Revista MVZ Córdoba 16(2) by Revista MVZ Córdoba

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Diseño y Diagramación Luis Carlos Salgado Arroyo Ingeniero de Sistemas luis_salga2@hotmail.com

Impresión Gráficas del Caribe Ltda. Cra. 1B No. 40-42 Tel. (57) (4) 782 6622 Telefax (57) (4) 782 7688 email: diseno@graficaribe.co

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Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba EDITOR

Marco González T. M.Sc. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COEDITOR CO-EDITOR

Salim Máttar V. Ph.D. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

ASISTENTES DEL EDITOR - ASSISTANT EDITORS Luis Carlos Salgado A. Ing. German Arrieta B, M.Sc. Diva Santana C, Lic. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COMITÉ EDITORIAL EDITORIAL COMMITTEE James N. Mills Nelson Alvis G. Raúl Poutou P. Oscar Vergara G.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA U. de Cartagena, Cartagena, Colombia Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá Universidad de Córdoba, Colombia

COMITÉ CIENTIFICO SCIENTIFIC COMMITTEE Nicholas Komar Maria Aguero R. Joaquín Quilez C. Marlene Vargas V. Claudio C. Fonseca Priscila V. Logato Marcelo B. Labruna

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA N. Y. Medical College, USA U. de Zaragoza, España U. Fed. de Vioçosa, Brasil U. Fed. de Vioçosa, Brasil U. Fed. de Lavras, Brasil U. de São Paulo, Brasil

Jorge Salazar B. Juan Carulla F. Henry Grajales L. Claudia Jiménez E. Agustin Góngora O. Sandra Pardo C.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

Texas Tech. University U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. de Los Llanos, Colombia U. Nacional, Colombia

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Revista MVZ Córdoba La Revista MVZ Córdoba es el órgano oficial de difusión de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba. La revista publica artículos originales de investigación, artículos técnicos, revisiones de literatura, revisiones de tema, comunicaciones breves e informes de casos que a juicio del Comité Editorial sean de interés. Los temas que publica la Revista MVZ Córdoba están relacionados con la medicina veterinaria, zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias. La revista está dirigida a los profesionales de la medicina veterinaria, zootecnia, salud pública humana y animal, acuicultura, biología, ciencias básicas biomédicas y biotecnología. Manuscritos y correspondencia: Enviar por correo electrónico al Editor o Coeditor de la Revista MVZ Córdoba. Correos: revistamvz@gmail.com revistamvz@unicordoba.edu.co Preparación de manuscritos: En la sección instrucciones a los autores, se puede obtener la información al respecto. También el documento se puede conseguir directamente en el sitio web: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Suscripción: La Revista MVZ Córdoba se publica cada cuatro meses y circula los meses de abril, agosto y diciembre. Los números de un año se agrupan en un volumen comenzando por el del mes de abril. La suscripción anual tiene un valor de $20.000 (US $10) para América Latina y el Caribe; US $15 para USA y Canadá; US $25 para otras regiones. Para suscribirse, diligencie el formulario que aparece al final de cada revista. Reproducción e impresos: Se autoriza la fotocopia de artículos para fines de uso académico o interno de las instituciones, citando la fuente. Para impresos dirija la solicitud a Revista MVZ Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Apartado aéreo No 354. Publicidad: La Revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba aclaran que la aceptación de publicidad no compromete la aprobación ni el respaldo de los productos o servicios que contraten pautas comerciales o de difusión. Teléfonos: (57) (4) 7561167 / 7560710, Montería, Colombia. Acceso en línea: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Disponible desde el volumen 5 número 1 enero-junio de 2000, texto completo, instrucciones a los autores y suscripciones.

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Journal MVZ Córdoba The Journal MVZ Córdoba is the official diffusion organ of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of the Universidad de Córdoba. The Journal MVZ-Córdoba is devoted to the publication of original research articles, technical articles, literature revisions, especific reviews, short comunications and presentations of cases interest to Editorial Committee. The Journal publishes topics that are related with veterinary medicine, zootechny, aquaculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences and other subjects of interest of the agricultural sciences. The journal is directed to professionals of the veterinary medicine, zootechny, human and animal public health, aquaculture, biology, biomedical basic sciences and biotechnology. Papers and correspondence: Papers should be sent by via e-mail to the Editor or Coeditor of the Journal MVZ Córdoba. e-mails: revistamvz@gmail.com revistamvz@unicordoba.edu.co Preparation of manuscripts: Information can be found in instructions to authors section. The document can be also obtained at following web-site: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Subscription: The Journal MVZ Córdoba is published triannually and circulates the months of April, August and December. The numbers of one year group in a volume beginning with the month of April. The annual subscription has a value of US$10 for Latin America and the Caribbean; US $15 for USA and Canada; US$25 for other regions. To subscribe, obtain the form that appears at the end of each journal. Reproduction and forms: Photocopies of articles is authorized for institutional or academic purposes. To obtain printed copies, please address your request to: Journal MVZ Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Apartado aéreo No 354. Publicity: The Journal MVZ Córdoba and the Universidad de Córdoba clarify that commercial of advertising does not imply the approval nor backing of such respective products or services. Telephones: (57) (4) 7561167 / 7560710, Montería, Colombia. On-line access: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Available from the volume 5, number 1 January-June of 2000, full text, instructions to authors and subscriptions.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba Indexada por: Indexed by:

Categoría A1 Impresa desde Volumen 1, número 1, año 1994 Printed effective with Volume 1, issue 1, 1994 Publicación cuatrimestral Published triannualy ISSN 0122-0268 Rev.MVZ Córdoba © 2011 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Financiada por / Sponsored by: Universidad de Córdoba

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Revista MVZ Córdoba Volumen 16

MAYO - AGOSTO

Número 2

CONTENIDO EDITORIAL Ratas, ácaros, guerras, pobreza, negligencia y rickettsiosis Marco González, Salim Mattar

2271

REVISIÓN DE LITERATURA Rickettsiosis en América Latina, el Caribe, España y Portugal

2435

Requerimientos nutricionales de peces ornamentales de agua dulce: una revisión

2458

Marcelo Labruna, Salim Mattar, Santiago Nava, Sergio Bermudez, Jose Venzal, Gaby Dolz, Katia Abarca, Luis Romero, Rita de Sousa, Jose Oteo, Jorge Zavala-Castro.

Yohana Velasco-Santamaría, Wilson Corredor-Santamaría

Principales marcadores moleculares utilizados para la identificación de Babesia bovis y Babesia bigemina 2470 Sandra Ríos, Leonardo Ríos

ORIGINALES Infección por Neospora caninum en ganado de carne mantenido en condiciones de pastoreo en el centro-norte de México 2484 Karina Mondragón-Zavala, Carlos Cruz-Vázquez, Leticia Medina-Esparza, Miguel RamosParra, Zeferino García-Vázquez

Diversidad genética en seis poblaciones de tilapia roja, usando microsatelites como marcadores genéticos 2491 Boris Briñez, Xenia Caraballo, Marcela Salazar

Efecto de la edad y la hora de la aspiración sobre la calidad oocitaria y el desarrollo in vitro en hembras bovinas prepúberes 2499 Sandra Bernal, Ángela Gonella, Diego Valbuena, Rubén Mendoza, Juan Molina, Liliana Chacón

Relación entre características de tipo y producción de leche en vacas Holstein de Antioquia, Colombia 2507 Juan Corrales, Mario Cerón-muñoz, Jhon Cañas A, Cristina Herrera, Samir Calvo

Modelación de curvas de lactancia para producción de leche, grasa y proteína en bovinos Holstein en Antioquia, Colombia 2514 Jhon Cañas, Mario Cerón-Muñoz, Juan Corrales

Eficiencia de la respuesta superovulatoria del ganado Brahman al protocolo P-24 Roger Salgado, Andrés Mejía, Pablo Suárez

2521

Evaluación química y organoléptica del ensilaje de maralfalfa (Pennisetum sp.) más yuca fresca (Manihot esculenta) 2528 Libardo Maza, Oscar Vergara, Elisa Paternina

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Revista MVZ Córdoba Volumen 16

MAYO - AGOSTO

Número 2

Evaluación de Lactobacillus plantarum en intestino grueso de lechones por microscopía electrónica y química sanguínea 2538 Henry Jurado, Diana Castaño, Cristina Ramírez

Comparación de los métodos Directo y de Friedewald para la determinación de los niveles de colesterol LDL en el equino 2549 José Osório, Luis Uribe-Velazquez

Efectos de la concentración de glucosa sobre la activación de la movilidad espermática en bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces, Characiformes) 2554 Gregorio Martínez, Víctor Atencio, Sandra Pardo

Aislamiento y serotipificación de Salmonella sp., en estanques con Crocodylus intermedius y testudines cautivos en Villavicencio - Colombia 2564 Diana Pachón, Adriana Pulido, Carlos Moreno

Presencia de Spiroplasma penaei en plancton, bentos y fauna acompañante en 2576 fincas camaroneras de Colombia José Altamiranda, Marcela Salazar, Boris Briñez

Dinámica de impregnación al vacío en apio (Apium graveolens L.) y pepino (Cucumis 2584 sativus L.) Yisell Martelo, Misael Cortés, Diego Restrepo

Influencia del empaque y envasado sobre las propiedades fisicoquímicas del hongo 2593 comestible Pleurotus ostreatus Misael Cortés, Marilza Ruiz, Luís Henriquez

Genotoxicidad del agua contaminada por plaguicidas en un área de Antioquia Flor Tobón, Luís López

2605

Eficiencia técnica relativa de las fincas asociadas a Coounión en Guasca Cundinamarca 2616 Wilson Oviedo, Gloria Rodríguez

COMUNICACIÓN BREVE Efectividad de una mezcla de cipermetrina y clorpirifós para el control de la mosca Haematobia irritans 2628 Gustavo López, Cristiano Grisi do, Diego González

CASO CLÍNICO Polidactilia en los cuatro miembros, en una potranca mestiza en Chile

2634

Instrucciones para los autores

2640

Onésimo Sepúlveda, Christian Rehhof, Reinaldo Ortíz, Lisandro Muñoz

2431

Journal MVZ Córdoba Volume 16

MAY - AUGUST

Issue 2

CONTENTS EDITORIAL Rats, mites, wars, poverty, negligence and rickettsioses Marco González, Salim Mattar

2271

LITERATURE REVIEW Rickettsioses in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal

2435

Nutritional requirements of freshwater ornamental fish: a review

2458

Principal molecular markers used to identify Babesia bovis and Babesia bigemina

2470

Marcelo Labruna, Salim Mattar, Santiago Nava, Sergio Bermudez, Jose Venzal, Gaby Dolz, Katia Abarca, Luis Romero, Rita de Sousa, Jose Oteo, Jorge Zavala-Castro

Yohana Velasco-Santamaría, Wilson Corredor-Santamaría

Sandra Ríos, Leonardo Ríos

ORIGINALS Neospora caninum infection in beef cattle reared under grazing conditions in northcentral Mexico 2484 Karina Mondragón-Zavala, Carlos Cruz-Vázquez, Leticia Medina-Esparza, Miguel RamosParra, Zeferino García-Vázquez

Genetic diversity of six populations of red hybrid tilapia, using microsatellites genetic markers

2491

Boris Briñez, Xenia Caraballo, Marcela Salazar

Effect of age and coasting period on oocytes quality and their in vitro development 2499 from prepubertal cattle Sandra Bernal, Ángela Gonella, Diego Valbuena, Rubén Mendoza, Juan Molina, Liliana Chacón

Relationship between type traits and milk production in Holstein cows from Antioquia, 2507 Colombia Juan Corrales, Mario Cerón-muñoz, Jhon Cañas A, Cristina Herrera, Samir Calvo

Modeling the lactation curves for milk, fat and protein yield of Holstein cattle in Antioquia, Colombia

2514

Jhon Cañas, Mario Cerón-Muñoz, Juan Corrales

Efficiency of superovulatory response to P-24 protocol in fixed time embryo transfer 2521 in Brahman cattle Roger Salgado, Andrés Mejía, Pablo Suárez

Chemical and organoleptic evaluation of maralfalfa silage (Pennisetum sp.) plus 2528 fresh cassava (Manihot esculenta) Libardo Maza, Oscar Vergara, Elisa Paternina

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Journal MVZ Córdoba Volume 16

MAY - AUGUST

Issue 2

Evaluation of Lactobacillus plantarum in large intestine of piglets by transmission microscopy and blood chemistry 2538 Henry Jurado, Diana Castaño, Cristina Ramírez

Comparison of direct versus Friedewald methods for determing LDL cholesterol levels in the horse 2549 José Osório, Luis Uribe-Velazquez

Effect of glucose concentration on sperm motility activation in bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces, Characiformes) 2554 Gregorio Martínez, Víctor Atencio, Sandra Pardo

Isolation and serotyping of Salmonella sp. in ponds with captive Crocodylus intermedius and testudines in Villavicencio – Colombia 2564 Diana Pachón, Adriana Pulido, Carlos Moreno

Presence of Spiroplasma penaei in plankton, benthos and fauna in shrimps farms of Colombia 2576 José Altamiranda, Marcela Salazar, Boris Briñez

Vacuum impregnation dynamic on celery (Apium graveolens L.) and cucumber (Cucumis sativus L.) 2584 Yisell Martelo, Misael Cortés, Diego Restrepo

Influences of the packing and packed about physiochemical properties of edible mushroom Pleurotus ostreatus 2593 Misael Cortés, Marilza Ruiz, Luís Henriquez

Genotoxicity of water contaminated by plaquicidas in an area of antioquia Flor Tobón, Luís López

2605

Relative technical efficiency of the farms associated to Coounion in Guasca Cundinamarca 2616 Wilson Oviedo, Gloria Rodríguez

SHORT COMMUNICATION Mixture of cipermetrina and clorpirifós to control Haematobia irritans fly Gustavo López, Cristiano Grisi do, Diego González

2628

CLINICAL CASE Polydactyly in an all four limbs in a halfbred filly in Chile

2634

Instructions to the authors

2640

Onésimo Sepúlveda, Christian Rehhof, Reinaldo Ortíz, Lisandro Muñoz

2433

Rev.MVZ Córdoba 16(2):2433-2434, 2011.

EDITORIAL

Ratas, ácaros, guerras, pobreza, negligencia y rickettsiosis Rats, mites, wars, poverty, negligence and rickettsioses. La historia de las infecciones ha descrito el papel decisivo que jugó el tifus en las guerras. Tal vez el más antiguo y documentado es el sitio de Granada (España) por parte de los católicos contra los árabes en el año 1489, donde se cree que murieron alrededor de 17.000 personas por rickettsiosis; seis veces más que el número de muertos en combate (1). Ya en el año de 1812, durante la toma de Moscú por parte de Napoleón y sus tropas, murieron más soldados por causa del tifus que por las balas de los rusos. Cien años más tarde, en la primera guerra mundial, el tifus fue el responsable de la muerte de más de 3 millones de personas de personas (2). La gran población de ratas y su carga de ácaros asociada a la pobreza producida por las guerras, así como a la ausencia de servicios públicos, provocó sin duda una alta mortalidad en la población. Tanto la situación de hacinamiento creada por las guerras, como la ausencia de medidas higiénicas facilitaron sin duda la proliferación de roedores y sus ectoparásitos que diseminaron el tifus con una alta mortalidad tanto en soldados como en la población civil. Solo hasta el año 1909 Charles Nicole logró implicar a los piojos como los vectores de la infección (3). Años más tarde, los investigadores Howard Ricketts y Von Prowazek, prácticamente se inmolaron y siguiendo los postulados de Koch murieron de tifus y descubrieron el agente etiológico, los cuales adquirieron su nombre (4). Las rickettsiosis son cosmopolitas; hoy día son un problema de salud pública y se constituyen en una complicación sanitaria de gran impacto sino son tratadas a tiempo. Colombia fue uno de los primeros países en reportar la enfermedad en Latinoamérica. Los primeros casos se presentaron en la población de Tobia, un municipio del departamento de Cundinamarca, y desde entonces se denominó fiebre de Tobia (5). Entre 1934 y 1936 se documentaron 65 personas víctimas de la enfermedad, 62 casos fueron fatales (95% mortalidad). No obstante, la enfermedad se mantuvo en silencio cerca de 70 años (5). Motivados por el desconocimiento de esta enfermedad en Colombia, la Universidad de Córdoba realizó en el año 2001 un estudio de seroprevalencia de Rickettsia sp en trabajadores del campo en la zona rural del municipio de Ciénaga de Oro, Córdoba, donde se encontró que 49% de los sujetos presentaron anticuerpos. La alta seroprevalencia encontrada en el área demostró la circulación de una rickettsia del grupo de las fiebres manchadas y la necesidad de profundizar en este campo (6). Posteriormente en 2004, la Universidad de Córdoba realizó otro estudio de seroprevalencia de Rickettsia sp, pero esta vez en el departamento de Sucre, donde se encontró una seroprevalencia de 7.7% (7). A partir de estos estudios se despertó cierto interés en el tema, y es así como en el año 2005 en Villeta (Cundinamarca) se reportó una seroprevalencia del 40% (8). No obstante, estos hallazgos pasaron desapercibidos para las autoridades de salud y para la comunidad en general. Con tantas cosas que atender en el país, solo se prestó atención en el año 2006 cuando se comprobaron las muertes de algunos militares y civiles en el municipio de Necoclí (Antioquia), como producto de un brote de fiebre hemorrágica (9). Un año más tarde, a unos 100 km de Necoclí, se presentó un brote de fiebre de origen desconocido en el municipio de Los Córdobas (Córdoba), el cual inicialmente fue atribuido a dengue hemorrágico, aunque finalmente se comprobó como rickettsiosis (10). En el año 2008, en el corregimiento Alto de Mulatos en el municipio de Turbo (Antioquia), se informó sobre la muerte de cuatro personas (letalidad 26.6%), tres de las cuales eran menores de edad; confirmándose los casos como rickettsiosis (11). 2433

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

De otro lado, aunque no hemos padecido guerras mundiales, vivimos un conflicto interno (obstinadamente negado por algunos) y la mitad de los colombianos viven por debajo de la línea de la pobreza sin servicios públicos, por lo que son frecuentes la presentación de patologías como la leptospirosis y la rickettsiosis entre otras. Hemos visto un breve recuento cronológico de la rickettsiosis en Colombia, sin embargo hay cientos de reportes en Latinoamérica, el Caribe, España y Portugal, que jamás han sido recopilados en forma sistemática. En ese sentido, en este número de la Revista MVZ Córdoba, se presenta por primera vez en la historia de la literatura científica de Latinoamérica, un trabajo retrospectivo que de manera ordenada y documentada resume la epidemiología, la ecología de vectores y los casos de infecciones producidas por Rickettsia. El responsable de este importante trabajo fue la Red Iberoamericana para la Investigacion y Control de las Enfermedades Rickettsiales (RIICER), entidad a la que le reconocemos este innegable aporte que deberá servir para impulsar el estudio de las rickettsias en Latinoamérica y el Caribe. Finalmente, la Revista MVZ Córdoba, como una primera aproximación hacia el continuo camino de la internacionalización de una revista científica, publica de forma bilingüe el artículo “Rickettsiosis en América Latina, el Caribe, España y Portugal” el cual pone a disposición de los lectores abriendo el presente número. Marco González T. M.Sc.

Salim Mattar V. Ph.D.

REFERENCIAS 1.

Zinsser, H. Rats, Lice and History. New York: Little Brown and Co; 1935.

Ríos R, Franco S, Mattar S, Urrea M, Tique V. Seroprevalencia de Leptospira sp., Rickettsia sp. y Ehrlichia sp. en trabajadores rurales del departamento de Sucre, Colombia. Infection 2008;12(2):319-23.

Snyder JC. Typhus Fever in the Second World War. California Medicine 1947; 66(1)3-10.

Nicolle C, Comte C, Conseil L. Transmission expérimentale du typhus exanthématique par le pou du corps. Comptes Rendus Hebdo-Madaires des Séances de l’Académie des Sciences 1909; 149:486–9.

Hidalgo M, Sanchez R, Orejuela L, Hernandez J, Walker DH, Valbuena G. Prevalence of antibodies against spotted fever group rickettsiae in a rural area of Colombia. Am J Trop Med Hyg 2007; 77(2):378-80.

Gross D, Schäfer G. 100th Anniversary of the death of Ricketts: Howard Taylor Ricketts (1871-1910). The namesake of the Rickettsiaceae family. Microbes Infect 2011; 13(1):10-3.

Acosta J, Urquijo L, Díaz A, Sepúlveda M, Mantilla G, Heredia D, et al. Brote de rickettsiosis en Necoclí, Antioquia, febreromarzo de 2006. Inf Quinc Epidemiol Nac 2006; 11:177-92.

Patino L, Afanador A, Paul JH. A spotted fever in Tobia, Colombia. Am J Trop Med Hyg 1937; 17:639–653.

Miranda A, Flores S, Máttar S. Alta seroprevalencia de rickettsiosis en trabajadores del campo en el Municipio de Ciénaga de Oro, Córdoba. Inf Quinc Epidemiol Nac 2002; 7:65-80.

10. Hidalgo M, Miranda J, Heredia D, Zambrano P, Vesga JF, Lizarazo D, et al. Outbreak of Rocky Mountain spotted fever in Cordoba, Colombia. Mem Inst Oswaldo Cruz 2011; 106(1):117-8. 11. García OEP, Giraldo MR, Duran MM, Hidalgo M, Galeano A, Echeverri I, et al. Estudio de brote febril hemorrágico en el corregimiento de Alto de Mulatos - Distrito Especial Portuario de Turbo, Antioquia, enero de 2008. Inf Quinc Epidemiol Nac 2008; 13(10):145-60.

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Rev.MVZ Córdoba 16(2):2435-2457, 2011.

REVISIÓN DE LITERATURA

Rickettsioses in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal Rickettsiosis en América Latina, el Caribe, España y Portugal Marcelo B. Labruna,1* Ph.D, Salim Mattar V,2 Ph.D, Santiago Nava,3 Ph.D, Sergio Bermudez,4 M.Sc, Jose M. Venzal,5 Ph.D, Gaby Dolz,6 Ph.D, Katia Abarca,7 M.D, Luis Romero,8 M.Sc, Rita de Sousa,9 Ph.D, Jose Oteo,10 M.D, Jorge Zavala-Castro,11 Ph.D. Universidade de São Paulo, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinhária e Zootecnia, São Paulo, SP, Brazil; 2Universidad de Córdoba, Instituto de Investigaciones Bilogicas del Tropico, Montería, Colombia, 3Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Estación Experimental, Agropecuaria Rafaela, Rafaela, Santa Fe, Argentina. 4Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud, Ciudad de Panamá, Panamá. 5Universidad de la República de Uruguay. Facultad de Veterinaria, Departamento de Parasitología Veterinaria, Regional Norte-Salto, Uruguay. 6Universidad Nacional de Costa Rica, Facultad Ciencias de la Salud, Escuela de Medicina Veterinaria. Heredia, Costa Rica. 7Pontificia Universidad Católica de Chile, Facultad de Medicina, Chile. 8Laboratorio Central de Diagnóstico Veterinario, Ministerio de Agricultura y Ganadería (MAG), San Salvador, El Salvador. 9Laboratorio de Saude Publica, Lisboa, Portugal. 10Hospital San Pedro, Área de Enfermedades Infecciosas, Logroño (La Rioja), España. 11Universidad Autónoma de Yucatan. Centro de investigaciones regionales “Dr. Hideyo Noguchi”, Merida Yucatan, Mexico. Corresponding author: labruna@usp.br 1

Recibido: Enero de 2011; Aceptado: Agosto de 2011.

