de un inmigrante por generación, es suficiente para evitar una diferenciación por efectos de deriva génica. La baja diferenciación genética (FST) y la alta tasa efectiva de migración (Nm) observada en estas poblaciones puede estar relacionada directamente con la utilización de inseminación artificial y la comercialización de vacas entre los diferentes municipios.

DISCUSIÓN Las poblaciones evaluadas en el departamento de Antioquia no presentaron desviaciones significativas (p>0.05) del equilibrio de HardyWeinberg para el gen de bGH, lo que parece indicar que dichas poblaciones no han sido sometidas a un proceso fuerte de selección sobre este gen recientemente, de tal manera que no se ha perturbado el equilibrio de una generación a la siguiente. Los resultados obtenidos concuerdan con los encontrados por Gorbani et al (20) en el 2009 al evaluar 183 toros iraníes, pero difieren de los encontrados por Mohammadabadi et al (21) en 2010 al usar el gen bGH en toros Iraníes, pero con la enzima de restricción AluI. En Colombia Echeverri et al (22) en el 2010 no encontraron diferencias significativas entre las frecuencias alélicas ni genotípicas entre fincas, al evaluar 165 vacas Holstein en diferentes municipios del Departamento de Antioquia (Colombia). Usme en el 2009 reportó equilibrio HW en el departamento de Antioquia con el gen de kappa-caseina (23). La heterocigosidad puede ser utilizada como un indicador de diversidad genética y en el presente trabajo tomó valores de medios a bajos (Tabla 3) de acuerdo a la población. Resultados similares se han encontrado en diferentes estudios (14, 20 y 22) con heterocigosidades mayores para este polimorfismo (MspI) solo reportadas en Bos indicus (20). Con respecto a la heterocigosidad observada y esperada no se encontraron diferencias significativas (p>0.05) en ninguno de los municipios, ni en la población total (Tabla 3), por lo tanto no se puede asumir que haya déficit o exceso de heterocigotos. La mayor heterocigosidad encontrada se presentó en Marinilla (h=0.310), lo que indica que dicha población presenta una diversidad genética importante posiblemente por que en esta población no se han realizado esfuerzos

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

importantes en la selección de animales. Los municipios de Don Matías y Envigado presentaron valores de heterocigosidad muy bajos (0.083 y 0.063) indicando una muy baja variabilidad genética, posiblemente por selección indirecta, en dichas poblaciones de importancia en la producción de leche. En el caso de Don Matías, el estadístico FIS fue negativo mostrando una pequeña tendencia a la exogamia que debería corresponder a un aumento en la diversidad sobre dicha población, pero que es tan pequeño que puede no haber sido suficientemente fuerte para mostrar un cambio en la heterocigosidad. Los resultados del presente estudio mostraron que el alelo MspI (+) fue más frecuente que el (-) (0.876 vs 0.124) en la población total, y se comportó de manera similar en las diferentes subpoblaciones variando de 0.776 a 0.969 para el alelo (+), y de 0.031 a 0.224 para el alelo (-), lo que parece indicar una variabilidad media entre municipios. En Colombia Echeverri et al (22) encontraron frecuencias alélicas de 0.85 para el alelo MspI+ y 0.15 para el MspIen el departamento de Antioquia, valores que se encuentran entre los rangos encontrados en este trabajo. Datos similares han sido reportados no solo en la raza Holstein sino en la mayoría de razas europeas que difieren en mucho a las frecuencias encontradas en los Bos indicus (20). Las frecuencias genotípicas mostraron que la mayoría de los animales (76.4%) fueron homocigotos (+/+), el 22.3% fueron heterocigotos y solo un pequeño porcentaje (1.3%) fueron homocigotos (-/-). Estos hallazgos fueron similares a los reportados previamente en ganado Holstein lechero (20) en los cuales se encuentra una muy alta proporción del genotipo (+/+) con una muy baja frecuencia del genotipo homocigotico (-/-), lo que parece indicar una tendencia a la fijación del alelo (+), posiblemente por la selección lenta e indirecta sobre el gen que posibilita la prevalencia de una forma alélica, pero que no es lo suficientemente fuerte y directa para ser reconocida en una prueba de Hardy Weinberg, ya que las variaciones alélicas para el alelo (+) que se encuentra en mayores proporciones no llega a ser significativa. En los municipios de Don Matías, Bello, Medellín y Envigado no se encontró el genotipo (-/-), y las frecuencias alélicas muestran una prevalencia de el alelo (+) llegando incluso a valores de 96.9% lo que indica que el alelo se encuentra casi fijado (Tabla 2). Las diferencias en las frecuencias encontradas también hablan de la selección indirecta que

se ha generado en los diferentes municipios, principalmente por el apareamiento dirigido. Los valores obtenidos de FIS y FIT no fueron significativos posiblemente por la alta variabilidad encontrada dentro de las subpoblaciones y dentro de la población total, por lo tanto, no es posible inferir alguna conclusión sobre tendencias a la endogamia y a la exogamia en ninguno de los niveles. La población total presentó una pequeña diferenciación (FST=0.0068) significativa (p<0.05) para el gen de bGH-MspI, es decir, que por lo menos hay dos poblaciones que se encuentran bien diferenciadas entre sí, lo cual significa que Antioquia no se comporta como una única población. Los valores de FST pareados permitieron determinar de que forma se presenta la estructuración entre municipios (Tabla 4). De acuerdo a lo anterior se pudo determinar que Marinilla presenta las mayores diferencias entre poblaciones con 6 diferencias significativas, además su valor de FST pareado fue el mayor (0.13) al compararse con el municipio de Don Matías, mostrando una diferenciación moderada entre estos (19). Tal diferenciación en Marinilla se pudo haber generado por el aislamiento que presenta esta población con respecto a las demás y por la falta de programas de selección. Las demás poblaciones presentaron diferencias muy bajas y solo unas pocas fueron significativas, por tal motivo el valor de flujo genético fue muy alto (Nm=36), teniendo en cuenta que solo es necesario un inmigrante por generación para evitar la diferenciación por deriva genética. Los programas de inseminación, en los que es posible integrar semen de toros de todo el mundo, derriban las barreras geográficas y aumentan el flujo genético, pero en algunos casos los sistemas de producción no permiten que todas las poblaciones tengan acceso a estos programas y se pueden generar barreras de flujo entre poblaciones y por lo tanto una diferenciación genética. Los resultados obtenidos en el presente trabajo postulan al gen de bGH-MspI como un candidato interesante para la evaluación de características de importancia económica en Colombia, ya que este no ha sido sometido a procesos de selección de manera directa, presenta variabilidades medias en las frecuencias alélicas de algunas poblaciones y es de gran importancia por su papel en la lactancia, incluso puede generar resultados satisfactorios si se determina el genotipo superior para estas condiciones, con

Rincon - Estructura y diversidad genética en vacas Holstein respecto a alguna característica de importancia económica. Teniendo en cuenta lo anterior, se debe tener en cuenta que para el desarrollo de un programa de selección asistido por marcadores moleculares, es pertinente realizar la evaluación a nivel local sobre el genotipo más deseado por su relación con parámetros productivos, debido a que los reportes son ambiguos (9,14,24) y pueden ser variables de acuerdo al lugar donde son evaluados y a la raza de los animales (24). Además, en Colombia no se han reportado

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asociaciones significativas entre el alelo MspI posiblemente porque la única investigación llevada a cabo por Echeverri et al (22), no poseía un numero de animales que permita lograr la significancia deseada. Agradecimientos A los propietarios de las fincas en cada municipio por permitir el desarrollo de este estudio, Al Laboratorio de Biología Molecular y Celular de la Universidad Nacional Sede Medellín.

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3355-3361, 2013. ORIGINAL

Estructura genética poblacional del gen lactoferrina bovino en vacas Holstein del departamento de Antioquia Population genetic structure of bovine lactoferrine gen in holstein breed of Antioquia Department Nancy Rodríguez C,1* M.Sc, Albeiro López H,1 Ph.D, Julián Echeverri Z,1 Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias Agrarias. Calle 59A N° 6320, Medellin, Colombia. *Correspondencia: nancyrodrigu@gmail.com. 1

Recibido: Octubre de 2010; Aceptado: Diciembre de 2011.

RESUMEN Objetivo. Estimar algunos parámetros de estructura poblacional en una población Holstein del departamento de Antioquia. Materiales y métodos. El estudio se realizó con 427 vacas de la raza Holstein pertenecientes a 5 municipios del departamento de Antioquia. La genotipificación se llevó a cabo usando la técnica de PCR-PFLPs. La Heterocigocidad observada (Ho) y Heterocigocidad esperada (He), la prueba de Hardy-Weinberg (HW) y la estructura y diferenciación genética entre las poblaciones se calculó mediante los parámetros F de Wright, evaluados mediante el software GENEPOP. Las frecuencias alélicas y genotípicas se evaluaron con el método descrito por Hartl. Resultados. Las frecuencias genotípicas encontradas fueron 0.61, 0.34 y 0.05 para los genotipos AA, AB y BB respectivamente y las frecuencias de los alelos fueron 0.78 y 0.22 para A y B, encontrándose la población en equilibrio de HW. La heterocigocidad fue media entre poblaciones (Ho=0.368). Los valores FIS, FST y FIT de la población total fueron -0.0717, 0.0099 y -0.0611. Conclusiones. No fue posible asumir endogamia, ni exogamia en los municipios analizados, exceptuando el municipio de San Pedro de los Milagros, en cuyo caso se percibe de manera más fuerte el efecto del mejoramiento genético y la disminución de la heterocigocidad. Palabras clave: Análisis genético, caracterización, polimorfismo (Fuente:CAB).

ABSTRACT Objective. Estimate some population structure parameters in a Holstein population of the Department of Antioquia. Materials and methods. Research involved 427 Holstein cows of five municipalities in the department of Antioquia. The cattle was genotyped using PCR-PFLP. Observed heterozygosity (Ho) and expected heterozygosity (He), the exact Hardy-Weinberg test (HW) and the structure and genetic differentiation among populations were calculated using F-Wright parameters which were assessed using the GENEPOP software. The allele and genotype frequencies were evaluated with the method described by Hartl. Results. The genotypic frequencies were 0.59, 0.37 y 0.04 to AA,

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AB y BB, respectively and allele frequencies were 0.78 and 0.22 of A and B. The population is in Hardy-Weinberg equilibrium. Heterozygosity was average among populations (Ho = 0.368). FIS, FST and FIT values of the total population were -0.0717, 0.0099 and -0.0611 but these were not significant. Conclusions. It was not possible to assume inbreeding or out breeding in the analyzed municipalities, except in the municipality of San Pedro de los Milagros, in which case the effect of genetic improvement and the reduction of heterozygosity was more strongly perceived. Key words: Characterization, genetic analysis, polymorphism (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN La lactoferrina (LTF) bovina estimula o inhibe diversos componentes humorales y celulares de la inmunidad implicados en la prevención o resolución de infecciones y de la inflamación asociada a estas últimas. La respuesta inmunitaria contra los agentes infecciosos involucra una interacción compleja entre diferentes tipos de células y sus productos, que culmina con la eliminación del agente infeccioso o la muerte del animal (1). La LTF se encuentra en diversas secreciones mucosas como la leche, las lágrimas y la saliva (2). También es un componente abundante de los neutrófilos y puede ser liberada al plasma sanguíneo por la acción de éstos (3). Las LTF humana y bovina, despliegan un amplio espectro antimicrobiano, actuando contra bacterias Gram positivas y Gram negativas y contra algunos virus y hongos (4). Inicialmente se pensó que esta actividad antimicrobiana se debía únicamente a su capacidad de secuestrar hierro (5). El efecto bacteriostático de la LTF en su forma de apo LTF se ha atribuido a su habilidad de captar el ion Fe3+ y limitar así su utilización por bacterias patógenas, que lo requieren como factor esencial para su crecimiento y expresión de factores de virulencia (6); se ha demostrado que el efecto bacteriostático in vivo de la LTF no depende exclusivamente de sus propiedades quelantes del Fe3+, sino de su capacidad para estimular la absorción intestinal de carbohidratos y reducir su disponibilidad para el crecimiento bacteriano, ya que algunas bacterias patógenas no sólo son capaces de contrarrestar las propiedades quelantes de la LTF sino que además la aprovechan como fuente de hierro (7). Este último puede ser removido directamente de la LTF por receptores expresados en la superficie de ciertas bacterias patógenas Gram positivas y negativas (8). Se ha demostrado que, dependiendo de la dosis ensayada, la apo LTF inhibe el crecimiento de bacterias patógenas no invasoras como Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) y Helicobacter pylori (9); La LTF ejerce un efecto

bactericida directo por su capacidad de unirse a porinas y al lípido A del lipopolisacarido (LPS), presentes en la membrana externa de bacterias gram negativas (7). El gen de la lactoferrina bovina (bLTF) está localizado en el cromosoma 22 del genoma bovino (referencia NCBI: NC_007320.4), se extiende sobre 33.4 kb, contiene 17 exones y 16 intrones. Por la naturaleza inmunogenica de la proteína bLTF, el gen presenta una cantidad importante de polimorfismos entre los cuales se encuentran polimorfismos en el exón 4 y en el exón 11 que causan cambios importantes en la cadena de aminoácidos, en el exón 4, en la base 1155 A/G causando un cambio de isoleucina a valina, y el exón 11 en la base 1415 C/T causando un cambio de histidina a tirosina; se encontró que un polimorfismo en el intrón 6 (C/T), está ligado a los cambios en los exones 4 y 11, separados por 14.5 kb. Cuando el intrón 6 se encuentra en su forma no mutada (citocina), el exón 4 contiene una adenina y el exón 11 una citocina, cuando el intrón 6 se encuentra con su forma mutada (timina) el exón 4 se encuentra con una guanina y el exón 11 con una timina (10). Las lecherías del departamento de Antioquia, aunque en su mayoría comparten características similares encuentran diferencias importantes en cuanto a tecnificación, la cual no ha tenido el mismo progreso en los diferentes municipios ya sea por cuestiones de topografía o accesibilidad al hato, lo que puede sugerir cambios génicos en las poblaciones de ganado Holstein. Conocer la estructura genética de las poblaciones locales de Holstein es de gran importancia, ya que una población para un locus determinado, en este caso el lugar del polimorfismo del intrón 6, podría producir cambios y por ende producir efectos genéticos importantes en los parámetros de la población, es decir, cambios en la frecuencia génica, éstas resultado usual del equilibrio entre selección, mutación, migración y azar (11). Lo que permitiría la interpretación de su evolución en la raza y la base para dilucidar sus efectos en las frecuencias génicas de las poblaciones de ganado Holstein.

Rodríguez - Estructura genética poblacional del gen lactoferrina bovino (LTF)

MATERIALES Y MÉTODOS Área y poblaciones de estudio. Se incluyeron 427 vacas de la raza Holstein, pertenecientes a nueve lecherías especializadas ubicadas en el departamento de Antioquia, el número de animales por disponibilidad en los municipios de San Pedro de los Milagros (Altura: 2.475 m.s.n.m; Tº: 14ºC), Belmira (Altura: 2.550 m.s.n.m; Tº: 14ºC), Entrerríos (Altura: 2.300 m.s.n.m; Tº: 16ºC), La Unión (Altura: 2.500 m.s.n.m; Tº: 13ºC) y Medellín, corregimiento Santa Elena (altura: 2.500m.s.n.m; Tº: 14ºC). Los municipios fueron tomados como subpoblaciones de Antioquia (Tabla 1), cada uno de estos presentan rasgos particulares en productividad y tecnificación. Además, de diferencias en los sistemas productivos; el inventario por hato no fue igual en todos los municipios, lo que derivó en un número desbalanceado de animales. Tabla 1. Número de vacas por Municipio. Municipio

Número de animales

Medellín

Belmira

Entrerríos

La unión

San Pedro de los Milagros

247

Total

427

Toma de muestras. De cada uno de los individuos se colectó 5 ml de sangre periférica en tubos de vacío con EDTA como anticoagulante, utilizando agujas número 18 (BD Vacutainer® TM). Los tubos fueron homogenizados por inversión, rotulados para su identificación y refrigerados con hielo durante su transporte hasta el laboratorio de Biología Celular y Molecular de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, en donde se realizó la extracción del ADN. Extracción del ADN de células de sangre. Para la obtención del ADN de sangre periférica se utilizó el método de “salting out” modificado, descrito por Miller (12) y se almacenó a 4°C hasta el momento del análisis. La cantidad y calidad del ADN extraído se evaluó en gel de agarosa al 0.8% teñido con bromuro de etidio, y se cuantificó en un espectrofotómetro NanoDrop ND 2000. La pureza del ADN genómico se determinó mediante un análisis de absorbancia en dos longitudes de onda. Sólo el ADN genómico con una pureza ideal entre 1.82.0 se consideró para los estudios a realizar.

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Amplificación y genotipaje del gen bLTF. El ADN aislado fue usado para la amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de un fragmento de 301 pb (pares de bases) con los siguientes cebadores: Directo: 5’-GCC TCA TGA CAA CTC CCA CAC-3’ Reverso: 5’-CAG GTT GAC ACA TCG GTT GAC-3’, según Seyfert y Kuhn (10). La PCR contenía 0.5 U de Taq polimerasa (Bioline®), 2.5 µl de Buffer para PCR 10x, 30ng/µl de DNA, 0.5 µl de MgCl2 a 50nM, 0.5 µl de dNTPs a 20nM y 0.5µl de cada primer y se aforó con agua desionizada y estéril para un volumen total de 25µl. Se estandarizó la PCR de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 95°C por 3 min, seguido de 28 ciclos a 95°C por 45s, 60°C por 30s, 72 por 20s, con una extensión final a 72°C por 3 min. El producto de la PCR se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Luego se realizó la digestión con la enzima de restricción EcoRI de la siguiente manera: 5µl de reacción de PCR, 2µ de Buffer EcoRI (Fermentas®), 0.5µ EcoRI (Fermentas®) y 12.5 µl de agua desionizada y estéril, para un volumen total de 20 µl, se incubó por 3 horas a 37°C, el producto se observó por electroforesis en gel de agarosa al 2.5% y bromuro de etidio. El patrón de restricción esperado para el genotipo AA es un fragmento de 301pb, para el genotipo AB tres fragmentos (301pb, 201pb y 100pb) y para el genotipo BB dos fragmentos (201pb y 100pb). Análisis Estadístico. Frecuencias alélicas y genotípicas. La frecuencia de los diferentes alelos se estimó determinando la proporción de cada forma del gen entre el número de copias totales de la población en estudio. Se identificaron los homocigotos (dos copias del mismo alelo) y los heterocigotos (una copia de cada alelo), y se calculó la frecuencia F de cada alelo contando los homocigotos y añadiendo la mitad de los heterocigotos, con el método descrito por Hartl (13). Frecuencia total (p) del alelo 1 en la población es: p= Fa/a +½ Fa/b Frecuencia total (q) del alelo 2 en la población es: q= Fb/b + ½Fa/b, donde; F a/a = Homocigótico F a/b = Heterocigótico Diversidad genética. Se estimó comparando la proporción de los diferentes genotipos dentro de las poblaciones, mediante la Heterocigosidad

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observada (Ho) y Heterocigosidad esperada (He) en cada población, utilizando los algoritmos incluidos en el programa GENEPOP versión 4.0 (14). La significación estadística de estos análisis se obtuvo de acuerdo al método de cadena de Markov (15), utilizando el conjunto de programas GENEPOP versión 4.0 (14). Estructura genética. Se determinó, la deficiencia o exceso de heterocigotos para el locus, en cada población y para la población total con la prueba exacta de Hardy-Weinberg (HW) con el programa GENEPOP versión 4.0 (14). La estructura genética entre las poblaciones se calculó mediante los estadísticos F de Wright (11). Estos parten el coeficiente de endogamia de una población subdividida, calculando el parámetro FIT, que corresponde a la endogamia total, el parámetro FIS, que mide la subdivisión intrapoblacional y el FST, que mide la subdivisión poblacional; usando las siguientes formulas: para el parámetro FIT= HT-Hi/HT, para el parámetro FIS= HS-HI/HS y para el FST=FIT-FIS/1-FIS; donde HT se refiere a la heterocigosidad esperada en la población total, HI es la heterocigosidad promedio observada en un grupo de poblaciones y HS es la heterocigosidad promedio esperada de cada población. Estos cálculos se realizaron usando el conjunto de programas GENEPOP versión 4.0 (14), bajo la hipótesis nula “los alelos o genotipos tienen la misma distribución en todas las poblaciones”. El flujo génico fue expresado como el número de migrantes (Nm) por generación, y se calculó con base a la siguiente expresión derivada de los estadísticos de Wright (11).

RESULTADOS Determinación de las frecuencias alélicas y genotípicas del gen LTF. Se obtuvo amplificación del ADN de las 427 vacas de un fragmento de 301pb; el análisis de los fragmentos de restricción con la técnica RFLP usando la enzima EcoRI contenía fragmentos de 301pb (alelo A, sin sitio de restricción), 201 pb y 100 pb (alelo B) (Figura 1). Las frecuencias de los alelos A y B fueron 0.78 y 0.22. Estos alelos forman tres genotipos AA, AB y BB, con frecuencias 0.59, 0.37 y 0.04 (Tabla 2). Es posible observar una presencia mayor de homocigotos BB en la subpoblación de Belmira y La Unión, comparada con las demás poblaciones y el promedio.

301 201 100

Figura 1. Producto de amplificación por PCR del polimorfismo del gen LTF y patrón de restricción con la enzima EcoRI (gel de agarosa 2.5%).

Diversidad genética. Solo la población de San Pedro de los Milagros, mostró desvíos significativos (p ≤ 0.05) para el análisis de equilibrio de HW, esta desviación se debió a un exceso de heterocigotos, lo que parece indicar una tendencia de apareamiento especifico en esta población. En ninguno de los otros municipios evaluados se encontraron evidencias suficientes para suponer desvíos significativos (p>0.05) (Tabla 2). Tabla 2. Frecuencias alélicas y genotípicas, Ho, He, equilibrio de Hardy-weinberg para el gen bLTF en algunas poblaciones de ganado Holstein de Antioquia.

Población

Frecuencia genotípica observada AA

San Pedro

AB (HO)

Frecuencia alélica A

Valor P

247

0.626 0.355 0.019 0.803 0.196 0.32

La Unión

0.542 0.375 0.083 0.729 0.271 0.40

n.s

Belmira

0.483 0.417 0.100 0.692 0.308 0.43

n.s

Entrerríos

0.554 0.411 0.036 0.759 0.241 0.37

n.s

Medellín

0.682 0.273 0.045 0.818 0.182 0.30

n.s

467

0.595 0.368 0.037 0.779 0.221 0.34

n.s

Total

*p≤0.05, n.s: no significativo, Ho: Heterocigosidad Observada, He: Heterocigosidad esperada, N: tamaño muestral

La Heterocigocidad observada y esperada tuvo una variación de 0.27 a 0.42 y de 0.30 a 0.43 respectivamente, indicando mediana variación entre las poblaciones considerable pero no significativa para toda la población (p>0.05). Estructura genética de las poblaciones. Los FST pareados por municipios, estuvieron entre -0.0049 y 0.0316, con diferencias significativas (p<0.05) para la población de San Pedro de los Milagros y Belmira (Tabla 3), encontrándose todos estos según los rangos propuestos por Wright (11), que define los valores de diferenciación genética (FST) en bajos (FST<0.05), moderados (FST de 0.05-0.15), altos

Rodríguez - Estructura genética poblacional del gen lactoferrina bovino (LTF) Tabla 3. Estadístico FST calculado entre diferentes pares poblaciones del Departamento de Antioquia. San Pedro

La unión

Población

0.0070

Belmira -

Belmira

0.0316*

-0.0120

Entrerrios

0.0014

-0.0119

0.0029

Medellín

-0.0105

-0.0014

0.0235

-0.0049

(FST 0.15-0.25) y muy altos (FST>0.25), entre la categoría de los bajos. El estadístico FST para la población total presentó un valor de 0.0099 aunque este careció de significancia (p>0.05), por lo tanto, no es posible asumir tendencias a la endogamia, ni a la exogamia en los municipios analizados. Los valores de FIS por municipio carecieron de significancia (p>0.05), excepto para el municipio de San Pedro de los Milagros (-0.12) indicando leve exceso de heterocigotos, lo cual parece indicar una tendencia a la exogamia en esta población. Dicho planteamiento es reforzado por el resultado planteado en la tabla 2, donde se observa una diferencia alta entre Ho y He, llevando a la perdida de equilibrio de HW. El estadístico FIS obtenido fue de -0.0717 y no fue significativo (p>0.05), por tanto, no es posible afirmar que exista una tendencia a la endogamia (Tabla 4).

Tabla 4. Índice FIS para cada una de las poblaciones y para la población total. Municipio

FIS

Valor P

0.1064

0.8930

Belmira

0.0315

0.7124

Entrerríos

-0.1136

0.3234

La unión

efectiva de migración (Nm) observada en estas poblaciones está ligada al apareamiento aleatorio entre individuos.

Entrerrios

*P≤0.05

Medellín

3359

0.0717

0.8148

San Pedro de los Milagros

-0.1226

0.0300

Promedio

-0.072

0.3433

El estadístico FIT obtenido fue de -0.0611 resultando no significativo (p>0.05), por tanto, no es posible afirmar que exista una tendencia a la endogamia (Tabla 4). Flujo génico. En este estudio el valor medio de flujo de genes Nm fue de 25, un valor muy alto considerando que la tasa efectiva de migración de más de un inmigrante por generación, es suficiente para evitar una diferenciación por efectos de deriva génica (11). La baja diferenciación genética (FST) y la alta tasa

DISCUSIÓN Todas las poblaciones estudiadas se encontraron en equilibrio de HW excepto San Pedro de los Milagros, para que se mantenga tal equilibrio se tienen que dar cinco condiciones, que exista una población grande para la reproducción, entrecruzamiento al azar, que no se dé ningún cambio alélico debido a mutaciones, que no se de migración y por último que no exista selección. Es posible que dado que la población de San Pedro de los Milagros es una de las más importantes para el sector lechero del departamento, se hayan concentrado allí muchos esfuerzos desde el punto de vista del mejoramiento genético aumentando los procesos de selección, para conseguir animales menos vulnerables a enfermedades infeccionas, ocasionando que en la actualidad el equilibrio para este gen se haya perdido, favoreciendo más alguna de las formas genotípicas. Estos resultados, en general difieren de los encontrados por Wojdak-maksymiec et al (16), en una población de 124 vacas de la raza Holstein en Polonia, donde se encontraron frecuencias de 0.68, y 0.33 para los alelos A y B respectivamente del gen LTF, y para los genotipos AA, AB, y BB, frecuencias de 0.38, 0.60 y 0.20 respectivamente; para el cálculo de equilibrio de HW encontraron desviaciones significativas (p≤0.000252) con un exceso de heterocigóticos. Igualmente en un trabajo realizado por Šrubařová y Dvořák (17) en una población de 94 vacas Holstein en República Checa, encontraron una frecuencia de 0.57 para el genotipo AA y 0.43 para el genotipo AB y no se encontró el genotipo BB, las frecuencias para el alelo A fueron de 0.79 y para el alelo B de 0.21, frecuencias muy similares a las encontradas en el presente estudio. Rosero (18) encontró una población de 30 animales Holstein ubicados en el Valle del Cauca (Colombia) en equilibrio de HW, para los genes de Kappa caseína y β-Lactoalbúmina. Al igual que Usme-Ciro et al (19) en una población de 145 hembras Holstein de Antioquia (Colombia) para el gen de Kappa Caseína. No se encontraron reportes de equilibrio de HW para el gen LFT en Colombia. Las diferencias en las frecuencias encontradas por otros autores denotan como en las

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poblaciones de Holstein se han trabajado apareamientos dirigidos (selección artificial), ya que el genotipo AA del gen LTF se ha asociado con un menor conteo de células somáticas, mientras que el genotipo AB se asocia con un mayor conteo (16); lo que podría explicar las frecuencias genotípicas de la población Checa.

El conocimiento poblacional del polimorfismo del gen LTF es de vital importancia para futuros trabajos en la asociación de este con enfermedades infecciosas como mastitis, problemas pódales y respiratorios, que aquejan y golpean el estado sanitario y la economía ganadera.

La utilidad de una población en condiciones exogámicas, tal como es la tendencia de la población del departamento de Antioquia para el gen bLTF, reside aumentar genes portadores de los caracteres favorables sobre sus alelos, que aportan las expresiones menos deseables del mismo carácter. Por lo tanto, la exogamia mejora el comportamiento de los descendientes, pero disminuye la potencialidad genética de los individuos sobresalientes en los cuales inicialmente los genes favorables se presentan en forma de homocigotos. (20).

