Rev MVZ Córdoba 15(3)

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

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Re vista MVZ Cór dob a Revista Córdob doba Journ al MVZ Cor dob a Journal Cordob doba EDITOR Marco González T. M.Sc. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COEDITOR – CO-EDITOR Salim Máttar V. Ph.D. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

ASISTENTES DEL EDITOR - ASSISTANT EDITORS Luis Carlos Salgado A. Ing. German Arrieta B, Esp. Diva Santana C, Lic. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COMITÉ EDITORIAL – EDITORIAL COMMITTEE James N. Mills Nelson Alvis G. Raúl Poutou P. Oscar Vergara G.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA U. de Cartagena, Cartagena, Colombia Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá Universidad de Córdoba, Colombia

COMITÉ CIENTIFICO – SCIENTIFIC COMMITTEE Nicholas Komar Maria Aguero R. Joaquín Quilez C. Marlene Vargas V. Claudio C. Fonseca Priscila V. Logato Marcelo Del Campo

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA N. Y. Medical College, USA U. de Zaragoza, España U. Fed. de Vioçosa, Brasil U. Fed. de Vioçosa, Brasil U. Fed. de Lavras, Brasil U. San Sebastián, Chile

Marcelo B. Labruna Jorge Salazar B. Juan Carulla F. Henry Grajales L. Claudia Jiménez E. Agustin Góngora O. Sandra Pardo C.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

U. de São Paulo, Brasil Texas Tech. University U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. de Los Llanos, Colombia U. Nacional, Colombia

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Revista MVZ Córdoba La Revista MVZ Córdoba es el órgano oficial de difusión de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba. La revista publica artículos originales de investigación, artículos técnicos, revisiones de literatura, revisiones de tema, comunicaciones breves e informes de casos que a juicio del Comité Editorial sean de interés. Los temas que publica la Revista MVZ Córdoba están relacionados con la medicina veterinaria, zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias. La revista está dirigida a los profesionales de la medicina veterinaria, zootecnia, salud pública humana y animal, acuicultura, biología, ciencias básicas biomédicas y biotecnología.

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Journal MVZ Cordoba The Journal MVZ Córdoba is the official diffusion organ of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of the Universidad de Córdoba. The Journal MVZ-Córdoba is devoted to the publication of original research articles, technical articles, literature revisions, especific reviews, short comunications and presentations of cases interest to Editorial Committee. The Journal publishes topics that are related with veterinary medicine, zootechny, aquaculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences and other subjects of interest of the agricultural sciences. The journal is directed to professionals of the veterinary medicine, zootechny, human and animal public health, aquaculture, biology, biomedical basic sciences and biotechnology.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

Re vista MVZ Cór dob a Revista Córdob doba Journ al MVZ Cor dob a Journal Cordob doba Indexada por: Indexed by:

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Volumen 15

Re vista MVZ Cór dob a Revista Córdob doba SEPTIEMBRE - DICIEMBRE de 2010

Número 3

CONTENIDO EDITORIAL Índice Bibliográfico Nacional – IBN Publindex 2004 – 2010 Marco Gonzalez, Salim Mattar

2145

ORIGINALES Uso de una conantokina y anticuerpos policlonales para identificar la subunidad NR2B del receptor n-metil-d-aspartato Edwin Reyes, Edgar Reyes, Leonardo Lareo

2147

Estudio de razas de palomas españolas a partir del análisis de caracteres morfológicos cualitativos Pere-Miquel Parés

2158

Evaluación de la colonización de micorrizas arbusculares en pasto Bothriochloa pertusa (L) A. Camus Alexander Pérez, Melba Vertel

2165

Efecto ixodicida de los extractos etanólicos de algunas plantas sobre garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus Ángela Rodríguez, Carlos Rodríguez, Anastasia Cruz

2175

Seroprevalencia de Leptospira spp en caninos y humanos de tres barrios de Tunja, Colombia Soledad Bermúdez, Martín Pulido, Roy Andrade

2185

Suplementación con balanceado comercial en crías vacunas lactantes bajo sistema doble propósito Esperanza Prieto, Donicer Montes, Leonardo Lara, Rosa Ríos

2194

Asociación entre receptores de leptina en testículo, niveles de leptina y testosterona en terneros púberes Z.Tatiana Ruiz, Martha Olivera

2204

Diagnóstico clínico-microbiológico de otitis externa en caninos de Bogotá – Colombia Adriana Pulido, Rubiela Castañeda, Melva Linares, Marcela Mercado

2215

Remoción de semillas por roedores en un fragmento de bosque seco tropical (RisaraldaColombia) Felipe Vélez, Jairo Pérez

2223

2142

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

Volumen 15

Re vista MVZ Cór dob a Revista Córdob doba SEPTIEMBRE - DICIEMBRE de 2010

Número 3

COMUNICACIÓN BREVE Estudios preliminares de la estructura genética del perro cimarrón uruguayo usando microsatélites Rosa Gagliardi, Silvia Llambí, Cristina García, María Arruga

2234 CASO CLÍNICO Otitis bovina por Rhabditis bovis en Córdoba, Colombia. Reporte de dos casos José Cardona, Marco González, Jaime Álvarez

2240

Diagnóstico de policitemia absoluta como posible causa de episodios convulsivos en un perro Sandra Acevedo, Mauricio Ramírez

2245

REVISIÓN DE LITERATURA Síndrome de disfunción cognitiva de perros geriátrico Diana Gallego, Judith Figueroa, Camilo Orozco

2252

Instrucciones para los autores

2263

2143

Volume 15

Journ al MVZ Cor dob a Journal Cordob doba SEPTEMBER - DECEMBER 2010

Issue 3

CONTENTS EDITORIAL National Bibliographic Index - IBN Publindex 2004 - 2010 Marco González, Salim Mattar

2145

ORIGINALS The use of conantokin and polyclonal antibodies to identify the NR2B subunit of the n-methyl-d-aspartate receptor Edwin Reyes, Edgar Reyes, Leonardo Lareo

2147

Study of spanish dove breeds based on the analysis of qualitative morphological characteristics Pere-Miquel Parés

2158

Colonization of arbuscular mycorrhizae in Bothriochloa pertusa (L) A. Camus pasture Alexander Pérez, Melba Vertel

2165

The acaricide effect of ethanolic extracts of some plants on tics Rhipicephalus (Boophilus) microplus Ángela Rodríguez, Carlos Rodríguez, Anastasia Cruz

2175

Seroprevalence of canines and humans of Leptospira spp in three neighborhoods of Tunja, Colombia Soledad Bermúdez, Martín Pulido, Roy Andrade

2185

Supplementing double purposed lactating calves with commercial feed Esperanza Prieto, Donicer Montes, Leonardo Lara, Rosa Ríos

2194

Association between leptin receptors in the testicle, leptin and testosterone levels in puber male calves Z.Tatiana Ruiz, Martha Olivera

2204

Clinical – microbiological diagnostic of external otitis in canines in Bogotá - Colombia Adriana Pulido, Rubiela Castañeda, Melva Linares, Marcela Mercado

2215

Seed removal by rodents in a fragment of dry tropical forest (Risaralda-Colombia) Felipe Vélez, Jairo Pérez

2223

2144

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

Volume 15

Journ al MVZ Cor dob a Journal Cordob doba SEPTEMBER - DECEMBER 2010

Issue 3

SHORT COMMUNICATION Preliminary studies of the genetic structure of “Cimarron uruguayo” dog using Rosa Gagliardi, Silvia Llambí, Cristina García, María Arrugamicrosatellite markers

2234

CLINICAL CASE Bovine otitis by Rhabditis bovis in Cordoba, Colombia. Report of two cases José Cardona, Marco González, Jaime Álvarez

2240

Diagnosis of absolute polycythemia as possible causes of seizure in a dog Sandra Acevedo, Mauricio Ramírez

2245

LITERATURE REVIEW Cognitive dysfunction syndrome in senior canines Diana Gallego, Judith Figueroa, Camilo Orozco

2252

Instructions for authors

2263

Rev.MVZ Córdoba 15(2):2145-2146, 2010.

2145

EDITORIAL

Índice Bibliográfico Nacional - IBN Publindex 2004 - 2010 National Bibliographic Index - IBN Publindex 2004 - 2010 El Sistema Nacional de Indexación de Publicaciones especializadas de Ciencia, Tecnología e Innovación en Colombia, ha cumplido con el compromiso de reconocer y clasificar en cuatro categorías, las revistas científicas colombianas que cumplen con ciertos niveles de calidad. Esta labor se ha desarrollado a través del Índice Bibliográfico Nacional Publindex, IBN Publindex. Con este instrumento, además de capturar la información particular de cada revista, organizarla, estructurarla y dejarla disponible para la comunidad científica, también ha contribuido con la visibilidad tanto nacional como internacional de las publicaciones colombianas (1).

El IBN Publindex, a través de las directrices de sus directivos, propende para que los editores colombianos presenten sus revistas y sean sometidas a su clasificación mediante convocatorias anuales, previo cumplimiento de requisitos mínimos. Por otra parte, se puede observar que los editores, dentro de sus políticas de mejoramiento integral de sus revistas, también optan por presentarlas al mayor número de directorios, índices bibliográficos y bases de datos internacionales, cumpliendo muchas de ellas con altos estándares de exigencia, con lo cual se incrementa sustancialmente el reconocimiento y visibilidad de las mismas (2).

Es innegable el efecto que el IBN Publindex ha ejercido en la comunidad científica y académica colombiana, si solo se compara que en la primera actualización del año 2004, independientemente de las categorías, dicho índice denunció la existencia de 91 revistas y en la primera actualización de 2010 existen 368 revistas. Estos guarismos en términos simples, significan la aparición de nuevas revistas año tras año, lo que se ve reflejado en un incremento superior al 400% en el periodo 20042010 (Tabla1).

Tabla 1. Actualizaciones Índice Bibliográfico Nacional – Publindex – 2004 -2010.

Por supuesto, es imprescindible mencionar como complemento importante el compromiso que instituciones y editores han asumido frente a este reto que beneficia a toda la comunidad académica y científica de Colombia.

Ahora bien, al considerar el incremento de revistas por categorías en términos de porcentaje, sorprende que para las revistas clasificadas en categoría A1, dicho incremento fuera del 2300%, para la categoría A2 de 733%, para la categoría B de 986% y para la categoría C del 284%, observándose un incremento constante a través de los años (Figura 1).

Si bien la tarea de mejoramiento de las revistas nunca termina, también es cierto que la comunidad académica y científica de Colombia tiene que creer en lo nuestro, en nuestras revistas, debemos consultarlas en los recintos universitarios, institutos de investigación, sociedades y fundaciones entre otros, e ir creando la cultura de las citaciones de lo nuestro, repetimos, de nuestras revistas, de nuestra ciencia, en definitiva de nuestro nuevo conocimiento.

2145

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

Como lo comentáramos en un editorial hace algún tiempo (3), insistimos en que Colciencias debería diseñar una política de estímulos para aquellas revistas que logren alcanzar la máxima categoría de Publindex. Por otra parte, pero conexa, creemos que una manera de estimular la participación de los investigadores como pares evaluadores de artículos científicos, sería que aquellos que sean integrantes de grupos de investigación clasificados en Colciencias, les sea asignado una puntación de acuerdo con la categoría del grupo al cual pertenece Figura 1. Incremento del número de revistas y, para el caso de pares evaluadores de las colombianas a través de los años – universidades públicas colombianas, ¿por periodo 2004-2010. qué no reconocerles algún punto dentro del decreto 1279 de junio 19 de 2002? o en su defecto, puntos no constitutivos de salario.

La mayoría de las revistas tienen en común el problema de su financiación constante, así como el tema de los pares evaluadores; estos son escasos, se toman su tiempo para responder y es lógico que estén ocupados adelantando proyectos de investigación, desarrollando actividades de docencia directa o en funciones administrativas de la institución a la cual pertenecen. En el nuevo ámbito de calidad de la educación colombiana pregonado por el actual gobierno, el Ministerio de Educación Nacional, por ejemplo, podría aportar recursos adicionales a aquellas universidades que tengan revistas indexadas en Publindex, acorde con su categoría de clasificación (A1, A2, B y C). Tampoco debemos olvidar que sobre el sistema de educación superior de Colombia prácticamente recae el 90% de la investigación e innovación tecnológica en las diferentes áreas del saber, especialmente sobre la universidad pública. La empresa privada o el sector productivo aun no realizan o no pueden hacer investigación para solucionar sus propios problemas y la universidad siempre ha estado presta a colaborar y ha contribuido a resolverlos. Las revistas científicas en este caso, son la “radio escrita” encargada de informar a la sociedad que las contribuciones de sus ciudadanos les han sido devueltas con creces. En la actualidad Colombia aporta solo el 2% de la producción científica iberoamericana (4), pero suponemos que esos aportes antes de la “era Publindex”, fueron mucho menores.

En ese sentido, “la explosión” de revistas en Colombia bajo criterios de calidad, es sin duda un avance grandioso para la academia, la visibilidad del país y para los investigadores. No obstante, se corre el peligro de fracasar estrepitosamente si la nación a través de Colciencias y el Ministerio de Educación Nacional no estimulan el mismo escalafón que han creado.

Marco González T. M.Sc.

Salim Mattar V. Ph.D.

REFERENCIAS 1.

2.

disponible en: http://201.234.78.173:8084/ publindex/EnIbnPublindex/resultados.do.

Colciencias. Sistema Nacional de Indexación y Homologación de Revistas Especializadas de CT+I. [En Linea]. [Fecha ingreso 24/ 12/2010]. URL disponible en: http:// 201.234.78.173:8084/publindex/jsp/ content/bbnp.jsp.

3.

González M, Mattar S. Impacto de las revistas científicas en los indicadores de la universidad pública (Editorial). Rev MVZ Córdoba 14(1):1529-1530, 2009.

Colciencias. Índice Bibliográfico Nacional IBN Publindex I Actualización 2010. [En Linea]. [Fecha ingreso 24/12/2010]. URL

4.

Fayad R. Anotaciones para una reflexión sobre la educación superior en Colombia.

Rev Fac Med. 2010; 18:123-133.

Rev.MVZ Córdoba 15(3):2147-2157, 2010.

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ORIGINAL

Uso de una conantokina y anticuerpos policlonales para identificar la subunidad NR2B del receptor nmetil-d-aspartato The use of conantokin and polyclonal antibodies to identify the NR2B subunit of the n-methyl-d-aspartate receptor Edwin Reyes G, 1 Lic. Química, Edgar Reyes M, 1* Ph.D, Leonardo Lareo, †2 Ph.D

1 Universidad Nacional de Colombia. Departamento de Química. Grupo de Investigación en Proteínas (GRIP). Cra 30 calle 45. Edificio 451. Laboratorio 201-1 Bogotá, D.C., Colombia. 2 Pontificia Universidad Javeriana, Departamento de Nutrición y Bioquímica,

Bogotá, D.C., Colombia. †In Memoriam. *Correspondencia: eareyesm@unal.edu.co

Recibido: Marzo 23 de 2010; Aceptado: Agosto 25 de 2010

RESUMEN Objetivo. Proponer una metodología de identificación de la subunidad NR2B, mediante el uso de conantokina G, así como una adecuada extracción de la subunidad NR2B. Materiales y métodos. Se ensayaron dos metodologías para la extracción de la subunidad NR2B de cerebro de rata adulta, la primera buscó la extracción de la subunidad a partir de la membrana mediante la utilización del detergente deoxicolato de sodio y la segunda, garantizó primero la solubilización y eliminación de proteínas citoplasmáticas para luego realizar la extracción de la subunidad mediante el uso del mismo detergente, a partir del pellet generado en la centrifugación del extracto obtenido. Adicionalmente se biotiniló la conantokina G para evaluar su eficiencia en la identificación de la subunidad y comparar los resultados con los obtenidos por metodologías tradicionales como DOT-BLOT, WESTERN-BLOT, ELISA e Inmunohistoquímica.

Resultados. La segunda metodología mostró mayor extracción de NR2B por lo que se seleccionó para la realización de los extractos posteriores. Los ensayos de identificación con la conantokina biotinilada evidenciaron interferencia en el reconocimiento, haciéndose necesaria la identificación de la presencia de la subunidad NR2B mediante el uso de anticuerpos policlonales en los ensayos mencionados. Conclusiones. Se propone que hay un impedimento de tipo estérico en el marcaje de la conantokina con la biotina lo que no favorece la interacción de este péptido con la subunidad.

Palabras clave: Receptor, N-metilaspartato, conantokina-G, cerebro, biotina.

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ABSTRACT Objective. To propose a methodology that identifies the NR2B subunit through the use of conantokin G, as well as an adequate extraction of the NR2B subunit. Materials and methods.

Two methodologies were tested for the extraction of the NR2B subunit of the adult rat, the first one sought the extraction of the subunit through a membrane by using sodium deoxicolate; and the second, guaranteed the solubilization and elimination of cytoplasmic proteins, in order to later extract the subunit through the use of the same detergent from the pellet resulting from the centrifugation of the obtained extract. Additionally, the conantokin G was biotynilated in order to evaluate its efficiency to identify the subunit and to compare the results obtained from traditional methodologies such as DOT-BLOT, WESTERN-BLOT, ELISA and Immunohistochemical. Results. The second methodology showed a greater extraction of NR2B, thus it was chosen for the subsequent extracts. The identification tests with biotynilated conantokin showed interference in recognition, thus, it was necessary identify the subunit NR2B through the use of the polyclonal antibodies mentioned in the tests.

Conclusions. An impediment of esteric character is proposed in marking the conantokin with the biotin, which does not favor the interaction of this peptide with the subunit.

Key words. Receptor, N-methyl aspartate, conantokin G, brain, biotin.

INTRODUCCIÓN El receptor de glutamato tipo NMDA es un canal iónico heteromérico dependiente de ligando, que interactúa con múltiples proteínas intracelulares por medio de sus diferentes subunidades (1). Se encuentra concentrado en regiones postsinápticas y en menor proporción en sitios presinápticos (2), involucra una variedad de procesos de plasticidad neuronal como aprendizaje y memoria. Su sobreestimulación produce enfermedades neurodegenerativas, las cuales se relacionan con el flujo excesivo de calcio. A nivel neuronal se distinguen funciones como: activación del receptor tipo NMDA asociada con la larga duración de cambios en energía sináptica (3), organización de fibras aferentes con respecto a la duración del desarrollo neuronal (4) y participación en la neurotoxicidad del glutamato.

Este receptor se divide en siete genes que codifican cada una de sus subunidades. El gen GRIN1 codifica la subunidad NR1, que es un componente principal para la funcionalidad del receptor. Existe cierta heterogeneidad de la subunidad NR2 ya que presenta cuatro subtipos NR2A-NR2D, que

poseen perfiles de expresión específicos dentro del cerebro (5,6); la subunidad NR3 presenta dos subtipos NR3A y NR3B (7,8).

La subunidad NR2B del receptor NMDA presenta cuatro dominios transmembranales putativos, M1-M4 (9), donde el M2 forma un loop reentrante similar a la subunidad NR1 (10). Es abundante en hipocampo y corteza cerebral (5), adicionalmente, se ha caracterizado en zonas sensoriales, motoras y en estructuras asociadas con el sistema límbico. Al utilizar antagonistas selectivos para NR1/NR2B, se confirmó su presencia en cuerpos celulares de neuronas corticales maduras y alta expresión de la subunidad durante la maduración de neuronas dentro de membranas plasmáticas y neuronas de hipocampo (11). La subunidad NR2B no se encuentra expresada significativamente en hipotálamo y en tálamo, aún así es responsable de muchas funciones regulatorias dentro de estas dos regiones del sistema nervioso central (6,12).

La conantokina G, una conotoxina aislada del veneno de Conus geographus, es un péptido marino de 17 aminoácidos que se caracteriza por la presencia de cinco residuos

Reyes - Uso de una conantokina y anticuerpos policlonales

de ácido g-carboxiglutámico (G-E-g-g-L-Qg-N-Q-g-L-I-R-g-K-S-N-NH2) (13). Muestra alta selectividad y antagonismo para la subunidad NR2B del receptor NMDA. Esta toxina produce hiperactividad, y demuestra ser un potente bloqueador competitivo de las actividades del receptor NMDA, también se ha demostrado que es neuroprotectora en el modelo de isquemia cerebral transitoria en ratas (14) y ha sido activa en el modelo de enfermedad de Parkinson (15). A este grupo también pertenecen las conantokinas R, L y T que, de la misma manera, han demostrado su potencial como anticonvulsionantes (16).

El objetivo de este estudio fue proponer una metodología de identificación de la subunidad NR2B, mediante la utilización de conantokina G.

MATERIALES Y MÉTODOS Métodos de extracción. Se usaron dos métodos para la extracción del receptor tipo NMDA como complejo.

Metodología 1. Se homogenizaron 5 cerebros de rata adulta wistar con buffer de extracción (Tris–HCl 50 mM pH 9.0 e inhibidores de proteasas PMSF 10 mM, EDTA 100 mM, leupeptina 1 mg/mL, pepstatina 1 mg/mL y deoxicolato de sodio al 1% (p/v)) y se incubaron a 37°C durante 1 hora (17). Posteriormente el extracto se centrifugó a 18000 rpm por 1 hora a 4°C en centrifuga Sorvall RC5C. El pellet se conservó a -30°C y el sobrenadante se dializó contra 10 volúmenes de Tris-HCl 50 mM pH 7.5; Tritón X-100 0.1% en agitación constante, realizando tres cambios de buffer de diálisis.

Metodología 2. Se trataron 5 cerebros de rata adulta wistar con buffer HEPES 10 mM pH 7.4 (NaCl 137 mM; KCl 4.6 mM; KH2PO4 1.1 mM; MgSO4 0.6 mM; EDTA 1.1 mM) e inhibidores de proteasas (PMSF 0.5 mM, EDTA 2.5 mM, leupeptina 1 mg / m L , pepstatina 1 mg/mL). Con el extracto obtenido se realizaron centrifugaciones a 18000 rpm durante 1 hora a 4°C en centrifuga Sorvall RC5C. El pellet obtenido se resuspendió en buffer de extracción

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descrito en la metodología 1, continuando con su tratamiento de acuerdo con lo descrito en esa metodología.

Purificación preliminar por cromatografia de exclusión molecular. Los extractos obtenidos de ambas metodologías se purificaron preliminarmente con una columna de exclusión molecular Sephacryl S-200 (volumen de soporte 226 mL) realizando siembras de 5 mL (4 mg/mL) y eluyendo con buffer Tris-HCl 50 mM pH 7.5; Tritón X-100 0.1%, con un volumen muerto aproximado de 70 mL. Se colectaron volúmenes de 1 mL realizando seguimiento de proteína mediante absorbancia a 280 nm. Los tubos que presentaron ma y o r a b s o r b a n c i a s e reunieron para formar las fracciones I y II de acuerdo con el perfil cromatográfico I. La fracción I corresponde al volumen muerto de la columna.

Concentración. Las fracciones I y II (FI y FII) obtenidas a partir de la cromatografía de exclusión molecular se concentraron, mediante ultrafiltración con membrana AMICON YM100. El volumen de extracto concentrado obtenido fue diez veces menor que el volumen de las fracciones iniciales.

Cromatografia de afinidad unando sepharosa 4B-NHS-Glu. Se utilizaron 2 mL de Sepharosa 4B-NHS (Pharmacia ®) a la cual se le acopló glutamato (Glu 2.0 M), de acuerdo con las siguientes condiciones (18): se tomaron 2 mL de sepharosa 4B y se lavaron con 2 mL de agua, seguido de dos lavados con 2 mL de NaOH 1 M. Posteriormente se suspendió en igual volumen de soporte una solución 1 M de NaOH más 200 mL de butanediolglicileter y 2 mg de NaBH4. Se mantuvo en agitación toda la noche a temperatura ambiente y se lavó el gel varias veces con agua, solución NaCl 1 M y de nuevo con agua. El glicidol modificado obtenido fue oxidado con periodato. Para esto, se lavó la sepharosa-epoxi activada con una solución de NH4OH 1 M y luego se suspendió en esta misma solución. Se mantuvo a 40°C en agitación por 3 horas.

Posteriormente, se enfrió la mezcla de reacción y se lavó con agua, solución de NaCl 1 M y de nuevo con agua. Se adicionó metperiodato de sodio (NaIO4 0.2 M) al gel,

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

agitando y manteniendo a temperatura ambiente por 90 min. Se lavó 5 veces con agua. Seguidamente, se lavó con 10 volúmenes del buffer de acople (buffer fosfato 0.1 M, pH 7.0). Se adicionaron al soporte, 2 mL de una solución de glutamato 2.0 M (en buffer de acople) y 0.024 g de cianoborohiduro de sodio, dejando la mezcla en agitación toda la noche a temperatura ambiente. Finalmente, el soporte se lavó con agua, solución de NaCl 1 M y agua de nuevo.

La determinación de la cantidad de glutamato acoplado a la columna se realizó mediante una curva de calibración de glutamato con ninhidrina y la determinación de la presencia de glutamato en las fracciones colectadas en los lavados posteriores al acople.

Una vez comprobado el acople, se realizó la cromatografía de afinidad usando la fracción FI concentrada. La columna se equilibró con Tris-HCl 50 mM pH 7.5; Tritón X-100 0.1% y este mismo buffer fue usado para elución de la fracción no retenida. El volumen de muestra sembrado fue de 5 mL (8.8 mg/mL) esto se eluyó con el buffer mencionado anteriormente, haciendo un seguimiento de absorbancia a 280 nm hasta obtener nuevamente la línea base. La fracción retenida se eluyó con Gly-HCl 50 mM, Tritón X-100 0.1% pH 2.4, colectándose fracciones de 0.85 mL a los cuales se les adicionaba previamente 0.15 mL de buffer Tris-OH pH 11.4. La presencia de proteína se detectó por seguimiento de absorbancia a 280 nm.

Cuantificación. Para determinar la concentración de proteína presente se utilizó el método del ácido bicinconínico (19) en microplacas, utilizando como patrón albúmina sérica bovina (BSA) de 1.59 mg/mL. Esta determinación se realizó a todos los extractos y fracciones obtenidas en cada uno de los pasos cromatográficos.

Biotinilación de la conantokina G. Se biotinilaron 0.2 mg de Conantokina G (Bachem®) con 0.1 mg de biotina (SulfoNHS-LCBiotina) (20) en 200 µL de PBS 150 mM pH 7.4. Se realizó el control mediante DOT-BLOT (método descrito posteriormente) del péptido biotinilado en diluciones seriadas de 1:100; 1:500; 1:1000.

Ensayos de identificación. Para determinar la presencia de la subunidad NR2B se utilizaron las siguientes técnicas: DOT-BLOT (21). Se tomó una membrana de nitrocelulosa de 6 cm x 3 cm, se sembraron las muestras por duplicado tomando como control 5 µL de PBS-BSA 1.3%. Las muestras usadas correspondieron a 5 µL de los extractos y fracciones de cromatografías realizadas, los cuales se fijaron a la membrana durante 2 horas a temperatura ambiente. Paso seguido se realizó el bloqueo de la membrana usando PBS-BSA 1.3% durante 4 horas a temperatura ambiente y toda la noche a 4°C. Posteriormente se retiró la solución de bloqueo y se lavó la membrana con PBS-Tween 20 0.1%. Se realizó este lavado tres veces consecutivas.

Seguidamente se adicionó una solución de anticuerpo primario (AntiNR2B (SantaCruz ®) 0.2% en PBS-BSA 1.3%) a l a m e m b r a n a , d u r a n te 2 horas a temperatura ambiente. Enseguida se procedió a retirar la solución de anticuerpo primario y se lavó 3 veces la membrana con PBS-Tween 20 0.1%. Se adicionó solución de anticuerpo secundario (Anti IgG de conejo generado en cabra acoplado a peroxidasa (Sigma ®) 0.2% en PBS-BSA 1.3%), por 1 hora a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se retiró la solución de anticuerpo secundario y se lavó 3 veces la membrana con PBS-Tween 20 0.1%. Posteriormente se adicionó la solución reveladora (10 mL de PBS, 5 mg de diaminobencidina “DAB” y 10 µL de peróxido de hidrógeno al 30%).

Finalmente la membrana se lavó con PBSTween 20 0.1%.

Ensayo de ELISA (17). Para el ensayo de ELISA se sensibilizó una placa de poliestireno NUNC-Maxisorp F-16 con las fracciones recolectadas de las cromatografías de los diferentes estados de purificación, tomando como controles extractos crudos (se utilizaron 3 controles). El ensayo se realizó por duplicado, fijando inicialmente 2, 10, 20 y 40 mg de proteína en cada pozo y adicionando 150 mL de buffer carbonato 50 mM pH 9.6 e incubando a 37°C durante 3 horas y a 4°C durante 12 horas. Seguidamente se lavó la placa 3 veces con PBS-Tween 20

Reyes - Uso de una conantokina y anticuerpos policlonales

0.1% y se adicionaron 200 mL de PBS-BSA 1.3% llevando a incubación a 37°C por 3 horas y luego a 4°C durante 12 horas. Se retiró la solución de bloqueo y se lavó de nuevo 3 veces con PBS-Tween 20 0.1%.

Seguidamente se adicionaron 200 mL de AntiNR2B 0.2% en PBS-BSA 1.3% como anticuerpo primario a las fracciones y al control 2. A los controles 1 y 3 se adicionaron 200 mL de PBS-BSA 1.3%. La placa se llevó a incubación durante 1 hora a 37°C y luego a 4°C durante 1 hora. Se retiró el anticuerpo primario y se lavó la placa 3 veces con PBSTween 20 0.1%. Se adicionaron 200 mL de anti IgG de conejo generado en cabra 0.2% en PBS-BSA 1.3% al control 3 y a las fracciones. A los controles 1 y 2 se adicionaron 200 mL de PBS-BSA 1.3%. La placa se llevó a incubación durante 1 hora a 37°C y luego a 4°C durante 1 hora.

Posteriormente se retiró el anticuerpo secundario y se lavó la placa 3 veces con PBS-Tween 20 0.1%. Se adicionaron a todos los pozos 200 mL de revelador (3 mg de ABTS en 10 mL de buffer citrato-fosfato pH 5.0 más 15 mL de peróxido de hidrógeno al 30%), se dejó la placa en la oscuridad y se determinó la absorbancia a 415 nm en lector de microplacas modelo 550 (BioRad™) a los 15, 30 y 45 minutos de reacción.

Imnumotransferencia WESTERN BLOT. Electroforesis SDS-PAGE. Se realizó de acuerdo con el método de Laemmli (17) usando geles de 8 cm de longitud, al 12.5% T, 5% C. Las muestras se mantuvieron en baño de agua en ebullición durante 5 minutos.

Se prepararon dos geles idénticos y se corrieron a 120 V, 70 mA hasta final del gel.

El gel se tiño con azul de Coomasie R-250.

WESTERN-BLOT (17). Los 2 geles obtenidos de SDS-PAGE 12.5% se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (previamente tratadas con buffer de transferencia), en cámara de transferencia (14 V, 67 mA, 1 W, durante 35 minutos). Luego las membranas se bloquearon con PBS-BSA 1.3% durante 4 horas a temperatura ambiente y toda la noche a 4°C. Se retiró la solución de bloqueo y se lavó la membrana con PBSTween 20 0.1%. A una de las membranas se adicionó solución de anticuerpo primario (AntiNR2B 0.2% en PBS-BSA 1.3%)

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durante 2 horas a temperatura ambiente.

Enseguida se procedió a retirar la solución de anticuerpo primario y se lavó la membrana con PBS-Tween 20 0.1%. Posteriormente se adicionó solución de anticuerpo secundario (Anti IgG de conejo generado en cabra 0.2% en PBS-BSA 1.3%), por 1 hora a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se retiró la solución de anticuerpo secundario y se lavó la membrana con PBS-Tween 20 0.1%.

Finalmente se adicionó la solución reveladora (10 mL de PBS, 5 mg de diaminobencidina “DAB”, y 10 µL de peróxido de hidrógeno al 30%) hasta coloración esperada. Se lavó con PBS-Tween 20 0.1%.

A la otra membrana de nitrocelulosa se adicionó solución de conantokina G- biotinilada al 0.2% en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Enseguida se procedió a retirar la solución y se lavó la membrana con PBSTween 20 0.1%. Se adicionó solución de Estreptavidina peroxidasa 0.2% en PBS por 1 hora a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se retiró esta solución y se lavó la membrana con PBS-Tween 20 0.1%.

Finalmente se adicionó la solución reveladora (10 mL de PBS, 5 mg de Diaminobencidina “DAB”, y 10 µL de peróxido de hidrógeno al 30%). Posteriormente la membrana se lavó con PBS-Tween 20 0.1%.

Histoquímica. Para determinar la presencia de la subunidad, se realizaron ensayos de histoquímica sobre cortes de hipocampo de cerebro de rata a los cuales se les hizo interactuar con conantokina biotinilada o antiNR2B y la detección se realizó por el sistema estreptavidina peroxidasa (el protocolo fue realizado con Vecstain ABC (Avidin-Biotin complex)) y DBA como sustrato. Se lavaron los tejidos tres veces con PBS-Tritón X-100 0.3% en intervalos de 4 minutos y posteriormente con PBS. Se adicionó PBS-H 2 O 2 3% por una hora a temperatura ambiente y se lavaron lo tejidos con PBS-Tritón X-100 0.3% en los mismos intervalos de tiempo. Los cortes de cerebro se dividieron en dos grupos para los ensayos con anticuerpos y los ensayos con Conantokina-G biotinilada.

Inmunohistoquímica (17). Después del lavado con PBS-Tritón X-100 0.3% se

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adicionaron 2 mL de anticuerpo primario (AntiNR2B 0.2% en PBS-BSA 1.3%), durante 2 horas a temperatura ambiente. Enseguida se procedió a retirar la solución de anticuerpo primario y se lavó el tejido con PBS-Tritón X100 0.3% tres veces en intervalos de tiempo de 4 minutos en cada lavado. Se adicionaron 2 mL de anticuerpo secundario (Anti IgG de conejo generado en cabra, 0.2% en PBSBSA 1.3%), por 1 hora a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se retiró la solución de anticuerpo secundario y se lavó el tejido con PBS-Tritón X-100 0.3% dos veces y un tercer lavado con PBS en intervalos de tiempo de 4 minutos en cada lavado. Finalmente se adicionó la solución reveladora (10 mL de PBS, 5 mg de Diaminobencidina “DAB”, y 10 µL de peróxido de hidrógeno al 30%).

Ensayo con péptido (Conantokina GBotinilada). Después del lavado con PBSTritón X-100 0.3% se adicionaron 2 mL de Conantokina G-biotinilada 0.2% en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente.

Enseguida se procedió a retirar la solución de péptido y se lavó el tejido con PBS-Tritón X-100 0.3% tres veces en intervalos de tiempo de 4 minutos en cada lavado. Se adicionaron 2 mL de estreptavidina peroxidasa 0.2% en PBS por 1 hora a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se retiró la solución y se lavó el tejido con PBS-Tritón X-100 0.3% dos veces y un tercer lavado con PBS en intervalos de tiempo de 4 minutos en cada lavado. Finalmente se adicionó la solución reveladora (10 mL de PBS, 5 mg de Diaminobencidina “DAB”, y 10 µL de peróxido de hidrógeno al 30%).

Al realizar la cromatografía de exclusión molecular con cada uno de los extractos obtenidos, se observa que el perfil obtenido es similar en todos los casos, y se muestra la presencia de dos picos de absorbancia, los cuales se nombran como FI y FII (Figura 1).

Figura 1. Cromatografía de exclusión molecular (Perfil cromatográfico). Obtención de fracciones I y II por cromatografía sobre Sephacryl S-200 realizada a extractos obtenidos por los métodos de extracción 1 y 2.

Comparando los dos métodos de extracción del receptor NMDA como complejo, el que presentó mayor efectividad de acuerdo con la cantidad de proteína extraída en la fracciones FI o de alto peso molecular de cromatografía de exclusión molecular S-200, fue el descrito como método 2 (Figura 2).Los datos encontrados para las proteínas de bajo peso molecular (Fracción II), muestran que el método 1 permite obtener una mayor cantidad de proteínas con esta característica (Figura 2).

Los cortes de tejido fueron observados en microscopio óptico a una amplificación total de 100X.

RESULTADOS Los datos iniciales de concentración de proteína varían entre 4.2 mg/mL y 4.8 mg/mL para los 5 extractos obtenidos mediante la metodología 1 y entre 4.5 mg/mL y 5.0 mg/ mL para los obtenidos mediante la metodología 2. Ante estos valores, se evidenció que la concentración de proteína obtenida es muy similar y que no hay diferencias marcadas entre estos dos métodos de extracción.

Figura 2. Cuantificación de proteína de S-200.

Concentración (mg/mL) de proteína en fracciones I y II de Cromatografía sobre Sephacryl S200 realizadas a extractos obtenidos por método 1 y 2.

Reyes - Uso de una conantokina y anticuerpos policlonales

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De igual manera los ensayos realizados mediante la prueba de ELISA permitieron observar que el método 2 para la extracción de la subunidad NR2B es más efectivo frente al método 1 de extracción. (Figura 3).

Figura 4. Cromatografía de afinidad. Perfil de Cromatografía de afinidad sobre Sepharosa 4B-NHS-Glu realizada a fracciones I obtenidas por cromatografía S-200.

Figura 3. Presencia de la subunidad NR2B. Determinación de la presencia de la subunidad NR2B en las fracciones obtenidas a partir de los extractos de cerebro de rata, por medio de la prueba de ELISA a fracciones I y II.

La extracción de la subunidad se realizó mediante la metodología 2, seguida de la realización de la cromatografía de exclusión molecular usando Sephacryl S-200. Las fracciones I (FI) de las diferentes cromatografías realizadas fueron reunidas y concentradas mediante ultrafiltración. Éstas se utilizaron para la realización de la cromatografía de afinidad de acuerdo con las especificaciones mostradas en la metodología.

El perfil cromatográfico obtenido al realizar la cromatografía de afinidad presenta dos picos característicos, uno de los cuales corresponde a la fracción no retenida y el otro, a la fracción retenida. (Figura 4). El pico número 1 presenta una alta concentración de proteína, la cual es eluída uniformemente del soporte activado. El pico número 2 requiere del uso de un pH ácido para su liberación del soporte y representa una porción muy pequeña de la cantidad de proteína presente en el extracto utilizado para esta cromatografía. Se reunieron varias fracciones retenidas y se concentraron hasta reducir su volumen cerca de diez veces (ultrafiltración).

Los extractos crudos y las diferentes fracciones de las cromatografías realizadas fueron cuantificadas por ácido bicinconínico (BCA). Los valores oscilan entre 12 mg/mL, correspondiente a extracto crudo concentrado por ultrafiltración, hasta 0.1 mg/mL de una fracción II de exclusión molecular (Figura 5).

Figura 5. Cuantificación de proteína por BCA. Concentración de proteína cuantificada por BCA de Extracto crudo, Fracciones I y II de cromatografía sobre sephacryl S-200 y concentrados de estas fracciones. Así como fracciones retenidas y no retenidas de cromatografía de afinidad.

Los ensayos de ELISA (Figura 6) y DOTBLOT permitieron detectar la presencia de la subunidad NR2B, presentando un reconocimiento del anticuerpo primario (AntiNR2B) hacia la subunidad de acuerdo con el patrón de marcación exhibido (Figura 7A1). Por esta técnica igualmente se

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evidenció la biotinilación de la conantokina G, lo cual se observó por el reconocimiento generado por la estreptavidina peroxidasa y su posterior revelado con DAB (Figura 7A2).