ABSTRACT Objective. To analyze and summarized the rickettsial studies in Latin America, Caribbean, Portugal and Spain. Material and methods. Data on genus and infectious by Rickettsia were retrospectively compiled from the critical review literature regarding all countries in Latin America, Caribbean islands, Portugal and Spain. We considered all Rickettsia records reported for human and/or animal hosts, and/or invertebrate hosts considered being the vector. In a few cases, when no direct detection of a given Rickettsia group or species was available for a given country, the serologic method was considered. Results. A total of 13 Rickettsia species have been recorded in Latin America and the Caribbean. The species with the largest number of country confirmed records were Rickettsia felis (9 countries), R. prowazekii (7 countries), R. typhi (6 countries), R. rickettsii (6 countries), R. amblyommii (5 countries), and R. parkeri (4 countries). The rickettsial records for the Caribbean islands (West Indies) were grouped in only one geographical area. Both R. bellii, R. akari, and Candidiatus ‘R. andeane’ have been recorded in only 2 countries each, whereas R. massiliae, R. rhipicephali, R.monteiroi, and R. africae have each been recorded in a single country (in this case, R. africae has been recorded in nine Caribbean Islands). For El Salvador, Honduras, and Nicaragua, no specific Rickettsia has been reported so far, but there have been serological evidence of human or/and animal infection. The following countries remain without any rickettsial records: Belize, Venezuela, Guyana, Surinam, and Paraguay. In addition, except for few Caribbean islands, many remain without records. A total of 12 Rickettsia species have been reported in Spain and Portugal: R. conorii, R. helvetica, R. monacensis, R. felis, R. slovaca, R. raoultii, R. sibirica, R. aeschlimannii, R. rioja, R. massiliae, R. typhi, and R. prowazekii. Amongst these Rickettsia species reported in Spain and Portugal, only R. prowazekii, R. typhi, R. felis, and R. massiliae have also been reported in Latin America. Conclusions. This is the first study on rickettsial diseases that fully summarized in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal. The data obtained allow a better understanding on rickettsial epidemiology and distribution of vector ecology. Key words: Acari, epidemiology, rocky mountain spotted fever, vector control. (Source: DeCS). 2435

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RESUMEN Objetivo. Analizar y resumir los estudios de Rickettsia en Latinoamérica, el Caribe, Portugal y España. Materiales y métodos. Los reportes del genero Rickettsia y sus infecciones asociadas fueron compilados de una revisión crítica retrospectiva de la literatura científica de los países de Latinoamérica, el Caribe, Portugal y España. Se consideraron todos los reportes para huéspedes humanos y/o animales y también para huéspedes invertebrados los cuales fueron considerados como vectores asociados con Rickettsia. En algunos casos, cuando no existió detección directa a un determinado grupo de rickettsias o especies no disponible en un país, se tuvo en cuenta la detección indirecta por serología. Resultados. Un total de 13 especies de Rickettsia han sido reportadas en Latinoamérica y el Caribe. Las especies más encontradas en los países fueron: Rickettsia felis (9 países), R. prowazekii (7 países), R. typhi (6 países), R. rickettsii (6 países), R. amblyommii (5 países) y R. parkeri (4 países). Los datos de las islas del Caribe (antillas menores o Indias occidentales), fueron agrupados en una sola área geográfica como un solo país. Ambas R. bellii, R. akari y Candidatus ‘R. andeane’ fueron reportadas en solo 2 países, mientras que R. massiliae, R. rhipicephali, R.monteiroi, y R. africae fueron informadas en un solo país. En este caso R. africae fue reportada en 9 islas de las Antillas menores. Para El Salvador, Honduras y Nicaragua, hasta ahora no se han reportado especies de Rickettsia, pero si evidencia serológica de infección humana y/o animal. Sin reportes de infección por Rickettsia permanecen: Belice, Venezuela, Guayana, Surinam y Paraguay. Además, a excepción de algunas islas del Caribe, muchas de ellas permanecen sin reportes. Un total de 12 especies de Rickettsia han sido documentadas en España y Portugal: R. conorii, R. helvetica, R. monacensis, R. felis, R. slovaca, R. raoultii, R. sibirica, R. aeschlimannii, R. rioja, R. massiliae, R. typhi y R. prowazekii. Entre estas, solamente R. prowazekii, R. typhi, R. felis y R. massiliae han sido documentados en Latinoamérica, España y Portugal. Conclusiones. Este es el primer estudio sobre las enfermedades producidas por rickettsias en Latinoamérica, el Caribe, España y Portugal, cuyos datos permiten entender mejor su epidemiología y la distribución de la ecología de los vectores. Palabras clave: Ácaros, control de vectores, epidemiologia, fiebre maculosa de las montañas rocosas, garrapatas. (Fuente: DeCS)

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The genus Rickettsia includes bacteria of the order Rickettsiales in the a-subdivision of the class Proteobacteria. They are Gramnegative coccobacilli in obligate association with eukaryote cells. A number of species have been identified in various terrestrial arthropods, and more recently in leeches and amoeba (1,2). Traditionally, pathogenic rickettsiae were classified into two groups: the typhus group (TG), composed of Rickettsia prowazekii and Rickettsia typhi, vectored by lice and fleas, respectively; and the spotted fever group (SFG), composed of more than 20 species mostly vectored by ticks (3). Other rickettsiae have shown antigenic and genetic particularities that preclude their inclusion in either the TG or SFG, such as Rickettsia bellii and Rickettsia canadensis, reported in ticks from the american continent (4,5). With the discovery of a variety of new rickettsiae in different orders of terrestrial arthropods,

El género Rickettsia incluye las bacterias del orden Rickettsiales subdivisión de la clase Proteobacteria, son cocobacilos Gram negativos de crecimiento obligado intracelular. Un número apreciable de especies ha sido identificado en varios artrópodos y recientemente en sanguijuelas y amebas (1,2). Tradicionalmente, las rickettsias patógenas fueron clasificadas en dos grupos: el tifus (TG) compuesta por Rickettsia prowazekii y Rickettsia typhi, cuyos vectores son piojos y pulgas respectivamente y, el grupo de las fiebres manchadas (SFG), compuesto por más de 20 especies con garrapatas como vector principal (3). Otras rickettsias han mostrado antigénica y genéticamente particularidades que indican su inclusión ya sea en el TG o en el SFG, tales como Rickettsia bellii y Rickettsia canadensis, reportadas en garrapatas del continente americano (4,5). Con el descubrimiento de una variedad de

Labruna - Rickettsiosis in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal

mostly free-living, and also with genetic analysis of rickettsial plasmids, the genus Rickettsia has been re-classified into different groups, including the SFG, TG, transitional group (TRG), bellii group (BG), canadensis group (CG), and several other basal groups (6,7). Many Rickettsia species cause diseases in humans and animals, to which they are vectored by lice, fleas, ticks, or mites (8). Most of the recognized pathogenic Rickettsia species are classified into the SFG, which includes agents of spotted fever rickettsioses in humans in different parts of the world, vectored by ticks (8). During the last decades, there has been an increasing number of new Rickettsia species of unknown pathogenicity, mostly isolated from ticks. Some of them, previously considered non-pathogenic, were recently shown to be pathogenic to humans, such as the SFG Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia massiliae, and Rickettsia monacensis in Europe (8,9). In addition, R. parkeri, an ‘old’ SFG organism first reported in ticks in the 1939 was shown to be pathogenic 65 years later (10). These facts indicate that any novel described Rickettsia from invertebrate hosts, especially ticks, should be regarded as potentially pathogenic for humans. The aim of this study was to analize and summarized the rickettsial reports in Latin America, Caribbean, Portugal and Spain.

MATERIALS AND METHODS Data collection and geographic coverage of the study. For the present study, retrospective data on bacteria of the genus Rickettsia were compilled from the literature regarding all countries in Latin America, and the West indies or Caribean islands (Guadaloupe, St. Kitts, Nevis, Dominica, Virgin islands, Montserrat, St. Lucia, Martinique, Antigua, Puerto Rico). Efforts were done to gather all available information for each country. Futhermore, for comparison purposes, we also compiled

2437

nuevas rickettsias en diferentes órdenes de artrópodos terrestres, la mayoría viviendo de forma libre y también con los análisis genéticos de plásmidos de las Rickettsia, el género ha sido reclasificado en diferentes grupos: TG, SFG, grupo transicional (TRG), grupo bellii (BG), grupo canadensis (CG) y otros grupos básicos (6,7). Muchas rickettsias causan enfermedades en humanos y animales los cuales tienen como vectores, piojos, pulgas, garrapatas o ácaros (8). Muchas de las especies de Rickettsia reconocidas como patógenas están clasificadas dentro del SFG, el cual incluye agentes de las fiebres manchadas en humanos en diferentes partes del mundo y son transmitidas por garrapatas (8). En las últimas décadas ha habido un incremento de nuevas especies de Rickettsia de patogenicidad desconocida, muchas de ellas aisladas de garrapatas. Algunas de ellas previamente fueron consideradas no patógenas, pero recientemente demostraron ser patógenas para humanos, tal es el caso del SFG Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia massiliae y Rickettsia monacensis en Europa (8,9). Además, R. parkeri un viejo miembro del SFG reportado por primera vez en 1939, demostró 65 años más tarde ser patógena (10). Estos hechos demuestran que cualquier nueva rickettsia descrita en huéspedes invertebrados, especialmente garrapatas, deberían ser consideradas potencialmente patógenas para los humanos. El objetivo de este trabajo fue el de analizar y resumir los estudios de Rickettsia en Latinoamérica, el Caribe, España y Portugal.

MATERIALES Y MÉTODOS Recolección de datos y cobertura geográfica del estudio. Para el presente estudio, se obtuvieron datos retrospectivos del género Rickettsia de la literatura científica de los países de Latinoamérica y de las islas del Caribe (Guadaloupe, St. Kitts, Nevis, Dominica, Virgin islands, Montserrat, St. Lucia, Martinique, Antigua, Puerto Rico). Se realizaron esfuerzos para obtener toda la información disponible

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

all Rickettsia species that have been reported in Spain and Portugal, since these two countries were responsible for the main colonization of Latin America. We considered all Rickettsia records reported for human and/or animal hosts, and/or invertebrate hosts (e.g., ticks, lice, fleas), which were considered to be the vector associated with the agent. In a few cases, when no direct detection of a given Rickettsia group TG or SFG or species was available for a given country, the indirect detection through serologic-based methods was considered, when this was the only record available.

RESULTS All available records on rickettsial infection on hosts (humans and animals) and vectors in Latin America and the Caribbean are represented by country, in tables 1-6. Spain and Portugal are presented in table 7.

de cada país. Además, para efectos de comparación, también se obtuvo información de España y Portugal, ya que estos países fueron los que colonizaron principalmente a Latinoamérica. Se consideraron todas las rickettsias reportadas como patógenas tanto para humanos como animales o huéspedes animales, y/o huéspedes invertebrados (ej, garrapatas, piojos y pulgas) y que fueron consideradas ser el vector asociado al agente etiológico. Cuando no existió evidencia directa de Rickettsia del grupo TG o SFG u otra especie disponible en el cada país, la detección indirecta basada en la serología fue considerada como el único reporte disponible.

RESULTADOS Todos los datos disponibles por infección de Rickettsia o huéspedes (humanos o animales) y vectores de Latinoamérica y el Caribe se presentan para cada país en las tablas 1-6. España y Portugal se muestran en la tabla 7.

Table 1. Infections by Rickettsia in Argentina, Chile and Uruguay. Geographical distribution

Species

Vector

Clinical cases confirmed

Animal infection

References

11,12

ARGENTINA R. amblyommii

Córdoba

Amblyomma neumanni

R. bellii

Córdoba

A. neumanni

Santiago del Estero

Amblyomma tigrinum

R. massiliae

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Rhipicephalus sanguineus

Yes

13,14

R. parkeri

Buenos Aires

Amblyomma triste

Yes

15-17

R. rickettsii

Jujuy

Amblyomma cajennense

Yes

Córdoba

Amblyomma parvum

Santiago del Estero

Amblyomma pseudoconcolor

12,19

R. felis

Santa Fe

Ctenocephalides felis

R. prowazekii

Jujuy

Pediculus humanus

Yes

Cand. ‘R. andeanae’

CHILE R. felis

Metropolitan2

Ctenocephalides felis

Yes3

Metropolitan

Rhipicephalus sanguineus

R. prowazekii

Metropolitan

Pediculus humanus

Orientia tsutsugamushi

Isla de Chiloé

Leech

Yes

URUGUAY R. parkeri

R. felis

Canelones

Amblyomma triste

Yes4

26-31

Maldonado

A. triste

Yes

29,31

Montevideo

A. triste

Yes

San José

A. triste

Yes

Lavalleja

A. triste

Yes

Montevideo

Ctenocephalides felis, Ctenocephalides canis

Reported as Rickettsia sp. strain Argentina (33). 2Santiago metropolitan area. 3Serologic evidence of infection of cats by this Rickettsia. Serologic evidence of infection in humans by this Rickettsia.

1 4

Labruna - Rickettsiosis in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal

2439

Table 2. Infections by Rickettsia in Brazil. Species

R. rickettsii

Geographical distribution

Bahia Espírito Santo Minas Gerais Rio de Janeiro São Paulo

R. typhi R. parkeri

São Paulo São Paulo

R. felis

Bahia Minas Gerais Rio de Janeiro Sao Paulo

R. amblyommii Rondonia São Paulo Bahia Pará R. rhipicephali

Rondônia São Paulo

R. bellii Rondônia

São Paulo

R. monteiroi São Paulo Spotted fever group Paraná Santa Catarina Rio Grande do Sul Typhus group Minas Gerais

Clinical cases confirmed

Animal infection

References

Yes Yes

No Yes*

34 35,36

Yes

37-40

Yes

41-43

Yes

44-48

Yes

49,50

Yes

Yes*

51-56

Yes Yes No

No No Yes*

58 59,60 61

52,62,63

Yes*

64-67

No No

Yes* No

68,69 70

Yes*

46, 51, 52, 54, 55, 70-72

Yes

Yes*

74-77

Yes

Vector

BRAZIL Amblyomma cajennense Amblyomma cajennense A. cajennense Rhipicephalus sanguineus A. cajennense R. sanguineus Amblyomma aureolatum A. cajennense R. sanguineus Xenopsylla cheopis Amblyomma triste Amblyomma ovale Amblyomma dubitatum Amblyomma nodosum No Ctenocephalides felis C. felis C. felis Ctenocephalides canis Polygenis atopus A. cajennense Amblyomma coelebs Amblyomma longirostre A. longirostre A. longirostre A. longirostre Amblyomma geayi Haemaphysalis juxtakochi H. juxtakochi A. ovale Amblyomma oblongoguttatum Amblyomma scalpturatum Amblyomma humerale Amblyomma rotundatum A. aureolatum A. dubitatum A. ovale Amblyomma incisum A. nodosum Ixodes loricatus H. juxtakochi A. incisum

* Serologic evidence of infection by this Rickettsia

2440

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Table 3. Infections by Rickettsia in Bolivia, Colombia, Perú and Ecuador. Species

Geographical distribution

Vector

Clinical cases confirmed

Animal infection

References

BOLIVIA R. parkeri

CochaBamba

Amblyomma tigrinum

Yes

R. prowazekii

La Paz

Pediculus humanus

Rickettsia sp.1

CochaBamba

A. tigrinum

R. rickettsii

Cundinamarca

Amblyomma cajennense

Yes

81,82

Antioquia

Yes

83,84

Córdoba

Yes

85,86

R. typhi

Caldas

Yes

Spotted fever group

Córdoba

Cundinamarca

Córdoba

Yes

Ctenocephalides felis

Amblyomma maculatum

COLOMBIA

PERÚ R. felis Cand. ‘R. andeanae’ R. prowazekii

Piura Piura

Ixodes boliviensis

Apurimac

Pediculus corporis

Yes

91,92

Arequipa

P. corporis

Yes

91,92

Ayacucho

P. corporis

Yes

91,92

Cuzco

P. corporis

Yes

91,92

Puno

P. corporis

Yes

91,92

Cuzco

Yes

90,93

Piura

Yes

90,93

Junin

Yes

Loreto

Yes

Typhus group

Loreto

Yes

R. prowazekii

Pichincha

Pediculus corporis

Yes

Azuay

Yes

Cañar

Yes

Carchi

Yes

Cotopaxi

Yes

Chimborazo

Yes

Imbabura

Yes

Loja

Yes

Tungurahua

Yes

Napo

Yes

Pastaza

Yes

Spotted fever group

ECUADOR

Close-related to R. aeschlimannii

A total of 13 Rickettsia species have been recorded in Latin America and the Caribbean. The species with the largest number of country confirmed records were Rickettsia felis (9 countries), R. prowazekii (7 countries), R. typhi (6 countries), R. rickettsii (6 countries), R. amblyommii (5 countries), and R. parkeri (4 countries).

Un total de 13 especies de Rickettsia se han documentado en Latinoamérica y el Caribe. Las especies con mayor frecuencia reportada en los diferentes países fueron: Rickettsia felis (9 países) R. prowazekii (7 países), R. typhi (6 países), R. rickettsii (6 países), R. amblyommii (5 países), and R. parkeri (4 países).

Labruna - Rickettsiosis in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal

2441

Table 4. Infections by Rickettsia in Costa Rica, El Salvador, Guatemala, French Guayana, Honduras, Nicaragua and Panamá . Species

Geographical distribution

Vector

Clinical cases confirmed

Animal infection

References

COSTA RICA R. rickettsii

Alajuela

Yes

99,100

Cartago

Yes

100,101

Heredia

Yes

100,102

Limón

Haemaphysalis leporispalustris

Yes

100-103

Yes

104

Amblyomma cajennense

105

Ctenocephalides felis

105

Alajuela

Yes

106

Limon

Yes

106

R. akari R. amblyommii

Limón

R. felis Spotted fever group

EL SALVADOR Spotted fever group

No data

Typhus group

No data

Yes

107,108

Yes

107,108

GUATEMALA R. prowazekii

Highlands (>1.300 m)

Yes

104

R. typhi

Lowlands (<1.300 m)

Yes

109

R. amblyommii

Régina

Amblyomma coelebs

109 104

FRENCH GUAYANA No

HONDURAS Spotted fever group

No data

Yes

Islas de la Bahía

Yes

No data

Yes

110 2

111

NICARAGUA Spotted fever group

No data

Yes

104

Yes

112-115

PANAMÁ R. rickettsii

Panamá

Amblyomma cajennense Amblyoma sp.

Coclé

Yes

116

Darién

Dermacentor nitens

117

Amblyomma cajennense

Yes

116

115,117

R. amblyommii Coclé

Rhipicephalus sanguineus Dermacentor nitens Amblyomma cajennense

Darién

Rhipicephalus sanguineus Dermacentor nitens

Kuna Yala

Rhipicephalus sanguineus

Yes

115

R. felis

Coclé

Ctenocephalides felis

116

R. typhi

Panamá

Yes

118

Serologic evidence of infection in humans by this Rickettsia, 2 Serologic evidence of infection in animals.

2442

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Table 5. Infections by Rickettsia in México. Species

Geographical distribution

Vector

Clinical cases confirmed

Animal infection

References

119,120

MÉXICO R. rickettsii

Baja California

Rhipicephalus sanguineus

Yes

Coahuila

R. sanguineus

Yes

121

Durango

R. sanguineus

Yes

120,122

Nuevo León

Amblyomma imitator

Yes

123

San Luis Potosí

R. sanguineus

Yes

121,122

Sinaloa

R. sanguineus

Yes

124

Sonora

R. sanguineus

Yes

125-129

Veracruz

Amblyomma cajennense

Yes

119,130

Yucatán

Yes

131,132

R. felis

Yucatán

Ctenocephalides felis

Yes

133-136

R. akari

Yucatán

R. sanguineus

Yes

137,138

R. prowazekii

Chiapas

Yes

139

Hidalgo

Yes

122

Jalisco

Yes

140

Estado de México

Yes

122,141

Nuevo León

Amblyomma sp

Yes

142,143

Oaxaca

Yes

122

Puebla

Yes

122

Veracruz

Yes

122

Ciudad de México

Yes

144

Guerrero

Yes

122

Hidalgo

Yes

122

Jalisco

Yes

122

Estado de México

Yes

122

Michoacán

Yes

122

Nayarit

Yes

122

Nuevo León

Yes

122

Oaxaca

Yes

122,145

Puebla

Yes

122

Querétaro

Yes

122

Tamaulipas

Yes

122

Zacatecas

Yes

122

Yucatán

Yes

146

Clinical cases confirmed

Animal infection

References

R. typhi

Table 6. Infections by Rickettsia in Caribbean Islands. Species

Geographical distribution

Vector CARIBBEAN ISLES

R. africae

Guadaloupe

Amblyomma variegatum

Yes

147,148

St. Kitts

A. variegatum

149

Nevis

A. variegatum

149

Dominica

A. variegatum

150

Virgin islands

A. variegatum

150

Montserrat

A. variegatum

150

St. Lucia

A. variegatum

150

Martinique

A. variegatum

151

Antigua

A. variegatum

152

R. felis

St. Kitts

Ctenocephalides felis

153

R. typhi

Puerto Rico

Xenopsylla cheopis

Yes

154

2443

Labruna - Rickettsiosis in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal Tabla 7. Infections by Rickettsia in Spain and Portugal. Species

Geographical distribution

Vector

Clinical cases confirmed

Animal infection

References

SPAIN R. conorii

All Spain

Rhipicephalus sanguineus

Yes

155

R. helvetica

All Spain

Ixodes ricinus

156

R. monacensis

All Spain

I. ricinus

Yes

R. felis

All Spain, Canary Islands

Ctenocephalides felis

Yes

157

R. slovaca

All Spain

Dermacentor marginatus

Yes

158

R. raoultii

All Spain

D. marginatus

Yes

158

R. sibirica

Pais Vasco, La Rioja

Yes

159

R. aeschlimannii

Castilla León, La Rioja

Hyalomma marginatum

160

R. typhi

South Spain, Canary Islands

Xenopsilla cheopis, C. felis

Yes

161

R. prowazekii

All Spain

Pediculus corporis

Yes

162

R. rioja

Galicia, Pais Vasco, La Rioja

D. marginatus

Yes

158,163

R. conorii

Continental Portugal

Rhipicephalus sanguineus

Yes

164-168

R. helvetica

Continental Portugal, Madeira Island

Ixodes ricinus

166,169

R. monacensis

Continental Portugal, Madeira Island

I. ricinus

170,171

172,173

Yes

166, 169, 174

PORTUGAL

R. felis

Continental Portugal, Madeira Island

R. slovaca

Continental Portugal

R. raoultii

Archaeopsylla erinacei maura, Ctenophatalmus sp. Ctenocephalides felis Dermacentor marginatus Dermacentor reticulatus

Continental Portugal

D. marginatus

171,175

Continental Portugal

Rhipicephalus pusillus, Rhipicephalus bursa,

Yes

175,176

Continental Portugal

Hyalomma marginatum

166, 179, 177

R. typhi

Continental Portugal, Madeira Island

Leptopsylla segnis

Yes

175, 178180

R. prowazekii

Continental Portugal

Pediculus corporis

Yes

162

R. massiliae

Continental Portugal

R. sanguineus

166

R. sibirica R. aeschlimannii

Table 8. Importated cases of Rickettsia in Latin America and Iberian peninsula. Species R. massiliae

Country of origin

Country of event occurrence

Reference

Argentina

Spain

South Africa

Spain

181

R. conorii

Portugal

Brazil

182

R. conorii

South Africa

Brazil

183

R. africae

Since the rickettsial records for the Caribbean islands were restricted to West Indies, we grouped these records like that they represented a single country (Table 6). Both R. bellii, R. akari, and Candidiatus ‘R. andeane’ have been recorded in only 2 countries each, whereas R. massiliae, R.

Los datos de las islas de las antiguas Antillas, se agruparon en un solo país (Tabla 6). Ambos R. bellii, R. akari y Candidiatus ‘R. andeane’ han sido reportados en solo 2 países cada uno, mientras que R. massiliae, R. rhipicephali, R.monteiro y R. africae han sido reportados en un solo país. En este

2444

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

rhipicephali, R.monteiroi, and R. africae have each been recorded in a single country (in this case, R. africae has been recorded in nine islands from the West Indies). Eight Rickettsia species have been associated with human diseases in Latin America and Caribbean: R. rickettsii causing rocky mountain spotted fever in Mexico, Costa Rica, Panama, Colombia, Brazil and Argentina; R. prowazekii causing epidemic typhus in Argentina, Bolivia, Chile, Ecuador, Guatemala, Mexico, and Peru; R. typhus causing endemic typhus in Brazil, Colombia, Guatemala, Mexico, Panama, and Puerto Rico; R. felis causing flea spotted fever in Mexico and Brazil; R. parkeri causing spotted fever in Brazil, Uruguay, and Argentina; R. africae causing African tick bite fever in the Caribbean islands; R. akari causing rickettsial pox in Costa Rica and Mexico; and R. massiliae causing spotted fever in Argentina. This R. massiliae case was reported in a Spanish traveler presumed to have acquired the infection in Argentina, but suffered the disease after her return to Spain (Table 8). The distribution of R. felis-infected fleas included seven countries (Costa Rica, Panama, Caribbean islands, Peru, Argentina, Chile, and Uruguay) where no human cases of infection have been reported so far. A total of five Rickettsia species of pathogenicty yet to be confirmed for humans has been reported: R. amblyommii (5 countries), R. bellii (2 countries), Candidatus ‘R. andeanae’ (2 countries), R. monteiroi (1 country), and R. rhipicephali (1 country). A total of 10 Rickettsia species have been reported in both Spain and Portugal: R. conorii, R. helvetica, R. monacensis, R. felis, R. slovaca, R. raoultii, R. sibirica, R. aeschlimannii, R. typhi, and R. prowazekii. In addition, R. rioja has been reported in Spain, and R. massiliae has been reported to occur in Portugal (Table 7). Amongst these Rickettsia species reported in Portugal and Spain, only R. prowazekii, R. typhi, R. felis, and R. massiliae have also been reported in Latin America. Two fatal cases of spotted fever caused by R. conorii have been diagnosed in Brazil,

caso R. africae ha sido documentada en nueve islas del Caribe. Ocho especies de Rickettsia han sido asociadas con enfermedad humana en Latinoamérica y el Caribe: R. rickettsii agente de etiológico de la fiebre de las montañas rocosas en México, Costa Rica, Panamá, Colombia, Brasil y Argentina; R. prowazekii es el causante del tifus epidémico en Argentina, Bolivia, Chile, Ecuador, Guatemala, México y Perú; R. typhus es el agente en Brasil, Colombia, Guatemala, México, Panamá y Puerto Rico; R. felis causa la fiebre manchada de las pulgas en México y Brasil; R. parkeri es la causa de la fiebre manchada en Brasil, Uruguay y Argentina; R. africae produce la fiebre africana por garrapatas en las Antillas menores; R. akari es la causa de la viruela rickettsial en Costa Rica y México; R. massiliae es el agente de la fiebre manchada en Argentina y también fue reportada en un viajero español procedente de Argentina el cual se presume adquirió la infección en ese país suramericano (Tabla 8). La distribución de pulgas infectadas por R. felis incluyó siete países (Costa Rica, Panamá, Antillas menores, Perú, Argentina, Chile y Uruguay) donde sin embargo, no se han presentado casos humanos hasta ahora. Un total de cinco especies de Rickettsia aún no han sido descritas como patógenas para humanos: R. amblyommii (5 países), R. bellii (2 países), Candidatus ‘R. andeanae’ (2 países), R. monteiroi (1 país) y R. rhipicephali (1 país). Un total de 10 especies de Rickettsia han sido reportadas en España y Portugal: R. conorii, R. helvetica, R. monacensis, R. felis, R. slovaca, R. raoultii, R. sibirica, R. aeschlimannii, R. typhi y R. prowazekii. Además, R. rioja ha sido reportada en España y R. massiliae en Portugal (Tabla 7). De estas especies de Rickettsia, solamente R. prowazekii, R. typhi, R. felis y R. massiliae han sido documentadas en Latinoamérica. Dos casos fatales de fiebre manchada por R. conorii se diagnosticaron en Brasil, sin embargo, estos 2 pacientes adquirieron la infección en Portugal y Sur África respectivamente y desarrollaron la enfermedad unos días después de arribar a

Labruna - Rickettsiosis in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal

however, patients of these cases were considered to have acquired the infection in Portugal and South Africa, respectively, and then suffered the disease few days after they arrived in Brazil (Table 8). Likewise, one case of R. africae infection was acquired in Africa before the patient returned to Spain. For El Salvador, Honduras and Nicaragua, although no specific Rickettsia species has been reported so far, there have been serological evidence of human or/and animal infection by spotted fever and/or typhus group rickettsioses in these countries (Table 4). According to our compiled data, the following countries remain without any rickettsial records in Central America and South America: Belize, Venezuela, Guayana, Surinam and Paraguay. In addition, except for the 10 Caribbean islands of this paper, many of them also remain without records. The geographical distribution of the 13 Rickettsia species that have been identified in Latin America and Caribbean are shown in figure 1.