En conclusión, hasta este momento y con base en la población analizada se puede concluir que el gen de la lactoferrina bovina LTF no ha sido objeto de selección genética ni de otras fuerzas génicas que sugieran cambios en la estructura de las diferentes poblaciones, pese a que este gen se ha encontrado asociado a diferentes características, en las poblaciones estudiadas la selección indirecta que se ha llevado a cabo, no ha provocado cambios que impliquen desviaciones del equilibrio de HW.

La diversidad genética medida en términos de Heterogocicidad observada (Ho) y Heterogocicidad esperada (He) indican entre media y baja variabilidad genética (Tabla 2). Resultados que no se alejan mucho de la variabilidad genética de otros genes tales como el gen Kappa-caseína, en un estudio realizado en el departamento de Nariño, con Ho de 0.30 y He de 0.32 (21); de igual manera Rosero (18) encontró para los genes de Kappa caseína, α-Lactoalbúmina, y β-Lactoalbúmina en ganado Holstein colombiano, un Ho de 0.567 y He de 0.457. En Colombia no se encontraron referencias para el gen LFT. Como se observó en la tabla 3, los valores de FIS para las poblaciones de los municipios de la Unión, Belmira y Medellín indican una leve deficiencia de heterocigotos. El valor medio de FIS = -0.0717 muestra que la población estudiada tiende a la heterocigosis, condición que puede estar asociada a un apareamiento aleatorio dentro de poblaciones, lo que evidencia que no se han presentado en esta población cruzamientos dirigidos para el gen de LTF. Este índice es una medida indirecta de consanguinidad y concuerda con los resultados obtenidos mediante la prueba de HW (Tabla 2), donde se encuentra esta población en equilibrio. Pero algunos valores positivos en las poblaciones de Medellín (0.11), La Unión (0.07) y Belmira (0.03), indican la tendencia a la disminución de su heterocigocidad, a partir del coeficiente de endogamia entre los componentes de una población debido a apareamientos no aleatorios dentro de poblaciones.

Con respecto a la estructura de las diferentes poblaciones no se encontraron resultados significativos por lo tanto, no es posible asumir endogamia, ni exogamia en los municipios analizados para este gen. Exceptuando el Municipio de San Pedro de los Milagros, en cuyo caso se percibe de manera más fuerte el efecto del mejoramiento genético y la disminución de la heterocigocidad, para reforzar esta teoría se sugiere la realización de estudios con un tamaño muestral mayor al del presente trabajo. Estos resultados son el primer reporte que caracteriza el gen lactoferrina bovino en ganado Holstein tropical colombiano. Los mismos, servirán de base para futuros estudios con este y otros marcadores moleculares, a fin de contribuir con la conservación y permanencia de alelos de importancia, su asociación con enfermedades de importancia económica y como posterior marcador de susceptibilidad o resistencia a las mismas; lo cual es de gran utilidad como criterio de selección. Algunas poblaciones tienen una tendencia a disminuir la heterocigocidad, lo que incrementa el riesgo de erosión genética asociado a altos niveles de endogamia que se pueden presentar si los apareamientos consanguíneos persisten, por tal motivo en la labor pedagógica y de extensión se debe enfatizar que la evaluación del impacto de los procesos de mejoramiento genético a través de la selección, se logran en el mediano y largo plazo, debido al prolongado intervalo generacional de los bovinos.

Rodríguez - Estructura genética poblacional del gen lactoferrina bovino (LTF)

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3362-3369, 2013. ORIGINAL

Micorrizas arbusculares asociadas al pasto angleton (Dichathium aristatum Benth) en fincas ganaderas del municipio de Tolú, Sucre-Colombia Arbuscular mycorrhizae associated to angleton grass (Dichathium aristatum Benth) on livestock farms at the municipality of Tolú, Sucre-Colombia Alexander Pérez C,1* Ph.D, Víctor Peroza C,2 M.Sc. Universidad de Sucre, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Grupos de investigación en Bioprospección Agropecuaria, Campus universitario Puerta Roja, Sincelejo, Colombia. 2Universidad de Sucre, Facultad de Ciencias Agropecuaria. *Correspondencia: alexander.perez@unisucre.edu.co. 1

Recibido: Julio de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

RESUMEN Objetivo. El presente estudio consistió en caracterizar el porcentaje de colonización de hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA); asociados a la rizósfera del pasto Angleton (Dichanthium aristatum) Benth de fincas ganaderas del municipio de Tolú, departamento de Sucre, Colombia. Materiales y métodos. Se muestrearon en total 35 fincas ganaderas, de las cuales se tomaron 10 muestras de suelo con raíces por finca a una profundidad de 20 cm. De cada muestra se aislaron esporas de HMA, se hizo separación de morfotipos y su respectiva identificación a través de claves taxonómicas. De las raíces colectadas se determinó el porcentaje de colonización utilizando métodos de coloración. Resultados. Los ANAVA multifactorial entre las variables densidad de esporas/100 g de suelo y porcentaje de colonización en función a zonas y corregimiento mostraron diferencias altamente significativas. Los resultados obtenidos indican que el 92% de las especies encontradas corresponden a características de hongos HMA similares al género Glomus, el 4% al género Gigaspora y el 4% restante a Paraglomus. Conclusiones. Este estudio preliminar realizado en el Caribe colombiano muestra la diversidad, densidad poblacional y el porcentaje de colonización de HMA asociadas al pasto Angleton en condiciones de siete corregimientos pertenecientes a dos zonas agrológicas del municipio de Tolú, departamento de Sucre. Palabras clave: Forraje, hongos, micorrizas, rizósfera (Fuente: DeCS).

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Pérez - Micorrizas arbusculares asociadas al pasto angletón

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ABSTRACT Objective. The present study was carried out to isolate, identify and determine the colonization rate of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) associated with rhizosphere of Dichanthium aristatum Benth grass, in livestock farms of the municipality of Tolú, department of Sucre. Materials and methods. Soil samples and roots from the different farms were picked up. Of each sample AMF spores were isolated, morphotype separation and identification was done by taxonomic keys. From the collected roots colonization rate were measured and calculated through staining methods. Results. 35 livestock farms were sampled, distributed throughout 7 areas of the municipality. The multifactorial ANOVA between the flux density of spores per 100 g soil and colonization percentage in terms of areas and farm factors showed highly significant differences. The results indicate that 92% of the species found are characteristic of fungi similar to the genus Glomus AMF, 4% to the genus Gigaspora, and the remaining 4% to Paraglomus. Conclusions. This preliminary study carried out in the Colombian Caribbean shows diversity, population density and the percentage of colonization of HMA Associated to Angleton grass in conditions of seven townships belonging to two agrological areas of the municipality of Tolú, Department of Sucre. Key words: Fiber, fungi, mycorrhizal, rhizosphere (Source: DeCS).

INTRODUCCIÓN La subregión fisiográfica Golfo del Morrosquillo (Colombia), cuenta con un total de 200.300 ha, de las cuales 149.349 son aptas para pasturas es decir representan el 74.56% del área total de la subregión y el 23.8% del área total de pasto en el departamento (1). Entre las principales especies de pasturas cultivadas en la región Caribe colombiana, se encuentran: Botriochloa pertusa (Colosoana o kikuyo); Branchiaria mutica (Admirable); Dichanthium aristatum (Angleton) y Pennisetum sp (King grass). El pasto Angleton (Dichantium aristatum Benth) representa la tercera especie con mayor área sembrada en Sucre, alcanzando una extensión de aproximadamente 56.200 ha, distribuidas en 19 municipios. El municipio de Santiago de Tolú cuya principal actividad económica es la ganadería semi-intensiva cuenta con la segunda mayor área sembrada (9.400 ha) con esta especie en el departamento (2). Los suelos de las fincas ganaderas del municipio de Tolú, se caracterizan por tener topografía plana, sujetos a inundación, químicamente tienen de mediana a alta saturación de bases, su profundidad efectiva varía de superficial a moderada, limitada por fluctuaciones del nivel freático, presentan cantidades variables de sodio, niveles de fósforo de medio a alto, contenido de bajo a mediano materia orgánica, pH de ligeramente ácido a ligeramente alcalino y fertilidad de media a alta. Estos suelos son aptos para cultivos que toleren la presencia de sales de sodio y las inundaciones. Los factores fisiográficos, las acciones antropogénicas degenerativas del medio

ambiente y el empleo de tecnologías inadecuadas, han dado lugar a la degradación de propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo, lo que limita la oferta y calidad de pastos y forrajes principalmente en temporada seca (3). La sequía y la salinidad son factores limitantes en la producción agrícola, los estudios sobre micorrizas en estos ambientes son relativamente recientes. Diversos autores señalan que la mejora de la nutrición fosforada en plantas micorrizadas es un factor clave que justifica el incremento de tolerancia a condiciones de salinidad (4). La actividad microbiana en la rizósfera es en parte la responsable del funcionamiento de los ecosistemas terrestres y de la fertilidad de los suelos agrícolas. Entre los microorganismos benéficos claves de la rizósfera, están los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA), contribuyendo con el desarrollo y la nutrición de la planta, como también con el incremento de la tolerancia de los cultivos frente a determinadas condiciones de estrés de tipo biótico o abiótico. La integración de estos microorganismos teniendo en cuenta además de los parámetros físico-químico del suelo y los climático en el sistemas garantizan la sostenibilidad, contribuyendo a optimizar la calidad y la salud del suelo, suministrar el aporte de nutrientes e incrementar los rendimientos (5). Los HMA, son una asociación simbiótica entre los hongos del filo Glomeromycota y la raíz de la mayoría de las especies de plantas en el planeta. La asociación está caracterizada por un intercambio de nutrientes y la generación de diversos beneficios para la planta. En ella ocurre

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la formación de una extensa red de micelio en el suelo que les proporciona múltiples ventajas tales como: el mayor transporte de agua y nutrientes (especialmente P, Cu y Zn entre otros); protección en condiciones de estrés, debido a problemas de salinidad, sequía, acidéz, elementos tóxicos o patógenos que atacan a la raíz (6). En la naturaleza, la mayor parte de las plantas presentan este tipo de asociación (7) y aunque aparentemente no existe especificidad taxonómica, evidencias recientes obtenidas con técnicas moleculares indican que las plantas son colonizadas preferentemente por ciertas especies de HMA con base en sus efectos diferenciales sobre el crecimiento vegetal. Tradicionalmente la identificación y clasificación de los HMA ha venido realizándose de acuerdo a las características morfológicas de las esporas, el tamaño, color y número, grosor y consistencia de las paredes, así como la formación de la espora a partir de las hifas, que permite diferenciar familias, y la presencia o no de ornamentación, que permite diferenciar algunas especies. Con el advenimiento de los métodos moleculares, se ha logrado mayor diferenciación de los HMA; ocurriendo cambios en la sistemática de estos microorganismos como la reclasificación de los HMA del Phylum Zigomycota al Phylum Glomeromycota (8). Algunos estudios han demostrado que el uso de HMA asociadas a plantas en condiciones de suelo salinos permite que estos vegetales se adapten mejor a las condiciones. Estudios recientes reportan que la inoculación de HMA incrementa la tolerancia de las plantas a la salinidad. Las micorrizas incrementan la tolerancia de las plantas al pastoreo por animales herbívoros, por un incremento en el suministro de nutrientes a las plantas hospedero, los cuales estimulan el rebrote continuo de las pasturas después de las defoliaciones hechas (9). Teniendo en cuenta las bondades de esta simbiosis multifuncional natural con HMA y que en la actualidad a nivel de microbiología del suelo en la costa norte colombiana, no existen estudios sobre esta especie de pasto y su asociación con estos microorganismos, en condición de suelo salinos, el presente estudio tuvo como objetivo aislar los diferentes géneros de hongos formadores de micorrizas arbusculares nativas asociadas con la especie de pasto Angleton en el municipio de Tolú y su relación con las diferentes zonas agrológicas.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización. El muestreo se llevó a cabo en 35 fincas ganaderas establecidas con el pasto Angleton del municipio de Tolú, correspondiente a dos zonas agrológicas ubicadas según la clasificación de las tierras por su capacidad de uso en las subclases IIIsc y IVsc-Vhs (Tabla 1). Tabla 1. Numero de corregimiento agrológicas muestreadas.

por

zonas

Corregimientos

Zonas agrologicas (subclases)

Cabecera Municipal

Zona 1 (subclase IIIsc)

Puerto Viejo

Zona 1 (subclase IIIsc)

Santa Lucía

Zona 1 (subclase IIIsc)

Límites Coveñas

Zona 1 (subclase IIIsc)

Nueva Era

Zona 1 (subclase IIIsc)

Pita En Medio

Zona 1 (subclase IIIsc)

Pita Abajo

Zona 2 (subclase IVsc - Vhs)

El municipio de Tolú hace parte de la subregión llanura costera aluvial o del Golfo del Morrosquillo, se encuentra ubicado al noreste del departamento de Sucre, tiene una extensión de 35750 ha con 45 Km de costa, ubicado a una altura que oscila entre 0 y 10 msnm, precipitación promedio anual de 900 a 1200 mm. La estación de lluvias va desde finales de abril hasta finales de noviembre, con algunas disminuciones sustanciales entre junio y agosto, denominado veranillo de San Juan, la época seca tiene duración aproximada de 5 meses (diciembre – abril) presentándose los vientos más fuertes con predominio de las direcciones del norte y noreste. La actividad ganadera está concentrada en un relieve de llanura fluviomarina, caracterizada por extensiones planas con desniveles pequeños y pendientes suaves, menores del 3% y relieve de vallecitos que corresponden a áreas estrechas y alargadas en los cuales se depositan los materiales por aporte lateral o longitudinal. Muestreo. En cada finca se tomaron aleatoriamente varias submuestras (suelo y raíces) a una profundidad 0-20cm de las cuales se conformó una muestra de 2000 g. Las muestras se depositaron en bolsas plásticas rotuladas con el número de la finca, corregimiento, área sembrada con Angleton y fecha de recolección (Tabla 1.). Una vez colectadas se refrigeraron hasta su utilización. Procesamiento, aislamiento e identificación de morfotipos. Las muestras fueron tamizadas para separar suelos y raíces. Las muestras de suelo se utilizaron para realizar los siguientes análisis: aislamiento de las esporas de los HMA, conteo de esporas (esporas/100 g de suelo),

Pérez - Micorrizas arbusculares asociadas al pasto angletón identificación de morfotipos por forma, color y tamaño de las esporas, siguiendo la metodología reportada por Pérez y Vertel (10). Las esporas de los diferentes morfotipos aislados, fueron depositadas en cajas de Petri y posteriormente se observaron las características similares a HMA. Una vez realizado el proceso anterior, se procedió a la identificación de morfotipos de HMA, mediante el uso de técnicas descriptivas por ICCS y VAMF (11). Porcentaje de colonización. De las raíces separadas, se procedió a realizar un corte de aproximadamente 10 cm de longitud, las cuales fueron sometidas a técnicas de coloración. Después de la coloración, se colocaron paralelamente sobre láminas, se cubrieron con laminillas y se observaron con objetivo 40X, donde se realizó el conteo de 100 campos ordenadamente. En cada campo se determinó campos negativos y positivos. En los campos positivos se tuvo en cuenta el tipo de estructura presente (arbúsculos, vesículas, hifas y esporas). Los resultados obtenidos fueron expresados en porcentaje de colonización en raíces (10). Análisis estadístico. Los resultados obtenidos de número de esporas y el porcentaje de colonización en función del corregimiento por zonas agrológicas, fueron correlacionados utilizando análisis de ANOVA multifactorial realizados en el programa estadístico R (12).

RESULTADOS Densidad poblacional de esporas de micorrizas arbusculares. Los resultados del ANOVA multifactorial entre la variable número de esporas/100 g de suelo (densidad poblacional o esporulación) en función de los corregimientos por zonas, mostró diferencias altamente significativas (Tabla 2). Para visualizar Tabla 2. Anova multifactorial para densidad poblacional de HMA en función de corregimiento y zonas en el municipio de Tolú. zona 1 (C1: Cabecera Municipal, C2: Puerto Viejo, C3: Santa Lucía, C4: Límites Coveñas, C5: Nueva Era, C6: Pita En Medio. Zona 2(Pita abajo). C: corregimientos. Fuente

Suma de Cuadrado Gl Razón-F Cuadrados Medio

Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES A:Corregimientos 1.12493E7

2.24987E6

20.66

0.0000***

B:Zonas

1.37309E7

2.28849E6

21.01

0.0000***

RESIDUOS

9.47423E6

108899.

TOTAL (CORREGIDO)

3.06336E7

***: Altamente significativa al 95.0% de nivel de confianza

3365

los resultados anteriores, se realizó un gráfico exploratorio en box plot (Figura 1). Los resultados de este gráfico muestran que el corregimiento 7 (Pita Abajo) localizado en la zona agrológica 2 presentó el mayor número de esporas (1000±1800). Con respecto al corregimiento 3 (Santa Lucia) de la zona 1, donde se presentó el menor número de esporas (500±650). En este mismos gráfico se observa que todos los suelos de las fincas pertenecientes al corregimiento 6 (Pita en medio), presentaron los rangos más amplios de esporulación (500±1700).

Figura1. Densidad de esporas/100 g de suelo de HMA en función de corregimientos y zonas agroecológicas con pasto angletón: zona 1 (C1: Cabecera Municipal, C2: Puerto Viejo, C3: Santa Lucía, C4: Límites Coveñas, C5: Nueva Era, C6: Pita En Medio. Zona 2(Pita abajo). C: corregimientos.

En condiciones químicas y de salinidad (Tabla 3) de los suelos de las diferentes fincas ganaderas, pertenecientes al corregimiento Pita Bajo de la zona 1, en el momento del muestreo, se encontraron las mayores densidades de esporas (esporulación) de HMA, en relación al corregimiento 3 de la zona agrológica 1, donde se presentaron las menores cantidades de esporas. Diversidad de HMA. En las 35 fincas ganaderas analizadas, se identificaron 25 morfotipos con características similares (cf) a HMA (Tabla 4). Fue observado que el morfotipo correspondiente al número 3 (Gigaspora albida Schenck & Smith, 1982), morfotipo 14 (Glomus occultum Walker (1982)- Paraglomus occultum Morton & Redecker, 2001) y morfotipo 25 (Glomus etunicatum Becker & Gerdermann, 1977), fueron observados con mayor presencia en las diferentes muestras analizadas (datos no mostrados).Los resultados obtenidos señalan que el 92% de las especies encontradas correspondieron a características de hongos similares al género Glomus el 4% al género Gigaspora y el 4% restante a Paraglomus (Figura 2). Estos resultados evidencian que el género Glomus predomina y se adapta a las

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Tabla 3. Resultados de número de esporas (esporulación) y colonización de HMA, de acuerdo a análisis físicoquímico y de salinidad de los suelos. Análisis fiísico-químico

M.O.

Esporulación

4.6 ±6.25

3.36 ±5.8

26.3 ±87.5

% de Colonización

5.05 ±5.56

3.36 ±4.9

33.6 8.0 4.24 ±98.4 ±12.80 ±10.1

CIC

Esporulación

4.6 ±6.25

0.31 ±0.90

26.13 ±27.5

% de Colonización

5.05 ±5.56

0.32 17.36 ±2.50 ±31.63

Análisis de salinidad

4.6 4.22 0.28 ±21.9 ±13.44 ±0.56

0.2 ±0.81

3.5 1.5 0.08 ±28.0 ±24.17 ±0.88 7.5 ±7.0

2.4 ±8.67

0.02 ±0.18

CIC

0.52 23.14 0.40 ±1.01 ±33.61 ±1.60

Corregimiento

4.0 ±51.60

4.40 ±9.6

24.40 ±62.8

1.09 ±1.63

7 (Pita abajo)

0.40 17.26 0.80 20.4 ±1.51 ±31.63 ±1.60 ±106.80

4.40 ±9.6

35.60 1.38 6 (Pita en medio) ±117.3 ±1.86

CaCO3

SO4

PSI

0.03 ±0.05

1.2 ±4.0

3.0 ±58.0

0.68 ±10.42

1.9 ±9,99

7 (Pita abajo)

0.00

2.8 ±3.40

1.2 ±4.0

1.20 ±2.25

2.04 ±6.38

6 (Pita en medio)

Tabla 4. Morfotipos de HMA aislados de suelo rizosférico de pasto angletón, en finas ganaderas del municipio de Tolú No de morf.

Características similares (cf)

Cf Glomus aggregatum Schenck & Smith, 1985 (11)

Cf Glomus multicaule Gerdemann & Bakshi, 1976 (11)

Cf Gigaspora albida Schenck & Smith, 1982 (11)

Cf Glomus claroideum Schenck & Smith, 1982 (11)

Cf Glomus ambisporum Smith & Schenck, 1985. (11)

Cf Glomus leptotichum Schenck & Smith, 1982. (11)

Cf Glomus fulvum Trappe & Gerdemann, 1922 (11)

Glomus sp.

Cf Glomus boreale Trappe & Gerdemann, 1922 (11)

Glomus sp.

Cf Glomus invermayanum Hall, 1977 (11)

Cf Glomus maculosum Millar & Walker, 1986 (11)

Cf Glomus fecundisporum Schenck & Smith, 1982 (11)

Cf Glomus occultum Walker (1982) Paraglomus occultum Morton & Redecker, 2001 (11)

Cf Glomus fragilistratum Skou & Jakobsen, 1989 (11)

Cf Glomus geosporum Walker, 1982 (11)

Cf Glomus dimorphicum Boyetchko & Tewari, 1986. (11)

Cf Glomus radiatum Trappe & Gerdemann, 1974 (11)

Cf Glomus fasciculatum Walter & Koske, 1987 (11)

Cf Glomus diaphanum, Morton & Walker, 1984 (11)

Cf Glomus trimulares Koske & Halvorson, 1989. (11)

Sclerocystis sp (Glomus sp Morton & Redecker, 2001) (11)

Cf Glomus clarum Nicolson & Schenck, 1979 (11)

Glomus sp.

Cf Glomus etunicatum Becker & Gerdermann, 1977. (11)

Figura 2. Distribución porcentual de géneros de hongos formadores de micorrizas arbusculares asociados al pasto angletón en los siete corregimientos del municipio de Tolú.

morf. = morfotipos

condiciones edafoclimáticas del municipio de Tolú establecidas con pasto Angleton. En las figuras 3 y 4 se observan los 25 morfotipos de HMA encontrados e identificados mediante el uso de manuales taxonómicos para micorrizas, en los suelos de las fincas ganaderas estudiadas.

Figura 3. Morfotipos de hongos formadores de micorrizas arbusculares en rizósfera de suelo de fincas ganaderas del municipio de Tolú. 1-12: morfotipos de HMA identificados. Los números de los morfotipos corresponden a la clasificación realizada en la tabla 2. Fuente: Peroza (2).

Pérez - Micorrizas arbusculares asociadas al pasto angletón

Figura 4. Morfotipos de hongos formadores de micorrizas arbusculares en rizósfera de suelo de fincas ganaderas del municipio de Tolú. 13-25: morfotipos de HMA identificados. Los números de los morfotipos corresponden a la clasificación realizada en la tabla 2. Fuente: Peroza (2).

Porcentaje de colonización en raíces. La tabla 5, reporta los resultados obtenidos en el ANOVA multifactorial entre el porcentaje de colonización de HMA en raíces del pasto Angleton con relación a las variables corregimientos y zonas. Se observa además, que existen diferencias altamente significativas entre el porcentaje colonización y las variable corregimiento (p-value: 0.0019) y zonas (p-value: 0.0017). La figura 5 muestra las diferencias encontradas a través del gráfico exploratorio box plot entre colonización y las variables analizadas. El grafico señala que las fincas ubicadas en el corregimiento de Pita en Medio (6), presentaron los mayores porcentajes de colonización de HMA (38±65 %) con respectos a las fincas del corregimiento Santa Lucia (3) en donde fueron encontrados los menores porcentajes de colonización (20±38%). Tabla 5. Anova multifactorial para el porcentaje de colonización de HMA en función a corregimiento y zonas en el municipio de Tolú. zona 1 (C1: Cabecera Municipal, C2: Puerto Viejo, C3: Santa Lucía, C4: Límites Coveñas, C5: Nueva Era, C6: Pita En Medio. Zona 2(Pita abajo). C: corregimientos. Fuente

Suma de Cuadrado Gl Razón-F Cuadrados Medio

Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES A:Corregimientos

3969.02

793.804

4.19

0.0019***

B:Zonas

4442.01

740.335

3.91

0.0017***

RESIDUOS

16487.9

189.516

TOTAL (CORREGIDO)

23834.7

***: Altamente significativa al 95.0% de nivel de confianza

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Figura 5. Porcentaje de colonización de hongos formadores de micorrizas arbusculares en raíces de Angleton (Dichanthium aristatum Benth) en función a corregimientos y zonas. zona 1 (C1: Cabecera Municipal, C2: Puerto Viejo, C3: Santa Lucía, C4: Límites Coveñas, C5: Nueva Era, C6: Pita En Medio. Zona 2(Pita abajo). C: corregimientos.

Los resultados mostrados en la tabla 3, indican que los mayores porcentajes de colonización observados en raíces del pasto Angleton fueron encontrados en las condiciones químicas y de salinidad de los suelos presentados por las diferentes fincas ganaderas, pertenecientes al corregimiento Pita en el momento del muestreo.

DISCUSIÓN De los 25 aislamientos encontrados, el género Glomus mostró la mayor presencia en los suelos; estudios realizados (10) con la especie de pasto Colosoana en condiciones de edafoclimatica de los suelos de fincas ganaderas del municipio de Corozal también reportaron un alto número de especies del género Glomus, lo que indica que en el departamento de Sucre, este es el predominante. Dentro del género Glomus, la especie de Glomus etunicatum mostró mayor presencia en las diferentes muestras analizadas en condiciones del municipio de Tolú. Estudios realizado en Brasil con el pasto Brachiaria decumbens, inoculado con la especie G. etunicatum, en suelos conteniendo diferentes niveles de cloruro de sodio, mostraron que la colonización y el número de esporas de G. etunicatum, no fue afectado por incrementos en los niveles de cloruro de sodio aplicados al suelo, lo que sugiere que podría ser una especie adaptada y resistente a esta condición (13). Otra especie con mayor abundancia correspondió a Gigaspora albida, aislada en los suelos de fincas ganaderas donde predominó la textura franco arenoso. También se observó mayor presencia de esporas de HMA del género Gigaspora en suelos de fincas ganaderas en el municipio de Tolú donde se reportó predomino de texturas arenosas (2).

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Estudios específicos sobre la presencia de HMA en suelos salinos en Colombia son escasos y poco conclusivos con relación a la influencia de parámetros físicos-químicos y la salinidad sobre el colonización in situ de HMA, asociados a la rizósfera y raíces del pasto Angleton. Lo anterior hace difícil la comparación de los resultados obtenidos en este estudio; sin embargo los resultados obtenidos son bajos para el número de esporas y porcentaje de colonización de HMA en raíces de Angleton para las fincas ubicadas en el corregimiento de Santa Lucia (3) en las condiciones físico-químicas y de salinidad presentados en el momento del muestreo y los mayores valores para número de espora y porcentajes de colonización se encontraron en el corregimiento de Pita Abajo (7) y Pita en Medio (6), respectivamente. Las fincas ubicadas en el corregimiento de Santa Lucía, presentaron de acuerdo a los resultados de los análisis físicos-químicos de los suelos, pH de muy ácido a fuertemente ácido, valores moderados a adecuado de materia orgánica, fósforo de alto a muy alto, valores muy altos de hierro, cobre zinc y manganeso y valores bajos a muy alto de calcio, contenidos adecuados a valores altos de potasio y magnesio y contenidos moderados de sodio. Los análisis de salinidad de los suelos mostraron valores de pH de medianamente ácido a ligeramente básico, valores de conductividad eléctrica (CE) no salino y salinidad del suelo de acuerdo con el porcentaje de sodio intercambiable (PSI) y la CE normal. El corregimiento de Pita Abajo presentó los mayores porcentajes de colonización en raíz; mientras que el de Pita en Medio mostró las mayores densidades de esporas en el suelo, presentando las siguientes características físico-químicas y de salinidad, respectivamente: pH de muy fuertemente ácido a fuertemente ácido, contenidos moderados a adecuado de materia orgánica, fósforo de contenidos adecuados a alto, valores muy altos de hierro, cobre y zinc, contenidos moderados a alto de calcio, magnesio y potasio, sodio de contenidos moderados a altos. Los análisis de salinidad de los suelos mostraron valores de pH de fuertemente ácido a ligeramente básico, valores de conductividad eléctrica (CE) no salino y salinidad del suelo de acuerdo porcentaje de sodio intercambiable (PSI) y la CE normal para la zona 6 y para la zona 7, pH de muy fuertemente ácido a ligeramente ácido, contenidos moderados a adecuado de materia orgánica, fósforo de contenidos adecuados a alto, valores muy alto de hierro, cobre zinc y manganeso y valores deficientes a muy alto de calcio, contenidos adecuados a valores altos de potasio y magnesio y sodio de

contenidos moderados a altos. Los análisis de salinidad de los suelos mostraron valores de pH de fuertemente ácido a medianamente alcalino, valores de conductividad eléctrica (CE) no salino y salinidad del suelo de acuerdo al porcentaje de sodio intercambiable (PSI) y la CE normal. Modelos matemáticos construidos para evaluar la densidad poblacional de esporas de HMA en suelos de fincas ganaderas del municipio de Tolú en función de parámetros físicos-químicos, indican que el mayor número de esporas de HMA en los suelos, está directamente relacionado con la concentración de los elementos intercambiables como magnesio (Mg), sodio (Na) y de valores de densidad aparente (Da) e inversamente relacionado con los valores de Cobre (Cu) y Manganeso (Mn) y los modelos construidos para predecir el número de esporas en función de la salinidad, muestra que esta interfiere directamente con la esporulación en presencia de las variables pH, magnesio (Mg), sodio (Na), sulfato (SO4), porcentaje de sodio intercambiable (PSI) y el porcentaje de sodio en partes por mil (S/00) e inversamente proporcional a la conductividad eléctrica (CEE) (14). Modelos matemáticos construidos para predecir la colonización de HMA en raíces de Angleton, señalan que las variables que están directamente relacionadas son los valores de los elementos intercambiables de potasio (K) y sodio (Na), de zinc (Zn) y del porcentaje de hidrógeno en los suelos y son inversamente proporcionales a los valores de los elementos de Ca y Mg intercambiable. De otra parte se encontró mediante modelos matemáticos que la salinidad interfiere con la colonización de HMA en raíces de Angleton, en presencia del elemento calcio intercambiable y de los valores de PSI e inversamente a los valores del elemento Magnesio intercambiables y de bicarbonato (HCO3) (14). Estudios realizados en Colombia sobre el establecimiento de los HMA en condiciones naturales han demostrado que estos procesos biológicos están determinados por condiciones tales como: factores físico-químicos del suelo (pH, contenido de fósforo, temperatura, aireación, textura y contenido de materia orgánica), condiciones climáticas y por las prácticas agronómicas (10). Sin embargo, aun faltan más estudios que permitan evaluar in situ, la esporulación de hongos formadores de micorrizas arbusculares asociadas a pasturas de importancia económica para la Región Caribe colombiana en diferentes agroecosistemas y en condiciones de salinidad.