Figura 6. Ensayo de ELISA. Resultados de ELISA realizado a diferentes extractos (EC, Extracto crudo, FI y FII de cromatografía de exclusión molecular y FR, fracción retenida de cromatografía de afinidad y B, control), utilizando ANTI-NR2B para reconocer la subunidad.

Con el péptido biotinilado se realizaron ensayos de ELISA comparando la interacción de este péptido marcado y la obtenida por el anticuerpo AntiNR2B con la subunidad. Los resultados obtenidos cuando se utilizó el péptido biotinilado, mostraron que no se había generado interacción con la subunidad que se encontraba en cada una de las fracciones utilizadas para este ensayo (extracto crudo, FI y FII de cromatografía de exclusión molecular y Fracción retenida de cromatografía de afinidad), independientemente de la cantidad de proteína presente en cada uno de los pozos del ensayo.

Los valores obtenidos a diferentes tiempos de revelado, se encontraban similares a los generados por los controles utilizados (datos no mostrados). De manera contraria a los resultados anteriores, la utilización del anticuerpo comercial mostró una buena interacción con cada una de las fracciones utilizadas y una tendencia a aumentar el valor de absorbancia obtenido después del revelado, de acuerdo con el aumento de la cantidad de proteína utilizada (5, 10, 20 y 40 µg) en cada pozo del ensayo (Figura 6).

Adicionalmente se muestra que el reconocimiento se hace más evidente al interactuar con las fracciones retenidas obtenidas por la cromatografía de afinidad, seguida por las fracciones de extracto crudo FI y FII de cromatografía de exclusión

Figura 7. DOT BLOT. Se identifica en (A1) la presencia de la subunidad NR2B en diferentes fracciones obtenidas por cromatografía de exclusión molecular, y en (A2) la marcación generada en la conantokina G biotinilada a diferentes diluciones. Electroforesis SDS-PAGE. Extracto crudo y fracciones en (B) (12,5%T, 5%C) y transferencia (C) a membrana de nitrocelulosa de extracto crudo (EC), fracción I y II (FI y FII) de cromatografía de exclusión molecular y fracción retenida (FR) de cromatografía de afinidad. La transferencia se verificó por tinción con Rojo Pounceau (C, derecha) y el WESTERN-BLOT se realizó con AntiNR2B.

molecular. Estos datos corroboran los obtenidos por DOT-BLOT ya que allí también se evidenció la interacción con la subunidad NR2B presente en la fracción I y en menor proporción, en la FII de la cromatografía de exclusión molecular.

La electroforesis SDS-PAGE mostró una banda de alto peso molecular que podría corresponder a la subunidad NR2B (mayor a 100 kDa en Extracto crudo y FI) y una banda de bajo peso molecular, cercano a 21 kDa presente en la fracción retenida de afinidad.

(Figura 7B). Al realizar la transferencia a membrana de nitrocelulosa e identificar la subunidad NR2B por el anticuerpo o, separadamente, por el péptido biotinilado, nuevamente se encontró un buen

Reyes - Uso de una conantokina y anticuerpos policlonales

reconocimiento por parte del anticuerpo, el cual marcó una banda de alto peso molecular en el extracto crudo y la FI, pero, contrario a lo esperado, reconoció también la banda de bajo peso molecular en la fracción retenida de la cromatografía de afinidad (Figura 7C).

Los resultados obtenidos al usar el péptido biotinilado para identificar interacción en las mismas fracciones mostraron que no se generaba la interacción ni con la banda de alto peso molecular del extracto crudo y FI ni con la banda de bajo peso molecular presente en la fracción retenida de la cromatografía de afinidad (datos no mostrados).

Los resultados obtenidos en la histoquímica (Figura 8) muestran que la interacción generada con la conantokina biotinilada no fue efectiva ya que la coloración y el marcaje obtenido fueron similares a los resultados obtenidos con el control negativo.

Figura 8. Histoquímica de cortes de hipocampo de cerebro de rata. A. Control negativo.

La tinción mostrada es hematoxilinaEosina. B. Control positivo. Corte tratado con anti-NR2B y revelado con DAB. Contracoloración de hematoxilinaEosina. C. Corte tratado con Conantokina biotinilada y revelado con DAB. Contracoloración de hematoxilinaEosina. Amplificación total: 100X.

El control positivo utilizado (tratado con antiNR2B) si mostró un reconocimiento marcado en las zonas que se han descrito previamente como las que presentan una mayor cantidad de este receptor (Hipocampo).

DISCUSIÓN El receptor de glutamato tipo NMDA es un blanco farmacológico de gran importancia debido a su incidencia en desórdenes

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neurológicos como epilepsia, Alzheimer, Parkinson, Huntington, entre otros. En todos estos casos, una de las subunidades que parece tener un mayor grado de importancia es la subunidad NR2B ubicada en membrana de regiones postsinápticas de células nerviosas (22). Por tanto es necesario establecer una metodología que permita la purificación y análisis de dicha subunidad.

En este caso particular se ensayaron dos metodologías de extracción, la primera (metodología 1) (17) la cual presenta ciertas modificaciones respecto a lo reportado en la segunda (metodología 2) se pretendió hacer una purificación previa mediante la utilización de un buffer de extracción que no posee detergentes y solubiliza proteínas no hidrofóbicas, dejando en el pellet de la primera centrifugación las proteínas que sean componentes de membranas ya que éstas requieren el uso de detergentes para su solubilización.

De acuerdo con el comportamiento e interacción del glutamato como agonista de la subunidad NR2B, se realizó el acople del glutamato al soporte de Sepharosa-4B previamente activado (18). El éxito del acople del glutamato al soporte se evidenció nuevamente por la obtención de una fracción retenida a partir de los extractos que fueron sembrados sobre esta columna. De acuerdo con los perfiles obtenidos (Figura 4), se evidenció que existe esta fracción retenida, la cual se eluye al modificar las condiciones de pH en el buffer de elución. El peso molecular de la proteína obtenida por esta cromatografía, se encuentra cercano a los 21 kDa que es un peso molecular muy bajo para cualquiera de las subunidades del receptor NMDA. Sin embargo, se puede ver cómo el anticuerpo utilizado reconoce esta banda con la misma intensidad que lo hace con una banda de peso molecular alto (160 kDa), que corresponde a la subunidad NR2B (Figura 7). Hasta el momento, no se ha descrito en la literatura un fragmento tan pequeño (21 kDa) que corresponda a una sección de la subunidad NR2B. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que dicho fragmento se puede encontrar y que podría corresponder a una sección del dominio extracelular que está comprometido con el reconocimiento al glutamato. Esta afirmación

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se sustenta con los resultados de afinidad, ELISA y WESTERN-BLOT (Figuras 4, 6 y 7).

Teniendo en cuenta la alta afinidad de la conantokina G por la subunidad NR2B y la poca reacción cruzada con otros receptores presentes en tejido cerebral, se utilizó este péptido para determinar la presencia de la subunidad mediante ensayos de WESTERN y DOT-BLOT. En estos ensayos se observó la interacción que tienen los anticuerpos en el reconocimiento de la subunidad, resultados que se comprueban con el ensayo de histoquímica, donde se presentan características propias a la detección por DAB y hematoxilina (reacciones coloreadas).

Pero en el caso del péptido biotinilado no se presentan los resultados característicos a un marcaje de la conantokina G por la biotina como método directo de interacción.

Puesto que la biotina se une de forma covalente a cadenas laterales amino o extremos amino terminales de aminoácidos, la unión de la conantokina en la biotinilación se haría en el residuo de lisina 15 y en la glicina 1 del péptido, residuos que pueden participar fuertemente en la interacción entre estas dos moléculas (13). Análisis computacionales (datos no mostrados), muestran que la incorporación de la biotina en la estructura de un péptido tan pequeño como la conantokina, modifica grandemente su campo energético y por tanto, su superficie molecular, lo que inevitablemente resulta en pérdida de los sitios de unión entre el péptido y la subunidad. Esto significaría que se genera un impedimento de tipo estérico que impediría el reconocimiento de los aminoácidos glutamato 2, g-carboxiglutamato

4 e isoleucina 12 del péptido.

En conclusión, si se da el acople de dos moléculas de biotina hacia la conantokina G, esas biotinas se presentarían como grupos voluminosos capaces de interferir en la afinidad del péptido marino hacia la subunidad NR2B, hecho que resulta ser valedero al momento de explicar la no interacción de la subunidad con el péptido biotinilado para su posterior reconocimiento por la estreptavidina peroxidasa.

Ahora bien, debido a la importancia del receptor NMDA en los procesos de aprendizaje, memoria y plasticidad neuronal, mediados por el transporte de calcio a través del canal asociado a dicho receptor, es preciso continuar en la comprensión del funcionamiento de este tipo de receptores ionotrópicos. Por tanto se hace necesario buscar una forma de marcaje de la conantokina G que no afecte la interacción y reconocimiento de este tipo de péptidos por la subunidad NR2B, además de identificar la banda de peso molecular bajo que se obtuvo en la purificación por cromatografía de afinidad y que es reconocida por el anticuerpo primario AntiNR2B. Agradecimientos Al Dr. Leonardo Lareo y a los Doctores Gerardo Pérez y Nohora Vega del Grupo de Investigación en Proteínas. A la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad Nacional de Colombia (División de Investigación-Sede Bogotá).

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Rev.MVZ REVISTA Córdoba MVZ 15(3):2158-2164, 2010. 15(3), Septiembre - Diciembre 2010 CÓRDOBA • Volumen 2158

ORIGINAL

Estudio de razas de palomas españolas a partir del análisis de caracteres morfológicos cualitativos Study of spanish dove breeds based on the analysis of qualitative morphological characteristics Pere-Miquel Parés C, Ph. D. Universidad de Lleida, ETSEA, Departamento de Producción Animal. Avda. Rovira Roure 191, 25198-Lleida, Catalunya, España. Correspondencia: peremiquelp@prodan.udl.cat

Recibido: Febrero 16 de 2010; Aceptado: Agosto 15 de 2010

RESUMEN Objetivo. Evaluar una posible base morfológica que sustente una clasificación racional y no arbitraria de razas de palomo, se estudió la relación fenética entre diferentes razas. Materiales y métodos. Se sometieron para su estudio morfológico comparativo un total de 29 razas españolas de palomas, considerándose cada raza como Operational Taxonomic Unit (OTU) y agrupadas a priori en grupos de afinidad funcional y morfológica: buchones, razas catalanas, razas baleáricas, palomos de morfología. Se realizó un análisis de coordenadas (ACo) sobre la base de la matriz de distancias de similitud de Gower entre OTUs a partir del análisis de 29 caracteres. A fin de conocer cuáles eran las variables responsables de las similitudes y/o disimilitudes observadas se aplicó igualmente un análisis de correspondencia (ACrr).

Resultados. En el ACo se reflejó que la variabilidad representada por los dos primeros vectores Eigen no es alta. El ACrr demostró que muchas variables están fuertemente correlacionadas. Conclusiones. La distribución de las razas en el ACo apunta a una distribución bastante buena en los 4 grupos establecidos. El ACrr mostró que las variables más discriminantes pueden ser reducidas a nueve: grosor y longitud del pico, desarrollo de las carúnculas nasales y oculares, longitud del cuello, tamaño y colgado de buche, longitud relativa de la cola y posición de las alas en reposo respecto de la cola.

Palabras clave: Análisis de coordenadas, análisis de correspondencia, buchón ladrón, etnología, morfología, variedad.

ABSTRACT Objective. To evaluate a possible morphological base that supports a rational and nonarbitrary classification of dove breeds, the phenetic relationship between different breeds was studied. Materials and Methods. Twenty nine different dove breeds were submitted for a comparative morphological study, considering each breed as an Operational Taxonomic Unit (OUT), and grouped a priori in morphological and functional affinity groups such as: 2158

Pere - Estudio de razas de palomas españolas

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large crop, Catalonian breeds, Balearic breeds, and morphological doves. A coordinate analysis (ACo) was made based on Gower’s similar distance matrix between OTUs from the analysis of 29 traits. In order to know which were the variables responsible for the observed similarities or differences, a correspondence (Carr) analysis was carried out. Results. The ACo showed that the variability represented by the two first eigen vectors is not high. The Carr showed that many of the variables are strongly related. Conclusions. The distribution of breeds in the Aco points towards a fairly good distribution in the 4 established groups. The Carr demonstrated that the most discriminating variables may be reduced to nine: thickness and beak length, development of nasal and eye caruncles, neck length, crop size and hang, relative tail length, and wing position in relation to the tail at rest position.

Key words: Coordenate analysis, correspondence analysis, crop, ethnology, morphology, variety.

INTRODUCCIÓN El pensamiento humano, en general, como se refleja en el lenguaje, parece depender fuertemente del reconocimiento de grupos, particularmente los grupos de objetos a los que damos nombres colectivos (1).

Podríamos notar que “raza de paloma” implica dos procesos mentales, primero el de considerar las semejanzas que poseen “todas” las palomas y segundo, considerar las diferencias entre razas. En el contexto etnológico, el concepto de clasificación racial está restringido al agrupamiento de los animales en razas por sus atributos estructurales, excluyendo de ellas algunos animales considerados “no puros”.

Muchas veces resulta empírico clasificar las razas en grupos, en base a una coincidencia de caracteres, y por ello la relación que suele utilizarse para hacer un agrupamiento racial suele ser la “asociación por semejanza”. Una insuficiencia de caracteres informativos puede ser la razón de por qué no se puede resolver la falta de una clasificación consistente. Dos fenómenos son los que podrían contribuir a esta dificultad. Primero, el hecho, bien conocido, de que el fenotipo, en la mayoría de las razas, está “estandarizado”, responde a un prototipo ideal –lo que debe ser– no a un morfotipo –lo que es–. Pero el estándar proporciona solamente unos pocos indicios morfológicos, insuficientes para intentar esta asociación.

El tema se complica aún más en las razas que no poseen estándar racial.

En taxonomía numérica existe un gran número de métodos de análisis multivariado tendientes a la caracterización de individuos o conjunto de individuos, generalmente asociados al tipo de variables con que se trabaja. El Análisis de Coordenadas (ACo) permite analizar las similitudes entre los perfiles de una misma nube de puntos, pudiendo establecerse qué grupos son más similares o disimilares entre sí, así como las similitudes entre categorías. Pero el ACo únicamente muestra la similitud o disimilitud entre grupos, facilitando la separación de éstos, aunque no permite saber cuáles son las variables responsables de estas similitudes y/o disimilitudes observadas. La interpretación de las relaciones entre perfiles de nubes diferentes no es directa, siendo necesario considerar la naturaleza baricéntrica de tal relación; y para ello, tales asociaciones deben evaluarse mediante las proyecciones sobre ejes factoriales. El análisis de correspondencia (ACrr) permite resaltar las variables que determinan la configuración de los ejes y que gozan de mayor calidad de representación.

En este trabajo se presenta un estudio de las relaciones existentes entre diferentes razas de palomas españolas, realizado a partir del análisis de la información generada del estudio de sus caracteres morfológicos cualitativos, con el objetivo final de convertir los resultados en un esquema de clasificación racional y, por tanto, no arbitrario. La

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ausencia hasta el presente de datos suficientemente objetivos de las razas de palomas, indujo el planteamiento de esta investigación, en un intento de contribuir a ampliar su conocimiento. Debe destacarse que los resultados se obtienen en base a semejanzas morfológicas, y no se pretende de ningún modo establecer una clasificación de tipo filogenético.

MATERIALES Y MÉTODOS Se sometieron para su estudio morfológico comparativo un total de 29 razas de palomas, considerándose cada raza como OTU (“Operational Taxonomic Unit”), agrupadas a priori en grupos de afinidad funcional y morfológica: buchones, razas catalanas, razas baleáricas, palomos de morfología. Las razas analizadas fueron: Alteño (ALT), Borino (BBO), “Colom d’Escampadissa” (BCE), Buchón Balear o “Gavatxut” (BGA), Mallorquina (BMA), “Nas de Xot” (BNX), “Pinta

Balear” o “d’Esbart” (BPB), Canario (CAN), Colillano (COL), Gaditano (GAD), Granadino (GRA), Jiennense (JIE), Laudino Sevillano (LAU), Marteño (MAT), Marchenero (MCH), Moroncelo (MOR), Morrillero Alicantino (MRR), Quebrado Murciano (QUE), Rafeño (RAF), “Coll Pelat” (SCP), “Colom d’Ull” (SCU), Figureta (SFI), “Flamenquilla” (SFL), Refilador o “Ull de Peix” (SRE), “Ull de Maduixa” (SUM), “Vol Català” (SVC), Chorrera o “Colom d’Enreixat” (SXO), Veleño (VEL) y Nuevo Buchón Valenciano (NVP). Como grupo de comparación se utilizó la paloma bravía (Columba livia, PAB).

Se definieron 29 caracteres morfológicos, todos ellos morfológicos cualitativos discontinuos y cualitativos, en series desordenadas (no aditivas y, lógicamente, no de naturaleza lineal), y dicotómicas o, la mayoría, multicotómicas. El estado de cada carácter para cada raza se estableció a partir de las descripciones dadas por el patrón racial (en las razas que lo poseen) y de las

Tabla 1. Caracteres utilizados y su correspondiente codificación

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descripciones proporcionadas por Levy (2), Mackrott (3) y Schille (4) y, en caso de falta de algún dato en la bibliografía consultada, según las informaciones ofrecidas por los propios criadores. Los números para cada estado fueron asignados de una manera arbitraria, no implicando ningún peso específico. El número de estado para cada carácter fue establecido según el número de clases fenotípicas distinguibles.

Cada estado puede derivarse directamente de cualquier otro y en cualquier secuencia, por lo que los caracteres son tratados bajo la opción de no ser aditivos (1). Se contabiliza como máximo un paso por transformación al aplicarlo a la longitud del árbol (1). Los caracteres utilizados y su

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correspondiente codificación se muestran en la tabla 1. La matriz básica de datos (MBD) se presenta en la tabla 2.

A fin de separar OTUs con características similares, se realizó un análisis de coordenadas (ACo) sobre la base de la matriz de distancias de similitud de Gower entre OTUs, aplicando una transformación exponencial c=1. El coeficiente de similitud de Gower (5) permite que los valores evaluados involucren variables de diferente naturaleza (nominal, presencia/ausencia), siendo apto para calcular similitudes cuando se tiene tales mezclas de variables, como es el caso del presente estudio.

Tabla 2. Matriz básica de datos (MBD). Abreviaturas en el texto

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Quizás considerar el “peso” de los caracteres permitiría afinar esta clasificación. Y es que muchos caracteres están altamente correlacionados. Considerar pues estos caracteres correlacionados como caracteres separados podría conducir a error, puesto que hablando en términos raciales, podrían ser puramente un reflejo de un único cambio morfológico o funcional en manos de los criadores. La formación de algunas razas en base a la búsqueda de unos determinados caracteres podría conllevar, por lo menos en algunos casos, la adquisición de un considerable número de nuevos caracteres.

De hecho, dentro de una raza, las transiciones entre caracteres por fuerza han de resultar más fáciles que en la evolución por mecanismos naturales (“tacañería evolutiva”). Por ello, a fin de conocer cuáles son las variables responsables de estas similitudes y/o disimilitudes observadas se aplicó un análisis de correspondencia (ACrr).

Para todos los análisis se utilizó el programa PAST (6).

RESULTADOS En el ACo se reflejó que la variabilidad representada por los dos primeros vectores Eigen no es alta. Los 3 primeros vectores absorbían únicamente un 43.37 % de la variabilidad total. En la tabla 3 se muestran los eigenvalues y porcentajes para los tres primeros ejes. Se observaron los planos factoriales 1-2, 1-3 y 2-3 para evaluar en éstos la estabilidad de los cuatro grupos.

Se eligió el plano 1-2 por ser el que mejor los mostraba (Figura 1) puesto que en él pueden representarse los grupos obtenidos de manera bastante exclusiva, con poca traslapación entre nubes: grupo de buchones (Alteño ALT, Canario CAN, Colillano COL, Gaditano GAD, Granadino GRA, Jiennense JIE, Laudino Sevillano LAU, Marteño MAT, Tabla 3. Valores obtenidos del análisis de coordenadas (3 primeros ejes).

0,25

BMA

0,2 BBO BC E 0,15

PAB

SC U

BPB

SUM 0,1 Coordenada 2

2162

MC H RAF 0,05

SFL

VNP

0 GRA GAD

SXO

QUE MRR

VEL

BGA

-0,05

SC P SFI

BNX C AN

-0,1

ALT

SVC

MOR

JIE

-0,15

-0,2 -0,4

SRE

LAU

-0,32

-0,24

-0,16

MAT C OL

-0,08

0

0,08

0,16

0,24

C oordenada 1

Figura 1. Análisis de Coordenadas utilizando la matriz de 29 variables cualitativas.

Proyección de las OTUs en el espacio de las coordenadas 1 y 2. Abreviaturas en el texto

Marchenero MCH, Moroncelo MOR, Morrillero Alicantino MRR, Quebrado Murciano QUE, Rafeño RAF, Veleño VEL y Nuevo Buchón Valenciano NVP), grupo 2, de palomas de vuelo funcional o acrobático (“Nas de Xot” BNX, “Coll Pelat” SCP, Figureta SFI, Refilador SRE, “Vol Català” SVC y Chorrera SXO); grupo 3, razas baleáricas (Borino BBO, “Colom d’Escampadissa” BCE, Mallorquina BMA, “Pinta Balear” BPB) de trabajo y producción (excluyendo el “Gavatxut” BGA, raza balear que entra dentro del grupo de buchones, al que pertenece funcionalmente); y grupo 4, puramente de morfología (“Colom d’Ull” SCU, “Flamenquilla” SFL y “Ull de Maduixa” SUM). En el resto de los planos (figuras no mostradas) las nubes de las OTUs se distribuían uniformemente en el espacio formado por los distintos ejes.

Del ACrr (Figura 2) se desprende que muchas variables están fuertemente correlacionadas (aparecen en pequeños ángulos, como las variables AA, AB y V, o R y W), y que son 9 las de más poder discriminante: F, G, I, K, M, U, T, Y y AC: grosor y longitud del pico, desarrollo de las carúnculas nasales y oculares, longitud del cuello, tamaño y colgado de buche, longitud relativa de la cola y posición de las alas en reposo respecto de la cola. Un nuevo ACo con únicamente estas variables refleja un mejor ajuste de los grupos raciales (Figura 3), siendo únicamente el “Gavatxut” (BGA) el que está dentro de la

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DISCUSIÓN

MC H

L 4

C OL

BGA

BPB

3

RAF

SXO

GAD

GRA 2 BPAB QUE BNX ALT

Componente 2

1 G

-6,4

-4,8

-3,2

-1,6

BC E

C J I A

D

1,6

H

VNP 3,2

SC U

-1

K

4,8 SC P

BMA

SRE SFL

BBO

F MOR

-2

MRR

LAU

SFI

-3E C AN

JIE

SUM

SVC -4 VEL

2163

MAT -5

En el plano 1-2 a partir únicamente de 9 variables –grosor y longitud del pico, desarrollo de las carúnculas nasales y oculares, longitud del cuello, tamaño y colgado de buche, longitud relativa de la cola y posición de las alas en reposo respecto de la cola–, los cuatro grupos de OTUs aparecen diferenciados con claridad, correspondiendo a los grupos establecidos a priori, con un único solapamiento para el “Gavatxut”, raza que, aunque Balear, tiene una clara aptitud como buchón.

Componente 1

Figura 2. Análisis de Correspondencia y biplot utilizando la matriz de 29 variables cualitativas. Abreviaturas en el texto.

SUM SC U SFL

0,32

0,24 RAF 0,16

Coordenada 2

BPB

0,08

0

BBO BMA

BNX BC E

BGA

C AN

PAB

GRA

MOR

LAU ALT GAD

-0,08

MAT

SC P SVC SXO

JIE MC H SRE

SFI

QUE

-0,16

VEL C OL

-0,24

-0,4

-0,32

-0,24

-0,16

-0,08

MRR

VNP

0

0,08

0,16

0,24

C oordenada 1

Figura 3. Análisis de coordenadas utilizando la matriz de 9 variables cualitativas. Proyección de las OTUs en el espacio de las coordenadas 1 y 2. Abreviaturas en el texto.

nube de los buchones. Es el carácter referido a la posición de las alas en reposo el que define mejor el grupo de vuelo funcional o acrobático (alas por encima de la cola, en reposo); el de la longitud relativa de la cola el que define mejor el grupo baleárico (cola de longitud media a larga); el del desarrollo de las carúnculas oculares el que define mejor el grupo de morfología (desarrollo notable de la carúnculas oculares); el grupo de buchones, finalmente, viene especialmente definido por los detalles de la longitud del cuello, el colgado del buche y el desarrollo de las carúnculas nasales.

A partir de esos nueve caracteres, pues, es posible diferenciar: el grupo 1, de buchones (Alteño, Canario, Colillano, Gaditano, Granadino, Jiennense, Laudino Sevillano, Marteño, Marchenero, Moroncelo, Morrillero Alicantino, Quebrado Murciano, Rafeño, Veleño y Nuevo Buchón Valenciano), caracterizados por una funcionalidad muy especial; el grupo 2, de palomas de vuelo funcional o acrobático (“Nas de Xot”, “Coll Pelat”, Figureta, Refilador, “Vol Català” y Chorrera); el grupo 3, razas baleáricas (Borino, “Colom d’Escampadissa”, Mallorquina, “Pinta Balear”) de trabajo y producción (excluyendo el “Gavatxut”, raza balear que entra dentro del grupo de buchones, al que pertenece funcionalmente); y un grupo 4, puramente de morfología (“Colom d’Ull”, “Flamenquilla” y “Ull de Maduixa”). Dentro del grupo de los buchones, el Rafeño se muestra como la raza más distante del conjunto.

Igualmente se destaca que el “Nas de Xot”, aunque actualmente propio de la isla de Mallorca (Baleares), proviene de un grupo de antiguas variedades de palomas mensajeras que se volaban en la región levantina española (4). El “Coll Pelat”, a pesar de su conspicua garlanda –carácter único en las razas estudiadas en este trabajo–, no se aparta del grupo de vuelo.

No existe una guía clara que determine qué nivel de semejanza (o de diferencia) es suficiente para establecer los diferentes niveles en una clasificación (1), por lo que la agrupación basada en los 9 caracteres propuestos en este artículo evita

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considerable subjetividad. Debe entenderse, por otro lado, que los caracteres estudiados procedían mayoritariamente de los estándares raciales; y el estándar viene a describir el prototipo –el patrón de perfección racial–; el estándar, pues, en algunos casos, podría diferir considerablemente de la descripción real de la raza –el morfotipo–, por lo que basar una clasificación en unos pocos caracteres normalmente siempre reflejados en los estándares resulta mucho más aplicativo que el uso de un gran número de variables, algunas, además, fuertemente correlacionadas.

En conclusión, partiendo únicamente de 9 características morfológicas cualitativas informativas –grosor y longitud del pico, desarrollo de las carúnculas nasales y oculares, longitud del cuello, tamaño y colgado de buche, longitud relativa de la cola y posición de las alas en reposo respecto de la cola–, las dos primeras dimensiones del análisis de correspondencia permiten una buena separación en cuatro grandes grupos raciales de las 29 razas estudiadas, según su aptitud, u origen, en el caso de las baleáricas.

REFERENCIAS

1.

López EJ, Pérez G. Métodos de análisis en la Reconstrucción Filogenética. Bol. S.E.A. 1999; 26: 45-56.

5.

Gower. A general coefficient of similarity and some of its properties. Biometrics 1971; 27(4):857–871.

2.

Levy WM. Encyclopedia of Pigeon Breeds.

South Carolina: Sumter SC. Sumter: Levi Publishing Co; 1965.

6.

3.

Mackrott H. Palomas de Raza. Barcelona: Omega; 1997.

4.

Schille HJ. Guía de las Palomas de Raza.

Cataluña, Valls: Arte Avícola; 2005.

Hammer Ø, Harper DAT, Ryan PD. PAST. Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis v. 1.94b.

Palaeontologia Electrónica [en línea] 2001; 4(1). [acceso 21 de diciembre de 2009]; URL disponible en: http://palaeoelectronica.org/2001_1/past/ issue1_01.html.

Rev.MVZ Córdoba 15(3):2165-2174, 2010.

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ORIGINAL

Evaluación de la colonización de micorrizas arbusculares en pasto Bothriochloa pertusa (L) A. Camus Colonization of arbuscular mycorrhizae in Bothriochloa pertusa (L) A. Camus pasture Alexander Pérez C, 1 * Ph.D, Melba Vertel M, 2 M.Sc. Universidad de Sucre, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Campus universitario Puerta Roja, Sincelejo, Colombia. 2 Universidad de Sucre, Facultad de Educación y Ciencias. *Correspondencia: alexander.perez@unisucre.edu.co 1

Recibido: Noviembre 28 de 2009; Aceptado: Julio 18 de 2010.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la colonización in situ de micorrizas arbusculares en raíces del pasto colosuana en función de factores físico-químicos de suelo, en fincas ganaderas de cuatro zonas agroecológicas, de la subregión fisiográfica de Sabanas. Materiales y métodos. La determinación del porcentaje de colonización fue realizada en raíces coloreadas. Para establecer diferencias entre porcentajes promedios de colonización entre zonas, se realizó un diseño completamente al azar. Para determinar diferencias entre zonas se utilizó la prueba de Tukey al 5% de significancia. Las variables físico-químicas y los porcentajes de colonización en las fincas muestreadas fueron caracterizados por la técnica de análisis en componentes principales y clasificadas las fincas por análisis de Cluster aglomerativo. Resultados. El ANOVA mostró diferencias significativas (p-value=0.02359) entre los porcentajes de colonización promedio entre zonas. La prueba de Tukey señaló que las zonas 2 y 4 presentaron los menores porcentajes de colonización y fueron estadísticamente iguales, mientras que las zonas 1 y 3 tuvieron los máximos valores de colonización. El análisis en componentes principales demostró altos porcentajes de colonización de HMA en las fincas que presentaron suelos con contenidos moderados de Fosforo y Nitrógeno; bajos contenidos de Sodio y pH moderadamente alcalinos. El Clúster aglomerativo mostró 5 grupos de fincas relacionadas con porcentajes de colonización en forma descendente cuando estuvo presente textura arcillosa a franco arenosa. Conclusión. Este es el primer trabajo a nivel regional y nacional sobre el efecto de parámetros físicos-químicos del suelo sobre la colonización de micorrizas arbusculares en raíces del pasto colosuana.

Palabras clave: Micorrizas, colonización, pasto, análisis cluster.

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ABSTRACT Objective. Evaluate in situ the colonization of arbuscular micorrhizae, in grass roots colosuana in function of the physical and chemical characteristics of the soil, in cattle farms of four agroecological areas of the savannah physiographical sub region. Materials and methods.

The determination of the colonization percentage was done in colored roots. In order to establish the differences between average colonization percentages between areas, a completely random design was used. To determine the differences between areas, the Tukey test was used to the nearest 5%. The physical and chemical variables and colonization percentages in the tested farms were characterized through the main component analysis technique, and the farms were classified through agglomerative cluster analysis. Results.

The ANOVA showed significant differences (p-value=0.02359) between the colonization average percentages between areas. The Tukey test revealed that areas 2 and 4 showed the least colonization percentages and are statistically the same, while areas 1 and 3 had the maximum colonization values. The main component analysis showed high colonization percentages of HMA in farms with moderate phosphorous and Nitrogen contents; low sodium and moderately alkaline pH. The agglomerative cluster showed 5 groups of farms related to decreasing colonization percentages in the presence of clay to sandy-loam structure.

Conclusion. This is the first regional and national level on the effect of physical-chemical parameters of soil on arbuscular mycorrhizal colonization in Colosuana grass roots.

Key Words: Micorrhizae, colonization, grass, analysis Cluster.

INTRODUCCIÓN En los últimos años ha despertado interés las interacciones entre las plantas y los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA). Los HMA son microorganismos del suelo que forman simbiosis con mas del 95% de las plantas terrestres (1,2), formando arbúsculos, vesículas (en algunas especies) e hifas, dentro de las células corticales de las plantas que colonizan (1). Tanto los hongos como las plantas tienen distribución universal, presentándose de esta manera ecotipos adaptados a condiciones diversas y extremas. Es de señalar que las plantas y las micorrizas tienen un origen común (2).

Las HMA están ampliamente distribuidas en condiciones naturales, se encuentran en todos los continentes, excepto en la Antártida; se dan en todos los suelos, incluyendo los de minas abandonadas, suelos agrícolas, suelos de pantanos y en hábitat acuáticos (3,4).

Los hongos formadores de micorrizas arbusculares son uno de los componentes de los ecosistemas naturales, representan entre el 5 a 50% de la biomasa de los microbios del suelo y son considerados como

una comunidad biológica diversa y activa esencial para incrementar la sostenibilidad de los agroecosistemas. Las asociaciones con hongos micorrízicos representan las simbiosis de mayor relevancia en los sistemas agroecológicos. Los suelos poseen naturalmente una diversidad de especies de micorrizas, que pueden colonizar las raíces de la mayoría de las plantas cultivadas, independientemente de las condiciones ambientales, mejorando así el suministro de nutrientes, crecimiento y producción de las plantas hospederas especialmente en condiciones de nutrientes deficientes (5, 6).

Se estima que el pasto colosuana o kikuyina (Bothriochloa pertusa) (L). A. Camus, alcanza un total de 274.005 ha, distribuidas en 19 municipios del departamento de Sucre.

El municipio de Corozal cuenta con la mayor área sembrada con esta especie de pasto en la región (32.223 ha). En el departamento de Sucre, la ganadería de doble propósito representa un 84.9% de su territorio (7).

Una de las limitantes en la productividad animal es la escasez o falta total de forraje durante la época seca debido a la estacionalidad de las lluvias. Esta escasez

Pérez - Evaluación de la colonización de micorrizas

es afectada cuando los suelos presentan diferentes grados de compactación, problemas erosivos, bajos niveles de fertilidad, la falta de abonamientos y el pastoreo extensivo, lo que genera la degradación de las praderas.

Existen escasas investigaciones a nivel mundial y nacional que demuestren integración entre los parámetros físicos, químicos y biológicos con relación a la calidad del ecosistema suelo. Las informaciones que existen son pocos conclusivas y de difícil interpretación, dada la gran complejidad del sistema en estudio en donde se evalúan varias características, generando un número mayor de datos, lo que proporcionalmente dificulta su interpretación. Una estrategia para evaluar el conjunto de indicadores biológicos asociados a los ecosistemas comúnmente sugeridos es el análisis a través de herramientas de bioestadística (análisis multivariados) que permita la conversión e interpretación de un conjunto de variables con una alta correspondencia entre ciertos indicadores y un componente, resultando en un alto peso absoluto del indicador en un componente determinado (8).

Se ha evidenciado la importancia que tiene la colonización de los HMA con las raíces de las plantas, en relación con el mejoramiento de las condiciones físicoquímicas del suelo; la estimulación del crecimiento e incremento de la calidad nutricional de las especies vegetales, convirtiéndolas en más tolerantes a condiciones adversas tanto abióticas como bióticas (9). Sin embargo existe escasa información in situ, del efecto de estos hongos con las plantas; debido a que in vivo es difícil de evaluar la relación entre las variables ambientales y la colonización de micorrizas arbusculares sobre las plantas.

A partir de la anterior situación, surge la necesidad de evaluar in situ la colonización de raíces con hongos formadores de micorrizas arbusculares en relación a parámetros físicos y químicos del suelo. Estos hechos justifican la profundización de estudios conducentes a determinar el efecto de esos componentes biológicos sobre

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agroecosistemas de pasturas. El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto de la colonización in situ de micorrizas arbusculares nativas, asociadas a raíces de la especie de pasto Bothriochloa pertusa (L) A. Camus, en función de parámetros físicoquímicos de suelo de fincas ganaderas de cuatro zonas agroecológicas, de la subregión fisiográfica de Sabanas.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. Se realizó en el municipio de Corozal-Sucre (Colombia), ubicado en la región fisiográfica de Sabanas que constituye el declive general de los montes de María hacia la depresión del bajo Cauca y San Jorge; a los 8º 55" y 9º 19" de latitud Norte, y entre 75º 25" y 74º 42" al Este del meridiano de Greenwich; con temperatura promedio anual de 28ºC, pluviosidad de 1105 mm anuales y humedad relativa del 80%, a una altura entre 174 a 200 msnm.

Selección de fincas. Se tomaron 48 fincas ganaderas del municipio de Corozal (Sucre) con pastura predominante de Bothriochloa pertusa (L) A. distribuidas en cuatro zonas agrologicas según la clasificación de tierras por su capacidad de uso y manejo (10, 11): zona 1 (III sc – IV hs), zona 2 (VIIsc – IV esc), zona 3 (VI sc – VI esc) y zona 4 (VII sc – VII esc).

Toma de muestras. Un tubo plastico de PVC de 3.8 cm de diámetro y 25 cm de longitud, fue usado para tomar las muestras a una profundidad entre 0-20 cm, introduciendo, rotando y extrayendo el cilindro con la muestra (suelo y raíces). En cada finca se tomaron entre 15-20 muestras, estas se homogenizaron por finca para conformar una con un peso de 2000 gramos.

Dos submuestras (1000 g cada una) fueron empleadas para determinar el porcentaje de colonización en raíces con hongos formadores de micorrizas arbusculares, y una submuestra de 1000 g para las determinación de parámetros físico-químicas del suelo (Sodio “Na”, Fósforo “P”, Nitrógeno “N”, pH, Capacidad de Intercambio Catiónico “CIC”, Calcio “Ca”, Magnesio “Mg”, Aluminio “Al” y Potasio “K”, Materia orgánica “MO”).

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Las muestras etiquetadas en bolsas plásticas se llevaron al laboratorio y se conservaron a 4°C hasta su posterior análisis.

Determinación de HMA. El porcentaje de colonización de HMA en raíces de Bothriochloa pertusa (L) A. fue determinado mediante técnica de coloración de raíces.

Las raíces coloreadas fueron colocadas sobre láminas cubiertas con laminillas, para su observación con objetivo 40X. Para estimar el porcentaje de colonización en raíces se contaron 100 campos ordenadamente por muestra. En cada muestra se observó la presencia de campos negativos (sin presencia de estructuras colonizantes) y positivos (con presencia de estructuras colonizantes). En los campos positivos se tuvo en cuenta el tipo de estructuras (arbusculos, vesículas, hifas y esporas) presente dentro de cada raíz (12).

Análisis estadístico. Se utilizó un diseño completamente al azar empleando las zonas agroecológicas como tratamientos, y repeticiones diferentes por tratamiento (fincas ganaderas muestreadas). Los datos obtenidos para todas las variables cuantificadas se sometieron a la prueba de Shapiro-Wilk para verificar su normalidad y el test de Bartlett para verificar la homogeneidad de varianzas. Se aplicó análisis de varianza (ANOVA) y prueba de

comparación de tratamientos Tukey al nivel del 5% de significancia para verificar el efecto de los tratamientos sobre el porcentaje de colonización en raíces de HMA (13). No se obtuvo normalidad de las variables Nitrógeno, Fósforo, Sodio, Potasio, se realizó análisis de varianza (ANOVA) por el método no paramétrico de Kruskal-Wallis y separación de medias por rangos por el procedimiento de Tukey.

Las relaciones estadísticas entre variables físico-químicas y colonización en raíces de HMA sobre las fincas muestreadas fueron determinadas mediante el método multivariado análisis en componentes principales (ACP) (14). La clasificación de las fincas muestreadas teniendo en cuenta la información recolectada en el ACP fue realizada con el análisis de cluster aglomerativo de distancias euclidianas ligado al método de Ward (15,16). Todos los datos numéricos fueron analizados en el programa estadístico R (17).