Brasil (Tabla 8). De igual manera, un caso de R. africae fue adquirido en África antes que el paciente regresara a España. Con respecto a El Salvador, Honduras y Nicaragua, aunque hasta ahora no se han reportado específicamente especies de Rickettsia, se han demostrado evidencia serológica de infección humana y/o animal por los grupos de las fiebres manchadas y/o tifus (Tabla 4). De acuerdo con los datos compilados, los siguientes países no presentan ningún tipo de registro de rickettsias en América Central y América del Sur: Belice, Venezuela, Guyana, Surinam y Paraguay. Además, a excepción de las 10 islas del Caribe de este trabajo, muchas de ellas también permanecen sin registro. La distribución geográfica de las 13 especies de Rickettsia que se han identificado en América Latina y el Caribe se muestra en la figura 1.

Caribbean sea

Atlantic ocean

Pathogenic species R. R. R. R. R. R. R. R.

felis prowazekii rickettsii typhi parkeri akari massiliae africae

Pacific ocean

Non - pathogenic species R. R. R. R. R.

2445

amblyommii bellii rhipicephali andeanae monteiroi

Figure 1. Geographical distribution of the 13 Rickettsia species in Latin America and Caribbean.

2446

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

DISCUSSION

DISCUSIÓN

Until the end of the last century, only three Rickettsia species were known to occur in Latin America and Caribbean: R. rickettsii, R. prowazekii, and R. typhi. With the increasing use of molecular methods since the 1990s, other Rickettsia species were discovered in the continent, such as R. africae in West Indies (147), and R. felis in Mexico (133) and later in Brazil (59). In this new century, there was a bulk in the study of Rickettsia in Latin America, with the discovery of at least 8 other Rickettsia species in the continent during the last 10 years, mostly associated with ticks: R. amblyommii, R. bellii, R. rhipicephali, R. parkeri, R. massiliae, R. akari, R. monteiroi, and Candidatus ‘R. andeanae’ (73,93,105,137).

Al final del último siglo, solamente R. rickettsii, R. prowazekii y R. typhi eran conocidas en Latinoamérica y el Caribe. Con la aparición de los métodos moleculares en los años 90, otras especies fueron descubiertas tales como R. africae en las Antillas (147), y R. felis en México (133) y más tarde en Brasil (59). En este siglo, se han desarrollado una gran cantidad de investigaciones sobre Rickettsia en Latinoamérica y al menos 8 especies nuevas se han descubierto en los últimos 10 años, la mayoría asociadas con garrapatas: R. amblyommii, R. bellii, R. rhipicephali, R. parkeri, R. massiliae, R. akari, R. monteiroi, and Candidatus ‘R. andeanae’ (73,93,105,137).

Consindering the three species (R. rickettsii, R. prowazekii, and R. typhi) known to occur in the continent since the first half of the last century, only R. rickettsii, the agent of rocky mountain spotted fever, showed an increased expansion on its distribution area during the last decades. In fact, rocky mountain spotted fever is currently considered a re-emerging disease in Mexico, Central and South America (81,93,112,131).

Teniendo en cuenta que R. rickettsii, R. prowazekii y R. typhi se describieron a mediados del siglo veinte, solamente R. rickettsii el agente de la fiebre manchada de las montañas rocosas, mostró en Latinoamérica un incremento en su distribución y expansión en las últimas décadas. De hecho, la fiebre manchada de las montañas rocosas, es actualmente considerada la enfermedad reemergente en México, Sur y Centro América (81,93,112,131).

The occurrence of R. typhi in the American continent has been practically neglected. Although this agent has been only scarcely reported in a few Latin American countries recently (49,146,184), most rickettsiologists believe that this rickettsia is widely distributed in the continent, together with its main hosts, synantropic rats and their flea Xenopsylla cheopis (185). Finally, the scarce number of recent records of R. prowazekii during the last few decades seems to be a result of decreased prevalence of its main vetcor, the body louse Pediculus corporis (185). Thus, almost all records of R. prowazekii in Latin America refer to the last century. More recent reports of human cases seem to have been restricted to highland areas of Peru, where body louse infestations are still a problem (185).

La ocurrencia de R. typhi en el continente americano ha estado prácticamente descuidada. Sin embargo, este agente ha sido reportado en algunos países de Latinoamérica recientemente (49,146,184), la mayoría de los rickettsiólogos creen que R. typhi está ampliamente distribuida en el continente, junto con las ratas sinantropicas y su pulga Xenopsylla cheopis (185). Finalmente, el escaso número de datos recientes de R. prowazekii en las últimas décadas parece ser el resultado del descenso de la prevalencia de su principal vector el piojo del cuerpo Pediculus corporis (185). Por lo tanto, casi todos los datos de R. prowazekii en Latinoamérica se refieren al último siglo. Recientes estudios de casos humanos han sido reportados en áreas altas de Perú, donde las infestaciones por el piojo del cuerpo son todavía un problema (185).

The significant advance in our knowlegment on rickettsiology during the last decade in Latin America and Caribbean was certainly a result of the increased interest of researchers on this subject in the continent. However,

El avance significativo del conocimiento sobre rickettsiología durante la última década en Latinoamérica y el Caribe fue sin duda el resultado del gran interés de los investigadores

Labruna - Rickettsiosis in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal

this advance should be considered still very incipient, if we compare the modest list of Rickettsia species and rickettsial diseases of Latin America and Caribbean with the greater lists here reported for the iberian countries, where rickettsiology has had much greater attention from researchers and governmental institutions. Indeed, the list of rickettsial diseases in Latin America will increase during the next years, not only in the countries with previous records, but also, in many of the American countries where Rickettsia has never been reported. A basal condition for this increase is the urgent need of increased capacity of Latin American laboratories to perform diagnosis of Rickettsia, since the absence of rickettsial dieases in such countries might be merely a result of absence of investigations.

Acknowledgments This work was supported by the Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnologia para el Desarrollo (CYTED) to Red Iberoamericana para la Investigacion y Control de las Enfermedades Rickettsiales (RIICER). To Janneth Gallegos M.Sc, Escuela Superior Politécnica de Chimborazo. Facultad de Ciencias. Riobamba Ecuador. To Jorge Miranda M.Sc, University of Cordoba, Colombia for the technical assistance.

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sobre esta materia en el continente. Sin embargo, este avance debería ser considerado todavía muy incipiente, si se tiene en cuenta la modesta lista de especies de Rickettsia y enfermedades rickettsiales de Latinoamérica y el Caribe, comparada con la de España y Portugal, donde la rickettsiología ha tenido mucha más atención de los investigadores e instituciones gubernamentales. De verdad, que la lista de las enfermedades por Rickettsia se incrementarán en Latinoamérica en los próximos años, no solamente en los países con reportes previos, sino en otros donde nunca ha sido reportada. Una condición básica para este incremento es la necesidad urgente de aumentar la capacidad de los laboratorios de Latinoamérica para llevar a cabo diagnóstico de Rickettsia, ya que la ausencia de la enfermedad en estos países podría ser meramente un resultado de la ausencia de investigaciones.

Agradecimientos Este trabajo fue financiado por el Programa Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) para la Red Iberoamericana de Investigación y Control de Enfermedades por Rickettsia (RIICER). A Janneth Gallegos, M.Sc. Escuela Politécnica de Chimborazo. Facultad de Ciencias. Riobamba Ecuador. A Jorge Miranda, M.Sc. Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.

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Rev.MVZ CórdobaREVISTA 16(2):2458-2469, 2011. • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 2458 MVZ CÓRDOBA

REVISIÓN DE LITERATURA

Nutritional requirements of freshwater ornamental fish: a review Requerimientos nutricionales de peces ornamentales de agua dulce: una revisión Yohana Velasco-Santamaría, 1* Ph.D, Wilson Corredor-Santamaría,

M.Sc(c).

Universidad de los Llanos, Instituto de Acuicultura (IALL), Research Group on Reproduction and Toxicology of Aquatic Organisms (GRITOX), Km 12 vía Puerto López, Villavicencio, Meta, Colombia. *Corresponding: ymvelasco@yahoo.com. 1

Recibido: Junio de 2010; Aceptado: Febrero de 2011.

ABSTRACT The knowledge of nutritional requirements in ornamental fish species is essential to improve the productive development; however, the nutritional information of these species is scarce and sometimes this information is extrapolated from results obtained from nonornamental fish species. In ornamental fish, a correct formulation of the diet improve the nutrient digestibility and supply the metabolic needs, reducing the maintenance cost and at the same time the water pollution. Inert food such as meal powder, flakes, milk powder, bovine heart and liver, tubifex worms, as well as live food including Artemia sp., rotifers and Moina have been used extensively in ornamental fish feeding with a diverse range of nutritional values and productive properties. In contrast with farmed fish, skin pigmentation is a mandatory characteristic in ornamental fish and the use of dietary supplements with carotenoids is recommended. The aim of this document is to review the specific nutritional requirements which are indispensable to improve economical and productive potential of freshwater ornamental fish. Key words: Aquarium fish, carotenoids, energy, lipids, ornamental fish, protein, vitamins. (Sources: AIMS, CAB).

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Velasco-Santamaría - Nutritional requirements of freshwater ornamental fish

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RESUMEN El conocimiento de los requerimientos nutricionales en peces ornamentales es esencial para su desarrollo productivo; sin embargo, la información nutricional en estas especias es limitada y algunas veces es extrapolada de resultados obtenidos de otras especies de peces no ornamentales. En peces ornamentales, una correcta formulación en la dieta mejora la digestibilidad nutricional y suple las necesidades metabólicas, reduciendo por tanto los costos de mantenimiento y la contaminación del agua. Alimentos inertes como comida en polvo, hojuelas, leche en polvo, corazón e hígado de bovino, gusanos tubifex así como alimento vivo tales como Artemia sp., rotíferos y Moina han sido usados extensivamente en la alimentación de peces ornamentales, con un amplio rango de valores nutricionales y propiedades productivas. A diferencia de las especies de cultivo, la pigmentación de la piel es una característica imprescindible en peces ornamentales y por tanto el uso de suplementos con carotenoides es recomendado. En conclusión, conocer los requerimientos nutricionales específicos para cada especie de peces ornamentales es indispensable para optimizar su potencial económico y productivo en la acuicultura. Palabras clave: Carotenoides, energía, lípidos, peces de acuario, peces ornamentales, proteína, vitaminas. (Fuente: AIMS, CAB).

INTRODUCTION The production and trade of ornamental fish is a profitable alternative in the aquaculture sector. Freshwater and marine species have been used successfully in the aquarium fish trade, being the most popular: discus (Symphysodona equifaciatus), guppy (Poecilia reticulata), swordtail (Xiphophorus helleri), molly (Poecilia sphenops, Poecilia latipinna) and goldfish (Carassius auratus) (1). Despite the economical importance of this sector, the nutritional information for ornamental fish is scarce and often few or even no data of the nutritional requirements is available (1,2). Guppy and goldfish are the most studied freshwater fish species (1), and true percula clownfish (Amphiprion percula) is considered as reference in nutritional studies in marine species (3). In natural conditions, fish can regulate and maintain their food intake and therefore their nutritional requirements, reducing the possibility of suffering nutritional deficiencies; however, this problem can be observed when the fish are subject to confinement conditions (4). Most of the information is not specific to ornamental fish because it has been based on results from farmed fish kept under different farming conditions, nutritional requirements, feeding habits and type of food. Therefore, the limited information

about nutrient digestibility in ornamental fish increases the maintenance costs and the water pollution (3). Taking into account the above, the aim of this article is to review the information available in the nutrition of freshwater ornamental fish with special emphasis on their nutritional requirements and feeding alternatives and to highlight the need to carry out more research in this relevant area. Nutritional requirements in ornamental fish. Lovell (4) reported that there are some factors that differentiate the nutritional requirements in fish e.g. they can absorb minerals through the gills and some fish require more dietary unsaturated fatty acids and vitamin C. Despite ornamental fish are known worldwide, the determination of nutritional requirements has not been studied deeply and it has based on the information from other species such as finfish used in aquaculture (4). One advantage of ornamental fish over farmed fish is the low amount of food required e.g. feeding requirements fluctuated from 3.8 mg feed/day/g BW in Neon tetra (Paracheirodoninnesi) to 25.79 mg feed/ day/g BW in goldfish (5).

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Energy. The energy required for maintenance and protein synthesis in fish is less than in mammals (4); therefore, the protein:energy ratio in fish is higher mainly due to the low levels of energy requirements. It is important to highlight that the food intake in fish is closely related to its energy requirements e.g. a decrease in feeding was observed in Cichla sp. at higher digestible energy (DE): brute protein (BP) ratios due to the fact that high dietary energy induce satiety (6). It was also observed that fish fed with low DE:BP ratio had a higher protein deposition due to the increase in the protein consumption (6). Based on that, it is possible to suggest that fish can use its dietary protein to maintain the energetic requirements at the expense of growth. Table 1 shows the energy requirements in some species of freshwater ornamental fish. Proteins and amino acids. The dietary protein level influences the body weight in several fish species (7,8). The crude protein requirements in many fish species generally range between 25 to 55% (9) (Table 1). The classification of the amino acids is based on both the body’s ability to synthesize them and to meet the

metabolic requirements which allow their classification into unessential and essential amino acids. Most animals including fish species require 10 essential amino acids namely arginine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine (9). The essential amino acid requirements in goldfish vary from 3.4% to 11.8% (10) which are higher than those reported in Japanese eel (Anguilla japonica), common carp (Cyprinus carpio), Channel catfish (Ictalurus punctatus) and Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha, 0.5% to 6.0%) (9). According to Elangovan and Shim (11), the comparison of protein requirements between fish species is complex since this can vary according to the size and life stage, diet formulation or farming condition. In Red tailed tinfoil (Barbodes altus), the optimal dietary protein level has been reported to be 41.7% with positive effect on weight gain. Despite the increase in the protein deposition of around 40%, this trend was not constant. A significant decrease in the body weight was observed with protein level around 50% due to the animal limitations to use the protein and their reduced feed efficiency (11).

Table 1. Protein and energy requirements in some freshwater ornamental fish species. The protein source is shown in parenthesis. Common name

Weight (g)

Energy (kJ/g)

Protein requirements (%)

Reference

Arapaima gigas

Pirarucu

120.7 ± 3.5

23.63 GE (564.5 kcal/100 g)

48.6 (FM - S)

Ituassú et al (12)

Barbodes altus

Tin foil barb

0.812

20.38 GE

41. 7 (C)

Elangovan and Shim (11)

0.2

11.72 DE

29 (FM - C)

Lochmann and Phillips (13)

0.008

20.3 GE

53 (FM - C)

Fiogbé and Kestemont (10)

Redhead cichlid

0.28

1.55 DE

40.81 (FM)

Olevera-Novoa et al (14)

Cichla sp.

Tucunaré

10 - 30

14.65 DE (3500 kcal/kg)

37 - 41 (FM - FE - S)

Sampaio et al (6)

Colisa lalia

Dwarf gourami

Shim et al (15)

Guppy

0.1

13.10 ME

30 - 40 (FM - C)

Shim and Chua (16)

Angelfish

2.33 ± 0.26

12.97 DE (3100 kcal/kg)

26 (S - CM)

Zuanon et al (17)

Discus

4.45 - 4.65

21.65 GE

44.9 - 50.1 (FM - C)

Chong et al (18)

Swordtails, 6 - 8 weeks

45% (FM - S)

Kruger et al (19)

Females, 20 wk

1.1 -1.2

16.5 GE

30 (FM - C)

Chong et al (8)

Females, 20 wk

0.8 - 0.9

20.9 GE

30 (FM - KM)

Ling et al (7)

Scientific name

Carassius auratus

Cichlasoma synspilum

Poecilia reticulata Pterophyllum scalare Symphisodon aequifasciata

Xiphophorus helleri

Goldfish

NR: not reported. GE: gross energy; ME: metabolizable energy; DE: digestible energy; FM: fish meal; C: casein; CM: corn meal; FE: fish egg; S: soybean; KM: krill meal.

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The protein source is also an important factor to be consider in the diet formulation. Marine protein sources were more efficiently to induce the weight gain in neon tetra (Paracheirodon innesi) than diets based on vegetable proteins; however, fish fed with both protein sources diets containing 45% or 55% crude protein showed a better growth performance than 25% crude protein diets (20). These authors confirm the need to carry out additional studies on the nutritional requirements of ornamental fish species using mainly vegetable protein sources to reduce the productive cost. The life stage also affects the protein requirements level, for example in juvenile goldfish the protein requirement is lower (29%) than larvae (53%) (10,13). These authors suggest that this difference can be explained by the faster growth in larvae over a shorter period, and the physiological characteristics such as the inadequate selection of protein in larvae. The species of Poeciliidae family including guppy, molly, red swordtail and platies (Xiphophorus maculatus) are the most popular ornamental fish produced in Singapore, Malaysia, Indonesia, Thailand, India and China; consequently, the broodstock nutrition is considered as an important factor in the reproductive performance in most fish species (8). In this respect, increases in the relative fecundity as well as fry production of X. helleri were observed in larvae from females fed with very high level of protein (>30%) (7,8). However, effects of the dietary protein on fry length and weight were not observed (8). These authors concluded that 30% of dietary protein could be used to guarantee the fry production. Lower protein levels (20%) produce lower protein content in muscle and ovary tissue in swordtail (7,8), which could be explained by the utilization of the body protein reserves and hence deficiency in protein for corporal growth and oocyte development. This is in agreement with Afzal Khan et al (21) who observed that fish fed with low dietary protein had lower egg protein content. Similarly, decreases

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in the ovarian mass was observed in fish fed with 20% of dietary protein as a result of poor oocyte development; in contrast, the hepatosomatic index was higher in fish fed with 30% of dietary protein level, probably as a mechanism to improve the vitellogenesis (7). Chong et al (18) suggested that discus (S. aequifasciata) has high protein requirements due to its carnivorous habits. In this species, casein, fish meal and bovine heart provided a high dry matter digestibility whereas wheat meal and soybean produced the low values. On the other hand, the high protein digestibility has been observed in diets contained casein but also in diets with fish meal, soybean and bovine heart (22). The use of bovine heart is a common practice in fish farms as a main ingredient in preparation of moist feed diets in ornamental fish. Chong et al (22) also suggested that this kind of food could be used as a major dietary protein source for commercial discus farming. To avoid water pollution, the ornamental fish require an efficient utilization of the dietary protein to minimize the ammonia excretion (3). Therefore, new alternatives of fish meal replacement have been studied, with soybean meal being a good option due to its high protein level and satisfactory growth results (3). However, high levels of soybean incorporation in the diet of discus lead to reduction in the food intake due to low palatability and decreased digestibility, therefore longer periods of acclimatization are recommended to avoid this problem (1,22). Lipids and essential fatty acids. According with Sales and Janssens (3), the lipids are important sources of energy and fatty acids which are essential for normal growth and fish survival. In general, most fish require unsaturated fatty acids with long chains; nevertheless, the requirements vary according to the species with the most essential n-3 and n-6 fatty acids (4). Freshwater fish require linoleic acid (18:2 n-6) or linolenic acid (18:3 n-3) whereas seawater species require eicosapentaenoic acid (20:5 n-3) and docosahexaenoic acid (22:6 n-3) (9). Despite the physiological

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importance of fatty acids, the information on the requirements of ornamental fish is scarce (3). Marine oils and some vegetable oils are the main source of lipids in fish food; however, the high cost and easy oxidation of marine oils have motivated the use of alternative sources. Ling et al (7) suggested that the muscle lipid content acts as a source of lipid in the ovary, making it a useful indicator of reproductive performance. Increases in dietary lipid from 8% to 16% with the same protein level, improved the growth performance in swordtail. The muscle lipid content had the same trend as the protein level, with the highest accumulation observed with the highest dietary lipid (7). In eastern mosquitofish (Gambusia holbrooki), a clear relationship between diet lipids and mobilization of ovary lipids during vitellogenesis improve the reproductive performance (23). In contrast, in the lipid content did not influence the gonadosomatic and hepatosomatic index in X. hilleri (7). Alternative food including tubifex worms, mosquito larvae and bovine liver and heart are offered frequently in some freshwater ornamental fish with the aim to improve the reproductive maturation and spawning (22,24). In this respect, Tamaru et al (24) reported that bovine liver and mosquito larvae had the highest composition levels of fatty acids (8.96 and 8.27 mg/100 mg dry weight, respectively); however, all of the live food and fresh food preparations evaluated showed deficient and lower levels of 22:6 (n-3) than bovine heart. The

most common fatty acids in alternative diets are 18:2 (n-6) and 20:4 (n-6) which are involved in the reproductive physiology since they are prostaglandin precursors which are important in the ovulation process (24). Frequently fish farmers use live food such as tubifex worms, blood worms and freshly prepared foods including bovine liver and heart, cockles and shrimps as protein sources (22). The composition of essential fatty acids in some of these alternative food is shown in the table 2. Carbohydrates. In ornamental fish the information about carbohydrate metabolism and its function remain unknown compared to the broad knowledge in other fish species. The hydrolysis of CHOn in the intestinal mucosa produce monosaccharides that are easily absorbed with glucose the most important sugar; however, the real role of CHOn and glucose in fish is uncertain (9). CHOn could be a cheaper source of energy than protein and lipids (3); however, the dietary carbohydrate requirements in fish has not been demonstrated clearly. Although in ornamental fish the information about carbohydrate metabolism is limited, some physiological and biochemical function has been found in other fish species. In some carnivorous fish, increases in starch above 10% of dietary dry matter reduce the food utilization and the fish are unable to control efficiently the glucose concentration. The CHOn are involved in the secretion and activity of insulin and glucagon

Table 2. Essential fatty acids contained in alternative food used in freshwater ornamental fish. Values are expressed in mg/100 mg dry weight. From Tamaru and Ako with permission (24). Fatty acids

Bovine heart diet*

Bovine liver

Black tubifex

Red tubifex

Moina

Earthworms

Mosquito larvae

18:2n-6

1.71

1.56

1.68

1.43

0.11

0.48

20:4n-6

0.51

0.22

0.90

0.64

0.16

0.22

0.33

18:3n-3

0.2

0.0

0.51

0.19

0.04

0.10

0.31

20:5n-3

0.11

0.0

0.61

0.33

0.07

0.09

0.23

22:6n-3

0.33

0.0

Total FA

4.86

8.96

6.22

4.68

4.22

0.81

8.27

*Bovine heart contains 0.33 mg/100 mg dry weight of 22:6n-3. This essential fatty acid was absent in the other kind of food (0).

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and in less proportion in the growth hormones. One of the most important pathways is the intake of CHOn in the pentose phosphate cycle to produce NADPH, which is essential for the fatty acid biosynthesis. Therefore CHOn are considered as a precursor of lipogenesis and stimulate the fat deposition. For instance, at low temperatures the pentose cycle is activated in some fish species and in other species the prolonged food deprivation stimulates the efficient utilization of the stored hepatic glycogen (25).

Vitamins E and C are considered antioxidants owing to their ability to reduce the stress response in fish (29). Vitamin C is essential in many metabolic processes including collagen synthesis (tissue repair), protection of cell membranes, metal absorption and detoxification of xenobiotics. In addition, vitamin C is considered an intra- and intercellular reducing agent. It is known that, the concentration of ascorbic acid affects the mixed-function oxidases activity that are involved in the metabolism of xenobiotics (30).