Pérez - Micorrizas arbusculares asociadas al pasto angletón

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3370-3378, 2013. ORIGINAL

Caracterización del sacrificio de corderos de pelo a partir de cruces con razas criollas colombianas Slaughter characterization of hair lambs from crosses with Colombian landraces William Albarracín H,1,3* Ph.D, Iván Sánchez B,2,3 M.Sc. Universidad Nacional de Colombia, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos (ICTA). Bogotá D.C., Colombia. 2Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Medellín, Colombia. 3Universidad Nacional de Colombia, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos, Grupo de investigación Aseguramiento de la calidad de Alimentos y desarrollo de nuevos productos. *Correspondencia: walbarracính@unal.edu.co. 1

Recibido: Marzo de 2011; Aceptado: Junio de 2012.

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto genético del cruce de corderos Dorper con razas criollas colombianas, tiempo de ayuno y aturdimiento sobre los rendimientos del sacrificio; niveles de glucosa como medida de estrés y pH como calidad de la canal. Materiales y métodos. Se emplearon 60 corderos raza Dorper X criollo criados en pastoreo y semi-estabulación con 10 semanas de edad. Se aplicaron 3 tiempos de ayuno (6, 12 y 18 horas) y 2 métodos de aturdimiento (electronarcosis y perno cautivo penetrante), evaluando los rendimientos de canal por pesaje de canales; glucosa en muestras antemortem y postmortem. Resultados. Los resultados obtenidos mostraron que el efecto combinado de ayuno y sistema de cría influencian los rendimientos de canal y subproductos. A tiempos prolongados de ayuno se aumenta la concentración de glucosa en sangre, aunque el tiempo de ayuno incide sobre el pH último. El efecto del aturdimiento, solo se presenta en el cambio de pH durante 24 horas, siendo un efecto de estimulación eléctrica por parte de la electronarcosis. Los animales de raza Dorper x criollo criados en sistema de pastoreo, presentaron mejores rendimientos en canal, pero menores porcentajes de vísceras blancas y rojas. Conclusiones. El porcentaje medio de rendimiento en canal es similar a los presentados en razas puras Dorper siendo viable y comparable este tipo de cruce. Palabras clave: Carne, glucosa, ovinos, pH, sacrificio (Fuente:CAB).

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ABSTRACT Objective. Evaluate the genetic effect of Dorper lambs crosses with Colombian landraces, fasting time and stunning in slaughter yields, blood glucose levels as a measure of stress and pH as carcass quality. Materials and methods. 60 Dorper lambs crosses with Colombian landraces feeding under grazing and semi-feedlot systems, 10 weeks old were used. 3 fasting times (6, 12 and 18 hours) and 2 stunning methods (electrical stunning and penetrating captive bolt) were applied, evaluating yield of carcasses by weighting, glucose antemortem and postmortem samples. Results. The results showed that the combined effect of fasting and breeding systems affects the carcass and by-products yields. At long fasting times, the concentration of blood glucose is increased, although the fasting time affects the ultimate pH. The stunning effect only occurs in the change of pH for 24 hours, with an effect of electrical stimulation by the electrical stunning. Animals Dorper crosses with Colombian landraces breeding in grazing system showed better carcass yields, but lower percentages of white and red viscera. Conclusions. The carcasses average yield is similar in pure Dorper breeds be viable and comparable this crossing. Key words: Glucose, meat, pH, sheep, slaughter (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN Para el año de 2011, Colombia cuenta con una población cercana a 1.5 millones de cabezas de ovinos (1), sin embargo el consumo per capita anual de carne de ovinos es superada por pollo, bovino y porcino en cerca de 10 kg, debido a que su cadena productiva no está desarrollada y no se cuenta con establecimientos autorizados para el sacrificio de esta especie, pese a tener un potencial exportador hacia algunos países del Caribe (2). Con la normatividad colombiana legal vigente, donde se hace énfasis en las buenas prácticas de sacrificio y el bienestar animal se hace necesario establecer las condiciones de sacrificio y protocolos adecuados para las razas presentes en el país. El sacrificio de un animal es la muerte profesional e indolora del mismo destinado para el consumo humano (3), con operaciones de descanso, aturdimiento y desangrado adecuados, donde el animal sea expuesto un nivel bajo de estrés haciendo humanitaria su muerte (4). El transporte y descanso de los animales son los factores que más afectan la presencia estrés en el animal (5), siendo las concentraciones de glucosa, cortisol y catecolaminas (adrenalina y noradrenalina) la respuesta a estas alteraciones (6); el ayuno es un factor que permite adaptar al animal frente a las alteraciones dadas por el transporte y permitir que haya una estabilización en las variables sanguíneas (7). Los niveles de glucosa plasmática han mostrado ser la mejor respuesta a las alteraciones por el ayuno según el proceso de glicogénesis de cada variable genética y la absorción de nutrientes (8). Algunos autores también han señalado la existencia de un relación entre el manejo antemortem de animales y calidad de la carne (9).

Varios estudios han mostrado la necesidad de un aturdimiento encaminado a establecer inconsciencia en el animal y reducir la percepción de dolor y angustia empleando aturdimiento con corriente o electronarcosis (10), perno cautivo penetrante e inhalación de CO2 (11) resaltando su eficiencia en la evaluación de rendimientos de procesos y calidad de la carne (12); no obstante la apreciación de la eficacia del aturdimiento es subjetiva a evaluar respuestas a estímulos musculares (13) y a respuesta en los niveles de glucosa sin encontrar diferencias entre los tipos de aturdimiento (8,14). Varios factores tienen influencia en la calidad de la carne como la especie, el sexo, la raza, el genotipo, y ambientales como el tipo y el nivel de alimentación, vivienda, tratamiento antemortem y el manejo postmortem en cuanto a la velocidad de enfriamiento y maduración (15), La producción de carne ovina con base al uso del macho de razas productoras de carne, con cruzamientos con razas locales es una alternativa que ha funcionado bien en países como Australia, Nueva Zelanda y el Reino unido; no se ha encontrado evidencias que permita caracterizar el producto carne y el efecto racial sobre la calidad de la carne (16). Las diferencias entre los tipos genéticos en parámetros productivos como velocidades de crecimiento, rendimientos y conformación, hacen necesario el uso de razas especializadas en la producción de carne, mostrando también que el cruce ayuda con un aumento en el peso al momento del sacrificio (17).

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Hay una tendencia al sacrificio de corderos a una edad más joven debido a que la canal tiene cortes como las piernas y lomos con menor contenido graso y su palatabilidad es mayor que en animales más viejos, pese a obtener rendimientos y pesos de canales inferiores (18); el uso de corderos lactantes a partir de cruces a un peso aproximado de 15 kg muestran buenos efectos en componentes corporales para una comercialización sin afectar el rendimiento (19). Por otra parte el efecto del sistema de alimentación se da no solo en el rendimiento de la canal; los efectos del sistema de pastoreo y semiestabulado, afectan el grado de engrasamiento del animal y por ende, la calidad de la canal. El sistema de alimentación artificial (semi estabulado) comparado con el sistema de pastoreo, permite una mejora en los rendimientos y variables fisicoquímicas de la carne, aunque estos efectos sólo se manifiestan a los 56 días de edad. Por lo tanto, este sistema de alimentación debe ser conveniente para obtener animales más pesados para el sacrificio, aumentando las rentabilidad a partir de los pesos de levante y sacrificio (20). No obstante, en animales de tan corta edad y bajo peso, los efectos de raza, sexo o peso pueden llegar a ser detectados en una evaluación de la canal (21). El pH, es el resultado de los cambios bioquímicos en el rigor mortis y la maduración, donde el pH final se conoce como el pH a las 24 horas del sacrificio (22). El rigor mortis dura entre 12 y 24 horas en ovinos, mostrando una disminución desde valores cercanos a 7.7 hasta 5.5, sin presentar defectos característicos como los presentados en carnes PSE (pálidas, suaves y exudativas) o DFD (oscuras, firmes, secas); la estabilidad durante la refrigeración y desde las 24 horas posteriores al sacrificio se da en torno a pH de 5.5 y 5.7. Entre los factores importantes que afectan esta variación están la raza, el sistema de producción donde los animales criados en pradera presentan menor potencial gligolítico definido como la capacidad de obtener energía rápidamente y una menor reserva de glucógeno, también, la presencia de estrés por el manejo de los animales, transporte, aturdimiento, y en menor medida, el efecto del sexo, almacenamiento, oreo, dieta, edad y peso de sacrificio. Se encuentra bastante relacionado el pH con la capacidad de retención de agua de la canal y factores fisicoquímicos como textura, olor y composición, que afectan directamente la calidad de la carne (9,23). No obstante, el pH no se puede predecir en función de la glucosa sanguínea pero puede indicar la efectividad del ayuno y su respuesta al estrés (24).

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto genético del cruce de corderos Dorper con razas criollas colombianas, tiempo de ayuno y aturdimiento sobre los rendimientos del sacrificio, niveles de glucosa como medida de estrés y pH como calidad de la canal.

MATERIALES Y MÉTODOS Animales de estudio. Para este experimento, se emplearon 60 corderos de 10 semanas de cruces de ovinos Dorper X criollo pertenecientes a 2 fincas, una aplicando sistema de pastoreo (n=30) y otra el sistema semiestabulado (n=30); los 60 animales se distribuyeron 3 grupos con un ayuno de 6, 12 y 18 horas respectivamente. En cada grupo de ayuno, 5 animales fueron aturdidos mediante electronarcosis y los 5 restantes fueron aturdidos por medio de un perno cautivo penetrante. Sacrificio. El sacrificio de los animales se desarrolló en la planta de sacrificio del Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos (ICTA) durante 6 días, donde en cada día, fueron sacrificados 10 corderos. Los animales durante su ayuno solamente tuvieron acceso a agua según los tiempos de ayuno descritos en la sección anterior. El aturdimiento mediante electronarcosis se realizó por aplicación de electrodos con corriente alterna de 0.9 A y 250 V (25) entre el ojo y la oreja en ambos lados de la cabeza, previamente humedecidos con solución salina durante 6 segundos; el aturdimiento con perno cautivo se localizó en la línea media detrás de la cresta entre los cuernos, apuntando hacia la base de la lengua. 30 seg después del aturdimiento los animales fueron izados de las 2 piernas y desangrados por corte parcial de vena cava superior y la arteria carótida derecha. Posteriormente, fueron desollados y eviscerados manualmente. Los despojos del sacrificio fueron embolsados, pesados y registrados. Las canales de los corderos fueron lavadas con agua potable y dejados en oreo por 2 h, posteriormente pesadas, envueltas en bolsas de polietileno y refrigeradas durante 7 días a 4°C, con pesado a los días 4 y 7 de refrigeración. pH. La medición de pH se realizó con un equipo portátil de sonda de punción Hanna® en el lomo del animal y la paleta izquierda. La medición se realizó inmediatamente después de lavadas las canales y cada 2 h durante 1 día. La medición de 24 h se define como pH último (22). Niveles de glucosa. Se tomaron 10 mL de muestras de sangre de los animales recién llegados a la planta de sacrificio en los corrales

Albarracín - Caracterización sacrificio de corderos a partir de cruces con razas criollas 3373 (post transporte) y durante el desangrado en la sala de sacrificio (post sacrificio). Cada muestra fue llevada al laboratorio clínico de la facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia, donde fueron centrifugadas tomando alícuotas de plasma y posteriormente se determinó glucosa por el método de glucosa oxidasa con medición de la absorbancia a 505 nm y reportado en mmol/L (14). Análisis estadístico. Los datos obtenidos fueron analizados estadísticamente por medio de un análisis de la varianza multifactorial (ANOVA) utilizando el paquete estadístico Statgraphics Centurion XV (Statistical Graphics Corp., U.S.A.), realizando una prueba de rangos múltiples mediante el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher y de múltiples interacciones a una significancia (p<0.05).

RESULTADOS En la figura 1 se presentan las pérdidas de peso durante el descanso y ayuno en los corrales, para animales procedentes de cruces de corderos Dorper con razas criollas colombianas.

Los niveles de glucosa en sangre posteriores al transporte y el aturdimiento respecto al tiempo de ayuno, se presentan en la figura 2.

Figura 2. Niveles de glucosa en sangre para 6, 12 y 18 horas de ayuno.

Para este parámetro se encontró que el tiempo de ayuno es el único factor significativo sobre los niveles de glucosa en los animales. En las mediciones posteriores al transporte no se presentaron diferencias significativas, mostrando la homogeneidad a la respuesta por el estrés durante el transporte. Las diferencias se presentaron entre 6 y 18 horas de ayuno (p<0.05) y una tendencia de aumento a tiempos prolongados de ayuno. En la figura 3 se presentan los resultados del porcentaje de canal o rendimiento de canal en caliente

Figura 1. Perdidas de peso durante el descanso y el tiempo de ayuno por el sistema de cría.

Se observó que el tiempo de ayuno y el sistema de cría son los factores que influencian la pérdida de peso en los corrales de descanso (Figura 1), encontrándose en general un aumento en la pérdida de peso con mayores tiempos de ayuno, para los dos sistemas de cría, encontrándose diferencias estadísticamente significativas entre las 6 y 12 horas de ayuno (p<0.05); mientras que entre las 12 y 18 horas de ayuno no se presentaron diferencias (p<0.05). Para 6 horas de ayuno, la respuesta de los animales criados en sistema semiestabulado frente a la pérdida de peso fue menor que los criados en pastoreo (p<0.05). A las 12 y 18 horas de ayuno no hubo diferencias entre los dos sistemas de cría manteniéndose en valores cercanos a 1.6 kg.

Figura 3. Rendimiento de canal en caliente para los sistemas de cría y los tiempos de ayuno evaluados.

Se encontró que los factores de sistema de cría y tiempo de ayuno, son los factores estadísticamente significativos sobre este rendimiento. En general, a mayores tiempos de ayuno hay mayores porcentajes de la canal; este factor afecta el balance general de los rendimientos, debido a que al disminuir el porcentaje de vísceras blancas, la base de cálculo que es el peso antemortem, se ve

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modificado. Respecto a los sistemas de cría, los rendimientos de canal son estadísticamente mayores en los animales criados en sistema de pastoreo (p<0.05). Los mayores rendimientos de canal se presentaron con animales criados en pastoreo y con ayunos de 12 y 18 horas, en donde este último factor no presentó diferencias significativas (p>0.05) Los porcentajes de los despojos de los animales sacrificados en el estudio se presentan en la tabla 1. Tabla 1. Relación del porcentajes del despojos del sacrificio. Pastoreo

Semiestabulado

Ayuno

12 h

18 h

12 h

18 h

Patas

2.37

2.64

2.76

2.43

2.58

2.31

Piel

6.78

7.47

7.89

8.44

6.94

7.16

Cabeza

5.72

6.03

5.47

5.61

5.83

5.86

27.03a

25.33

23.45a

24.29b

23.72

22.91b

4.43c

4.99c

4.53c

5.49c

4.18c

5.32c

Vis. Blanca Vis. Roja

Figura 4. Perdidas de peso por almacenamiento debido al ayuno y el sistema de cría.

a,b,c. Diferencias estadísticamente significativas entre las mismas letras a (p<0.05).

Para los animales de experimentación de sacrificio no hubo diferencias significativas (p>0.05) en cuanto a las partes de conformación como lo son las patas, piel y cabeza debido a la homogeneidad en la edad de los animales, este resultado implica también que no hay un efecto por el sistema de cría, ayuno o tipo de aturdimiento. En cuanto al porcentaje de vísceras blancas, se evidenciaron diferencias estadísticamente significativas entre los dos sistemas de cría (p<0.05), siendo mayores en los animales criados en pastoreo; a su vez, hubo un efecto entre los tiempos de ayuno en ambos sistemas de cría, en los cuales, a mayor tiempo de ayuno el porcentaje de vísceras blancas disminuye, siendo estadísticamente significativo entre 6 y 18 horas (p<0.05). El porcentaje de vísceras rojas mostró diferencias debido al sistema de cría, con mayores porcentajes en el sistema de cría semiestabulado. En la figura 4 se encuentran las perdidas por almacenamiento durante 7 días a 4°C representadas como porcentaje de la canal caliente. El sistema de cría y el tiempo de ayuno son los factores estadísticamente significativos en el porcentaje de perdidas por almacenamiento (p<0.05). En general se observaron mayores pérdidas a tiempos de ayunos prolongados, donde las diferencias estadísticas se encontraron entre las 6 y 18 horas. Para cada tiempo de ayuno hay mayores pérdidas en los animales

criados en sistema de pastoreo respecto al sistema semiestabulado (p<0.05). Es importante mencionar que no se evidenció efecto debido al sistema de aturdimiento sobre las mermas durante el almacenamiento en frio. La disminución del pH entre el tiempo transcurrido de las 2 y 24 horas posteriores al sacrificio se presenta en la figura 5 como la diferencia ∆pH entre los valores de pH a 2 horas – pH último.

Figura 5. Cambio de pH (∆pH) entre 2 y 24 horas posteriores al sacrificio, para el aturdimiento mediante electronarcosis y perno cautivo.

El aturdimiento y el ayuno tuvieron un efecto significativo en este descenso. Para los animales aturdidos mediante electronarcosis, no se presentaron diferencias a los diferentes tiempos de ayunos (p>0.05), con una variación cercana a 0.66 unidades de pH. Para el aturdimiento por perno cautivo, el cambio en el pH, desciende a medida que el tiempo de ayuno es mayor, encontrándose diferencias entre 6 y 18 horas de ayuno (p<0.05) en los animales aturdidos por perno cautivo. Los valores del cambio de pH en los animales con 12 y 18 horas de ayuno y aturdimiento con perno cautivo no presentaron diferencias con los valores registrados en animales aturdidos por electronarcosis (p>0.05).

Albarracín - Caracterización sacrificio de corderos a partir de cruces con razas criollas 3375 En la figura 6 se presentan los valores de pH último respecto a los tiempos de ayuno evaluados en la experimentación.

Figura 6. pH último de las canales, en función del tiempo de ayuno.

El ayuno es el único factor que afecta estadísticamente el pH último; solamente se presentaron diferencias entre las 6 y 12 horas de ayuno (p<0.05) y entre las 6 y 18 horas de ayuno (p<0.05).

DISCUSIÓN Los resultados presentados en la Figura 1, sugieren un efecto del sistema de cría y tiempo de ayuno, existiendo diferencias de peso entre el sistema de pastoreo y semi estabulado para 6 horas de ayuno. Ferguson y Warner (26), sugieren que las pérdidas de peso se hacen evidentes entre las primeras 12 horas por la falta de agua y comida, lo cual se evidenció en el presente estudio, donde posterior a las 12 horas no se presentaron diferencias entre los sistemas de cría. Los resultados obtenidos en el presente estudio respecto a los niveles de glucosa en sangre (Figura 2), donde no se encontraron diferencias en los niveles de este compuesto, posterior al transporte, pueden ser debidos a los factores de manejo previo (7,27) y su homogeneidad en la reproducibilidad en estas actividades. Miranda de la Lama et al (7), recomiendan que 9 horas son necesarias para que el cortisol y la glucosa se regulen, pero la respuesta a la homeostasis se puede dar a 24 horas posteriores a la alimentación y puede ser más lenta en adultos (28). Para los animales criados en sistema de pastoreo, resulta un factor estresante la presencia de humanos, aumentando los valores de cortisol y glucosa (29).

En la figura 2 se observó la evolución de la glucosa post-aturdimiento con niveles elevados a través del tiempo, efecto que pudo ser debido a una inhibición de la utilización de la glucosa por la acción del cortisol; se ha reportado que el ayuno está acompañado de una hipoglicemia que actúa sobre la liberación de catecolaminas, estas a su vez, inciden en la producción energética a través de procesos de lipólisis, glucogenólisis y gluconeogénesis para satisfacer la demanda de glucosa en el citoesqueleto y el cerebro (26). Pero, como se mencionó anteriormente el efecto de la homeostasis se puede dar a las 24 horas, y el consumo de glucosa debido al tiempo de ayuno se puede presentar a tiempos superiores a los evaluados en este estudio, conllevando a una disminución de su concentración de acuerdo a lo evidenciado en novillos por Tadich et al (14). Así mismo periodos largos de descanso son necesarios para que los niveles de cortisol se repongan sin presentar defectos posteriores en la carne (29). El trasporte y el ayuno per se no tiene efecto directo en los porcentajes de la canal caliente. Los resultados obtenidos, (variación de rendimientos en canal respecto al ayuno, Figura 3), se deben a un cambio en la base de cálculo del peso antemortem. No obstante, Ferguson y Warner (26), mencionaron que las pérdidas de peso en la canal debido al ayuno se hacen evidentes a tiempos superiores a las 24 horas. Para los animales analizados en el presente estudio se encontró que hubo mayores rendimientos en las canales de los animales criados en sistema de pastoreo que en el estabulado, contrario a lo presentado por otros autores (30-32), donde se evidenciaron mayores rendimientos en sistema de suplementación o estabulados. La eficiencia del cruzamiento con las razas criollas colombianas respecto a los porcentajes de canal donde se mantienen cercanos al 50% (Figura 3) es comparable con el porcentaje de rendimiento en canal medio para razas puras Dorper (34); Burke y Apple (31) evidenciaron que las razas de pelo (Dorper, Catahdin, entre otras) no presentaron mayores diferencias en estos rendimientos, al igual que el cruce de raza Merino con mestizajes franceses (32), permitiendo inferir que los cruces de razas especializadas en carne con mestizajes colombianos, pueden proveer buenos rendimientos a edades tempranas aunque con menores tamaños del animal al alcanzar su madurez fisiológica. En los rendimientos de los subproductos del sacrificio presentados en la tabla 1, las diferencias significativas en los porcentajes de vísceras blancas se deben a los factores de sistema de cría y el ayuno. Lo anterior concuerda con lo

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observado por Joy et al (30), quienes observaron que los animales en pastoreo presentaron mayores porcentajes de vísceras blancas a ayunos cortos, indicando menor transformación del alimento y mayor acumulación en los estómagos; en comparación de sus resultados con variación en la dieta (suplementación), donde el efecto de la maduración temprana aumentó el porcentaje de vísceras rojas, hecho que también fue evidenciado en el presente estudio. Las mediciones del peso de las canales a los 4 días de almacenamiento a 4°C, mostraron que el efecto del sistema de cría incide en las perdidas por almacenamiento o driploss (Figura 4). Este efecto está relacionado con la perdida de la capacidad de retención de agua y es función de la variación de pH, no obstante en la Figura 5 no se evidencia un efecto debido al sistema de cría sobre los valores de pH, por lo cual se puede inferir que la conformación y contenido muscular en animales de pastoreo, presentó mayores pérdidas y por ende menor rentabilidad en la comercialización. Los resultados presentados en la figura 5, muestran que el cambio de pH por efecto de la electronarcosis no presenta diferencias significativas, esto se puede atribuir al efecto de estimulación que recibe el animal cuando recibe la descarga eléctrica. No obstante, lo presentado anteriormente respecto a la influencia del ayuno sobre el estrés del animal, indica que el descenso está ligado a las reservas de glucógeno que presenta el animal, por lo cual se puede explicar el comportamiento del tiempo de ayuno cuando fueron aturdidos por el perno cautivo. Al comparar las figuras 2 y 5 se puede inferir que la demanda de glucosa está ligada al cambio de pH, presentando mayores cambios cuando hay menores concentraciones de glucosa en sangre, pero los valores de pH ultimo (Figura 6) muestran que el efecto de ayuno es incidente solo hasta las 6 horas de ayuno, efecto consistente con la disponibilidad de glucosa y bloqueo por efecto del cortisol para ser utilizado en la producción de energía y consecuentemente en la producción de acido láctico.

Hay que aclarar que los valores de pH cercanos a 6 obtenidos en las canales empleadas en el presente estudio, indicarían un defecto en la calidad de la canal, pero de acuerdo con las pérdidas de peso por almacenamiento (Figura 4), este factor no representa una alta significancia. Devine et al (33) encontraron que animales con tiempos de recuperación menores a 3 días presentaron pH superiores a 5.7 y con tiempos de 10 días el 8% de los animales mostraron valores superiores a 5.8; sugieren que para carnes con pH superiores a este 5.8 es necesario un tiempo de maduración para obtener fuerzas de corte menores y recomiendan que valores intermedios de pH entre 5.7 y 5.8 se pueden alcanzar por medio de una estimulación eléctrica para no tener problemas con la terneza de la carne a 72 horas del sacrificio. Adicionalmente, el pH último no se vió afectado por el sistema de alimentación al igual que lo encontrado por Carrasco et al (29), donde la presencia de humanos durante el pastoreo resultaría estresante y por consiguiente presentaría menores descensos en el pH a las 24 horas del sacrificio, lo cual tampoco se evidenció. En conclusión, el efecto combinado de ayuno y sistema de cría influyen en los rendimientos tanto de la canal y sus despojos, la concentración de glucosa en sangre y la disminución del pH en la canal. Las combinaciones de tiempo de ayuno y sistema de cría para los cruces de raza Dorper X criollo permiten disminuir el efecto estresante del animal al momento del sacrificio y aumentar los rendimientos del sacrificio sin afectar la calidad de la canal. Agradecimientos A la Dirección de investigación DIB de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá, por financiar este trabajo y al criadero de ovinos la Primavera por su asistencia y apoyo con los animales del estudio.

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3379-3386, 2013. ORIGINAL

Expresión de enzimas relacionadas con el metabolismo de glucocorticoides en tejidos ováricos bovinos Expression of enzymes related with the metabolism of the glucocorticoids in bovine ovarian tissue Michael López C,1* MVZ, Ayelen Amweg,2 Lic. en Biotec, Matías Stangaferro,2 MV, Hugo Ortega,2 Ph.D. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Tunja, Colombia. 2Universidad Nacional del Litoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Centro de Experimentaciones Biológicas y Bioterio, Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Esperanza – Santa Fe, Argentina. *Correspondencia: agame_el_coraire@hotmail. com. 1

Recibido: Marzo de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

RESUMEN Objetivo. Identificar la expresión de enzimas relacionadas con el metabolismo de glucocorticoides en tejidos ováricos bovinos. Materiales y métodos. Se obtuvieron muestras de tejidos provenientes de ovarios sanos (n=10) y con Enfermedad Quística Ovárica (COD) (n=10), a las cuales luego de su procesamiento histológico, se las incluyó en parafina. Mediante la técnica de inmunohistoquímica indirecta, se identificaron in situ en folículos primarios, secundarios, terciarios, atrésicos y quistes de las isoformas 1 y 2 de la enzima 11ß-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11βHSD) utilizando anticuerpos específicos. Resultados. La expresión de la enzima 11βHSD-1 presentó diferencias significativas únicamente en las células de la granulosa de los diferentes grupos foliculares. La enzima 11βHSD-2 mostró diferencias significativas con respecto a su expresión en las células de la granulosa de los folículos primarios comparada con los folículos secundarios y quísticos. En las células de la teca interna, esta diferencia se observó entre los folículos terciarios y los folículos atrésicos y quísticos. En las células de la teca externa, los folículos terciarios mostraron diferencias significativas en su expresión con respecto a los folículos atrésicos. Conclusiones. Se demostró la presencia de las isoformas tipo I y II de 11βHSD en tejidos ováricos bovinos obtenidos de frigorífico, lo que permite inferir la existencia de un mecanismo endocrino de regulación de la actividad de los glucocorticoides, que podría alterar el patrón normal de desarrollo folicular generando estructuras foliculares anovulatorias y/o quistes foliculares, y al mismo tiempo anestro y otras alteraciones reproductivas en bovinos. Palabras clave: Bovinos, cortisol, Estrés, inmunohistoquímica, quistes foliculares (Fuente:CAB).