RESULTADOS Teniendo en cuenta los resultados del análisis descriptivo (media ± desviación estándar) y ANAVA para parámetros físicos-químicos en fincas ganaderas (Tabla 1), muestran valores de pH que oscilan de fuertemente

Tabla 1. Estadística descriptiva numérica (Media ± desviación estándar), análisis de varianza y prueba de Tukey de parámetros químicos de suelos ganaderos por zonas agroecológicas.

Media ± desviación estándar de las variables evaluadas para cada zona agroecológica. *Diferencias significativas a p<0.05, NS: No hay diferencias significativas al 5% Letras iguales no hay diferencias significativas entre zonas para cada variable

Pérez - Evaluación de la colonización de micorrizas

ácidos a fuertemente alcalinos, contenidos medios a bajos de Fósforo, Materia Orgánica, Nitrógeno y Sodio, y valores altos a medios de Calcio, Magnesio y Potasio.

Los resultados de los análisis de varianza (Tabla 1) para parámetros químicos del suelo en zonas agroecológicas, señalan que hubo diferencias significativas entre los valores de pH, Fosforo y Sodio del suelo en las diferentes zonas agroecológicas analizadas con relación a los otros parámetros químicos evaluados. No se obtuvo normalidad de las variables Nitrógeno, Fósforo, Sodio, Potasio, se realizó análisis de varianza (ANOVA) por el método no paramétrico de Kruskal-Wallis y separación de medias por rangos por el procedimiento de Tukey.

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La figura 1b, muestra la variabilidad de cada una de las zonas para el porcentaje de colonización. Se cumplieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas para el porcentaje de colonización (pvalue=0.178 para la prueba de Shapiro-Wilk; p-value = 0.679 para la prueba de Bartlett).

El ANOVA para porcentajes de colonización de micorrizas arbusculares en raíces de colosoana, señala diferencias altamente significativas (p-value = 0.02359) entre zonas agroecológicas. Los resultados de la prueba de Tukey, muestra que las zonas 2 y 4 son estadísticamente similares con valores promedios menores para porcentaje de colonización; mientras que, las zonas 1 y 3 presentan los mayores porcentajes de colonización (Figura 1a).

En la figura 2b, se observa que los hongos formadores de micorrizas arbusculares presentaron diferentes patrones de

Figura 1. Resultados de la prueba de Tukey (a) y gráfico de boxplot (b) de la distribución de zonas para % promedio de colonización HMA.

Figura 2. Modelo de colonización HMA en raíces de Bothriochloa pertusa (L) A. Camus, (a): A-vesícula; B-micelio; C y DEsporas. (b): por zonas agroecológicas.

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colonización sobre las raíces del pasto colosuana. Las principales estructuras de colonización encontradas correspondieron a: esporas, micelios, vesículas y arbusculos. La figura muestra una mayor presencia de micelio y vesículas en la zona agroecológica 3; en las zonas 1 y 2 se observa mayor cantidad de micelio y en la zona 4 presencia de vesícula. En todas las zonas agroecológicas analizadas fue encontrada una menor cantidad de estructuras colonizantes correspondientes a esporas y arbusculos.

la capacidad de intercambio catiónico (Calcio, Magnesio y Potasio) con el porcentaje de colonización (ë1=3.48, explica el 35% de la variabilidad total de los datos).

Las fincas 9, 10, 11 y 12 de la zona 4 presentan valores alto de Magnesio (20.5 meq/100g), Calcio (32.2 meq/100g), Potasio (1.3 meq/100g) y se registran los menores porcentajes de colonización.

Al relacionar parámetros físico-químicos en las fincas ganaderas, mediante el análisis de componentes principales (Figura 3), la primera componente (eje “X”), contrapone

Figura 4. Análisis de clúster aglomerativo entre porcentaje de colonización y tipo de estructuras de suelos por fincas ganaderas. 1-5: grupos de fincas relacionadas a parámetros físicoquímicos.

La segunda componente (eje “Y”) está relacionada a Fósforo, pH, Nitrógeno y Sodio (ë2=2.5, explica el 25% de la variabilidad total de los datos), por ejemplo las fincas de las zonas 1 y 3, presentan altos porcentajes de colonización cuando se dan contenidos moderados de Fosforo (18.94 ppm), Nitrógeno (0.03%), valores muy bajos de Sodio (1.7 meq/100g) y pH medianamente alcalino (7.8).

Figura 3. Análisis en componentes principales para parámetros físico-químicos y colonización sobre las diferentes fincas en las zonas de estudio.1-5: grupos de fincas relacionadas a parámetros físico-químicos.

Al analizar los porcentajes de colonización con tipos de estructuras de los suelos mediante análisis de cluster aglomerativo (Figura 4) teniendo en cuenta el análisis en componentes principales para parámetros físico-químicos (Figura 3), mostró 5 grupos de fincas relacionadas a porcentajes de colonización en forma descendente. En el grupo 1 están presentes fincas con estructura arcillosa, relacionadas con bajos porcentajes de colonización y altos contenidos de Magnesio, Calcio y Potasio; el grupo 2 está constituido por fincas con

Pérez - Evaluación de la colonización de micorrizas

estructura franco-arenosa, con altos porcentaje de colonización, altos valores de capacidad de intercambio catiónico (CIC) y altos contenidos de materia orgánica. En el grupo 3, se muestran fincas con estructuras arenosa, arcillosa, franco arenosa, franco arcillosa a franco arcillo-arenosa con valores medios en porcentaje de colonización, cuando además están presentes valores moderados de Magnesio, Calcio, Potasio, materia orgánica, CIC, pH, Nitrógeno, Fosforo y Sodio; en el grupo 4, se observan fincas con estructuras franco arcillosa a franco areno-arcilloso, con altos porcentajes de colonización en presencia de bajos contenidos de Sodio, Nitrógeno y pH. Finalmente en el grupo 5, se encontraron fincas con altos porcentajes de colonización en presencia de bajos contenidos de Magnesio, Calcio y Potasio, cuando están presentes estructuras de los suelos de franco arenosa y franco arcillosa.

DISCUSIÓN En los suelos de las fincas ganaderas objeto del presente estudio en los últimos no se ha realizado ninguna práctica agrícola para mejorar las propiedades físico-químicas del suelo, principalmente su aireación, ni abonamiento para suplir la extracción de nutrientes que la especie de pasto ha venido haciendo a través del tiempo. A pesar de esta serie de limitaciones edafológicas y de manejo, el pasto colosuana, presenta algunas características deseables para el empresario ganadero como son: rápida recuperación después del pastoreo, especie altamente estolonífera, alta producción de semillas, resistencia al pisoteo y buena gustosidad para el ganado.

Estudios relacionados a la influencia de parámetros físicos-químicos sobre el establecimiento (colonización) in situ en raíces de colosuana con HMA, son escasos, lo que dificulta hacer una comparación con los resultados obtenidos en el presente trabajo. Existe evidencias de alta colonización de HMA en otras especies de pasturas como Andropogon gerardi, cuando en los suelos se presentan niveles bajos a moderados de Fosforo, Nitrógeno, Materia

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Orgánica y valores de pH medianamente alcalinos (18).

El establecimiento (colonización) de los HMA bajo condiciones de campo están determinado por diversos condiciones tales como: factores físico-químicas del suelo (pH, contenido de fósforo, temperatura, aireación, textura y contenido de materia orgánica), condiciones climáticas (intensidad y duración de la luz, temperaturas, humedad, épocas de lluvias y épocas secas) y por las prácticas agronómicas (preparación del terreno, aplicación de pesticidas y prácticas culturales). En los suelos el efecto del pH es difícil de evaluar, debido a que las propiedades químicas cambian con el pH, al igual que la solubilidad y disponibilidad de otros elementos hacia las raíces de las plantas en el suelo, incluyendo hierro, manganeso, cobre, zinc y cantidades tóxicas de aluminio.

Los hongos formadores de micorrizas arbusculares tienen amplia capacidad de adaptación, se han encontrado en rangos de pH desde 2.7 a 9.2. Sin, embargo en suelos su formación se requiere pH de 4.5 a 5.5 (19-21).

Los efectos del fosforo en el suelo pueden estar asociados a otros factores como: tipo de suelo, pH y niveles de nitrógeno. Los altos y bajos niveles de fósforo, así como la fertilización nitrogenada reducen el porcentaje de colonización de las micorrizas, en tanto que niveles moderados de P, incrementan los niveles de nitrógeno y la colonización de estos microorganismos. La forma del nitrógeno inorgánico en el suelo influye tanto en el porcentaje de colonización, la longitud de las raíces y la presencia estructuras colonizantes como los arbusculos y vesículas (23).

La absorción de fósforo en las especies de pastos, Digitaria ciliaris (especie pobremente colonizada por HMA), Ixeris denticulate (especie moderadamente colonizada por HMA) y Kummerowia striata (altamente colonizada por HMA), sembradas en asocios y en forma individual fueron evaluadas en China con niveles limitante de fósforo. Los resultados demostraron que las pasturas altamente colonizadas con micorrizas

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muestran un impacto positivo sobre la coexistencia de las otras pastoras asociadas con esta en relación a patrones de colonización y la eficiencia en la absorción de fósforo (24). Estudios comparativos de diferentes fuentes de fósforo y la colonización de micorrizas arbusculares en raíces de trigo forrajero, demostraron que la fertilización con roca fosfórica, inducen incrementos de las micorrizas en el suelo y un alto porcentaje de colonización de esta micorrizas nativas con el trigo (25).

Diferentes investigaciones demuestran que las micorrizas arbusculares aumentan la eficiencia en la absorción de fósforo mineral (26, 27), a partir del fósforo solubilizado por otros microorganismos que actúan sinérgicamente (28,29).

Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) se caracterizan por presentar un crecimiento intra e intercelular en la corteza de la raíz y por formar dos tipos de estructuras, arbúsculos y vesículas. Los arbúsculos son hifas que se dividen dicotómicamente, son invaginados por la membrana plasmática de las células corticales y presentan periodos de vida cortos, mientras que las vesículas son estructuras de almacenamiento que se forman en la parte terminal de las hifas. En raíces del pasto colosuana fueron encontradas diversas estructuras colonizantes con mayor predominio de vesículas y menor presencia de arbusculos en la condiciones del experimento. Diferentes patrones de colonización de micorrizas arbusculares como micelios, cordones hifas, vesícula y arbusculos de micorrizas arbusculares fueron observadas en células corticales de raíces en la especie de pasto Bothriochloa pertusa, y arboles leguminosas de Acacia farnesiana, Breynia fruticosa, Cyanotis cristata, Vitex negundo, Sida acuta, Polyalthia cerasoides, Boea hygrometrica (30).

La relación HMA-planta no es considerada específica, debido a que cualquier especie de HMA puede colonizar o formar simbiosis con cualquier planta, ya que se encuentran en todo tipo de suelos prácticamente. No obstante, bajo ciertas condiciones edafoclimáticas, algunos hongos pueden beneficiar mejor o en mayor

grado un determinado hospedero.

El pH, la humedad del suelo y la disponibilidad de nutrientes influyen no solo en la colonización sino también en el número de esporas producidas por los hongos formadores de micorrizas arbusculares. Los HMA son encontrados en todo tipo de suelos y pueden colonizar cualquier planta que establezca simbiosis con ellos, sin embargo, las condiciones físico-químicas del suelo podrían estar generando cierto tipo de especificidad con respecto a las plantas hospederas, según las respuestas que muestran las plantas a determinadas especies de HMA. La mayoría de los estudios existentes, relacionan la potencialidad y la eficiencia de la inoculación de HMA en diferentes cultivos en in vitro y en casa de vegetación invernadero. Pocos estudios han evidenciado el efecto que tienen las condiciones ambientales sobre el establecimiento de las HMA en diferentes ecosistemas. Este estudio se convierte en uno de los primeros a nivel del Caribe Colombiano que muestra como ciertos parámetros físico-químicos (pH, Fosforo, Nitrógeno y sodio) de suelos de fincas ganaderos en el departamento de Sucre tienen un efecto directo sobre el establecimiento de HMA sobre raíces de colosuana. Es importante seguir evaluando in situ, los efectos de condiciones ambientalessobre la colonización de estos microorganismos en diferentes nichos ecológicos con pasturas.

Las micorrizas son un recurso biológico cuyo manejo y conservación, además de los efectos sobre la productividad vegetal, genera beneficios ambientales al mejorar las condiciones físicoquímicas y biológicas del suelo. Los beneficios desde el punto de vista biológico, se derivan de su interacción con los diversos grupos de macro y microorganismos de la rizósfera, tales como aquellos implicados en el ciclaje de nutrientes (bacterias fijadoras de nitrógeno y los microorganismos solubilizadores de fosfato). Así mismo, dichos hongos interactúan con microorganismos implicados en el control biológico de patógenos presentes en el suelo, demostrando que existen diferentes tipos de interacción con las micorrizas arbusculares.

Pérez - Evaluación de la colonización de micorrizas

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Rev.MVZ Córdoba 15(3):2175-2184, 2010.

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ORIGINAL

Efecto ixodicida de los extractos etanólicos de algunas plantas sobre garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus The Acaricide effect of Ethanolic Extracts of Some Plants on Tics Rhipicephalus (Boophilus) microplus Ángela Rodríguez S, 1* MVZ, Carlos Rodríguez M, 1 Esp, Anastasia Cruz C, 2 M.Sc. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Grupo de Investigación en Bioquímica y Nutrición Animal - GIBNA. Tunja, Colombia.

2 Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias, G r u p o d e I n v e s t i g a c i ó n e n C i e n c i a s Ve t e r i n a r i a s - G I C I V E T. Tu n j a , C o l o m b i a . * Correspondencia: angelarsmvz@yahoo.es 1

Recibido: Diciembre 1 de 2009; Agosto 5 de 2010

RESUMEN Objetivo. Evaluar in vitro, el efecto ixodicida del extracto etanólico de cinco plantas; Brugmasia arborea, Sambucus nigra, Nicotiana tabacum, Bidens pilosa y Ambrosia cumanenses sobre garrapatas adultas de la especie Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Materiales y métodos. El extracto de cada planta fue obtenido mediante la técnica de lixiviación. Para las pruebas, se utilizaron garrapatas adultas de dos tamaños (pequeñas y medianas), que fueron expuestas a los extractos de cada planta, utilizando la técnica de inmersión de garrapatas adultas. A las 24 h de exposición, se realizó la lectura de mortalidad, donde se tomó como mínimo eficaz una mortalidad del 60%. Las pruebas iniciales se realizaron con extractos puros y cuando éstos mostraban eficacia se procedía a realizar diluciones crecientes, hasta encontrar la concentración mínima eficaz. Estas pruebas fueron realizadas en clima frio y cálido. Resultados. El extracto de N. tabacum, mostró efectividad en garrapata pequeña, hasta las diluciones 0.5:10 y 1:10 en clima frio y cálido, respectivamente y con 2.5:10 y 5:10 sobre garrapata mediana en clima frio y cálido, respectivamente; B. arbórea, mostró eficacia sobre garrapata pequeña hasta la dilución 7.5:10 en ambos climas; S. nigra y B. pilosa solo fueron eficaces en clima cálido sobre garrapatas pequeñas empleando extracto puro. A. cumanenses no fue eficaz en ninguna de las pruebas. Conclusión. N. tabacum, mostró mayor eficacia y se observó que los mejores resultados se obtuvieron con las mayores concentraciones.

Palabras clave: Garrapatas, control, plantas, extractos.

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ABSTRACT Objective. Evaluate in vitro, the ixodicide effect of the ethanolic extract of five plants; Brugmasia arborea, Sambucus nigra, Nicotiana tabacum, Bidens pilosa and Ambrosia cumanenses on adult ticks of Rhipicephalus (Boophilus) microplus species. Materials and methods. The extract of each plant was obtained through leaching technique. Adult ticks of two different sizes (small and medium) were used in the tests, by being exposed to the extract of each plant using the immersion of adult tick technique. Twenty-four hours after exposure, the mortality rate reading was taken, where an efficient minimum mortality rate was defined to be 60%. The initial tests were conducted with pure extracts, and when these proved to be efficient, increasing dilutions were made, until the minimum efficient concentration was found. These tests were done in both cold and warm areas. Results.

The N. tabacum extract showed effectiveness in small tics, with dilutions of 0.5:10 and 1:10 in both cool and warm areas, accordingly, and 2.5:10 and 5:10 on medium sized ticks in cool and warm areas respectively; B. arborea, showed efficiency on small tick up to a 7.5:10 dilution in both climates; S. nigra and B. pilosa were only efficient in warm areas on small ticks using pure extracts. A. cumanenses was not efficient in any of the tests.

Key Words: Ticks, control, plants, extracts.

INTRODUCCIÓN La garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus es un ectoparásito hematófago que se encuentra con frecuencia en bovinos, principalmente en las regiones tropicales y subtropicales y está ampliamente distribuida en Colombia (1). Dentro de los efectos adversos producidos, se destaca la transmisión de microorganismos de los cuales es vector, como Babesia spp y Anaplasma spp; así mismo, induce anemia, daño de la piel y estrés, esto último, conduciendo a anorexia, disminución de peso y pérdidas económicas en los sistemas de producción animal (1 - 3).

A pesar de que en el ámbito mundial se han utilizado diferentes estrategias para controlar estos ectoparásitos, a través del manejo integrado con control inmunológico por medio de vacunas, hongos, etc., el método más empleado incluye el tratamiento con compuestos químicos como piretroides, organofosforados, carbamatos, fenilpirazol, fipronil y lactonas macrocíclicas. Sin embargo, el uso indiscriminado de estos fármacos ha favorecido su residualidad en diferentes componentes del ecosistema y la selección de poblaciones de garrapatas resistentes, hasta hacer ineficaz su uso (4, 5).

En respuesta a esta problemática y buscando disminuir los costos que implica la creación de nuevas moléculas farmacológicamente activas, se ha despertado el interés por investigar la presencia de principios farmacológicos en aquellas plantas, que por tradición popular, son reconocidas en estudios de etnobotánica como antiparasitarias (6,7).

De acuerdo con las investigaciones realizadas sobre el efecto insecticida de los extractos de plantas, se reporta la existencia de algunas de estas en el territorio de Colombia, tal es el caso de Azadirachta indica (Meliaceae), reportada contra garrapatas (8), Mammea americana (Clusiaceae), con acción insecticida sobre mosquitos (9), Bidens pilosa, con acción insecticida sobre el gorgojo de maíz (10), B. arbórea, con efecto insecticida y repelente sobre insectos plaga (11, 12), y N. tabacum con acción sobre la mosca Haematobia irritans (13). De igual forma se reconocen otras especies promisorias con acción insecticida, como, Sambucus nigra, Ambrosia cumanenses, Ruta graveolens, Urtica dioca (14, 15).

Es así como, partiendo del uso que por

Rodríguez - Efecto ixodicida de los extractos etanólicos

tradición cultural se da a las plantas medicinales, consideradas insecticidas en ciertas zonas del departamento de Boyacá, los grupos de investigación en Bioquímica y Nutrición Animal -GIBNA y en Ciencias Veterinarias -GICIVET, pertenecientes al programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (UPTC), desarrollaron este estudio, con el fin de evaluar el efecto insecticida in vitro de los extractos etanólicos de Bidens pilosa, Sambucus nigra, Brugmasia arbórea, Nicotiana tabacum y Ambrosia cumanenses contra formas adultas de garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. El estudio fue de tipo experimental in vitro y se desarrolló en tres fases. La primera consistió en la colecta de las plantas en los municipios de Tunja y Macanal, en el departamento de Boyacá, Colombia, así como la elaboración de los extractos en el Laboratorio de Control Biológico de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la UPTC, sede Tunja. La segunda fase comprendió la colecta de garrapatas de bovinos parasitados naturalmente en el municipio de Gachantivá y mantenimiento de las mismas, en una cámara a una temperatura constante de 18oC y 75% de humedad relativa (HR), en el mismo laboratorio de la UPTC. La tercera fase, consistió en evaluar el efecto insecticida de cada extracto y de sus diluciones, sobre garrapatas adultas Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Colecta de plantas y elaboración de extractos. De acuerdo con los resultados obtenidos en un estudio previo desarrollado en Paipa, Boyacá, por los grupos GIBNA y GICIVET (16), se seleccionaron las cinco plantas mas reconocidas por los habitantes de la zona, como plantas con efectos insecticidas, estas fueron: B. pilosa, S. nigra, N. tabacum, B. arbórea y A. cumanenses.

En todos los casos, se tomaron únicamente las hojas, que fueron cortadas con tijeras hasta alcanzar una cantidad superior a 1000 g y se transportaron en bolsas de

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papel hasta el laboratorio, donde se dispersaron sobre papel limpio, separadas unas de otras. Durante el secado se mantuvieron a temperatura ambiente, en un lugar aireado, cubierto y seco. Completado el secado, las hojas se trituraron manualmente hasta obtener una cantidad de 200 g y a partir de ahí se obtuvo el extracto necesario para las pruebas.

El método empleado para la elaboración de los extractos de cada una de las platas analizadas fue “Lixiviación en frio” (17), utilizado como método de extracción de metabolítos de plantas medicinales, el cual permite extraer todos los compuestos liposolubles afines a solventes alcohólicos.

Para ello, se tomaron de cada planta, 200 g de hojas secas y trituradas, que se colocaron en una columna de extracción de PVC, empacando las dos terceras partes de su capacidad. Dicha columna de extracción, se conectó con mangueras, conformando un circuito cerrado, que permitió reutilizar el solvente. Posteriormente, se llenó la columna con una solución de etanol al 20% y se conectó a un motor para mantener constante el flujo del solvente, durante 24 horas.

Una vez finalizado el tiempo de extracción, se desconectó una de las mangueras y el contenido eluido fue recogido en un Erlenmeyer; consecutivamente, se adicionó más solvente, repitiendo el proceso varias veces, hasta que el solvente recuperado saliera translúcido. El proceso culminó con la evaporación del solvente del respectivo extracto recogido, empleando un baño maría, lo que permitió, obtener un extracto bruto 100%, el cual, se conservó a 4°C (18). Los extractos obtenidos se evaluaron por observación directa para determinar características como, color, olor, consistencia y volumen obtenido. El extracto obtenido, sirvió para elaborar las diluciones empleadas en el estudio, en las cuales se utilizó agua destilada como solvente.

Finalmente y con el fin de corroborar la presencia de compuestos químicos, a cada uno de los extractos puros, se les realizó una cromatografía en capa fina (CCF) en láminas de sílica, usando cloroformo: etanol, en proporción 2:3, como solvente, lo cual permitió

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observar la presencia de los compuestos eluidos, por fluorescencia.

Colecta y mantenimiento de las garrapatas. Las garrapatas adultas de la especie Rhipicephalus (Boophilus) microplus, se colectaron de animales parasitados naturalmente, en el municipio de Gachantivá, departamento de Boyacá. Para tal propósito, se pasó suavemente la mano sobre el animal, una vez detectada la garrapata se procedió a girarla y tirarla suavemente en contrapelo hasta desprenderla (19). Posteriormente se colocaron en envases de vidrio y se llevaron al laboratorio de Control Biológico de la UPTC, donde fueron lavadas con una solución de hipoclorito de sodio al 2.5% para prevenir contaminación bacteriana y fúngica (20); se eliminaron aquellas que presentaban mutilaciones o malformaciones (5) y finalmente se procedió a su identificación como B. microplus utilizando las claves taxonómicas recopiladas por Ruedisueli y Manship (21).

Las garrapatas fueron mantenidas a una temperatura constante de 18oC y 75% de HR, por 24 h, tiempo que se tomó como, estabilización, por si se presentaba algún tipo de alteración o muerte. Cumplido este tiempo, las garrapatas se clasificaron según su tamaño, en pequeñas (80 mg) y medianas (120 mg), descartando las garrapatas repletas, ninfas y larvas. Una vez clasificadas, fueron divididas en grupos de diez y ubicadas en cajas de Petri colocadas sobre icopor a temperatura ambiente (19).

Con el propósito de determinar la influencia que tiene la temperatura sobre la eficacia de cada uno de los extractos y teniendo en cuenta que las poblaciones de garrapatas ya no habitan exclusivamente ambientes cálidos, el trabajo se realizó en dos climas diferentes, por un lado en la ciudad de Tunja (Boyacá), con una temperatura promedio de 12oC y otro en el municipio de Gachantivá (Boyacá), con una temperatura promedio de 18oC, temperaturas que fueron monitoreadas con un termómetro para tal fin.

Evaluación del efecto ixodicida de los extractos puros y las diluciones. Con el fin de evaluar cada uno de los extractos

puros, así como las diluciones obtenidas a partir de estos, se emplearon para cada caso, tres grupos con diez garrapatas cada uno, lo que constituyó, el grupo tratado y sus dos réplicas.

La exposición de las garrapatas (pequeñas y medianas) a los extractos, se hizo mediante, la prueba de inmersión de adultas (5, 19, 22). Para esto, en una caja de Petri se depositaron 5 ml del extracto a probar (puro o dilución), luego se colocaron allí las garrapatas (n=10), las cuales se sumergieron completamente con la ayuda de una aguja punta roma, para evitar daño en la cutícula, permaneciendo sumergidas durante 15 min; completado este tiempo, se eliminó la totalidad del extracto (22), dejando así, las garrapatas en un medio seco. Posteriormente las cajas se taparon con papel aluminio y se rotularon, indicando el nombre del extracto, la dilución y hora de exposición.

Inicialmente, se evaluó el efecto de cada extracto puro y posteriormente, se evaluaron las diluciones de cada uno. Las diluciones evaluadas no fueron necesariamente las mismas para todos los extractos, puesto que se aplicó el método de mínimas y máximas, empleado en farmacología, para hallar dosis efectivas de moléculas nuevas. Bajo este concepto, la concentración del extracto se aumentó o disminuyó, aproximadamente 50%, respecto a la anterior, de acuerdo con los resultados de mortalidad. En consecuencia, cuando la mortalidad fue efectiva, se preparó el extracto a una dilución mayor hasta encontrar la mínima eficaz. En el caso de encontrar una eficacia baja, se trabajó con preparaciones menos diluidas, hasta encontrar la dilución a la cual el extracto era eficaz.

De igual modo, y siguiendo la metodología descrita para la exposición de las garrapatas a los extractos, se trabajó con un grupo control positivo, en el que se empleó un insecticida piretroide a base de cipermetrina al 15%, preparado según las recomendaciones de la etiqueta (dilución 1:1000 en agua). Igualmente, se contó con un grupo control negativo, empleando agua destilada. Los grupos control, positivo y negativo, y sus respectivas réplicas, se

Rodríguez - Efecto ixodicida de los extractos etanólicos

mantuvieron bajo las mismas condiciones del ensayo.

La mortalidad de las garrapatas se evaluó a las 24 h post-aplicación del extracto, momento en el cual, se consideraban como garrapatas muertas, aquellas que luego de una exposición a una fuente de calor por 10 min; mostraron ausencia de movimientos en sus patas. Se tomó como valor mínimo de eficacia, una mortalidad del 60%, por lo cual valores inferiores fueron tomados como ineficacia (23).

Análisis estadístico. El experimento se desarrolló empleando un diseño completamente al azar. Los porcentajes de mortalidad fueron comparados entre grupos a través de un análisis de varianza y las diferencias estadísticas se determinaron mediante la prueba de comparación de medias de Tukey, con el uso del programa SPSS para Windows, versión 11.5.1 del 2002.

RESULTADOS El método de extracción por lixiviación empleado, permitió obtener un volumen final de extracto puro de 50 ml para N. tabacum y S. nigra, 40 ml para B. arbórea y 70 ml para B. pilosa y A. cumanenses. En cuanto a las características de consistencia y olor, todos los extractos fueron viscosos, con olor característico a la planta de origen, exceptuando a B. arbórea, que mostró un olor a caramelo.

A los extractos puros obtenidos de las cinco plantas, se les realizaron pruebas de CCF, que permitieron determinar la presencia de compuestos químicos, deduciendo así que el método de extracción permitió una adecuada extracción de compuestos.

Según lo planteado en este estudio el extracto de N. tabacum (Tabaco), mostró eficacia sobre garrapatas pequeñas en las pruebas realizadas en clima frio hasta la dilución 0.5:10, observándose diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) con las pruebas con extracto puro (Ext. Puro) y

2179

las diluciones 7.5:10, 5:10 y 2.5:10; evidenciándose para estas últimas diferencias estadísticamente no significativas (NS) (Tabla 1). En clima cálido, la eficacia sobre garrapata pequeña se observó hasta Tabla 1. Porcentaje de mortalidad de Rhipicephalus (Boophilus) microplus pequeñas, en clima frio, expuestas a extractos de plantas.

Medias con letras diferentes en la misma columna, diferencias estadísticamente significativas (p<0.05).

la dilución 1:10 y a pesar que la dilución 0.5:10 no fue eficaz, no existieron diferencias significativas (p>0.05) entre estas dos pruebas (Tabla 2).

En las pruebas realizadas con garrapatas medianas en clima frío, la eficacia se mantuvo hasta la dilución 2.5:10, mostrando diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) con las primeras diluciones (Tabla 3), mientras que en clima cálido, la eficacia del extracto se reportó hasta la dilución 5:10, observándose diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) en todas las pruebas (Tabla 4).

En las pruebas realizadas con el extracto de Tabla 2. Porcentaje de mortalidad de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, pequeñas en clima cálido, expuestas a extractos de plantas.

Medias con letras diferentes en la misma columna, diferencias estadísticamente significativas (p<0.05).

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B. arbórea (borrachero, floripondio), sobre garrapatas pequeñas, en clima frío la eficacia se observó hasta la dilución 7.5:10, siendo estadísticamente NS (p>0.05) con respecto al extracto puro (Tabla 1), de igual forma, en clima cálido, la eficacia se mantuvo hasta la dilución 7.5:10. No obstante, se observaron diferencias no significativas (p>0.05) con respecto a las pruebas con extracto puro (Tabla 2). Para el caso de las garrapatas medianas, tanto en clima frio como en clima cálido, no se alcanzó la eficacia estipulada en el estudio (mortalidad igual o superior al 60%) (Tabla 3 y 4).

observó eficacia (Tabla 1, 3 y 4).

Analizando el extracto de S. nigra (saúco),

Analizando los resultados alcanzados con el grupo control positivo, se corroboró la eficacia del producto utilizado y del método de aplicación, observándose que hubo mortalidad del 100% en la dilución indicada en la etiqueta (1:1000). Con el grupo control negativo, no se observaron muertes de las garrapatas.

Tabla 3. Porcentaje de mortalidad de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, medianas en clima frio, expuestas a extractos de plantas.

El comportamiento ixodicida del extracto de B. Pilosa (chipaca, amor seco), fue similar al reportado para S. nigra, observándose eficacia en la pruebas con garrapatas pequeñas tras la exposición al extracto puro en clima cálido (Tabla 2), existiendo diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) con respecto a las otras diluciones.

En cuanto al extracto de A. cumanenses.

(Altamisa), no se observó eficacia en ninguno de los bioensayos realizados (Tabla 1-4)

DISCUSIÓN

se observó eficacia solo con el uso del extracto puro en las pruebas realizadas con garrapatas pequeñas en clima cálido (Tabla 2), donde existieron diferencias estadísticamente significativas con respecto a las demás diluciones; en las pruebas con garrapatas pequeñas en clima frio y medianas en clima cálido y frio no se Tabla 4. Porcentaje de mortalidad de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, medianas en clima cálido, expuestas a extractos de plantas.

Medias con letras diferentes en la misma columna, diferencias estadísticamente significativas (p<0.05).

Analizando los resultados del extracto de N. tabacum, se encontró que con el uso de diluciones altas se alcanzan resultados efectivos. De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, se ratificó la acción del tabaco, reportada por varios autores (24, 25, 13), efecto que obedece a la presencia de la nicotina, un alcaloide natural utilizado por la planta como mecanismo de protección (26). La nicotina actúa mimetizando la acetilcolina sobre los receptores nicotínicos, generando una despolarización sostenida que lleva a parálisis excitatoria y finalmente la muerte del parásito (24-26). Actualmente, la industria farmacéutica comercializa insecticidas conocidos como neonicotinoides, que son copias sintéticas o derivadas de la estructura de la nicotina como son imidacloprid, thiacloprid, nitempiram, acetamiprid y thiamethoxam, entre otros (24), con esto se corrobora la acción insecticida hallada por otros investigadores y el uso dado a esta molécula.

Aunque la acción ixodicida de N. tabacum no se había valorado en garrapatas, una vez

Rodríguez - Efecto ixodicida de los extractos etanólicos

analizados los resultados del presente trabajo in vitro, se puede confirmar que es efectiva como ixodicida y que bajo las condiciones planteadas en la investigación, se podría pensar en su posible uso como ixodicida natural en las producciones bovinas, no sin antes realizar estudios de toxicidad y residualidad en los animales tratados.

B. arbórea, a pesar de la poca eficacia que mostró en este estudio, popularmente en el departamento de Boyacá, es considerada una planta medicinal útil como insecticida y para dolores reumáticos. Su acción como insecticida natural, se atribuye a su principal componente, la escopolamina (11). En estudios realizados con B. arbórea sobre Haematobia irritans, este extracto mostró ser eficaz en diluciones altas de 1.2:10, donde la mortalidad reportada fue del 75% (13). Sin embargo, en estudios donde se evaluó la mortalidad y repelencia en larvas de Rhynchophorus palmarum L. y Eupalmides cyparissias (Lepidoptera: Castniidae), se reportó una baja mortalidad con un aceptable efecto repelente (11, 12). Por lo anterior, y teniendo en cuenta los resultados obtenidos en este estudio, se podrían llevar a cabo investigaciones que prueben su efecto repelente sobre garrapatas. Además, teniendo en cuenta los altos contenidos en escopalamina, es necesario realizar pruebas de toxicidad antes de pesar en su uso en animales.

En cuanto al extracto de B. pilosa, cuya composición química se caracteriza por la presencia de taninos y flavonoides, entre otros, ha sido reportada por sus efectos cicatrizantes, antibacterianos y antiparasitarios (27, 28) y cuya acción insecticida se ha demostrado sobre el gorgojo de maíz (10). Por su parte, S. nigra, posee flavonoides, ácido cumárico, ésteres beta glucósidos y pectina, entre otros (29, 30).

Sin embargo, según los resultados del presente estudio, tanto B. pilosa como S. nigra, no parecen ser promisorias en el control de garrapatas, ya que fueron eficaces solo sobre poblaciones de garrapatas pequeñas tras la exposición al extracto puro. A pesar de este hecho, algunos autores reportan la eficacia del S. peruviana y B. pilosa en el control del gorgojo

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del maíz (10) y la mosca de los cuernos (13).

El extracto alcohólico de A. cumanenses, posee flavonoides, triterpenos, derivados de la cumarina, taninos e inulina y se reporta como eficaz para el control de parásitos internos y externos (31); sin embargo con la metodología planteada en este estudio, no alcanzó en ninguna de las pruebas, una eficacia aceptable, no obstante en bajas proporciones mostró ser tóxico sobre las garrapatas, por lo que se ratifica el efecto insecticida señalado en estudios donde reportan que este extracto, obtenido por lixiviación, es eficaz contra Haematobia irritans, alcanzando mortalidades superiores al 60% hasta la dilución de 1.2:10 (29).

En conclusión, los extractos etanólicos de las cinco plantas evaluadas en este estudio, mostraron en todos los casos cierto grado de mortalidad, siendo algunas más efectivas que otras; sin embargo, como se ha mencionado, la mayor efectividad se observó con el extracto de N. tabacum.

En cuanto al efecto que ejerce el clima sobre la efectividad de los extractos, se observó un comportamiento similar en la mayoría de los casos (Tabla 1-4), sin embargo, el extracto de N. tabacum, mostró mayor eficacia en las pruebas realizadas en clima frio.

En las pruebas realizadas con los extractos de las cinco plantas estudiadas (extracto puro y diluciones), se observó que, el tamaño del parasito influye sobre la eficacia de los extractos, observándose una mortalidad menor en garrapatas medianas que en garrapatas pequeñas, probablemente porque estas últimas requieren dosis menores del compuesto insecticida. Además, se evidenció que la eficacia fue inversamente proporcional a la dilución del extracto, ya que entre más diluido se encontraba el extracto menor era el porcentaje de mortalidad, posiblemente, por la relación dosis-respuestas en la cual la mayor concentración de compuestos químicos logra un efecto insecticida más notorio (5). Por lo anterior, es necesaria la realización de investigaciones en donde se determine el nivel de concentración, estabilidad de las sustancias químicas en los

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extractos puros y en sus diluciones, así como la identificación de las sustancias responsables del efecto toxico. De manera complementaria será necesario investigar diversos tipos de solventes con el fin de lograr una penetración eficaz de los compuestos activos en la cutícula del parásito y con ello facilitar la acción de éstos.

Finalmente, teniendo en cuenta que los componentes activos de las plantas pueden variar por muchos factores, es recomendable la realización de trabajos similares, donde se evalúe la acción de estas plantas, utilizando diferentes partes de la planta

(hojas, raíces, frutos) y diferentes métodos extracción como, extracción en caliente (Soxleth), hidrolatos, infusión, etc. Además de probar con solventes diferentes, tanto en la elaboración como en la dilución del extracto. Asimismo, realizar pruebas, evaluando efectos repelentes, inhibidores de queratina, supresores de la ovulación y oviposición en las garrapatas. También es adecuada la realización de pruebas in vivo y estudios de toxicidad, que permitan conocer el riesgo potencial de estas plantas promisorias en las especies animales de interés.

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Rev.MVZ Córdoba 15(3):2185-2193, 2010.

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ORIGINAL

Seroprevalencia de Leptospira spp en caninos y humanos de tres barrios de Tunja, Colombia Seroprevalence of in canines and humans Leptospira spp in three neighborhoods of Tunja, Colombia Soledad Bermúdez C, 1 * MVZ, Martín Pulido M,

1

Esp, Roy Andrade B,

1

Ph.D(c).

1 Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Grupo de Investigación GIDIMEVETZ, Tunja, Colombia.*Correspondencia: sunshine2805@hotmail.com

Recibido: Diciembre 15 de 2009; Aceptado: Agosto 2 de 2010

RESUMEN Objetivo. Establecer la seroprevalencia de Leptospira spp., en la población canina y humana de barrios marginados en la ciudad de Tunja. Materiales y métodos. Se muestrearon 61 sueros caninos en los barrios marginales de la ciudad, parlelamente se muestrearon y encuestaron 46 humanos propietarios de las mascotas. Para el procesamiento de las muestras se empleó la técnica de microaglutinación-lisis (MAT) para seis serotipos de Leptospira spp.

Resultados. Se encontró una seropositividad del 67.2% en la población de caninos muestreada, la seroprevalencia por serovares arrojada fue del 14.8% para L. icterohemorrágica; 8.2% para L. pomona; 9.85% para L. hardjo; 18% para L. canicola y 6.6% para L. automnalis y 9.8% para L. sejroë. Para los humanos la prevalencia fue del 21.7%, por serovares se encontró que L. automnalis tiene 4.35%; L. hardjo 2.17%, L. sejroë tiene 6.52%, L. icterohaemorragiae 6.52% y L. canicola 2.17%. Conclusiones.

Estos resultados demostraron una gran problemática de alto impacto ya que en contraste con prevalencias de otros municipios de Colombia, mostró una elevada positividad en esta zona y dejan una gran preocupación por una rápida diseminación que podria suceder debido al contacto entre los diferentes vectores como lo roedores y caninos.

Palabras clave: Leptospira, salud pública, animales, humanos.