Despite the above findings, Krogdahl et al (26) reviewed the carbohydrate digestion and physiological mechanism in fish concluding that with the current information it is impossible to elucidate the real digestibility and nutrient utilization of carbohydrates, emphasizing the need to carry out additional studies in this area.

Vitamin C is supplemented using ascorbic acid (AA) as a source. Its deficiency in fish can produce deformities in opercula and jaws, lordosis, growth reduction and hemorrhage in eyes and fins (4,31). In addition, erosion of the skin and fins, exophthalmia, swollen abdomen and dark coloration has been reported in mayan cichlid (Cichlasoma urophthalmus) (32). Fracalossi et al (31) reported that oscar (Astronotus ocelatus) without AA supplementation showed reduced weight gain and deformities in the cartilage supporting the gills and the vertebral column due to the decrease in collagen content. Therefore, these authors concluded that 25 mg AA/kg diet is sufficient to prevent the clinical manifestation of vitamin C deficiency. Blom and Dabrowski (2) reported no effects on mortality, macroscopic alterations or negative effects on growth performance in angelfish (Pterophyllumscalare) fed with concentrations of ascorbic acid between 30 to 1440 mg/kg diet during 96 days.

Minerals. Lovell (4) states that, in general, the mineral supplementation in fish is reduced since they can absorb these minerals through the gill membranes and intestinal epithelium; which could explain the few studies regards mineral requirements in fish. It has been observed in guppy, that the required magnesium level for optimal growth is 0.54 g/kg of diet (27). The most important minerals include calcium, phosphorus, copper, iodine, iron, magnesium, manganese, selenium and zinc (4). Within these, phosphorus is commonly supplemented since it is essential in growth, bone mineralization and lipid and carbohydrate metabolism (3) and because its concentration in water is low (4). Some clinical manifestations of phosphorus deficiency in guppy include depressed appetite, scoliosis and lordosis has been observed (28). Vitamins. Based on Lovell (4), most fish species require vitamin supplementation which vary according to species, fish size, food rates, environmental factors, nutrient interrelationships or health condition. Essential vitamins in some metabolic and corporal enzymatic reactions are commonly supplemented in the diet.

In angelfish, ascorbic acid levels above 360 mg/kg diet increased the liver AA level; in contrast, diets with less than 120 mg AA/ kg diet showed the lowest AA concentration (2). To keep the maximum liver storage of vitamin C, angelfish juveniles require higher AA levels than the requirements of vitamin C in other ornamental fish such as Oscars (Astronotus ocellatus) and Mexican cichlids and farmed fish like catfish (11 mg AA/kg) and tilapia aurea (50 mg AA/ kg) (Table 3).

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Table 3. Vitamin A and C requirements in four ornamental fish species. Scientific name

Initial weight (g)

Vitamin C (mg/kg)

Cichlasoma urophthalmus

0.16 - 0.17 mg

40 (growth) 110 (health)

Chávez de Martínez (26)

29.1 ± 1.9

Fracalossi et al (25)

2000 - 4000

Shim and Tan (33)

1.12 ± 0.08

360

Blom and Dabrowski (2)

Astronotus ocellatus Poecilia reticulata Pterophylum scalare

Vitamin A

(IU/kg)

Reference

NR: not reported.

The activity of L-ascorbic acid is timedependant and oxidation labile, making necessary to keep a fresh diet preparation (4, 30). In ornamental fish food, it is possible to find L-ascorbic-2-phosphate which is incorporated into commercial diets (ascorbic acid phosphate; 4). Other sources of vitamin C which are more stable and resistant to oxidation include L-ascorbic-2-sulphate, ascorbic2-glycoside and ascorbate-6-palmitate (24). However, the selection of the vitamin C form depends on the diet, fish size, fish species, husbandry and cost. Carotenoids and their role in the colour enhancement. Dietary carotenoids and carotenoid-protein complexes are the main source of fish skin and muscle pigmentation (3,4,34); therefore, to increase the skin and flesh colour in captivity, fish must obtain an optimum level of carotenoids in their diet (35). Fish skin colour is mainly attributed to the presence of chromatophores that contain pigments including melanins, pteridines, purines and carotenoids (34). Since fish, like other animals, do not biosynthesize carotenoids de novo, it is essential to provide them with dietary supplements to allow the storage in tissue and teguments (34). Carotenoids are only synthesized by plants, phytoplankton (microalgae), zooplankton and crustaceans; therefore, the primary productivity in ponds directly affects the skin pigmentation due to the availability of natural or life food to synthesized these compounds (4). Wallat et al (36) reported that fish skin colour pigmentation is faster in pond-water-reared than in those fish reared in well water.

The most common carotenoids in freshwater include astaxanthin, zeaxanthin, xanthophylls, lutein, α- and β-carotene, taraxanthin and tunaxanthin (9). Wang et al (37) report that in Serpae tetra (Hyphessobrycon callistus), astaxanthin is the main body carotenoid and most of the dietary β-carotenoid are converted and stored as astaxanthin into the body. The carotenoid has a variety of functions including antioxidant, inducer of provitamin A activity, enhancing immune response, reproduction, growth, maturation and photoprotection (35). It has been shown, in flame-red dwarf gourami (Colisa lalia) that inclusion of synthetic astaxanthin in the diet enhance the red skin coloration stimulating sexual behaviour (38). In terms of immune response, decrease in superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidise (GTP), aspartate and alanine transaminase activities were observed with increased dietary carotenoid concentration, suggesting a possible antioxidant capacity and liver protection (37). The cost of synthetic pigments has encouraged the research of natural compounds such as yeast, marine bacteria, green algae and even plants extracts as a pigment sources. In this respect, Chlorella vulgaris has been the most effective to improve the skin colour intensity in ornamental fish (39,40). The great bioavailability and the thin cellular membrane are the variables that contribute to the high efficiency of C. vulgaris. However, there is still difference in terms of pigmentation between natural and synthetic sources. Supplementation with C. vulgaris showed good skin pigmentation in goldfish but the best pigmentation rates were observed in fish fed with astaxanthin

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diets (40). Shina and Asimi (35) evaluated in goldfish four natural carotenoid sources (Spirulina, China rose petals, Marigold petals and Lactobacil a at 5 mg/kg) showing that China rose petals as the most effective to enhance skin pigmentation and improve gonadal development. In contrast, Ezhil et al (41) evaluated the use of marigold petal meal in swordtail concluding that this lutein can be used as a pigmenting source. The supplementation with natural or synthetic dietary carotenoid in some fish species did not stimulate neither the growth, feed efficiency nor survival (37,39,40,41). Therefore, owing to the carotenoid nutritional value is often lower than traditional diets, protein supplementation with this dietary source is highly recommended. Live food as an alternative to improve ornamental fish production. Lim et al (42) states that the efficiency in the production of fish larvae, fry and fingerlings are related with the accessibility to live food for feeding purpose. Suitable quantities of live food have contributed to the success in most of the marine fish species; however, the production in freshwater fish has been limited due to the reduced availability of live food (42). Various types of macro- and micro-live food used in marine and freshwater fish species included Artemia nauplii, rotifers, bloodworm, Tubifex, mosquito larvae, Daphnia and Moina (22,24,42). Rotifers are suitable for the first feeding in fish larvae due to their small size, slow swimming and nutritional quality. The principal marine and freshwater rotifers used are Brachyonius plicatilis and B. calcyflorus, respectively (42). The common live food offered after rotifer feeding is Artemia nauplii, a marine species used massively in marine and freshwater fish because itâ&#x20AC;&#x2122;s high nutritional properties; however, itâ&#x20AC;&#x2122;s high productive cost is a disadvantage (42). In this respect, Lim et al (43) proposed the use of decapsulated cysts as a substitute for Artemia nauplii or Moina in freshwater ornamental fish, showing a better growth performance, survival and stress resistance as well as a low cost and better hygienic

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procedure. Finally, on-grown Artemia has produced high performance when bigger ornamental fish are fed (42). The feeding of clown fish (Amphiprion percula) fry with dry feed showed similar survival rate to fish fed with Artemia (44); however, this species could only efficiently digested the artificial food from 9 days post hatching (45). Food preparation for ornamental fish. Coutinho et al (46) reported that the inert diets used in the nutrition of marine fish larvae have been formulated with a similar composition to live food; some of these inert diets include algae, yeast, blood, egg, heart and mammal liver and fish muscle which are suitable sources of nutrients. As previously stated, algae, rotifers and Artemia nauplii are the most common food for ornamental fish larvae, especially for larvae from small eggs due to the yolk sac is consumed faster once hatching, and in this period the digestive tract is unable to receive inert food (4). In larvae with small mouths, supplementation with egg yolk suspension, milk powder or powdered food and small plankton are used routinely (42). Usually during the first week the larvae are fed with live food or a mix with an inert food with the aim to subsequently increase the ingestion of dry food. In this step, powder meal is supplemented with vitamins and oil to reduce the losses of nutrients into the water (4). Another alternative is to offer pellets with a gradual increase in the size according to the larvae age (4). A suitable growth rate and maintenance has been observed in angelfish fed with extruded and pellet diets (4000 kcal/kg and 28% protein); however, fish fed with ground diet showed poor growth and smaller specific growth rate (47). In contrast, higher growth was observed in guppy fed with powdered food rather than flake food, probably due to the fish ability to consume the food quickly, preventing the leaching of vital nutrients from the food (48). One of the problems is owing to the fact that different ornamental fish species are often kept in the same aquarium or tank, making difficult to supply the nutritional requirements for each particular species

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taking into account the physiological and morphological characteristics as well as the feeding habits (45). Due to these factors, feeding fish in aquarium on a speciesspecific basis is impractical and therefore diet extrapolation has been a common practice in the aquariophily. Final remarks. The scarce knowledge about nutrient requirement and digestibility in ornamental fish has led to extrapolate the information available from farmed fish without consider the species-specific requirements; therefore, this practice could lead to affect negatively the growth performance, phenotype and physiology.

Taking this review into account, we highlight the need to carry out studies in native ornamental fish or ornamental species with commercial interest in order to fulfill their optimum nutritional requirements, promote optimal growth, reduce the cost and food waste, and minimize the water pollution. Moreover the traditional parameters used in aquaculture to evaluate diet formulation such growth performance and reproduction, is required to consider diets containing carotenoids to enhance the skin and flesh pigmentation. Finally, based on the importance of the live food as a source of fatty acids, protein and vitamins, it is highly recommended to carry out research in this area to improve the production of live food and to supply the food demand.

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Rev.MVZ CórdobaREVISTA 16(2):2470-2483, 2011. • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 2470 MVZ CÓRDOBA

REVISIÓN DE LITERATURA

Principales marcadores moleculares utilizados para la identificación de Babesia bovis y Babesia bigemina Principal molecular markers used to identify Babesia bovis and Babesia bigemina Sandra Ríos T,

M.Sc, Leonardo Ríos O, 1,* Ph.D.

Universidad de Antioquia, Escuela de Microbiología, Grupo de Investigación en Microbiología Veterinaria, Calle 67 # 53 – 108, AA 1226. Medellín, Colombia. *Correspondencia: mleonardo@ udea.edu.co. 1

Recibido: Junio de 2010; Aceptado: Febrero de 2011.

RESUMEN Este artículo describe los principales marcadores moleculares utilizados para la identificación de B. bovis y B. bigemina reportados en la literatura científica. Para ello se diseñó una revisión sistemática a partir de la aplicación de la estrategia metodológica PICO modificada con el objetivo de definir las secuencias nucleotídicas detectadas en los diferentes sitios geográficos y su utilidad diagnóstica. Se realizó una búsqueda avanzada con los términos “Babesia bovis” y “DNA” y “Babesia bigemina” y “DNA” en las bases de datos ScienceDirect, SpringerLink y PubMed que después de ser filtradas permitieron obtener un resultado total de 68 artículos originales. Tanto los artículos incluidos como los excluidos fueron almacenados en tablas, en las cuales se presenta la justificación de su condición dentro del estudio. A los 68 artículos seleccionados se les aplicó una evaluación con criterios de inclusión y exclusión previamente definidos, de este modo, 21 artículos originales cumplieron con los criterios de inclusión y se incluyeron en el estudio. Se describe la utilidad de los marcadores moleculares referenciados en la literatura científica desde 1995 hasta el 2010: la subunidad pequeña RNAr, el gen citocromo b, gen msa-1 and msa-2c, el gen Bv, el factor de elongación alfa (EF-1α), el gen de la beta-Tubulina, SBP 1-2-3, y los RAP; su aplicación diagnóstica y su utilización en los diferentes sitios geográficos. Los marcadores moleculares utilizados para la detección de las babesias bovinas varían dependiendo de la región geográfica, grado de conservación genética y resultados de estudios previos que concluyen su utilidad diagnóstica. Palabras clave: Citocromo b, DNA, marcadores genéticos, secuencias nucleotídicas, tubulina. (Fuente: CAB).

2470

Ríos - Principales marcadores utilizados en Babesia bovis y Babesia bigemina

2471

ABSTRACT This paper describes the principal molecular markers used to identify B. bovis and B. bigemina reported in the scientific literature. A systematic review was designed based on the application of the PICO methodologic modified strategy to define the nucleotide sequences detected in different geographical locations and their diagnostic utility. An advanced search was made in data bases ScienceDirect, SpringerLink and PubMed. Using the terms “Babesia bovis” and “DNA” and “Babesia bigemina” and “DNA”. A total of 68 original articles were selected after the information was filtered. Both included and excluded articles were registered in tables, where its position of their status, within the study, was represented. The 68 articles were evaluated using a previously defined criteria of inclusion or exclusion. A total of 21 articles met the inclusion criteria and were included in this study. It was described the usefulness of molecular markers referenced in the scientific literature from 1995 to 2010: small-subunit ribosomal rna, cytochrome b gene, msa-1 and msa-2c gene, bv gene, elongation factor –1 alpha (ef-1α), beta-tubulin gene, sbp 1-2-3, and rap genes, its diagnostic application and its use in different geographical locations. Molecular markers used for detection of bovine babesia vary by geographic region, degree of genetic conservation and results of previous studies that conclude their diagnostic utility. Key words: Cytochrome b, DNA, genetic markers, nucleotide sequences, tubulin. (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN La Babesiosis bovina, una enfermedad causada por un protozoo intraeritrocítico del orden Piroplasmida, phylum Apicomplexa, género Babesia, se encuentra ampliamente distribuida en países tropicales y subtropicales (1-3). Babesia bigemina y Babesia bovis, son las especies mas frecuentes causantes de esta enfermedad en bovinos y son transmitidas por garrapatas del género Rhipicephalus (Boophilus); otros vectores incluyen Ixodes sp, y Haemaphysalis sp. (4). B. bigemina es la especie que presenta la distribución más amplia, sin embargo, B. bovis es la más patógena. Las infecciones se caracterizan por presentar fiebre alta, ataxia, anorexia, shock circulatorio general y en ocasiones, síntomas nerviosos como resultado del secuestro de eritrocitos infectados en los capilares cerebrales (5). Los síntomas en las infecciones por B. bigemina incluyen fiebre, hemoglobinuria y anemia, pero no tiene lugar el secuestro intravascular de eritrocitos. (6). Esta enfermedad es responsable de grandes pérdidas económicas en términos de mortalidad y morbilidad de los bovinos;

generando un impacto significativo en la producción de carne y leche y por consiguiente en el manejo de la ganadería. (7). En la literatura científica, desde la década de los noventa se han reportado secuencias nucleotídicas de cepas circulantes de B. bovis y B. bigemina en diferentes regiones, reportándose genotipos idénticos en Asia, África, América, Europa y Oceanía (8,9); sin embargo, se han reportado cepas con variaciones genéticas asociadas a modificaciones endógenas y exógenas inducidas por tratamientos antiparasitarios, mecanismos de respuesta inmune del hospedador y procesos evolutivos que han generado mecanismos de resistencia y patogenicidad que garantizan su permanencia en el tiempo (7). Las investigaciones recientes sobre babesiosis bovina se han centrado en la determinación de su taxonomía, el desarrollo de técnicas diagnósticas sensibles y específicas, aspectos de la fisiopatología y búsqueda del mejoramiento de métodos de quimioterapia e inmunoprofilaxis (10). Sin embargo, no existen estudios que recopilen

2472

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y analicen la literatura existente acerca de los marcadores moleculares más utilizados para la detección de estos hemoparásitos de acuerdo con su distribución geográfica. Por lo anterior, el objetivo de esta revisión sistemática fue describir los principales marcadores moleculares utilizados para la identificación de B. bovis y B. bigemina, reportados en la literatura científica con el fin de definir las secuencias nucleotídicas detectadas en los diferentes sitios geográficos y su utilidad diagnóstica. Se diseñó un estudio teórico bajo la metodología PICO (11), modificada, donde el paciente se relaciona con la especie parasitaria (B. bovis y B. bigemina), Intervención, con los diferentes marcadores moleculares, Comparación con la ubicación geográfica de los estudios evaluados, y Outcome con el resultado de la descripción de los diferentes estudios sobre los marcadores y la utilidad de cada uno de ellos. A partir de la aplicación de esta estrategia metodológica se buscó responder a la pregunta de investigación: ¿Cuáles son los principales marcadores moleculares utilizados para la identificación de Babesia bovis y Babesia bigemina reportados en la literatura científica? Se seleccionaron artículos originales reportados en la literatura científica en los cuales se amplificaron cepas de B. bovis y B. bigemina circulantes en zonas endémicas del mundo; se incluyeron artículos en inglés y español publicados entre enero de 1995 y enero de 2010. Se excluyeron aquellos artículos que amplificaron DNA de otros parásitos o que utilizaron el DNA de B. bovis y/o B. bigemina como control para el diagnóstico de otras hemoparasitosis, artículos de revisión, protocolos y capítulos de libro. La búsqueda directa de artículos en las bases de datos Pubmed, Springerlink, Science Direct se realizó utilizando los términos de búsqueda seleccionados con base en los sistemas Mesh (Medical subject Heading) y DecS (Descriptores de

Ciencias de la Salud) donde se encuentra el vocabulario de términos biomédicos. Los términos no Mesh (Babesia bigemina) fueron adoptados del sistema DecS. Estos fueron: “Babesia bovis”, “Babesia bigemina” y “DNA”, unidos por el conector AND, con búsquedas diferentes “Babesia bovis” AND “DNA” y “Babesia bigemina” AND “DNA”. De los 68 artículos seleccionados, 21 artículos originales cumplieron con los criterios de inclusión (Tabla 1); y la ubicación geográfica de los estudios en los cuales se incluyen los marcadores moleculares se presenta en la figura 1. Tabla 1. Artículos de referencia Año

Base de Datos

Ubicación geográfica

Marcador molecular

Caccio et al (5)

2000

PubMed

Italia

Beta-tubulin

Silins et al (12)

1996

PubMed

Australia

BNMK

1997

Science Direct

Australia

Bv80

1997

PubMed

Australia

Bv80

1998

PubMed

México

Bv80

Quintao-Silva et al (14)

2007

PubMed

Brasil

Bv80

Bock et al (15)

2000

PubMed

Australia

Bv80 and BvVA1

Buling et al (16)

2007

Science Direct

España

Citocormo b

Salem et al (17)

1999

PubMed

USA

Citocromo b

Suarez et al (18)

2006

Science Direct

Australia

Factor de elongación 1α

Borgonio (19)

2008

PubMed

México

msa-1 y msa-2c

Pérez-Llaneza et al (20)

2010

Science Direct

Argentina

msa2

Silva ET al (21)

2009

Science Direct

Portugal

RAP-1/CT-STR

Luo et al (22)

2005

Springer

China

rRNA

2007

Springer

Sudán

rRNA

2008

Springer

Túnez

rRNA

Adham et al K (25)

2009

Springer

Egipto

rRNA

Durrani, (26)

2008

Springer

Pakistán

rRNA

2000

Science Direct

México

SBP 1,2,3

2009

PubMed

Ghana, Mongolia y Brasil

SBP 2 - RAP 1

2009

Science Direct

USA

Ves1alfa

Autor

Lew et al (1) Lew et al (2) Figueroa (13)

Salih et al (23) M’ghirbi (24)

Kamal

Ruef et al (27) Aboulaila (28)

Zupanska et al (29)

Ríos - Principales marcadores utilizados en Babesia bovis y Babesia bigemina Marcador Bv80

2473

Referencia Lew et al (1) Lew et al (2) Figueroa et al (13) Quintao - Silva et al (14) Bock et al (15)

rRNA

Jianxu et al (22) Salih et al (23) M’ghirbi et al (24) Adham et al (25) Durrani, Kamal (26) Ruef et al (27)

RAP-1

Silva et al (21) Aboulaila et al (28)

BNMK SBP 1,2,3

Silins et al (12) Ruef et al (27) Aboulaila et al (28)

EF 1α Citocromo b

Suarez et al (18) Buling et al (16) Salem et al (17)

b-tubulina msa1 msa2c

Caccio et al (5) Borgonio et al (19) Pérez- Llaneza et al (20)

Figura1. Mapa de distribución de los marcadores moleculares reportados en la literatura científica

Principales marcadores moleculares utilizados para la identificación de B. bovis y B. bigemina en diferentes regiones del mundo. Gen BNMK, L35 (b/35). Es una región del genoma nuclear de B. bovis que codifica para una proteína ribosomal homóloga L35 (b/35) y un nucleósido monofosfato quinasa (BNMK). Silins (12) presenta la primera evidencia de secuencias intrónicas, así como de RNAm heterogéneos 5 ‘y 3’ de un miembro del género Babesia. El examen de las estructuras de los genes indicó que la codificación de regiones que contienen pequeñas secuencias de intervención, obedecen a la regla GT-AG de eucariotas o intrones. El único intrón separa el codón de iniciación B135 del resto de la región codificante y el exón (gen BNMK), no parece estar complementado de manera diferente. Ambos genes utilizan sitios de poliadenilación múltiples similares a los de los mamíferos. Los análisis revelan que la extensión del primer en el gen BNMK utiliza un conjunto de puntos de inicio de la transcripción, uno de los cuales se utiliza con más frecuencia (12). Basándose en estos resultados, se especula que el gen BNMK tiene un papel dentro de la mitocondria de la Babesia sp. La

presencia de intrones de tamaño pequeño en el genoma de Babesia sp. sugiere que desempeñan un papel importante dentro de este parásito que podría incluir complementación diferencial (12). No se identificaron en esta región elementos de repetición, secuencias de transcripción eucariota y otros elementos semejantes de control. La ausencia más notable incluyen la típica señal de mamíferos TATAA / TA (TATAbox), CCAAT (CAAT-box) y GGGCGG (SPL). Los datos encontrados en los estudios revisados sugieren que se empleó preferencialmente uno de los sitios de poliadenilación por el gen B135, aunque los resultados no fueron tan claros para BNMK. Los múltiples sitios de poliadenilación podrían representar una mezcla de transcripciones dependiendo de la especie de Babesia, que tal vez corresponden a variaciones morfológicas de la especie. Alternativamente, los extremos heterogéneos 3’ se pueden generar sin un propósito específico, como está reportado en las plantas. Por otro lado, la heterogeneidad del 3’ puede estar relacionada con la presencia de una población de parásitos genéticamente mixta; sin embargo, la escasa variación en los nucleótidos, de acuerdo con lo

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observado en las secuencias de ADN, sugiere que Babesia sp. no utiliza la señal de los mamíferos AATAAA para dirigir el sitio de poli A. (12). Subunidad pequeña RNAr. Es el componente pequeño de los ribosomas del citoplasma eucariótico, y por lo tanto uno de los componentes básicos de todas las células eucariotas (22). Los datos del DNAr 18S son ampliamente utilizados en el análisis molecular y reconstrucción de la historia evolutiva de los organismos; como su ritmo evolutivo es lento, lo hace adecuado para reconocer los cambios en lugar y tiempo (25). Luo et al (22) compararon y analizaron las secuencias del gen de la subunidad pequeña del RNA ribosomal de seis poblaciones Chinas de babesias bovinas, incluyeron Babesia sp., B. bigemina, B. bovis, B. ovata, B. major. Los resultados mostraron que la transmisión B. ovata se da por Haemaphysalis longicornis y los aislados de Babesia sp., se limitan al mismo grupo que B. ovata en Corea, con una identidad entre ellos mayor a 96.5%, mientras que B. major que es transmitida por H. punctata fue situado en otra rama, y la identidad con otras especies bovinas de Babesia fue inferior a 92.5%. B. ovata debe, por tanto, ser una especie válida para bovinos, a diferencia de B. major, de acuerdo con la secuencia del gen 18S RNAr. Salih et al (23), realizaron un estudio epizootiológico de las enfermedades transmitidas por garrapatas al sur de Sudán, usando como gen blanco la subunidad pequeña del RNAr, y como primers, secuencias reportadas en Estados Unidos, que amplificaron perfectamente las cepas circulantes en Sudán, mostrando ser una secuencia conservada en diferentes regiones del mundo. Por otro lado, M’ghirbi et al (24), en Túnez, realizaron una encuesta molecular de hemoparásitos en Babesia sp y Theileria sp, utilizando para su identificación por PCR la región hipervariable del V4 de este mismo gen. Luego de la secuenciación de los

productos amplificados se demostró que es un gen muy conservado para cada una de las especies; esto se confirmó al someter las secuencias para la evaluación de su identidad (BLAST) en comparación con las previamente reportadas en el GenBank (EF643472; AY524666) resultando identidad del 96 al 100% con aislados de México y Turquía. En Egipto, Adham et al (25) realizaron el análisis de la secuencia del producto de PCR de B. bovis y B. bigemina, encontrando un alto porcentaje de identidad en comparación con las especies similares encontradas en el GenBank. La comparación se hizo mediante un BLAST para cada una de las especies, encontrando identidad desde el 93 al 100% con aislados provenientes de diferentes ubicaciones geográficas. (Tamaulipas, EF642472; Israel, EF601930; Veracruz, EF643474, AY150059; Quintana Roo, EF643469) para B. bovis; y para B. bigemina (DQ785311; AY533147; DQ159075, DQ159072); se reporta así como un gen conservado entre aislados de diferentes continentes, susceptible de ser amplificado en estudios posteriores. Gen del citocromo b. Gen de la proteína mitocondrial y componente obligatorio en la cadena respiratoria del microorganismo, fue utilizado por Buling et al (16), en España, para detectar y cuantificar babesias bovinas, debido a que este presenta una mayor cantidad de copias que los genes ribosomales. Los autores compararon secuencias amplificadas de ambos genes de aislados de España, Portugal, Argentina y, para el gen de la subunidad 18S RNAr, se encontró el 100% de coincidencia con otras secuencias depositadas en la base de datos GenBank, con la única excepción de un aislado de China (AY603402) que mostró diferencias muy leves. Se observó una mayor similitud entre muestras procedentes de América (Argentina, México [obtenidos en el GenBank]) o de Europa (España, Portugal) que entre muestras de diferentes continentes. Mientras que aislados de las ubicaciones geográficas referenciadas mostraron exactamente la

Ríos - Principales marcadores utilizados en Babesia bovis y Babesia bigemina

2475

misma secuencia de la proteína citocromo b, lo que demuestra su conservación en las diferentes regiones geográficas.

sólo en aislados de México con una alta identidad en la secuencia (≥ 99%, en ocho aislamientos).