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ABSTRACT Objective. Identify the expression of enzymes related to metabolism of glucocorticoids in bovine ovarian tissue. Materials and methods. Samples of tissues of healthy ovaries (n=10) and ovaries with Cystic Ovarian Disease (COD) (n=10) were obtained and then preserved in paraffin after their histological processing. By applying the indirect inmunohistochemistry technique and using specific antibodies it was possible to identify in situ the 1 and 2 isoforms of the 11β-hidroxiesteroide dehydrogenase (11βHSD) enzyme in primary, secondary, tertiary, atretic and cystic follicles. Results. The expression of the 11βHSD-1 enzyme showed significant differences only in the granulosa cells of the different follicular groups. The 11βHSD-2 enzyme showed significant differences with respect to its expression in the granulosa cells of primary follicles compared to the secondary and cystic follicles. In the cells of the theca interna this difference was observed between the tertiary and the atretic and cystic follicles. In the external theca cells, the tertiary follicles showed significant differences in its expression with respect to the atretic follicles. Conclusions. The presence of isoforms I type and II type of 11βHSD was observed in ovarian bovine tissues, obtained in slaughterhouses. This allows for concluding the existence of an endocrine mechanism, which regulates glucocorticoid activity. This mechanism allows for the alteration of the normal level of follicular development by generating follicular anovulatory structures and/or follicular cysts and at the same time generating anestrus and others reproductive alterations in cattle. Key words: Cattle, cortisol, follicular cyst, inmunohistochemistry, stress (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN Los glucocorticoides son hormonas esteroides, de la categoría de adrenocorticales, de la cual también son parte los mineralocorticoides, estos son capaces de atravesar la membrana plasmática e interaccionar en el citoplasma con receptores citoplasmáticos específicos. Por otra parte, los glucocorticoides tienen importantes efectos clínicos, a través de la inhibición de la respuesta inflamatoria, que consiste en la prevención de la dilatación capilar, la extravasación del líquido a los espacios tisulares, la migración leucocitaria, el depósito de fibrina y la síntesis de tejido conjuntivo. Una de las vías por las que estas hormonas inhiben la respuesta inflamatoria es mediante la supresión de la formación de sustancias que promueven la inflamación, como prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos (1). Los glucocorticoides actúan directamente sobre las células ováricas inhibiendo la acción de las gonadotrofinas y la síntesis de esteroides (2,3). En una gran variedad de órganos, incluido el hígado y los riñones, el cortisol es oxidado a cortisona (metabolito inactivo) por la enzima 11ß-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11βHSD) (4). A la fecha se han descrito 2 isoformas bioquímicamente distintas de la 11βHSD, designadas 11βHSD tipo 1 (11βHSD-1) y 11βHSD tipo 2 (11βHSD-2) (5). Se han determinado las bases moleculares de la transición de 11βHSD-2 a 11βHSD-1 durante la luteinización, concluyendo que la sobreexpresión de 11βHSD-1 en el momento de la ovulación es inducida por las gonadotrofina (6). Como la ovulación es un evento inflamatorio, caracterizado por un incremento en la síntesis

de interleuquinas y prostaglandinas (7), la generación incrementada de glucocorticoides antiinflamatorios por la actividad reductasa de la 11βHSD-1 en el momento de la ovulación, podría representar un mecanismo fisiológico para limitar el proceso inflamatorio en el ovario (8,9). En este sentido, se ha demostrado que los glucocorticoides inhiben la síntesis de prostaglandinas y citoquinas pro-inflamatorias en el ovario (10). Debido a que la expresión de 11βHSD es estimulada en las células de la granulosa por la LH y por citoquinas proinflamatorias (11), la síntesis de glucocorticoides vía 11βHSD-1 podría ser incrementada por las gonadotrofinas y/o citoquinas, como un aspecto integral de la cascada de la ovulación. En trabajos realizados en bovinos, Tetsuka et al (12), describieron que las células granulosas bovinas en folículos antrales grandes, solamente expresan ARNm correspondiente a 11βHSD-1, mientras que no detectaron ARNm para 11βHSD2. En el cuerpo lúteo bovino, se co-expresaron ambos isotipos, siendo predominantes el ARNm para 11βHSD-1 en los cuerpos lúteos activos y el ARNm para 11βHSD-2 en cuerpos lúteos en regresión (12). Datos informados recientemente sugieren que la expresión y actividad de 11βHSD2 es predominante en las células granulosas en todos los estadios de desarrollo folicular activo bovino, con una transición a la isoforma 11βHSD1 en el cuerpo lúteo (13). Los únicos datos previos en quistes foliculares bovinos indicarían que existen moduladores de la acción de estas enzimas, no muy bien caracterizadas hasta el momento (5).

López - Expresión de enzimas relacionadas con metabolismo glucocorticoides Presumiblemente y teniendo en cuenta datos publicados por otros autores (5), las enzimas que participan en el metabolismo de glucocorticoides, particularmente el cortisol podrían participar en la patogenia de los quistes foliculares en el ovario de los bovinos. El cortisol es generado por un estimulo de la hormona adrenocorticotropa (ACTH) a nivel adrenal pudiendo interferir con los mecanismos que regulan el cronograma de eventos dentro de la fase folicular. Esto ocurre principalmente a nivel del eje hipotálamohipofisiario-gonadal donde se reducen los pulsos de GnRH y LH por acciones tanto en la hipófisis como en el hipotálamo, privando al ovario de adecuados niveles de LH (14). Por esto es que el estrés ha sido propuesto como uno de los factores predisponentes más importantes (15), en el desarrollo de quistes foliculares en bovinos. El objetivo de esta investigación fue identificar por inmunohistoquímica la expresión de las isoformas 1 y 2 de la enzima 11ß-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11βHSD) y su relación con el metabolismo de glucocorticoides en tejidos ováricos bovinos sanos y con Enfermedad Quística Ovárica (COD).

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realizó bloqueo de la actividad de la peroxidasa endógena y de las uniones inespecíficas mediante el uso de sueros no inmunes y albúmina sérica bovina de acuerdo a lo descrito y validado previamente (16,17). Los anticuerpos primarios para cada una de las enzimas (11βHSD-1 1:100; Abcam, UK, Cat # 39364 y 11βHSD-2 1:800; Abcam, UK, Cat # 37800) se incubaron 18 h a 4ºC. Posteriormente, las muestras se lavaron en PBS y se incubaron 40 minutos a 18°C con el anticuerpo biotinilado, según el anticuerpo primario utilizado; para el anticuerpo secundario 11βHSD-2 se incubó además el anticuerpo puente anti IgY; luego se incubó el complejo estreptavidina-peroxidasa; después la reacción para cada enzima se reveló utilizando 3.3’ diaminobencidina (DAB) como cromógeno; finalmente se hizo contracoloración con hematoxilina activada, se deshidrataron los cortes y se montaron con bálsamo de Canadá (16,17). Los anticuerpos utilizados y sus respectivas concentraciones se encuentran detallados en el tabla 1. Tabla 1. Anticuerpos primarios usados en la técnica de Inmunohistoquímica. Anticuerpos usados, proveedor y diluciones

MATERIALES Y MÉTODOS Obtención y procesamiento de muestras de frigorífico. Se recolectaron los ovarios de 20 bovinos Holando Argentino en frigoríficos de la zona (Esperanza, Provincia de Santa Fe, Argentina). Muestras de 10 vacas con desarrollo folicular normal y 10 que presentaron alteraciones macroscópicas, compatibles con la existencia de COD (folículo mayor a 20 mm, en ausencia de cuerpo lúteo y sin tono uterino) (1517). Los ovarios obtenidos se disecaron y fijaron en formol bufferado al 10% durante 6h a 4°C, luego se lavaron en buffer fosfato salino (PBS) y procesaron siguiendo protocolos de rutina para efectuar la inclusión en parafina (16). Para hacer una caracterización inicial y evidenciar la morfología general se utilizó la coloración de hematoxilina-eosina. Inmunohistoquímica. Se efectuaron cortes seriados, de 4 µm de espesor, los que se montaron en portaobjetos previo tratamiento con 3-aminopropyl-triethoxysilane (Sigma, USA). Para la determinación de las enzimas 11βHSD-1 y 11βHSD-2 se realizó una técnica de inmunohistoquímica indirecta con la siguiente secuencia: primero se desparafinó, rehidrató y realizó recuperación antigénica a los cortes mediante calentamiento en microondas, luego se

Anticuerpo

Tipo

Proveedor

Concentración

Anti 11βHSD-1

Policlonal

Abcam

1:100

Anti 11βHSD-2

Policlonal

Abcam

1:800

Anti IgY

Policlonal

Abcam

1:600

Análisis de los resultados. Las imágenes microscópicas generadas con un microscopio Olympus CH30, se digitalizaron mediante una cámara SONY CCD-IRIS conectada a una PC de escritorio. Los resultados de inmunohistoquímica se evaluaron determinando la densidad óptica por análisis digital de imágenes, utilizando el sistema Image-Pro Plus 3.0.1 (Media Cybernetics). Para ello se realizó la segmentación automática de colores, de acuerdo a la intensidad de la reacción en los controles positivos, siguiendo las técnicas descriptas previamente (16,17). Los datos fueron evaluados con el programa SPSS 10.1 (SPSS Inc. USA) para Windows. Se realizó un análisis con pruebas paramétricas ANOVA y el post-test de Duncan para los diferentes grupos, de acuerdo a lo propuesto por Siegel (18) y Zar (19). Específicamente para cada isoforma se evaluó la inmunomarcación en las tres capas foliculares (granulosa, teca interna y teca externa) de folículos primarios, secundarios, terciarios y atrésicos en ovarios de animales sanos y folículos quísticos en animales con COD.

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RESULTADOS Se demostró la presencia de las isoformas tipo I y II de 11βHSD en tejidos ováricos bovinos obtenidos de frigorífico, mediante la aplicación de la técnica de inmunohistoquímica indirecta. Expresión de enzimas relacionadas con el metabolismo de glucocorticoides en el ovario bovino. En las células que rodean el ovocito de los folículos primarios, se presentó una leve marcación positiva para la 11βHSD-1 (Figura 1). En las células de la granulosa y de la teca externa de los folículos secundarios se observó también una débil marcación positiva (Figura 1). En las tres capas foliculares de los folículos terciarios y atrésicos se presentó marcación positiva para la 11βHSD-1 (Figura 1). En las células de la granulosa de los folículos quísticos se observó una intensa marcación positiva (Figura 1).

Se presentó marcación positiva para la enzima 11βHSD-2 en las células de la granulosa tanto de los folículos primarios como de los folículos secundarios, para las células de la teca externa de estos últimos también hubo marcación positiva (Figura 2). En los folículos terciarios, se observó una leve marcación positiva en las células de la granulosa, teca interna y teca externa (Figura 2). Asimismo se presentó una intensa marcación positiva en las células de la granulosa, teca interna y teca externa de los folículos atrésicos (Figura 2). En las células de la granulosa y teca interna de los folículos quísticos también hubo una intensa marcación de la enzima 11βHSD-2 (Figura 2).

En cuanto a la enzima 11βHSD-2 se evaluó la inmunomarcación en las tres capas foliculares (Granulosa, Teca Interna y Teca Externa) de folículos primarios, secundarios, terciarios, atrésicos y quistes.

Figura 2. Pared de estructuras foliculares de ovario bovino inmunomarcadas para 11βHSD-2. 40X. (a) Folículo Primario. (b) Folículo Secundario. (c) Folículo Terciario. (d) Folículo Atrésico (e) Folículo Quístico. G: granulosa; TI: teca interna; TE: teca externa.

Figura 1. Pared de estructuras foliculares de ovario bovino inmunomarcadas para 11βHSD-1. 40X. (a) Folículo Primario. (b) Folículo Secundario. (c) Folículo Terciario. (d) Folículo Atrésico (e) Folículo Quístico.

Inmunohistoquímica 11βHSD-1. La inmunomarcación positiva de la 11βHSD1 e n l a c a p a d e l a g ra n u l o s a p r e s e n t ó diferencias significativas (p<0.05) para folículos terciarios y folículos quísticos con relación a los folículos primarios y folículos secund arios, present ándose ad emás un

López - Expresión de enzimas relacionadas con metabolismo glucocorticoides porcentaje intermedio de inmunomarcación para folículos atrésicos. El porcentaje del área inmunopositiva de la 11βHSD-1, no mostró diferencias significativas en la teca interna de las diferentes estructuras foliculares (folículos terciarios, folículos atrésicos y folículos quísticos). No se halló diferencia en el porcentaje del área inmunopositiva de la enzima 11βHSD-1 en la teca externa de los folículos secundarios, folículos terciarios, folículos atrésicos y folículos quísticos (Figura 3). Inmunohistoquímica 11βHSD-2. El porcentaje del área inmunopositiva de la 11βHSD-2, en la capa de la granulosa, fue mayor para folículos atrésicos y folículos quísticos con relación a los folículos primarios, presentándose además valores intermedios

Figura 3. Porcentaje del área inmunopositiva para la enzima 11βHSD-1 en las células de varios tipos foliculares en muestras obtenidas de frigorífico. (a) Granulosa. (b) Teca Interna. (c) Teca Externa.

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sin diferencias significativas para folículos secundarios y folículos terciarios. En las células de la Teca Interna, el porcentaje del área inmunopositiva para 11βHSD-2 evidenció una diferencia significativa para folículos atrésicos y folículos quísticos con relación a los folículos terciarios. La inmunomarcación de la enzima 11βHSD-2, en las células de la Teca Externa, fue mayor para folículos atrésicos con relación a folículos terciarios, asimismo el porcentaje para folículos secundarios y folículos quísticos tuvieron valores intermedios sin diferencias significativas (Figura 4).

Figura 4. Porcentaje del área inmunopositiva para la enzima 11βHSD-2 en las células de varios tipos foliculares en muestras obtenidas de frigorífico. (a) Granulosa. (b) Teca Interna. (c) Teca Externa.

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DISCUSIÓN Los quistes foliculares son uno de los desordenes reproductivos mas comunes en vacas lecheras, presentándose también en animales destinados a la producción de carne. Se ha descrito que en diferentes tipos de rodeos, pueden afectar hasta un 15% de las vacas durante el periodo postparto, prolongando el intervalo parto-concepción (20) y causando perdidas significativas a la producción pecuaria. Además, los quistes, a veces, son acompañados por la expresión de conducta sexual receptiva (estro), resultando en costos adicionales por las infructuosas inseminaciones artificiales (21). Watson y Cliff (22) detectaron diferentes incidencias de quistes foliculares durante la investigación de anestro (58%), celos irregulares (12%), diagnósticos negativos de preñez (12%), y exámenes pre-servicio (17%). Dentro de sus causas, el estrés ha sido propuesto como uno de los factores predisponentes más importantes (15). Los estresores reducen la fertilidad por interferir con los mecanismos que regulan el cronograma de eventos dentro de la fase folicular. Esto ocurre principalmente a nivel del eje hipotálamohipofisiario-gonadal donde se reducen los pulsos de GnRH y LH por acciones tanto en la hipófisis como en el hipotálamo, privando al ovario de adecuados niveles de LH (14). En este trabajo, se corroboró la expresión de enzimas vinculadas con el metabolismo de los glucocorticoides (5), más específicamente las isoformas de la enzima 11ßHSD, en folículos ováricos bovinos, inclusive hasta estadios patológicos de los mismos. Se hallaron diferencias significativas, para la enzima 11ßHSD-1, en el porcentaje del área inmunopositiva en las células de la granulosa del folículo terciario y folículo quístico con relación a folículo primario y folículo secundario, asimismo el folículo atrésico tuvo una expresión intermedia con relación a los folículos evaluados; para esta misma enzima, no se hallaron diferencias significativas en el porcentaje del área inmunopositiva para las células de la teca interna y la teca externa respectivamente. Se evidenciaron diferencias significativas en la inmunomarcación con la 11ßHSD-2 en la capa de la granulosa, en particular al comparar el folículo primario con el folículo atrésico y quístico; también, pero en las células de la teca externa, se presentaron diferencias significativas en el porcentaje del área inmunopositiva entre folículo terciario en relación con folículo atrésico y folículo quístico. Fueron importantes también

las diferencias en la inmunomarcación de la enzima 11ßHSD-2 en las células de la teca externa, puesto que los valores mínimos y máximos de expresión se hallaron en folículo terciario y folículo quístico respectivamente, en comparación con los valores intermedios para folículo secundario y folículo quístico. Con estos resultados se puede sugerir que las isoformas de la enzima 11ßHSD se encuentran en actividad en los diferentes estadios de desarrollo folicular, siendo evidente la síntesis de la enzima 11ßHSD-1 en folículos de ovario bovino presentes en la ovulación, y por consiguiente la activación local de cortisol, el cual a nivel ovárico puede cumplir funciones de regulación mediante mecanismos paracrinos. A pesar de la poca información científica con relación a la presencia de receptores de ACTH a nivel ovárico en bovinos, son sólidas las evidencias de la participación del cortisol en la regulación del proceso ovulatorio (26), y la expresión de enzimas relacionadas a su activación/inactivación pueden representar uno de los mecanismos mediante el cual se altere el patrón normal de desarrollo folicular, y por consiguiente la generación de quistes foliculares. Basados en estos resultados se puede sugerir que la regulación del metabolismo del cortisol en el ovario podría jugar un papel clave en la patogenia de algunas enfermedades relacionadas con anestro debido al estrés. Por ejemplo, la ACTH estimula la liberación de cortisol y progesterona, en respuesta a situaciones de estrés. Por su parte la progesterona actúa inhibiendo la liberación de GnRH en el hipotálamo, mientras que el cortisol ejerce un efecto inhibitorio directo en el ovario sobre la secreción de estradiol y sobre el contenido de receptores de LH. Consecuentemente falla el mecanismo de retroalimentación positiva de los estrógenos, suprimiendo el pico preovulatorio de LH, bloqueando la ovulación y generando el desarrollo de quistes foliculares (23, 24). En trabajos previos se observó una respuesta diferencial de los quistes en relación a los folículos terciarios en la secreción de cortisol y estradiol frente a un estimulo con ACTH. Estos resultados indican que la ACTH puede afectar la secreción de esteroides en los folículos de ovarios bovinos y que los quistes foliculares tienen una respuesta diferencial, en relación a los folículos normales (25). Estos hallazgos apoyan la idea de que el estrés afecta la función ovárica y que esto puede ser un importante factor etiológico de los quistes foliculares en bovinos. Los resultados del análisis inmunohistoquímico en tejidos ováricos bovinos de este estudio, permiten inferir la existencia de un mecanismo endocrino

López - Expresión de enzimas relacionadas con metabolismo glucocorticoides soportado en activaciones e inactivaciones hormonales subsecuentes regidas por factores generales y específicos inherentes al bovino, que originan el cuadro característico de quistes foliculares espontáneos, del cual se debe partir para dilucidar la patogenia de esta disrupción reproductiva al trabajar con quistes foliculares inducidos y al aplicar técnicas celulares y moleculares de mayor especificidad.

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Asimismo se concluye que aunque se ha descripto que los folículos ováricos de bovino presentan la capacidad de liberar cortisol en respuesta a estímulos mediados por gonadotropinas, esta capacidad se encuentra aumentada en los quistes foliculares. Esto podría indicar una capacidad de regulación de los niveles locales de glucocorticoides independientemente de los niveles sistémicos, coincidiendo con lo propuesto por otros autores (2).

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3387-3398, 2013.

ORIGINAL

Especies promisorias para el ecoturismo en “Campo Aventura Roca Madre”, Toluviejo-Sucre, Colombia Promising species for the development of ecotourism in “Campo Aventura Roca Madre”, Toluviejo-Sucre, Colombia Alcides Sampedro-M,1* Ph.D, Angel Álvarez-P,1 Biól, Luz M. Domínguez,1 Biól, Ivonne Herrera-M,1 Biól. Universidad de Sucre, Grupo de Biodiversidad Tropical, Sincelejo, Sucre, Colombia. *Correspondencia: asampedro2002@yahoo.es. 1

Recibido: Febrero de 2011; Aceptado: Diciembre de 2011.

RESUMEN Objetivo. Determinar las especies de flora y fauna más importantes para el desarrollo del ecoturismo, en una localidad del departamento de Sucre, Colombia. Materiales y métodos. Se hizo un listado de las especies de flora y fauna observadas en el sendero ecológico de un centro de ecoturismo en Toluviejo, Sucre y se calculó su abundancia, importancia económica, estado de conservación y adaptaciones, que fueron evaluadas mediante un índice de importancia potencial para el ecoturismo, que suma los valores que se asignan a las variables consideradas de interés. Resultados. Se detectaron 18 especies promisorias de fauna, de 91 especies observadas y 16 especies vegetales de 53 observadas. Los animales de mayor potencial ecoturístico resultantes, fueron: Dendrobates truncatus y Saguinus oedipus, especies endémicas de Colombia, seguidas por Basiliscus basiliscus, Atta sp., Morpho peleides, Lycorea halia y Ara ararauna; todas estas con una alta abundancia y fácil detección. Dentro de las plantas, Anacardium excelsum obtuvo el mayor índice de importancia, como resultado de su endemismo y sus adaptaciones. Las especies Piper auritum, Matayba escrobiculata, Tabernaemontana cymosa y la comúnmente conocida como jazmín de monte, fueron fácilmente detectables y abundantes, además Brownea ariza y Tabebuia rosea resultaron las más representativas por la belleza de sus flores. Conclusiones. Se determinaron las especies que pueden ser de interés para los ecoturistas y esto hace posible mejorar el producto que se oferta a partir de profundizar en su conocimiento. Palabras clave: Ecoturismo sostenible, especies promisorias, fauna silvestre, flora (Fuente: Tesauro ambiental para Colombia).

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ABSTRACT Objectives. To determine the species of flora and fauna relevant for development of ecotourism in a location of Sucre, Colombia. Materials and methods. A list of various species at the ecotourism center in the municipality of Toluviejo, Sucre, was studied which included abundance, economic and conservation relevance and adaptation data. The census was estimated and evaluated according to our index of potential importance for ecotourism, by adding the values assigned to each of the variables of interest. Results. 18 promising species of fauna and 16 promising species of plants were found. Animals with higher ecotourism potential were Dendrobates truncatus and Saguinus oedipus, endemic to Colombia, followed by Basiliscus basiliscus, Atta sp. Morpho peleides, Lycorea halia, Ara ararauna, all these of high abundance and easy detection. Regarding plants, Anacardium excelsum obtained the highest value as a result of endemism and their adaptations. Piper auritum, Matayba escrobiculata, Tabernaemontana cymosa and the specie commonly known as “jazmín de monte”, were easily detectable and abundant. Brownea ariza and Tabebuia rosea were the best candidates because of the beauty of their flowers. Conclusions. The species that may be of interest to eco-tourists were determined and this makes it possible to improve the product offering from deepening their knowledge. Key words: Flora, promising species, sustainable ecotourism, wildlife (Source: Tesauro ambiental para Colombia).

INTRODUCCION

MATERIALES Y MÉTODOS

En Colombia se ha prestado atención oficial al ecoturismo a través de un documento conjunto entre los Ministerios de Comercio, Industria y Turismo y el Ministerio de Vivienda y Desarrollo Territorial (1) en el que se traza la Política Para el Desarrollo del Ecoturismo. En este documento se enfoca la necesidad de capacitar a las personas, profesionales o no, acerca del conocimiento ambiental, como única forma de lograr una conservación efectiva. Berovides (2) y Rodríguez y Berovides (3) propusieron una metodología, que valora la fauna promisoria para el ecoturismo, lo que permite brindar un producto de calidad al ecoturista y compatibilizar el uso de la fauna con su conservación. Los autores en mención se basaron en que los productos que brinda el ecoturismo se relacionan con la belleza que se observa en la naturaleza y las características ecológicas de los organismos que allí habitan.

Área de estudio. La serranía de Coraza y Montes de María, bajo la jurisdicción de CARSUCRE (4), forma parte de la serranía de San Jacinto. Situada al norte del departamento de Sucre, en áreas compartidas por los municipios de Colosó, Chalán y Toluviejo, y abarca una extensión de 6.653 ha. Allí se encuentra “Campo Aventura Roca Madre”, localizado en el corregimiento de La Piche (09°30’45,73’’ N y 075°24’37,12’’ W), municipio de Toluviejo, con una extensión de 127 ha. Este sitio se caracteriza por poseer una cobertura de bosque seco tropical, formadas por superficies montañosas de elevación mediana, con alturas que van desde los 200 a los 560 msnm, temperatura promedio de 27°C, y con precipitación promedio anual de 1500 mm.

El objetivo del presente trabajo fue hacer un inventario de las especies principales de flora y fauna en el área que ocupa “Campo Aventura Roca Madre” en el departamento de Sucre, Colombia. Además, se determinó cuáles de ellas tienen mayor importancia para la actividad ecoturística, dándole valor a la importancia de las diferentes especies, teniendo en cuenta la abundancia, lo endémico de la especie, la belleza y las posibilidades de ser observadas, entre otros elementos (2).

Procedimiento para la determinación de especies promisorias. La metodología (3) contempla diez elementos a evaluar que son: 1) accesibilidad al hábitat de la especie, 2) si es o no endémica, 3) su detectabilidad (si es posible observarla con facilidad o si es difícil por su coloración, porque se oculta, o por alguna otra razón), 4) la abundancia, 5) actividad diaria, 6) actividad estacional, 7) adaptaciones, 8) utilización por el hombre, 9) situación conservacionista y 10) valor sistemático. Este último, en el presente trabajo se modificó por “aspecto” de la especie, debido a se consideró el interés que expresan los ecoturistas en relación a si un animal es grande o pequeño, si presenta un color llamativo, o se camufla muy bien entre la vegetación por su coloración críptica, si tiene un dimorfismo sexual marcado. En el caso de las

Sampedro - Especies promisorias para el ecoturismo Toluviejo-Sucre-Colombia 3389 plantas, se tuvo la misma consideración, ya que estas pueden llamar la atención por su altura, grosor, cobertura, presencia de espinas, hojas grandes, coloración, entre otras características. En el caso de la flora se sustituyó “actividad estacional” por “caducidad”. A cada parámetro se le asignó valores entre uno y diez, en función de su mayor o menor importancia respecto a los otros. Al valor así obtenido se le denomina Índice de Potencialidad Ecoturística Ponderado (IPEw) (2). Para ello, se acordó un criterio único sobre el orden de importancia de los elementos considerados; este acuerdo parte del principio de que siempre el valor de los elementos es subjetivo y variable en relación a la la localidad y la especie a evaluar, pero se puede obtener consenso de cuáles son aquellos que motivan a los ecoturistas y establecer un orden de prioridad que permita cuantificar las preferencias. En el caso de la fauna los valores asignados fueron: 1) Si la especie es endémica 10 2) Abundancia 9 3) Detectabilidad 8 4) Accesibilidad al hábitat 7 5) Adaptaciones 6 6) Aspecto 5 7) Actividad diaria 4 8) Actividad estacional 3 9) Peligro de extinción 2 10) Valor etnozoológico 1 Para la fauna, la suma de los valores de cada elemento es 55 como valor máximo y el valor promedio más uno, es decir 27.5 + 1, es el límite de selección de una especie considerada promisoria. En el caso de la flora los valores asignados fueron: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9)

Si la especie es endémica 9 Abundancia 8 Detectabilidad 7 Accesibilidad al hábitat 6 Adaptaciones 5 Aspecto 4 Caducidad 3 Peligro de extinción 2 Valor etnobotánico 1

Para la flora se procedió de la misma manera, pero en este caso la suma total es 45 y el límite de selección de una especie considerada promisoria es 22.5 + 1.