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ABSTRACT Objective. To establish the seroprevalence of Leptospira spp in the canine and human populations of slum neighborhoods in the city of Tunja. Materials and Methods. Sixty-one canine serums were obtsined in slum neighborhoods of the city, sera of 46 human pet owners were also obtained, an interview was done as well. The microagglutination-lysis (MAT) technique was used to process the samples for six serotypes of Leptospira spp.

Results. 67.2% of the canine population tested was found to be seropositive, the seroprevalence by serovars resulted in 14.8% for L. icterohemorragica; 8.2% for L. pomona; 9.85% for L. hardjo; 18% for L. Canicola, 6.6% for L. automnalis and 9.8% for L. sejroë.

Humans showed a prevalence of 21.7%, the distribution was as follow: L. Automnalis (4.35%); L. Hardjo (2.17%), L. Sejroë (6.52%), L. icterohaemorragiae (6.52%) and L. Canicola (2.17%). Conclusions. These results showed a great problem with high impact, in contrast with prevalence rates in other municipalities in Colombia, revealed a high positivity rate in this area and produces big concern because of its rapid dissemination, which may be caused by the close contact between vectors, such as rodents and canines.

Key words: Leptospira, public health, animals, humans.

INTRODUCCIÓN La Leptospirosis es una enfermedad infecciosa letal que puede causar grandes epidemias. Aunque es curable, la inespecificidad de los síntomas hace que se confunda con patologías que presentan las mismas características sintomatológicas, permitiendo que la enfermedad evolucione hasta llegar a graves complicaciones como el daño renal y hepático, los cuales acarrean secuelas irreversibles en el organismo. Así mismo los reservorios de la enfermedad son un gran número de mamíferos (ratas, perros, entre otros.)(1), la mayoría de los cuales está en contacto permanente con la población humana.

Debido a que las leptospiras realizan su ciclo de transmisión a través de aguas contaminadas con orina de estos mamíferos (2), uno de los sectores de la población más susceptible a contraer leptospirosis es la de pocos recursos, ya que en la mayoría de los casos las zonas donde residen las personas de este sector, no cuentan con un control adecuado de basuras. Igualmente en la mayoría de los casos los sistemas de acueducto y alcantarillado son deficientes.

La importancia de realizar estudios de prevalencia en esta población radica en que, una vez se identifique el foco de infección,

se podrán ejecutar planes de control adecuados que pre s e n t e n m e d i d a s sanitarias concretas y eficientes, encaminadas a evitar la diseminación de la enfermedad en la población humana susceptible de la ciudad de Tunja.

La leptospirosis es una zoonosis de amplia distribución, causada por especies patógenas de leptospira. El espectro de la enfermedad humana causada por leptospiras es extremadamente amplio, variando de infección subclínica a síndrome severo con infección multiorgánica y alta mortalidad.

Este síndrome, leptospirosis ictérica con falla renal aguda, fue reportado por primera vez hace unos cien años por Weil (3). Sin embargo, un síndrome aparentemente idéntico ocurrido en trabajadores de alcantarillas fue descrito muchos años antes. Las descripciones previas de enfermedades que probablemente correspondían a leptospirosis fueron recientemente revisadas (4).

Estos microorganismos, se encuentran dentro del orden Spirochaetales, al que pertenecen otras bacterias patógenas como Treponema y Borrelia; pertenecientes a la familia Leptospiraceae y en el género Leptospira. Existe una clasificación genotípica

Bermúdez - Estudio seroepidemiológico de Leptospira spp en caninos

y una clasificación serológica del género Leptospira, la primera aunque es la correcta taxonómicamente, resulta tediosa para el microbiólogo clínico, por tal motivo usualmente se opta por la clasificación serológica la cual las agrupa en dos especies de acuerdo a su patogenecidad, Leptospira interrogans (patógenas) y Leptospira biflexa (no patogenas (5-8). Estas dos se subdividen a su vez en múltiples serovares (7,8). La especie L. interrogans contiene aproximadamente de 200 a 280 serovares, mientras que la especie L. biflexa posee más de 60 serovares (6,8,9). Los serovares se organizan a su vez en 23 serogrupos de L. interrogans y 28 grupos de L. biflexa, basándose en la antigenicidad compartida (6).

Son espiroquetas enrolladas herméticamente, usualmente de 0.1 µm por 6 a 0.1 por 20 µm, pero en algunas ocasiones los cultivos pueden tener células más grandes. La amplitud helicoidal es aproximadamente de 0.1 a 0.15 µm y su longitud es aproximadamente de 0.5 µm (10). Morfológicamente, todas las leptospiras son indistinguibles, pero la morfología individual de los aislamientos varía con el subcultivo in vitro. La leptospira tiene una estructura típica de doble membrana, común con otras espiroquetas (11). Los lipopolisacáridos leptospíricos tienen una composición similar a los de las otras bacterias Gram-negativas (12), pero tienen menor actividad endotóxica. Estos microorganismos pueden ser teñidos usando contratinción carbol-fuschina (10).

Las leptospiras son anaerobios obligados con una temperatura óptima de crecimiento de 28 a 30ºC. Producen catalasa y oxidasa.

Crecen en medio simple enriquecido con vitaminas (las vitaminas B2 y B12 son factores de crecimiento), ácidos grasos de cadena larga, y sales de amonio (8). Los ácidos grasos de cadena larga son utilizados como fuente de carbono y son metabolizados mediante b-oxidación (13).

La leptospirosis como enfermedad, es una zoonosis causada por la infección con especies patógenas de leptospira. En humanos, varía desde una infección subclínica hasta un síndrome severo con

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infección multiorgánica y alta mortalidad.

Este síndrome, es conocido como leptospirosis ictérica con falla renal aguda (3,14). La enfermedad fue reconocida como un riesgo ocupacional de los recolectores de arroz en la antigua China (10) y el nombre japonés de Akiyami, o fiebre de otoño, persiste en la medicina moderna. El papel de la rata como fuente de infección humana fue descubierto en 1917 (15).

La vía de ingreso usualmente son las abrasiones o cortes en la piel y mucosas nasal y conjuntival. La transmisión a través del agua contaminada ha sido documentada; la contaminación de los abastecimientos de agua ha resultado en numerosos brotes de leptospirosis. La inhalación de agua o aerosoles también resulta en infección mediada a través de las membranas mucosas del tracto respiratorio. Raramente la infección se puede dar a través de mordedura de animales (16-18). La transmisión directa entre humanos es infrecuente. Sin embargo, la excreción de leptospiras en la orina humana meses después de la recuperación ha sido reportada (19,20). Se piensa que el bajo pH de la orina humana limita la supervivencia de las leptospiras después de la excreción.

La transmisión sexual durante la convalescencia ha sido reportada (21,22).

Los animales, incluyendo los humanos, pueden ser divididos en hospedadores de mantenimiento o en hospedadores accidentales. La enfermedad es mantenida por infección crónica de los túbulos renales de los hospedadores de mantenimiento (23) y usualmente es adquirida a una edad joven, permitiendo que la excreción crónica en la orina incremente con la edad del animal.

Los animales se pueden comportar como hospedadores de mantenimiento o accidentales dependiendo de los serovares que los infecten, generalmente cuando un serovar de leptospira infecta un animal el cual no corresponde a su hospedador de mantenimiento la infección puede causar enfermedad fatal. Los más importantes hospedadores de mantenimiento son los pequeños mamíferos, los cuales pueden transferir la infección a animales domésticos de granja, perros, y humanos. Diferentes

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especies de roedores pueden ser reservorios de distintos serovares, pero las ratas son generalmente hospedadores de mantenimiento para serovares de los serogrupos icterohaemorrhagiae y ballum y los ratones son los de mantenimiento del serogrupo ballum, siendo por lo tanto la orina de las ratas y ratones, fuente importante de infección de estos serovares para los demás animales, incluido el hombre.

Los animales domésticos son también hospedadores de mantenimiento, el ganado lechero puede albergar serovares hardjo, pomona, y grippotyphosa; los cerdos pueden alojar pomona, tarassovi, o bratislava; las ovejas pueden albergar hardjo y pomona; mientras que los perros pueden albergar principalmente canicola (24).

Distintas variaciones en los hospedadores y en los serovares que ellos poseen ocurren alrededor del mundo. Un conocimiento de los serovares prevalentes y sus huéspedes de mantenimiento es esencial para conocer la epidemiología de la enfermedad en cualquier región.

Las ratas son consideradas el reservorio más importante, sin embargo, no todos los roedores tienen el mismo potencial epidemiológico en ese respecto. Para convertirse en una fuente de infección de otros animales, incluyendo a los humanos; los roedores tienen que ser infectados, de esta forma la cepa patogénica puede multiplicarse y estimular una respuesta patogénica. Muchos estudios muestran que cerca del 50% de las ratas (Rattus norvegicus), coipo (Myocastor coypu) y almizcleras (Ondatra zibethicus) son seropositivas. Sin embargo, para ser un reservorio eficiente, cada especie tiene que expulsar la bacteria y en este respecto los roedores no son idénticos en términos de transporte renal. Casi el 30% de las ratas y almizcleras son transportadoras renales de leptospiras (especialmente icterohaemorrhagiae para ratas y grippotyphosa para almizcleras) mientras que solo el 5% de los coipos transportan; particularmente sejroë (25).

Esta enfermedad, puede manifestarse por una amplia variedad de síntomas y signos, así como con diferentes formas clínicas, por

eso es frecuente que se confunda con muchas otras enfermedades y se haya denominado “la gran simuladora” (19).

En caninos, afecta animales de cualquier edad con mayor incidencia en machos. Los casos graves se caracterizan al principio por debilidad, anorexia, vómitos, conjuntivitis, temperatura de 39.5 a 40.5°C, posteriormente depresión pronunciada y mucha sed e ictericia de intensidad variable.

Hay dolor a la palpación en la región lumbar o en la región anterior del abdomen. Lesiones en la mucosa oral, signos de gastroenteritis hemorrágica, nefritis crónica, pigmentos biliares en orina, temblores musculares, hipotermia y muerte entre 5 y 10 días luego de iniciados los síntomas (26).

Con el incremento de la población humana en zonas de asentamientos hacia la periferia de Tunja, la probabilidad de exposición a vectores y reservorios de leptospirosis es cada vez más alta, lamentablemente esto se da en las zonas de mayor vulnerabilidad social, en donde los recursos disponibles para salud son muy limitados.

Los datos obtenidos de esta investigación contribuirán a futuro, a fortalecer programas que brinden un adecuado y oportuno servicio de información sobre esta enfermedad a la comunidad en general. Además, se pretende que mediante la generación de alertas, se dinamizará la participación de entidades oficiales con la creación de verdaderas herramientas que contribuyan a proteger la salud y calidad de vida en sectores desprotegidos.

MATERIALES Y METODOS Área de estudio. La investigación se realizó en el municipio de Tunja, capital del departamento de Boyacá; se encuentra a los 5º, 32", 7’ de latitud norte y 73º, 22" y 04 de longitud oeste. Límita por el norte con Motavita, Cómbita y Oicatá; al oriente con Oicatá, Chivatá y Soracá; al sur con Boyacá, Ventaquemada y Samacá y por el occidente con Samacá, Sora y Cucaita. La extensión territorial de Tunja es de 118 kilómetros cuadrados, de los cuales el 87%

Bermúdez - Estudio seroepidemiológico de Leptospira spp en caninos

corresponde al área rural y el 13% al área urbana. Su altura sobre el nivel del mar es de 2.775 metros. Su altura máxima es de 3.200 metros en límites con Cucaita y su altura mínima es de 2.400 metros sobre el nivel del mar, en límites con el municipio de Boyacá. Es una zona de clima frío.

Durante el estudio, se muestrearon 3 barrios de zonas marginales de Tunja (El dorado, Patriotas y Esmeralda).

Población de estudio. La conformaron 61 caninos, tomando aquellos animales que presentaron características de importancia epidemiológica como la edad, el género, los hábitos de alimentación y desplazamiento, la presencia de ratas en el barrio y el contacto de estas con los perros, entre otros.

Se muestrearon un total de 3 barrios, tomando suero de 24 machos caninos y 37 hembras caninas de zonas marginales.

También fueron muestreados 17 hombres y 29 mujeres, con una edad comprendida entre 25 y 55 años, todos, propietarios de mascotas caninas.

Tipo de estudio. Esta investigación correspondió a un estudio epidemiológico descriptivo, observacional, longitudinal aleatorio simple. El análisis de los datos se realizó por medio de un paquete estadístico (Epiinfo2005). Posteriormente, se realizó el análisis de la prevalencia de leptospirosis en cada zona o barrio. Se trabajó con un límite de confianza del 95% y un margen de error del 5%.

Muestreo de campo y procedimientos de laboratorio. La recolección de los sueros caninos se realizó durante diferentes jornadas de trabajo. Se llegó a los barrios marginales y a la comunidad gracias a líderes y miembros de acción comunal que permitieron establecer lazos de comunicación eficientes durante los procesos de perifoneo.

Previo a la toma de muestras, se aplicó una encuesta a los dueños de los caninos para obtener información correspondiente sobre el género, edad, comportamiento, sintomatología concordante con la enfermedad, o si son asintomáticos, vacunas recientes, barrio en el cual vive (estrato 1)

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entre otros. Posteriormente, se obtuvo por venopunción de la vena cefálica con jeringa, obteniendo 5 ml de sangre de diferentes caninos y luego depositándola en tubos sin anticoagulante identificados adecuadamente.

Luego se llevaron estos tubos a centrifugar con el fin de obtener los sueros, los cuales fueron conservados a 20ºC para luego realizar el análisis respectivo con la técnica de MAT. Se muestrearon igualmente los dueños de perros provenientes de zonas marginales, obteniendo una muestra de sangre de 5 ml de la vena cubital, la cual se centrifugó para la obtención del suero y su posterior utilización en el laboratorio para el procesamiento con la técnica de migroaglutinación lisis (MAT). La técnica MAT se empleó para seis serotipos de Leptospira, los cuales fueron L. icterohemorrhagiae, L. pomona, L. harjo, L. canicola, L. sejroe, L. automnalis.

Técnica MAT. Los sueros se llevaron a una dilución de 1:100, agregando 50 µl de cada antígeno y 50 µl del suero diluido en 1:50 de PBS, estas mediciones se realizaron con una pipeta automática; luego se dispensaron en pozos separados de la placa de microtítulo.

Las placas fueron cubiertas e incubadas por 2 horas a 28 - 30°C. Posteriormente, cada una de las placas se examinó directamente bajo un microscopio de campo obscuro para observar la presencia de aglutinación. Los sueros que mostraron una aglutinación del 50% con uno o más serovares se les fueron realizadas más diluciones. Se consideraron negativos, los títulos menores a 1:100 y positivos, los títulos mayores a 1:100.

RESULTADOS La prevalencia mostrada en este estudio para los diferentes serovares de leptospira arrojó los siguientes resultados: 67.2% de positivad total de caninos frente a los diferentes serovares de leptospira (Figura 1).

L. canicola presentó 11 anímales positivos para un total de 18.0%, L. icterohaemorrhagiae presentó 9 animales positivos para un total del 14.85%, L. sejroë con 6 animales positivos para un total de 9.8%, L. hardjo presentó 6 anímales positivos para un total de 9.80, L. pomona presentó 5 animales positivos para

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Figura 1. Prevalencia de Leptospirosis en caninos provenientes de tres barrios marginales de la ciudad de Tunja.

un total de 8.2% y L. automnalis presentó 4 animales positivos para un 6.6% de positividad (Figura 2).

Figura 2. Porcentaje de serovares encontrados en caninos positivos a Leptospira.

Figura 4. Porcentaje de serovares encontrados en humanos positivos a Leptospira.

DISCUSIÓN La seropositividad de 67.2% en la población canina es alta si se compara con un estudio realizado en Tunja, que reportó un 29% (27).

En ese mismo estudio, el resultado para humanos fue del 11%, mientras que el del presente estudio fue de 21.7%, considerado igualmente alto. Los serovares más diseminados dentro de las poblaciones estudiadas fueron icterohaemorrhagiae y canicola, seguidos por sejroë, hardjo, automnalis y pomona.

En humanos, la prevalencia fue del 21.7% (Figura 3) y se distribuyó en los diferentes serovares de Leptospira así: L. icterohaemorrhagiae 6.52%, L. sejroë tiene 6.52%, L. automnalis tiene 4.35%, L. hardjo 2.17%, L. canicola 2.17% y L. pomona fue negativa (Figura 4).

La explicación de las prevalencias más altas para el serovar icterohaemorrhagiae, se puede presumir por el hecho de que se ha reportado para Tunja una prevalencia de 94% de casos positivos en una prevalencia de leptospira en ratas para dicho el serovar (28), en donde se conoce que estos roedores actúan como hospedador de mantenimiento (25).

Figura 3. Prevalencia de Leptospirosis en humanos propietarios de mascotas pertenecientes a tres barrios marginales de la ciudad de Tunja.

Por su lado, la explicación a las altas tasas de prevalencia del serovar canicola puede inferirse debido a que este utiliza al perro como su principal hospedador de mantenimiento (25,29). A pesar de ello, el serovar canicola mostró una prevalencia alta en perros y en humanos solamente se reportó un caso de seropositividad. En el serovar canicola se obtuvo una significancia estadística (p<0.004) con una oportunidad relativa de contagio de perros sobre humanos de 9.9 veces más. Esto reafirma que esta especie es el huésped natural de este serovar.

Bermúdez - Estudio seroepidemiológico de Leptospira spp en caninos

A pesar que no se obtuvo una significancia estadística, la oportunidad relativa de contagio del serovar hardjo en caninos sobre humanos es 4.9 veces más grande. Esto se podría explicar debido a que en los barrios marginales, incluso en barrios centrales de la ciudad de Tunja; es costumbre mantener ganado en pastoreo; daño oportunidad a que los perros entren en contacto con los bovinos y sus secreciones, contaminándose con el serovar hardjo; del cual los bovinos son hospedadores de mantenimiento (30).

La oportunidad relativa de contagio a los serovares icterohaemorrhagiae (2.48 veces más); sejroë (1.56 veces más) y automnalis (1.54 veces más), a pesar de que no se obtuvo significancia estadística; puede interpretarse como el contacto que pueden mantener los perros con secreciones de ratas, especialmente en los barrios marginales donde aún se pueden observar aguas empozadas y algunas veces sistemas de alcantarillado y acueducto deficientes; además de desecho inadecuado de basuras.

Hay que sumarle la posibilidad de que algunas de estas mascotas complementen su dieta cazando ratas.

Es importante observar que no existe una homogeneidad en la distribución de los serovares entre los grupos caninos y humanos, lo cual hace que la positividad en humanos no pueda ser atribuida ni exclusivamente ni principalmente a los caninos. En los humanos la prevalencia del serovar canicola es baja, caso contrario a los caninos en los cuales este serovar presentó la mayor prevalencia. De esta forma la alta incidencia de L. icterohaemorrhagiae en humanos podría ser atribuida a la presencia de otros vectores tales como los roedores.

En conclusión, es evidente la problemática que se presenta en en la zona de estudio, pues al comparar los resultados del presente estudio con otros previamente realizados en

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la ciudad de Tunja, se observa una creciente y elevada positividad, así como una rápida diseminación. Esto puede estar dado al estrecho contacto entre los diferentes vectores, como lo son roedores, caninos y humanos. La importancia de la leptospirosis como enfermedad reemergente la convierte en una amenaza para la salud pública, lo cual complica el entendimiento de la epidemiología y el diagnóstico de la enfermedad, además de poder desarrollar programas preventivos adecuados, como vacunación a partir de cepas existentes en el entorno.

A pesar de que es bien sabido que la leptospirosis se ha reconocido históricamente como una enfermedad relacionada con riesgo ocupacional al trabajar con animales y agricultura, su tradicional estatus de enfermedad esporádica y de ambientes rurales se ha venido desvirtuando con estudios como estos y a raíz de la aparición de brotes importantes en diferentes partes del mundo, relacionados con falta de planeación del crecimiento urbano donde se presentan malas prácticas sanitarias, principalmente. Debe considerarse que la dinámica de las leptospiras en el medio ambiente de Tunja, está muy poco estudiada; y que es peligroso el hecho de desconocerla como una enfermedad potencialmente lesiva contra la salud pública (zoonosisantropozoonosis) y contra la misma economía.

Por tanto, se debe poner atención, pues puede resultar endémica por condiciones multifactoriales, como lo es la presencia de múltiples hospedadores de mantenimiento de diferentes serovares patógenos.

Agradecimientos A la Secretaria de Salud del Departamento de Boyacá, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Dirección de Investigaciones DIN de la UPTC y al Programa de Colciencias Jóvenes Investigadores E Innovadores “VIRGINIA GUTIERREZ DE PINEDA”.

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ORIGINAL

Suplementación con balanceado comercial en crías vacunas lactantes bajo sistema doble propósito Supplementing double purposed lactating calves with commercial feed Esperanza Prieto M, 1 * M.Sc, Donicer Montes V, 1 Esp, Leonardo Lara M, 2 Zoot, Rosa Ríos H, 2 Zoot.

Universidad de Sucre, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de zootecnia, Sincelejo, Colombia.2 Ejercicio particular. *Correspondencia: esperanza.prieto@unisucre.edu.co

1

Recibido: Noviembre 3 de 2009; Aceptado: Julio 26 de 2010

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto que ejerce la suplementación con alimento balanceado sobre la ganancia diaria de peso (GDP) y el consumo de alimento (CA) en terneros lactantes y su impacto económico en una empresa ganadera manejada bajo un sistema vacuno de doble propósito, en el municipio de Sincé, Sucre–Colombia. Materiales y métodos. Se suplementaron 14 crías (6 machos y 8 Hembras) entre 3 y 5 meses de edad, con alimento balanceado comercial al 1.5% del peso vivo (Tratamiento 1) y se compararon con un grupo igual sin suplementar (Tratamiento Testigo), durante 113 días en época de lluvias. La GDP y CA fueron evaluados mediante prueba t de Student. Se determinó Relación beneficio: costo y rentabilidad. Resultados. La GDP de las crías lactantes fue afectada de manera altamente significa por la suplementación con alimento balanceado comercial (p<0.05) siendo en las crías suplementadas 99.77% (870.97 gr) superior a las crías no suplementadas (435.96 gr.) debido al aporte de nutrientes de alta digestibilidad por parte del suplemento. El sexo de las crías no afectó la ganancia diaria de peso de los terneros dentro de cada tratamiento (p>0.05), encontrándose el mismo resultado para el consumo de alimento balanceado (p>0.05) explicando así la no diferencia estadística en la GDP entre sexos. El análisis económico confirmó que la estrategia alimenticia es viable al presentarse una relación B:C del 1.1. y una rentabilidad trimestral del 9.27%. Conclusiónes. La suplementación de terneros lactantes es una práctica viable, que permite obtener ganancias adicionales.

Palabras clave: Terneros, suplementación, ganancia de peso, alimento, rentabilidad.

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ABSTRACT Objective. To evaluate the effect over the daily weight gain (DWG) and feed consumption (FC) caused by supplementing with commercial feed, on lactating calves and its economic impact in a cattle ranching company managed under a double purpose cattle system. Materials and methods. Fourteen calves were supplemented (6 males and 8 females) between 3 and 5 months old, with commercial balanced feed at 1.5% of live weight (Treatment 1) and they were compared to an equal in sex group which was not supplemented (control Treatment), for 113 days, during rainy season. The data for DWG and FC were statistically analyzed through a t Student test. The cost-benefit relationship and profitability were determined.

Results. The DWG of the lactating calves was significantly affected by the supplementation with commercial feed (p<0.05) being the supplemented calves 99.77% (870.97 g) higher to those non-supplemented (435.96 g.) due to the nutrient contribution and high digestibility of the supplement. The gender of the calves did not affect the daily weight gain (p>0.05), or the consumption of the commercial feed (p>0.05), within each treatment, thus explaining the statistical non-difference in DWG among genders. The economical analysis confirmed that the feeding strategy is viable when there is a relation B: C of 1.1 and a trimester profitability of 9.27%. Conclusion. Supplementing lactating cattle calves is a reasonable practice that allows gaining additional profit.

Key words: Lactating cattle calves, supplementation, weight gain, feeding, profitability.

INTRODUCCION La producción bovina en Colombia juega un papel importante para la economía nacional aportando el 66% del PIB pecuario, con un inventa r i o d e 2 3 ’ 0 0 0 . 0 0 0 c a b e z a s distribuidas de la siguiente manera: 38% en el sistema doble propósito, 60% para cría, levante y ceba y el 2% para lecherías especializadas, siendo estos los principales sistemas de producción manejados en el país (1).

En las ganaderías manejadas bajo el sistema doble propósito, los terneros lactantes representan uno de los grupos o categorías más importantes, debido a que de allí surgirán las futuras hembras de reemplazo y los machos destetos que representan uno de los componentes de ingreso económico.

Uno de los principales problemas que se presenta en ésta categoría animal es el desequilibrio en el aporte de nutrientes necesarios para un adecuado crecimiento; la principal causa es el mal manejo alimenticio que se les ofrece a los terneros, debido a varios factores como son: por una parte al exhaustivo ordeño al que son sometidas las madres, las cuales por tener un alto

componente Bos taurus dejan menos leche residual al ternero. Por otro lado las crías menores de 4 meses, solo toman la leche residual después del ordeño y permanecen con sus madres entre 5 y 7 horas diarias, posteriormente son encerradas en horas de la tarde (1:00 p.m.) en los corrales, sin ninguna oferta de alimento, hasta el ordeño del día siguiente (6:00 a.m.) y/o son sometidas a un pastoreo en los potreros mas cercanos a la casa, presentando estos en la mayoría de los casos, forraje en muy baja cantidad y calidad.

Lo anterior ocasiona problemas de subnutricion durante esta etapa productiva, conllevando a bajas ganancias diarias de peso y bajos pesos al destete (inferiores a 130 Kg), mayor incidencia de problemas sanitarios, alta mortalidad y un precio reducido al momento de la venta. También es importante destacar que de este grupo de animales surgen, normalmente, las futuras hembras de reemplazo, que representan, en gran medida, el futuro económico de la empresa, en este caso los futuros vientres llegan a una edad tardía a la pubertad y por

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consiguiente con alta edad al primer parto, dando pocos terneros durante su vida productiva.

El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto que ejerce la suplementación con alimento balanceado comercial sobre la ganancia diaria de peso y su viabilidad económica, en terneros lactantes manejados bajo un sistema vacuno de doble propósito en condiciones de sabana en el departamento de Sucre.

MATERIALES Y METODOS Tipo de estudio. Se realizó un estudio de tipo experimental con asignación aleatorizada para evaluar dos tratamientos en un lote de hembras y uno de machos, con ocho repeticiones para las hembras y seis para los machos en cada tratamiento, para un total de 28 unidades experimentales, observadas durante 113 días.

Localización. El trabajo se llevó a cabo en la empresa ganadera El Nido, municipio de Sincé, subregión sabanas del departamento de Sucre. Su posición geográfica está determinada entre los 9°14’45" de latitud Norte y 75° 08’ 58" de longitud Oeste, en el kilómetro 35 de la entrada a Sincé desde San Juan de Betulia. Los datos meteorológicos de la zona afirman que el lugar se encuentra de acuerdo con la clasificación de Montes (2) en bosque seco tropical (bs-T) a 125 m.s.n.m., con temperatura promedio de 28°C, humedad relativa de 75% y precipitación media anual de 1100 m.m., distribuidos entre los meses de marzo y noviembre.

La empresa ganadera posee 36 hectáreas distribuidas en 12 potreros, de los cuales tres se encuentran ocupados con pastos de corte como elefante morado, elefante enano y caña dulce, los 9 restantes están en praderas. La principal fuente de alimentación consiste en praderas conformadas por una mezcla de gramíneas y leguminosas siendo el pasto colosuana (Bothriochloa pertusa) el predominante. Se cuenta con agua subterránea para el sistema de riego, agua de jagüeyes y agua de acueducto para el consumo de los animales.

Población y muestra. Como unidades experimentales se utilizaron un total de 28 terneros lactantes, integrados por 12 machos y 16 hembras, todos cruzados resultantes del sistema doble propósito con componentes raciales desde 3/4 Bos taurus hasta 3/4 Bos indicus, con participación de las razas Holstein, Pardo Suizo, Gyr, Brahman y Guzerat. Los terneros fueron clasificados y seleccionados lo mas homogéneos posible con una edad entre 3 y 5 meses y un peso promedio de 79.05 Kg para los machos y 75.55 Kg para las hembras.

Se evaluaron los siguientes tratamientos sobre el desempeño productivo: Tratamiento Control (T 0 ): Crías no suplementadas.

Tratamiento 1 (T1): Crías suplementadas con alimento balanceado comercial (1.5% del Peso Vivo).

Las unidades experimentales fueron asignadas al azar en los diferentes tratamientos, de tal forma que cada uno quedo representado por 14 crías, conformado por 6 machos y 8 hembras.

La evaluación se llevó a cabo durante un periodo experimental de 113 días en la época de lluvia, de los cuales 14 correspondieron a la fase de acostumbramiento y 99 a la evaluación y toma de datos.

Se verificó que todos los terneros mamaran la leche residual luego del ordeño de cada vaca durante media hora, finalizada esta actividad, las crías salían en compañía de sus madres al potrero asignado para vacas paridas donde encontraba agua y mezcla mineral comercial al 8% de P. Los terneros evaluados fueron separados todos los días de sus madres a las 11:00 a.m., y llevados a pastoreo. Para esto se utilizaron 2 potreros de 0.9 ha (c/u) para cada tratamiento, cada uno de estos potreros se subdividió en 2, manejando un sistema de pastoreo alterno, con 14 días de ocupación y 14 días de descanso, permaneciendo las crías en su respectivo potrero el resto del día. Las crías del tratamiento 1 fueron trasladadas a las 4:00 p.m., a los corrales donde se les brindó la

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suplementación, ofreciendo 1.5% del peso vivo, luego de saciarse eran dirigidas nuevamente a los potreros donde pasaban el resto de la noche hasta el ordeño del día siguiente. Una vez retirados los terneros se pesó el alimento residual. La cantidad de alimento se ajustó cada quince días y se ofreció de manera individual en comederos de madera con medidas de 60 cm de ancho x 70 cm de largo y 30 cm de fondo.

Adicionalmente, se evaluó la composición química del forraje disponible y la muestra se colectó a través del método de simulación de pastoreo (“hand plucking”). Se determinó porcentajes de materia seca (MS), proteína bruta (PB), cenizas (C) y materia orgánica (MO) por el método AOAC (1984), porcentajes de fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente ácido (FDA) y lignina (LDA)(3).

El suplemento ofrecido fue en forma de pellet para iniciación de terneros en zonas tropicales, con suministro a partir de los 10 días de edad hasta los 9 meses. La composición química del alimento se presenta en el tabla 1.

Indicadores económicos. Para el cálculo de los indicadores económicos, se tuvo en cuenta los costos e ingresos adicionales por efectos de la suplementación, es decir los egresos por consumo del alimento balanceado comercial y los ingresos por la ganancia total de peso adicional que obtuvieron las crías suplementadas frente a las no suplementadas.

Tabla 1. Composición nutricional del suplemento alimenticio suministrado a las crías evaluadas en el tratamiento 1 (T1).

Recolección procesamiento y análisis de la información. Se evaluaron las siguientes variables: Ganancia diaria de peso, consumo diario de suplemento, relación beneficiocosto, utilidad neta y rentabilidad.

Ganancia diaria de peso. Los terneros fueron pesados cada quince días, de manera individual, antes de que cada ternero tuviera contacto con la madre durante el ordeño, este pesaje se hizo utilizando una báscula ganadera.

Consumo diario de alimento. Diariamente se determinó el consumo del suplemento o alimento balanceado por parte de las crías del tratamiento 1, que resultó de la diferencia entre la cantidad ofrecida y los sobrantes o rechazo.

Debido a que los dos tratamientos experimentales se sometieron al pastoreo se determinó la disponibilidad de materia seca y composición botánica a la entrada y salida de cada pastoreo.

Análisis de los resultados. La ganancia diaria de peso y el consumo de alimento fueron analizadas a través de la prueba t Student, para dos colas a un nivel de confianza del 95% (4), considerando los efectos simples de los tratamientos en donde se compararon las medias obtenidas para cada variable por tratamiento y sexo. Para la evaluación económica, se determinó la relación beneficio costo, la utilidad neta y la rentabilidad. El precio por kg de peso fue considerado de acuerdo al precio de venta de animales anteriores en la finca.

RESULTADOS Ganancia diaria de peso (GDP). La GDP de las crías lactantes fue afectada de manera altamente significa por la suplementación con alimento balanceado comercial (p<0.05), siendo de 870.97 g/día para las crías suplementadas y de 435.96 g/día para las crías no suplementadas.

El sexo de las crías no afectó la ganancia diaria de peso de los terneros dentro de cada tratamiento (p>0.05), sin embargo tendió a ser mayor en los machos.

El análisis estadístico de las crías del mismo sexo pero de diferentes tratamientos mostraron diferencias altamente

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significativas (p<0.05) lo que corrobora el efecto positivo de la suplementación en la ganancia diaria de peso, de esta manera tanto machos como hembras del tratamiento 1, fueron superiores a las crías del mismo sexo del tratamiento control (Tabla 2).

digestibilidad lo que significa que el suplemento aportó el 50% de la materia seca, el 44.12 % de la proteína cruda y el 41.8% de energía digestible (3.75 Mcal), dentro de los requerimientos nutricionales de las crías en esta etapa.

Tabla 2. GDP por sexo de las crías suplementadas (T1) y No suplementadas (T0) bajo el sistema de doble propósito.

Al estimar el consumo de leche residual (como el 30% de la producción de la vaca) y calcular el consumo de forraje, se pudo observar que el consumo de leche residual entre los terneros suplementados y no suplementados fue similar, pues este parámetro depende de la capacidad productora de las madres el cual presentó un comportamiento parecido; no obstante, el consumo de alimento balanceado por parte de los terneros del T1, disminuyó el consumo de forraje durante el pastoreo en este grupo de animales (Tabla 4).

Consumo de alimento. Para el consumo de alimento balanceado por parte de los terneros del tratamiento 1, no existió diferencia significativa entre machos y hembras (p>0.05), de otra parte, el consumo de suplemento se encontró entre 1.35 y 1.29% del peso vivo, sin conseguir el 1.5% (Tabla 3).

Tabla 3. Consumo diario de balanceado comercial (g.) por parte de las crías lactantes suplementadas (T1) bajo el sistema de doble propósito.

a, letras iguales entre filas, no presentan diferencia significativa (p>0.05)

En promedio los teneros consumieron 1500 g de alimento balanceado diarios de donde obtuvieron un consumo de 1.31 kg de MS y 267.79 g de proteína cruda de alta

Tabla 4. Consumo diario de leche y forraje durante el pastoreo de las crías vacunas lactantes no suplementadas (T0) y suplementadas (T1) bajo el sistema DP.

Al considerar el consumo de nutrientes en el alimento balanceado, la leche y el forraje (Tabla 5) s e p u e d e a f i r m a r q u e l o s terneros suplementados presentaron una dieta bastante completa que se aproximó a los requerimientos nutricionales de las crías , lo que explica en gran parte los buenos resultados encontrados en cuanto a GDP se trata.

Tabla 5. Consumo estimado de nutrientes por parte de las crías vacunas lactantes no suplementadas (To) y suplementadas (T1).

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Viabilidad económica de la suplementación sobre la ganancia diaria de peso (GDP) en crías lactantes. En la tabla 6, se muestra el consumo total de suplemento balanceado comercial de las crías del tratamiento 1, así como su equivalencia en dinero, lo que representa la inversión adicional a los costos de producción realizados en la empresa ganadera en comparación con el tratamiento control, que para efectos de la investigación reflejó el comportamiento tradicional de la finca. En este sentido el gerente ganadero invirtió $ 1.882.085,6 en 2.352,61 kg de alimento balanceado el cual consumieron las 14 crías en un periodo de 113 días evaluados.

La viabilidad económica adicional por efecto de la suplementación con alimento balanceado, se puede apreciar en el tabla 8.

Tabla 6. Costo de la suplementación con balanceado comercial en crías vacunas lactantes durante el periodo experimental.

Ganancia diaria de peso (GDP). Las crías suplementadas con alimento balanceado comercial superaron en 99.77% a las crías no suplementadas en ganancia de peso. De acuerdo con lo expuesto por Combellas (5), los alimentos balanceados tienen un efecto mejorador sobre las variables productivas por la disponibilidad de nutrientes que estos poseen y por la calidad energética que son capaces de proveer a los rumiantes, que un pasto en clima tropical difícilmente suministraría, siendo el limitante en un sistema de pastoreo en el trópico.

Los ingresos adicionales por efectos de la suplementación aparecen en la tabla 7 donde se observa que las crías suplementadas obtuvieron 685.5 kg de peso adicionales a las crías no suplementadas (1369.5 - 684 kg), esto representado en un ingreso adicional de $ 2.056.500 tomando como precio $ 3000 por kg de peso vivo.

Tabla 8. Cálculo de la viabilidad económica adicional por efecto de la suplementación con balanceado comercial en Crías lactantes.

DISCUSIÓN

A pesar del resultado anteriormente expuesto, las crías suplementadas no alcanzaron ganancias diarias de peso de 1000 g diarios, esto pudo deberse a las actividades de descorne y marcaje a que fueron sometidos todos los animales, dentro del 3° al 5° pesaje, en donde las ganancias

Tabla 7. Ingreso adicional en crías lactantes Suplementadas con balanceado comercial durante el periodo experimental.

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de peso cayeron entre un 33.8 y 45.2%.

Este descenso pudo ser causado por efectos de la acción de corticoides en el estrés y por el dolor que experimentaron los animales a través de la cura de heridas que se realizaron en este periodo. Se pudo notar, un incremento de la GDP para los animales en los dos tratamientos al sanar completamente las heridas de las crías.

Varios investigadores han evaluado el efecto de la suplementación sobre la ganancia diaria de peso en crías lactantes siendo los resultados en la mayoría de los casos satisfactorios a favor de la suplementación.

Martínez et al (6), estudiaron el efecto de tres niveles de suplementación (0.5, 1.0 y 1.5% del peso vivo) con alimento balanceado vs un tratamiento control, sobre la GDP en crías lactantes mestizas manejadas bajo un sistema de doble propósito. Los resultados encontrados mostraron efectos similares a los de la presente investigación, siendo la alimentación con balanceado en los tres niveles evaluados, las que presentaron los valores mas altos en ganancia diaria de peso, con diferencias altamente significativas (p<0.01) sobre los terneros no suplementados. La GDP también fue afectada por los diferentes niveles de suplementación, presentando los mejores resultados los niveles al 1 y al 1.5%, sin diferencia significativa (p>0.05) entre estos, pero ambos superiores a los otros con diferencia significativa, siendo la opción más atractiva económicamente, la suplementación al 1% , con una rentabilidad de 21% en un periodo de 8 meses hasta el destete de los animales.

Reza et al (7), Blanco (8), estudiaron el efecto de la suplementación del ternero lactante bajo un sistemas vacuno de doble utilidad; en todos los casos, los terneros suplementados obtuvieron mejores resultados productivos en GDP cuando los compararon con los terneros no suplementados.

Resultados diferentes fueron encontrados por Cero et al (9), quienes estudiaron el efecto de la suplementación en terneros Cebú cubano, no encontrando diferencia significativa entre los terneros

suplementados y no suplementados, atribuyendo dicho efecto a la capacidad genética limitada de las crías suplementadas, la cual no les permitió mantener e incrementar la producción frente a los no suplementados y por ende la suplementaciòn no fue viable económicamente.