Se sugiere además que la amplificación del gen episomal es más sensible que la del gen ribosomal, porque con ensayos realizados con diluciones seriadas de DNA de muestras positivas se generan productos de amplificación con cantidades más pequeñas de DNA que con el gen ribosomal.

Análisis de secuencia y de alineamiento múltiple demostraron un alto grado de identidad de secuencia en el msa- 2c (90100%) entre los aislamientos de B. bovis de México y las cepas de referencia. Al utilizar un anticuerpo policlonal de msa-2c, este reaccionó contra los extractos de proteínas reconocidas y conservadas en al menos nueve de los aislamientos de B. bovis. Los resultados obtenidos en este estudio coinciden con los previamente reportados por otros investigadores y confirman que, con base en la conservación de la secuencia identificada en México de B. bovis y las cepas aisladas hasta ahora, msa-2c representa un antígeno ideal que vale la pena evaluar en estudios moleculares como una posible vacuna.

Gen msa-1 y msa-2c. Estos genes presentes en Babesia bovis codifican para las proteínas antigénicas presentes en la superficie del merozoito (msa) y están involucrados en la invasión del parásito a los eritrocitos de la especie bovina. Los estudios realizados en msa-1 han puesto en evidencia la variación alélica en B. bovis en aislados de regiones endémicas similares, así como en los aislados de diferentes regiones geográficas del mundo (Argentina, Australia, Israel). Sin embargo, estudios realizados sobre msa-2c, han demostrado que este antígeno se conserva ampliamente en los aislados de diferentes regiones geográficas (19). Borgonio et al (19) en México plantearon la hipótesis de que los antígenos msa-1 y msa-2c contienen epítopes comunes a pesar de las diferencias en las secuencias de nucleótidos en 13 aislamientos de B. bovis y cepas recolectadas en regiones geográficamente distantes de México. Se realizó un análisis bioinformático de la estructura primaria del DNA de los fragmentos derivados de la amplificación por PCR, la clonación y secuenciación de los genes msa-1 y msa-2c de las 13 poblaciones de B. bovis, reveló que el producto de genes msa-1 presentes en las diversas cepas probadas es poco conservado entre los aislados obtenidos en una región geográfica similar en México (51-99.7% identidad de secuencia). Los resultados obtenidos del análisis por inmunoblot de extractos proteicos de B. bovis, que reaccionaron con un anticuerpo monoclonal para el antígeno msa-1 de 42 kDa, mostraron de manera concluyente una reacción cruzada con epítopes comunes

Familia génica Bv. La familia de Bv corresponde a proteínas de las roptrias del merozoito que presentan un polimorfismo limitado dentro de las especies de Babesia; sin embargo, la comparación de las secuencias de las proteínas equivalentes y la organización de los genes sugiere que los miembros de esta familia tienen la posibilidad de adquirir y de tolerar polimorfismos sustanciales en la secuencia de aminoácidos. Se han utilizado sondas polimórficas de DNA para demostrar la heterogeneidad entre aislamientos de Babesia bovis (30-32). Estudios de hibridación de sondas han demostrado que los aislados de B. bovis comprenden subpoblaciones fenotípicamente diferentes y que por procesos de atenuación puede revertir a un fenotipo virulento (30,33-35). Una de las secuencias conservadas entre especies es el gen BvVA1 de Babesia bovis, y ha sido aplicado con éxito para comparar las subpoblaciones de parásitos (36). Lew et al (37) demostraron que el número de alelos BvVA1 detectado refleja el número de subpoblaciones genéticamente distintas; Dalrymple et al (36) sugirieron que este gen es un marcador genético ideal para la discriminación de las cepas, por ser específico y útil para la caracterización

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molecular de los otros parásitos apicomplexa. Los genes de Babesia bovis Bv80 y BvVA1 tienen características similares, y las regiones conservadas se encuentran separadas por conjuntos de secuencias repetidas en tándem, que varían en longitud (36), sin embargo, por su alta variabilidad no es recomendable para realizar estudios de frecuencia en diferentes poblaciones del mundo. Gen del factor de elongación alfa (EF1α). Codifica para una proteína expresada de forma constitutiva de manera abundante y es un elemento clave en la traducción de proteínas eucariotas. Debido a su alto nivel de la transcripción, el promotor EF-1α ha sido utilizado para dirigir la expresión de genes exógenos en células transfectadas. Otras funciones conocidas de EF-1α en las células eucariotas son la proteólisis dependiente de microtúbulos y la ruptura de la ubiquitina. Además, EF-1α es regulador de la apoptosis programada (22). En un estudio realizado por Suárez et al (18) identificaron y caracterizaron el EF-1α de Babesia bovis, y evaluaron la actividad transcripcional de los promotores de esta proteína. En Babesia bovis el EF-1α, contiene dos genes EF-1α idénticos (‘A’ y ‘B’) dispuestos en orientación cara a cara y separados por 1,4 kb intergénicas (IG), región que contiene una repetición terminal de 260 pb de arriba abajo. Los genes EF1α codifican proteínas idénticas con 448 aminoácidos y un peso molecular calculado de 49 kDa. Mientras que la secuencia IG de B. bovis de EF-1α se conserva entre las múltiples cepas de B. bovis; no está significativamente relacionado con ninguna secuencia reportada de las bases de datos de DNA. La región IG promueve la expresión de los dos genes EF-1α. El análisis de las transcripciones por EF-1α confirma que ambos genes EF-1α son transcritos en los merozoitos y son muy conservados en esta especie. Gen de la beta-tubulina. La familia de las tubulinas alfa (α), beta (β) y gamma (γ) son un grupo de proteínas que comparten una identidad entre sus cadenas de aminoácidos de 35-40%,

aunque su similitud con cualquier otra proteína conocida es mínima. Las tubulinas α y β son las subunidades esenciales de los microtúbulos, mientras que la tubulina-γ es un componente fundamental del centrosoma. Los fragmentos N-terminales de las tubulinas α y β están notablemente conservados con variaciones mínimas. La alta tasa de conservación dentro de la familia de las tubulinas implica que las propiedades funcionales de estas proteínas imponen unas limitaciones enormes a cualquier diversificación de la secuencia, de manera que las mutaciones sólo pueden acomodarse en unas pocas posiciones sin producir un efecto deletéreo (38) Caccio et al (38), amplificaron un fragmento del gen de la β-tubulina, para la identificación de las especies patógenas más comunes de Babesia y Theileria. El gen de β-tubulina es uno de los pocos genes apicomplejos que son interrumpidos por uno o varios intrones. Además, la posición de estos intrones se conserva en todas las especies investigadas hasta ahora, lo que permite un diseño fácil de los cebadores en torno a esta región. Por último, los intrones asociados con el gen β-tubulina muestran grandes variaciones tanto en longitud como en secuencia. Estas características hacen de esta región del genoma, un buen candidato para el desarrollo de marcadores informativos, como se ha demostrado previamente para varios parásitos protozoarios. Como se esperaba, mientras que la secuencia de codificación fue muy conservada entre las especies, fue muy poco conservada entre los intrones de las distintas especies (38). En el caso de B. bovis, una comparación de la secuencia genómica parcial obtenida en este trabajo con un DNAc disponible en el GenBank (Q04709) mostró que el intrón supuesto no estaba presente en la secuencia del DNAc (38). Gen de la proteína del cuerpo esférico (SBP) 1-2-3. Ruef et al (39) identificaron una proteína de 135-kDa que contiene una región conservada en las cepas de B. bovis de Texas, México y Australia. La proteína se localiza en los órganos del complejo apical de Babesia y fue designada proteína

Ríos - Principales marcadores utilizados en Babesia bovis y Babesia bigemina

2477

del cuerpo esférico 3 (SBP3). Los estudios de inmunofluorescencia mostraron la unión de anticuerpos monoclonales a la región de membrana de los eritrocitos infectados, pero no a sus homólogos no infectados, lo que demuestra una gran asociación con las proteínas de cuerpo esférico, SBP1 y SBP2, aisladas previamente en B. bovis. Con la identificación de proteínas un tercer cuerpo esférico, que se asocia con la cara citoplasmática de la membrana de los eritrocitos infectados, se ha identificado un complemento de distintas proteínas de B. bovis que pueden contribuir a la supervivencia intracelular, al crecimiento y desarrollo de este parásito. Esta proteína debe ser estudiada en futuras investigaciones por ser una región muy conservada con el objetivo de evaluar los procesos inmunológicos que genera esta infección en el hospedador (28).

bovinas B. bovis y B. bigemina varían dependiendo de la región geográfica de estudio, su grado de conservación y los resultados de estudios previos que concluyen su utilidad diagnóstica. Según los datos obtenidos por la revisión de la literatura los marcadores moleculares más utilizados para la detección de especies de Babesia son la subunidad pequeña del RNAr, región muy conservada entre especies que permite, incluso con técnicas de detección múltiple, diferenciar, caracterizar y secuenciar Babesia bovis y Babesia bigemina, y tiene como ventaja que su nivel de conservación se encuentra distribuido en las cepas de diferentes regiones geográficas, aisladas entre sí. Por lo tanto, se presenta como un marcador molecular ideal para la amplificación del material genético con baja probabilidad de modificación. (22-24, 26)

Gen RAP. Proteínas asociadas a roptrias que proporcionan un buen nivel de detección de las infecciones tempranas y tardías de los bovinos debido a su grado de conservación entre diferentes regiones geográficas. Las comparaciones de secuencias entre genes rap-1 en B. bovis reveló entre el 98 y el 100% de identidad entre todos los aislados portugueses. (GenBank: FJ901342; FJ939723). Por lo tanto, de conformidad con las observaciones anteriores, las secuencias del gen B. bovis rap-1 de aislados portugueses son altamente conservados y similares a los publicados secuencia de B. bovis de la cepa Argentina (R1A, GenBank: AF030055), la cepa de Texas (T2Bo, GenBank AF030059) y la cepa de Australia (S2P, GenBank: AF030056) (40, 41). En cambio, aunque los amplicones de B. bigemina mostraron 100% de identidad de secuencia entre las cepas portuguesas (GenBank: FJ939724), estos tenían un 82% identidad con los publicados en otras regiones (GenBank: S45366) (42). Este estudio mostró la alta conservación del marcador molecular RAP 1 entre cepas de B. bovis pero no para B. bigemina lo que lo hace un marcador específico de especie (21)

El gen Citocromo B fue comparado con la subunidad pequeña del RNAr y, aunque presentó mayor número de copias, sigue predominando la conservación del marcador ribosomal; en este caso, de acuerdo con los objetivos planteados en estudios de amplificación de Babesia sp., se deben definir los criterios de selección para el marcador molecular, de acuerdo con los resultados esperados en la investigación, referidos al grado de conservación de la secuencia (16, 43).

En conclusión, los marcadores moleculares utilizados para la detección de las babesias

En este sentido, uno de los principales criterios para la selección del marcador molecular a emplear para la detección de Babesia sp en bovinos se encuentra referido a su nivel de conservación. De acuerdo con la literatura revisada, tanto para B. bovis como B. bigemina, la amplificación de la subunidad pequeña del RNAr se presenta como el método más adecuado con alto nivel de sensibilidad, y reportes de identidad cercanos al 100%; igualmente el gen Citocromo B, aunque con menos estudios, ha sido reportado con porcentajes de identidad superiores al 90% para ambas especies. (Tabla 2). Otro de los marcadores moleculares más utilizados es el gen Bv, específico de especie que corresponde a proteínas de las roptrias

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Tabla 2. Porcentaje de Identidad de los marcadores moleculares de Babesia sp Referencia Estudio

Marcador molecular

Especie

Origen especie

Comparación

Origen especie comparación

% Identidad

M’ghirbi et al (24)

ssRNAr

B. bovis T. annulata

Túnez

B. bovis (EF643472)

México

96%

B. bovis T. annulata

Túnez

T. annulata (AY524666)

Turquía

100%

B. bigemina (Q785311)

España /Argentina

B. bigemina (59607)

México

100%

B. bigemina (Q785311)

España /Argentina

B. bovis (AY648884)

Suiza

100%

B. bigemina (Q785311)

España /Argentina

B. bovis (AY603402)

China

99.9%

B. bovis (AY150059)

Portugal

B. bovis (L19077)

Sudáfrica

97.3%

B. bovis (DQ287947)

España

B. bovis (AY150059)

Portugal

97.6%

B. bovis (DQ785313)

Argentina

B. bovis (L19078)

Sudáfrica

99.9%

B. bigemina (DQ785312)

España/Argentina Portugal

B.bigemina (AF109354)

USA

100%

B. bovis (DQ785310)

España

B. bovis (AF053002)

México

98.8%

B. bovis (DQ287946)

Argentina

B. bovis (AF053002)

México

98%

B. bovis (AF053002)

México

99.2%

Buling et al (16)

ssRNAr

Citocromo b

B. bovis (DQ785308) Ruef et al (27)

SBP3

B. bovis (AF107117)

Mexico

Theileria parva

México

40-65%

Adham (25)

ssRNA

B. bovis (EF643472)

Tamaulipas

B. bovis (EF601930)

Israel

99%

Luo et al (22)

ssRNA

B. major Yili

China

B. divergens (Z48751)

China

80.2%

B. ovata Lushi

China

B. divergens (U16370)

China

81.9%

B. ovata Zhangjiachuan

China

B. bovis (M87566)

China

62.9%

Babesia sp. Wenchuan

China

B. bovis (L31922)

China

73.3%

B. ovata (AY081192)

China

B.bovis (L19077)

China

80.3%

B. bigemina Kunming

China

B.bovis Shannxian

China

73.3%

B. bigemina (X59604)

China

B. bigemina Kunming

China

99.5%

B.bovis Shannxian

China

B. ovata (AY081192)

China

80.2%

B.bovis (L19077)

China

Babesia sp. Wenchuan

China

80.9%

B. bovis (L31922)

China

B. ovata Zhangjiachuan

China

73.6%

B. bovis (M87566)

China

B. ovata Lushi

China

68%

B.divergens (U16370)

China

B. major Yili

China

91.1%

B. divergens (Z48751)

China

B. bigemina (X59604)

China

89.7%

B. major Yili

China

B. ovata Lushi

China

92.4%

B. major Yili

China

B. ovata Zhangjiachuan

China

92.5%

B. major Yili

China

Babesia sp. Wenchuan

China

92.1%

B. major Yili

China

B. ovata (AY081192)

China

91.4%

ssRNA

2479

Ríos - Principales marcadores utilizados en Babesia bovis y Babesia bigemina

Caccio et al (5)

Borgonio et al (19)

B- Tubulina

msa-2c

B. major Yili

China

B. bigemina Kunming

China

92.5%

B. major Yili

China

B. bigemina (X59604)

China

92.4%

B. major Yili

China

B. bovis Shannxian

China

73.4%

B. major Yili

China

B. bovis (L19077)

China

80.3%

B. major Yili

China

B. bovis (L31922)

China

73.5%

B. major Yili

China

B. bovis (M87566)

China

59.9%

B. major Yili

China

B. divergens U16370

China

91.1%

B. major Yili

China

B. divergens (Z48751)

China

80.2%

Babesia bovis

Nigeria

Babesia bigemina

Ankara

99.9%

B. bovis (EF640942– EF640954)

Jalisco, Nayarit, Tabasco, Veracruz-1, Tamaulipas, Chetumal, México

B. bovis (AF275908)

México

99.7%

B. bovis (AF275909, AF275910)

Argentina

22%–48%

Australia

47%–48%

B. bovis (DQ028735– DQ028757)

México

51%

B. bovis (AF275908)

Argentina

44%–45%

Australia

44%– 81%

B. bovis (AF275909, AF275910)

México

57%

B. bovis (DQ028735– DQ028757)

Argentina

47%–48%

Australia

25%–51%

Guerrero, Tamaulipas-2, Veracruz-2

B. bovis (DQ028735– DQ028757) B. bovis (AF275908)

B. bovis (EF640942– EF640954)

B. bovis (AF275909, AF275910) Chiapas-1

B. bovis (AF275909, AF275910) B. bovis (EF640942– EF640954)

B. bovis (DQ028735– DQ028757 B. bovis (AF275908) Veracruz-2

B. bovis (EF640942– EF640954)

del merozoito, y presenta un polimorfismo limitado dentro de las especies de Babesia, lo cual sugiere que los miembros de esta familia tienen la posibilidad de adquirir y de tolerar polimorfismos sustanciales en la secuencia de aminoácidos; en consecuencia, sus posibles modificaciones puedan alterar potencialmente

México

54%

Argentina

50%–51%

Australia

23%–49%

los resultados de las amplificaciones en diferentes regiones geográficas con cepas diferentes. Estudios previos realizados con este gen en cepas australianas, evidencian la posibilidad de explorar su uso como marcador molecular ideal específico de cepas circulantes en una región específica de Latinoamérica (44).

2480

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

El gen RAP muestra ser muy conservado en la especie B. bovis pero no en B. bigemina; lo que lo hace un marcador específico en estudios que sólo busquen amplificar esta especie (3, 21) Por otra parte, genes como la Beta tubulina, los msa, SBP, el factor de elongación 1alfa; requieren más estudios para hacer una comparación y selección de estas secuencias como marcadores, ya que aunque demuestran ser muy conservadas, no es posible inferir su comportamiento a lo largo del mundo, por falta de reportes que generen conclusiones para sugerir utilizarlos como marcadores moleculares. (5, 10, 18-20, 27, 28) Es importante recalcar que la información acerca de los marcadores moleculares no sólo es de interés para estudios epizootiológicos en lo relacionado con el desarrollo de métodos de detección con altos niveles de sensibilidad; dos aspectos adicionales se hacen relevantes sobre los posibles usos de esta información. En primer lugar, está el carácter inmunogénico de los marcadores descritos, de los cuales se concluye que mientras mayor sea la identidad presente entre los marcadores de los mismos aislados, y entre diferentes regiones geográficas, habrá mayor potencial inmunogénico; algunos ejemplos de esta utilidad los encontramos en el marcador msa-2c, sobre el cual algunos estudios evidencian la presencia de epítopes comunes que permiten suponer un alto potencial para el desarrollo de vacunas (19, 20), igual potencial se ha referido al marcador RAP-1 (21); en el caso de los genes que codifican las proteínas SBP1, SBP2, SBP3, estos sólo han sido detectados en B. bovis, lo cual evidencia que esta familia de genes posee un alto potencial para diagnóstico de esta especie, pero al mismo tiempo, dicha característica la convierte en un potencial candidato para el desarrollo de vacunas

específicas de especie en diversas regiones geográficas (28); así como ocurre con la proteína SBP3, la cual se ha asociado con la supervivencia intracelular y el crecimiento y desarrollo del parásito, y por lo tanto, se convierte en un blanco potencial para investigaciones sobre la inmunidad del hospedador y su uso como vacuna. (27) El segundo aspecto relevante se refiere a la posibilidad de discriminar cepas vacunales de cepas circulantes utilizando marcadores altamente conservados; estudios realizados con los genes Bv80 y BvVA1 se sugiere su utilización en pruebas de PCR para la certificación de la identidad de los parásitos en procesos de vacunación para B. bovis con parásitos vivos atenuados, de forma que permitan diferenciar cepas vacunales de cepas de campo. (1, 2). En este mismo sentido, los estudios sobre el marcador ssrRNA proponen que la sensibilidad de su amplificación facilita el análisis de vacunas y su capacidad para inducir o evitar el estado de portador; además, su detección puede ser utilizada para probar la eficacia de medicamentos contra el parásito y realizar estudios sobre la transmisión (25). Estudios sobre este mismo marcador como el de Salih et al (23) sugieren la necesidad de realizar futuras investigaciones que se centren en la caracterización de aislados de campo de diferentes áreas en una región geográfica determinada, utilizando cepas mantenidas tanto in vitro como in vivo para caracterizar su nivel de inmunogenicidad y determinar de esta manera su uso en la inmunización contra la babesiosis bovina, teniendo en cuenta el grado de conservación del marcador.

Agradecimientos Universidad de Antioquia, Escuela de Microbiología y grupo de investigación en Microbiología Veterinaria por su apoyo logístico y académico.

RĂos - Principales marcadores utilizados en Babesia bovis y Babesia bigemina

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Rev.MVZ CórdobaREVISTA 16(2):2484-2490, 2011. • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 2484 MVZ CÓRDOBA

ORIGINAL

Neospora caninum infection in beef cattle reared under grazing conditions in north-central Mexico Infección por Neospora caninum en ganado de carne mantenido en condiciones de pastoreo en el centro-norte de México Karina Mondragón-Zavala,1 M.Sc, Carlos Cruz-Vázquez,1* Ph.D, Leticia Medina-Esparza,1 Ph.D, Miguel Ramos-Parra,1 M.Sc, Zeferino García-Vázquez,2 Ph.D. Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes. Aguascalientes, México. 2Centro Nacional de Parasitología Veterinaria, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Jiutepec, Morelos, México. *Corresponding: cruva18@yahoo.com.mx 1

Recibido: Agosto de 2010; Aceptado: Febrero de 2011

ABSTRACT Objetive. To determine the seroprevalence of N. caninum antibodies and prevalence of parasite DNA in blood, and estimate the association between seroprevalence and the potential risk of some factors in beef cattle under grazing conditions in north-central Mexico. Materials and methods. Blood samples from 139 cows and only 10 bulls belonging to 13 farms were collected and evaluated by ELISA test to detect antibodies against N. caninum. Furthermore, to determine the presence of parasite DNA, nested PCR probe was performed on blood samples. Association between potential risk factors and seroprevalence was estimated. Results. Overall seroprevalence was 23% (35/149 samples), while the prevalence of parasite DNA in blood was 28% (42/149 samples). Of the 149 animals examined 28 (19%) were positive to both tests (25 cows and 3 bulls). Concordance between tests was k = 0.63. All herds had seropositive animals with positive parasite DNA detection in blood. The only risk factor identified was the presence of dogs (OR= 2.65). Conclusions. This study showed that bovine neospososis should be considered as an important infectious disease in north-central Mexico herds. Therefore, an epidemiological control should be taken into consideration to avoid the negative effect of this disease on mexican beef industry. Key words: Bovines, DNA, prevalence, seroprevalence, PCR. (Sources: AIMS,CAB).

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Mondragón-Zavala - Neospora caninum infection in beef cattle

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RESUMEN Objetivo. Determinar la seroprevalencia de anticuerpos contra N. caninum y la prevalencia de ADN del parásito en sangre y estimar la asociación entre la seroprevalencia y algunos potenciales factores de riesgo de ganado de carne mantenido bajo condiciones de pastoreo en el centro– norte de México. Materiales y métodos. Se seleccionaron trece hatos ganaderos, en los cuales se recolectaron muestras de suero sanguíneo de 139 vacas y de solo 10 sementales, que fueron evaluados mediante la prueba de ELISA para detectar anticuerpos contra N. caninum. Por otra parte, se realizó una prueba de PCR anidado en muestras de sangre para determinar la presencia de ADN del parásito. Se estimó la asociación entre la seroprevalencia y algunos potenciales factores de riesgo. Resultados. La seroprevalencia general fue de 23%, mientras que la prevalencia a la presencia de ADN del parásito en sangre fue de 28%. Veintiocho muestras de 149 fueron positivas en ambas pruebas, mientras que 3/10 sementales fueron positivos en las dos pruebas. La concordancia entre las pruebas fue k=0.63. Todos los hatos tuvieron animales seropositivos y con presencia de ADN del parásito en sangre. El único factor de riesgo identificado fue la presencia de perros (OR=2.65). Conclusiones. La infección por N. caninum determinada en este estudio es importante, y deberá de ser más documentada; del mismo modo, algunas medidas de control deberán de considerarse para limitar sus efectos negativos en la industria mexicana de la carne. Palabras clave: ADN, bovinos, PCR, prevalencia, seroprevalencia (Fuentes: AIMS, CAB).