Trabajo de campo. Este trabajo se realizó entre los meses de febrero y julio del 2010, finalizando el período seco y comenzando el período de lluvias y durante este tiempo se desarrollaron 54 salidas de campo de 8 horas cada una. Para observar la fauna se utilizaron binoculares, telescopio Tele Star y cámara fotográfica Cannon Rebel XS con Zoom acoplado. En el caso de la flora, las observaciones se hicieron mediante inspección ocular. Las visitas se realizaron en la mañana y en la tarde al sendero ecológico, que tenía una extensión de 2069 m y el ancho que se tuvo en cuenta a ambos lados, para las observaciones, fue de 20 m. La posición geográfica al inicio del sendero es 9º 30’ 41.2” N y 75º 24’ 37.8” O, con una altura de 91 m, y al final 9º 30’ 47.0” N y 75º 23’ 54.6” O, con una altura de 288 m, aunque la altura mayor en este sendero fue de 321 m. Se trata de un sector donde abundan las pequeñas y medianas elevaciones y arroyos y se observa cierto grado de antropización, sobre todo al inicio y al final del trayecto, debido a la presencia de animales domésticos en las cercanías y a la influencia de una cortadora de mármol, también cercana; sin embargo, la vegetación y la fauna características del lugar fueron predominantes siempre. Se anotaban las especies de flora y fauna observadas y la hora de observación. Las especies vegetales se identificaron directamente en el lugar y las que no era posible identificar, se les tomó muestras de hojas y frutos para su posterior análisis y consulta con especialistas y la bibliografía (5). El mismo procedimiento se utilizó con la fauna observada y en este caso la bibliografía utilizada fue fundamentalmente para aves (6). A partir de las observaciones directas y del análisis bibliográfico acerca de las especies observadas, se obtuvieron las principales adaptaciones, morfológicas, fisiológicas y conductuales, así como el establecimiento de la actividad diaria y estacional de cada especie, determinando la partición del recurso tiempo, en base a las horas de avistamiento durante todo el trabajo de campo y a lo hallado en la literatura. Los datos acerca de la utilización de la flora y la fauna se obtuvieron a partir de la bibliografía especializada y a través de entrevistas aleatorias con este fin, a 65 personas adultas (más de 25 años), de ambos sexos (38 hombres y 27 mujeres). La abundancia relativa de las principales especies de fauna fue medida como la frecuencia de avistamiento:

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F= Nº de avistamiento de cada especie /Nº de muestreos por 100 Se determinó la abundancia absoluta de las principales especies de plantas en el sendero ecológico, como: A= Nº de individuos /área total El área del sendero ecológico es de 8.3 ha. Los resultados se interpretaron teniendo en cuenta el valor mínimo y máximo de la abundancia, de este modo se tomaron rangos como sigue: 1-20 poco observada (PO); 21-40 moderadamente común (Mc); 41-70 común (C); 71-100 abundante (A).

RESULTADOS En la tabla 1 aparece el listado de las plantas observadas en el parque durante el período de trabajo. Se trata de 29 familias y 53 especies. En la tabla 2 se registran las especies de fauna observadas en el área de estudio. Aparecen 49 familias y 91 especies, dentro de las que, las aves son las mejor representadas con 46 especies, repartidas en 23 familias. Las familias que mostraron mayor riqueza de especies fueron Psittacidae y Accipitridae, con 8 y 4, respectivamente.

Tabla 1. Especies de flora observadas en el sendero ecológico de Aventura Roca Madre. FAMILIA

ESPECIE

NOMBRE COMÚN

Acanthaceae

Tichanthera sp

palo de agua

Anacardiaceae

Anacardium excelsum

caracolí

Mangifera indica

mango

Spondias mombin

jobo

Aspidosperma polyneuron

carreto

Tabernaemontana cymosa

bola de barraco

Tabernaemontana sp

tomatón

Plumeria alba

azuceno

Aquifoliaceae

Ilex sp

barbasco de monte

Arecaceae

Desmoncus orthacanthos

matamba

Sabal mauritiiformis

palma amarga

Attalea butyracea

palma de vino

Alocasia macrorrhiza

malanga

Dieffenbachia sp

matapuerco

Crescentia cujete

totumo

Macfadyena uncata

uña de gato

Tabebuia rosea

roble

Tabebuia chrysea

polvillo

Ceiba pentandra

ceiba de agua

Bombacopsis quinata

ceiba tolúa

Pseudobombax septenatum

majagua

Burseraceae

Bursera simarouba

indio en cuero o almácigo

Cecropiaceae

Cecropia obtusifolia

guarumo

Combretaceae

Sp indeterminada

varaleòn

Elaeocarpaceae

Muntingia calabura

periquito

Eritroxilaceae

Erythoxylon sp

coca de mico

Euphorbiaceae

Hura crepitans

ceiba de leche

Flacourtiaceae

Casearia corymbosa

vara de humo

Heliconiaceae

Heliconia sp

lengüeta

Lauraceae

Persea americana

aguacate

Lecythidaceae

Gustavia superba

membrillo

Leguminosa/ Caesalpinaceae

Brownea ariza

arizal

Caesalpinia coriaria

dividivi

Haematoxylum brasiletto

brasil

Albizia saman

campano

Albizia niopoides

guacamayo

Calliandra magdalenae

carbonero

Zygia inaequalis

guamo macho

Apocynaceae

Araceae

Bignoniaceae

Bombacaceae

Leguminosa/ Fabaceae

Sampedro - Especies promisorias para el ecoturismo Toluviejo-Sucre-Colombia Leguminosa/ papilionoideae

Platymiscium pinnatum

trébol

Meliaceae

Cedrela odorata

cedro

Brosimum alicastrum

guáimaro

Ficus sp

caucho

Ficus dendroica

suán

Piperaceae

Piper auritum

santa maría

Rubiaceae

Sp indeterminada

jazmín de monte

Sapindaceae

Simira cordifolia

pijiño

Talisia olivaeformis

mamón de mico

Matayba escrobiculata

guacharaco

Sapotaceae

Manilkara zapota

níspero

Sterculiaceae

Guazuma ulmifolia

guácimo

Sterculia apétala

camajón

Urticaceae

Urera baccifera

Verbenaceae

pringamoza

Vitex compresa

aceituno

Tabla 2. Especies de fauna observadas en el sendero ecológico de Campo Aventura Roca Madre. FAMILIA

ESPECIE

NOMBRE COMÚN

INVERTEBRADOS Formicidae Morphidae Nymphalidae

Atta sp. Morpho peleides Lycorea halia

Bufonidae Dendrobatidae Hylidae

Bufo marinus Dendrobates truncatus Hyla crepitans REPTILES Liotyphlops albirostris Leptodeira septentrionalis Liophis lineatus Oxybelis aeneus Mastigodryas boddaerti Pseudoboa neuwiedii Urotheca euryzonus Helicops danieli Basiliscus Basiliscus Hemidactylus brooki Gonatodes albogularis Tretioscincus bifasciatus Iguana iguana Anolis vittigerus Mabuya mabouya Tupinambis teguixin Ameiva festiva Ameiva Ameiva Porthidium nasutum Bothrops asper AVES

sapo común rana venenosa rana platanera

Buteogallus meridionalis

bebehumo

Buteogallus urubutinga

águila negra

Buteo magnirostris

gavilán jabao

Leucopternis albicollis

águila blanca

Aramidae

Aramus guarauna

carrao

Caprimulgidae

Nyctidromus albicollis

bujío

Cathartidae

Sarcoramphus papa

rey golero

Cathartes aura

aura

Coragyps atratus

golero

Columba fasciata

paloma

Zenaida auriculata

paloma torcaza

Columbina talpacoti

tortolita tierrera

Penelope purpurascens

pava congona

Ortalis garrula

guacharaca

Curvidae

Cyanacorax affinis

charán o chau chau

Cuculidae

Crotophaga ani

chingola

Crotophaga mayor

cocinera

Falco peregrines

halcón

Falco sparverius

halcón o cernícalo

Milvago chimachima

pígua

Anomalepididae

Colubridae

Corytophanidae Gekkonidae Gymnophthalmidae Iguanidae Polychrotidae Scincidae Teiidae Viperidae

Accipitridae

Columbidae

Cracidae

Falconidae

VERTEBRADOS ANFIBIOS

hormiga arriera mariposa azul mariposa

ciega mapaná guardacamino bejuquillo cazadora candelilla roja coral falsa mapaná de agua pasarroyo lagartija salamanqueja lagartija cola azul iguana lagartija lisa lobo pollero lobito lobito común patoco mapaná negra

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Fringillidae

Oryzoborus crassirostris

yolofo

Sicalis flaveola

canario

Galbulidae

Galbula ruficauda

jacamar

Hirumdidae

Progne chalybea

golondrina

Icteridae

Psarocolius decumanus

oropendola

Agelaius icterocephalus

toche

Mimidae

Mimus gilvus

sinsonte

Parulidae

Troglodytes aedo

cucarachero común

Picidae

Campephilus melanoleucos

carpintero moña roja

Psittacidae

Aratinga pertinax

cotorra cara sucia

Ara ararauna

guacamaya azul

Ara macao

guacamaya bandera

Ara severa

guacamaya verde

Amazona ochrocephala

loro copete amarillo

Amazona amazónica

loro basto

Brotogeris ugularis

perico

Pionus menstruus

periquito cabeciazul

Ramphastidae

Ramphastus sulfuratus

guasalé

Strigidae

Bubo virginianus

búho real

Thraupidae

Thraupis palmarum

azulejo palmero

Thraupis episcopus

azulejo común

Ramphocelus diminiatus

sangre toro

Trochiladae

Anthracothorax nigricolis

chupaflor

Troglodytidae

Campylorhynchus griseus

chupa huevo

Tyrannidae

Elaenia flavogaster

copetón

Megarhynchus pitangua

chuchafria

MAMIFEROS Agoutidae

Agouti paca

guartinaja

Atelidae

Alouatta seniculus

mono aullador colorado

Ateles fusciceps

marimonda

Saguinus oedipus

tití cabeza blanca

Cebus capucinus

mono capuchino

Dasypodidae

Dasypus novemcinctus

armadillo

Dasyproctidae

Dasyprocta punctata

ñeque

Didelphidae

Didelphis marsupialis

zorra chucha

Felidae

Leopardus pardales

tigrillo

Sciuridae

Sciurus granatensis

ardilla roja

Cebidae

Tabla 3. Valor de uso y conservacionista de la fauna en Campo Aventura Roca Madre. Especie

UIA

Morpho peleides

CA(7, 8)

CITES

X(9)

Dendrobates truncates(10)

Bufo marinus(11)

LR:Ca

AP II

Iguana iguana(12)

Tupinambis teguixin(13)

AP II AP II

Astigodryas boddaerti

Leptodeira septentrionalis

Liophis lineatus

Ramphocelus dimidiatus

X(14)

Columba fasciata(15)

Penelope purpurascens(16)

Ortalis garrula(16)

X AP III X

Ramphastus sulfuratus Ara ararauna(17) Ara severa Amazona farinosa Amazona ochrocephala Brotogeris jugularis

AP II

X(17)

X(18)

AP II

X(17)

X(18)

AP II

X(18)

AP II

Buteogallus meridionalis

AP II

Buteo magnirostris

AP II

Milvago chimachima

AP II

Alouatta seniculus

X(18)

Saguinus oedipus

X(18)

Cebus capucinus Sciurus granatensis

AP II

LR:Ca

AP II

X X

X(18)

LR/VU

AP I

C: comestible; UIA: uso industrial y artesanal; M: uso como mascota; P: peligrosa; E: endémica; CA: categoría de amenaza; VU: Vulnerable; LR: Bajo riesgo, Ca: Casi amenazado.

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Sampedro - Especies promisorias para el ecoturismo Toluviejo-Sucre-Colombia Tabla 4. Valor de uso y conservacionista de la flora en Campo Aventura Roca Madre Especie Hura crepitan(20) Ceiba pentandra(20) Anacardium excelsum(20) Brownea ariza(21) Tabernaemontana cymosa Guazuma ulmifolia(20) Tabebuia rosea(20) Sterculia apétala(20) Sabal mauritiiformis(20) Platymiscium pinnatum(20) Pseudobombax septenatum(20) Alocasia macrorrhiza(22) Spondias mombin(20) Bombacopsis quinata(23) Bursera simarouba(20) Piper auritum(24) Sp. Indeterminada1 (Jazmin de monte) Dieffenbachia sp.(25) Brosimum alicastrum(20) Tabebuia chrysea(20) Cecropia obtusifolia(26) Sp. Indeterminada 2 (Varaleon)

Prop. curativas X X

X X X X X X X X

X X X X

X X

Uso industrial y/o artesanal

Uso ornamental

X X X X

X X

X X X X X X

X X X X

X X

X X X

X X

LC LC/NT

X X X X

CA(19)

X X X

X X

C: Comestible, T: Tóxica, M: Maderable, E: Endémica. Casi amenazado (NT), Preocupación menor (LC), En peligro (EN).

El valor de uso y conservacionista para las especies que presentaban alguno de ellos, aparece en las tablas 3 y 4, para fauna y flora respectivamente. La mayor parte de las especies de fauna presentan algún valor de uso, sobre todo como mascota y algunas comestibles. Solo tres de ellas son endémicas y la mayor parte aparecen en el apéndice II de CITES. La flora por su parte, presenta un gran valor de uso de todo tipo, hay pocas especies endémicas y solo cuatro con algún grado de amenaza. Sólo siete especies resultaron abundantes, dentro de las cuales el mono aullador, las hormigas arrieras y la mariposa azul, fueron avistadas en todos los muestreos (Tabla 5). El lobito común, una mariposa, el pasarroyo y el chau chau, fueron las otras especies abundantes. En cuanto a la flora, tres especies aparecen con mayor abundancia absoluta, el jazmín de monte, la santa maría y el caracolí (Tabla 6). La gran mayoría de las especies que fueron observadas en Campo aventura Roca Madre son activas durante las horas del día (Tabla 7) y solo tres son migratorias. Las especies de fauna que por el valor que obtuvieron del índice de potencialidad ecosturística ponderado (IPEw) se pueden considerar promisoras, aparecen en la Tabla 8. De las especies evaluadas, 18 presentaron IPEw superior a 28.5, por lo que se seleccionan como

Tabla 5. Abundancia relativa de la fauna en Campo Aventura Roca Madre. ESPECIE

Atta sp.

100

Morpho peleides

100

Alouatta seniculus

100

Ameiva ameiva

92.5

Lycorea halia

81.5

Basiliscus basiliscus

77.8

Cyanocorax affinis

77.8

Dendrobates truncatus

66.7

Ramphastus sulfuratus

63.0

Ara ararauna

51.9

Sciurus granatensis

51.9

Anolis vittigerus

44.4

Amazona farinosa

44.4

Amazona ochrocephala

44.4

Ara severa

33.3

Iguana iguana

22.2

Leptodeira meridionalis

22.2

Penelope purpurascens

22.2

Ortalis garrula

22.2

Sarcoramphus papa

22.2

Buteo magnirostris

22.2

Saguinus oedipus

22.2

Campephilus melanoleucos

18.5

Tupinambis teguixin

14.8

Cebus capucinus

14.8

Bufo marinus

11.1

Mastigodryas boddaerti

11.1

Liophis lineatus

11.1

Columba fasciata

11.1

Brotogeris jugularis

11.1

Cathartes aura

11.1

Milvago chimachima

11.1

Ramphocelus dimidiatus

7.4

Elaenia flavogaster

7.4

Psarocolius decumanus

7.4

Crotophaga ani

7.4

Buteogallus meridionalis

7.4

AR: abundancia relativa; I: interpretación; A: abundante; C: común; MC: Moderadamente común; PO: poco observada

3394

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

Tabla 6. Abundancia absoluta de la flora detectada en el sendero ecológico de Campo Aventura Roca Madre. ESPECIE sp.indeterminada 1 (jazmín de monte)

Tabla 7. Partición del recurso tiempo (diario y estacional) para la fauna de Campo Aventura Roca Madre.

ABUNDANCIA ABSOLUTA ni/ha

ESPECIE

Actividad diaria D

58.1

Piper auritum

23.6

Anacardium excelsum

21.3

Actividad estacional R

Atta sp.(27)

Morpho peleides(5)

Lycorea halia(5)

Talisia olivaeformis

8.7

Dendrobates truncates(6)

Matayba escrobiculata

8.2

Bufo marinus(8)

Tabernaemontana cymosa

7.6

Basiliscus basiliscus(28)

Dieffenbachia sp

7.6

Anolis vittigerus(29)

5.2

Iguana iguana(10)

Ameiva ameiva

Tupinambis teguixin(11)

Brownea ariza Hura crepitans

4.5

Alocasia macrorrhiza

3.3

Sp. Indeterminada 2 (varaleón)

3.1

Tabebuia rosea

2.8

Ficus sp

2.7

Sabal mauritiiformis

X X

Mastigodryas boddaerti(11) Leptodeira septentrionalis

Liophis lineatus(11)

Ramphastus sulfuratus

2.7

Amazona ochrocephala(15)

Tabernamontana sp

2.7

Amazona farinosa

Spondias mombin

2.0

Cyanocorax affinis

Guazuma ulmifolia

1.7

Ara ararauna(15)

Sterculia apetala

1.6

Ara severa(15)

1.4

Brotogeris jugularis(15)

Ramphocelus dimidiatus(12)

Elaenia flavogaster(12)

Psarocolius decumanus(12)

Campephilus melanoleucos(12)

Columba fasciata(13)

Simira cordifolia

Pseudobombax septenatum

1.3

Ilex sp

1.0

Zygia inaequalis

0.7

Brosimum alicastrum

0.7

Ceiba pentandra

0.4

Tabebuia chrysea

0.2

Penelope purpurascens(14)

Platymiscium pinnatum

0.2

Ortalis garrula(14)

Cecropia obtusifolia

0.1

Sarcoramphus papa(30)

Cathartes aura(30)

Buteogallus meridionalis(30)

Buteo magnirostris(29)

Milvago chimachima(30)

Cebus capucinus

Saguinus oedipus

Alouatta seniculus(5)

Sciurus granatensis(31)

promisorias para el ecoturismo en la localidad de estudio. Los mayores valores los posee Dendrobates truncatus y Saguinus oedipus, especies endémicas de Colombia, seguidas por Basiliscus basiliscus, Atta sp., Morpho peleides, Lycorea halia, Ara ararauna, todas con alta abundancia y detectabilidad. Las mariposas y la guacamaya azul, presentaron además un gran atractivo por su belleza. Por otra parte, 19 especies resultaron con valores por debajo de 28.5, por lo que no se consideran apropiadas para el ecoturismo. De las 27 especies vegetales evaluadas (Tabla 9), 16 presentaron un IPEw superior a 25.5, Anacardium excelsum obtuvo el valor más alto como resultado de su endemismo y sus adaptaciones. Las especies Piper auritum, Matayba escrobiculata, Tabernaemontana cymosa y la comúnmente conocida como jazmín de monte, fueron fácilmente detectables y abundantes, además Brownea ariza

Crotophaga ani

D: diurno; C: crepuscular; N: nocturno; R: residente; M: migratorio

y Tabebuia rosea fueron las más representativas por la belleza de sus flores, y alrededor del 40% son caducifolias o semicaducifolias, que las hacen características de este tipo de bosque. También se puede notar en esta tabla que tres de las especies promisorias para el ecoturismo, entre ellas, Sabal mauritiformis y Bombacopsis quinata, presentaron problemas de conservación, lo que demuestra que su uso en el ecoturismo debe ser sustentado con un plan de manejo bien estructurado.

3395

Sampedro - Especies promisorias para el ecoturismo Toluviejo-Sucre-Colombia

Tabla 8. Índice de potencialidad ecoturística ponderado (IPEw), de las especies de fauna consideradas promisorias en Campo Aventura Roca Madre. El número entre paréntesis se corresponde con el valor máximo que tiene ese elemento. ELEMENTOS/ ESPECIES

E(10)

AB(9)

D(8)

AH(7)

AD(6)

A(5)

ADI(4)

AE(3)

SC(2)

VE(1)

TOTAL

Basiliscus basiliscus

Anolis vittigerus

32 35

Dendrobates truncatus

Ameiva meiva

Cyanocorax affinis

Ara ararauna

Ara severa

Ramphastus sulfuratus

Amazona farinosa

Amazona ochrocephala

29 35

Ortalis arrula Sciurus granatensis

Saguinus oedipus

Alouatta seniculus

Cebus capucinus

Atta ephalotes

Lycorea halia

Morpho peleides

E: endemismo; AB: abundancia; D: detectabilidad; AH: accesibilidad al hábitat; AD: adaptaciones; A: aspecto; ADI: actividad diaria; AE: actividad estacional; SC: situación conservacionista; VE: valor etnozoológico.

Tabla 9. Índice de potencialidad ecoturística ponderado (IPEw), de las especies de flora consideradas promisorias en Campo Aventura Roca Madre. El número entre paréntesis se corresponde con el valor máximo que tiene ese elemento. ELEMENTOS/ ESPECIES

E(9)

AB(8)

D(7)

AH(6)

AD(5)

B(4)

DE(3)

SC(2)

VE(1)

TOTAL

Sp. Indeterminada (jazmín de monte)

Piper auritum

Anacardium excelsum

Tabernaemontana cymosa

Dieffenbachia sp

Brownea ariza

Hura crepitans

Alocasia macrorrhiza

Tabebuia rosea

Ficus sp

Spondias mombin

Guazuma lmifolia

Sterculia apétala

Pseudobombax septenatum

Ceiba pentandra

Bombacopsis quinata

Endemismo; AB: abundancia; D: detectabilidad; AH: accesibilidad al hábitat; AD: adaptaciones; B: belleza; DE: deciduasd diaria; SC: situación conservacionista; VE: valor etnobtánico.:

DISCUSIÓN La flora y fauna reportadas en la zona de estudio resultan coincidentes con los reportes hechos en los últimos años por investigadores de esta región en localidades relativamente cercanas, como Colosó (32-34), lo que pudiera significar que también en esa y otras localidades cercanas la fauna promisoria para el ecoturismo coincidiría con la que se reporta en este trabajo. No obstante, sería necesario realizar estudios similares en las diferentes localidades, porque pueden existir diferencias notables entre las condiciones ambientales de cada sitio, así como diferencias en las formas de uso del suelo por el hombre y esto pudiera influir en los elementos que se evalúan y dar como resultado otras especies promisorias.

Las especies aquí avaladas como de mayor importancia para el ecoturismo, pueden ser tratadas como tal, utilizando los resultados para promocionar los centros de ecoturismo y las especies seleccionadas que servirían para atraer mayor público y realizar una labor de educación ambiental más efectiva, con información detallada e interesante de aquellas especies que observarán. Otro aspecto a considerar es, que las especies endémicas y las que presentan algún grado de amenaza, deben ser consideradas cuidadosamente en los planes de ecoturismo, de manera que su supervivencia sea asegurada (2). Para algunas especies que no obtuvieron el puntaje necesario para quedar dentro de las promisorias, pero que son de interés por su gran abundancia, características adaptativas o

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

belleza, deberá hacerse un análisis más detallado y particular (2). Estas especies podrían ser de interés para muchas personas. Tal es el caso de Milvago chimachima, un gavilán que se observa con mucha frecuencia y se ve claramente durante su vuelo de búsqueda de presas emitiendo silbidos de alta intensidad (35); lo mismo sucede con Campephilus melanoleucos, pájaro carpintero, de gran tamaño, de color negro con líneas blancas y copete rojo que llama mucho la atención por su canto característico y su forma peculiar de buscar alimento taladrando con su fuerte pico en el tronco de los árboles (6); por último está el caso de Bufo marinus, un sapo de gran tamaño, que se infla como una pelota cuando es atacado por sus enemigos y que puede aparecer en pleno día, cercano a cuerpos de agua. Además, su cuerpo está cubierto de glándulas venenosas, de las cuales se extraen sustancias que se utilizan en farmacología, como la bufotoxina (36). Esto evidencia que la metodología descrita y utilizada puede ser subjetiva, son los mismos investigadores los que determinan cuáles son los aspectos de mayor o menor valor, no obstante, un análisis detallado de las características de cada localidad donde se aplique, permitiría determinar las especies más importantes en esa localidad específica (3).

También debe considerarse el hecho de que pudieran concurrir visitantes que tienen mayor interes por una especie en específico; tal es el caso de los turistas científicos, que son mayormente profesores universitarios, científicos, naturalistas, que viajan a determinados sitios en el mundo para corroborar información científica, desarrollar proyectos o con otros intereses. En estos casos, las especies promisorias pueden no ser exactamente el objetivo que persiguen y el nivel de información que los mismos tienen es diferente al de la población común, por tanto deberá pensarse en una atención especializada donde intervengan profesionales de la temática de interés en cada caso. Esta metodología puede ser utilizada, con algunas modificaciones, para determinar “sitios” adecuados para el ecoturismo, lo que ha sido demostrado para arrecifes coralinos (3) y esto puede ser de importancia para la planificación científica de los lugares de mayor interés para el ecoturismo, tanto a nivel departamental, como nacional.

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3398

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3399-3407, 2013. ORIGINAL

Análisis de las universidades colombianas de acuerdo con el ranking SCImago 2010-2012 Analysis of the Colombian universities according to SCImago ranking 2010-2012 Salim Mattar V,1* Ph.D, Marco González T,1 M.Sc, Luis Salgado A,1 Ing. Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Departamento de Ciencias Pecuarias. Montería, Colombia. Correspondencia: mattarsalim@hotmail.com 1

Recibido: Octubre de 2012; Aceptado: Enero de 2013.

RESUMEN Objetivo. Analizar la clasificación de las universidades colombianas de acuerdo con el escalafón Iberoamericano SCImago Institutions Ranking (SIR) 2012. Materiales y métodos. Se realizó un análisis descriptivo que incluyó la productividad académica de cada universidad según SIR. También, se incluyeron las clasificaciones de 2010 y 2011 para analizar el progreso académico de las universidades. El análisis incluyó los siguientes indicadores: producción científica, colaboración internacional, calidad científica promedio, porcentaje de publicaciones en revistas del primer cuartil SJR y radio de excelencia. Resultados. Colombia ocupa el tercer lugar con 113 Universidades en Iberoamérica y el séptimo puesto con 7 universidades con más de 400 documentos. Sólo el 6.2% de las instituciones colombianas mantienen una producción científica competitiva frente al resto de las universidades Iberoamericanas. Las cinco primeras universidades colombianas con mayor productividad fueron: Nacional de Colombia, Antioquia, Andes, Valle y Javeriana. Las cinco primeras universidades del Caribe fueron: Norte, Cartagena, Córdoba, Magdalena y Sucre. Algunas universidades privadas como Antonio Nariño, el Bosque y la Escuela Colombiana de Ingenieria, a pesar de no estar dentro de los quince primeros puestos del pais, han hecho esfuerzos para mejorar los indicadores de calidad científica mediante publicaciones en revistas del primer cuartil y radio de excelencia. Conclusiones. Las clasificaciones que permiten comparar las IES a nivel mundial son importantes. Las IES de Colombia deben apostarle a la calidad usando al menos los cinco factores de SCImago. Aunque los rankings no obligan, ignorarlos significa autoaislamiento en un mundo cada día más globalizado. Palabras clave: Categorización, educación, visibilidad (Fuente: CAB).