La no diferencia en la GDP por sexo, puede atribuirse a que las crías vacunas hembras y machos en etapa media de lactancia, dependiendo de las condiciones de manejo, presentan un crecimiento homogéneo, efecto que podría estar explicado por la interacción genotipo ambiente (10). A pesar de lo anterior muchos investigadores han encontrado efectos diferentes a los aquí reportados. Por ejemplo, Osorio (11), obtuvo 35 kg más al destete y 105 g más en GDP en crías machos con relación a las hembras siendo el promedio de machos de 205,9 kg al destete y 701.2 g en GDP con relación a las hembras con 180 kg al destete y 551 g en GDP. Por otra parte, Álvarez (12), señala una ventaja de 6 a 9% a favor de los machos para la GDP en la lactancia frente a las hembras, manejadas bajo un sistema de doble propósito y pastoreo rotacional.

Consumo de alimento balanceado. La no diferencia en el consumo promedio de alimento balanceado entre machos y hembras, podrían en parte explicar la no diferencia estadística en la GDP entre sexos dentro de este tratamiento.

El consumo de alimento balanceado y el aporte de nutrientes que este hizo, explica la eficiencia productiva de los terneros suplementados frente a los no suplementados; por un lado, se satisface en parte los requerimientos nutricionales para esta etapa y por otro lado dentro de su comportamiento ingestivo, disminuiría el tiempo dedicado a la búsqueda de alimento o pasto e incrementaría el tiempo de reposo y por ende su eficiencia metabólica, esto reforzado por una alta digestibilidad del alimento consumido.

El consumo de alimento balanceado no alcanzó a llegar al 1.5% del peso vivo en los diferentes sexos; siendo de 1.32% en promedio; lo anterior debido posiblemente a

Prieto - Suplementación con balanceado comercial en crías vacunas

la época de invierno donde hay mayor disponibilidad de forraje, mayor producción de leche y mayor consumo de leche por parte del ternero. Es posible que en verano, donde disminuye la producción de forraje, se logre un consumo del 1.5% del peso vivo.

El consumo de alimento balanceado de los terneros del T1, disminuyó el consumo de forraje durante el pastoreo. Varios investigadores coinciden con lo anterior (1315),quienes encontraron que la suplementación energética y/o proteica disminuyen el consumo de materia seca en el forraje, así como tiende a reducir el tiempo dedicado a la actividad de pastoreo, lo cual incrementa la tasa metabólica de los animales y por ende su eficiencia productiva. En todos los casos anteriores, a medida que aumentó el nivel de inclusión del suplemento con relación al peso vivo disminuyó el consumo de forraje. Por lo anterior es posible que adicionalmente la suplementación permita aumentar la carga animal en estos potreros.

Viabilidad económica de la suplementación sobre la ganancia diaria de peso (GDP) en crías lactantes. Las grandes ventajas biológicas (GDP) que ofreció el alimento balanceado comercial a las crías del tratamiento uno frente a las del tratamiento control, mostró un efecto proporcional en los indicadores económicos para la viabilidad de la estrategia evaluada (Tabla 8), en tal sentido que la rentabilidad de la inversión adicional por efectos de la suplementación alcanzó un 9.27% durante el periodo evaluado (113 días), encontrándose por encima a la tasa de interés bancaria nacional1. El resultado indicó que por cada $ 100 invertidos se obtuvo $ 9.27 de utilidad adicional, esto confirma que es viable económicamente la implementación de esta estrategia alimenticia; por otro lado, la relación beneficio:costo, solo llegó a 1.1 que a pesar de no arrojar perdidas si está algo estrecha, lo que se refleja en una utilidad bruta adicional baja siendo de $ 174.414 en 113 días evaluados. Este efecto puede mitigarse realizando una reducción en el nivel de suplementación llegando al 0.5% (16) o al 1.0% (6) del peso, pues según estos investigadores, estos niveles de suplementación fueron los favorables económicamente.

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Bravo y Bracho 2000 (17), encontraron que la suplementación al 0.5 % representó una disminución del 84.52% con respecto al 1.5%, asimismo, la suplementación permitió obtener una rentabilidad del 25% anual, considerándose bastante buena y estando por encima a la encontrada en la presente investigación.

En conclusión, la suplementación con alimento balanceado comercial a crías lactantes manejadas bajo el sistema de doble propósito y en las condiciones tropicales de sabanas evaluadas, permitió duplicar la ganancia diaria de peso frente a las crías no suplementadas. El sexo de las crías evaluadas no afectó la ganancia diaria de peso durante el periodo experimental dentro de cada tratamiento. El consumo de alimento balanceado comercial fue estadísticamente el mismo para las crías machos y hembras del tratamiento suplementado.

El análisis económico realizado a la suplementación de terneros lactantes manejados bajo el sistema de doble propósito, confirmó que es una practica viable, que permite obtener una ganancia de dinero extra, en el ciclo de producción, al presentarse una rentabilidad por encima a la tasa de interés bancaria y margen positivo de utilidad adicional. Sin embargo el máximo beneficio se consigue a largo plazo, ya que las hembras, podrían llegar mas temprano a una vida reproductiva, al presentar un crecimiento mucho mas rápido que las no suplementadas; del mismo modo los machos llegarían más jóvenes al faenamiento incrementando la calidad de la canal.

Se recomienda la evaluación de diferentes niveles de suplementación con alimento balanceado comercial a crías lactantes con el fin de encontrar las más viable, no solamente productiva sino económicamente aplicable. Continuar con el monitoreo de los pesajes de los animales y la suplementación y de esta forma conocer su impacto en la llegada a la pubertad y edad al primer parto en las hembras.

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ORIGINAL

Asociación entre receptores de leptina en testículo, niveles de leptina y testosterona en terneros púberes Association between leptin receptors in the testicle, leptin and testosterone levels in puber male calves Z.Tatiana Ruiz-Cortés,

1*

Ph.D, Martha Olivera A, 1 Dr.Sc.

U n i ve r s i d a d d e A n t i o q u i a , Fa c u l t a d d e C i e n c i a s A g ra r i a s , G r u p o d e I nve s t i g a c i ó n Biogénesis, Robledo, Medellín, Colombia. *Correspondencia: ztatiana@agronica.udea.edu.co

1

Recibido: Agosto 10 de 2009; Aceptado: Junio 18 de 2010

RESUMEN Objetivos. Describir la presencia de receptores de leptina (OBR) en el testículo en la llegada de la pubertad en terneros y estudiar la posible asociación entre la expresión de éstos y los niveles de leptina (L) y de testosterona. Materiales y métodos. Se utilizaron 6 terneros Holstein x Cebú a los cuales se les midió quincenalmente y durante 7 meses concentraciones de testosterona y de L por RIA. Fueron castrados unilateralmente según períodos peripuberales para estudiar por RT-PCR la expresión de isoformas del receptor de L. El análisis estadístico se realizó con el programa Statistica®. Resultados. La testosterona presentó niveles desde menores a 1ng/mL a los 6 y 6.5 meses de edad, hasta concentraciones de 5.3 ng/ml a los 12.5 meses antes de la llegada a pubertad, momento en el cual los animales tuvieron niveles de 4.01±1.8 ng/ml. Las concentraciones de L variaron entre 0.61 y 0.98 ng/ml, con una concentración en pubertad de 0.91±0.05 ng/ml. Dos isoformas, OBRi y OBRb, fueron encontradas y se correlacionaron significativamente entre ellas en la pubertad. Se hallaron correlaciones negativas entre OBRi-OBRb y niveles de testosterona y de L (p=0.08). Los niveles de testosterona y de L mostraron una correlación directa significativa. Conclusiones.

Se sugiere un posible efecto directo de la leptina en gónadas de terneros hasta la llegada a pubertad. La correlación entre las isoformas de OBR y su asociación con las concentraciones de leptina y testosterona también sugiere la acción complementaria o conjunta de ambos receptores OBR en testículos de terneros peripuberales.

Palabras clave: Gen obesidad, hormonas, maduración sexual machos.

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ABSTRACT Objectives. To describe the presence of leptin receptors (ObR) in the testicle during puberty in calves and study the possible association between the expression of the testicles and the levels of leptin (L) and testosterone. Materials and Methods. During 7 months every two weeks on six Holstein x Zebu calves, concentrations of testosterone and L were measured

by RIA. They were castrated unilaterally according to their peribubertal periods in order to study by RT-PCR the expression of the L receptor isoforms. The statistical analysis was done with the Statistica® program. Results. The levels of testosterone were <1ng/mL at 6 and 6.5 months of age, concentrations of 5.3 ng/ml at 12.5 months were reached before puberty, moment in which the animals had levels of 4.01±1.8 ng/ml. The L concentrations varied between 0.61 and 0.98 ng/ml, with a concentration at puberty of 0.91±0.05 ng/ml.

Two isoforms, OBRi and OBRb, were found and correlated significantly at puberty. Negative correlations were found between OBRi-OBRb and the testosterone and L (p=0.08) levels.

Testosterone and L levels showed a significant direct correlation. Conclusions. A possible direct effect of leptin on calf gonads until they reach puberty is suggested. The correlation between the OBR isoforms and their association to leptin and testosterone concentrations also suggests the complimentary or joint action of both OBR receptors in peripubertal calves’ gonads. key words: Obesity gene, hormone, male sexual maturation

INTRODUCCIÓN La leptina es una hormona proteínica de 16 KDa, está compuesta por 146 aminoácidos y es sintetizada principalmente por el tejido adiposo. Esta hormona es codificada por el gen ob, identificado originalmente en estudios conducentes a identificar las causas de la obesidad en el ratón obeso (ob/ob) (1). La leptina actúa a través de receptores específicos de membrana (OBR) los que se han demostrado como altamente similares con los receptores de la familia interleuquina 6 (IL-6) (2-5). Las isoformas de receptores de leptina, incluyen receptores de forma larga (OBRb) y varios receptores de forma corta (OBRa, OBRc, OBRd y OBRf), así como el receptor soluble (OBRe) que se encuentra en plasma circulante (5,6).

La proteína o el ARNm de receptores de leptina han sido encontrados en gran variedad de tejidos incluyendo tejido adiposo blanco y pardo, páncreas, intestino, hígado, músculo esquelético, placenta, cerebro, glándula mamaria, corteza adrenal, en el ovario en células de la granulosa, células de la teca y en cuerpo lúteo y en testículo, en espermatocitos y en células de Leydig (2,7-11).

En el eje hipotálamo-hipófisis-gonadal, la leptina juega un papel muy importante en la regulación de la reproducción de los mamíferos. Actúa en la regulación y secreción de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) por el hipotálamo (12, 13) y en la hipófisis modula la secreción de la hormona luteinizante (LH), como sucede en algunas especies animales tales como, cerdos (4, 14), primates (15), roedores (16), oveja (17) y bovinos (12).

En las hembras bovinas, la leptina está relacionada con la regulación del ciclo estral y probablemente está involucrada en el control de la reproducción. Según Williams et al (12), la leptina circulante disminuye durante la fase luteal y folicular del ciclo estral, en vacas y novillas sexualmente maduras, variación concomitante con la variación en las pulsaciones de LH y las concentraciones séricas de insulina e IGF-1 como reguladores del ciclo estral.

Además, se ha encontrado en algunos estudios, que las concentraciones sistémicas de leptina incrementan durante la pubertad en machos y hembras, tanto en

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humanos (18), como en muchas especies animales: cerdos (19), ratones (20) y ganado bovino (21). Sin embargo, el incremento sólo se mantiene en las hembras, porque en los machos los niveles de leptina disminuyen después de la pubertad (22). El modo de acción de la leptina en la reproducción en los machos ha sido muy discutido por los autores (22-25), indicando que es muy complejo por ejercer efectos tanto inhibitorios como estimulatorios del eje gonadal por ejemplo a nivel del control de la expresión de genes importantes en la vía de la esteroidogénesis (SF-1, StAR y P450scc); además, la expresión del receptor OBR muestra patrones igualmente complejos con la presencia de isoformas reguladas de manera homóloga (leptina) y heteróloga (gonadotropinas) (22), se propone que sucedería esto según el momento reproductivo del animal.

El objetivo de esta investigación fue describir la presencia de receptores de leptina (OBR) en el testículo en un modelo bovino en la llegada de la pubertad. Se hipotetiza que los OBR aumentan progresivamente su expresión en el testículo entre el periodo prepuberal y hasta el inicio de la pubertad de terneros, indicando una posible relación entre las hormonas leptina y testosterona y un efecto conjunto sobre el inicio de la pubertad.

MATERIALES Y MÉTODOS Zona de estudio. El estudio se realizó en la ganadería Los Balcones localizada en el municipio de Santa Rosa (departamento de Antioquia-Colombia), a una altitud de 2550 metros, una temperatura promedio de 18°C, una humedad relativa de 79% y una precipitación media anual de 2238.9 mm, la cual la ubica en una zona de vida bmh-MB. Animales. En el sistema de producción se seleccionaron terneros cruzados F1 (Bos taurus x Bos indicus), nacidos en diferentes épocas del año por la disponiblidad de los animales. Los animales fueron alimentados desde el nacimiento hasta el destete con leche recién ordeñada (promedio de este periodo 4.5 lt) en sistema estabulado

individual, luego se llevaron a un sistema semi-estabulado con rotación de potreros a base de pasturas (Penisetum clandestinum, Lolium multiflorum y Penisetum sp) y de concentrado. Los animales fueron sometidos al plan sanitario que se realiza en el sistema de producción (desparasitación 3 veces al año, vacunas anti Aftosa y triple).

Determinación del inicio de la pubertad.

Para determinar el inicio de la pubertad se tuvieron en cuenta todos los signos siguientes: la edad en meses, el peso corporal en kg, perímetro torácico en centímetros con cinta (26), la circunferencia escrotal en centímetros con cinta testicular, la observación de libido (monta a otros terneros, erección del pene, inicio de reflejo de Flehmen) todos estos parámetros medidos cada 15 días.

Además, se recolectaron muestras de orina y de líquido espermático mensualmente desde la detección de los signos de llegada a la pubertad descritos (edad, peso, perímetro testicular, libido). La muestra de orina se recolectó por masaje en el prepucio y fue centrifugada a 1800 g a 25°C y por 5 minutos, se recolectó el precipitado para posteriormente observar la presencia de espermatozoides al microscopio (Leica DME®).

Para la obtención del eyaculado se estimuló por masaje prepucial la salida de orina, se lavó la región y se procedió a utilizar un electroeyaculador (Electroyac III, Ideal Instruments®) por un tiempo de 40 -60 segundos, con voltaje que osciló entre 12 y 20 voltios hasta la expulsión del liquido espermático. Este se observó al microscopio para determinar la presencia de al menos 50 millones de espermatozoide con al menos 10% de motilidad progresiva, con lo que se determinó finalmente que el animal estuviera en pubertad (27).

Periodos evaluados. En el experimento se evaluaron tres periodos así: a) prepuber (68 meses edad), b) prepuber (8-10meses de edad) verificando que estos animales no hubieran iniciado la pubertad al no presentar ninguna de las características descritas y c) inicio de la pubertad-pubertad (10m-

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pubertad), al presentar dichos signos. En los 2 momentos prepuber los animales fueron castrados unilateralmente, y en el momento 10 m-pubertad se les castró el testículo restante. Además, se recolectaron muestras de sangre a todos los animales desde los 6 meses de edad y hasta detección de llegada a pubertad, para la evaluación de testosterona y de leptina en suero.

los lineamientos de la ley 84 de 1989 acerca del uso de los animales vivos en experimentos o investigaciones.

Determinación de concentraciones de testosterona y de leptina. En tubos secos, se recolectaron muestras quincenales de sangre (3-5 ml) de la vena coccígea o yugular de los terneros desde los 6 meses de edad hasta la confirmación del inicio de la pubertad; la sangre se centrifugó a 1800 g a una temperatura de 25°C por 10 min en una centrífuga (IEC Centra GP8®) para la posterior extracción del suero y la medición de testosterona y de leptina por radioinmunoanálisis (RIA). Se envió la mitad del volumen de las muestras a la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá para medición de testosterona (T) por medio de la técnica de radioinmunoanálisis (RIA) con un kit comercial DPC Coat-A Count Total Testosterone®, con sensibilidad analítica para el procedimiento básico de 1 ng/dl y coeficiente de variación inter-ensayo de aproximadamente 7% (28). La otra mitad del volumen de las muestras de suero fue sometido a liofilización y enviado a la Universidad de West Australia para su reconstitución y lectura de leptina (Lept) por la técnica de RIA descrita por otros autores (29,30).

Purificación y análisis del ARN (para RTPCR). El ARN total fue purificado usando un Kit de aislamiento de ARN comercial (RNeasy Fibrous Tissue - Qiagen®); para la síntesis de la primera cadena de cADN se usaron 5 µg de ARN en un volumen total de reacción de 20 µl los cuales contenían Tris-HCl, KCl, MgCl2, DTT, dNTPs, Transcriptasa reversa (RevertAidTM M-MuLV Fermentas), y como primer se uso Oligo (dT)18 (Fermentas®), para confirmación de la RT-PCR el producto fue visualizado en un gel de agarosa al 1.5% conteniendo Bromuro de Etidio (0.7 µg/mL).

Castraciones (para purificación de ARNtotal y amplificación de ADN). Se realizaron castraciones unilaterales por grupos; fueron preanestesiados con Xilazine® a una dosis de 0.01 mg/kg vía intravenosa (IV) y atropina a una dosis de 0.04 mg/kg subcutánea (SC); adicionalmen t e , s e a d m i n i s t r ó anestesia local con Lidocaína® 3 ml en el cordón espermático. El postoperatorio se realizó con la aplicación de un antibiótico de amplio espectro (Penicilina-Estreptomicina) intramuscular (IM) a una dosis de 15000 UI/ kg antes del procedimiento quirúrgico. Todo el procedimiento descrito fue realizado luego de aprobación del comité de bioética de la Universidad de Antioquia (2006), siguiendo

Los testículos se transportaron refrigerados (4°C) en solución fosfato buffer (PBS) a pH 7.2 y se almacenaron a –20ºC hasta la utilización de las técnicas que determinaron la expresión de receptores de leptina.

Amplificación del ADN. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 50 µl, que contenían: 3 µg/mL de cADN; buffer de reacción 1X (10 mM Tris-HCl pH 9.0; 50 mM KCl; 1.1% Tritón® X-100);1 mM de MgCl2; 2 mM de cada dNTP; 0.1 µM de cada primer y 1.25 Unidades de Taq DNA Polimerasa (Fermentas®). La amplificación se efectuó en un termociclador PTC-200 (MJ Research Peltier Termal Cycler). Para la amplificación del receptor de leptina bovina (OBR) (acceso número U62385) fueron utilizados los primer: sentido (1-25) 5'-GTGCCAGCAACTACAGATGCTCTAC-3' y primer antisentido (356-380), ' 5 AGTTCATCCAGGCCTTCTGAGAACG-3' que codifican para el fragmento extracelular del receptor, sintetizados por MWG BIOTECH los cuales amplifican 2 fragmentos de 300 y 700 de pb aproximadamente (isoformas intermedia-OBRi y larga-OBRb).

Como gen de referencia se utilizó aquel que codifica para la enzima gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (acceso número U85042.1) para normalizar la expresión del receptor por medio del cálculo de la relación OBR/GAPDH. Los primers de la enzima GAPDH fueron los siguientes: sentido 5'-TGCTGGTGCTGAGTATGTGGT-3' y primer antisentido 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-

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3', sintetizados por MWG BIOTECH los cuales amplifican un fragmento de 295 pb. El perfil térmico para cada reacción consistió en una desnaturalización inicial de 94ºC por 3 min seguido por 45 ciclos a 94°C por 1 min, 65°C por 1 min, 72°C por 2 min, terminando con una extensión final de 72°C por 10 min. Los productos de la PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 2% conteniendo Bromuro de Etidio (0.7 µg/mL).

de edad con pulsos repetidos cada mes (pulsos de amplitud similar) y hasta los 11.5 meses de edad, esto es, en el período prepuber. Luego, se encontró un aumento marcado en la amplitud del pulso de testosterona con concentración máxima de 5.3 ng/mL, 1 a 2 semanas antes del inicio de la pubertad, seguido de caída de los niveles hacia los 13.5 meses de edad (Figura 1).

6,00

A cada una de las variables se le verificó normalidad de distribución de datos (Shapiro Wilk‘s W test); las variables de expresión de receptores OBR y de niveles de T fueron transformados a raíz cuadrada de los datos originales y alcanzaron normalidad; luego se realizaron análisis estadísticos descriptivos.

Tras comprobación de homogeneidad de varianzas (Levene), los niveles de receptores de leptina encontrados fueron analizados por ANAVA. Las diferencias entre promedios fueron comparadas por el test de Tukey con un nivel de significancia de (p<0.05).

Correlaciones entre niveles de expresión de receptores y entre receptores y niveles hormonales fueron analizados por medio del coeficiente de Spearman. Un valor de (p<0.05) fue considerado estadísticamente significativo.

RESULTADOS Testosterona en período prepuber. Los niveles de testosterona presentaron niveles detectables de 1 ng/mL desde los 7.5 meses

T e s to s te ro n a y le p tin a , n g /m L

5,00

Análisis estadístico. El paquete estadístico utilizado fue Statistica® para Windows 5.0, (1995) y los datos fueron presentados en promedios y desviación estándar (DE). Las variables analizadas fueron: hormonas testosterona y L en ng/ml y la expresión de isoformas del receptor de leptina (OBRi, OBRb) cuantificado en unidades arbitrarias.

Esto último se realizó con la normalización de los datos de expresión de las isoformas dividido en los datos de expresión del gen de referencia GAPDH, es decir obteniendo el coeficiente: expresión de isoforma numerizado/expresión de GAPDH numerizado, numerizaciones realizadas con el programa Biometra/BioDocAnalyser 2.0®.

4,00 Leptina

3,00

Tes tos terona

2,00

1,00

0,00 6

6,5

7

7,5

8

8,5

9

9,5

10

10,5 11 11,5 12 12,5 13

13,5

M e se s de e da d

Figura 1. Niveles de testosterona y de leptina en terneros holstein x cebú hasta la detección de la pubertad. Promedio ± DE de niveles de testosterona y de leptina en suero (ng/ml) de terneros HolsteinxCebú, desde los 6 meses de nacidos y hasta la edad promedio (12.75±1.06 meses) de la llegada a la pubertad indicada por la flecha.

Pubertad y testosterona. Cuando todos los animales estaban en un rango de edad entre 11.5 y 13.5 meses (promedio 12.75±1.06), con promedio de peso de 282.8Kg ±45.1, perímetro torácico de 149.5±9 cm, circunferencia escrotal de 22.3±1.7 cm y niveles de testosterona de 4.01±1.2 ng/mL (Figura 1) se determinó la llegada de la pubertad. Esto se corroboró además porque los terneros mostraron reflejo de protrusión de pene (desprendimiento del prepucio) al realizarse masaje, salida de una cantidad mínima de líquido seminal con espermatozoides, y presencia de espermatozoides en orina. Se observó igualmente la monta a otros terneros, erección del pene, inicio de reflejo de Flehmen (datos no mostrados).

Niveles de leptina. Las concentraciones de L no presentaron variación importante durante el período de muestreo (desde 6 meses y hasta 13.5 meses de edad).

Se encontraron dentro de un rango de 0.61 y 0.98 ng/mL y la concentración a

Ruiz - Asociación entre receptores de leptina en testículo

la pubertad fue de 0.91±0.05 ng/mL. Expresión de OBR en períodos prepuber y en pubertad. Según los oligonucleótidos o primers seleccionados, se detectaron 2 isoformas del receptor de leptina a las que se denominaron, según el peso molecular, forma larga OBRb (aprox. 700pb) y OBR intermedia (aprox. 300pb; Figura 2). La amplificación del gen GAPDH resultó en un fragmento de 295pb claramente visible en la figura 2. Luego de realizar normalización de la carga de muestras experimentales en los O BRb 6-8m

8-10m

pubertad

OBR/GAPDH, unidades arbitrarias

1,6

DISCUSIÓN GAPD H

*

* *

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Prepub 6-8

Prepub. 8-10

Pubertad

geles por medio del cálculo de su coeficiente con el fragmento numerizado del gen referencia GAPDH, se encontró diferencia estadística (p<0.05) entre la expresión del ADN de la isoforma OBR en las muestras de los terneros y aquella expresión en el tejido control positivo (testículo de animal adulto) se trata de una mayor expresión en las muestras de terneros en de los grupos 6-8, 8-10 y P, comparando con dicho control (Figura 2). La isoforma OBRb, presenta un patrón similar con una mayor expresión de OBRb en las muestras experimentales comparativo al control (Figura 2) pero sin diferencia estadística (p=0.08).

OBR C+

500pb 250pb

2209

Control +

Figura 2. Cuantificación de la presencia del gen del receptor de leptina en 2 isoformas en testículos de terneros holstein x cebú hasta el inicio de la pubertad.

Parte superior. foto representativa de las 3 repeticiones de la técnica de RTPCR, indicando donde se encuentran las bandas de las isoformas del gen de receptor de leptina,OBR, (aprox.

300 y 700pb) y del gen GAPDH. Se ubicaron en el gel de izquierda a derecha: pozo 1. escalera, 2-3. animales de 6-8 meses de edad, 4-6. animales de 8-10 meses, 7-11. animales en pubertad, 12. Control positivo, C+: testículo bovino adulto.

Parte inferior. expresión promedio ± DE de 2 isoformas (larga:negro; intermedia: blanco) en testículos de terneros HolsteinxCebú en período prepuberal (6 a 8 y 8 a 10 meses de edad) y en la pubertad. Los valores de ADN amplificado fueron normalizados por el gen GAPDH. Los asteriscos indican diferencia significativa con relación al C+.

Niveles de testosterona Testosterona en período prepuber.

Cambios en la secreción episódica de GnRH regula la secreción de gonadotropinas LH y FSH en terneros prepúberes lo que finalmente regula la función testicular. Ha sido ampliamente documentado desde hace más de tres décadas, que la amplitud y la frecuencia de los pulsos de LH cambian con el estado reproductivo del macho, que la secreción de LH y de testosterona es episódica y que existe una relación temporal entre estas dos hormonas en el toro (31).

La liberación de LH desde las semanas 8 a 10 de edad estimula la secreción permanente de testosterona por las células de Leydig que llega a niveles máximos hacia los 10 meses de edad de los terneros (31). Más recientemente, Rawlings et al (27) describen una fase de crecimiento rápido del testículo y de glándula sexuales accesorias dependientes de andrógenos en terneros luego del mes 5 de edad y hasta el mes 12, concomitante al aumento rápido progresivo de la secreción de testosterona.

En el presente estudio se encontró que la liberación episódica de testosterona se presentó en forma de pulsos mensuales desde el mes 8 de edad y hasta el mes 12 iniciando la pubertad (Figura 1).

Pubertad y testosterona. Los valores de edad, peso corporal, circunferencia escrotal

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y niveles de testosterona aqui presentados fueron anteriormente reportados hasta la pubertad para toretes venezolanos 5/8 Holstein y 5/8 Pardo Suizo con 5/16 de Cebú Brahman en ambos cruces (32), es decir en cruces entre Bos taurus y Bos indicus como lo utilizado en el presente estudio. La única variable que presentó datos similares a los del presente estudio fue la de circunferencia escrotal entre 22 y 23 cm. Es de notar que aunque la circunferencia escrotal esta referenciada como signo de llegada a pubertad que varía según las razas, se ha determinado como valor de referencia de llegada de pubertad un valor de 28 cm, valor que sobrepasa los anteriormente mencionados (27).

Para la variable de edad a la pubertad, los animales del presente estudio parecieron ser más precoces en 2 meses comparando con Aranguren-Méndez et al (32), sumado esto a niveles de testosterona marcadamente más altos (4.01 ng/ml en promedio vs. 1.7 ng/ml).

Comparando con una referencia menos reciente de cruces de Bos taurus (Angus, Hereford y Pardo Suizo) (33), las concentraciones de testosterona aqui obtenidas serían relativamente bajas ya que los autores informan de rangos entre 4.3 y 7.3 ng/ml medidos ente 7 y 13 meses de edad. Por otro lado, los niveles de testosterona que se encontraron entre 1 y 5.3 ng/mL están en concordancia con lo reportado en 2007 por Brito et al (34).

Es de interés resaltar que los animales a los que les fue extraído el primer testículo a partir del mes 6 de edad, llegaron a la pubertad más rápido (11.75±0.2) que aquellos con primera castración en el octavo mes (12.8±0.9). Respectivamente, presentaron niveles promedio de testosterona en todo el tiempo de medición de 0.6±0.3 y 1.6±0.5, con menor concentración en animales castrados tempranamente. Se sugiere que se trataría de animales, que de manera compensatoria luego de la castración unilateral, son más sensibles a niveles bajos de testosterona y alcanzan pesos corporales y perímetros torácicos relacionados con el crecimiento

corporal suficiente para iniciar pubertad a los 11.75 meses de edad. Sin embargo, esto es contrario a estudios de Barnes et al (35) donde terneros Holstein castrados unilateralmente mostraron de manera compensatoria incremento en el tamaño del testículo restante pero ninguna variación significativa en niveles de testosterona ni llegada a la pubertad más temprana al comparar con terneros control enteros (35,36).

Niveles de leptina. Se publicó previamente (34) que terneros prepúberes AngusxCharolais, presentan niveles de leptina que aumentan constantemente desde los 6.5 meses de edad de concentraciones de 2 ng/mL hasta niveles de 5 ng/mL a los 16.5 meses de edad pasando por el período de pubertad a los 11.5 meses con 4.5 ng/mL. En el presente trabajo, la variación mínima de leptina podría verse compensada por una expresión importante de 2 isoformas de su receptor (Figura 2) como se describe en más detalle adelante. Además, es de notar que los niveles de la hormona encontrados por los autores (34), no es comparable a las bajas concentraciones descritas en el presente estudio entre 0.61 y 0.98 ng/mL. En efecto, se debe considerar la mayor frecuencia con que se realizó el muestreo y el método de medición utilizado, ya que no se usó kit multiespecie (multi-species leptin RIA kit, Linco Research, St Charles MO, USA) pero si el método específico creado en Australia (RIA) basado en leptina bovinaovina con mayor sensibilidad (29,30).

Expresión de OBR en períodos prepuber y en pubertad. Estos receptores de leptina y su RNAm en testículo han sido encontrados en células de Leydig de rata (23,37-39) y en equinos (40), en plasma seminal, espermatozoides (41,42), y en túbulos seminíferos de humanos (42) y más recientemente en múltiples tejidos en bovinos (11). En este estudio se reporta igualmente expresión de 2 isoformas. La expresión de ambas isoformas de OBR se correlacionaron positivamente (r=0.82, p<0.01) en todos los terneros, sugiriendo posibles vías de

Ruiz - Asociación entre receptores de leptina en testículo

acción complementarias o conjuntas entre ellas para regular las acciones periféricas de la leptina como lo reportado recientemente en bovinos (11) y en otros sistemas (43).

Los niveles de t e s t o s t e r o n a y d e L presentan una correlación negativa con la expresión de OBRi y de OBRb (p>0.05), sugiriendo que a mayores niveles de testosterona, menor expresión de los receptores de leptina en testículo.

Tena-Sempere et al (38), estudiaron el desarrollo y la regulación hormonal del RNAm del OBR en testículo de rata, planteando la posibilidad de un efecto directo de los estrógenos en testículos en desarrollo (neonatos) sobre la modulación de la expresión del gene OBR. Durante el periodo de desarrollo testicular puberal, encuentran un aumento de la expresión de receptores, como los encontrados y plantean los autores, se explicaría por el efecto de hormonas como la leptina, la hCG y la FSH; finalmente, encuentran disminución de la expresión en animales adultos. Se propone que en este estudio también habría efecto de los niveles de testosterona en la regulación de expresión de estos receptores.

Los pocos estudios que se han realizado usando el modelo bovino, han sido en hembras y más a nivel central que local (12), en machos bovinos no se han realizado estudios que expliquen el rol de la leptina en la pubertad.

En el presente trabajo se sugieren interesantes efectos locales de la leptina relacionados con el inicio de la pubertad y aunque se haya

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reportado anteriormente que tratamientos exógenos con leptina recombinante para lograr este efecto han sido infructuosos (44), futuros usos terapéuticos con leptina recombinante que aborden diferentes estadios nutricionales y que tengan en cuenta la identificación de marcadores para genotipificación de la resistencia a la leptina deberían investigarse en el macho.

En conclusión, exite expresión de receptores de leptina en testículo de bovinos prepúberes y presentan la tendencia a aumentar mientras se acerca la pubertad. Esto podría indicar un posible rol de la leptina hacia la llegada de la pubertad. La regulación de la expresión de estos receptores está dada por un gran número de factores, entre ellos posiblemente, los niveles de testosterona circulantes, aunque harían falta estudios con mediciones periódicas de los receptores y de la hormona para verificar este supuesto. La expresión de 2 isoformas del gene de OBR hacia la llegada a la pubertad en bovinos sugiere una posible actividad conjunta y/o complementaria de estos 2 receptores para que la leptina desencadene sus efectos, pero se necesitan mayores estudios a nivel molecular y de vías de señalización para dilucidar este fenómeno.

Agradecimientos A Colciencias-Colombia, proyecto 115-1216774, por la financiación del proyecto. A la ganadería Los Balcones y su propietario por el mantenimiento de los animales del experimento.

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Rev.MVZ Córdoba 15(3):2215-2222, 2010.

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ORIGINAL

Diagnóstico clínico-microbiológico de otitis externa en caninos de Bogotá – Colombia Clinical – microbiological diagnostic of external otitis in canines in Bogotá - Colombia Adriana Pulido V,

1

M.Sc, Rubiela Castañeda S, 1 M.Sc, Melva Linares L, Marcela Mercado G, 3 M.Sc.

2

M.Sc(c),

Pontificia Universidad Javeriana (PUJ). Facultad de Ciencias (FC). Departamento de Microbiología (Mic). Área de diagnóstico veterinario. 2 PUJ-FC-Mic. Área de Micología. 3 PUJFC-Mic. Área de Epidemiología. Bogotá D.C. Colombia. *Correspondencia: adriana.pulido@javeriana.edu.co 1

Recibido: Septiembre 2 de 2009; Aceptado: Marzo 21 de 2010

RESUMEN Objetivo. Evaluar clínica y microbiológicamente la implicación de Malassezia sp como agente etiológico de otitis externas en caninos. Materiales y métodos. Se obtuvieron 166 muestras de hisopados óticos de caninos con sintomatología y hallazgos clínicos compatibles con otitis externa durante el periodo comprendido entre julio – diciembre 2008. A partir de las muestras se realizaron cultivos bacteriológicos y micológicos e identificación de género mediante perfiles bioquímicos para cada unos de los microorganismos aislados. Los datos clínicos asociados a la patología fueron consignados en una base de datos y posteriormente analizados en el programa estadístico SPSS 17 Resultados. A partir de la 166 muestras obtenidas 98, (59%) de ellas fueron positivas para el cultivo bacteriológico con predominio de Staphylococcus sp 37% (61) y 73% (121) positivas para Malassezia. De las 121 levaduras aisladas 32.2% fue Malassezia pachydermatis. El análisis estadístico no evidenció diferencias significativas con respecto a las relaciones entre variables (género, edad, raza, tipo de oreja y respuesta inflamatoria por citología) y el aislamiento de Malassezia sp. El nivel de significancia establecido para la prueba fue de 0.05%. Conclusiones. No se observaron asociaciones estadísticas entre las variables género, edad, raza frente a la otitis externa por Malassezia sp. Malassezia sp fue aislada en un 73% de los casos con otitis externa, con participación de diferentes agentes bacterianos especialmente Staphylococcus sp, otitis externa, con participación de diferentes agentes bacterianos especialmente Staphylococcus sp.

Palabras clave: Canino, otitis externa, Malassezia sp., Staphylococcus sp.

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ABSTRACT Objective. To evaluate clinically and microbiologically implication of Malassezia sp as an etiologic agent of external otitis in canines. Materials and methods. 166 samples of otic swabs in canines with symptoms and clinical findings consistent with external otitis were obtained during the period between July and December 2008. Bacteriological and mycological cultures were carried out from the samples, identification using biochemical profiles for each of the isolated microorganisms were done. Clinical data associated with the disease was entered into a database and then analyzed with the SPSS 17 statistical program. Results.

From the 166 samples 98, (59%) of them were positive for bacterial culture with a predominance of Staphylococcus sp 37% (61) and 121 (73%) were positive for Malassezia. Of the 121 yeast isolates, 32.2% were Malassezia pachydermatis. Statistical analysis showed no significant difference regarding the relationship between variables (gender, age, race, type of ear or inflammatory response by cytology) and the isolation of Malassezia sp. The significance level for the test was set on 0.05%. Conclusions. There were no statistical associations between the gender, age, or race variables and external otitis by Malassezia sp. Malassezia sp was isolated in 73% of patients with external otitis, involving different bacterial agents especially Staphylococcus sp.

Key words: Canine, external otitis, Malassezia sp., Staphylococcus sp.

INTRODUCCIÓN Las enfermedades óticas son entidades de frecuente presentación en medicina de pequeños animales, siendo la otitis externa una de las patologías auditivas más comúnmente diagnosticadas, ésta se define como una inflamación del canal auditivo externo (1-3).

Dentro de las posibles etiologías de otitis externa se encuentran en primer lugar causas primarias de la enfermedad como son cuerpos extraños y presencia de parásitos dentro del canal, enfermedades de tipo alérgico y/o autoinmune y desórdenes de la queratinización principalmente; en segundo lugar existen factores predisponentes como el tamaño y la posición de la oreja, humedad excesiva de la misma, factores iatrogénicos, y disminución de la luz del canal auditivo lo que impide un adecuado drenaje de las secreciones óticas (2,3). Adicionalmente existen otros factores asociados a la enfermedad como son la presencia de bacterias y/o levaduras así como los procesos infecciosos del oído medio que juegan un papel importante en los casos de otitis recurrentes (2).

Uno de los principales agentes etiológicos involucrados con los procesos de otitis externa

en caninos son las levaduras, dentro de las cuales se encuentran implicadas aquellas pertenecientes al género Malassezia.

Malassezia es una levadura lipofílica considerada como flora cutánea y ótica normal, la cual puede convertirse en patógena de acuerdo con las condiciones microambientales del canal auditivo del hospedero y a las alteraciones del sistema inmunológico (2,4-7).

A excepción de M. pachydermatis todas las levaduras pertenecientes al género Malassezia son lipodependientes (4, 8-10) ya que utilizan ácidos grasos de cadena larga (ácido oléico, linoléico, palmítico, mirístico) como fuente de carbono lo que hace necesaria su inclusión en los medios de cultivo artificiales como el Dixon (5,6,10,11) y Leming’s que garantizan un óptimo crecimiento (12,13). La temperatura ideal para su desarrollo es de 32°C (31–35°C) por un periodo de incubación de 7 días, después de los cuales se observan características macroscópicas de las colonias como: color blanco-amarillento, pequeñas, lisas o levemente rugosas, brillantes o mates; sin embargo, microscópicamente se observan algunas variaciones en forma y tamaño entre especies; junto con las pruebas de catalasa,

Pulido - Diagnóstico clínico-microbiológico de otitis externa en caninos

ureasa, esculina y patrones de asimilación de lípidos es posible realizar la identificación de especie (8,10,12,14).