INTRODUCTION Bovine neosporosis is a parasitic disease caused by Neospora caninum (Apicomplexa, Sarcocystidae), a protozoan that affects a great variety of domestic and wild animals, and is currently considered as one of the main causes of abortion worldwide (1). In bovine neosporosis epidemiology, transmission mechanisms are diverse, this factor, undoubtedly contributes to the high presence of the parasite in cattle populations. Dogs and coyotes (2) have been described as definitive hosts of N. caninum, and they appear as main factors in the horizontal transmission by excreting oocysts in the feces that contaminate the drinking water and feed. However, there is not doubt that vertical transmission is the main route to maintain the infection in cattle. It has been reported that calves are infected through placenta by chronically infected mothers; however, this is highly efficient allowing the birth of infected but clinically healthy offspring (1,2). Although there is information about the presence of N. caninum in mexican in dairy cattle (3-5), but data about the presence of this disease in beef cattle raised under grazing conditions is scarce.

The objective of this study was to determine the seroprevalence of N. caninum antibodies and prevalence of parasite DNA in blood, and estimate association between seroprevalence and the potential risk of some factors in beef cattle farms under grazing conditions in north-central Mexico.

MATERIALS AND METHODS Study site. This study was carried out in the State of Aguascalientes, Mexico, which is located in the north-central part of the country, at 1.885 m above sea level, with an average temperature of 16.9°C, and 475 mm annual rainfall which occurs during summer. This part of the country is semiarid presenting warm conditions with wide range of temperature variation. Situation of the farms and animals. A total of 13 beef small cattle farms, with an average herd size of 50 cows and 1 bull per farm from different areas of the State were selected. At the time of this study, farmers raised crossbred (in different proportions) cows (Bos taurus and Bos indicus). Cows were kept, under grazing conditions and together with bulls along the year (mainly

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Simmental, Charolais and Brown Swiss races), for breeding purposes. No data on gestation status was available and no abortions were notified to be detected in the last 6 months. Blood samples were obtained at random from 139 cows (>2 years old) and from only 10 bulls from each farm selected.

in a cabinet under UV light, with new sterile materials and each sample was tested in replicated test. Positive results were those that showed a product with 146 base pairs.

Blood sampling. Blood was obtained from each animal by puncture of the caudal vein and divided into two vacutainer tubes: 1) sample with anticoagulant (EDTA) and 2) sample without EDTA. Samples with anticoagulant were frozen at -20°C and samples without anticoagulant were centrifuged (1000g/15 min) and the sera obtained were stored at -20°C until used.

Management practices on farms. A survey was as carried out to each farmer with the purpose to establish the status of each farm, related to health and farmmanagement conditions. The specific question were related to breeding (use of bulls and/or artificial insemination), presence of other domestic animals in the farm, frequency of abortions, fate of disposable, presence of dogs and/or coyotes in the farm, type of cattle-grazing prairies, use of supplemental feed and sources of drinking water.

Serologic test. Serum samples were tested using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), to determine N. caninum specific IgG which using the Herd Check anti N. caninum commercial kit (IDEXX Laboratories, Westbrook, USA), with 100% sensitivity and 98.9% specificity, according to the manufacturer procedures. To detect positive and negative sera, the test was carried out in paired runs using only one serum dilution (1:100). The cut of value was set at 0.50, considering as positive serum sample that had a mean reading greater than 0.50 (6,7).

Data analyses. Disease seroprevalence, as well as prevalence of parasite DNA in blood were determined and arrange by farm and sex; also animals positive to both tests were identified. Kappa index was calculated to determine concordance between results obtained with both tests (p<0.05). Association between seroprevalence and the factors recorded in the questionnaire was estimated calculating the Odds Ratio (OR) where values above 1 indicated association. The test was corroborated by χ2 test using Yates correction (p<0.05). All tests were done using the EpiInfo software.

PCR probes. Deoxyribonucleic acid (DNA) was extracted from blood samples using the Ultraclean DNA BloodSpin commercial kit (MOBIO Laboratories, Carlsbad, USA) following the manufacturer’s instructions, in aseptic conditions. DNA samples were subjected to single tube nested Polymerase Chain Reaction (PCR) probe, with the primers NF1, NS2, NR1 and SR1, using positive and negative controls (5). For PCR assays, DNA concentration in each sample was verified by UV light spectrophotometer and 5 µl of the sample containing 2 µg of DNA, were used in PCR assays. Amplification products were run in 2.5% agarose gels, with a molecular weight marker (Phix 174 DNA, Promega, Madison, USA) in order to estimate product size; gels were stained with ethidium bromide and visualized by UV light lamp. All procedures were carried out

RESULTS Overall seroprevalence of N. caninum was 23% (35/149); range: 9 to 54%; 95% confidence Interval (C.I.) (17-31). Prevalence of parasite DNA in blood was 28% (42/149; range: 9 to 63%; 95% (C.I. 21-36). (Table 1). All farms studied were found to have positive animals to one or the other test or both. Seroprevalence in cows was 23% (32/139; 95% C.I. 16-31), and in bulls 30% (3/10; 95% C.I. 0.8-64), while prevalence of parasite DNA in blood was 28% (39/139; 95% C.I. 20-36) in cows and 30% (3/10; 95% C.I. 0.8-64) in bulls. Twenty eight animals were positive to

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Table 1. Seroprevalence of N. caninum antibodies and prevalence of N. caninum DNA in blood in thirteen small farms with beef cattle raised under grazing conditions Farm

N° animals examined

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

11 11 11 5 11 9 18 18 12 13 11 12 7

ELISA positive n

(%)

1 2 1 1 1 1 2 5 3 6 6 4 2

9 18 9 20 9 11 11 28 25 46 54 33 28

both tests, corresponding to 25 cows and 3 bulls, representing 19% (28/149) of the animals studied. There were 7 positive animals by ELISA and 14 positive animals by PCR. Concordance between ELISA and PCR was k = 0.63 (95% C.I. 47 – 79). The presence of dogs was associated with seroprevalence (OR 2.65; C.I. 95% 1.146.25; p<0.05). However, it could not be found an association with seroprevalence among farms that presented similar health and farm-management conditions.

DISCUSSION In different regions of the world the seroprevalence has been found higher in dairy cattle than in beef cattle, mainly attributed to existing differences in management practices (1). In the present study, it was found a higher seroprevalence, more than double of the reported in beef cattle in Mexico (8,9), but lower than observed in dairy cattle (4,10,11). This results clearly show that animals not only have been exposed to N. caninum infection, as evidenced by the presence of antibodies detected through ELISA assay, but also have a high proportion of active infections supported by parasite DNA detection in blood circulation, therefore real prevalence could be underestimated.

C.I.95% 0.4-42 3-52 3-52 1-70 1-70 0.5-49 2-36 11-54 7-57 20-74 24-51 11-64 5-69

DNA positive n

(%)

1 2 1 1 4 2 4 6 3 5 7 4 2

9 18 9 20 36 22 22 33 25 38 63 33 28

C.I. 95% 0.4-42 3-52 3-52 1-70 12-68 4-59 7-48 14-58 7-57 15-67 31-88 11-64 5-69

This situation also may interfere with the identification of potential infection risk factors. In seropositive animals the parasite DNA detection in blood appears during all gestation, although not of constant form, nevertheless these animals have seropositive offspring and eventually they might abort (12,13). Some studies have reported that seronegative animals, with antibodies level undetectable by the diagnostic test, may be infected and have seropositive offspring (14-16); while another study reported that N. caninum DNA may be identified in heifers’ brains without detecting the parasite in blood however their offspring are born infected (12). Recent study found seronegative animals in which were possible detect N. caninum in the brain tissue by PCR probe (17). Results from this study allow us to conclude that seronegative animals indeed have N. caninum DNA present in their blood and surely are capable of vertical infection transmission or have abortions as the seropositive/positive to DNA detection in blood animals. It is highly likely that some of these animals were probably in the early phases of the infection and therefore diagnostic use of the PCR test may be an aid in the opportune detection of this status with all the epidemiological implications that these results may have. In this study, 3 bulls came out seropositive

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and with parasite DNA presence in blood, with a possibility of N. caninum transmission by excretion of viable organisms in semen as has been previously reported (18,19). Currently, there is not much information on what happens in naturally infected bulls, even though the low excretion of tachyzoites in semen as detected in experimental infections hints at a limited possibility for these infections (20), so, further studies in this matter are essential.

infection risk factor. Also all the owners indicated that coyotes are frequently seen on the prairies. In this study, dogs and cows were found to share the same areas and sources of drinking water. Also, there was a possible consumption of fetuses and placental waste by dogs. It becomes also important, the needs to be taken into account the presence of coyotes, in order to understand the observed seroprevalence of this parasite.

The high prevalence found in this study may be only explained by the simultaneous presence of the two transmission routes known for this parasite infection, due to the fact that if vertical transmission were predominant, prevalence would have to be less. Prevalence increases when animals are infected horizontally, as it has already been reported for dairy cattle; dogs and coyotes which have a very important role in horizontal transmission (1). Nevertheless, it has been suggested that this situation is most favored by the coexistence of dogs and cows than by feeding in the same places (21). Most of the farms, raised had dogs, and they were identified as an

The seroprevalence in dogs that reside in dairy farms has been reported to be 41% (22). Evidence, that dogs represent an infection risk has not been found in studies carried out in beef cattle in Mexico (8). Similar results have been reported for other regions of the world, where dogs do not live in close contact with cattle. (23-25). In conclusion, infection by N. caninum in beef cattle belonging to small farms and raised under grazing conditions should be more fully documented. There is not doubt, that an epidemiological control of this disease is necessary to avoid its negative effect on Mexican beef industry.

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Mondragón-Zavala - Neospora caninum infection in beef cattle

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

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Rev.MVZ Córdoba 16(2):2491-2498, 2011.

ORIGINAL

Genetic diversity of six populations of red hybrid tilapia, using microsatellites genetic markers Diversidad genética en seis poblaciones de tilapia roja, usando microsatelites como marcadores genéticos Boris Briñez R,1,2* M.Sc, Xenia Caraballo O,1 M.Sc, Marcela Salazar V,1 MD. Centro de Investigaciones para la Acuacultura de Colombia (Ceniacua), Cra 9 C No. 114 – 60, Bogotá, Colombia. 2State University of Campinas – UNICAMP, Department of Genetics, Evolution and Bioagents. Institute of Biology, Brazil. *Correspondencia:borisbrinez@hotmail.com 1

Recibido: Junio de 2010; Aceptado: Febrero de 2011.

ABSTRACT Objective. To determine and evaluate the genetic diversity of six populations of red hybrid tilapia, with the purpose to assess the potential benefit of a future breeding program conducted at the Research Center for Aquaculture (Ceniacua), Colombia. Material and methods. A total of 300 individuals, representing a wide genetic variability, were genotyped using a fluorescent microsatellite marker set of 5 gene-based SSRs in 6 different farms belonging to 4 States of Colombia. Results. The result showed that the mean number of alleles per locus per population was 8.367. The population 5 had the highest mean number of alleles with 9.6 alleles, followed by population 4 with 9.4 alleles, population 2 with 9.2, population 3 with 8.0, population 1 with 7.2 and population 6 with 6.8 alleles. The analysis of the distribution of genetic variation was (17.32%) among population, while among individuals within populations was (28.55%) and within individuals was high (54.12%). The standard diversity indices showed that population 4 was the more variable (mean He=0.837) followed by population 1 (mean He=0.728), population 3 (mean He=0.721), population 5 (mean He=0.705), population 2 (mean He=0.690), population 6 (mean He=0.586). Highly significant deviations from Hardy–Weinberg, exhibited all of the populations, mostly due to deficits of heterozygotes. Genotype frequencies at loci UNH 106 of population 5 and loci UNH 172 of population 6 were Hardy-Weinberg equilibrium (HWE). Conclusions. The results of this study, contribute to the genetic breeding program of Tilapia, conduced by the Research Center for Aquaculture. The Fst distance showed that the samples are differentiated genetically and it is possible to use at the beginning of the genetic program. However, it is recommended to introduce others individuals to the crossbreeding program. Key words: Breeding programmes, fishes, genetic diversity. (Sources: AIMS, CAB).

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RESUMEN Objetivo. Determinar y evaluar la diversidad genética de seis poblaciones de tilapia roja híbrida, con el propósito de evaluar el potencial beneficio de un futuro programa de mejoramiento adelantado en el Centro de Investigación para la Acuicultura (CENIACUA), Colombia. Materiales y métodos. Fueron genotipados un total de 300 individuos utilizando un grupo de 5 microsatélites fluorescentes. Las muestras se tomaron en 6 fincas diferentes en 4 departamentos de Colombia, representando una amplia variabilidad genética. Resultados. El número medio de alelos por locus por población fue de 8.367. La población 5 tuvo el número más alto de alelos por locus: 9.6, seguida de la población 4 con 9.4, población 2 con 9.2, población 3 con 8.0, población 1 con 7.2 y población 6 con 6,8 alelos. Los análisis de distribución de la variación genética fueron de (17.32%) entre las poblaciones mientras que dentro de las poblaciones fue de (28.55%), y entre los individuos fue de (54.12%). Los índices de diversidad estándar mostraron que la población 4 fue la más variable (media He=0.837) seguida de la población 1 (media He=0.728), población 3 (media He=0.721), población 5 (media He=0.705), población 2 (media He=0.690) y población 6 (media He=0.586). Todas las poblaciones mostraron desviaciones significativas de equilibrio de Hardy–Weinberg, debido principalmente a la falta de heterocigotos. Las frecuencias genotípicas de los locis UNH 106 de la población 5 y loci UNH 172 de la población 6 estuvieron en equilibrio de Hardy-Weinberg. Conclusiones. La distancia Fst evidenció que las muestras estan diferenciadas geneticamente y es posible usar esas poblaciones para el programa de mejorameinto genético, sin embargo, es recomendable introducir otros individuos. Palabras clave: Diversidad genética, peces, programas de mejoramiento (Fuentes: AIMS, CAB).

INTRODUCTION Cichlids are an emerging model system for studying a broad range of questions at the interface of organismal biology and genomics (1). Tilapias (Oreochromis spp.) are cichlid fishes, which have become one of the most important species in global aquaculture. Native to Africa, several species of tilapia have been introduced to tropical areas of Asia and the Americas to increase supplies of animal protein. World aquaculture production of tilapia is second only to carp, and now exceeds 1.5 million tons per year (2). Long time ago a tilapia was considered a fish of low value but in the last years, it reaches up the acceptation among consumers and now is one of the most species-rich families. Aquaculture practices may inadvertently decrease the genetic variability present in farmed stocks by breeding among related individuals or by the use of small numbers of founding broodstock. Selective breeding programs can also lead to decreased diversity when they utilize only a small

number of “superior” families that may be related or use a mass selection approach with high selection intensities (3). Unless pedigree records are maintained, there is often a probability of selecting related individuals as parents for constructing the next generation and thereby increasing inbreeding (4). Conversely, breeding programs may deliberately introduce divergent stocks and utilize crossbreeding programs to increase diversity and productivity (5). However, the extent of stock mixing, the relative survival of the different stocks and the extent to which they are disseminated are important issues that frequently need to be addressed for effective management of aquaculture species (6). There is also often a need to evaluate the status of wild stocks in aquaculture species as escapes of aquaculture stocks are common and these fish can have negative effects on resident indigenous forms (7). Molecular markers have been used to assist breeding programs in many ways. These studies, based on the structure of genetic

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Briñez - Genetic diversity of six populations of red hybrid tilapia

diversity are important and efficient to discovery of genes involved in phenotypes of interest. Microsatellites, or simple sequence repeats (SSRs), represent a unique type of tandemly repeated genomic sequences, which are abundantly distributed across genomes and demonstrate high levels of allele polymorphism. They are codominant markers of relatively small size, which can be easily amplified with the polymerase chain reaction. These features provide the foundation for their successful application in a wide range of fundamental and applied fields of biology and medicine, including forensics, molecular epidemiology, parasitology, population and conservation genetics, genetic mapping and genetic dissection of complex traits. In the field of fisheries and aquaculture, microsatellites are useful for the characterization of genetic stocks, broodstock selection, constructing dense linkage maps, mapping economically important quantitative traits and identifying genes responsible for these traits and application in marker assisted breeding programmes (8). In Colombia, given the great potential of Tilapia in terms of global demand and commercial market and the fact that shrimp farming has been affected by lethal diseases, the Research Center for Aquaculture of Colombia (CENIACUA) has implemented the use of intensive shrimp farming systems for growing Tilapia (9). The Center has demonstrated the usefulness of the technology and the necessity of studies in genetic diversity that assist the efficiency of the breeding programs. The objective of this study was to determine and evaluate the genetic diversity of six populations of red hybrid tilapia (Oreochromismossambicus X O. niloticus), that were differentiated genetically in the process of adaptation to different farm environments. This study was conducted the Research Center for Aquaculture (Ceniacua), Colombia, using Five microsatellite and 50 samples per strain. with the purpose to assess the potential benefit of a future breeding program using these populations.

MATERIALS AND METHODS Sample collection and storage. A total of 300 samples were collected in six different locations of four States in Colombia (Huila, Risaralda, Valle del Cauca and Meta). An aliquot of tissue was placed into an eppendorf pipette with 99% ethanol and then carried to the molecular biology laboratory for DNA extraction and microsatellites analyses. DNA extraction. An amount of 30 mg of tissue was cut from each sample and DNA was extracted using a modified protocol of Chomczynski and Sacchi (10). In brief, preserved tissue was wash in TE 1X buffer (10 mMTris pH 8.0, 10 mM EDTA) 5 minutes at 14.000 rpm. Then the samples were cut and incubated with 500 μl of guanidine isothiocyanate for 30 minutes at 60°C. Subsequently, a volume of isopropanol was added and centrifugated for 15 minutes at 14.000 rpm. To wash the DNA, a volume of ethanol 70% to the upper layer was added and the sample was centrifugated for 5 minutes at 13.000 rpm. The DNA pellet was then air-dried, resuspended in 100 μl of TE and stored at –20°C until used. Microsatellites selection. Five microsatellites were selected (UNH 106, UNH 222, UNH 172, UNH123, and UNH216) (Table 1), based on the level of heretozygosity and the good amplification obtained. Table 1. Characteristics of microsatellite loci used in this study. Locus

UNH 106

UNH 222

UNH 172

UNH 123

UNH216

Primer Sequence f-CCTTCAGCATCCGTATAT r-GTCTCTTTCTCTCTGTCACAAG f-CTCTAGCACACGTGCAT r-TAACAGGTGGGAACTCA f-AATGCCTTTAAATGCCTTCA r-CTTTTATAGTCGCCCTTTGTTA f-CATCATCACAGACAGATTAGA r-GATTGAGATTTCATTCAAG f-GGGAAACTAAAGCTGAAATA r-TGCAAGGAATATCAGCA

Annealing Temp (°C)

Size (pb)

Accesion

130-240

G12259

122-209

G12373

119-194

G12324

145-208

G12276

116-154

G12367

Polymerase chain reaction and electrophoresis. The polymerase chain reaction (PCR) was performed in a 20 μl reaction volume with a final concentration of

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200 μM each dNTPs, 2.5 mM MgCl2, 0.5 μM of each primer loaded with Cy5, about 10– 100 ng of template DNA, 1 X Taq buffer and 1.25 units of Taq polymerase. PCR cycling conditions were as follows: 4 min at 94°C, 35 cycles of 20 s at annealing temperature (45–55°C) (Table 1), and 20 s at 72°C, followed by a final elongation step of 4 min at 72°C. PCR products were separated on a 6% denaturing polyacrylamide gel using an ALFwin sequence analyzer 2000 (Amersham Biosciences) following manufacturer’s instructions and the bands were analyzed using the software AlleleLocator 1.03 (Amersham Pharmacia Biotech AB). Genetic diversity analysis. Changes in genetic variation of the populations were evaluated by estimating, expected heterozygosity (He) number of alleles, conformation of Hardy Weingberg, linkage disequilibrium Fst, the F statistics for the hierarchy of individuals within the species (Fit) and populations (Fis) were estimated using the program POPGENE Version 1.32 (11). Analysis of molecular variance (AMOVA) was used to partition the total genetic variance into components due to differences between populations, among individuals within populations, and among individuals within each stock. That was calculated using the software Arlequin 3.1 (12). Neighbor joing phylogenetic tree were constructed based on Fst and corrected average pairwise difference distance matrices using the program Mega 4.0 (13) (Figure 1). The distributions of the samples were observed plotting the likelihood of individual genotypes in all populations (Figure 2) using the software Statistic 7.1 (14).

RESULTS All five microsatellite loci were polymorphic, with UNH123 as the most variable locus with 16 alleles, and the less variable UNH 106 and UNH 172 with 4 alleles respectively. Allele sizes ranged from 130 to 240 bp for UNH106, 122 to 209 bp for UNH222, 119-

194 bp for UNH 172, 145 to 208 bp for UNH 123 and 116 to 154 bp for UNH 216 (Table 1). The mean number of alleles per locus per population was 8.367. The population 5 had the highest mean number of alleles with 9.6 alleles, followed by population 4 with 9.4 alleles, population 2 with 9.2, population 3 with 8.0, population 1 with 7.2 and population 6 with 6.8 alleles. The analysis of the distribution of genetic variation indicated among population variation was very low (17.32%), while among individuals within populations was (28.55%) and within individuals was high (54.12%) (Table 2). Table 2. AMOVA analysis of variance of Tilapia populations Source of variation

d.f.

Sum of squares

Among populations

Among individuals within populations

287

Within individuals Total

Variance components

Percentage of variation

193.269

0.37139 Va

17.32

684.419

0.61216 Vb

28.55

293

340.000

1.16041 Vc

54.12

585

1.217.688

214.396

The standard diversity indices showed that population 4 was the most variable (mean He=0.837) followed by population 1 (mean He=0.728), population 3 (He=0.721), population 5 (mean He=0.705), population 2 (mean He=0.690), population 6 (mean He=0.586). Highly significant deviations from Hardy– Weinberg, exhibited all of the populations, mostly due to deficits of heterozygotes. Genotype frequencies at loci UNH 106 of population 5 and loci UNH 172 of population 6 were Hardy-Weinberg equilibrium (HWE). The molecular diversity indices showed that population 4 had the highest average gene diversity over loci (0.837 +- 0.464), followed by population 1 (0.723 +- 0.409), population 3 (0.721 +- 0.408), population 5 (0.694 +- 0.395), population 2 (0.673 +0.385), population 6 (0.586 +- 0.343). The population 4 had the highest correlation of the alleles on the gametes (Theta) (5.164) followed by population 1 (2.678), population 3 (2.593), population 5 (2.394),

BriĂąez - Genetic diversity of six populations of red hybrid tilapia

population 2 (2.229), population 6 (1.415). The Wrightâ&#x20AC;&#x2122;s F statistics showed the highest fixation indices Fit and Fis, which illustrated their deficits of heterozygotes (Fis=0.34535 and Fit=0.45875).

2495

The dispersion graph showed that the samples from population 2 from Valle del Cauca State, Alevinos del Valle Hatchery are concentrated in one group and the others samples form another group (Figure 2).

Genetic differentiation between populations was analyzed using FST pairwise differences. All estimates of pair wise FST were significant (p<0.05). The largest genetic differentiation between populations, using FST pairwise differences, was between the cultured populations 2 (Alevinosdel Valle Hatchery in the Valle del Cauca) and population 6 (PiscicolaPiedraPintada Hatchery lacated at the Huila state) (Table 3). Table 3. The pairwise Fst distance of the 6 populations of red hybrid Tilapia analysed. Population

0.000

0.195

0.000

0.132

0.192

0.000

0.105

0.138

0.124

0.000

0.160

0.205

0.221

0.153

0.000

0.221

0.239

0.229

0.171

0.157

0.000

The neighbor joing phylogenetic trees were constructed using Fst genetic distance matrix. The Risaralda and Valle samples formed one group, the populations of Meta formed other group, while the populations from huila were clustered into another one (Figure 1).

Figure 2. Dispersion graph of main coordinated species of populations. population 1=Risaralda (Piscicola Rio Nilo Hatchery); population 2=Valle del Cauca (Alevinos del Valle Hatchery); population 3=Meta (Langostinos del Rio Hatchery); population 4=Meta (Piscicola Primavera Hatchery); population 5=Huila (Piscicola El Triunfo Hatchery); population 6=Huila (Piscicola Piedra Pintada Hatchery).

This could be explained by the geographic localization and the fact that the other samples have more genetic diversity and possibly more selection pressure.

DISCUSSION Microsatellites are highly variable nuclear genetic markers, which are inherited codominantly in a Mendelian fashion (15).