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3400

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

ABSTRACT Objective. To analyze the classification of Colombian universities according to the Latin-american and spanish ranking SCImago Institutions rankings (SIR) 2012. Materials and methods. A descriptive analysis was performed, which included academic productivity of each University according to SIR. 2010 and 2011 classifications were also included to discuss the academic progress of the universities. The analysis included the following indicators: scientific production, international collaboration, scientific quality, average percentage of publications in journals of the first quartile SJR and ratio of excellence. Results. Colombia ranks third place with 113 universities in Latin America and the seventh place with 7 universities with more than 400 documents. Only 6.2% of the Colombian institutions maintain a competitive scientific production compared to the rest of the Latin-American and spanish universities. The first five Colombian universities with higher productivity were: Nacional, Antioquia, Andes, Valle, and Javeriana. The first five universities of the Caribbean were: Norte, Cartagena, Córdoba, Magdalena and Sucre. Some private universities such as Antonio Nariño, El Bosque and the Colombian School of Engineering, despite not being within the first fifteen places of the country, they have made efforts to improve the indicators of scientific quality through publications in journals of the first quartile and radio excellence. Conclusions. The classifications that allow to compare the IES at the global level are important. The IES of Colombia should bet on quality using at least five factors SCImago ranking. Although the rankings are not mandatory, ignoring them means self-isolation in a world each day more globalized. Key words: Education, ranking, visibility (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN La universidad moderna está concebida como el claustro para la construcción de la sociedad, tanto en su papel de educar como el de difundir el conocimiento y por lo tanto, debe ser el eje principal del desarrollo humano sostenible que impulse la transformación de la sociedad. Es la carta de presentación de un país, que incluye la política de la educación superior y debe propender por un profundo desarrollo humano que impacte en la sociedad, promoviendo la rentabilidad social sostenible en el tiempo. La universidad no puede ser ajena a la dinámica mundial. En ese sentido, el mundo académico es cada día más exigente con sus profesores y estudiantes. Para ello se han implementado modelos destinados a medir la calidad de la educación, que mediante diversas variables objetivas, intentan calificar a las instituciones de educación superior. Aunque el fenómeno de la calidad es complejo debido a la diferencia social mundial y a las condiciones individuales de trabajo de cada universidad (1,2), existen variables comunes que permiten acercarlas con una medición homogénea. Las mediciones o rankings (en inglés) son motivo de debate en los claustros universitarios debido a las metodologías, que al parecer de algunos, no toman en cuenta las diferencias existentes entre las universidades del mundo. No obstante, estas clasificaciones se han convertido en una herramienta adecuada que utilizan las universidades para aumentar la visibilidad

y la competitividad (2,3). Los rankings son sistemas que se utilizan para clasificar listados de universidades, programas, revistas, utilizando diferentes metodologías de evaluación, lo que ofrece una clara visión de la calidad de la educación superior de un país, su ubicación y la relación con su entorno y el mundo (4,5). Entre los rankings más destacados a nivel mundial se encuentra el Academic Ranking of World Universities, elaborado por la Universidad Jiao Tong de Shanghai (China), el cual clasifica las primeras 500 universidades del mundo, de acuerdo con los siguientes criterios de evaluación: calidad de la educación, calidad del personal académico, producción investigativa, tamaño de la institución (6). The World University Rankings, elaborado por el Times Higher Education, que incluye las 400 mejores universidades del mundo las califica de acuerdo a 13 indicadores divididos en 5 grandes categorías: i) Docencia: entorno de aprendizaje; ii) Investigación: cantidad, ingresos, reputación; iii) Referencias: impacto de la investigación; iv) Ingresos empresariales: innovación y v) Aspectos internacionales: personal, estudiantes e investigación (7). El Webometrics Ranking tiene como objetivo principal apoyar las iniciativas de acceso abierto y promover el acceso global al conocimiento académico producido por universidades en todo el mundo (8). Finalmente, está el proyecto SCImago “SCImago Instituciones Rankings (SIR)”, el cual permite la clasificación de universidades Iberoamericanas, teniendo

Mattar - Análisis de las universidades colombianas en cuenta los siguientes factores: producción científica, colaboración internacional, calidad científica promedio, porcentaje de publicaciones en revistas del primer cuartil en SCImago Journal & Country Rank (SJR) que es un portal que incluye los indicadores científicos de país desarrollados a partir de la información contenida en la base de datos Scopus® (9) y por último el radio de excelencia (10). Por tal motivo, los rankings de las universidades se han convertido en un elemento indispensable y “neutral” para medir el nivel de impacto que tienen a nivel del país, de la región y del mundo. Bajo la perspectiva de la calidad de la educación y de la divulgación del conocimiento, estos rankings facilitan a las universidades la posibilidad de diseñar estrategias que les permitan competir de una forma justa y transparente en busca de los primeros lugares de los mismos. El objetivo del presente estudio fue realizar un análisis descriptivo del estado de las universidades colombianas siguiendo la clasificación propuesta por la última actualización del Ranking Iberoamericano SCImago SIR 2012.

MATERIALES Y MÉTODOS M u e s t r a . S e t o m a r o n l a s p r i m e ra s 5 0 universidades Colombianas del Ranking Iberoamericano Scimago 2012 (10), lo que equivale al 3.7% del total de Universidades iberoamericanas dentro del ranking. Para analizar y comparar el progreso académico de las universidades en el tiempo, también se incluyeron las clasificaciones de SCImago de 2010 y 2011 (10). Análisis de los datos. Los registros procedentes del ranking Iberoamericano SIR 2012 se integraron a una base de datos y mediante una hoja de cálculo de Ms Excel® se elaboraron tablas y figuras. Se emplearon indicadores bibliométricos cuantitativos basados en el análisis de la información contenida en dicho ranking y se discriminaron por las variables o indicadores utilizadas por Scimago: Producción Científica (PC). Es la producción de la institución medida en número de publicaciones en revistas científicas. PC ofrece una idea general del tamaño de una institución. En publicaciones con coautoría, se asigna un punto a cada una de las instituciones participantes. Colaboración Internacional (CI). Ratio de publicaciones científicas de una institución que han sido elaboradas conjuntamente con otros

3401

países. Los valores se calculan analizando las publicaciones de una institución cuya filiación incluye direcciones pertenecientes a más de un país. Calidad Científica Promedio (CCP). Impacto científico de una institución después de eliminar la influencia del tamaño y el perfil temático de la institución. El CCP permite comparar instituciones de diferentes tamaños y con distintos perfiles de investigación. Una puntuación de 0.8 significa que una institución es citada un 20% menos que la media mundial. Un valor de 1.3 indica que la institución es citada un 30% más que la media mundial. Porcentaje de Publicaciones en Revistas del Primer Cuartil SJR (Q1). Indica el porcentaje de publicaciones que una institución ha publicado en revistas incluidas en el primer cuartil (25%) ordenadas por el indicador SJR. El indicador SJR mide la influencia o prestigio científico de las revistas mediante el análisis de la cantidad y la procedencia de las citas que recibe una revista científica. Su uso se ha extendido a través del portal SCImago Journal & Country Rank y es utilizado por Elsevier en su índice de citas Scopus (9). Ratio de Excelencia (ER). Indica el porcentaje de la producción de una institución que se encuentra incluida en el 10% de los trabajos más citados del mundo en sus respectivos campos científicos. Es un indicador de la producción científica de alta calidad que produce una institución.

RESULTADOS Al analizar a Colombia dentro del Ranking SIR 2012, se puede observar que ocupa el tercer lugar con 113 universidades en Iberoamérica (Figura 1A) y el séptimo puesto con 7 universidades con más de 400 documentos (Figura 1B), en ese sentido, sólo el 6.2% de las instituciones colombianas dentro del SIR 2012, mantienen una producción científica competitiva frente al resto de las universidades Iberoamericanas. Las 50 primeras universidades de Colombia de un total de 113 en el listado del Ranking Iberoamericano en el período 2010-2012, se muestran en la tabla 1. De las 113 universidades colombianas, el 44% son públicas y el 56% privadas. En la tabla 1 se puede ver como algunas universidades se han mantenido en sus puestos durante estos tres años, como la Universidad Nacional de Colombia y la Universidad de Antioquia; otras han perdido o escalado posiciones tanto a nivel nacional como internacional.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

A. Columnas rojas se observa el número de universidades por país dentro del ranking. B. Columnas azules universidades con más de 400 documentos publicados.

Figura 1. Clasificación de países dentro del Ranking Iberoamericano 2012, según SCImago (10).

Tabla 1. Clasificación de las primeras 50 Universidades colombianas, 2010-2012. Universidad

2012

2011

2010

COL

IBE

LAC

COL

IBE

LAC

COL

IBE

LAC

Universidad Nacional de Colombia

Universidad de Antioquia

Universidad de los Andes, Colombia

108

121

Universidad del Valle

117

119

118

Pontificia Universidad Javeriana

144

153

154

Universidad Industrial de Santander

150

162

101

158

Universidad del Rosario

205

136

219

148

226

152

Universidad Pontificia Bolivariana

244

168

244

168

236

161

Universidad del Norte

257

180

318

233

307

221

Universidad del Cauca

275

197

298

216

259

178

Universidad Tecnológica de Pereira

289

210

333

247

304

218

Universidad de Caldas

299

219

328

242

296

210

Universidad de Cartagena

312

230

337

251

306

220

Universidad EAFIT

318

235

343

257

298

212

Universidad Distrital Francisco José de Caldas

334

248

368

280

346

254

Universidad del Quindío

339

253

383

293

333

244

Universidad de Cordoba

341

255

366

278

355

262

Universidad CES

347

261

339

253

315

228

Universidad de La Sabana

355

268

384

294

356

263

Universidad El Bosque

363

275

358

272

330

241

Universidad del Tolima

374

286

429

334

361

268

Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia

385

297

405

312

360

267

Universidad de Pamplona

389

301

372

284

323

235

Universidad Autónoma de Occidente

404

311

482

385

388

292

Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano

425

330

436

341

393

297

Universidad Militar Nueva Granada

428

333

446

351

368

274

Universidad del Magdalena

444

349

455

358

379

284

Universidad de Nariño

457

360

488

390

372

277

Universidad Autónoma de Bucaramanga

479

381

434

339

334

245

Universidad de La Salle

509

410

516

416

415

315

Mattar - Análisis de las universidades colombianas

3403

Universidad de San Buenaventura

512

413

507

407

373

278

Universidad Antonio Nariño

534

432

537

434

391

295

Universidad Santo Tomas

537

435

615

506

478

370

Universidad de Sucre

535

433

560

454

439

333

Universidad Surcolombiana

553

450

568

462

408

308

Universidad del Atlántico

559

455

609

500

442

336

Fundación Universitaria San Martin

614

504

614

505

446

340

Escuela de Ingeniería de Antioquia

628

517

637

525

463

357

Instituto Tecnológico Metropolitano

644

532

745

628

541

431

Universidad Católica de Colombia

645

533

628

519

480

372

Universidad Popular del Cesar

648

536

616

507

411

311

Universidad Santiago de Cali

653

541

642

530

454

348

Universidad Autónoma de Manizales

659

547

622

513

449

343

Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid

668

554

654

540

472

364

Universidad de Santander

679

565

680

565

489

380

Universidad de Manizales

689

575

707

590

479

371

Escuela Colombiana de Ingeniería Julio Garavito

693

578

700

583

488

379

Universidad Pedagógica Nacional, Bogotá

706

591

766

647

512

403

Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud

711

596

714

597

471

363

Universidad Central

712

597

795

675

COL: Colombia; IBE: Iberoamérica; LAC: Latino América.

Al analizar el factor relacionado con la producción científica (PC), la Universidad Nacional de Colombia ocupa el primer lugar con 4.302 publicaciones, seguido de la Universidad de Antioquia con 2.326, en tercer lugar la Universidad de los Andes con 1.709. Existe una diferencia significativa (p≤0.05) en este factor con relación a las publicaciones entre las cinco primeras universidades. Al comparar las tres primeras universidades internacionales del ranking: Universidad de Sao Paulo con 44610, Universidad Nacional Autónoma de México con 18350, Universidade Estadual de Campinas con 16154; se nota una amplia diferencia de este factor con las cinco primeras universidades colombianas. En la figura 2 se describe el factor de colaboración internacional, relacionado con las publicaciones científicas en donde uno o más coautores pertenecen a diferentes países; se observó un aumento en todas las universidades del país. Las tres primeras universidades colombianas que sobresalen con este indicador son: Universidad de Pamplona (68.7), Universidad del Atlántico (63.3) y Universidad Jorge Tadeo Lozano de Bogotá (63.1), las cuales tienen una clasificación dentro del Ranking nacional de 23, 36, 25, respectivamente. Este factor es importante por la visibilidad; sin embargo, al parecer no pondera lo suficiente en la producción científica de la universidad ni en el puesto final en el ranking. Al comparar el factor de colaboración internacional de las tres primeras universidades latinoamericanas como son Universidad de Chile

(43.9), Universidad de Buenos Aires (39.8) y Universidad Nacional Autónoma de México (38.3), las universidades colombianas paradójicamente mostraron una mejor cooperación internacional; es decir, que a pesar del mayor desarrollo que tienen las tres universidades extranjeras mencionadas, las colombianas repuntaron con este factor. También se evaluó la calidad científica promedio (CCP), la cual mide las citaciones de las universidades, que es una especie de factor de impacto universitario; una puntuación de 0.8 demuestra que una universidad es citada un 20% menos que la media mundial y un valor de 1.3 indica que es citada un 30% más que la media mundial. Este valor en general para todas las instituciones del país está muy por debajo de la puntuación media mundial, las tres universidades que sobresalieron fueron: Universidad Antonio Nariño con una puntuación de 2.5, Universidad El Bosque con 1.2 y las Universidades de Caldas, Escuela Colombiana de Ingeniería Julio Garavito y de los Andes, con puntuación de 1 (Figura 3). El resto de universidades no superaron una puntuación de 0.9 con excepción de las Universidades de Caldas y de los Andes puestos 12 y 3 respectivamente; no se observó relación con la ubicación en el ranking. Al comparar las universidades latinoamericanas que ocupan los tres primeros puestos en este factor de medición ninguna superó la puntuación de 1. Es importante que las IES de Colombia se enfoquen en las publicaciones de calidad e impacto para mejorar el peso y la visibilidad internacional.

3404

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013 Universidad Nacional de Colombia Universidad de Antioqui a Universidad de los Andes, Colombia Universidad del Valle Pontificia Universidad Javeri ana Universidad Indus trial de Santander Universidad del Rosario Universidad Pontificia Bol ivariana Universidad del Norte Universidad del Cauca Universidad Tecnológica de Pereira Universidad de Caldas Universidad de Cart agena Universidad EAFIT Universidad Dis trital Francis co José de Caldas Universidad del Quindí o Universidad de Cordoba Universidad CES Universidad de La Sabana Universidad El Bos que Universidad del Tolima Universidad Pedagógic a y Tec nol ógica de Colombi a Universidad de Pamplona Universidad Au tónoma de Occidente Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Loz ano Universidad Militar Nu eva Granada Universidad del Magdalena Universidad de Nariño Universidad Au tónoma de Bucaramanga Universidad de La Salle Universidad de San Buenavent ura Universidad An tonio Nariño Universidad de Sucre Universidad Santo Tomas Universidad Su rcolombiana Universidad del Atl ánt ico Fundación Un iversitari a San Marti n Escuela de Ingeniería de Antioqui a Ins tituto Tecnológico Metropolitano Universidad Cat ól ica de Colombi a Universidad Popular del Cesar Universidad Santi ago de Cali Universidad Au tónoma de Manizales Politécnic o Colombi an o Jaime Isaza Cadavid Universidad de Santander Universidad de Maniz al es Escuela Col ombiana de Ingeniería Julio Garavito Universidad Pedagógic a Nacional, Bogotá Fundación Un iversitari a de Ci enc ias de la Salud Universidad Cent ral 0

Figura 2. Relación de Colaboración Internacional en publicaciones con autores de diferentes nacionalidades.

SCImago incluyó el factor del porcentaje de publicaciones de las universidades en revistas del primer cuartil SJR. Esto mide la influencia o prestigio científico de las revistas mediante un análisis de cantidad y procedencia de las citas que recibe una revista científica (factor de impacto). Sólo 14 universidades de las estudiadas se mantuvieron sobre el promedio anteriormente mencionado y de acuerdo con este análisis las tres mejores IES colombianas fueron: Universidad del Bosque (46.5), Escuela de Ingeniería de Antioquia (38.9) y Universidad de Pamplona (38.8). Al comparar esta medición con las tres primeras universidades Latinoamericanas: Universidad

de Buenos Aires (51.5), Universidad Nacional Autónoma de México (44.9), Universidad de Chile (42.9) se observa una mayor puntuación en las 3 latinoamericanas. Finalmente, el ratio de excelencia, mide el porcentaje de la producción (output) de las instituciones nacionales, lo cual indica que una universidad se encuentra incluida en el 10% de los trabajos más citados del mundo en sus respectivos campos científicos. Esto es muy importante y demuestra el esfuerzo de las universidades en publicar sus investigaciones en revistas de calidad. Las tres universidades

Mattar - Análisis de las universidades colombianas Universidad Antonio Nariño

3405

2.5

Universidad El Bosque

1.2

Universidad de los Andes, Colombia

Universidad de Caldas

Escuela Colombiana de Ingeniería Julio Garavito

CCP

Universidad El Bosque

46.5

Escuela de Ingeniería de Antioquia

38.9

Universidad de Pamplona

38.8

Universidad de los Andes, Colombia

37.3

Universidad de Santander

35.7

Universidad Antonio Nariño

Escuela Colombiana de Ingeniería Julio Garavito

21.4

Universidad El Bosque

17.8

Universidad de los Andes, Colombia

13.1

Universidad de Caldas

12.8 05

Figura 3. Distribución de las Universidades según su Calidad Científica Promedio (CCP), Publicaciones en el primer cuartil (Q1) y Ratio de Excelencia (ER).

que se destacaron en esta categoría fueron: Universidad Antonio Nariño, Escuela Colombiana de Ingeniería Julio Garavito y Universidad El Bosque (Figura 3).

DISCUSIÓN La mayoría de las universidades que se destacan en los primeros puestos del ranking, le han apostado a la investigación como la variable crucial que “arrastra” por si sola a los otros factores. Esto significa tener mejores profesores, ojalá la mayoría con doctorado y maestria, que en últimas son los que impulsan las investigaciones de calidad que generan publicaciones. El mundo académico exige tambien la unión de grupos de investigación, en ese sentido el factor de la cooperación internacional es importante para tener un puesto de honor en la clasificacion de las IES. El 44% de las universidades en el ranking son públicas, de ellas las 2 primeras han liderado durante los 3 últimos años la clasificación (Tabla 1). Entre las 10 primeras del pais la mitad son públicas, lo que es relevante, ya que indica que los aportes del estado en estas universidades han sido bien invertidos. Esta inversión también se ve reflejada con las publicaciones en áreas específicas en los analisis bibliométricos previos, donde las IES han aportado más del 85% de las publicaciones (11).

Aunque las carreras de pregrado son muy importantes para la nación, las 50 primeras IES de Colombia (Tabla 1) le han apostado fuerte a las escuelas de postgrado como generadores de nuevos conocimientos. Es claro que los estudiantes de postgrado (Maestría y Doctorado), son los que inciden en la clasificación de las universidades, ya que ellos son quienes generan la mayoría de las publicaciones con sus tutores. Las IES internacionales como la universidad de Sao Pablo (Brasil), por ejemplo, primera en el escalafón de SCImago (Tabla 1), el 60% de sus estudiantes están matriculados en escuelas de postgrados. Esto requiere repensar si las universidades de Colombia deben aumentar una cobertura anodina con estudiantes de pregrado o apostarle a este factor al menos por un decenio. Esto permitira subir en el ranking sin desconocer desde luego, el papel de la universidad en la preparación de jovenes profesionales que requiere el país, así como el relevo generacional que ellos representan. Con relación a la producción científica, se puede observar claramente un incremento en la mayoría de las instituciones de educación superior en la búsqueda de divulgar la información que se desarrolla en cada una de ellas. Esto se refleja en el creciente número de revistas científicas que cada año hacen parte de la clasificación nacional de PUBLINDEX COLCIENCIAS (12,13), esta última ha motivado y exigido el fortalecimiento

3406

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

a las revistas nacionales con el objeto de acceder a las bases de datos internacionales más importantes que son las que en última instancia muestran la visibilidad global.

promulgadas por COLCIENCIAS-PUBLINDEX y es conveniente que las IES colombianas las tengan muy en cuenta a la hora de financiar las revistas institucionales.

Con respecto a la cooperación internacional, se debe en gran medida a la relación personal entre los investigadores del país con sus colegas de universidades extranjeras, pero no porque en Colombia exista una politica que invierta en ese factor. La cooperacion internacional es una excelente estrategia para las universidades, dado que al publicar con instituciones mejor escalafonadas su visibilidad aumenta y de paso su reconocimeinto de trabajo en grupo, además de todos los créditos académicos que esta relación implica en la generación del nuevo conocimiento.

Si bien es cierto que las universidades públicas ocupan los dos primeros lugares del ranking desde el 2010, es importante resaltar que algunas universidades privadas como Antonio Nariño, el Bosque y la Escuela Colombiana de Ingenieria, a pesar de no estar en los 15 primeros puestos del pais, han hecho esfuerzos destacados para mejorar los indicadores de calidad científica, realizando publicaciones en el primer cuartil y radio de excelencia. Las universidades públicas de Caldas (calidad cientifica) y Pamplona (primer cuartil) se muestran interesadas en mejorar esos indicadores, política y estrategia que deberían seguir todas las universidades colombianas. Es muy probable que en la proxima clasificación este esfuerzo se vea reflejado en las posiciones del ranking.

Al observar la calidad científica promedio, se ve una disminución en las citaciones de las instituciones del país. Este factor afecta a las IES en Colombia, dado por el menor número de revistas científicas del país en bases de datos de más alto prestigio como son ISI o SCOPUS, entre otras, lo que reduce el número de las citaciones a instituciones colombianas. El porcentaje de publicaciones en revistas del primer cuartil SJR, se torna muy reducido y mucho se debe al incremento de las exigencias que tienen las revistas con mayor factor de impacto, por lo cual se deben incrementar políticas de calidad científica de las publicaciones que se generan dentro de las instituciones educativas. Estas políticas en términos generales están

En conclusión, cada día se le da mayor importancia a las clasificaciones o rankings que se desarrollan a nivel mundial, aunque varía en la forma en que cada país asume las responsabilidades y estrategias relacionadas con este tipo de categorizaciones. Las IES de Colombia deben mandatoriamente apostarle a la calidad vista al menos desde la perspectiva de los cinco factores analizados por SCImago. Aunque los rankings no obligan a las universidades a aceptar los escalafones; el ignorarlos no significa otra cosa que un autoaislamiento en un mundo cada día más globalizado.

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4. Docampo D. “Rankings internacionales y calidad institucional”. Revista de Educación 2008; Número Extraordinario:149-176. URL Disponible en: http://www. revistaeducacion.mec.es/re2008/ re2008_07.pdf 5. Martínez RF. Los rankings de universidades: una visión crítica. Rev Educ Sup 2011; 40(157):77-97. URL Disponible en: http:// scielo.unam.mx/pdf/resu/v40n157/ v40n157a4.pdf 6. ARGU. About Academic Ranking of World Universities. [en línea]. China: Shanghai Jiao Tong University; 2013 [fecha de acceso enero de 2013]. URL Disponible en: http:// www.shanghairanking.com/aboutarwu.html

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3407

11. Ríos R, Mattar S, González M. Análisis bibliométrico de las publicaciones sobre enfermedades infecciosas en Colombia, 2000-2009. Rev Salud Pública 2011; 13(2):298-307. 12. González M, Mattar S. Índice Bibliográfico Nacional – IBN Publindex 2004 – 2010. Rev MVZ Córdoba 2010; editorial 15(3): 2145-2146. 13. Indicadores Publindex 2002-2011. [en línea]. Colombia: Publindex, Colciencias; 2011. URL Disponible en: http://www. colciencias.gov.co/sites/default/files/ ckeditor_files/files/INDICADORES%20 GENERALES%20PUBLINDEX%202011.pdf.

Rev.MVZ Córdoba 18(1):3408-3413, 2013. COMUNICACIÓN BREVE

Variaciones hematológicas y de presión sanguínea en perros después de una picadura de abejas Hematological and peripheral blood pressure changes in dogs after a bee sting Jorge Muñoz G,1 MV, Verónica Arnes V,1 Tec Med, Marcelo Mieres L,1 M.Sc, Mirela Noro,1* Ph.D. Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias Veterinarias, Instituto Ciencias Clínicas Veterinarias. Casilla 567, Valdivia, Chile. *Correspondencia: mirelanoro@gmail.com. 1

Recibido: Abril de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

RESUMEN Objetivo. El objetivo de este estudio fue determinar los cambios hematológicos y de presión arterial en perros después de una picadura cutánea de abejas. Material y métodos. Se utilizaron 10 perros adultos, a los cuales se les inoculó veneno de abeja mediante una picadura cutánea controlada. De cada animal se extrajo una muestra de sangre previa y los 15 y 300 minutos post inoculación. Se registró la presión arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD), media (PAM) y de pulso (PP) desde 15 minutos previos hasta 45 minutos posteriores a la inoculación. Resultados. El recuento de eritrocitos, el hematocrito y la concentración de hemoglobina se redujeron a los 15 minutos post-inoculación (p<0.05), retornando a valores basales al tiempo 300. El recuento de reticulocitos disminuyó al tiempo 15 en relación al tiempo 0 (p<0.05), manteniéndose bajo a los 300 minutos. Se observó una disminución del recuento relativo de eosinófilos a los 300 minutos relación al tiempo 0 (p<0.05). La media de la PAS a los minutos 3, 15, 30 y 39 fueron inferiores a la del minuto -15, y en la PAD, las medias de los minutos 15, 42 y 45 fueron inferiores a del minuto 9 (p<0.05). A su vez, la PAM y la PP permanecieron constantes (p>0.05). Conclusiones. La picadura cutánea de abejas produce un descenso transitorio del recuento de eritrocitos, hematocrito y concentración de hemoglobina, junto con una disminución en el recuento de reticulocitos y del recuento relativo de eosinófilos, sin alterar mayormente la presión sanguínea. Palabras clave: Hematología, perros, presión sanguínea, veneno de abeja (Fuente: MeSH, DeCS).

ABSTRACT Objective. The purpose of this study was to determine changes in hematological parameters and arterial blood pressure in dogs after a bee sting. Materials and methods. Ten adult dogs were used, to which bee venom was inoculated through a direct bee sting. Three blood samples was extracted from the animal, the first sample before inoculation, and the other two samples were extracted 15 and 300 minutes after inoculation. Systolic (SAP), diastolic (DAP), mean (MAP) and pulse arterial pressure were also recorded for an hour, from 15 minutes before venom inoculation up to 45 minutes after, at intervals of three minutes between each record. Results. The erythrogram recorded a decrease in erythrocyte count, hematocrit and hemoglobin concentration at time 15 relative to time 0 (p<0.05), returning to basal values at time 300. The reticulocyte count decreased at 15 minutes in relation to

3408

Muñoz - Variaciones hematológicas y de presión sanguinea en perros

3409

time 0 (p<0.05), staying low at 300 minutes. White blood cell count showed a decrease in eosinophils at 300 minutes relative to time 0 (p<0.05). Regarding blood pressure, the mean SAP readings on minutes 3, 15, 30 and 39 were lower than minute -15, and the mean DAP readings on minutes 15, 42 and 45 were lower than minute 9 (p<0.05). The MAP and pulse pressure records remained constant (p>0.05). Conclusions. A skin deep bee sting can produce a transient decrease in erythrocyte count, hematocrit and hemoglobin, along with a decrease in reticulocyte count and eosinophil relative count, without major alterations in blood pressure. Key words: Bee venom, blood pressure, dogs, hematology (Sources: MeSH, DeCs).

INTRODUCCIÓN La apiterapia es el uso de productos de las abejas para prevenir, curar o recuperar a un individuo de una o más enfermedades. La aplicación terapéutica del veneno de abejas ha sido usada desde tiempos antiguos, incluyendo la administración a partir de picadura con abejas vivas, inyecciones y acupuntura con veneno de abeja (1). Después de una picadura de abeja, lo primero y más común es el dolor local y la hinchazón. Esta reacción se produce en todos los individuos picados, debido a los componentes vasoactivos del veneno de abeja y no por un mecanismo alérgico (2). La inyección de veneno de abeja produce dolor tónico e hiperalgesia, pudiendo ejercer al mismo tiempo efectos antiinflamatorios y antinociceptivos en cuadros inflamatorios. En base a esto, la apiterapia ha sido utilizada en la medicina tradicional para el tratamiento de varias enfermedades como artritis, reumatismos, dolor, tumores cancerosos y enfermedades de la piel (3). La terapia con veneno de abejas es curativa y profiláctica, porque además de aliviar diversas enfermedades actúa sobre todo el organismo y aumenta la inmunidad (4). Por otro lado se han descrito efectos adversos como hemólisis en perros atacados por enjambres de abejas (5), desconociéndose el efecto de dosis consideradas terapéuticas de veneno de abejas sobre los parámetros hematológicos y de presión sanguínea en perros. El objetivo del estudio fue determinar los cambios hematológicos y en la presión sanguínea periférica de perros posterior a una picadura cutánea controlada de abejas.

MATERIAL Y MÉTODOS Animales. Se utilizaron 10 perros mestizos, 2 machos y 8 hembras, entre 2 a 6 años de edad, y 12 y 24 kg (15.6 ± 4.3 kg) de peso.