Otros patógenos importantes en los procesos óticos son las bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas, de las cuales algunas se pueden encontrar como flora normal del canal auditivo pero que bajo condiciones que permitan una colonización masiva ocasionan un proceso patológico; las más comúnmente asociadas con otitis son Staphylococcus intermedius, Pseudomonas aeruginosa (importante en otitis crónica), Proteus mirabilis, Escherichia coli, Corynebacterium spp, Enterococcus spp, y Streptococcus spp (2,8).

En estudios preliminares realizados por el grupo de investigación UNIDIA de la Pontificia Universidad Javeriana, se detectó en la ciudad de Bogotá una prevalencia de consultas por problemas óticos del 20%, del cual el 40% estuvo relacionado con otitis externa y/u otitis causadas por levaduras; llegando al diagnóstico definitivo solo por el examen clínico (75%) y en ocasiones con citología exfoliativa (15%). Teniendo en cuenta este análisis, el objetivo del trabajo fue realizar el diagnóstico microbiológico en pacientes que fueron llevados a consulta en cuatro (4) clínicas veterinarias de Bogotá, durante el periodo de julio – diciembre de 2008, y de esta manera realizar el primer reporte en el país sobre aislamientos de levaduras del género Malassezia spp asociadas a patologías óticas en caninos.

MATERIALES Y METODOS Recolección de datos. Para la obtención de los anamnésicos de los pacientes se diseñó un formulario en el que se consignaron los datos correspondientes a edad, género, raza, antecedentes de problemas óticos, realización de tratamientos caseros y/o farmacológicos para ser analizados y determinar su correlación con la presentación del cuadro clínico.

Obtención de las muestras. Se seleccionaron 4 clínicas veterinarias en la ciudad de Bogotá, en las cuales se hicieron

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los muestreos por un periodo de seis meses.

Se obtuvieron 166 hisopados óticos de caninos que presentaban sintomatología compatible con otitis externa. La muestra de la(s) oreja(s) afectadas se obtuvo con un hisopo de algodón estéril (cultturete ®) previamente impregnado con solución de transporte Tween 20 al 0.05%, garantizando así un ambiente lipofílico, el cual fue utilizado para cultivo. Se tomó un segundo hisopo para análisis citológico y evaluación bacteriológica.

Cepas de referencia. Se utilizaron las cepas CBS: Malassezia furfur 7019, Malassezia pachydermatis 1879, Malassezia symphodialis 7222, Malassezia restricta 7877, Malassezia slooffiae 7956, Malassezia globosa 7966.

Aislamiento bacteriano. Las muestras se sembraron en agar sangre para la evaluación y clasificación del crecimiento bacteriano.

Procesamiento de las muestras.

Aislamiento primario e identificación bioquímica. Las muestras se sembraron en agar sangre, se incubaron a 37°C por 24–48 horas y se procedió a la identificación bacteriológica siguiendo los estándares de clasificación; adicionalmente para el aislamiento de levaduras se utilizó agar Sabouraud y agar Dixon´s, fueron incubados a 32°C evaluándose crecimiento a los 2, 5 y 7 días, una vez identificadas las características morfológicas de crecimiento, se realizaron pruebas bioquímicas como determinación de ureasa, hidrólisis de bilis esculina (10,15), crecimiento en agar Sabouraud, asimilación d e Tw e e n 2 0 , 4 0 , 6 0 y 8 0 ( 1 0 , 1 1 ) y asimilación del cremophor (16).

Citología exfoliativa. Se realizó coloración de Gram y Wright para determinar la presencia o ausencia de bacterias, levaduras y reacción inflamatoria. La lectura se realizó teniendo en cuenta la escala semicuantitativa por cruces (de + a ++++) indicando el tipo de morfología bacteriana y su ordenamiento; para levaduras se tuvo en cuenta la escala propuesta por Nobre et al (17) con algunas modificaciones de acuerdo

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a lo observado en el medio de estudio, negativo, + de 1 a 5 células/campo, ++ de 6 – 10 células/campo, +++ de 10 a 19 células por campo y ++++ > 19 células/campo (17).

Análisis estadístico. Se realizó un estudio prospectivo, descriptivo y transversal. Los datos fueron analizados utilizando el programa estadístico SPSS-17.0. Se realizaron pruebas de c2 y de asociación estadística (OR) entre la variable dependiente (cultivo positivo para Malassezia sp) y las variables independientes (tipo de oreja, edad, género y respuesta inflamatoria por análisis citológico), el valor de significancia establecido fue (p<0.05).

Se encontró una mayor presentación de otitis en machos (61.4%) comparado con las hembras (34.3%); sin embargo el análisis estadístico no mostró diferencias significativas (p=0.87).

Clínicamente los principales signos evidenciados en los pacientes con oreja pendulosa (N= 124) fueron el prurito con un 80.7% (n= 100), la inflamación en el 73.4% (n=91) y el exudado oscuro con un 71% (n=88) como se puede observar en la figura 2.

RESULTADOS De los 166 caninos que consultaron las diferentes clínicas veterinarias, se evidenció que los pacientes con oreja pendulosa tuvieron una mayor predisposición a la presentación de patologías óticas con un 74.7% (n=124), estas razas fueron: French Poodle con 19.9% (n=33), Labrador Retriever con un 16.9% (n= 28) y Golden Retriever con 12.7% (n=21) en comparación con la razas de oreja erecta; sin embargo, el análisis estadístico no evidenció diferencias significativas entre el tipo de oreja y la presentación de otitis (p=0.23). Con respecto a la edad la mayor predisposición se observó en animales entre 3 y 6 años (37 a 72 meses) donde el porcentaje de patología ótica fue de 25.9% (n=43), estadísticamente no se observaron diferencias significativas entre los rangos de edades (p=0.31) (Figura 1).

Figura 1. Porcentajes de presentación de otitis con respecto a las variables: Tipo de oreja, edad/meses y sexo.

Figura 2. Porcentaje de sintomatología ótica según el tipo de oreja.

A todos los pacientes (N=166) que ingresaron en este estudio se les realizó análisis citológico a partir de hisopados óticos observándose diferentes grados de reacción inflamatoria mediada principalmente por polimorfonucleares (Tabla 1A). Con respecto a la variable dependiente no se observaron diferencias estadísticamente significativas (p=0.12). En cuanto a la presencia de microorganismos evaluada mediante coloración de Gram se encontraron Bacilos Gram positivos (n=11) y Gram negativos (n=9), así como cocos Gram positivos (n=64) y estructuras con morfología compatible con levaduras (n= 99) (Tabla 1B, C y D), con lo que se evidencia que los microorganismos predominantes en el canal auditivo fueron cocos gram positivos y levaduras en una proporción entre ocasionales a 2+.

Se obtuvo un 59% (n=98) de muestras positivas para cultivo bacteriológico y el 73% (n=121) de muestras positivas al cultivo de levaduras (Tabla 1.E); del total de muestras el 28.3% (n=47) tuvieron aislamientos mixtos.

Pulido - Diagnóstico clínico-microbiológico de otitis externa en caninos

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Tabla 1. Evaluación citológica y microbiológica de hisopados óticos.

Los aislamientos bacterianos hallados en mayor proporción fueron: Staphylococcus sp en monocultivo con un 36.8% o en compañía de otros como Streptococcus a, b, g hemolíticos, Pseudomonas sp, E. coli, Klebsiella sp en el 10.8%, de la misma manera cada uno de estos microorganismos se encontraron en monocultivo o en aislamientos mixtos.

De las 121 muestras con positividad al cultivo (monocultivo o mixto) de levaduras, el 12.4% (n=15) correspondió Malassezia furfur y a Malassezia pachydermatis el 32.2% (n=39); los demás aislamientos 52.1% (n=63) se identificaron como Malassezia spp teniendo en cuenta los patrones descritos por Güehó et al (10) y Guillot et al (11) dadas las reacciones atípicas obtenidas en las pruebas metabólicas realizadas (Figura 3).

Figura 3. A1. Cremophor negativo, A2. Cremophor positivo. B. Ubicación de los Tweenes en los diferentes pozos. C. Asimilación de todos los Tween. D.Tween 20 negativo. E. Tween 20, 40 y 60 negativos.

F. Tween 20 y 40 negativos.

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DISCUSIÓN Los hallazgos de acuerdo con el tipo de oreja mostraron una mayor prevalencia de otitis para aquellas razas con orejas pendulosas (74%) dentro de las cuales se destacan: French Poodle, Labrador Retriever y Golden Retriever con 19.9%, 16.7% y 12.7% respectivamente; contrario a lo reportado por Crespo et al (13), quienes hallaron un mayor porcentaje de presentación en una raza con oreja erecta como lo es el pastor alemán (20.2%), seguida por razas criollas y Cocker Spaniel con 19.7% y 15.9% respectivamente, al igual que los reportado por Nobre et al (17) quienes encontraron un 92.3% de los pacientes con orejas erectas con cultivos positivos a Malassezia pachydermatis, mientras los de oreja pendulosa correspondieron al 71.6% .

De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre la presentación de otitis por Malassezia sp relacionada con el tipo de oreja del paciente; estos resultados concuerdan con lo reportado por Masuda et al (6), quienes tampoco reportan esta diferencia.

El rango de edad donde se halló una mayor proporción de problemas óticos se dio entre los 3-6 años (25.9%), lo que concuerda parcialmente con lo observado por Girao et al (7) quienes obtuvieron rangos de mayor presentación en edades de 1- 3 años (44.7%) y de 4 – 6 años (35.7%); en el análisis estadístico no se observaron diferencias significativas en cuanto a la variable edad al igual que lo observado por Crespo et al (5).

En cuanto a la variable género al igual que en diferentes reportes no se observaron diferencias significativas (5,7).

Con respecto a la sintomatología clínica, los resultados arrojaron en su orden un mayor porcentaje de presentación para prurito (80.7%), inflamación (73.4%) y exudado (71.0%) independientemente del tipo de oreja; mientras que Masuda et al (6), consideran como principal signo la abundante secreción ótica con un 79.16%; por su parte

Nobre et al (17), reportaron que los signos predominantes fueron eritema y secreción con un 51.3%. En general se pudo observar una concordancia en cuanto a los principales signos clínicos de pacientes con otitis en este estudio, al compararlo con otras investigaciones internacionales.

Malassezia pachydermatis, ha sido frecuentemente implicada como el principal agente etiológico de las otitis externas en caninos, así lo afirman Crespo et al (5), Nobre et al (17), Sallerller y Kirkan (18), Petrov y Mihaylon (19), Oliveira et al (20) al reportarla en casos clínicos en un 62.2%, 76.5% y 73% respectivamente; los resultados obtenidos en este análisis comparten parcialmente lo observado por estos autores, aunque el porcentaje de asilamiento de M. pachydermatis fue de 32.3%; sin embargo, esto contrasta con otros reportes como el de Sarierler y Kirkan (18), quienes hallaron porcentajes muy bajos de esta especie (5.1%). Por otra parte, el 52.1% correspondió a Malassezia sp, dado que los patrones de asimilación metabólica no coincidieron con los perfiles establecidos por Guého et al (10); Guillot et al (11) y Mayser et al (16). Con respecto a las especies lipodependientes se halló un 12.4% de aislamientos correspondientes a Malassezia furfur frente al 4.5% reportado en otras investigaciones (5,7,19).

A diferencia de lo obtenido por otros autores como Nobre et al (17), Oliveira et al (20), Sarierler y Kirkan (18) donde Candida albicans fue encontrada en un 2%, 3% y 12.82% respectivamente, en el presente estudio no se presentó ningún aislamiento.

Los aislamientos de tipo bacteriano implicados en los procesos óticos correspondieron principalmente a Staphylococcus sp con un 36.8%, siendo esta bacteria reconocida como parte de flora normal; la asociación con Malassezia pachydermatis se dio en un 19.9% de los casos analizados, mientras para otros autores esta asociación se dio en porcentajes altos como del 54.8% (20), pero coinciden con los reportado por Nobre et al (17), donde la relación está en un 19.2% y con Petrov y Mihaylov (19), quienes obtuvieron un 18.8%.

Pulido - Diagnóstico clínico-microbiológico de otitis externa en caninos

En aislamientos adicionales, el 10.8% fue identificado como Streptococcus a, b, g hemolíticos, Pseudomonas sp, E. coli, Klebsiella sp y Proteus sp hallados en cultivo puro o en asociaciones entre ellos y/o con Staphylococcus sp, hallazgos acordes con el 12% reportado por Oliveira et al (20); sin embargo, contrasta con el 37.5% de Petrov y Mihaylov (19) y el 33.4% de Nobre et al (17), aunque coinciden los géneros bacterianos reportados, dentro de los cuales Pseudomonas sp es reconocido como el de mayor implicación dada sus características patogénicas. Todos estos agentes pueden llegar a complicar la presentación de la enfermedad llevando a otitis recurrentes como se evidenció en estudios preliminares realizados por el grupo de investigación, en los que el porcentaje de recurrencia observado fue 12.5%.

En conclusión, se evidenció que la presentación de la patología es independiente del género, la edad y la raza; así mismo la severidad de la otitis es independiente del tipo de oreja; con respecto a las manifestaciones clínicas que predominaron fueron el prurito, la inflamación y el exudado oscuro quedando descartada como signo típico la inapetencia.

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Se estableció la implicación de las levaduras pertenecientes al género Malassezia sp en los casos de otitis externa en caninos de Bogotá con un 73% en ocasiones asociadas a agentes bacterianos causando sintomatología más severa.

Siendo este el primer estudio realizado en Colombia sobre el aislamiento de Malassezia sp en caninos con problemas óticos, se demuestra la importancia del diagnóstico microbiológico con el fin de establecer el/los agentes etiológicos involucrados; adicionalmente si se tienen en cuenta los resultados obtenidos es necesario realizar una identificación molecular para determinar las especies de este género de levaduras implicadas en la epidemiología de las otitis en el país.

Agradecimientos Dr. Carlos Moreno T. y Dr. Olimpo Oliver E., Universidad Nacional de Colombia, Laboratorio Clínico de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, a la Clínica de pequeños animales, ABANIMAL, al Centro de Especialidades Veterinarias (CEV) y Zoovida (EPSA) y al Laboratorio de Micología, Pontificia Universidad Javeriana.

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Rev.MVZ Córdoba 15(3):2223-2233 2010.

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ORIGINAL

Remoción de semillas por roedores en un fragmento de bosque seco tropical (Risaralda-Colombia) Seed removal by rodents in a fragment of dry tropical forest (Risaralda-Colombia) Felipe Vélez-García, 1,* B.Sc, Jairo Pérez-Torres,

1

Ph.D.

Pontificia Universidad Javeriana, Unidad de Ecología y Sistemática (UNESIS), Laboratorio de Ecología Funcional (LEF). Cra. 7 No. 43-82, Edificio 54, Laboratorio 406B. Bogotá D.C., Colombia. * Correspondencia:velez.j@javeriana.edu.co 1

Recibido: Octubre 14 de 2009; Aceptado: Marzo 21 de 2010

RESUMEN Objetivos. Los roedores son los mayores depredadores de semillas en ecosistemas neotropicales, sin embargo, la fragmentación afecta su presencia y por ende la depredación de semillas. Materiales y métodos. Se reconoció el porcentaje y la tasa de remoción de semillas por roedores en zonas de interior, borde y pastizal de un fragmento de bosque seco en el sector Cerritos – La Virginia (Risaralda–Colombia). Entre marzo y julio de 2003 se identificaron los roedores presentes en el bosque con la ayuda de 60 trampas Sherman ubicadas en diferentes zonas del fragmento. Para obtener el porcentaje y la tasa de remoción de semillas por roedores fueron aplicados dos experimentos (primero en junio y el segundo en julio) con un diseño de bloques aleatorios usando tres tipos de encierros: total (acceso a insectos), parcial (acceso a roedores) y control (acceso a cualquier organismo), teniendo en cuenta la ubicación en el fragmento (interior-borde-pastizal). Durante el primer experimento (junio) fueron utilizadas7200 semillas de Samanea saman y 6000 semillas durante el segundo (julio). Resultados. Se capturaron 4 individuos de Heteromys australis al interior del bosque.

En junio 1577 (44.87%) semillas fueron removidas por los roedores al interior del bosque. En julio se removieron 1620 semillas de las cuales el 60.5% fue por roedores al interior del bosque. Conclusiones. Los resultados reflejan una mayor remoción de semillas por roedores al interior del bosque donde el riesgo de depredación y la disponibilidad de refugio son más altos.

Palabras clave: Depredación, semillas, Samanea saman, roedores, Heteromys australis, Colombia.

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ABSTRACT Objectives. Rodents are the biggest seed predators in Neotropical ecosystems, however, fragmentation affects their presence, therefore seed predation. Materials and methods.

The percentage and removal rate of seeds by rodents was recognized in areas of interior, borderline and pasture of a dry forest in the area of Cerritos – La Virginia (Risaralda– Colombia). Between March and July 2003, rodents present in the forest were identified with the aid of 60 Sherman traps located in different areas of the fragment. To obtain the percentage and removal rate of seeds by rodents, two experiments were conducted, (the first in June and the second one in July) with a random block design, using three types of closures: total (access to insects), partial (access to rodents) and control, (access to any organism), taking into account the location within the fragment (interior, borderline, or pasture). During the first experiment (June) 2700 seeds of Samanea saman were used and during the second one (July) 6000 seeds were used. Results. Four individuals of the Heteromys australis species were captured in the interior of the forest. In June 1577 (44.87%) seeds were removed out by rodents within the interior of the forest. In July 1620 (60.5%) seeds were removed out by rodents within the interior of the forest. Conclusions. The results show a higher seed removal by rodents within the interior of the forest where the risk of predation and refuge availability is higher.

Key words: Predation, seeds, Samanea saman, rodents, Heteromys australis, Colombia.

INTRODUCCIÓN

En ecosistemas neotropicales los roedores son considerados los mayores consumidores de semillas (1,10-12). Sin embargo, problemas como la fragmentación alteran la presencia de roedores en un área determinada, afectando también procesos como la remoción y depredación de semillas y por consiguiente la regeneración de bosques y de áreas degradadas (7,11,13).

vegetal a nivel del suelo y del dosel, la competencia por explotación de recursos y la distancia a diferentes límites (bordes) de vegetación (4,14-16). Estos factores se encuentran asociados a la fragmentación de los bosques y a condiciones resultantes de la fragmentación como el tamaño y la forma del fragmento y el tipo de matriz circundante (17). En este sentido la fragmentación de los bosques afecta la presencia y actividad de los roedores en los ecosistemas, especialmente en hábitats de borde donde la densidad y actividad varían dependiendo de la capacidad de adaptación de las especies a las nuevas condiciones resultantes de la fragmentación (4,14,18).

Dado lo anterior la depredación de semillas en hábitats fragmentados y especialmente en los bordes puede variar dependiendo de la disponibilidad de semillas y de la estructura y composición del ensamblaje de roedores, presentando un efecto cascada en la interacción planta-roedor (11,19).

El uso del espacio por roedores para el forrajeo varía en función de factores como: la cantidad de luz, parámetros meteorológicos asociados, la densidad y tipo de cobertura

Aunque se han desarrollado diversos estudios para evaluar el efecto de borde sobre la remoción o depredación de semillas, los resultados son contradictorios respecto al

La depredación de semillas juega un papel importante en la dinámica poblacional de las plantas, limitando la regeneración natural de los bosques y afectando su composición y estructura (1). Los roedores son de gran importancia en la ecología de las plantas gracias a procesos como la dispersión de semillas (2,3), el establecimiento de plántulas (1,4-6) y la depredación de semillas (1,3,6-9), siendo organismos m o d e l o p ara identificar los efectos ocasionados por esta en la distribución y dinámica de poblaciones vegetales (8).

Vélez - Remoción de semillas por roedores

hábitat (interior o borde) en el que se presenta mayor depredación (11,19). La depredación de semillas y el reclutamiento de plántulas es un proceso complejo de múltiples estados y aún es poca la información generada para entender bien este proceso especialmente en su relación con el efecto de borde en ambientes fragmentados (19).

En Colombia, los bosques secos del Valle del Cauca y los sub-húmedos de Risaralda son de gran importancia para el sostenimiento de la fauna, así como para la regulación hídrica de la zona (20). Actualmente la deforestación a causa de la agricultura, la ganadería extensiva y el urbanismo son las principales amenazas que enfrenta (20).

El objetivo de este trabajo fue reconocer si el porcentaje y la tasa de remoción de semillas por roedores cambian de acuerdo con el tipo de hábitat (interior-borde-exterior) en un fragmento de bosque montano seco en el sector Cerritos-La Virginia, municipio de Pereira (Risaralda- Colombia).

MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio. El estudio se desarrolló en la Hacienda Cristales, Vereda el Cauquillo, sector Cerritos-La Virginia, municipio de Pereira (Risaralda), Colombia. Esta comprende una zona boscosa transicional entre bosque seco tropical (bs-T) y bosque húmedo premontano (bh-PM), alrededor de los ríos Otún y Cauca, ubicada entre 900 y 1200 m de altitud, con una extensión aproximada de 96.25 ha. Presenta una precipitación anual de 1500-3000 mm/ha, con una humedad relativa de 70-80% y una temperatura promedio anual de 18-24°C (20).

La vegetación más común está compuesta por matorrales donde domina la zarza (Mimosa pigra), guayabo de loma (Psodium guineensis), maugle (Escallonia sp.) y el rascador (Mauria ovalifolia). En las vegas de los ríos se encuentra cañabrava (Gynerium sagittarium), carbonero (Calliandra sp.), chagualo (Rapanea guianensis), cedrillo (Guarea sp.), moro (Brysonima cumingana), cedro (Cederia sp.), cassias y cámbulos.

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Actualmente también se aprecian potreros de ganadería extensiva y pequeños relictos de Guadua (Guadua angustifolia) (20).

Métodos. El estudio se desarrolló de marzo a julio de 2003 (correpondiente a los periodos lluvioso y seco en el área de estudio) teniendo en cuenta dos componentes: 1) captura de roedores y 2) experimentos de remoción de semillas.

Captura de roedores. Para la captura de roedores se utilizaron 60 trampas Sherman 8 cm x 9 cm x 23 cm, en las que se utilizó como cebo avena en hojuelas y mantequilla de maní. Entre marzo y junio de 2003 las trampas fueron instaladas en diferentes puntos del pastizal y del bosque, buscando los sitios más propicios para la presencia de roedores. Las trampas se mantuvieron activas las 24 horas del día, para un esfuerzo de muestreo de 2552 trampas-noche al interior del bosque y 480 trampas-noche en el pastizal. En junio, tiempo en el que se iniciaron los experimentos de remoción de semillas, las trampas fueron colocadas entre los transectos experimentales (al interior y en el borde) a excepción del pastizal, ya que no hubo indicios de roedores durante los muestreos anteriores en esta zona. En cada una de las zonas se trazó un transecto de 130 m, separado a un mínimo de 35 m de los transectos del experimento. En cada transecto se colocaron 14 trampas Sherman separadas cada 10 metros. Los ejemplares capturados fueron medidos y pesados para su posterior identificación.

Remoción de semillas. Para medir la remoción de semillas se realizaron dos experimentos de exclusión (en los meses de junio y julio, respectivamente) utilizando hábitat de interior, borde y pastizal. En cada hábitat se trazaron dos transectos de 180 m cada uno, manteniendo una distancia mínima de 200 m entre el final del primer transecto y el comienzo del segundo, y ubicados de forma paralela al borde del bosque. Los transectos del interior fueron trazados en el centro del fragmento, los del borde fueron trazados a una distancia de 10 m desde el borde físico hacia el interior del fragmento de bosque y los transectos del pastizal fueron trazados a 10 m contados

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desde el borde físico del bosque hacia el exterior. En cada transecto, se ubicaron 10 parcelas experimentales de 2x2m, distanciadas 20 m desde el centro de una parcela hasta el centro de la siguiente.

Cada parcela fue divida en cuatro cuadrantes de 1x1m, de los cuales se escogieron aleatoriamente tres para ubicar los tratamientos.

Se establecieron tres tratamientos: 1) Tratamiento “exclusión total”, el cual permitió la entrada de invertebrados pero evitó el ingreso de roedores, aves y otros vertebrados predadores de semillas. 2) Tratamiento “exclusión parcial”, que permitió el ingreso de insectos y roedores, pero impidió el acceso de otros organismos como aves y mamíferos medianos y grandes. 3) Tratamiento “sin exclusión” el cual permitió el acceso a cualquier organismo presente en la zona.

Los tratamientos consistieron en colocar, a manera de encierro, cubos de malla plástica de 20 x 20 x 10 cm, con un ojo de 0.5 x 0.5 cm, en el centro de cada uno de los cuadrantes previamente seleccionados. Para el tratamiento “exclusión total” (ET), las caras laterales de los cubos de malla se dejaron intactos (cerrados), mientras que en el tratamiento “exclusión parcial” (EP), se hicieron orificios de 5.0 cm de ancho x 3.5 cm de alto en las caras laterales del cubo, para permitir el ingreso de roedores, manteniendo los demás lados cerrados. Para el tratamiento “sin exclusión” (SE) no se utilizó encierro, permitiendo el acceso a las semillas por parte de cualquier organismo del bosque. En cada encierro se colocó un plato de icopor de 12 cm de diámetro, sobre el cual se depositaron 40 semillas de Samanea saman, la cual es una especie característica de bosque seco tropical, presente en pastizales y zonas abiertas, y con alto potencial agroforestal (21). Las semillas cuyo tamaño promedio es de 1.0 cm de largo por 0.7 cm de diámetro fueron colectadas de diferentes árboles presentes en la zona.

El primer experimento se llevó a cabo del 9 al 20 de junio de 2003. Para este experimento se utilizó un total de 7200 semillas las cuales se revisaron cada tercer día. Se registró el

número de semillas removidas o con marcas de depredación (roídas o con infección de escarabajos) que implicaran que ya no fuesen viables. El tiempo de duración del experimento se determinó como el momento en que se removió el 50% (800 semillas) de las semillas de alguno de los tratamiento con acceso a roedores (tratamientos EP y SE) en cualquiera de los hábitats (interior, borde y pastizal). Para el caso del pastizal, solo se obtuvieron datos de remoción de uno de los transectos trazados ya que el ganado presente en los pastizales destruyó las parcelas experimentales.

El segundo experimento se desarrolló del 13 al 25 de julio de 2003. Para este se utilizaron 6000 semillas de S. saman debido a la poca disponibilidad de semillas durante esta época del año; en este caso solo se utilizó un transecto en el borde, mientras que para el interior y el pastizal se utilizaron los mismos transectos del primer experimento. La revisión se realizó cada tres días registrando el número de semillas removidas o con marcas de depredación. El tiempo de finalización para este experimento fue el mismo que en el primer experimento.

Análisis de información. Para analizar la remoción de semillas se calculó un valor de remoción neta, que permitió una aproximación a la posible remoción por roedores (para el caso del tratamiento EP) y otros vertebrados de mediano o gran tamaño (tratamiento SE).

La remoción neta se calculó restando los valores de remoción total (observada en campo) para los tratamientos de la siguiente manera: Para el tratamiento EP (remoción por roedores), se restaron los valores de la remoción observada en el tratamiento ET (remoción por insectos), para el tratamiento SE (otros vertebrados) se restaron los valores de remoción observada en los tratamientos ET (remoción por insectos) y EP (remoción por roedores). Los valores de remoción neta obtenidos para los tratamientos, fueron los valores utilizados para obtener el porcentaje de la remoción de semillas por roedores en cada hábitat en los que se desarrollaron los experimentos.

La remoción neta se analizó mediante la prueba Kruskal-Wallis teniendo en cuenta

Vélez - Remoción de semillas por roedores

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dos comparaciones: 1) entre tratamientos (ET, EP y SE), 2) respecto a la ubicación (interior, borde y pastizal). Las tasas de remoción se compararon mediante la prueba G.

n=26, gl=2, p>0.05) (Figura 1c); en este caso las mayores diferencias se presentaron para tratamiento EP al interior y para el tratamiento SE en el borde y el pastizal.

RESULTADOS

En cuanto a la ubicación (comparación entre hábitats para un mismo tratamiento) se encontró mayor remoción al interior del fragmento (855 semillas), y menor en pastizal (134 semillas). El tratamiento ET presentó mayor porcentaje de remoción de semillas en el pastizal (3%) y menor el interior (0.38%) (H=4.31, n=50, gl=2, p>0.05) (Figura 2a). El tratamiento EP presentó el mayor porcentaje de remoción al interior (44.87%) y el menor en el pastizal (4.25%), sin embargo las diferencias no fueron significativas (H =5.88, n=47, gl=2, p>0.05) (Figura 2b). Finalmente el tratamiento SE

Captura de roedores. Se capturaron cuatro individuos (tres hembras y un macho) de Heteromys australis (Heteromyidae), al interior del bosque entre marzo y junio; el éxito de captura fue de 0.0015 individuos por 100 trampas-noche.

Remoción de semillas. Para el primer experimento (junio) se removieron 1577 semillas luego de 12 días de iniciado. Durante este tiempo se consumieron más del 50% (852) de las semillas con acceso a roedores, al interior del bosque.

Para el porcentaje de remoción de semillas se encontraron variaciones entre tratamientos al interior del fragmento (H=26.13, n=55, gl=2, p<0.05) (Figura 1a) y en el borde (H=32.01, n=56, gl=2, p<0.05) (Figura 1b), mientras que en el pastizal las diferencias no fueron significativas (H=4.31,

Figura 1. Comparación entre el porcentaje de remoción de semillas entre tratamientos del experimento 1 (junio). A) Interior. B) Borde C) Pastizal.

ET= Exclusión total. EP= Exclusión parcial, SE= Sin exclusión.

Figura 2. Comparación entre el porcentaje de remoción y la zona trabajada en el fragmento de bosque para cada tratamiento del experimento 1 (junio).

A). Exclusión Total. B). Exclusión Parcial.

C). Sin Exclusión.

presentó un porcentaje de remoción significativamente mayor en el borde (42.25%) y menor en el pastizal (19%) (H=7.21, n= 40, gl=2, p<0.05) (Figura 2c).

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Para la tasa de remoción, el tratamiento ET (Figura 3a) mostró el menor porcentaje de pérdida de semillas en el tiempo en el interior (menor al 5%), y el mayor valor en el pastizal (G=1.06, n=50, gl=2, c2=p>0.05). El tratamiento EP (Figura 3b), reveló un significativo incremento en la tasa de remoción de semillas en el interior del bosque (G=12.19, n=50, gl=2, c2=p<0.05). Por último con el tratamiento SE (Figura 3c) se encontró la mayor tasa de remoción respecto a los demás tratamientos, con un mayor porcentaje de

Figura 3. Tasa de remoción de semillas para cada tratamiento en cada zona del experimento 1 (junio). A) Exclusión Total. B) Exclusión Parcial. C) Sin Exclusión.

pérdida en el tiempo al interior del bosque (>60%) y menor en el pastizal (<30%) (G=29.91, n=50, gl=2, c2=p<0.05).

En julio se removieron 1620 semillas luego de 12 días de iniciado el experimento.

Durante este tiempo fueron removidas más

del 50% (983) de las semillas de los tratamientos con acceso a roedores al interior del bosque. Al comparar la remoción por tratamientos entre hábitats se encontraron diferencias significativas. La remoción fue mayor para el tratamiento EP en el interior (H=33.35, n=50, gl=2, p<0.05) (Figura 4a) y en el borde (H=9.16,

Figura 4. Comparación entre el porcentaje de remoción de semillas entre tratamientos del experimento 2 (julio).

A)Interior. B)Borde. C)Pastizal.

ET=Exclusión total; EP=Exclusión parcial; SE=Sin exclusión.

n=26, gl=2, p<0.05) (Figura 4b). Por su parte en el tratamiento SE presentó la mayor remoción en el pastizal (pastizal H=21.89, n=48, gl=2, p<0.05) (Figura 4c).

Respecto a la ubicación, el tratamiento ET (Figura 5a) presentó la mayor remoción de semillas al interior del bosque (17%) y la menor en el borde (14%); aunque estas

Vélez - Remoción de semillas por roedores

2229

diferencias no fueron significativas (H=2.42, n=49, gl=2, p>0.05). Por el contrario en el tratamiento EP (Figura 5b) se presentó un porcentaje de remoción significativamente mayor (H=20.73, n=45, gl=2, p<0.05) en el interior (58.37) del fragmento respecto al pastizal (5.87%).

Finalmente en el tratamiento sin exclusión (SE) (Figura 5c) se presentó un mayor

Figura 6. Tasa de remoción de semillas para cada tratamiento del experimento 2 (julio).

A) Exclusión Total, B) Exclusión Parcial, C) Sin Exclusión.

Figura 5. Comparación entre el porcentaje de remoción y la zona trabajada en el fragmento de bosque para cada tratamiento del experimento 2 (julio).

A). Exclusión Total. B). Exclusión Parcial.

C). Sin Exclusión.

porcentaje de remoción en el borde (24.75%) respecto al pastizal, aunque estas diferencias no fueron significativas (H=0.73, n= 30, gl=2 p>0.05).

La tasa de remoción de semillas (Figura 6) fue mayor al interior del fragmento para los tratamientos EP y SE mostrando diferencias significativas (G=25.183.74, n=498, gl=23, c2=p<0.05, y G=8.28, n=49, gl=2, c2=p<0.05 respectivamente). Sin

embargo para el tratamiento EP la tasa fue mayor en el pastizal pero sin diferencias significativas (G=0.9633, n=498, gl=23, c2=p>0.05).

DISCUSIÓN Captura de roedores. La baja abundancia y variedad de roedores encontrada evidencia el efecto negativo de la fragmentación sobre el ensamblaje de roedores en esta zona. En el caso particular del área de muestreo se le suma el efecto del uso en los pastizales de plaguicidas (glifosato) para el sostenimiento de los pastos mejorados.

Se ha sugerido que la fragmentación influye sobre el desarrollo de las comunidades de roedores (3,4,14,22). La intensidad de los

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efectos de la fragmentación sobre las comunidades animales, varía de acuerdo a la estructura de la vegetación y a condiciones abióticas del fragmento de bosque (17).

Becerra-Ramírez (18), sugirió que la composición y abundancia de especies de pequeños mamíferos en el bosque seco varía respecto al gra d o d e a l t e r a c i ó n o influencia antrópica y a las habilidades que cada especie tenga para adaptarse al nuevo ecosistema.

Respecto al efecto de los plaguicidas sobre los roedores, Vander Wall (23) demostró su efecto sobre las habilidades olfativas de los roedores; encontraron que las moléculas de los plaguicidas se adhieren al suelo, activándose con el aumento de la humedad relativa e incrementando su volatilidad con el aumento de la temperatura. Cuando esta acumulación ocurre cerca al sitio donde se encuentra el alimento de los roedores, altera la facilidad con la que dicho alimento es encontrado, afectando especialmente a especies granívoras, como Heteromys australis, que depositan semillas en escondites (15,24). Esto permite pensar en los plaguicidas como un factor que influye sobre la abundancia de roedores en el área de estudio, especialmente en el pastizal donde su uso es constante y en los bordes, donde puede existir una acumulación (25).

Remoción de semillas. La cuantificación del porcentaje de remoción neta permitió una mejor aproximación a los organismos que atacaron las semillas en cada tratamiento.

En ET la remoción estuvo dada por insectos, en el tratamiento EP estuvo dada por roedores y en el tratamiento SE posiblemente estuvo dada por aves y mamíferos mediano.

La remoción por insectos (ET), dentro de los que se observaron hormigas y coleópteros, fue baja durante los dos experimentos. Este resultado concuerda con lo encontrado por Donoso et al (7) quienes analizaron el efecto de la fragmentación sobre la depredación de semillas en el bosque Maulino en Chile; observaron que la granivoría por insectos fue dos veces menor en encierros impermeables (sin acceso a vertebrados) que en encierros semiimpermeables (acceso a pequeños vertebrados) y el tratamiento control (sin

encierro). Estos autores consideraron que hormigas y coleópteros fueron los principales predadores de semillas dentro del encierro impermeable y que su actividad estuvo afectada por la fragmentación del bosque.

Dentro de los insectos, los coleópteros son considerados grandes predadores de semillas (10), estos generalmente atacan las semillas antes de ser dispersadas, siendo el caso para las semillas de Samanea saman, en donde los bruchidos (Coleoptera) son sus principales depredadores predispersión (26).

Para el tratamiento EP los resultados concuerdan con diversos estudios en los que los roedores han sido considerados como los principales predadores de semillas en diferentes ecosistemas (1,4,6,8,12); siendo afectados por la fragmentación del hábitat (7,11,27).

Respecto al tratamiento SE, los datos sugieren que la posible actividad predatoria por parte de mamíferos medianos y aves es mayor en el borde y en el pastizal. El único mamífero mediano registrado en la zona fue Dasyprocta punctata, el cual aunque es importante depredador de semillas (10), prefiere frutos carnoso con semillas grandes.

En este sentido es más probable que la depredación de semillas encontrada en el tratamiento SE haya sido por aves granívoras de los géneros Sporophila, Sicalis y Volantina.

Los resultados de la remoción de semillas por roedores muestran un efecto evidente de la ubicación (interior-borde-pastizal) sobre la pérdida de semillas, siendo mayor en el interior, seguida del borde y del pastizal respectivamente. De acuerdo con Jones et al (12), la variación en los patrones espaciales de la depredación de semillas depende de las densidades poblacionales del depredador. La ausencia de roedores en el pastizal y en los bordes se puede explicar por la baja oferta de alimento, así como a la dificultad en encontrar semillas debido al uso de plaguicidas; adicionalmente los roedores pueden estar evitando las áreas abiertas para minimizar la presión de los depredadores. Por su parte, en los bordes existe una presión de depredación alta y una acumulación de contaminantes, en

Vélez - Remoción de semillas por roedores

este caso plaguicidas (23,25). La presencia de un roedor que acumula semillas en alta proporción como Heteromys australis se relaciona con el mayor consumo de semillas al interior del bosque. Esta especie puede estar encontrando al interior del bosque unas condiciones para establecerse, menos variables en la humedad del suelo y el aire, una menor exposición a depredadores y una menor concentración de plaguicidas (8,12,15,16,23).

La disponibilidad de alimento durante el primer experimento fue mayor dada la presencia de frutos dentro del bosque, mientras que durante el segundo experimento la disponibilidad de frutos en el bosque fue menor (observación personal). Esta diferencia podría explicar el mayor aprovechamiento de las semillas por los roedores durante el segundo experimento, de tal manera que la densidad de semillas en la zona afecta la remoción en un sitio determinado, sugiriendo que la depredación de semillas en esta zona es un proceso denso-dependiente.

De acuerdo con la hipótesis de escape (12,28), los depredadores de semillas forrajean más en lugares con mayor densidad y variedad de semillas, que es generalmente al interior de los bosques cerca a los parentales; al mismo tiempo, minimizan los costos de búsqueda y el riesgo a la depredación. En consecuencia los roedores pueden evitar lugares donde la densidad de semillas y/o la probabilidad de arribo de estas es menor, que en el caso de este trabajo son los pastizales. Esto puede explicar, la baja remoción de semillas y la baja densidad de los roedores en los pastizales en comparación con el interior del fragmento.

Al haber una menor disponibilidad de frutos y semillas durante la época de la realización del segundo experimento, los puntos donde se colocaron los tratamientos durante este experimento podrían estar simulando el lugar de concentración de semillas cerca a un árbol parental, haciéndola más vulnerable

2231

a la acción depredadora de los roedores.

Esto podría explicar por qué la tasa de remoción fue mayor durante los primeros días del experimento y se estabilizó luego de un tiempo.

En general, la tasa de remoción de semillas por roedores reflejó su relación con la presencia de estos en los diferentes hábitats del bosque y por consiguiente con su actividad predadora de semillas. Esta actividad pudo estar determinada por cambios en las condiciones bióticas y abióticas entre el interior, el borde y el pastizal a causa de la fragmentación (7,11,12) y por el uso de plaguicidas (23).