Figure 1. Neighbor Joing phylogenetic tree constructed using Fst genetic distance matrix. Population1=Risaralda (Piscicola Rio Nilo Hatchery); population2=Valle del Cauca (Alevinos del Valle Hatchery); population3=Meta (Langostinos del Rio Hatchery); population4=Meta (Piscicola Primavera Hatchery); population5=Huila (Piscicola El Triunfo Hatchery); population6=Huila (Piscicola Piedra Pintada Hatchery).

Microsatellites have been found suitable for a variety of applications in fisheries and aquaculture research, particularly where genetic differentiation within and between populations may be limited. Potential applications in aquaculture include monitoring changes in genetic variation as a consequence of different breeding strategies, the investigation of interactions between wild and cultured populations, parentage assignment and estimation of relatedness between potential breeding pairs (4,7,15-17).

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Genetic diversity is important to cultured populations because it provides the necessary spectrum of genotypes for adaptive response to changing conditions and heterozygous individuals usually are superior to less heterozygous individuals in many economically important characteristics like growth, fertility and disease resistance (18). The original red tilapias were bred in separate instances in Taiwan, Israel, and Florida by crossing mutant-colored O. mossambicus with either the Nile (O. niloticus), blue (O.aureus) or Zanzibar tilapia (O. urolepishornorum) (19). Like the Nile tilapia, the red tilapia hybrids have been propagated in Asia, and are now widely cultured in Central and South America. The red tilapia hybrids are colored either gray, albino, pink, red-orange and dark-blotched. In most cases, the characteristics of red tilapias were morphometrically intermediate (in terms of snout shape, mouth width, head length to standard length ratio, mouth width to head width ratio, and peduncle length to peduncle depth ratio) between the species used in the hybrid crosses (20). The red-orange hue of the red tilapia comes from the O. mossambicus parent, where the red coloration is inherited as a simple Mendelian recessive (21). Hence, because of (a) the use of relatively few and possibly bottlenecked mutant-colored female founder stocks in the original hybrid crosses, and; (b) the propagation of stocks through several generations using the redorange hybrid progenies as parents for subsequent crosses, genetic variability of the red tilapia hybrids is not as high as expected and the stocks have become less divergent (22). The results obtained in this study, for mean expected heterozygosities ranging from 0.587 to 0.837 agreed with those obtained for Rowena et al (22) who found values ranging from 0.567 to 0.715. That indicated that variability of the red

tilapia is low. Rowena et al (22) showed the same results for mtDNA-RFLP analysis where the five red tilapia stocks were also noted to be less variable. These results may be counterintuitive in that interspecific hybrids such as the red tilapias might be presumed to be more variable and divergent from each other than the Nile tilapias, having been produced by crossing entirely different species. The values of Ho showed significant differences with He. That frequently happens in cultured populations (22, 23). The Fis and Fit values represent a measured of genetic frequencies in relation to panmitic frequencies expressed in excess or deficiency of heterozygotes and can be interpreted as endogamy coefficient (f). The results show inbreeding in all the population due to an excess of homozygosis. Looses in genetic variability is hope because of the characteristics of reproduction, the origin of strains and the genetic improvement management. Melo et al (24) worked with commercial hatcheries and found 39 alleles in 5 loci. Rutten et al (23) studied 4 strains of Nile Tilapia and obtained a range of 5 to 7,5 alleles by locus. Rowena et al (22) found a variation of 4.8 to 10 alleles by locus. In this study, was obtained a mean of 6.33 to 11.66 alleles by locus. The AMOVA represent high percentage of molecular variation due to with individuals (54.12%) and less percentage between populations (17.32%). Melo et al (23) found low variability with individuals. It could be associated with imbalance proportion of males and females used to reproduction. Rowena et al (22) found low genetic differentiation among populations of Nile tilapia. The results of this work demonstrated that the microsatellites technique is a powerful tool to evaluated commercial fish populations. These data will allow to take decisions on facts about the reproductive management and the intensity of the selection, with the purpose to maintain low level of inbreeding.

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Rev.MVZ Córdoba 16(2):2499-2506, 2011.

ORIGINAL

Effect of age and coasting period on oocytes quality and their in vitro development from prepubertal cattle Efecto de la edad y la hora de la aspiración sobre la calidad oocitaria y el desarrollo in vitro en hembras bovinas prepúberes Sandra Bernal U,

MVZ. Ángela Gonella D,1* MVZ. Diego Valbuena,2 MV. Rubén Mendoza, 2 MV. Juan Molina,3 M.Sc. Liliana Chacón J, 4 Ph.D.

Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales UDCA, Facultad Ciencias Agrarias. Bogotá, Colombia. 2Central de procesamiento de semen y núcleo de mejoramiento Genético “Las Camelias”. Puerto Araujo, Colombia. 3Intervet International B.V. 4Universidad de La Salle, Facultad de Medicina Veterinaria. Bogotá, Colombia. *Correspondencia: angelamvz@gmail.com 1

Recibido:Junio de 2010; Aceptado: Febrero de 2011

ABSTRACT Objective. This study evaluated the effect of age and coasting period over oocyte quality and their posterior development under in vitro conditions from prepubertal Bos indicus crossbred donors. Material and methods. Donors females received a norgestomet implant and estradiol benzoate. Four days later a unique dosage of 150 IU of eCG was administered. Three coasting periods (24, 48, and 56 h) and four ages (3, 6, 10, and 12 months) were proved. All antral follicles were aspirated and an in vitro culture proceed was done. Results. 439 follicles were aspirated, of which 385 (87.7%) were 2-5 mm, 41 (9.33%) were 5-10 mm, and 13 (2.3%) were ›10 mm. After aspiration, a total of 373 oocytes (84.9%) were recovered, finding differences (p<0.05) between averages of 6 (9.3) and 10 months old animals (32.3). 285 (76.4 %) recovered oocytes were subjected to in vitro process. Cleavage values were significantly higher (p<0.05) in 10 (27.1%) and 12 months animals (26.8%). Although the number of transferable embryos was low, there were differences between ages (p<0.05) obtaining a higher percentage in age 3 (12.6%). Conclusions. A coasting period higher than 24 h has a negative effect on oocyte quality. Some oocytes from 3 months old calves were competent for in vitro embryo development; however, higher numbers of embryos were produced from 10 and 12 months of age prepuber females, indicating they have higher competency in vitro. Key words: ECG, in vitro embryo production, oocytes donation, stimulation. (Sources: DeCS, AIMS).

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RESUMEN Objetivo. Este estudio evaluó el efecto de la edad y el período de aspiración folicular sobre la calidad del oocito y su posterior desarrollo in vitro con donadoras prepúberes Bos indicus mestizas. Materiales y métodos. Las hembras donantes recibieron un implante de norgestomet y benzoato de estradiol y cuatro días más tarde una dosis única de 150 UI de eCG. Las aspiración folicular se realizó en tres tiempos (24, 48, y h 56) y en cuatro edades (3, 6,10, y 12 meses). Todos los folículos antrales fueron aspirados y se realizaron procedimientos de maduración, fertilización y cultivo in vitro. Resultados. Se aspiraron 439 folículos en total, de los cuales 385 (87.7%) fueron de 2-5 mm, 41 (9.33%) fueron de 5-10 mm, y fueron 13 (2.3%) > 10 mm. Se recuperó un total de 373 oocitos (84.9%) y se encontraron diferencias significativas (p<0.05) entre los promedios de los animales de 6 (9.3) y 10 meses (32.3). 285 (76.4%) oocitos fueron sometidos a los procesos in vitro. La tasa de división fue significativamente mayor (p<0.05) en los animales de 10 (27.1%) y 12 meses (26.8%). Aunque el número de embriones transferibles fue bajo, existieron diferencias entre las edades (p<0.05), obteniendo el porcentaje más alto los animales de 10 meses (12.6%). Conclusiones. Un período de aspiración superior a 24 h tiene un efecto negativo sobre la calidad del oocito. Algunos oocitos procedentes de terneras de 3 meses fueron competentes en el desarrollo in vitro, sin embargo, un mayor número de embriones se produjeron con hembras de 10 y 12 meses de edad. Palabras Clave: Donación de óvulo, eCG, estimulación, producción de embriones in vitro. (Fuentes: DeCS, AIMS).

INTRODUCTION The potential of commercial application of in vitro embryo production (IVP) programs in fetal (1) and prepubertal females (2) offers accelerated genetic gain through a reduction in the generation interval since these animals represent a rich source of germ plasm (3-5). Furthermore, the use of IVP in prepubertal females is mainly useful in the genetic improvement of cattle breeds where puberty is achieved later, such as Bos indicus breeds (6). Bos indicus breeds and their crossbreeding with Bos taurus offers broad characteristics of tolerance and resistance to the extreme conditions in the tropics (7). These selective breeding effects (heterosis) on in vitro embryo production have been evaluated by Camargo et al (8) who evidenced that blastocyst development of Gyr (Bos indicus) and crossbred embryos is greater than with Holstein embryos. Through IVP, it would be possible to produce embryos from crossbred prepubertal donors with greater genetic merit for dairy or beef crossbred herds (6). Nevertheless, previous studies have reported that

developmental competence of oocytes from prepubertal donors is low in both Bos taurus and in Bos indicus (2, 6, 9-11). Low follicular activity needs to be stimulated in some donors, mostly by using Follicle Stimulating Hormone (FSH) and Luteinizing Hormone (LH), their combinations or equine chorionic gonadotropin (eCG) (1214). Some studies have demonstrated that the administration of gonadotropin increases the number of viable oocytes and the follicular development per session. These have been administrated at different schemes, dosages, and products with different results (10, 15-20). Few studies have been conducted with prepubertal Bos indicus and Bos indicus crossbreeds as donors of oocytes. But none have evaluated the effect of the time interval between hormonal stimulation and oocyte recovery (coasting period) (21,22) and the donor age in prepubertal Bos indicus crossbred females. A correct costing period is required to have an excellent process of in vivo prematuration and in vivo final maturation (22). This study was developed

Bernal - Effect of age and coasting period on oocytes quality

to evaluate the effect of age of the donor at the OPU’s time and the coasting period after gonadotropin stimulation over oocyte quality and their posterior development under in vitro conditions from prepubertal Bos indicus crossbred donors.

MATERIALS AND METHODS Gonadotropin stimulation. Twenty one Bos indicus crossbred (F1, Gyr x Holstein) prepubertal females, received a norgestomet sub cutaneous implant (Day 0; Crestar; Intervet International B.V.) and estradiol benzoate (1 mg; Syntex Laboratories). Four days later (day 4) a sole total dosage of 150 IU of Equine Chorionic Gonadotrophin (eCG; Folligon; Intervet International B.V.) was administered to each female. After the follicular aspiration, the implant was removed. Chemical reagents. Unless otherwise stated, all chemicals were purchased from Sigma-Aldrich Chemical Co. Oocyte Recovery. After stimulation, three coasting periods were established. The first group of animals was aspirated 24 hours after the eCG administration, the second group of animals was aspirated 48 hours after the gonadotropin administration, and the last group was aspirated 56 hours after the eCG administration. Prior to follicular aspiration, the animals were anesthetized with a xilacine and ketamine combination. The ovaries were exposed by midventral laparotomy, and all antral follicles were aspirated using a 16-gauge needle attached to a 10 mL disposable syringe (15). The oocytes were aspirated in a medium consisted of 0.9% saline sterile solution supplemented with 1% penicillin and streptomycin, 10% fetal bovine serum (FBS), and 5 IU/mL of sodium heparin. Immediately the content of the syringe was transferred into an Em-Con filter and washed 2-3 times. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected, evaluated, and washed in this medium and then subjected to in vitro maturation. The oocytes were classified under the

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following parameters: Quality I (QI) oocytes with homogeneous cytoplasm and at least four compact cumulus cell layers; Quality II (QII) - oocytes with some granulation in cytoplasm and less than four compact cumulus cell layers; Quality III (QIII) - oocytes with homogeneous or some granulation in cytoplasm and some cumulus cells expanded; Quality IV (QIV) oocytes with expanded cumulus; Quality V (QV) - naked oocytes. In vitro maturation (IVM). Maturation was performed from 22 to 26 hours. The maturation medium was bicarbonatebuffered TCM-199, containing 10% FBS, 0.01 mL/IU of FSH, (0.1 IU/mL of LH, 0.055 mg/mL of pyruvate, 100 IU/mL of penicillin, and 100 µg/ mL of streptomycin) (23). Oocytes from individual donors were placed into cryotubes containing 700 µL of maturation medium covered with 300 µL of mineral oil. Each cryotube was gassed with a mixture of 5% CO2 and 5% O2 before being sealed. They were stored and transported at 38°C during approximately ten hours to the in vitro fertilization (IVF) laboratory. At the laboratory, each cryotube cap was unscrewed and the cryotubes were transferred to the incubator in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air at 38.5°C. In vitro fertilization (IVF). After maturation, matured COCs were transferred into 50 µL droplets under a mineral oil fertilization medium (TALP-FERT, 23) enriched with BSA, piruvate, and antibiotics. Motile spermatozoa were obtained by frozen-thawed spermatozoa on a Percoll discontinuous density gradient. Spermatozoa were diluted to obtain a final concentration of 1 x 106 cells/mL and coincubated with COCs for 18 h in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air at 38.5°C. In vitro embryo culture (IVC). Presumptive zygotes were denuded by agitation for a minute and cultured under mineral oil in 50 µL droplets of CR2aa medium (24) enriched with 10% fetal calf serum, and 1 mg/mL of BSA. Every 48 h, half of the medium was replaced. Seven days post-insemination embryo development was evaluated.

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Statistical analysis. This study involved four age groups of animals: 3, 6, 10, and 12 months. Each group was conformed by three groups of different aspiration hours after stimulation 24, 48, 56 h. All groups were managed as a single experiment. Statistical computations were performed by using variance and student-t test analysis on all data (SAS 9.1.3 Version, SAS Institute Inc.)

significantly different values (p<0.05) (Tables 2 and 3) were found among coasting periods; 24 h being the period with the highest averages. Furthermore, there were no differences among ages for these qualities. Table 2. Effect of age on quality of oocytes recovered from Bos indicus crossbred prepuberal females.

RESULTS The prepubertal status of the animals was confirmed by the absence of the corpus luteum or corpus albicans prior to the time of follicle aspiration (6). Before aspirations, the follicles were counted, measured, and classified according to their size: < 5 mm, 5-10 mm, and > 10 mm (25). From the total number of 439 aspirated follicles, 385 (87.7%) were 2-5 mm, 41 (9.33%) were 5-10 mm, and 13 (2.3%) were >10 mm. There were no differences among the coasting periods (p<0.05), but differences were found (p<0.05) between 6 and 10 months animals for the aspirated follicle number: 10.5 (8.7%) and 37.3 (34.67%), respectively. Differences were not found (p>0.05) for the 5-10 and > 10 mm sizes. After aspiration, a total of 373 oocytes (84.9%) were recovered, and differences were located (p<0.05) between the oocite recovery averages of 6 (9.3) and 10 months (32.3) (Table 1).

(A,B) Mean values followed by different letters in the same column differ statistically between ages (p<0.05).

Quality III had the greatest number of oocytes and differences were found (p<0.05) (Tables 2 and 3) only between the ages 6 (62.5%) and 10 months (90%). For the QIV, there were differences between the ages 3 and 12 months with the latter having the highest value (30.15%). Moreover, 56 h was the coasting period with the highest averages for this quality (4.1,31.4%). From the total recovered oocytes, 285 (76.4%) were subjected to in vitro maturation/in vitro fertilization/in vitro embryo culture (IVM/IVF/IVC). Table 3. Effect of three coasting periods post stimulation on quality of oocytes recovered from Bos indicus crossbred prepuberal females.

Table 1. Effect of age and three different coasting periods post-stimulation on follicular size from Bos indicus crossbred prepuberal females.

(a,b) Mean values followed by different letters in the same column differ statistically between hours of aspiration post-stimulation (p<0.05). (A,B) Mean values followed by different letters in the same column differ statistically between ages (p<0.05). There were no differences between hours of aspiration post stimulation for each variable (p<0.05).

The oocytes were classified according to their quality. Although the number of oocytes for the QI and QII were low,

The cleavage values were significantly higher (p<0.05) in 10 (27.1%) and 12 months of ages animals (26.8%). Although the number of transferable embryos was low, there were differences between ages (p<0.05) and, 10 months of age animals obtained the highest percentage (12.6%).

Bernal - Effect of age and coasting period on oocytes quality Table 4. Effect of age and three different coasting periods post-stimulation on embryo development of in vitro fertilized oocytes from Bos indicus crossbred prepuberal females.

(A,B) Means followed by different letters in the same column differ statistically between ages (p<0.05). There were no differences between hours of aspiration post stimulation for each variable (p<0.05).

There were no differences (p<0.05) among coasting periods for cleavage and transferable embryo values (Table 4).

DISCUSSION This is the first study to investigate the effect of time interval between hormonal stimulation and oocyte recovery (coasting period, 21) and the donor age in prepubertal Bos indicus crossbred cattle. When the ovarian response was evaluated, we found that follicular development was similar among the different coasting periods. In contrast, Blondin et al (21) evidenced that a longer coasting period resulted in a greater percentage of 5-10 mm follicles in stimulated cows. We only found differences for the total aspirated follicles and follicles of 2-5mm between 6 and 10 months of age, of which 10 months had greater values (92.1% for â&#x20AC;š5mm follicles). These results differ from Snel-Oliveira et al (26), who did not find differences in the total follicle number (â&#x2030;Ľ3mm) among Nelore donors at 10, 11, and 12 months, or differences in stimulation treatments. We did not find differences with the 12 months of age animals in which the number of follicles was lower than 10 months of age ones (26). Molina et al (27) showed that hormonal stimulation with gonadotropins increased oocyte quality and their in vitro development. On the contrary, SnelOliveira et al (26) reported that there were no differences in the total recovered

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oocytes or in the viable oocytes between ages and stimulation treatments. In the present study, qualities I and II of recovered oocytes were only found in the 24-h coasting period, the quantity of expanded follicles increased with the coasting period after stimulation, most oocytes were quality III, and 10 months of age animals had the highest quantity of QIII oocytes. Thus, indicating that oocyte quality declines with the increase of the coasting period. In contrast, Blondin et al (21) found no effect of 33 h and 48 h coasting periods on types of COCs from stimulated cows. Oropeza et al (28), reported 53, 61 and 60% of competent oocytes from unstimulated Bos taurus (Holstein) calves at 6-7, 9-10, and 11-12 months of age, as well as blastocyst rates of 1, 9, and 10% for the same ages; therefore, showing that age affects cleavage rates. In this study, the cleavage and transferable embryos were higher in older donors (9.510 and 11.5-12 months) and these results agree with previous reports. For example, the oocytes collected from non-stimulated calves at 1-4 months (9), between 5 and 9 months of age (16), and from 6-8 months B. taurus (11), lacked embryonic competence to produce viable transferable embryos. Additionally, Oropeza et al (28) evidenced that oocytes from Bos taurus calves between 6-7 months of age produced lower blastocyst development rate. Furthermore, Camargo et al (6), showed that non-stimulated B. indicus crossbred 4-7 month old calves are less competent than oocytes derived from cows, but oocytes from non-stimulated 9 to 14 month old heifers achieve similar developmentally competent as oocytes from cows. Camargo et al (6) showed that oocytes from nonstimulated B. taurus (Holstein) females reached competence at 11 months of age, suggesting that these oocytes have similar competence to those of cows. The reduced developmental competence of oocytes from prepubertal calves is attributed to a deficient expression of facilitative glucose transporters, insufficient protein translation (28), size, ultrastructure, metabolism, and cytoplasmic maturation (29). Through this study, we observed broad individual variability among donors of

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the same age. We found values among 0 and 64 recovered oocytes and embryo production rates from 0 to 7 in the same groups. These observations have been previously reported in prepubertal animals by other authors (15, 26, 30, 31). In conclusion, the results suggest that a coasting period higher than 24 h has a negative effect on oocyte quality and on their subsequent in vitro development. Additionally, some oocytes from 3 month old calves were competent for in vitro

embryo development. However, a higher number of embryos were produced by 10 and 12 month prepuberal females, thus, indicating higher in vitro competence.

Acknowledgments This work was supported by the Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología COLCIENCIAS-BID. No. 1254-07-12211, contrato No. 269-2002.

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Rev.MVZ Córdoba 16(2):2507-2513, 2011.

ORIGINAL

Relación entre características de tipo y producción de leche en vacas Holstein de Antioquia, Colombia Relationship between type traits and milk production in Holstein cows from Antioquia, Colombia Juan Corrales A,1,2 Zoot, Mario Cerón-Muñoz,1 Ph.D, Jhon Cañas A,1 Zoot, Cristina Herrera R,1 Zoot, Samir Calvo C,1 Zoot. Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias. Grupo de Investigación en Genética, Mejoramiento y Modelación Animal. 2Joven investigador Colciencias, programa jóvenes investigadores e innovadores “Virginia Gutiérrez de Pineda”. *Correspondencia: mceronm@agronica.udea.edu.co. 1

Recibido: Mayo de 2010; Aceptado: Febrero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la relación entre las características de tipo agrupadas por factores con la producción de leche en ganado Holstein de Antioquia, Colombia. Materiales y métodos. Se utilizaron datos de 24 características lineales y producción de leche de 3102 vacas de la raza Holstein del departamento de Antioquia en control lechero oficial. Se realizó un análisis por factores (AF) con el método de componentes principales y se retuvieron los factores que mostraron valores propios mayores que 1.0. Posteriormente se realizó un análisis de varianza para la variable producción de leche, donde se tuvieron en cuenta los efectos fijos de finca, mes de parto y año de clasificación y se estimaron los coeficientes de regresión lineal para cada uno de los factores retenidos. Resultados. El AF mostró que sólo siete factores fueron retenidos y agruparon cerca del 64% del total de la varianza de todas las características de tipo analizadas. El primer factor reunió las variables relacionadas con la estructura general de la vaca y tuvo un valor propio de 3.85. El análisis de varianza mostró que los factores se relacionaron con producción de leche Conclusiones. Para producción de leche en Antioquia, Colombia, sobresalen las vacas grandes, anchas de pecho, altas y profundas del cuerpo, con pezuñas uniformes, angulosas y talones profundos, un sistema mamario caracterizado por ubres de textura suave, buen ligamento medio, un buen carácter lechero y ubres profundas. Palabras clave: Análisis de componentes, control lechero, modelos lineales, producción lechera. (Fuentes: AIMS, CAB).

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ABSTRACT Objective. To evaluate the relationship between type traits and milk production in Holstein cows from Antioquia, Colombia. Materials and methods. A total of 24 type traits and milk production from 3102 cows under an official milk control records were used. Data were analyzed by factors (FA) using the principal components method. Factors that showed eigenvalue greater than 1.0 were retained, and analyzed by ANOVA for production of milk, which took into account the fixed effects of farm, months of calving and year of evaluation. Then, linear regression coefficients were estimated for each of the factors retained. Results. The FA showed that only seven factors were retained, explaining about 64% of the total variance of all type traits analyzed. The first factor met the variables related to the overall structure of the cow and had an eigenvalue of 3.85. It was also found, that the factors studied were related mainly to milk production. Conclusions. The high milk production of dairy cows from Antioquia, Colombia, was associated to large cows, characterized by wide chest, tall and deep body, uniform feet and angular and deep heel and a mammary system characterized by soft texture, strong median suspensory ligament, deep udder and good dairy character. Key words: Component analysis, linear models, milk production, milk recording. (Sources: AIMS, CAB).

INTRODUCCIÓN Los rasgos morfológicos son la base de los sistemas de clasificación lineal en diferentes razas bovinas (1). Este sistema está basado en medidas visuales de características individuales desde un extremo biológico observable a otro el cual varía de 1 a 50 en el sistema de evaluación estadounidense y de 1 a 9 en los sistemas canadiense y europeo (2,3). La importancia de estas características está dada con la posibilidad de estar genotípica y fenotípicamente relacionadas con la longevidad y la habilidad para producción de leche (3). Estudios tendientes a evaluar la relación entre las características de tipo con vida productiva y producción de leche, han sido comúnmente analizados por regresión lineal múltiple (4). Sin embargo, las altas correlaciones entre dichas características producen dificultad en su interpretación por efecto de la alta colinealidad, y por ende imprecisiones entre los estimativos de regresión (5). Un enfoque estadístico para evitar dependencia entre las variables y desarrollar estimativos más ajustados, es el análisis factorial. Este procedimiento remueve la información redundante de variables correlacionadas, presentándolas

en un pequeño grupo de variables derivadas llamadas factores (6) y permite agrupar variables que estén fuertemente relacionadas (7). De esta manera, los diferentes factores resultantes pueden ser utilizados en análisis posteriores, sin tener problemas de colinealidad. El objetivo de este estudio fue evaluar la relación entre las características de tipo con la producción de leche en ganado Holstein de Antioquia.

MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de datos. Se utilizaron 3102 datos de producción de leche y clasificación lineal (sistema de 1 a 9) de vacas de primer parto, registradas en la Asociación Holstein de Colombia. Se contó con información de producción de leche ajustada a los 305 días y edad adulta (8), y evaluación lineal de 24 características de tipo: estatura, tamaño, ancho de pecho, profundidad del cuerpo, colocación de isquiones, ancho del isquion, calidad de hueso, colocación de los miembros, profundidad de la ubre, medio suspensorio, inserción anterior, colocación del pezón, largo del pezón y angularidad, basado en los parámetros utilizados por la Asociación Holstein de Colombia. Los datos fueron colectados entre los años 2000 y 2008.