Aspectos éticos. El estudio fue realizado acorde a las Normas para la utilización de animales en investigación, según el Comité Uso de Animales en la Investigación de la Universidad Austral de Chile. Para el ensayo se utilizó un pequeño número muestral, además los procedimientos con los animales fueron realizados por un único profesional entrenado para manipulación y obtención de muestras sanguíneas de forma a garantizar el bienestar y no alterar los parámetros fisiológicos. Todos los procedimientos fueron autorizados por los propietarios de los animales. Recolección de abejas. Las abejas Apis mellifera fueron obtenidas de una colonia silvestre. Para ello, se utilizó un frasco de boca ancha con un cono de cartón, papel y miel en su interior. Se procedió a la captura de abejas vivas ubicando dicho frasco cerca de la entrada de la colmena, donde las abejas entraban libremente a recolectar la miel, capturándose de esta manera únicamente abejas pecoreadoras. Las abejas fueron capturadas 1 ó 2 días antes de ser utilizadas, manteniéndolas en el frasco hasta su uso. Método de inoculación del veneno de abejas. Con el animal en decúbito esternal o lateral derecho y un bozal, se inoculó veneno de una abeja en el codo izquierdo a través de la picadura directa entre el epicóndilo lateral del húmero y el olecranon, dejando la lanceta inocular veneno durante 3 segundos, para luego ser retirada. Para lograr esto, se colocó un trozo de tela elástica tensado y presionado contra el codo de los perros por sobre el cual se aproximó la abeja para que pique sujetándola por las alas con una pinza hemostática. Una vez clavada la lanceta, se esperó 3 segundos y retiró la tela, arrastrando la lanceta. Obtención y procesamiento de las muestras de sangre. De cada animal se obtuvo una muestra de sangre con EDTA de la vena cefálica del miembro anterior derecho, previo

3410

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

a la picadura de abeja (tiempo 0; antes de comenzar con las mediciones de la presión sanguínea) y a los 15 y 300 minutos postinoculación. En las muestras se determinó el recuento de eritrocitos (cámara de Neubauer), hematocrito (microhematocrito), concentración de hemoglobina (cianmetahemoglobina, 546 nm, fotómetro Hitachi ® 4020), índices de Wintrobe (volumen corpuscular medio o VCM, concentración de hemoglobina corpuscular media o CHbCM), recuento de leucocitos (cámara Neubauer). El diferencial celular se realizó en frotis teñido con tinción rápida de Corzap®1, Hemogram, Brasil; además se realizó el recuento plaquetario promediando 10 campos del frotis, para obtener el recuento por µl se multiplicó el resultado por 20.000 x1000 = 20.000 plaquetas/ µl) El recuento de reticulocitos se realizó incubando 3 gotas de sangre con EDTA mezcladas con 3 gotas de azul cresil brillante en baño térmico a 37ºC por 15 minutos, posteriormente se realizó un extendido en portaobjeto, el cual fue observado al microscopio (1000x), contando el total de reticulocitos en 10 campos homogéneos. Las variables cualitativas del hemograma se expresaron con el grado de presencia en el frotis: 0= ausencia, 1= presencia escasa, 2= presencia moderada y 3= abundante. Medición de la presión. Se registró la presión arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD) y media (PAM) desde 15 minutos antes de la picadura hasta 45 minutos post-picadura con intervalos de 3 minutos, mediante un equipo multiparámetro con oscilómetro, Datascope® TrioTM, utilizándo una manga pediátrica colocada en el antebrazo izquierdo de los perros, inmediatamente distal al codo. La presión de pulso (PP) fue calculada como la diferencia entre la PAS y la PAD. Para las mediciones, los perros se encontraban en decúbito esternal o lateral derecho en un lugar silencioso, a fin de disminuir el estrés y distracciones. Análisis estadístico. Se realizó un análisis descriptivo, normalidad mediante la prueba de Shapiro-Wilk, y de homocedasticidad mediante la prueba de Bartlett. Las diferencias entre tiempos para las variables paramétricas y homocedásticas se realizaron mediante un modelo lineal AOV/AOCV considerando el animal como un cofactor, y los promedios se contrastaron por la prueba de Tukey. Los datos no paramétricos o heterocedásticos fueron contrastados mediante la prueba de Kruskall-Wallis, a un nivel de significancia del 95% en el al programa Statistix® 8.0 (NH Analytical Software, Roseville, MN; USA).

RESULTADOS Durante la picadura de la abeja se apreció una breve vocalización en un perro, manifestada con un gemido. Cinco perros reaccionaron levantando la cabeza, mirándose la zona de inoculación, retirando el brazo o intentando ponerse de pie, reacción que no duró más de 5 segundos, mientras que los otros no mostraron reacción durante la inoculación. Hemograma. Posterior a la picadura de abejas el recuento de eritrocitos, el hematocrito y la concentración de hemoglobina disminuyeron (p<0.05), retornando a sus valores basales a los 300 minutos (Tabla 1). El VCM, la CHbCM, la presencia de anisocitosis y policromasia, el recuento plaquetario, la concentración de proteínas plasmáticas totales y fibrinógeno no evidenciaron variaciones posterior a la picadura (p>0.05; Tabla 1). Por otro lado, el recuento de reticulocitos disminuyó a los 15 minutos en relación al tiempo 0 (p<0.05), manteniéndose bajos a los 300 minutos (Tabla 1).

Tabla 1. Valores ( X ± DE) de las variables del eritrograma previo (tiempo 0) y a los 15 y 300 minutos de una picadura cutánea controlada de abeja en 10 perros. Tiempo (minutos)

300

Valor P

Eritrocitos (106/µL)

6.78 ± 0.65ª

6.16 ± 0.62b

6.72 ± 0.64ª

0.0016

Hematocrito (%)

50.4 ± 4.74ª

45.2 ± 3.22b

48.6 ± 3.98ª

0.0001

Hemoglobina (g/dL)

17.2 ± 2.04ª

16.0 ± 1.74b

17.0 ± 1.93ª

0.0105

VCM (fL)

74.6 ± 6.82ª

73.5 ± 3.75ª

72.7 ± 4.55ª

0.6196

CHbCM (g/dL)

34.1 ± 2.11ª

35.4 ± 2.14ª

34.9 ± 1.76ª

0.0656

Anisocitosis (0-3)

1.4 ± 0.52ª

0.8013

Policromasia (0-3)

1.3 ± 0.48ª

1.2 ± 0.42ª

0.3874

Reticulocitos (%)

1.17 ± 0.89ª

0.69 ± 0.58b

0.74 ± 0.66b

0.0191

242 ± 89

275 ± 55

317 ± 62

0.1033

Proteínas (g/L)

68.5 ± 8.78ª

66.0 ± 7.83ª

67.8 ± 7.97ª

0.0570

Fibrinógeno (g/L)

3.2 ± 0.42ª

3.1 ± 0.32ª

0.3874

Plaquetas (103/µL)

a,b diferencias entre tiempos (p<0.05).

Muñoz - Variaciones hematológicas y de presión sanguinea en perros Las variables del leucograma se mantuvieron constantes en el tiempo posterior a la picadura de la abeja (p>0.05), excepto el recuento relativo de eosinófilos, que descendió a los 300 minutos en relación al tiempo 0 (p<0.05; Tabla 2).

Tabla 2. Valores ( X ± DE) de las variables del leucograma previo (tiempo 0) y a los 15 y 300 minutos de una picadura cutánea controlada de abeja en 10 perros. Tiempo (minutos)

300

Valor P

Leucocitos (Cél/µL)

10191 ± 2570ª

11603 ± 2992ª

11.492 ± 2989ª

0.1686

Eosinófilos

12.4 ± 6.93ª

10.8 ± 5.37ªb

7.1 ± 5.26b

0.0383

Neutrófilos

62.3 ± 9.01ª

64.7 ± 9.27ª

70.2 ± 8.11ª

0.0772

Linfocitos

15.7 ± 4.16ª

15.4 ± 6.65ª

15.2 ± 7.48ª

0.9794

Monocitos

9.6 ± 4.74ª

9.1 ± 4.75ª

7.5 ± 2.8ª

0.3244

Rec. relativo (%)

Rec. absoluto (Cél/µL) Eosinófilos

1250 ± 682ª

1327 ± 860ª

826 ± 679ª

0.0772

Neutrófilos

6328 ± 1755ª

7538 ± 2495ª

8193 ± 2819ª

0.0674

Linfocitos

1601 ± 582ª

1675 ± 624ª

1570 ± 571ª

0.9251

Monocitos

1013 ± 666ª

1063 ± 651ª

902 ± 506ª

0.6195

Rec.= recuento; a,b diferencias entre tiempos (p<0.05).

Presión. Los valores de la PAS a los distintos tiempos se mantuvieron constantes, salvo a los 3, 15, 30 y 39 minutos, en que se registraron valores menores al del minuto -15 (p<0.05; Figura 1a), no presentando diferencias con los demás minutos (p>0.05). Similar la PAD se mantuvo constante, salvo a los minutos 15, 42 y 45, los cuales fueron inferiores al registrado en el minuto 9 (p<0.05, Figura 1b). Los valores medios de la PAM y de la PP se mantuvieron constantes posterior a la picadura de abejas (p>0.05).

3411

DISCUSIÓN Los hallazgos de dolor leve en la mitad de los perros contradice a otro estudio en que indica que todos animales presentan dolor local e hinchazón posterior a una picadura de abeja causada por los componentes vasoactivos del veneno de abeja (2). La mayor responsable del dolor local posterior a la picadura sería la melitina, presente en el veneno de abejas, la cual es capaz de hidrolizar membranas celulares, alterar la permeabilidad celular y causar liberación de histamina. Es por eso que individuos picados por abejas presentan dolor tónico y una breve vocalización (6). Posterior a la picadura de la abeja ocurrió una disminución transitoria del recuento de eritrocitos, hematocrito y concentración de hemoglobina, observándose además, un descenso sostenido en el recuento de reticulocitos (Tabla 1), al mismo tiempo dentro de los límites de referencia. Estos cambios podrían indicar una redistribución de los eritrocitos hacia el bazo, los cuales a los 300 minutos retornaron a la circulación general (7). El bazo actúa como reservorio de eritrocitos, donde estos pueden quedar atrapados en las trabéculas luego de rezumar a través de los capilares hacia la maya trabecular. Por otro lado se describe que perros atacados por enjambres de abejas presentan anemia macrocítica, anisocitosis, policromasia, metarrubrocitemia moderada asociadas a una hemólisis (5). En estudios realizados in vitro con sangre entera de rata con EDTA mezclada con veneno de abejas (1 µg/mL de sangre) no se observó variaciones en las variables eritrocitarias (8). Una disminución en el recuento relativo de eosinófilos (Tabla 2) posterior a la picadura podría deberse a estrés o migración de eosinófilos al tejido donde se produjo la picadura de abeja. Los eosinófilos tienen una especial tendencia a acumularse en los tejidos en que se producen

Figura 1. Valores ( X ± DE) de la presión arterial sistólica (PAS; superior) y diastólica (PAD; inferior) (mm Hg) de 10 caninos adultos sometidos a una picadura cutánea controlada de abeja (tiempo 0). a,b p<0.05; ↑picadura; #obtención de muestra de sangre.

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reacciones alérgicas, como en la piel después de las reacciones alérgicas cutáneas (7). Al respecto, en lesiones inflamatorias podría ocurrir secuestro, degranulación o destrucción de eosinófilos, lo que podría llevar a eosinopenia (9). La melitina es capaz de desencadenar dolor local en la zona de la picadura y adicionalmente induce liberación de catecolaminas (2). El resultado del leucograma indica que el descenso en el porcentaje de eosinófilos podría deberse a la migración de los eosinófilos circulantes al lugar de inoculación del veneno y no al estrés, debido a que no se apreció neutrofilia, linfopenia ni monocitosis (9). Las variaciones observadas en las variables de presión post-inoculación fueron mínimas (3 mm Hg para la PAS, 2 mm Hg para la PAD y para la PAM, y 1 mm Hg para la presión de pulso), y estarían asociadas a la liberación de catecolaminas e incremento de la actividad simpática por el estrés por miedo y dolor, resultando en un consecuente aumento en la frecuencia cardiaca y en la presión sanguínea (7). Sin embargo, el veneno administrado por vía endovenosa en dosis altas (5 mg/kg) ha generado un descenso progresivo de la presión sanguínea, mientras que al ser administrado en dosis bajas (0.2 a 0.5 mg/kg) ejerció un efecto estimulante sobre el corazón, produciendo un marcado aumento de la presión ventricular izquierda con un leve cambio en la presión aórtica (10).

El veneno de abejas posee quininas entre sus constituyentes, las que influirían en la presión sanguínea, generando hipotensión (11). Por otro lado, individuos alérgicos al veneno de abejas pueden presentar signología cardiovascular al verse expuestos a éste, pudiéndose encontrar signos tales como hipotensión, vasodilatación con hipovolemia secundaria y aumento de la permeabilidad (12). Sin embargo, no se observó signología de alergia en los perros durante el tiempo de seguimiento, así como tampoco cambios significativos en la presión sanguínea. Las variaciones momentáneas y de baja magnitud en los parámetros hematológicos, y la mantención de la presión sanguínea en perros sometidos a una picadura cutánea de abejas por 3 segundos indica que la misma no fue un factor que generó un estrés significativo en los perros. Se sugiere que la aplicación terapéutica de veneno de abejas a través de la picadura directa con abejas vivas, en microdosis, en perros que no presentan alergia al veneno de abeja, sería un método alternativo seguro para el tratamiento de las enfermedades en que se señala que éste sería efectivo. Se puede concluir que la picadura cutánea controlada de abejas en perros produce un descenso transitorio del recuento de eritrocitos, hematocrito y concentración de hemoglobina, junto con una disminución en el recuento de reticulocitos y del recuento relativo de eosinófilos, sin alterar mayormente la presión sanguínea.

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3414-3419, 2013. COMUNICACIÓN BREVE

Ingreso de psittacidos al centro de atención de fauna (CAV–CVS), durante los años 2007-2009 Entrance of parrots to the center of attention of wildlife (CAVCVS), during the years 2007-2009 Juan Carrascal V,1* M.Sc, Julio Chacón P,2 MVZ, Vivian Ochoa C,3 MVZ. Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Ciencias Pecuarias. Montería, Colombia. 2Universidad de Córdoba, Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías. 3 Corporación Autónoma Regional de los Valles del Sinú y San Jorge – CVS. *Correspondencia: jcvelasque@yahoo.com. 1

Recibido: Septiembre de 2010; Aceptado: Diciembre de 2011.

RESUMEN Objetivo. En este estudio se determinó la dinámica de ingresos de la familia Psittacidae al Centro de Atención y Valoración de Fauna Silvestre (CAV – CVS). Materiales y métodos. Se tomaron datos obtenidos desde el año 2007 hasta el año 2009, a los cuales se implementó análisis de frecuencias para las variables especies, tipo de ingreso y tiempo (meses y años), para la variable meses se aplicó un análisis de diferencia de medias y se presentó la relación ingreso de las especies versus los meses del año, por medio de un stripplot. Resultados. La familia Psittacidae presentó el 58% del total de aves que ingresaron al CAV producto de decomisos preventivos realizados en mercados públicos y vías del departamento de Córdoba. La especie con mayor frecuencia de ingresos fue Brotogeris jugularis, con 73.99% del total de individuos, siendo la especie que obtuvo los mayores ingresos durante todo el año. Asimismo, se encontró diferencias significativas para el ingreso por meses (X2= 26.785, gl = 11, p-valor = 0.004951). Conclusiones. Se logró determinar que la época seca, acorde con las festividades en el departamento, presentó los valores más altos de ingresos. Palabras clave: Brotogeris jugularis, Colombia, fauna, Psittacidae (Fuente: CAB).

ABSTRACT Objetive. The entrance dynamics of family Psittacidae to the Wildlife Attention and Valuation Center (CAV - CVS) was determined. Materials and methods. Data were obtained between 2007 to 2009. A frequency analysis for the variables species, entrance type and time (months and years) was implemented. For the variable months an analysis of mean difference was applied and the relationship entrance of the species versus the months of the year by means of a stripplot was presented. Results. The Family Psittacidae presented 58% of the total of birds that entered the CAV-CVS, samples collected from public markets and highways of the department of Córdoba. The species with more entrance frequency was Brotogeris jugularis, with 73.99% of the total of individuals, being that specie the one that obtained higher entrances throughout the year. Significant differences in incoming samples per month (X2=26.785, df=11, p=0.004951), were also detected. Conclusions. The dry season, confluent with festivities in the department, presented the highest values of incomings to the center. Key words: Brotogeris jugularis, Colombia, fauna, Psittacidae (Source: CAB).

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Carrascal - Ingresos de psittacidos al centro de atencion de fauna

INTRODUCCIÓN Durante un extenso periodo de la historia colombiana la fauna silvestre ha sido objeto de libre uso y aprovechamiento; una de las principales consecuencias de este accionar es la declinación de las poblaciones de algunas especies animales (1). La enorme oferta de biodiversidad ha convertido también al país en un centro importante del comercio ilegal de vida silvestre y pese a la legislación existente y a las medidas adoptadas hasta ahora para fomentar su uso sostenible y garantizar su protección, se asume que el volumen del tráfico ilegal sigue siendo de gran magnitud, pero debido a la naturaleza ilícita de la actividad, a las pocas cifras disponibles sobre extracción y comercialización de fauna en el país, y a los pocos recursos con que cuentan las autoridades ambientales, se carece de patrones que permitan establecer el impacto biológico para cada especie, así como el impacto sobre los ecosistemas (2). De acuerdo con los registros de decomisos adelantados en el período comprendido entre 1992 y 1999 por parte del Ministerio de Ambiente, varias especies de la fauna silvestre pertenecientes a las clases aves, mamíferos, reptiles, anfibios, gasterópodos, peces, arácnidos, crustáceos y antozoarios son objeto de tráfico ilegal (3). En el caso de las aves, el comercio mundial afecta a un gran número de especies y representa una actividad económica importante para algunos países, como Perú, Bolivia y Mexico (4-7). Más de 2600 especies de aves han sido detectadas en el comercio internacional en los últimos 20 años, lo que representa aproximadamente el 27% de las especies descritas de este grupo de vertebrados (8). De acuerdo a estos, nace la estrategia nacional para la conservación de las aves de Colombia liderada por el Instituto Alexander von Humboldt, como una de sus metas la protección de especies amenazadas (9). Asimismo, se conoce que las aves mayormente decomisadas por las autoridades ambientales se encuentran representados en su gran mayoría por especímenes de la familia Psittacidae (10). A pesar de los datos registrados, se desconocen las cantidades y el por qué la gente anhela tener a los psitácidos como mascotas. Se demuestra que existe una alta demanda nacional para la tenencia de especies de psitácidos como mascotas a pesar de ser considerada una actividad ilegal (11). Sin embargo, dicha información sobre el tráfico en las Corporaciones Autónomas Regionales CAR’s en general no son divulgadas, impidiéndole al Ministerio de Ambiente Vivienda y Desarrollo (MAVDT) generar las estadísticas para un conocimiento preciso del tráfico de especies en

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Colombia (2) en especial al grupo de Psitácidos, el cual es considerado el más amenazado dentro de las aves colombianas (12). De acuerdo a lo anterior, en este trabajo se evaluó el ingreso de la familia Psittacidae al Centro de Atención y Valoración de Fauna Silvestre (CAV - CVS), teniendo en cuenta la naturaleza taxonómica, tipo de ingreso (Decomiso Preventivo y Entrega Voluntaria) y tiempo (años y meses).

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. Este trabajo se realizó durante el periodo 2007-2009 en las instalaciones del centro de atención y fauna silvestre CAVCVS ubicado en el municipio de Montería, Departamento de Córdoba (08º48’13.976” N y 75º50’41.755” W). Análisis de los datos. Este estudio presenta un análisis retrospectivo del ingreso de Psitaciformes al CAV-CVS. La información fue filtrada a partir de las bases de datos de ingresos de fauna al centro, agrupando la información de acuerdo a su naturaleza taxonómica, tipo de ingreso (Decomiso Preventivo y Entrega Voluntaria) y tiempo (años y meses), a estos datos se les aplicó un análisis de frecuencias. Para determinar si los datos se comportan normalmente se realizó el test de normalidad de Shapiro-Wilk, para luego realizar el test de Kruskal-Wallis con el fin de determinar si existía diferencia entre las medias entre los meses. Por otra parte, se realizó una grafica de puntos (stripplot) para comparar el ingreso de las especies según los meses. Estos análisis se realizaron con ayuda del software R 2.10.1.

RESULTADOS Al centro de atención de fauna silvestre CAVCVS en el periodo comprendido entre enero de 2007 y diciembre de 2009 ingresaron un total de 1111 individuos pertenecientes a 12 especies del orden Psitaciformes (Tabla 1), equivalentes al 53.98% de las aves que ingresaron al CAV durante el periodo de estudio. Cabe resaltar que solo un individuo no fue posible identificar a nivel específico por las condiciones de ingreso. Por su parte, la especie que presentó el porcentaje más alto de ingreso fue el perico (Brotogeris jugularis) con un 73.99% del total de individuos, seguida de la especie Aratinga pertinax (Cotorra) con un 12.87% (Figura 1). De acuerdo al tipo de ingreso, se encontró que los Psitácidos que ingresaron al CAV-CVS fue

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

Tabla 1. Listado de especies de Psitácidos que ingresaron al CAV-CVS durante el periodo comprendido entre enero de 2007 y diciembre de 2009. Género Amazona

Nombre Científico

Nombre Común

Amazona amazonica

Lora cari amarilla

Amazona autumnalis

Lora moña roja

Amazona farinosa

Lora mojosa

Amazona ochrocephala

Lora moña amarilla

Amazona sp

Lora

Ara ararauna

Guacamaya Vientre Amarillo

Ara macao

Guacamaya Bandera

Ara severa

Cheja

Aratinga

Aratinga pertinax

Cotorra

Brotogeris

Brotogeris jugularis

Perico

Forpus

Forpus conspicillatus

Cascabelito

Pionus

Pionus menstruus

Loro cabeciazul

Ara

un 37.17% del total de individuos. Al realizar este análisis teniendo en cuenta los meses se encontró que los picos más altos de ingresos de las especies de Psitácidos al CAV-CVS se dan principalmente en los meses de febrero (20.16%) con aumento en el mes de marzo (29.52%), así como también en los meses de diciembre (10.98) y julio (9.9%) (Figura. 2).

Figura 2. Variación mensual de ingresos de Psitácidos al Centro de Atención y Valoración CAV-CVS entre los años 2007 y 2009.

Figura 1. Frecuencia de ingreso por especies de Psitácidos al Centro de Atención y Valoración CAV-CVS entre los años 2007 y 2009.

dada mayormente por decomisos preventivos (97.66%) realizados en los principales mercados públicos y vías carreteables del departamento de Córdoba. El análisis de la frecuencia de ingresos por año mostró que el año 2008 obtuvo el mayor porcentaje de ingresos de Psitácidos al CAV con

Se encontró que los datos se comportan normalmente al aplicar el test de Shapiro – WilK (W = 0.4114, p-valor < 2.2e-16). De acuerdo a esto, el test de Kruskal-Wallis mostró que existen diferencias significativas en el ingreso de psitácidos entre el análisis de ingresos mensuales (X2= 26.785, gl = 11, p-valor = 0.004951). Al observar la gráfica de puntos para la relación ingreso de las especies por mes se puede notar que Brotogeris jugularis mostró los mayores ingresos a lo largo del año (Figura 3).

Figura 3. Diagrama de puntos para el ingresos de Psitácidos al Centro de Atención de Fauna Silvestre (CAVCVS) entre los años 2007 y 2009.

Carrascal - Ingresos de psittacidos al centro de atencion de fauna

DISCUSIÓN Al igual que lo mostrado en las estadísticas del uso ilegal de fauna silvestre en Colombia (13) y lo reportado por la CITES, donde para los años 1994-1996 la familia Psittacidae es la más afectada por el comercio ilícito a nivel global, con el 32.2.% del total de familias objeto de tráfico ilegal (14). Este trabajo muestró que el orden Psittaciformes presenta valores superiores al 50% del total de las aves que ingresaron al CAV. Es de anotar que la mayor parte de los individuos que ingresan al centro se encuentran en estado juvenil o neonatos, extraídos de sus nidadas. Dicha extracción de nidos es un factor de mortalidad de psitácidos generalizado y biológicamente significativo (15). Para México, se conoce que la cadena captura, transporte, distribución y venta, genera mortalidades estimadas del 77% de los individuos antes de poder ser entregados al consumidor, dado al trato inhumano que se le da a los individuos (16). De acuerdo a esto, esta situación advierte el colapso de las poblaciones de psitácidos en áreas naturales (10). Brotogeris jugularis presentó mayores decomisos durante todo el año (Figuras. 1, 3), siendo concordante con lo reportado en distintas partes del país, como en Girardot donde esta especie es comercializada ilegalmente principalmente en el mes de abril (11). De igual manera, según el Ministerio del Medio Ambiente B. jugularis presenta los mayores porcentajes de decomisos en el país (13). Igualmente, en otros países como Nicaragua esta especie es considerada como la de mayor comercialización por vendedores ambulantes en vías y mercados públicos, principalmente por su pequeño tamaño y fácil captura (17). Por otro lado, el ingreso de especies pertenecientes a los géneros Ara y Amazona, las cuales son consideradas dentro del Libro Rojo de Aves de Colombia y categorizadas dentro del listado de especies de la CITES (10, 18), muestran que Córdoba hace parte del eje de trafico de estas especies en el país, siendo concordante con lo mostrado por Baptiste y Franco (19), quienes advierten en su libro “Especies focales para la conservación en

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el departamento de Córdoba” que todas las especies de psitacidos muestran algún grado de amenaza por la presión de la cacería ilegal y la destrucción de los hábitats. En general, la familia Psittacidae sufre la mayor presión de cacería en época seca, la cual coincide con la época de reproducción de estas especies. Los psitacidos son capturados en las nidadas (huecos de árboles y termiteros) principalmente en estado juvenil o neonatal (20). Sumado a esto, es en estas épocas donde se da la mayor afluencia de turistas debido a las vacaciones, Semana Santa y festividades, que promueven no solo la venta de la oferta presente en los mercados, sino la extracción de más individuos para compensar la demanda de estas especies (11). Los resultados de este estudio mostraron diferencias significativas existentes entre los meses, dado por el aumento de ingresos en los meses de febrero y marzo, como se anotó anteriormente. En conclusión, los psitácidos representan el 58% de las aves que ingresan al Centro de Atención y Valoración (CAV – CVS), siendo la especie Brotogeris jugularis la que sufre mayor impacto por tráfico ilegal a lo largo del año. Asimismo, el tráfico ilegal de Psitácidos en el departamento de Córdoba se da principalmente en la época seca (febrero y marzo), causando disminuciones importantes en las poblaciones naturales, debido a que estos índices de decomisos concuerdan con las épocas de reproducción de estas especies. El departamento de Córdoba, se considera como un eje de tráfico a nivel nacional dado a que se dan procesos extractivos importantes, principalmente en especies con altos grados de amenaza. Agradecimientos Al Centro de Atención y Valoración (CAV-CVS) y a todo el personal que labora ahí, por permitir acceder a los datos de ingresos de fauna. A Roger Ayazo por su ayuda en el análisis de la información y a todas aquellas personas que de alguna u otra forma colaboraron para que este trabajo pudiera realizarse.

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Rev.MVZ Córdoba 18(1):3420-3424, 2013. CASO CLÍNICO

Síndrome de Wooblers en un caballo Wooblers syndrome in a horse José Cardona Á,1* M.Sc, César Betancur H,1 M.Sc, Jaime Alvarez P,1 M.Sc. Universidad de Córdoba. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Departamento de Ciencias Pecuarias. Montería, Colombia. *Correspondencia: cardonalvarez@hotmail.com. 1

Recibido: Abril de 2010; Aceptado: Agosto de 2012.

RESUMEN Se describe un caso de síndrome de Wooblers en un caballo, macho entero, de 14 años de edad, procedente del municipio de Cereté (Córdoba, Colombia). Esta patología es también conocida en equinos como mielopatía estenótica vertebral cervical (MEVC), la cual es una enfermedad del desarrollo caracterizada por estenosis del canal vertebral cervical resultando en compresión intermitente o continua de la médula espinal. A este paciente se le detectaron signos de incoordinación con tropiezos, ataxia simétrica, paresia o debilidad, espasticidad y pérdida de la propiocepción, principalmente en los miembros posteriores, por lo que se le realizó radiología cervical detectando estenosis de canal medular a nivel de la vértebra cervical C4. Estos hallazgos obedecen principalmente al síndrome de Wooblers. Palabras clave: Ataxia, equino, Mielopatía (Fuente:CAB).

ABSTRACT A case of Wooblers syndrome is described in a complete male 14-year-old horse from the town of Cereté (Cordoba, Colombia). This condition is also known as equine cervical vertebral stenotic myelopathy (CVSM), which is a disease characterized by developmental cervical spinal canal stenosis resulting in intermittent or continuous compression of the spinal cord. This patient showed to have signs of incoordination which included stumbling, symmetrical ataxia, paresis or weakness, spasticity and loss of propioception, particularly in the hindquarters, so that radiology was performed to detect cervical spinal canal stenosis at the level of the cervical vertebrae C4. These findings are related as Wooblers syndrome. Key words: Ataxia, equine, mielopaty (Source:CAB).