En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo indican que los roedores son los principales removedores de semillas en el sector Cerritos-La Virginia, mostrando el mayor porcentaje y la tasa más alta de remoción al interior del fragmento. Se evidencia una relación entre el porcentaje y la tasa de remoción de semillas con la ubicación en el fragmento (interior- bordepastizal). Se reconoce a Heteromys australis como un posible predador de semillas al interior del fragmento.

Aunque es posible que las aves jueguen un papel importante en la remoción de semillas, este trabajo solo permite hacer una aproximación preliminar, por lo que es importante evaluar de manera directa el papel de las aves granívoras en las tasas de remoción de semillas dispersadas en estos fragmentos. Por último sugerimos evaluar el papel de los roedores en la tasa de depredación de plántulas, ya que aunque los propágulos escapen a la depredación en el estadío de semilla, siguen siendo vulnerables a la acción depredadora de los roedores en estados subsiguientes. Asi se tendría una idea más completa del papel que los depredadores de semillas y plántulas tienen sobre los procesos de sucesión y regeneración natural, especialmente en áreas degradadas.

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Rev.MVZREVISTA CórdobaMVZ 15(3):2234-2239, 2010. 15(3), Septiembre - Diciembre 2010 CÓRDOBA • Volumen 2234

SHORT COMMUNICATION

Preliminary studies of the genetic structure of “Cimarron uruguayo” dog using microsatellite markers Estudios preliminares de la estructura genética del perro cimarrón uruguayo usando microsatélites Rosa Gagliardi B,

1*

M.Sc, Silvia Llambí D, María Arruga L,

1 2

Ph.D, Cristina García G, Ph.D.

2

Ph.D,

Universidad de la República, Facultad de Veterinaria, Área Genética. Lasplaces 1550. C.P. 1 1 6 0 0 , M o n t e v i d e o , U r u g u a y. 2 U n i v e r s i d a d d e Za ra g o z a , Fa c u l t a d d e Ve t e r i n a r i a , Laboratorio de Citogenética y Genética Molecular. Zaragoza, C. P. 50013, España. *Corresponding: rgagliar@gmail.com

1

Recibido: Abril 12 de 2010; Aceptado: Agosto 30 de 2010

ABSTRACT Objetive. To analyze the population structure, using microsatellite markers in a sample of “Cimarron Uruguayo” dogs. Materials and methods. Thirty dogs were analyzed in different areas of Uruguay with a set of nine molecular microsatellite markers using PCR. The population structure was analyzed using the free distribution software “Structure’’. Results.

According to our data, the preliminary results show that it is not possible to establish a subdivision among the animals in the sample. Conclusions. The study supports the hypothesis that the currently existing canines derive from a founding nucleus that took refuge in the Northeastern region of the country. The distribution of the breed among the different areas of Uruguay continues nowadays, so there is no isolation among the different groups of animals, and the exchange is constant Key words: Population structure; DNA markers; Cimarron Uruguayo.

RESUMEN Objetivo. Analizar la estructura poblacional en una muestra de perros “Cimarrón Uruguayo” usando marcadores moleculares tipo microsatélites. Materiales y métodos. Se analizaron treinta caninos de diferentes zonas de Uruguay con un set de nueve marcadores moleculares microsatélites empleando PCR. La estructura poblacional se analizó con el software de distribución libre “Structure”. Resultados. Según nuestros datos, los resultados preliminares 2234

Gagliardi - Preliminary studies of the genetic structure of Cimarron Uruguayo

2235

muestran que no es posible establecer una subdivisión entre los animales de la muestra.

Conclusiones. El estudio realizado apoya la hipótesis de que los perros que existen en la actualidad derivan del núcleo fundador que se refugió en la región noreste del país. La distribución de la raza entre las distintas áreas de Uruguay continúa hoy en día, no existe aislamiento entre los diferentes grupos de animales y el intercambio es constante.

Palabras clave: Estructura poblacional, marcadores de ADN, Cimarrón Uruguayo.

INTRODUCTION The “Cimarron Uruguayo” is the only dog breed which is originary from Uruguay. On 21 February 2006, the “Fédération Cynologique Internationale” recognizes the breed in primary form, which means that it is in a proof period of five years before its final recognition (1). This has led to an increase in the interest in the breed on the part of the breeders and the exhibitors, which is why strict controls are being made to ensure the standardization and prevent the occurrence of undesirable hereditary characteristics. At different times in history, these animals have represented a serious danger to man and livestock. Some historians, in the XVIth century, talked about their multiplication and the damage they produce, even putting a price on their heads.

In 1788, the extermination of these dogs was approved by Buenos Aires Council.

During the XIXth century, the persecution of these dogs still continued. The second time when these dogs represented a problem was during the “Guerra Grande”. At this time, there was another pursuit of Cimarron dogs.

However, a few individuals still remained in rural places of the provinces of Cerro Largo and Treinta y Tres (2-3). Characterization of the population structure of this dog breed is useful in a variety of contexts. Genetic ascertainment of within-species population structure has been widely applied for classifying subspecies, for defining intraspecific conservation units, for understanding events in the history of a species, for identifying ongoing speciation events and for testing hypothesis about evolutionary processes (4). “Structure” is one of the freeware used to analyze population structure. It uses multi-locus

genotypic data, so it can be applied to the majority of the commonly-used genetic markers (5). Microsatellites are among the plausible genetic markers to be used for these analyses. It is assumed that there is no linkage among the chosen loci.

Having in consideration its history and the interest this breed has arisen, the objective of this investigation was to analyze the population structure, using microsatellite markers in a sample of “Cimarron Uruguayo” dogs.

MATERIALS AND METHODS Animals and study area. Thirty “Cimarron Uruguayo” dogs were analyzed: 13 animals from the northeastern (NE) area of Uruguay and 17 from the southern (S) area. These areas were selected taking into account: the background of the founding nucleus in the origins of the breed (NE area: provinces of Cerro Largo and Treinta y Tres) and animal density (S area: provinces of Montevideo and Canelones).

DNA isolation. DNA was isolated using the AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit (Axygen biosciences). Nine microsatellite markers tested in previous studies in this breed (6), included in ISAG (International Society for Animal Genetics) panel 2 were analyzed using PCR technique; each of them was amplified separately. The amplifications were performed using standard programmes (denaturation, 95°C, 4 minutes; 35 cycles of 95°C, 1 minute, 44-60°C, 30 seconds, 72 ºC, 45 seconds). A mix was made with the amplifications of each animal. In table 1 are

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

shown microsatellite markers used in this work, its respective primers and PCR conditions.

Data analysis. The results were read with the MegaBACE 1000 programme, with the permit of the University of Zaragoza (UNIZAR).

The population structure was analyzed with the “Structure 2.3.1” freeware with admixture (7). The “Estimated Ln Prob of Data” obtained from running the software was considered to estimate the number of subpopulations (K).

This data corresponds to the estimation of ln Pr(X/K), where X are the genotypes. To verify the reliability of the estimations obtained by running the software, three runs were performed for each K.

Figure 1. Inference of the number of subpopulations of “Cimarron Uruguayo” dogs, in accordance with the date obtained with the “Structure” software.

RESULTS The results obtained from the simulations performed with the “Structure 2.3.1” software are shown in figures 1 and 2. Obtained alleles, observed and expected heterozygosity for each population are shown in table 2.

The number of subpopulations (K), according to the Bayesian rule [considering K=1, where the highest value of ln Pr(X/K) was obtained] was inferred according to Pritchard et al (5).

Figure 2. Result obtained from the simulations performed with the “Structure” software. Each simulation was done independently, according to the analysis shown in figure 1.

Gagliardi - Preliminary studies of the genetic structure of Cimarron Uruguayo 2237 Table 1: Primers and PCR conditions used for each microsatellite marker.

Table 2. Results obtained for each sub-population. Pop1: sub-population 1, pop2: sub-population 2, Ho: observed heterozygosity, He: expected heterozygosity.

DISCUSSION According to the data obtained with the software “Structure”, it is not possible to establish a subdivision between the animals of the sample, as all of them belong to the same population. The analysis of the population presented in this paper show that the method has power to detect how many populations are presented in the samples studied.

The “Structure” software has been successfully used in different species, with the aim of identifying subpopulations of animals of different breeds or areas (8,9).

The analysis of our populations of “Cimarron Uruguayo” dogs, performed with the “Structure” software, gave a value of K=1 (Figures 1 and 2). This would imply that the

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

analyzed animals belong to the same population. Previous studies performed with RAPDs showed a high homogeneity and genetic identity among the animals of the NE and S areas (10), which would match the results obtained in this work. However, when making this type of studies, microsatellites have some advantages, including their high variability in populations and their codominant inheritance, which have made them more widely used (11).

In dogs, particularly, this software has been used with the aim of identifying subpopulations corresponding to different breeds (9). In our case, the result coincides with the history of the dog breed “Cimarron Uruguayo”, as it would confirm the hypothesis that current dogs derive from the founding nucleus that managed to take refuge in the NE region of the country (12).

In addition, the distribution of the breed among the different areas of Uruguay continues nowadays, so there is no isolation among the different groups of animals, and the exchange is constant.

This would not only not allow the formation of separated subpopulations, but also all the animals would continue being part of the same population. However, we intend to continue with these kinds of studies with other methods as population and quantitative genetics.

Acknowledgments The authors would like to thank the Uruguayan Kennel Club for their collaboration in the sample extraction and the CSIC for their economical support.

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REVISTA CÓRDOBA • Volumen Rev.MVZ Córdoba MVZ 15(3):2240-2244, 2010. 15(3), Septiembre - Diciembre 2010 2240

CASO CLÍNICO

Otitis bovina por Rhabditis bovis en Córdoba, Colombia. Reporte de dos casos Bovine otitis by Rhabditis bovis in Cordoba, colombia.

Report of two cases José Cardona Á, *1 M.Sc, Marco González T,

1

M.Sc, Jaime Álvarez P,

1

M.Sc.

1 Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Ciencias Pecuarias.

Montería, Colombia. *Correspondencia: cardonalvarez@hotmail.com

Recibido: Enero 5 de 2010; Aceptado: Noviembre 24 de 2010

RESUMEN Se reportan dos casos de bovinos de la raza Gyr puros, atendidos en el servicio ambulatorio de la clínica medico-quirúrgica de grandes animales de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba, Colombia. Los animales presentaron al examen físico signos de otitis clínica en ambos lados, con otorrea, olor fétido, inflamación con cierto grado de estenosis del conducto auditivo, inclinación de la cabeza, prurito intenso y rascado excesivo de las orejas. Se realizó inspección directa y colecta de material del conducto auditivo externo, y se observó en forma directa el movimiento de los parásitos en el cerumen, posteriormente confirmado por observación microscopio-estereoscópico, en el laboratorio de parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Córdoba, en el cual se reveló la presencia de larvas y adultos de nemátodos del género Rhabditis bovis. Es el primer reporte de esta enfermedad en bovinos de la raza Gyr en el departamento de Córdoba y Colombia.

Palabras clave: Otitis parasitaria, Rhabditis bovis, bovinos.

ABSTRACT Two cases of pure Gyr bred bovines, treated at the outpatient medical-surgical clinic for large animals of the Faculty of Veterinary Medicine and Animal Husbandry, at the University of Cordoba, Colombia are reported. During the physical examination, the animals showed signs of clinical otitis with otorrhea, fetid odor, swelling with some degree of stenosis of the ear canal, head inclination, intense itching and excessive scratching of both ears. Direct inspection was performed and a collection of material from the outer ear canal was taken, 2240

Cardona - Otitis parasitaria bovina por Rhabditis bovis

2241

the movement of parasites in the wax was directly observed, and later confirmed by observation under a stereoscopic microscope in the Parasitology laboratory of the Faculty of Veterinary Medicine at the University of Cordoba, which revealed the presence of nematode larvae and adults of the genus Rhabditis bovis. This is the first report of this disease in Gyr cattle in the department of Cordoba and in Colombia.

Key words: Parasitic otitis, Rhabditis bovis, bovine.

INTRODUCCIÓN Las otitis parasitaria bovina causada por nematodos Rhabditiformes ha sido reportada en diversos países africanos de clima caliente y húmedo como Tanzania (1), Kenia (2,3) y Zimbabwe (4), sin embargo la mayoría de los reportes de esta enfermedad se han generado en Brasil (5-9).

Las manifestaciones clínicas de un bovino con otitis parasitaria incluyen otitis clínica en el conducto auditivo, otorrea que puede llegar a ser purulenta, olor fétido, inflamación con cierto grado de estenosis del conducto auditivo, prurito intenso con rascado excesivo de las orejas. Algunos animales se pueden observar con la cabeza pendulante de un lado a otro, por el constante balanceo de las orejas (8,9), en ocasiones ciertas otitis pueden llegar a producir síndrome vestibular y en algunos casos puede ocurrir lesión del nervio facial (10,11). Por otro lado a la inspección del conducto auditivo externo y colecta del cerumen, se puede observar en forma directa el movimiento de los parásitos (8).

La raza Gyr parece estar predispuesta a la otitis parasitaria (Rhabditis bovis) en relación con otras razas, debido a la conformación anatómica del pabellón auricular, el cual es bastante largo y encartuchado, lo que favorece la retención de cerumen proporcionando un ambiente favorable para la reproducción y permanencia del parasito, condición favorecida por la presencia de pelos y proliferación de bacterias saprofitas (12-14); Sin embargo Leite et al (12) y Vieira et al (13), reportaron la otitis parasitara en la raza Indubrasil.

Son considerables las pérdidas económicas en las explotaciones de zonas tropicales y subtropicales, en lo referente a los gastos

de medicamentos, manejo, disminución en la producción y ganancia de peso (9,14).

Con respecto a la epizootiología del parasito, se reporta que una de la fuentes de contagio son las actividades grupales como baños contra ectoparasitos y sitios de libre desplazamiento y contacto de animales enfermos con otros animales sanos (15,16).

Por otro lado, se reporta que uno de los factores de riesgo relevantes es la presencia exagerada de moscas, así como las épocas lluviosas que también favorecen la presentación de la enfermedad (4).

En el presente reporte, se describen hallazgos clínicos y diagnósticos de dos casos de otitis parasitaria bovina por Rhabditis bovis en dos bovinos de ambos sexos de la raza Gyr en el departamento de Córdoba, Colombia.

CASO CLÍNICO Fueron atendidos en el servicio ambulatorio de la clínica medico-quirúrgica de grandes animales de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba, Colombia, dos bovinos de la raza Gyr, un macho de 32 meses de edad, con un peso de 400 kg y una hembra de 28 meses de edad y un peso de 280 Kg, los cuales presentaron otorrea con secreción purulenta (Figura 1), con olor fétido, inflamación y estenosis de los conductos auditivos (Figura 2), prurito intenso, balanceo constante de la cabeza y rascado excesivo de las orejas, así como linfadenitis a nivel de los nódulos linfáticos mandibulares, los demás parámetros fisiológicos se encontraban dentro de los valores normales (temperatura, tiempo de llenado capilar, frecuencia ruminal, cardiaca

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

y respiratoria). Según lo reportado por los propietarios en la anamnesis, los animales tenían aproximadamente 8 meses de presentar algunas manifestaciones clínicas como: pérdida progresiva de peso, mal olor y rascado constante en las orejas, también informaron que había sido diagnosticado y tratado como micosis ótica, sin mostrar

mejoría al tratamiento antimicótico instaurado.

Los hallazgos clínicos encontrados sugirieron un cuadro de otitis clínica, por lo que se le realizó colecta de material del conducto auditivo externo, con una sonda acanalada (Figura 3) y se observó en forma directa el movimiento de los parásitos en el cerumen, posteriormente fue observado en el laboratorio de parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Córdoba, por análisis estereoscópico y microscópico, en el cual se reveló la presencia de larvas y adultos de nemátodos del género Rhabditis bovis (Figura 4) agente reportado en la literatura como el causante de la otitis parasitaria bovina (17).

Figura 1. Otorrea (exudado), acompañada de ® ). material purulento (®

Figura 2. Apariencia del conducto auditivo externo con lesiones inflamatorias y estenosis ® ). del conducto auditivo externo (®

Figura 3. Colecta de cerumen desde el oído externo con sonda acanalada.

Cardona - Otitis parasitaria bovina por Rhabditis bovis

2243

Figura 4. Rhabditis bovis (® ® ), observado en el microscopio. 4x.

DISCUSIÓN Los hallazgos clínicos (otorrea, olor fétido, otitis clínica) encontrados en los 2 animales, la anamnesis, el tiempo de padecer la enfermedad y la evolución del cuadro, así como movilidad masal del cerumen son datos importante que hacen presumir o sospechar clínicamente de una otitis parasitaria bovina (Rhabditis bovis) (14,17).

Santos et al (17), indicaron que esta condición parasitaria es común en animales de la raza Gyr e Indubrasil, principalmente en rebaños que se encuentran en países de bosque húmedo tropical. Vieira et al (13,14), describen que los animales con otitis parasitaria en la mayoría de los casos presentan la afección en ambas orejas, y acompañados principalmente de manifestaciones clínicas como depresión, inapetencia, otorrea con secreción algunas veces purulenta y fétida, dolor a la palpación en las bases de los orejas, linfadenitis de los nódulos linfáticos mandibulares.

Algunos autores como Leite et al (6), Duarte et al (7), Vieira et al (14) y Santos et al (17), recomiendan que se debe colectar material de secreción de los conductos auditivos externos y observar el movimiento en olas del material, generado por el movimiento de los parásitos. También indican que se debe transportar el material diluido en solución

salina fisiológica a temperatura ambiente para observarlo al microscopio y determinar la presencia de formas parasitarias en estado adulto y larvario de Rhabditis bovis, siendo esta observación la confirmación de la presunción clínica de otitis parasitaria bovina, de igual forma estas recomendaciones se hicieron en los dos casos clínicos informados, para poder reportar la presencia de otitis parasitaria bovina en el departamento de Córdoba, Colombia.

El género Rhabditis, es un parasito saprofito que habita en zonas de bosque húmedo tropical, vive comúnmente en materias fecales, tierras húmedas y materia orgánica en descomposición (8, 14), por otro lado Abdala et al (10) y Souza et al (11) reportan que por las características propicias de la oreja de los bovinos de la raza Gyr, se pueden presentar con frecuencia, recidivas de la enfermedad.

En conclusión, por las manifestaciones clínicas (antecedentes, rascado, inquietud, otorrea), las características del cerumen del conducto auditivo externo (color, olor y movimiento), así como la observación del parasito en el laboratorio, permitió diagnosticar otitis parasitaria bovina (Rhabditis bovis) en bovinos de la raza Gyr, en el departamento de Córdoba, Colombia.

2244

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

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Rev.MVZ Córdoba 15(3):2245-2251, 2010.

2245

CASO CLÍNICO

Diagnóstico de policitemia absoluta como posible causa de episodios convulsivos en un perro Diagnosis of absolute polycythemia as possible causes of seizures in a dog Sandra Acevedo T, 1 * Esp, Mauricio Ramírez L, 1 Esp. U n i ve r s i d a d d e A n t i o q u i a , Fa c u l t a d d e C i e n c i a s A g ra r i a s , G r u p o d e i nve s t i g a c i ó n CENTAURO. Medellín, Colombia. *Correspondencia: crisalida18@agronica.udea.edu.co

1

Recibido: Septiembre 16 de 2009; Aceptado: Julio 28 de 2010

RESUMEN Se expone el caso de un perro poodle de 3 años de edad, el cual hace un año comenzó a convulsionar esporádicamente, principalmente después de hacer ejercicio y en algunas ocasiones presentó temblor generalizado. Al examen clínico realizado se observó mucosas orales y oculares hiperémicas. Al realizar los exámenes paraclínicos complementarios se encontró en hemogramas seriados un aumento marcado del hematocrito y la hemoglobina con niveles de proteínas plasmáticas en rangos normales, y una eritropoyectina 10 veces por debajo del rango normal. Se realizó ecografía abdominal y evaluación cardiaca. El diagnóstico fue de policitemia absoluta como la causa de las convulsiones.

Palabras clave: Canino, convulsión, eritropoyetina, hematocrito, policitemia.

ABSTRACT The case of a 3-year-old poodle, which last year began to suffer sporadic seizures, especially after exercise and sometimes-presented generalized tremor, is reported. At clinical examination the hyperemic eye and oral mucosa were observed. Additional Laboratory tests performed showed that serial blood counts increasingly marked the hematocrit and hemoglobin with levels of plasmatic proteins within normal ranges, and erythropoietin was 10 times under the normal range. An abdominal ultrasound and a cardiac evaluation were performed. The diagnosis was absolute polycythemia as the cause of seizures. key words: Policitemia, eritopoyectina, hematocrito, convultion, canine

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

INTRODUCCIÓN La policitemia se define como el hallazgo de un recuento celular elevado de glóbulos rojos, se expresa como un aumento del volumen celular aglomerado (VCA) por encima de los rangos de referencia, siendo esta lo contrario a un proceso anémico. (1-3). En medicina veterinaria otras líneas celulares sanguíneas no necesariamente se ven involucradas, mientras que cuando esta enfermedad se presenta en humanos se comprometen otras líneas como las plaquetas y en ocasiones los glóbulos blancos.(1, 4, 5) .La policitemia se puede presentar en pacientes con ciertos tipos de tumores vasculares como leihomiomas y hemangiosarcomas los cuales llevan a una sobreproducción de eritopoyectina por hipoxia renal (6-8) entre otras causas de la eritocitosis se encuentran los shunts arteriovenosos, deshidratación severa, hiperadrenocortisismo, policitemia vera (policitemia primaria) y en general enfermedades crónicas de tipo cardiaco y pulmonar (9, 10).

La policitemia se clasifica como relativa o absoluta según la etiología (1,3,11). La relativa se refiere a hemoconcentración; la masa celular de glóbulos rojos se encuentra normal pero aparentemente estos están incrementados de tamaño es decir no se produce aumento real de la masa eritrocitaria (4,11,12). La deshidratación es la causa mas común de policitemia relativa en pacientes caninos (3,13), en donde el VCA, el hematocrito y la concentración de proteínas plasmáticas están leve o severamente incrementados debido a que existe una eventual disminución en el fluido corporal total (14-16). Su diagnostico se basa en valorar la apariencia clínica del paciente, el cuadro hematico completo y en el análisis e interpretación de pruebas paraclinicas sanguíneas, como la concentración de nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) y creatinina que pueden estar incrementadas así como la densidad urinaria la cual generalmente se encuentra concentrada o hiperestenurica (1,7,8). La adrenalina e histamina liberada por animales asustados o sometidos a factores de stres causa una contracción esplénica y redistribución de las células sanguíneas, pero esta forma de policitemia

es pasajera y no está asociada a incremento en la concentración de proteínas plasmáticas.(11,17,18) La policitemia absoluta o vera es un desorden mieloproliferativo (4,9,16) donde el defecto podría estar a nivel de las células multipotenciales o en el sistema hematopoyetico, generándose un aumento en la masa celular de glóbulos rojos, hemoglobina, recuento de glóbulos rojos y hematocrito con una concentración normal de proteínas plasmáticas(6,12,19). Se conoce que esta se presenta con mayor frecuencia en perros de mediana edad y no hay predilección por raza especifica (1,3,17).

Los síntomas de la policitemia vera, dependen del grado de viscosidad de la sangre pudiéndose formar trombos disminuyendo la microcirculación provocando hipoxia local, causando signos de tipo neurológicos como convulsiones, ataxia, ceguera, temblores o cambios de comportamiento. (1,15) En el presente artículo se describe el caso de un paciente canino el cual presentaba convulsiones aisladas que en los últimas semanas aumentaron en intensidad y frecuencia. En los exámenes complementarios realizados la única anormalidad encontrada fue una policitemia y al profundizar con diversas ayudas paraclinicas se diagnostica una policitemia primaria se discute su diagnostico, tratamiento y evolución. Al descartar las demás etiologías causantes de convulsión se llega al diagnostico presuntivo de policitemia causante de las convulsiones.

Presentación del caso Reseña. Perro de raza poodle macho de 3 años de edad, peso de 5.8 Kg. con plan de vacunación y desparasitación vigente, el cual desde hace un año presentaba episodios esporádicos convulsivos no tratados, pero que en las últimas 3 semanas han aumentado en intensidad y frecuencia presentándose estos después de realizar ejercicio o ante un evento que genere excitación en el paciente.

Anamnesis. Los propietarios reportan que desde hace un año ha sufrido episodios

Acevedo - Diagnóstico de policitemia absoluta

convulsivos esporádicos, pero que desde hace algunas semanas estos episodios se han hecho más frecuentes e intensos, principalmente después de realizar ejercicio, y en algunas ocasiones en momentos de excitabilidad, como cuando llega uno de los propietarios.

Hallazgos al examen físico. Paciente atento al medio pero con marcada ansiedad.

Mucosa ocular y oral hiperémicas, jadeo, taquicardia, pulso fuerte sin signos de deshidratación (Tabla 1). A la auscultación cardiaca, pulmonar y palpación abdominal no se hallaron anormalidades. El examen nueorológico fue normal.

Tabla 1. Constantes fisiológicas del paciente en la evaluación inicial.

Ayudas diagnósticas. Se realizó hemograma, ALT, creatinina, Ca, eritropoyetina, T4 y glicemia, tratando de descartar una causa no neurogénica o extracraneal de las convulsiones presentadas por el paciente (1,8). Los resultados de las pruebas químicas se encontraron dentro de los parámetros normales. El hemograma reveló un aumento del hematocrito y de la hemoglobina de 56% y 18.1 g/dl respectivamente y con proteínas totales en 6.6 g/dl. (Tabla 2). Los resultados de eritropoyetina fueron los siguientes: 1.0 u/ml siendo el rango normal de 88.2 u/ml.

Correspondiendo esto con un cuadro hemático compatible con policitemia (12, 15) frente a lo cual se determinó no iniciar una terapia médica anticonvulsiva hasta encontrar la causa real del problema. Previo a los exámenes paraclínicos se realizó ecografía abdominal, ecoca r d iografía y placas radiográficas de tórax y abdomen descartando presencia de tumores o enfermedad cardiaca o pulmonar concomitante.

2247

Tabla 2. Resultados del hemoleucograma #1

U: Unidad

Ecocardiografía. Modo B-Doppler Color: Ventana para esternal derecha: Eje Largo; Se aprecia el ventrículo y atrio izquierdo con tamaño cameral adecuado para la talla; válvula mitral de anatomía y cierre adecuado, no hay regurgitación; septo interventricular de tamaño normal e integro; ventrículo y atrio derecho normal. Válvula tricúspide de anatomía y cierre adecuado, no hay regurgitación. No hay presencia de masas o trombos intracavitarios. No hay presencia de masas pericardiaco. En conclusión, ecocardiografía normal.

Interpretación radiográfica. En la proyección LL y DV de tórax y abdomen, no se apreciaron cambios en la estructura cardiaca ni en campos pulmonares, así como tampoco en cavidad abdominal. No se observaron masas ocupantes ni en tórax, ni abdomen.

Enfocándose básicamente en confirmar la policitemia vera como causa primaria de las convulsiones, se realizaron otros 2 hemogramas de control a los 8 y 15 días respectivamente, recomendándole a los propietarios del paciente quietud absoluta previa a la toma de la muestra, para evitar alteraciones en al cuadro hematico debido al ejercicio (4,12,20). En los hemogramas se encontró un aumento leve en el hematocrito y en la hemoglobina con niveles de proteínas plasmáticas sostenidos (Tabla 3).

Por lo anterior se decidió realizar una flebotomía como método diagnóstico y terapéutico (1,3,7). Este procedimiento se realizó según

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Tabla 3. Resultados del hemoleucograma #2

U: Unidad

el protocolo recomendado por Kienle (9). El paciente presentó un hematocrito de 56% y se calculó uno deseado del 50% a fin de evitar efecto rebote, según la formula: Sangre a remover (ml) = [(peso del paciente kg x 0.08) x 1000 ml x (hto actual - hto deseado) / Hematocrito actual] Se extrajeron 52 ml de sangre los cuales se restituyeron a través de fluidos endovenosos Hartman 2 veces el volumen obtenido de sangre o sea 188 ml en 3 horas. En donde efectivamente el hematocrito y la hemoglobina disminuyeron. Se midieron niveles sericos de eritropoyetina (4,6,7) encontrando un valor con una marcada disminución por debajo del promedio reportado en caninos (Resultado de la prueba 1.0 u/ml y rango normal 88.2 u /ml) lo cual confirma el diagnóstico de policitemia absoluta.

Este nivel se encuentra muy por debajo de los niveles normales debido a que como el paciente presenta un severo aumento en la línea roja la hipófisis realiza una retroalimentación negativa causando a nivel de las células yuxtaglomerulares una disminución en la producción de esta hormona (4,7).

Debido a que todo orientaba a un diagnostico de policitemia vera se decidió descartar otras posibles causas de eritrocitosis como masas neoplásicas ocupantes y cardiopatías (12,13,18) realizando al paciente radiografía

LL y DV de tórax, ecografía abdominal, ecocardiografia y electrocardiograma descartando con estas cualquiera de las patologías antes mencionadas.

Tratamiento. Durante el tiempo de diagnostico el paciente solo presentó un episodio convulsivo de intensidad moderada, luego de este se realizó la primera flebotomía, por medio de esta se logró controlar los episodios convulsivos del paciente. Se recomendó al propietario manejar hidroxiurea, medicamento recomendado en estos casos ya que inhibe la enzima ribonucleósidodifosfato - reductasa logrando causar una mielodepresión en los pacientes (4,7,15) acompañada de las flebotomías pero por los posibles efectos secundarios de este medicamento, cursando desde leucemogénesis como el más grave, hasta anorexia, vómito e hiperpigmentación, el escalamiento, el eritema, la alopecia, la descamación de la región facial (8,15,18) y la manipulación necesaria del propietario del paciente no accedió a instaurar dicho tratamiento.

Cuatro meses después de la flebotomía el paciente nuevamente comenzó a presentar convulsiones agrupadas, por ello se decidió realizar otra flebotomía bajo las condiciones antes mencionadas, en donde se obtuvo muy buena respuesta en el control convulsivo.

Sin embargo al cabo de 3 meses el paciente nuevamente comenzó con episodios convulsivos, pero los propietarios no autorizaron el tratamiento.

DISCUSIÓN La policitemia absoluta es un diagnostico diferencial de convulsiones en un caninos (8), que puede desencadenar episodios que cursan desde muy esporádicos hasta frecuentes y, si no es tratada correctamente puede causar afecciones mucho más graves o inclusive hasta la muerte (3,4,6). Entre los daños o alteraciones sistémicas se describen entre otros, disnea de moderada a severa y cianosis marcada generalmente en las extremidades por la evidente hemoconcentración o la viscosidad (1,18).

En este caso el paciente no presentó ningún

Acevedo - Diagnóstico de policitemia absoluta

síntoma de tipo cardiovascular o vascular periférico como se descartó debidamente por medio del examen físico y de las pruebas realizadas para este efecto; por lo tanto se puede inferir que las anormalidades físicas no cumplen un orden característico en su presentación y que aunque se esperaría que el paciente, al presentar signología de tipo nervioso debería cursar antes con signología cardiovascular esto no sucedió, dando clara muestra que en este caso la policitemia primaria no necesariamente cursa con alteraciones vasculares periféricas como inicio de la gravedad del problema, sino que en esta es posible la presentación de cualquier otra enfermedad concomitante y que no existe un orden especifico para su presentación, en donde se esperarían alteraciones periféricas antes de alteraciones mucho mas graves cursando desde cianosis en las extremidades antes que alteraciones de tipo anóxico cerebrales que causen convulsiones como en este caso se expone.

No se realizó el examen sistémico de la medula ósea, ya que es un método altamente invasivo y no permite distinguir entre policitemia primaria y secundaria. En cualquier caso el componente eritroidemiloide es normal o esta disminuido (1).

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por la manipulación y por los costos que esta puede implicar.

La hidroxiurea como medicamento mielodepresor es la herramienta básica junto con las flebotomías para el control y manejo de la policitemia primaria (5,11,20). Este medicamento presenta una respuesta adecuada causando una mielosupresión que si es controlada y manejada presenta una mejor recuperación y mantenimiento para el paciente. Los efectos secundarios reportados con el uso de este medicamento como: anorexia, vómito, hiperpigmentación, escalamiento y descamación de la región facial, así como la falta de experiencia de los autores para su manejo y los pocos reportes que se encuentran acerca del uso de este en medicina veterinaria, hacen que su terapéutica sea difícil. Por lo tanto, como indicación médica presenta serias precauciones que no permitieron su manejo en el caso expuesto, debido a que se hace complicado su uso en pacientes caninos.

Las flebotomías son el principal método terapéutico para el tratamiento de policitemia primaria (3,11,14) y mediante este método es posible lograr una sobrevida de los pacientes de hasta 6 años (1). En este caso y como se mencionó antes, se realizaron dos flebotomías con intervalos de 4 meses mediante las cuales se logró interrumpir satisfactoriamente los episodios convulsivos.

Para este caso se pretendió hacer con el objetivo de tratar de mantener niveles adecuados del hematocrito, la hemoglobina y un control de los demás factores sanguíneos, los cuales probablemente serian seriamente afectados y alterados causando una descompensación hematológica y sistémica del paciente, por lo que no se instauró tratamiento con la hidroxiurea aunque fuera la terapia de elección, quedando su manejo, terapéutica e indicación para un estudio posterior en el que se controlen y reporten los riesgos que este medicamento pueda causar en los pacientes.

Existen reportes de tratamientos por medio de estas con resultados muy satisfactorios.

(1,15,19). En el caso expuesto la indicación era el tratamiento con flebotomías seriadas teniendo en cuenta la adecuada respuesta del paciente y que por medio de estas se logró interrumpir los episodios convulsivos.

Aunque la indicación era esa y teniendo en cuenta los resultados, se planteó la posibilidad de continuar con las flebotomías, pero por cuestiones culturales es difícil para los propietarios autorizar el tratamiento y someter a su mascota a este procedimiento

El diagnóstico diferencial de la epilepsia con otros trastornos neurológicos es imprescindible, a fin de establecer el diagnóstico exacto y excluir crisis nerviosas como los desvanecimientos, sincopes o crisis por anormalidades reversibles como hipoglucemia, hipocalcemia, policitemia, fármacos, entre otros (1,3,16). En casos como el del presente informe, aunque el diagnostico de los episodios epilépticos convulsivos fue concluyente y no necesariamente fue a causa de factores neurológicos sino sistémicos como

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anteriormente se describió, su tratamiento y manejo en un principio fue el adecuado por medio de las flebotomías con los resultados anteriormente expuestos.

Cabe anotar que a los propietarios del paciente se les brindaron múltiples opciones con respecto al manejo y adecuada terapia según el diagnostico presentado pero estos de ninguna manera aceptaron las sugerencias y opciones brindadas.

La medición de los niveles séricos de la eritropoyectina es la prueba fundamental en el diagnóstico de la policitemia primaria (4,21). Esta prueba confirma la afección a nivel mieloproliferativa como un desorden a nivel del tallo clonal (4, 9), actuando como un regulador químico hormonal el cual es detectado a nivel central y causa una retroalimentación negativa con un resultante descenso de sus niveles para tratar de sostener un hematocrito normal (1,13,16).

Por lo anterior, entre mayor sea la hemoconcentración, menores son los niveles de esta hormona, puesto que responde a una supresión causal de las células

yuxtaglomerulares, para tratar de mantener un control en el hematocrito, hemoglobina y plaquetas (4,19,10) lo cual sucedió en el caso que se expone, en donde los niveles de esta hormona se encontraron 10 veces por debajo de los niveles normales de un canino situación que aclara el diagnostico de este paciente, concluyendo que las convulsiones correspondían a esta patología y esta a su vez no era causa subsecuente de otra anormalidad sistémica, sino que la policitemia vera desencadenó ciertos desordenes sistémicos como las convulsiones.

En conclusión, los resultados del caso clínico demuestran que existen varias alteraciones de tipo sistémico que causan desordenes neurológicas convulsivo, es de suma importancia el conocimiento, valoración y diagnostico preciso de estas anormalidades.

En ciertas ocasiones los pacientes con estas afecciones pueden ser sujeto de un subdiagnóstico y por ende de un manejo médico y terapéutico que generalmente no es el adecuado, puesto que si no se corrige el factor primario, no es posible el manejo correcto y eficaz del problema.

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REVISIÓN DE LITERATURA

Síndrome de disfunción cognitiva de perros geriátricos Cognitive dysfunction syndrome in senior canines Diana Gallego V, 1 MV, Judith Figueroa R, 1 M.Sc, Camilo Orozco S, 1 * Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Departamento de Ciencias para la Salud Animal, Sede Bogotá, Colombia. *Correspondencia: caorozcos@unal.edu.co 1

Recibido: Noviembre 15 de 2009; Aceptado: Julio 18 de 2010

RESUMEN Durante su vida geriátrica, algunos perros pueden presentar cambios progresivos en su comportamiento habitual, como desorientación, disminución en la interacción con los miembros de la familia, irritabilidad y vocalización excesiva, entre otros. La inespecificidad de estas alteraciones ha hecho que muchas de estas modificaciones comportamentales sean consideradas, erróneamente, como signos típicos del envejecimiento “normal”. No obstante, estas pueden ser reflejo de un proceso patológico cerebral que provoca deterioro progresivo de las funciones cognitivas en perros geriátricos. Recientemente, fue descrita una enfermedad conocida como Síndrome de Disfunción Cognitiva de perros senior o “enfermedad de Alzheimer del perro”, debido a las similitudes clínicas y patológicas con esta enfermedad en humanos.

Los animales afectados desarrollan cambios morfofuncionales en diferentes zonas cerebrales, lo que probablemente conduce a la aparición de cambios asociados al decline cognitivo, es decir, disminución en la capacidad de recopilar información, procesarla, retenerla y tomar decisiones, lo que termina provocando efectos deletéreos sobre la calidad de vida del paciente afectado al no lograr desenvolverse normalmente en su medio. Dada la inespecificidad de los signos clínicos, la anamnesis y los test comportamentales han sido considerados como las principales herramientas diagnósticas para identificar este síndrome. Por otra parte, debido a que aún no han sido plenamente establecidos los aspectos etiopatológicos, los mecanismos implicados en el desarrollo de esta neuropatología aún siguen inconclusos, por lo tanto, no son muchas las estrategias terapéuticas disponibles, de las cuales solo la selegilina ha sido aprobada por la FDA. Palabras clave: Disfunción cognitiva canina, envejecimiento canino, neurodegeneración, síndrome demencial canino.

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Gallego - Síndrome de disfunción cognitiva de perros

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ABSTRACT During their senior life, some dogs may show progressive changes in their normal behavior such as disorientation, decreased interaction with family members, irritability and excessive vocalization, among others. The non-specificity of these alterations has led to the erroneous belief that many of these behavioral modifications are, typical or “normal” signs of aging.

However, this may be a reflection of a pathological process that causes progressive brain deterioration of the cognitive functions in senior dogs. Recently, a condition called Cognitive Dysfunction Syndrome in senior dogs or “dog Alzheimer’s disease” was described, due to its clinical and pathological similarities with the human disease. Affected animals develop morphological and functional changes in different areas of the brain, which probably leads to the appearance of changes associated with cognitive decline, i.e., decreased ability to gather, process, or retain information, and make decisions, which ends up causing deleterious effects on quality of life of affected patients by failing to function normally within their environment. Given the nonspecific clinical signs, medical history and behavioral tests have been considered as the main diagnostic tools to identify this syndrome. On the other hand, due to the fact that no etiopathological aspects have been fully established, the mechanisms used in the development of this neuropathology are still inconclusive, therefore, they are not many therapeutic strategies available, out of which Selegiline has been approved by the FDA. Key words: Canine cognitive dysfunction, canine aging, neurodegeneration, canine dementia syndrome.