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Cardona - Sindrome de Woobler en caballo

INTRODUCCIÓN El síndrome de Wooblers, mielopatía estenótica vertebral cervical (MEVC) o síndrome de incoordinación equina, es una enfermedad que se caracteriza por ataxia y debilidad, causada por el estrechamiento del canal vertebral cervical con o sin malformación de las vértebras cervicales, resultando en la compresión y/o trauma repetitivo de la médula espinal cervical, se considera una enfermedad multifactorial y es la principal causa de ataxia no infecciosa de la médula espinal en el caballo (1). Los caballos afectados con el síndrome de Wooblers generalmente son llevados a consulta debido a la debilidad y a la falta de coordinación, en edades comprendidas entre los 6 meses y los 4 años, aunque el problema puede ocurrir a cualquier edad (2), los machos enteros parecen ser los más comúnmente afectados con MEVC que las hembras; la razón para esta prevalencia no es clara, no obstante, esto puede ser el resultado de la influencia de la testosterona en el crecimiento o en el desarrollo de los osteocondrocitos (3). Aunque no existe evidencia de que esta patología sea directamente heredable por patrones mendelianos recesivos, no se descarta el origen hereditario. Todas las razas pueden ser afectadas, presentándose con más frecuencia en caballos Pura Sangre Inglés y Cuarto de Milla, razas ligeras y de tiro; sin embargo, las razas ligeras y de tiro parecen ser las más predisponentes por su mayor exigencia para obtener productos de gran talla en el menor tiempo posible (4). La causa principal de los signos clínicos es la estenosis; la cual puede ser el resultado de una malformación genética o un sobre crecimiento de los procesos articulares de las vértebras cervicales asociados con un rápido crecimiento o con desequilibrios nutricionales (5). Estos factores generan trastornos del desarrollo en los sistemas muscular y esquelético, trayendo como consecuencia problemas neurológicos por compresión del cordón espinal en diversos niveles de las vértebras cervicales (2,6).

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ataxia simétrica, paresia o debilidad, espasticidad y pérdida de la propiocepción, principalmente en los miembros posteriores. Se le realizó exámen clínico general y neurológico especializado, consistente en evaluación de la cabeza, cuerpo entero, analizando postura y finalmente andadura. L a a t a x i a s e e va l u ó n e u r o l ó g i c a m e n t e , acentuándose más al efectuar círculos, elevar la cabeza o taparle los ojos y evadir obstáculos (Figura 1); al caminar, la debilidad se manifestó por tropiezos con arrastre de la punta del casco; al descansar se observó alteración de la propiocepción manifestada por una postura anormal (Figura 2). La espasticidad se evidenció por disminución de la flexión de la articulación de la rodilla al caminar. Cuando se le instó a moverse atrás (reculeo) el paciente abrió su base de apoyo e inclinó su cuerpo hacia atrás antes de mover sus miembros (Figura 3).

Figura 1. Evaluación neurológica de la ataxia, tapándole los ojos, nótese la renuencia a dar el paso, indicando acentuación de la ataxia.

CASO CLÍNICO En el presente reporte se describe un caso de MEVC en un equino mestizo criollo por cuarto de milla, macho entero de 14 años de edad, 500 kg de peso aproximadamente, dedicado a labores de trabajo (cochero), procedente del municipio de Cereté (Córdoba, Colombia), fue atendido por el servicio clínico ambulatorio de grandes animales de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba, el cual presentó signos de incoordinación con tropiezos,

Figura 2. Posición anormal, después de realizar pruebas de propiocepción consciente, dejó el miembro en la posición colocada, debiendo ubicarlo nuevamente en su posición de apoyo.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013 Se detectó radiográficamente estenosis de canal medular a nivel de la vértebra cervical C4 (Figura 4), así como disminución del diámetro sagital vertebral (A/B) menor que 50% (Figura 5).

Figura 3. Movimiento hacia atrás (reculeo), el paciente abrió su base de apoyo e inclinó su cuerpo hacia atrás antes de mover sus miembros.

Hay dos manifestaciones clínicas de la enfermedad: La tipo 1, que tiende a ocurrir en animales jóvenes, desde el destete hasta los 2 años de edad, en este tipo se presenta malformación con estenosis del canal vertebral. Es una condición dinámica que ocurre de manera intermitente cuando el animal flexiona el cuello, más frecuentemente afecta las vértebras C3 - C4 y C4 - C5. Un trauma externo puede ser el factor que precipita inicialmente el síndrome clínico (7). La compresión de la médula espinal a nivel cervical en zonas donde las vertebras se encuentran inestables o malformadas, se deben principalmente a anormalidades del desarrollo (8). La tipo 2 tiende a ser más frecuente en pacientes viejos con severa osteoartritis, la compresión es constante y es más común en la parte más caudal (C5 - C6, C6 - C7) (7). Estos caballos generalmente tienen una enfermedad vertebral cervical traumática adquirida (9). Se recomendó un estudio radiográfico del cordón espinal cervical para determinar la probabilidad de MEVC, la cual fue realizada en la clínica de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba, con el fin de valorar una posible malformación vertebral o la estrechez del canal vertebral se hicieron proyecciones laterales de cuello en el animal de pié.

Figura 4. Estenosis del canal medular a nivel de la vértebra cervical C4.

Figura 5. Disminución del diámetro sagital vertebral, menor que 50% (A/B) en C4.

El diagnóstico presuntivo se fundamenta sobre la base de la historia clínica, del exámen clínico neurológico, la localización neuroanatómica y el exámen radiográfico lateral de las vertebras cervicales, obtenidas en el caballo de pie. La principal característica de malformación ósea de las vértebras cervicales en caballos con MEVC son “destellos” de las epífisis caudales en el cuerpo de la vertebra, osificación anormal del proceso articular, mala alineación entre las vértebras adyacentes, extensión de la lamina dorsal y la enfermedad articular degenerativa en el proceso articular de las articulaciones, caracterizada por osteocondrosis y/o artrosis del proceso articular, siendo la lesión más comúnmente identificada en las radiografías cervicales vertebrales en los caballos afectados con MEVC (1,10).

Cardona - Sindrome de Woobler en caballo Es importante la difusión de este caso clínico en la literatura médica veterinaria dado que puede presentarse de 2 a 4% en los animales con mal manejo nutricional o físico, como lo reporta Moore et al (3) y que afecta a un 2% de caballos pura sangre (1).

DISCUSIÓN Basados en los datos anamnésicos e historia clínica, la exploración física, el exámen neurológico y los hallazgos radiológicos, el diagnóstico final de este paciente fue MECV o síndrome de Wooblers. En el examen radiográfico se observó estenosis del canal medular a nivel de la 4a vértebra cervical que podría ser compatible con MECV, efectivamente se comprobó un canal vertebral estrecho a nivel de C4, demostrado por una disminución en el diámetro sagital mínimo (DSM), debido a que la interpretación de muchos cambios radiológicos es subjetiva, es necesario el uso de la relación sagital, ya que proporciona objetividad. Esto se calcula dividiendo el DSM en el aspecto craneal de la vértebra entre el diámetro del cuerpo vertebral en su parte más ancha y craneal; éste método elimina subjetividad y corrige por magnificación, tiene una sensibilidad y especificidad de 89% entre C4 y C7. Una relación sagital normal debe ser más del 50%; si esta relación es menor que 50%, es recomendado realizar un mielograma para confirmar la compresión medular. Si la relación es mayor que 50% el mielograma debe evitarse o posponerse, por lo que se deben considerar otros diferenciales. En este caso la relación fue menor que el 50%, confirmándose ECVM, por lo que los resultados arrojados por el exámen radiológico, son compatibles con los reportados por Moore et al (3), Van Biervliet et al (11), y Rush y Grady (12). El diagnóstico de este caso, se orientó hacia una ECVM del tipo II, por las características del paciente y por ser un equino geriátrico;sin

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embargo en la radiografía se observó estenosis del canal vertebral a nivel de C4, contrastando con lo informado por Mayhew I (7), quien indica que la ECVM tipo II es más frecuente en las vértebras C5 - C6 y C6 - C7, aunque el paciente pudo llevar mucho tiempo padeciendo el proceso. En equinos, la etiología de MECV es multicausal, se cree en la etiología de origen genético, además se han considerado causas ambientales, no se estableció la genealogía del paciente, lo cual podría haber servido para identificar factores hereditarios, propuesto por Stewart et al (13). Es importante tener como ayuda diagnóstica a la radiología, ya que de esta manera se puede determinar la estenosis del canal o los cambios degenerativos articulares, así como la alineación vertebral y asociarlos contundentemente a los signos clínicos neurológicos. En conclusión, los equinos manejados en explotaciones ganaderas de alta producción, están predispuestos a sufrir de enfermedades metabólicas y degenerativas, debido a la falta de un adecuado programa de alimentación estratégico para equinos de trabajo, siendo este un factor determinante en la presentación de este tipo de casos, ya que se ha reportado mejoría en caballos con esta enfermedad, al ser aplicados tratamientos nutricionales y de manejo conservatorio (14). Las terapias pueden ser conservadoras o sofisticadas, siendo ambas costosas y con resultados inconsistentes, por lo que es conveniente establecer en los criaderos programas de alimentación y manejo adecuados con la finalidad de disminuir la incidencia de estos casos. También se postula la corrección quirúrgica, como tratamiento más reconocido de esta condición (15). Se recomendó al propietario la realización de un tratamiento médico y conservatorio informándole además acerca de la gravedad del proceso y por lo incierto del pronóstico, se decidió practicar la eutanasia al paciente

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Revista MVZ Córdoba INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES La revista MVZ Córdoba es el órgano oficial de difusión de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba con periodicidad de publicación cuatrimestral y circula en el ámbito internacional. La revista publica (secciones) artículos originales de investigación, artículos técnicos, revisiones de literatura, revisiones de tema, comunicaciones breves, informes de casos y, otros que a juicio del Comité Editorial sean de interés general. Los temas que publica MVZ Córdoba están relacionados con la medicina veterinaria y zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias.

generales descritas abajo. La revista MVZ Córdoba se acoge a los requisitos generales de uniformidad para revistas biomédicas (normas de Vancouver).

“La revista MVZ Córdoba apoya las políticas para registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de esas iniciativas para el registro y divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente se eceptarán para publicación, a partir de 2007, los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por OMS e ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio del ICMJE. El número de identificación se deberá regiostrar al final del resumen”.

1.2. Nombre, apellido del autor o autores: Para el segundo apellido solo se colocará la inicial en mayúscula seguida de coma y el grado académico más alto o el título profesional. Se deberá incluir la filiación institucional de los autores (institución, dirección, ciudad, país). Se deberá indicar además, el responsable de la correspondencia del manuscrito suministrando su correo electrónico.

Los interesados en publicar deberán enviar al Editor una carta remisoria firmada por todos los autores declarando expresamente que el artículo remitido no ha sido publicado previamente y se indicará que los autores no tienen conflicto de intereses. El artículo se deberá enviar por correo electrónico, escrito en procesador de palabras, a doble espacio, con letra verdana a 12 puntos. Las márgenes no deben ser inferiores a 3 cm. y las páginas se numerarán consecutivamente incluyendo todo el material. Se aceptan artículos en español e inglés. Se recomienda observar las guías

1. Presentación: Debe contener la siguiente información: 1.1. Título del artículo: deberá ir en español e inglés. Este último deberá ir debajo del primero dejando doble espacio y en tamaño de letra menor que el principal. El título deberá ser preciso pero informativo y en lo posible no debe superar las 15 palabras.

1.3. Resumen: Deber ser estructurado y será máximo de 250 palabras. Deberá ofrecer una idea clara del contenido del artículo incluyendo: Objetivo, materiales y métodos, resultados y conclusiones. Estas secciones deberán ir con negrilla y luego punto seguido en donde se inicia el texto de cada sección. 1.4 Palabras clave: Son términos cortos que ayudan a la clasificación del artículo. Se sugiere emplear 6 como máximo. Utilice los términos de la lista “Medical subject headings” (MeSH) u otro descriptor acorde con el tema de su investigación. (DeCS, BIREME, NLM, etc.). 1.5 Abstract (resumen traducido al inglés) debe poseer una estructura y contenido igual al de español.

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1.6 Key Words: Palabras clave, deben ser iguales a las de español, pero en idioma ingles. 2. Introducción: Debe indicar claramente e l p r o p ó s i t o d e l a i nv e s t i g a c i ó n , relacionando igualmente en forma selectiva la literatura pertinente. No incluya datos ni conclusiones del trabajo que está dando a conocer. Al finalizar esta sección deberá hacerse con el objetivo general. 3. Materiales y métodos: Se debe describir claramente los procedimientos empleados en la investigación, incluyendo diseño estadístico y análisis de datos. Esta sección deberá ser estructurada indicando tipo de estudio, sitio, condiciones geo-climáticas, coordenadas del sitio de estudio, pacientes o animales de estudio, métodos de laboratorio, aspectos éticos, análisis de resultados, etc. Estas secciones deberán ir con negrilla y luego punto seguido en donde se inicia el texto de cada sección. 4. Resultados: Corresponde a la información de los hallazgos pero sin incluir comentarios ni referencias a otros trabajos. Se sugiere utilizar tablas y figuras, las cuales no deberán ser más de seis en lo posible. 5. Discusión: Es la interpretación de los resultados obtenidos y la contrastación de los mismos con otros estudios. Se debe destacar las limitaciones del estudio e igualmente evitar especulaciones. Resaltar las conclusiones del estudio, así como las recomendaciones para futuras investigaciones. 6. Agradecimientos: Mencionar las personas o instituciones que han colaborado con la investigación (financiera, logística, intelectual, entre otras.). 7. Correspondencia: Nombre completo del autor responsable, dirección laboral y residencial, correo electrónico, teléfono celular y teléfono fijo. Esta información puede ser suministrada en la carta remisoria o en una hoja al final del artículo remitido.

8. R e f e r e n c i a s : D e b e n n u m e r a r s e consecutivamente según el orden en que se mencionen por primera vez en el texto por medio de números arábigos colocados entre paréntesis. La lista de referencias se iniciará en hoja aparte, en estricto orden de aparición en el texto, no será en orden alfabético. Para los artículos originales no se aceptarán más de 30 referencias. Para revisiones de literatura hasta 50 referencias. Para la presentación de casos y comunicaciones breves hasta 12 referencias. Como guía general a continuación se presentan ejemplos de referencias bibliográficas. 8.1. Revistas • Nombre del autor o autores • Título completo del artículo referenciado • Abreviatura internacional del nombre de l a r e vi sta • Año • Vol ume n • Páginas incluidas. Las abreviaturas internacionales pueden consultarse en Journals database de PubMed, C a t a l o g o C 1 7 , DREV, Revistas de biomedicina del IHCD de Valencia. 8.2. Libros y monografías • Autor o editor • Título del libro, lugar de publicación, editorial, año de publicación y páginas consultadas. 8.3. Ejemplos para las referencias bibliográficas según las normas de Vancouver. Artículos de Revistas • Artículos Autor/es. Título del artículo. Abreviatura internacional de la revista, año; volumen (número): página inicial-final del artículo. Ejemplos: Díez Jarilla JL, Cienfuegos Vázquez M, Suárez Salvador E. Ruidos adventicios respiratorios: factores de confusión. Rev MVZ Córdoba 1999; 109: 632-634. • Más de seis autores Martín Cantera C, Córdoba García R, Jane Julio C, Nebot Adell M, Galán Herrera S, Aliaga M et al. Virus and public health J Vet Sci 1997; 109: 744-748.

3427 • Autor Corporativo Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos amenazantes. Rev MVZ Córdoba 1997; 33: 31-40. • No se indica nombre del autor Cáncer in South África (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16. Los artículos deben escribirse en su idioma original si la grafía es latina. • Suplemento de un volumen Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117. • Suplemento de un número Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma. Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531. • Número sin volumen Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14. • Sin número ni volumen Browell DA, Lennard TW. Inmunologic status of the cancer fish patient and the effects ofblood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33. • Paginación en número romanos Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology. Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII. • Indicación del tipo de artículo según corresponda Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337.

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Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos Laborales. (Boletín Oficial del Estado, número 269, de 10-11-95). • Mapa Nombre del mapa (tipo de mapa). Lugar de publicación: Editorial; año. Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico). Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003. Material no publicado • En prensa Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007. • Artículo de revista en formato electrónico Autor. Título. Nombre de la revista abreviado (tipo de soporte) año (fecha de acceso); volumen (número): páginas o indicador de extensión. Disponible en: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia. MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/ mmwrhtml/00048303.htm • Monografía en formato electrónico Título. (Tipo de soporte). Editores o productores. Edición. Versión. Lugar de publicación: Editorial; año. Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CD-ROM). Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0. Hagenstown: Lippincolt-Raven; 1997. • Archivo informático Autor. Título. (Tipo de soporte). Versión. Lugar: Editorial; año. • Tesis de Maestría, doctorado y trabajos de grado Autor(es) título, Facultad, Departamento, año. Arrieta G. Producción de Verotoximas en Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

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9. F o t o g r a f í a s : S e p o d r á n u t i l i z a r fotografías, de excelente calidad, digital. La identificación, secuencia y títulos deben establecerse claramente para localizar el lugar que le corresponda en el contenido del artículo. Las fotografías deberán llevar el título de figura. 10. Evaluación de artículos: Los artículos recibidos para publicación, después de constatar que cumplen con las normas expresas de la Revista MVZ Córdoba, serán enviados a pares que conforman el Comité Científico para su respectiva evaluación. En caso de recibir algún manuscrito que por su especialidad de contenido no pueda ser evaluado por los miembros del comité, este será remitido a sendos evaluadores pertenecientes a la comunidad científica nacional o internacional. En la redacción del contenido deberán respetarse las normas internacionales para manuscritos científicos que regulan las abreviaturas, literatura citada, símbolos, n o m e n c l a t u ra s a t ó m i c a s , z o o l ó g i c a s , botánicas, químicas, entre otros. Los valores

deben informarse en unidades del sistema métrico decimal y de acuerdo con el Sistema Internacional de Unidades. La revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba no se responsabilizan por opiniones y resultados expresados por los autores, los cuales serán responsabilidad exclusiva de ellos. Conflicto de intereses. Los autores deben expresar los intereses posibles que posean en el trabajo que realizaron. Correspondencia: Los artículos, consultas, aclaraciones y correspondencia general se deben dirigir a la dirección abajo señalada, sin embargo, también los trabajos pueden ser remitidos en forma electrónica al editor o al coeditor. http:// www.unicordoba.edu.co Comité Editorial REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Teléfonos (094) 756 90 27 http://revistas.unicordoba.edu.co/revistamvz/ Apartado Aéreo 354 Montería - Colombia Editor Marco González Tous. M.Sc. editormvzcordoba@gmail.com

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Journal MVZ Córdoba Instructions to the Authors The Journal MVZ Cordoba is the official organ of diffusion of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of the Universidad de Cordoba, is a triannually publication and circulates in the international environment. The magazine publishes (sections) original articles of investigation, technical articles, literature reviews, topic revisions, brief communications, inform of cases and, others that to opinion of the Editorial Committee are from general interest. The topics that the Journal MVZ Cordoba publishes are related with the veterinary medicine and zootechny, aquaculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences and other topics of interest in the agricultural sciences.

Spanish or English. Authors should consult general guides described below. The Journal MVZ Cordoba is welcomed to the general requirements of uniformity for biomedical journals (Norms of Vancouver).

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1.2. Name: Last name of author(s). For the second name only be placed the first letter in capital followed by coma and each author´s highest academic degree or professional title. It should include the institution affiliation of authors, (Institution Name, address, city, country). It should also indicate the responsible person for the manuscript correspondence (e-mail included).

Interested in publishing will send to the Editor an introductory letter signed by all the authors declaring expressly that the remitted article has not been published previously and that the authors don’t have conflict of interests. Two printed copies will be sent of the article written on any of the programs for word processing, double space, paper size letter, in ink quarter note for a single face of the leaf, with arial letter, font size 12 and C.D. (these originals will not be returned) or by e-mail. Margin should not be inferior to 3 cm and pages will be numbered consecutively including the whole material. Journal accepts papers in either

1. Presentation: It should contain the following information: 1.1. Title of the article: It should be presented in Spanish and English language. The last one should appear below the first one double spaced and with a minor font size that the main one. The Title should be concisely but informative and be of up to 15 words.

1.3 Abstract: Should be structured and of approximately 250 words, indicating the paper’s objective clearly and including: objective, material and methods, results and conclusions. This section should be in boldface and then point followed by the text of the subsequent section. 1.4 Key words: Are short terms. These will be useful to classify the article. List 6 as maximum. Use the terms of the “Medical subject headings” (MeSH) list or another describer in agreement with the topic of their investigation. (DeCS, BIREME, NLM, etc.). 1.5 Abstract (summarize translated to English) it should possess a structure and content similar to the one of Spanish.

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1.6 Key Words: Key words, it should be similar to those of Spanish, but in English language. 2. Introduction: should indicate the paper’s objective clearly, relating equally in selective form the pertinent literature. Do not include data neither conclusions of the work that is giving to know. When concluding this section it will be made with the general objective. 3. Material and Methods: should be described clearly the procedures used in the investigation including statistical design and data analysis. This section should be structured indicating type of study, place, geo-climatic conditions, coordinate of the study place, patients or animals, laboratory methods, ethical aspects, result analysis, etc. These sections should be in boldface then point followed by the text of the subsequent section. 4. Results: Correspond to findings without comments no references to other works. The use of tables and figures is suggested which should be no more of six. 5. Discussion: is the interpretation of the obtained results followed by a comparison with other studies. It should stand out the limitations of the study and equally to avoid speculations. Point out conclusions and suggestions for further research. 6. Acknowledgements: Contributions from people or institutions who have collaborated with the investigation (financial, logistics, intellectual, among others) should appear under “Acknowledgements”. 7. Correspondence: Full names of the responsible author, affiliation address, postal address, cellular and telephone number, email addresses. This information should be include in the remission letter or in a single sheet at the end of the article. 8. References: Will be cited with a number correlative to the order in which they

appear in the text and should be numbered consecutively by means of Arabic numbers placed within parenthesis. The list of references will begin in separate sheets, in strict appearance order in the text; they were not in alphabetical order. Original articles should have no more than 30 references. For literature revisions up to 50 references. Presentation of cases and short communications will have only 12 references. As general guide examples of bibliographical references are given below. 8.1. Journals • Author’s names • Full title of the referenced article • International abbreviation of the journal name • Year • Volume • Included pages. International abbreviation must be search in Journals database of PubMed, Catalogue C17, DREV, Biomedical journals of Valencia IHCD. 8.2. Books and monographs • Author or editor • Title of book, publication place, editorial, year of publication and consulted pages. 8.3.

Examples for the bibliographical references according to the Vancouver norms Journal articles • Articles Author(s). Title of the article. International Abbreviation of the journal, year; volume (number): initial-final page of the article.

Examples: Díez Jarilla J, Cienfuegos Vázquez M, Suárez Salvador E. Ruidos adventicios respiratorios: factores de confusión. Rev MVZ Córdoba 1999; 109: 632-634.

• More than six authors Martín Cantera C, Córdoba García R, Jane Julio C, Nebot Adell M, Galán Herrera S, Aliaga M et al. Virus and public health J Vet Sci 1997; 109: 744-748.

• Corporate author Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos

3431 amenazantes. Rev MVZ Cordoba 1997; 33: 31-40. • The author’s name is not indicated Cancer in South Africa (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16. The articles should be written in their original language if the graph is Latin. • Supplement of a volume Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117.

• Supplement of a number Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma. Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531. • Number without volume Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14.

• Without number neither volume Browell DA, Lennard TW. Inmunologic status of the cancer fish patient and the effects of blood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33. • Paging in Roman numbers Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology. Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII.

Laborales. (Boletín Oficial del Estado, número 269, de 10-11-95).

Unpublished Material • In press Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007.

• Journal article in electronic format Author. Title. Name of the journal in abbreviate form (support type) year (access date); volume (number): pages or extension indicator. Available in: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia. MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/ mmwr/preview/mmwrhtml/00048303. htm

• Indication of the article type as it corresponds Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337. Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN) (abstract). Kidney Int 1992; 42: 1285.

• Legal documents Laws: LawTitle. (Name of the Official Bulletin, date, year of publication). Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos

• Map Name of the map (map type). Publication Place: Editorial; year. Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico). Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003.

• Monograph in electronic format Title. (Support type). Editors or producers. Edition. Version. Publication place: Editorial; year. Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CD-ROM). Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0. Hagenstown: Lippincolt-Raven; 1997.

• Informatics file Author.Title. (support Type). Version. Place: Editorial; year.

• Thesis of Master, Doctorate and under Graduate works Author(s) title, faculty, department, year. Arrieta G. Producción de Verotoximas en Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

9. Photographs: Pictures can be use, of excellent digital quality. The identification,

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18(1) Enero - Abril 2013

sequence and titles should settle down clearly to locate the place that corresponds in the content of the article. The photographs will take the title of figure. 10. Evaluation of articles: Those manuscripts submitted to the Journal, after verifying that they fulfill the expressed norms of the Journal MVZ Cordoba will be subject to peer reviews of the Scientific Committee for its evaluation. In the event of receiving some manuscript that by its special content cannot be evaluated by the members of the committee it will be remitted to appraisers belonging to the national or international scientific community. In the writing of the content the international norms will be respected for scientific manuscripts that regulate the abbreviations, mentioned literature, symbols, atomic, zoological, botanical, chemical nomenclatures, among others. The values should be informed in units of the metric decimal system and in accordance with the International System of Units.

The Journal MVZ Cordoba and the Universidad de Córdoba don’t take the responsibility for opinions and results expressed by the authors, which will be exclusive responsibility of them. Conflict of interests. The authors should express the possible interests that possess in the work made by them. Correspondence: Articles, consultations, explanations and general correspondence should be sent to the address below, however, the works can also be remitted in electronic form to the editor or the coeditor. http://www.unicordoba.edu.co Editorial Committee REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Telephones: (094) 756 90 27 http://revistas.unicordoba.edu.co/revistamvz/ Apartado Aéreo 354 Montería - Colombia Editor Marco González Tous. M.Sc. editormvzcordoba@gmail.comm

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3435 Árbitros Rev.MVZ Córdoba 18(1) 2013 Referees Journal MVZ Córdoba 18(1) 2013 Adroher Francisco Álvarez F. Luz Araya V. Oscar Arboleda Z. Elkin Ballesteros C. Jesús Barbeito C. Gustavo Berovides Á. Vicente Bolaños S. Tomas Brihuega Bibiana Cabreira J. Clóves Campos G. Rómulo Canal D. Nelson Cardona Á. José Carvalho M. Bruno Cecato Ulysses Céspedes R. Angel Chacón J. Liliana Correa C. Héctor Correa O. Margarita Cruz C. Pablo Cuartas C. César De Araújo M. Jair De la Ossa V. Jaime Escobar M. Magally Gallego M. Manuel Gimeno Eduardo Godoy P. Adolfo Góngora O. Agustín González H. Luis Jiménez E. Claudia Lenis S. Gustavo Martínez M. Mastoby Mira L. Tatiana Montañez V. Oziel Morales S. Elizabeth Muiño B. María Ortíz M. Martha Pedraza O. Francisco Pérez Cardozo Ricardo Pérez P. Rosaura Pinos R. Juan Quijano B. Jorge Ramírez M. Juan Ramírez V. Nicolás Ríos O. Leonardo Rodríguez Virginia Tarazona M. Ariel Tavares D. Marcos Uribe V. Rubén Van Cleef Eric H.C.B. Vargas V. Marlene Zanatta E. Greyson

Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. M.Sc. Ph.D. M.Sc. Ph.D. M.Sc. Ph.D. M.Sc. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. M.Sc. M.Sc. M.Sc. Ph.D. M.Sc. M.Sc. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

U. de Granada, España U. Nal. de Colombia, Colombia U. Austral de Chile, Chile U. de Antioquia, Colombia U. de Córdoba, Colombia U. Nal de la Plata, Argentina U. de la Habana, Cuba U. Piloto de Colombia, Colombia Inst. Nal. Tec. Agropecuaria, Argentina U. Estadual de Maringá, Brasil U. Nal. de Colombia, Colombia U. del Tolima, Colombia U. de Córdoba, Colombia U. Austral de Chile, Chile U. Estadual de Maringá, Brasil U. del Tolima, Colombia U. de La Salle, Colombia U. Nal. de Colombia, Colombia U. de Antioquia, Colombia U. de los Llanos, Colombia U. Nal. de Colombia, Colombia U. Fed. do Recôncavo da Bahia, Brasil U. de Sucre, Colombia U. de La Salle, Colombia U.D.C.A., Colombia U. de la Plata, Argentina U. de Chile, Chile U. de los Llanos, Colombia U. del Amazonía, Colombia U. Nal. de Colombia, Colombia U. de Antioquia, Colombia U. de Córdoba, Colombia U. de Antioquia, Colombia U. de Guadalajara, México U. Nal. Autónoma de México, México U. de Zaragoza, España U. Federal de San Carlos, Brasil U. de Caldas, Colombia U. de Sucre, Colombia U. de Zaragoza, España U. Aut. de San Luis Potosi, México U. Nal. de Colombia, Colombia U. de los Llanos, Colombia U. de Antioquia, Colombia U. de Antioquia, Colombia U. de Córdoba, Colombia U. Nal. de Colombia, Colombia Embrapa Amapá, Brasil U. de Santander, Colombia U. Est. Paulista Júlio de Mesquita Filho, Brasil U. Federal de Viçosa, Brasil U. de São Paulo, Brasil

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