INTRODUCCIÓN Desde tiempos ancestrales, el perro ha acompañado al hombre a lo largo de su historia evolutiva brindándole compañía, lealtad y seguridad. Dada esta estrecha relación, actualmente el canino es considerado como una de las especies domésticas más cercana al hombre, desempeñando un papel relevante como miembro activo en un gran número de familias y comunidades humanas alrededor del mundo donde, el sentido de responsabilidad de algunos propietarios por sus mascotas caninas, ha promovido el mejoramiento de los cuidados nutricionales y sanitarios que permiten al animal, alcanzar, alargar y vivir normalmente su vejez (1). No obstante, la edad avanzada en caninos se asocia frecuentemente a alteraciones comportamentales y déficit cognitivo, los cuales pueden manifestarse con signos clínicos de desorientación, pérdida de la interacción social, disturbios del sueño, disminución en la actividad general y pérdida progresiva de recuerdos adquiridos durante el entrenamiento casero o profesional (1-3).

Inicialmente, estos cambios comportamentales fueron asumidos por

algunos médicos veterinarios, como indicio de senilidad asociada a la edad, de etiología desconocida y frente a los cuales no se podía realizar ningún tipo de intervención (2). Sin embargo propusieron la terminología de Síndrome de Disfunción Cognitiva de perros geriátricos (SDC), para describir el déficit cognitivo observado en algunos perros geriátricos (1,2,4,5).

El SDC o “enfermedad de Alzheimer del perro”, por sus similitudes clínicas y fisiopatológicas con esta enfermedad de los humanos (6), es un síndrome demencial, neurodegenerativo, de carácter progresivo, que tienden a padecer algunos caninos a lo largo de su vida geriátrica (4,7-9). Esta patología se presenta generalmente en perros mayores de 7 años (6), algunos de los cuales exhiben contundentes signos clínicos relacionados a la disminución de la capacidad cognitiva.

El término cognición hace referencia a procesos mentales como percepción, conciencia, aprendizaje, memoria y toma de decisiones, que permiten al individuo obtener información del medio ambiente para así,

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tomar decisiones, actuar y desenvolverse normalmente (10). En este sentido, el déficit cognitivo observado en pacientes con SDC se refiere a la disminución en la capacidad de recopilar información, procesarla, retenerla y tomar decisiones (3,8,11-13), dando origen a cambios comportamentales que al ser considerados por algunos propietarios, como signos “normales” del envejecimiento, no son reportados al médico veterinario. Estos cambios incluyen la falta de reconocimiento hacia los miembros de la familia, dificultad para realizar tareas simples como comer, hacer deporte y alteraciones en el ciclo sueño-vigilia (14), provocando limitación del desenvolvimiento social y sentido de supervivencia en el animal afectado, lo que finalmente puede conducir al rechazo de ciertos propietarios para asumir el cuidado de este tipo de pacientes, aumentando el riesgo de algunas mascotas a ser sacrificadas.

Por otro lado, el sacrificio del animal también se refleja en una disminución en la calidad de vida de su familia, ya que se genera en ella sentimientos de dolor y pérdida.

Tras considerar las implicaciones médicas y sociales de este tipo de padecimientos y teniendo en cuenta la importancia de hacer un reconocimiento preciso de esta patología, frente a signos de decline cognitivo leve provocados por el envejecimiento normal, el presente artículo se propone describir de manera detallada las características clínicas y fisiopatológicas propias de este síndrome demencial canino y de igual manera presenta las herramientas diagnósticas y terapéuticas que buscan detener la progresión de los signos clínicos de esta enfermedad, la cual es considerada hoy como uno de los trastornos neurodegenerativos de mayor impacto, asociados a la edad en la población canina geriátrica.

Presentación clínica del SDC. Los signos que incluyen alteraciones comportamentales en perros geriátricos, algunas veces son considerados como rasgos propios del proceso de envejecimiento, sin embargo, es importante diferenciar entre aquellas alteraciones comportamentales que están relacionadas con un daño serio de los

procesos cognitivos, es decir, “envejecimiento patológico” y una disminución leve de la actividad psicomotora o “envejecimiento normal” (2,13,15-16).

Los cambios comportamentales son característicos de cada paciente afectado, pudiendo observarse distintos grados de alteración cognitiva, por ejemplo, algunos perros pueden llegar a desconocer a los miembros de su familia y otros, con un grado menor de déficit cognitivo, pueden recordar sin dificultad las instrucciones aprendidas durante el entrenamiento casero previo (14).

Probablemente, la alteración de los hábitos de micción, pero no de defecación, es el más frecuente de los signos observados por los amos en los pacientes con SDC (14); así, la poliuria puede ocurrir sin la presencia de enfermedades secundarias o sin que ocurran cambios medioambientales como la falta de acceso a un área apropiada de evacuación y la presencia o no de los propietarios. Adicionalmente, en algunas ocasiones se reportan casos en los que el perro afectado presenta episodios de confusión y desorientación (17), en los que la mascota puede perderse dentro de la casa o el jardín, atascarse en una esquina, ir a la puerta equivocada o al lado equivocado de la puerta. Los signos clínicos también incluyen menor interacción con los propietarios, lentitud para obedecer órdenes, alteraciones en el ciclo sueño-vigilia, vocalización excesiva, intolerancia al ejercicio, dificultad para subir escaleras, aumento de la irritabilidad, nuevos miedos o fobias y en algunos casos aislados, los perros pueden apegarse más a sus propietarios y seguirlos a todos lados. (14,17).

Dada la amplia variedad de alteraciones comportamentales reportadas, algunos autores han sugerido el uso de escalas de clasificación para las mismas, como la propuesta por Landsberg (3), donde los signos clínicos pueden ser categorizados bajo los siguientes tópicos: 1. Desorientación espacial y/o confusión, 2. Alteración en las capacidades de aprendizaje y memoria (pérdida de hábitos de aseo en casa, pérdida de la capacidad para obedecer algunas ordenes o tareas previamente aprendidas), 3. Actividad repetitiva o disminución de esta,

Gallego - Síndrome de disfunción cognitiva de perros

4. Alteración y disminución de las relaciones sociales, 5. Disminución de la percepción y/ o de la capacidad de respuesta, 6. Aumento de la ansiedad o inquietud, 7. Alteración del apetito, asociada a estados de confusión que les impide ubicar su alimento, 8.

Alteración de los ciclos diurno-nocturno (sueño-vigilia). Aunque la alteración del ciclo sueño vigilia característica de algunos perros con SDC ha sido más difícil de interpretar, los resultados obtenidos a partir de estudios realizados en humanos con enfermedad de Alzheimer (EA) sugieren que el disturbio de este proceso puede ser el resultado de una alteración en el ritmo circadiano en perros que padecen SDC (18,19).

Prevalencia. Considerando los reportes que sugieren la presencia a nivel mundial de más de 52 millones de caninos alrededor de los 7 años edad (20), y teniendo en cuenta que debido a su condición geriátrica, esta es la población canina con mayor riesgo de padecer SDC (6,19), numerosos estudios de impacto regional, han diseñado e implementado diferentes cuestionarios observacionales, a través de los cuales, los propietarios de mascotas caninas geriátricas son entrevistados para detectar posibles cambios comportamentales y, con esto, lograr determinar la prevalencia de SDC en los animales evaluados. En este sentido, un estudio realizado en Italia que incluyó 124 perros geriátricos, reveló una prevalencia de SDC cercana al 50%, en la que 75 perros mayores de 7 años, presentaron signos coincidentes con la enfermedad (13). De igual manera, otro estudio (1) realizado con 180 perros entre los 11 y 16 años de edad, encontró que el 28% de los perros entre 11 y 12 años, mostraron algún grado de déficit cognitivo, mientras que aquellos individuos entre 15 y 16 años tenían una probabilidad cercana al 68% de sufrir la enfermedad, lo cual sugiere una estrecha relación entre el proceso de envejecimiento y la probabilidad de padecer SDC. No obstante, los datos sobre la prevalencia mundial de este síndrome demencial aún no han sido obtenidos, en parte, debido a la tendencia de un gran número de propietarios a no reportar al médico veterinario los posibles cambios comportamentales en sus

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mascotas geriátricas (13), lo que probablemente ha limitado la obtención de datos precisos que estimen la prevalencia del SDC a nivel mundial.

Bases fisiopatológicas del SDC. El término neurodegeneración define la muerte neural patológica observada en algunas enfermedades neurodegenerativas como el SDC. Esta enfermedad se caracteriza morfológicamente por una disminución en el número de neuronas colinérgicas en la corteza cerebral y el hipocampo (áreas especialmente relacionadas con cambios en el comportamiento cognitivo y la memoria) (3,21). Aunque el origen de esta disminución es desconocido, algunos autores han sugerido al estrés oxidativo y la acumulación de péptido beta-amilode (bA), como posibles factores causales de los signos clínicos observados en SDC (2).

El péptido bA juega un papel importante en la fisiopatología de la demencia canina (2,8,22-29) y de la EA en humanos (2) ya que su acumulación genera efectos neurotóxicos (6) como degeneración de las sinapsis y pérdida de neuronas colinérgicas; adicionalmente, su presencia y grado de acumulación han sido relacionados con la severidad de los signos clínicos (1,6,8,22,30-31).

Por su parte, el estrés oxidativo provoca lesiones a nivel de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos de diversas neuronas (2,8,32-33).

De acuerdo con algunos autores, este daño oxidativo es un mecanismo fundamental para el desarrollo de las enfermedades que cursan con disfunción cognitiva asociada a la edad (34), ya que el paso del tiempo en el cerebro provoca agregación de sustancias oxidantes y disfunción de los mecanismos protectores como la superóxido dismutasa y la vitamina E (35), lo que puede potencialmente dañar la función neuronal y provocar su muerte (2). Esta muerte neuronal conduce a la depleción de neurotransmisores de tipo excitatorio como la acetil-colina que interviene en prácticamente todas las funciones cognitivas y especialmente en la memoria; la dopamina que se relaciona con el control del movimiento (motricidad), las emociones y la capacidad de sentir placer;

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la noradrenalina asociada con la vigilia, la atención y la capacidad de asimilar nuevos datos; y la serotonina que se relaciona con el estado anímico y el control del sueño (6,21,23,36). En este sentido, tales alteraciones neuroquímicas, acompañan la manifestación de varios de los signos clínicos observados en pacientes con SDC. Diagnóstico. En la práctica veterinaria, los problemas conductuales son comunes y además, suelen ser de origen multifactorial (8,9,31). Así, considerando la variedad e inespecificidad de los signos clínicos asociados al SDC, es importante utilizar la anamnesis como herramienta para obtener datos específicos del paciente y asegurarse que el propietario ha proporcionado una lista completa de todos los signos comportamentales y médicos de su mascota, ya que tal información podría proporcionar un sustento sólido en el hallazgo de posibles problemas médicos que puedan ser responsables de la presentación o exacerbación de los signos clínicos (3), además, el examen clínico y la evaluación neurológica mediante el uso de pruebas de evaluación cognitiva, podrían conducir al médico veterinario a la obtención de un diagnóstico temprano; no obstante, el único diagnóstico confiable es el que se basa en estudios anatomopatológicos post mortem de muestras encefálicas, de tal forma que se pueda confirmar microscópicamente la presencia de los cúmulos de bA (6).

Dentro de estos cuestionarios de evaluación cognitiva, se encuentran las pruebas neurofisiológicas sistemáticas que buscan clasificar el daño cognitivo a través de métodos como el Aparato Modificado de Prueba General de Winsconsin (Universidad de Toronto), en el que los perros son recompensados por cada respuesta acertada que obtengan. En términos generales, en esta prueba los perros tienen acceso a una bandeja extraíble que contiene tres alimentos empotrados en pozos, los cuales pueden ser cubiertos para poner a prueba el aprendizaje visual y la memoria (37-38).

De esta manera, la escasez de pruebas diagnósticas de alta confiabilidad que garanticen la presencia o no de la enfermedad, otorga a la identificación temprana de los signos clínicos, un papel crucial para el establecimiento de un buen pronóstico en términos del mejoramiento y extensión en la calidad de vida de los pacientes afectados.

Por ejemplo, una prueba de discriminación consiste en presentar a los perros una opción de respuesta frente a tres objetos, donde uno es diferente y los otros dos son idénticos.

Para realizar de forma adecuada esta prueba, se requiere que el sujeto aprenda que el objeto extraño está asociado con un premio de comida y que recuerde esta regla general al ser evaluado en una ocasión posterior.

Además, para distribuir el sentido del olfato para la solución, se coloca igual cantidad de comida en una posición inaccesible de los objetos que no ofrecen recompensa (2).

Estas pruebas neurofisiológicas permiten la evaluación objetiva y cuantitativa de los déficits en el aprendizaje y la memoria, sin depender de los cuestionarios realizados a los propietarios y esta evaluación es posible gracias a la implementación de tres objetivos específicos: 1. Identificación de los cambios cognitivos no subjetivos, que sean característicos del envejecimiento en los perros, 2. Caracterización de las bases neurobiológicas de la disminución en la capacidad cognitiva, debido al envejecimiento, y 3. Elaboración de potenciales intervenciones con el objeto de suprimir o minimizar los efectos sobre la calidad de vida del animal (2,37-38).

En este sentido y de acuerdo con algunos autores, la forma más efectiva de detectar esta condición es a través de la instauración de cuestionarios comportamentales en la clínica geriátrica rutinaria (2,8), obtenidos a partir de diversas investigaciones (15,34) que han permitido el desarrollo de una serie de cuestionarios que pretenden clasificar el comportamiento de los pacientes afectados.

Igualmente y teniendo en cuenta que las dos capacidades cerebrales susceptibles a declinar frente al paso de los años, memoria espacial (la habilidad para recordar la localización de la comida, por ejemplo) y memoria de reconocimiento de objetos (la habilidad para recordar objetos vistos con 10-120 segundos de anticipación) (8), son afectadas en los procesos

Gallego - Síndrome de disfunción cognitiva de perros

neurodegenerativos, varios estudios han desarrollado ciertas escalas y criterios de evaluación indirecta de demencia en perros (39). Por ejemplo, ha sido propuesto un índice de evaluación de demencia que discrimina entre normal, predemencia y demencia (17). Adicionalmente (40), presentó la escala A.R.C.A.D (evaluación de desordenes cognitivos y afectivos relacionados con la edad), donde el comportamiento del perro es evaluado indirectamente por medio de un cuestionario formal realizado al propietario, con el fin de evaluar el déficit mediante una escala de evaluación de 1 a 5.

No obstante, para la detección del grado de disfunción cognitiva, habrá de tenerse en cuenta el tipo de prueba realizada y el aumento en la variabilidad de las habilidades cognitivas de los perros afectados (8,13).

De acuerdo con (2), la terminología actual de clasificación basada en los déficits cognitivos y los cambios comportamentales observados en perros geriátricos, es probable que necesite de un mayor perfeccionamiento o revisión por parte de los investigadores, ya que aún no es claro si la clasificación del comportamiento en perros examinados, presenta un vínculo directo con las medidas clínicas y de laboratorio observadas en pacientes afectados con SDC; además, se desconoce actualmente si los resultados del laboratorio se pueden traducir directamente en los resultados obtenidos a partir de la práctica clínica. Es importante hacer esta distinción, debido a que aún no se encuentra establecido si las pruebas de aprendizaje, de memoria y de procesamiento cognitivo realizadas junto con las pruebas de laboratorio específicas, involucran la participación de los mismos circuitos cerebrales que están comprometidos en SDC. Debido a esto, el clasificar un perro con SDC en base a las puntuaciones neuropsicológicas resulta bastante complejo, ya que aquellos estudios que han incluido pruebas neuropsicológicas y cuestionarios para evaluar los cambios comportamentales, solo se han realizado en un mismo grupo de perros (2).

Adicionalmente, son varios los dominios cognitivos que se ven afectados durante el SDC (lenguaje, memoria, habilidades viso-

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espaciales); y la observación de un signo, no es suficiente para la instauración de un tratamiento. No obstante, la aparición de un deterioro cognitivo se puede llegar a traducir en el empeoramiento de los signos existentes, y pone de manifiesto la importancia de hacer seguimiento a las evaluaciones clínicas (8).

En conclusión, para determinar si un perro presenta signos de disfunción cognitiva, el médico veterinario debe confiar en la información otorgada por el propietario en la historia clínica; no obstante, con el diseño y aplicación de un cuestionario cuidadosamente elaborado, es probable que los signos de SDC, sean detectados durante las primeras etapas de desarrollo, y en especial si se trata de animales que hayan tenido previamente un alto nivel de entrenamiento (3).

Alternativas terapéuticas para el tratamiento del SDC. Actualmente se dispone de varias estrategias terapéuticas que han sido desarrolladas a lo largo de diferentes estudios realizados con caninos geriátricos afectados por SDC. De tipo comportamental.

Una consecuencia de las patologías asociadas a la edad en perros, es la pérdida de los recuerdos adquiridos durante el entrenamiento casero o profesional y debido a este efecto, el perro puede perder su habilidad para realizar tareas simples o para responder comandos previamente aprendidos. Frente a este tipo de cambios comportamentales que pueden ser observados en pacientes con SDC, la instauración de una terapia comportamental y reentrenamiento del animal en estados tempranos de la enfermedad, han sido sugeridas como herramientas terapéutica adecuadas y adicionales al tratamiento farmacológico. Reeducar a perros con disfunción cognitiva, requiere paciencia y el uso de órdenes muy simples con una clara recompensa y es importante que el propietario inicie este re-entrenamiento lo antes posible, para evitar el establecimiento de comportamientos indeseados en la mascota (2,6).

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Farmacológico. Parte del tratamiento farmacológico tiene como objetivo restablecer los niveles de neurotransmisores para evitar que el proceso degenerativo avance demasiado rápido. La mayor parte de tratamientos utilizados para personas afectadas con la EA, aún no han sido probados en perros, así que en la práctica clínica se hace necesario utilizar el criterio científico y profesional para ver cuales tratamientos funcionan y cuáles no. No obstante, existen algunas opciones disponibles como la selegilina, primer agente terapéutico aprobado por la FDA en 1998 para uso en perros (5,41); este es un inhibidor selectivo e irreversible de la enzima monoamino-oxidasa B (MAO B), que aumenta los niveles de dopamina y además posee efecto antioxidante, disminuye la muerte celular y favorece la síntesis de factores de crecimiento neuronal. En cerebros caninos, la selegilina incrementa la 2-feniletilamina, la cual funciona como neuromodulador y potencializa las funciones de la dopamina y las catecolaminas (3). Un doble estudio utilizando selegilina, demostró la disminución en la progresión de los cambios degenerativos en pacientes con EA y un mejoramiento significativo en perros con SDC (1). Por lo anterior, la regulación en la concentración de neurotrasmisores ha mostrado ser la terapia farmacológica con mayor efectividad frente a la progresión de signos clínicos de perros con SDC. Por otro lado, existen otras opciones farmacológicas para el tratamiento del SDC en caninos geriátricos, tales opciones incluyen fármacos que favorecen la circulación vascular cerebral, como la nicergolina y la propentofilina; y fármacos que potencien el sistema noradrenérgico como el adrafinil y el modafinil (42).

Nutricional. Tras reconocer el papel de ROS (especies reactivas al oxígeno) en las enfermedades neurodegenerativas, algunos investigadores han recomendado, por una parte, intentar reducir la cantidad de radicales libres formados a partir de influencias exógenas ambientales y, por otra parte, la inclusión en la dieta de suplementos nutricionales, los cuales han demostrado poseer un papel potencialmente valioso a la

hora de maximizar los beneficios de la terapia psicofarmacológica, en términos de aumento de la calidad de vida al observar cambios positivos significativos en el comportamiento de caninos que sufren SDC (2,5,33).

Dentro de los efectos benéficos atribuidos a los productos antioxidantes, se encuentra la potencialización de la función mitocondrial durante la vejez, lo que resulta en disminución de la producción de ROS e incremento funcional de los sistemas antioxidantes (2-3,8,34). Como resultado de estos efectos, algunos autores han sugerido un mejoramiento en la capacidad cognitiva de pacientes afectados con SDC (43) y adicionalmente, una variedad de estudios han mostrado que la ingesta de frutas y vegetales, puede disminuir el riesgo de sufrir el decline cognitivo asociado a la edad en roedores, perros, e inclusive en humanos, atribuyendo esta propiedad a sus capacidades antioxidantes y antiinflamatorias (3,5,34).

Tales investigaciones, han permitido la identificación de una cantidad de compuestos antioxidantes como las vitaminas E y C, el beta-caroteno, el selenio, la L-carnitina y el ácido alfa lipóico, cuya asociación se ha comprobado que mejora la función mitocondrial en neuronas de animales viejos, haciendo que funcionen a niveles comparables a los de animales jóvenes, además, tienen un efecto sinérgico en el mejoramiento de la memoria. Igualmente, ciertos autores sugieren que el Gingko Biloba, vegetal que además de poseer efecto antioxidante, presenta una variedad de propiedades tales como antiinflamatoria, vasodilatadora cerebral, potenciadora de la función mitocondrial e inhibidora de la enzima MAO (3,13,44), genera una disminución de la severidad de los signos clínicos observados en pacientes con SDC. Adicionalmente, compuestos naturales de origen animal como el propóleo, del cual nuestro grupo de investigación estudia sus propiedades neuroprotectoras, actualmente son valorados por sus cualidades antioxidantes y neuroprotectoras (45); no obstante, aún no existen estudios que describan efectos positivos de este compuesto sobre SDC.

Gallego - Síndrome de disfunción cognitiva de perros

Otras investigaciones incluyen el estudio de la función de ciertas moléculas clasificadas como cofactores mitocondriales (acido lipoico, l-carnitina), los cuales pueden potenciar la función de la mitocondria de células viejas, provocando una menor producción de ROS durante la respiración aerobia. La suplementación alimenticia con estos cofactores mitocondriales, incrementa sus concentraciones dentro de las células y restaura la unión a enzimas específicas, lo que restituye la eficiencia mitocondrial y reduce el daño oxidativo al RNA (46).

Igualmente, se ha sugerido el uso de cofactores mitocondriales junto con antioxidantes, con el objeto de provocar un mejoramiento en los procesos de aprendizaje y memoria, por medio de una acción sinérgica (18).

Por otro lado, en el sector comercial ya se encuentran disponibles productos como la dieta terapéutica de Hill’s, conocida como Prescription dietR Canine b/dR, (Hills Pet Nutrition, Topeka, KS), disponible para el tratamiento de la disfunción cognitiva en perros senior. La eficacia de esta dieta fue evaluada utilizando pruebas neurofisiológicas durante más de dos años. El objetivo del estudio fue suplementar la dieta de perros, con cofactores mitocondriales y antioxidantes de amplio espectro, con el fin de mejorar las defensas antioxidantes y disminuir la acumulación de ROS y sus efectos tóxicos; después de una prolongada evaluación, los resultados indicaron que estos productos pueden ayudar retrasar el decline cognitivo relacionado con la edad (3). No obstante, para desarrollar una dieta suplementada con antioxidantes, se debe tener en cuenta que la selección de los componentes, los rangos de dosis y la vía de administración, varían considerablemente entre especies. Algunos antioxidantes son absorbidos más rápidamente que otros, por factores propios de cada especie, debido a las diferencias metabólicas intrínsecas de biodisponibilidad; así, diferentes especies pueden beneficiarse de diferentes tipos de antioxidantes, pero no todas las especies pueden beneficiarse de los mismos antioxidantes (2).

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En conclusión, esta práctica requiere de mayor investigación para poder integrar la suplementación alimenticia como un componente terapéutico en los casos de SDC, lo que a su vez, podría llegar a ser soportado por algunos autores que han sugerido una variedad de efectos benéficos en casos de EA, a partir de la implementación de dietas ricas en sustancias antioxidantes (2-3,8,34).

Hábitos de vida más saludables. Para perros geriátricos afectados con SDC el ejercicio físico, una correcta alimentación y la suplementación alimenticia con sustancias antioxidantes, se constituyen como herramientas útiles para retrasar tanto la aparición del proceso, como la velocidad de evolución del mismo. La actividad física mejora el flujo sanguíneo al cerebro y así puede reducir el riesgo de infarto, demencia y declive cognitivo. La actividad podría estimular el crecimiento de las células nerviosas en el hipocampo, la región del cerebro que participa en funciones de la memoria, y de acuerdo con varios estudios, ello ayudaría al cerebro a construir una especie de reserva para prevenir un futuro deterioro mental (3,6).

En conclusión, dado el papel del médico veterinario como velador de la calidad de vida de los caninos geriátricos, durante la práctica clínica resulta de gran importancia el entrenamiento en el conocimiento, detección de signos clínicos asociados al Síndrome de Disfunción Cognitiva y además, el criterio científico con el que sea abordado el manejo terapéutico para esta enfermedad, haciendo énfasis en el diagnóstico de la condición para instaurar algunos de las alternativas terapéuticas disponibles.

Por otra parte, teniendo en cuenta la relación existente entre este síndrome demencial y el proceso de envejecimiento, los perros en riesgo de padecer la enfermedad son muchos y más si se considera el continuo crecimiento de la población canina geriátrica, por lo tanto, se hacen necesarias futuras investigaciones en el conocimiento, control y prevención de esta patología, para disminuir el impacto generado por sus efectos.

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1.4 P a l a b r a s c l a v e : S o n t é r m i n o s cortos que ayudan a la clasificación

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del artículo. Se sugiere emplear 6 como máximo. Utilice los términos de la lista “Medical subject headings” (MeSH) u otro descriptor acorde con el tema de su investigación. (DeCS, BIREME, NLM, etc.).

limitaciones del estudio e igualmente evitar especulaciones. Resaltar las conclusiones del estudio, así como las recomendaciones para futuras investigaciones.

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Agradecimientos: Mencionar las personas o instituciones que han colaborado con la investigación (financiera, logística, intelectual, entre otras.).

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1.5 A b s t r a c t ( r e s u m e n t r a d u c i d o a l inglés) debe poseer una estructura y contenido igual al de español.

1.6 Key Words: Palabras clave, deben ser iguales a las de español, pero en idioma ingles.

2.

3.

Introducción: Debe indicar claramente el propósito de la investigación, relacionando igualmente en forma selectiva la literatura pertinente. No incluya datos ni conclusiones del trabajo q u e e s t á d a n d o a c o n o c e r. A l finalizar esta sección deberá hacerse con el objetivo general.

Materiales y métodos: Se debe describir claramente los procedimientos empleados en la investigación, incluyendo diseño estadístico y análisis de datos. Esta sección deberá ser estructurada indicando tipo de estudio, sitio, condiciones geo-climáticas, coordenadas del sitio de estudio, pacientes o animales de estudio, métodos de laboratorio, aspectos éticos, análisis de resultados, etc.

Estas secciones deberán ir con negrilla y luego punto seguido en donde se inicia el texto de cada s ec c i ó n .

4.

Resultados: Corresponde a la información de los hallazgos pero sin incluir comentarios ni referencias a otros trabajos. Se sugiere utilizar tablas y figuras, las cuales no deberán ser más de seis en lo posible.

5.

Discusión: Es la los resultados contrastación de otros estudios. Se

interpretación de obtenidos y la los mismos con debe destacar las

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8.3.E j e m p l o s p a r a l a s r e f e r e n c i a s bibliográficas según las normas de Vancouver.

Artículos de Revistas • Artículos Autor/es. Título del artículo.

Abreviatura internacional de la revista, año; volumen (número): página inicial-final del artículo.

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Los artículos deben escribirse en su idioma original si la grafía es latina.

• Suplemento de un volumen Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 15(3), Septiembre - Diciembre 2010

(número): páginas o indicador de extensión.

Disponible en: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia. MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/ mmwr/preview/mmwrhtml/ 00048303.htm • Monografía en formato electrónico Título. (Tipo de soporte). Editores o p r o d u c t o r e s . E d i c i ó n . Ve r s i ó n .

Lugar de publicación: Editorial; año.

Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CDROM). Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0. Hagenstown: LippincoltRaven; 1997.

• Archivo informático A u t o r. T í t u l o . ( T i p o d e s o p o r t e ) .

Versión. Lugar: Editorial; año.

• Tesis de Maestría, doctorado y trabajos de grado Autor(es) título, Fa c u l t a d , Departamento, año. Arrieta G. P r o d u c c i ó n d e Ve r o t o x i m a s e n Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

9.

Fotografías: Se podrán utilizar fotografías, de excelente calidad, digital. La identificación, secuencia y títulos deben establecerse claramente para localizar el lugar que le corresponda en el contenido del artículo. Las fotografías deberán llevar el título de figura.

10. E v a l u a c i ó n d e a r t í c u l o s : L o s artículos recibidos para publicación, después de constatar que cumplen con las normas expresas de la Revista MVZ Córdoba, serán

enviados a pares que conforman el Comité Científico para su respectiva evaluación. En caso de recibir algún manuscrito que por su especialidad de contenido no pueda ser evaluado por los miembros del comité, este será remitido a sendos evaluadores pertenecientes a la comunidad científica nacional o internacional.

En la redacción del contenido deberán respetarse las normas internacionales para manuscritos científicos que regulan las abreviaturas, literatura citada, símbolos, nomenclaturas atómicas, zoológicas, botánicas, químicas, entre otros. Los valores deben informarse en unidades del sistema métrico decimal y de acuerdo con el Sistema Internacional de Unidades. La revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba no se responsabilizan por opiniones y resultados expresados por los autores, los cuales serán responsabilidad exclusiva de ellos.

Conflicto de intereses. Los autores deben expresar los intereses posibles que posean en el trabajo que realizaron.

Correspondencia: Los artículos, consultas, aclaraciones y correspondencia general se deben dirigir a la dirección abajo señalada, sin embargo, también los trabajos pueden ser remitidos en forma electrónica al editor o al c o e d i t o r. http:// www.unicordoba.edu.co Comité Editorial REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Fa c u l t a d d e M e d i c i n a Ve t e r i n a r i a y Zootecnia Teléfonos (094) 756 11 67, 756 07 10 http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/ revistamvz/index.htm Apartado Aéreo 354 Montería - Colombia E d i t o r M a r c o G o n z á l e z To u s . M . S c . marcog@escarsa.net.co

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Re vista MVZ Cór dob a Revista Córdob doba

Instructions to the Authors The Journal MVZ Cordoba is the official organ of diffusion of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of the Universidad de Cordoba, is a biannual publication and circulates in the international environment. The magazine publishes (sections) original articles of investigation, technical articles, literature reviews, topic revisions, brief communications, inform of cases and, others that to opinion of the Editorial Committee are from general interest. The topics that the Journal MVZ Cordoba publishes are related with the veterinary medicine and zootechny, aquaculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences and other topics of interest in the agricultural sciences.

“The Journal MVZ Córdoba follows the policies of the World Health Organization (WHO) and of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) for clinical trial registration, recognizing the importance of those initiatives for international dissemination of information on clinical research, in open access. Accordingly, only articles of trials previously registered in one of the clinical Trial Registries that meet WHO and ICMJE requirements will be accepted for publication, starting in 2007. The list of registries accepted by WHO and ICMJE is available in ICMJE site.

The trail registration number should be published at the end of teh abstract”.

Interested in publishing will send to the Editor an introductory letter signed by all the authors declaring expressly that the remitted article has not been published previously and that the authors don’t have conflict of interests.

Two printed copies will be sent of the article written on any of the programs for word processing, double space, paper size letter, in ink quarter note for a single face of the leaf, with arial letter, font

size 12 and C.D. (these originals will not be returned) or by e-mail. Margin should not be inferior to 3 cm and pages will be numbered consecutively including the whole material. Journal accepts papers in either Spanish or English. Authors should consult general guides described below. The Journal MVZ Cordoba is welcomed to the general requirements of uniformity for biomedical journals (Norms of Vancouver).

1.

Presentation: It should contain the following information:

1.1. T i t l e o f t h e a r t i c l e : I t s h o u l d b e presented in Spanish and English language. The last one should appear below the first one double spaced and with a minor font size that the main one. The Title should be concisely but informative and be of up to 15 words.

1.2. Name: Last name of author(s). For the second name only be placed the first letter in capital followed by coma and each author´s highest academic degree or professional title. It should include the institution affiliation of authors, (Institution Name, address, city, country). It should also indicate the responsible person for the manuscript correspondence (e-mail included).

1.3 Abstract: Should be structured and of approximately 250 words, indicating the paper’s objective clearly and including: objective, material and methods, results and conclusions. This section should be in boldface and then point followed by the text of the subsequent section.

1.4 Key words: Are short terms. These will be useful to classify the article.

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List 6 as maximum. Use the terms of the “Medical subject headings” (MeSH) list or another describer in agreement with the topic of their investigation. (DeCS, BIREME, NLM, etc.).

6.

Acknowledgements: Contributions from people or institutions who have collaborated with the investigation (financial, logistics, intellectual, among others) should appear under “Acknowledgements”.

1.5 Abstract (summarize translated to English) it should possess a structure and content similar to the one of Spanish.

7.

Correspondence: Full names of the r e s p o n s i b l e a u t h o r, a f f i l i a t i o n address, postal address, cellular and telephone number, email addresses.

This information should be include in the remission letter or in a single sheet at the end of the article.

8.

References: Will be cited with a number correlative to the order in which they appear in the text and should be numbered consecutively by means of Arabic numbers placed within parenthesis. The list of references will begin in separate sheets, in strict appearance order in the text; they were not in alphabetical order. Original articles should have no more than 30 references. For literature revisions up to 50 references. Presentation of cases and short communications will have only 12 references. As general guide examples of bibliographical references are given below.

8.1.

Journals • Author’s names • Full title of the referenced article • International abbreviation of the journal name • Ye a r • Vo l u m e • I n c l u d e d p a g e s .

International abbreviation must be search in “Journals database” of PubMed, “Catalogue C17”, “DREV”, Biomedical journals of Valencia IHCD.

8.2.

Books and monographs • Author or editor • Title of book, publication place, editorial, year of publication and consulted pages.

8.3.

Examples for the bibliographical references according to the Vancouver norms

1.6 Key Words: Key words, it should be similar to those of Spanish, but in English language.

2.

Introduction: should indicate the paper ’s objective clearly, relating equally in selective form the pertinent literature. Do not include data neither conclusions of the work that is giving to know. When concluding this section it will be made with the general objective.

3.

Material and Methods: should be described clearly the procedures used in the investigation including statistical design and data analysis.

This section should be structured indicating type of study, place, geoclimatic conditions, coordinate of the study place, patients or animals, laboratory methods, ethical aspects, result analysis, etc. These sections should be in boldface then point followed by the text of the subsequent section.

4.

Results: Correspond to findings without comments no references to other works. The use of tables and figures is suggested which should be no more of six.

5.

Discussion: is the interpretation of the obtained results followed by a comparison with other studies. It should stand out the limitations of the study and equally to avoid speculations. Point out conclusions and suggestions for further research.

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Journal articles • Articles Author(s). Title of the article.

International Abbreviation of the journal, year; volume (number): initial-final page of the article.

Examples: Díez Jarilla J, Cienfuegos Vázquez M, Suárez Salvador E. Ruidos adventicios respiratorios: factores de confusión. Rev MVZ Córdoba 1999; 109: 632-634.

• More than six authors Martín Cantera C, Córdoba García R, Jane Julio C, Nebot Adell M, Galán Herrera S, Aliaga M et al. Virus and public health J Vet Sci 1997; 109: 744-748.

• Corporate author Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos amenazantes. Rev MVZ Cordoba 1997; 33: 31-40.

• The author’s name is not indicated Cancer in South Africa (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16.

The articles should be written in their original language if the graph is Latin.

status of the cancer fish patient and the effects of blood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33.

• Paging in Roman numbers Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology.

Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII. • Indication of the article type as it corresponds E n z e n s b e r g e r W, F i s c h e r P A .

Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337.

Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN) (abstract).

Kidney Int 1992; 42: 1285.

• Legal documents Laws: LawTitle. (Name of the Official Bulletin, date, year of publication).

Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos Laborales. (Boletín Oficial del Estado, número 269, de 10-11-95).

• Supplement of a volume Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117.

• Map Name of the map (map type).

Publication Place: Editorial; year.

Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico). Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003.

• Supplement of a number Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma. Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531.

Unpublished Material • In press Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007.

• Number without volume Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14.

• Journal article in electronic format Author. Title. Name of the journal in abbreviate form (support type) year (access date); volume (number): p a g e s o r e x t e n s i o n i n d i c a t o r.

Available in: Transmission of Hepatitis C Virus

• Without number neither volume Browell DA, Lennard TW. Inmunologic

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infection associated infusion therapy for hemophilia. MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/ mmwr/preview/mmwrhtml/ 00048303.htm • Monograph in electronic format Title. (Support type). Editors or producers.

Edition.

Ve r s i o n .

Publication place: Editorial; year.

Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CDROM). Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0. Hagenstown: LippincoltRaven; 1997.

• Informatics file A u t h o r. T i t l e . (support Ty p e ) .

Version. Place: Editorial; year.

• Thesis of Master, Doctorate and under Graduate works Author(s) title, faculty, department, year.

Arrieta G. Producción de Verotoximas e n S h i g e l l a . Te s i s d e M a e s t r í a , Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

9.

Photographs: Pictures can be use, o f e x c e l l e n t d i g i t a l q u a l i t y. T h e identification, sequence and titles should settle down clearly to locate the place that corresponds in the content of the article.

The photographs will take the title of figure.

10. Evaluation of articles: Those manuscripts submitted to the Journal, after verifying that they fulfill the expressed norms of the Journal MVZ Cordoba will be subject to peer reviews of the Scientific Committee for its evaluation. In the

event of receiving some manuscript that by its special content cannot be evaluated by the members of the committee it will be remitted to appraisers belonging to the national or international scientific community.

In the writing of the content the international norms will be respected for scientific manuscripts that regulate the abbreviations, mentioned literature, symbols, atomic, zoological, botanical, chemical nomenclatures, among others.

The values should be informed in units of the metric decimal system and in accordance with the International System of Units.

The Journal MVZ Cordoba and the Universidad de Córdoba don’t take the responsibility for opinions and results expressed by the authors, which will be exclusive responsibility of them.

Conflict of interests. The authors should express the possible interests that possess in the work made by them.

Correspondence: Articles, consultations, explanations and general correspondence should be sent to the address below, however, the works can also be remitted in electronic form to the editor or the coeditor. http://www.unicordoba.edu.co Editorial Committee REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Fa c u l t a d d e M e d i c i n a Ve t e r i n a r i a y Zootecnia Telephones: (094) 7561167, 756 07 10 http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/ revistamvz/index.htm Apartado Aéreo 354 E d i t o r M a r c o G o n z á l e z To u s . M . S c . editormvzcordoba@gmail.com

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Árbitros Rev.MVZ Córdoba 15 (3) 2010 Referees Journal MVZ Córdoba 15 (3) 2010

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Índice de Autores Rev. MVZ Córdoba Volumen 15, 2010 Authors Index Journal MVZ Córdoba Volume 15, 2010

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Índice de Árbitros Rev. MVZ Córdoba Volumen 15, 2010 Referees Index Journal MVZ Córdoba Volume 15, 2010

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FORMULARIO DE SUSCRIPCIÓN Región Colombia América Latina y el Caribe Latin America and Caribbean EUA y Canadá/U.S. and Canada Otras regiones

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NOTA: Cualquier cambio de dirección exige su notificación inmediata a la dirección de la Revista.

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