Corrales - Relación entre características de tipo y producción de leche

2509

Análisis estadístico. Se utilizó la técnica multivariada de análisis por factores (AF) a través del procedimiento FACTOR del software estadístico SAS® 9.1, con el fin de reducir la dimensionalidad y sintetizar la información contenida en un conjunto de p variables observadas (y1,….., yp) por la extracción de un nuevo conjunto de m factores subyacentes (m< p) denotados por f1, f2,……, fm. El modelo empleado fue el siguiente:

Donde у es la producción de leche ajustada a 305 días y edad madura, µ es la media de producción de leche, уi es el efecto fijo del i-ésimo hato, ςj es el efecto fijo de mes de parto, λk es el efecto fijo de año de clasificación y β2ƒ1/+…+ βnƒn/ hace referencia a los / factores retenidos de 1 a hasta n y ℮ijklm es el error aleatorio.

Xj = λj1f1 + λj2f2 + ….. + λjmfm+ηj para j= 1,2,…,p

Las medias y las desviaciones estándar para cada una de las 24 características de tipo evaluadas en la primera lactancia se pueden observar en la tabla 1. Las medias variaron de 4.45 a 6.34, donde los mayores coeficientes de variación se presentaron para las características ancho de la inserción (35.73) y vista posterior de los miembros (30.89)

X es el vector con las nuevas variables f1, f2,….,fm son los factores comunes y η1, η2, …., ηp factores específicos. La cantidad ηj describe la variación residual específica a la j-ésima variable respuesta. Los multiplicadores λjk cargas de los factores.

denominan

La cantidad apropiada de factores se extrajo por el método de Componentes Principales (CP), a partir de la matriz de correlación fenotípica de las características de tipo con valores propios mayores a 1. Para la interpretación de cada uno de los factores retenidos se tuvo en cuenta que los coeficientes de cada característica dentro del factor λjk fueran mayores a 0.30. Se realizó una rotación de los factores por el método varimax propuesto por Kaiser (9), con el objetivo de lograr una interpretación adecuada de cada uno de los factores que se retuvieron. Para evaluar la relación de los factores con la producción de leche, se utilizó un modelo lineal generalizado mediante el procedimiento GLM de SAS® 9.1. El modelo incluyó los efectos fijos de hato, mes y año de parto y la regresión de cada uno de los factores retenidos por el procedimiento anterior. El modelo utilizado fue el siguiente: Yijklm = μ + γi + ςj + λk + β2 ƒ1l + ..... + βn ƒnl + eijklm

RESULTADOS

Tabla 1. Medias, desviaciones estándar y coeficiente de variación de las características de tipo en vacas Holstein del departamento de Antioquia. Media

Estatura

Característica

5.98 ± 1.27

21.24

Extremo anterior

4.93 ± 0.97

19.68

Tamaño

5.63 ± 1.31

23.27

Ancho de pecho

4.96 ± 1.36

27.42

Profundidad de cuerpo

5.51 ± 1.18

21.42

Fortaleza del lomo

5.71 ± 1.24

21.72

Colocación de ísquiones

4.86 ± 1.09

22.43

Ancho de ísquiones

5.45 ± 1.41

25.87

Ángulo de la pezuña

4.82 ± 1.25

25.93

Uniformidad de pezuña

5.31 ± 1.09

20.53

Profundidad de talón

4.79 ± 1.25

26.10

Calidad del hueso

5.86 ± 1.46

24.91

Colocación de los miembros

5.71 ± 1.25

21.89

Vista posterior

5.18 ± 1.60

30.89

Profundidad de la ubre

5.48 ± 0.98

17.88

Textura de la ubre

6.22 ± 1.25

20.10

Ligamento suspensorio medio

6.31 ± 1.25

19.81

Inserción anterior

5.38 ± 1.57

29.18

Colocación de pezones anteriores

4.74 ± 1.08

22.78

Largo del pezón

4.89 ± 1.20

24.54

Altura de la inserción posterior

6.34 ± 0.92

14.51

Ancho de la inserción

4.45 ± 1.59

35.73

Colocación de pezones posteriores

6.24 ± 1.07

17.15

Angularidad

6.09 ± 0.99

16.26

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Los análisis de factores realizados inicialmente mostraron que las características colocación de ísquiones, vista posterior de los miembros, largo del pezón, altura de la inserción posterior y fortaleza del lomo no tenían peso dentro de los factores con valores propios mayores que 1, por lo que fueron excluidos del análisis y se realizó un nuevo análisis con las otras 19 características. Se encontró una correlación aceptable y una adecuación muestral aceptable, según el coeficiente de KMO (Kaiser-MeyerOlkin), la cual fue de 0.75. Se encontraron siete valores propios mayores que 1, los cuales explicaron el 64% de la variabilidad total de las 19 variables de tipo analizadas. El primer factor tuvo un valor propio de 3.85 y explicó el 20% de la varianza. El segundo y tercer factor obtuvieron valores propios de 2.05 y 1.70 con el 11% y 9%, del total de la varianza, respectivamente.

La matriz de los factores rotados con aplicación de Varimax se puede observar en la tabla 2, donde valores superiores a 0.30 están marcados con un asterisco, indicando las características que definen ese factor. El primer factor se relacionó con la estructura de la vaca, agrupando las vacas grandes, anchas de pecho y de ísquiones, altas, profundas del cuerpo, altas en su extremo anterior y angulosas. Las pezuñas, el sistema mamario, la vista posterior de la vaca, el carácter lechero, la ubre anterior y la profundidad de la ubre se relacionaron con los factores 2, 3, 4, 5, 6, 7, respectivamente (Tabla 3). En la tabla 4 se presentan los coeficientes de regresión lineal estándar de los factores que fueron retenidos y definidos en la tabla 3. El promedio de producción de leche fue de 7141.53 litros. Seis de los siete factores fueron altamente significativos con producción de leche, donde el factor

Tabla 2. Coeficientes de las características de tipo evaluadas en vacas Holstein del departamento de Antioquia en el Análisis de Factor. Característica

Factor 1

Factor 2

Factor 3

Factor 4

Factor 5

Factor 6

Factor 7

Tamaño

0.87*

0.09

0.04

0.17

-0.01

0.04

-0.05

Ancho de pecho

0.75*

0.06

0.02

0.10

-0.26

0.08

-0.15

Profundidad del cuerpo

0.63*

-0.16

0.05

0.14

0.11

0.19

-0.29

Estatura

0.63*

0.23

0.10

0.24

0.25

-0.18

0.29

Extremo anterior

0.60*

-0.01

-0.06

-0.20

0.08

0.32*

-0.04

Ángulo de la pezuña

0.03

0.86*

-0.01

0.05

0.01

0.05

-0.05

Profundidad del talón

0.10

0.85*

0.04

0.03

-0.03

0.00

0.01

Colocación de pezones posteriores

0.04

0.03

0.82*

-0.19

0.01

-0.03

0.01

Ligamento suspensorio

0.02

-0.01

0.76*

0.19

0.10

0.12

-0.01

Ancho de la inserción

0.26

-0.04

0.06

0.72*

0.06

0.10

-0.22

0.43*

0.02

0.04

0.55*

0.19

-0.17

0.21

0.14

-0.27

0.22

-0.52*

0.15

-0.17

0.01

Calidad de hueso

-0.19

-0.07

0.02

-0.02

0.84*

0.07

0.06

Angularidad

0.38*

0.08

0.15

0.16

0.65*

0.14

-0.17

Inserción anterior

0.16

0.04

0.01

0.00

0.09

0.82*

0.12

Textura de la ubre

0.05

0.16

0.32*

0.35

0.23

0.51*

-0.08

Profundidad de la ubre

-0.14

-0.06

0.01

-0.09

-0.03

0.14

0.87*

Uniformidad de pezuñas

0.09

0.34*

-0.03

-0.06

0.08

-0.04

-0.22

Colocación de pezones anteriores

0.08

-0.29

0.33*

0.27

-0.03

0.42*

0.15

Ancho de Ísquiones Colocación de los miembros

*Valores absolutos mayores de 0.30 que explican cada uno de los factores.

2511

Corrales - Relación entre características de tipo y producción de leche

Tabla 3. Descripción de los factores obtenidos de las características de tipo evaluadas en vacas Holstein del departamento de Antioquia. Factor

Nombre

Característica

Estructura de la vaca

Vacas grandes, anchas de pecho y de ísquiones, altas, profundas del cuerpo, altas en su extremo anterior y angulosas.

Pezuñas

Sistema mamario

Vacas con pezones anteriores y posteriores hacia adentro, ligamento suspensorio fuerte y ubre con textura suave.

Vista trasera de la vaca

Vacas anchas en la inserción de la ubre, anchas de ísquiones y patas derechas.

Carácter lechero

Ubre anterior

Profundidad de la ubre

Tabla 4. Coeficientes de regresión lineal para producción de leche ajustada a los 305 dias y edad adulta sobre los factores obtenidos de las características lineales evaluadas en vacas Holstein del departamento de Antioquia. Factor

Coeficiente de regresión lineal

284.46±26.91**

116.16±27.10**

149.11±25.33**

324.37±28.31**

157.62±25.57**

0.39±25.62ns

-356.17±25.39**

seis no fue significativo. El coeficiente de regresión del séptimo factor fue negativo, el resto de los coeficientes de regresión para los otros factores retenidos fueron positivos.

DISCUSIÓN Los coeficientes de variación encontrados en este estudio fueron altos (entre 14.51 y 35.73), resultado cercano al reportado por Foster et al (10) quienes utilizando el sistema de medida estadounidense de 1 a 50 encontraron coeficientes de variación para las características de tipo entre 17.04 y 27.88, lo cual indica que es

Vacas profundas de talón empinadas y uniformes.

con

pezuñas

Vacas angulosas y huesos planos Vacas con inserción anterior de la ubre fuerte, colocación de pezones anteriores hacia adentro y textura de la ubre suave. Vacas con ubres superficiales

normal encontrar en las características de tipo una heterogeneidad en sus valores debido al sistema de medición que se basa en medidas visuales realizadas por un clasificador. Se presentaron siete factores con valores propios mayores a 1, los cuales explicaron un 64% de la variabilidad total. Este resultado concuerda con estudios similares realizados en características de tipo en bovinos Holstein de Estados Unidos, donde el total de la variabilidad obtenida en los factores retenidos explica entre el 69% y el 74% de la variabilidad total con menor número de variables (11,12). De los siete factores, el primer factor (estructura de la vaca) explicó el 20% de la variabilidad total, el cual estuvo conformado por vacas grandes y fuertes. Teniendo en cuenta el coeficiente de regresión lineal para este factor, se concluye que las vacas grandes y fuertes presentan una mayor producción de leche, resultado que concuerda con las correlaciones reportadas por Berry et al (2), quienes reportaron correlación genética positiva de la estatura, ancho de pecho, profundidad del cuerpo y ancho de ísquiones con producción de leche y difieren de lo encontrado por Sieber et al (11), quienes encontraron que vacas grandes y fuertes tenían una menor producción de leche.

2512

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

El segundo factor (conformación de pezuñas) explicó el 11% de la variabilidad total, el cual se caracterizó por vacas con pezuñas empinadas, uniformes y con un talón profundo. Estos resultados concuerdan con los encontrados por Sieber et al (11,13) y Vukasinovic et al (12), quienes reportaron que las características de las patas y pezuñas se agrupaban en un factor. Esto indica una fuerte correlación entre estas dos características. El análisis de varianza indicó una relación positiva (coeficiente de regresión positivo) de la producción de leche con vacas que tuvieron talón profundo, pezuñas angulosas y uniformes, lo cual se explica por las condiciones de producción en Colombia, donde el sistema se basa principalmente en pastoreo en campos ondulados y las vacas con mejores condiciones de pezuñas son las que finalmente se desplazan más fácilmente desde el potrero hasta la sala de ordeño. EL tercer factor (sistema mamario) se caracterizó por vacas con colocación de pezones hacia adentro, ligamento suspensorio fuerte y ubre con textura suave. El cuarto factor (vista trasera de la vaca) se definió por vacas anchas de la inserción de la ubre, de ísquiones y patas derechas; el quinto factor (carácter lechero) por vacas angulosas y de huesos planos. Los coeficientes de regresión positivos de los factores 3, 4 y 5 indicaron que vacas con buena conformación de la ubre, tren posterior y con carácter lechero tienden a tener mayores producciones de leche. El sexto factor (ubre anterior) en la cual las vacas se caracterizaron por tener una inserción fuerte, pezones hacia adentro y textura de la ubre suave, presentó un coeficiente de regresión con producción de leche negativo, pero no fue significativo. El sexto factor (ubre anterior) en la cual las vacas se caracterizaron por tener una inserción fuerte, pezones hacia adentro

y textura de la ubre suave, presentó un coeficiente de regresión no significativo con producción de leche. Esto se debe principalmente a que estas características no se relacionan con la capacidad de almacenar o producir leche y por el contrario se encuentran más relacionadas con la vida productiva de la vaca (12). El séptimo factor (profundidad de la ubre) se caracterizó por vacas con ubres superficiales. Este factor obtuvo un coeficiente de regresión negativo con producción de leche, lo cual indicó que las vacas con ubres superficiales tienden a tener menor producción de leche. Estos resultados concuerdan con los presentados por Sieber et al (11), quienes encontraron que las vacas con ubres superficiales tenían un coeficiente de regresión negativo con producción. Lo anterior puede ser explicado por la poca capacidad que tiene la ubre de almacenar leche en gran cantidad debido a lo estrecha en la inserción y en lo superficial de la ubre. Además, la vaca al tener una profundidad del cuerpo muy superficial, no tiene la capacidad para almacenar grandes cantidades de alimento. Finalmente, se puede concluir que los individuos con buenas condiciones corporales tienden a producir mayores cantidades de leche. Sin embargo, se hace necesario la realización de estudios tendientes a evaluar los puntajes ideales en condiciones locales y de esa manera poder relacionar los resultados encontrados con los reportados en otros países.

Agradecimientos Este trabajo fue posible gracias al apoyo del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, Fondo Nacional del Ganado, Universidad de Antioquia, Asociación Holstein de Colombia y Corporación Antioquia Holstein.

Corrales - Relación entre características de tipo y producción de leche

2513

REFERENCIAS 1. Wiggans GR, Gengier N, Wright JR. Type trait (Co)Variance components for five dairy breeds. J Dairy Sci 2004; 87:2324-2330. 2. Berry DP, Buckley F, Dillon P, Evans RD, Veerkamp RF. Genetic relationships among linear type traits, milk yield, body weight, fertility and somatic cell count in primiparous dairy cows. Ir J Agr Food Res 2004; 43: 161-176. 3. Samoré AB, Rizzi R, Rossoni A, Bagnato A. Genetic parameters for funtional longevity, type traits, somatic cell scores, milk flow and production in the Italian Brown Swiss. Ital J Anim Sci 2010; 9:145-152 4. Daliri Z, Hafezian SH, Parvar A, Rahimi G. Genetic relationships among longevity, milk production and linear type traits in Iranian Holstein cattle. J Anim Vet Adv 2008; 7(4):512-515. 5. López E. Tratamiento de la colinealidad en regresión lineal múltiple. Psicothema 1998; 10: 491-507. 6. Macciota NP, Vicario D, Corrado DM, Caprio-Borlino A. A multivariate approach to modeling shapes of individual lactation curves in cattle. J Dairy Sci 2004; 87:1092-1098. 7. Thompson B. Exploratory and confirmatory factor analysis: Understanding concepts and applications. International Standard Book Number: 1-59147-093-5. Washington DC, USA: American Psychological Association; 2004.

8. Stanton TL, Blacke RW, Quaas RL, Van Vleck LD, Carbaño MJ. Genotype by environment interaction for Holstein milk yield in Colombia, Mexico, and Puerto Rico. J Dairy Sci 1991; 74:17001714. 9. Kaiser HF. The varimax criterion for analysis rotation in factor analysis. Psychometrika 1958; 23:187-200. 10. Foster WW, Freeman AE, Berger PJ. Linear type trait analysis with genetic parameter estimation. J Dairy Sci 1988; 71:223-231. 11. Sieber M, Freeman AE, Hinz PN. Factor analysis for evaluating relationships between first lactation type scores and production data of Holstein Dairy cows. J Dairy Sci 1987; 70:1018 - 1026. 12. Vukasinovic N, Moll J, Künzi N. Factor analysis for evaluating relationships between herd life and type traits in Swiss Brown cattle. Livest Prod Sci 1997; 49:227-234. 13. Sieber M, Freeman AE, Hinz PN. Comparison between factor analysis from a phenotypic and genetic correlation matrix using linear type traits of Holstein dairy cows. J Dairy Sci 1988; 71:477-484.

Rev.MVZ CórdobaREVISTA 16(2):2514-2520, 2011. • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 2514 MVZ CÓRDOBA

ORIGINAL

Modelación de curvas de lactancia para producción de leche, grasa y proteína en bovinos Holstein en Antioquia, Colombia Modeling the lactation curves for milk, fat and protein yield of Holstein cattle in Antioquia, Colombia Jhon Cañas A,1 M.Sc, Mario Cerón-Muñoz,

* Ph.D, Juan Corrales A,1 M.Sc.

1, 2

Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias e Instituto de Biología, GaMMA: Grupo de investigación en Genética, Mejoramiento y Modelación Animal, Medellín, Colombia. 2Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias, Medellín, Colombia. *Correspondencia: mceronm@agronica.udea.edu.co 1

Recibido: Junio de 2010; Aceptado: Febrero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Modelar curvas de lactancia para producción de leche y para los porcentajes de grasa y proteína y determinar los principales factores que influyen en la curva de lactancia. Materiales y métodos. Fueron empleados los datos de control lechero de 1532 animales de raza Holstein pertenecientes a 19 haciendas ubicadas en el departamento de Antioquia, Colombia, donde se compararon los modelos matemáticos no lineales propuestos por Wood, Brody, Papajcsik y Bodero y Wilmink. En el modelo que presentó los mejores ajustes se determinó el efecto del parto, la época de parto y el año de parto. Resultados. Las curvas de lactancia para producción de leche y porcentaje de grasa y proteína, estimadas por el modelo de Wood, presentaron los mejores valores en los criterios de comparación empleados. Los efectos de año y número de parto fueron significativos para los parámetros estimados en el modelo de Wood. Conclusiones. El modelo de Wood mostró el mejor ajuste en curvas de lactancia para producción de leche y para los porcentajes de grasa y proteína. La curva de lactancia para el porcentaje de proteína se caracterizó por ser muy consistente y no presentar mayores fluctuaciones durante toda la lactancia. Palabras clave: Control lechero, época del parto, modelos matemáticos, tasa de partos. (Fuente: CAB).

2514

Cañas - Modelación para producción de leche, grasa y proteína en bovinos

2515

ABSTRACT Objective. Modeling lactation curves for milk yield and for fat (%) and protein (%) and to determine the main factors affecting the lactation curve. Materials and methods. Official milk control data of 1532 Holstein dairy cows from 19 farms from the department of Antioquia, Colombia were used. Non-linear mathematical models proposed by Wood, Brody, Papajcsik and Bodero and Wilmink were calculated. Regression coefficients of the best fit non linear model selected was used for the effect on parity, time and year of birth was. Results. Lactation curves for milk yield and both fat and protein percentages estimated by Wood’s model showed the best values for the comparison criteria used. Parity and year of parity effects were significant for the estimated parameters in the Wood’s model. Conclusions. Wood’s model showed the best fit in lactation curves for milk yield and for fat (%) and protein (%). The lactation curve for protein (%) was characterized by a very consistent production and no major fluctuations throughout lactation. Key words: Calving rate, calving season, mathematical models, milk recording. (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN En el mejoramiento de la calidad de la leche, tanto los factores genéticos como ambientales desempeñan un papel muy importante que debe ser reconocido y comprendido (1). Al igual que la producción de leche, los porcentajes de grasa y proteína también pueden ser modelados empleando modelos probabilísticos (2,3). Los modelos más empleados han sido los no lineales como el de gamma incompleto descrito por Wood (4), el modelo de Wilmink (5), Brody et al (6), entre otros. La forma de la curva para los porcentajes de grasa y proteína siguen una relación inversa a la curva de producción de leche. Así, durante los primeros días correspondientes al calostro, los componentes sólidos en la leche son altos, pero caen rápidamente en la misma proporción en que la producción de leche incrementa; hacia el último tercio de la lactación el incremento de los sólidos vuelve a ser significativo (7). Existen numerosos factores ambientales que influyen en la producción de leche, grasa y proteína y que consecuentemente alteran la forma de la curva de lactancia en ganado Holstein, entre ellos los más influyentes son el número de parto y la época y año de parto (1,3,7).

El objetivo de este trabajo fue modelar curvas de lactancia para producción de leche y para los porcentajes de grasa y proteína y determinar los principales factores que influyen en la curva de lactancia.

MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de datos. Se emplearon los datos de control lechero mensual, realizado en los años de 2008 y 2009, de 19 haciendas ubicadas en el norte y el oriente del departamento de Antioquia en los municipios de San Pedro, Bello, Entrerrios, Belmira, Rionegro y La Ceja. Variables climáticas. La temperatura media fue de 15°C, con precipitaciones de 1570 mm/año, altitud de 2300 a 2500 msnm y humedad relativa del 72%. Meses del parto. Los meses de parto fueron agrupados por trimestres en cuatro épocas: diciembre-febrero, marzo-mayo, junio-agosto y septiembre-noviembre. Manejo de los animales y controles lecheros. Los animales se encontraban bajo un sistema de pastoreo rotacional, en pasto Kikuyo (Pennisetum clandestinum). Las vacas fueron ordeñadas dos veces al día y recibían alimento concentrado entre

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

6 y 12 Kg dependiendo de la producción. Para este análisis se contó con un total de 13640 datos de controles lecheros mensuales de 2156 lactancias de 1532 vacas Holstein (Tabla 1). Animales con lactancias inferiores a 100 días de producción y menos de cuatro controles lecheros por lactancia no fueron tenidos en cuenta para este análisis. El control lechero consistió en mediciones individuales de leche, grasa y proteína mediante visitas mensuales en los dos ordeños (am y pm). Para lo anterior se emplearon equipos portátiles (Ekomilk) que permiten la valoración de los constituyentes sólidos de la leche. Obtención de muestras individuales de leche. Fueron obtenidas al finalizar el ordeño de cada animal a través del medidor de leche (ordeño en sala) o directamente del balde, previa homogenización de la muestra (ordeño en potrero). Estas muestras fueron almacenadas en tubos con capacidad de 50ml para ser analizadas por medio del analizador de leche portátil (Ekomilk) a un rango de temperatura de entre 20 y 28°C con homogenización previa y calentamiento al baño maría

Tabla 1. Distribución del número de controles lecheros mensuales y el número de animales empleados en este análisis. Controles lecheros mensuales

Número de animales

2974

395

2980

329

2465

241

1907

210

1545

174

≥6

1769

183

2007

2083

372

2008

8959

802

2009

2598

358

Parto

Año de Parto

según las especificaciones del equipo. Los equipos fueron calibrados continuamente por medio de pruebas de laboratorio. Modelación de curvas de lactancia. Para cada animal en cada lactancia se evaluaron los siguientes modelos matemáticos no lineales: β (−β t ) Wood (4): yi = β 0ti 1 e 2 i + ei

(− β t ) (− β t ) Brody et al (6): yi = β 0 e 1 i − β 0 e 2 i + ei (−0.05t i ) + ei Wilmink (5): yi = β 0 + β1ti + β 2e

(− β t ) Papajcsik & Bodero (8): yi = β 0ti e 2 i + ei

Donde, уi es la producción de leche, porcentaje de grasa o porcentaje de proteína a un tiempo (i) determinado, los β0, β1 y β2 son los parámetros a estimar en la función, e es la función exponencial, t son los días en leche y ei es el error asociado a cada observación. Para la elaboración de las curvas se utilizó el procedimiento NLIN del paquete estadístico SAS ® (9), donde se empleó el método de iteracción de Gauss-Newton. Para la elección del modelo que mejor ajustó las curvas de lactancia se tuvo en cuenta el porcentaje de curvas que convergieron (PCCON), el porcentaje de curvas significativas (PCSIG) (p<0.05), los criterios de información de Akaike (AIC) y Bayesiano (BIC), el porcentaje de curvas con el valor más bajo de AIC (PAIC) y de BIC (PBIC), los valores del coeficiente de determinación (R2) y el porcentaje de curvas con el valor más alto de R2 (PR2). Para el modelo que presentó los mejores ajustes se estimó por medio de la primera derivada el tiempo en el cual se alcanza el pico de producción (Tpico). La producción máxima (Ymax) o producción mínima (Ymin), esta última en el caso de los porcentajes de grasa y proteína, se obtuvo reemplazando el tiempo al pico en la fórmula inicial. Análisis estadístico. Para las variables, β0, Tpico y Ymax o Ymin se determinó el efecto del hato, el número de parto y la época y año de parto. Se empleó el procedimiento

Cañas - Modelación para producción de leche, grasa y proteína en bovinos

GLM del paquete estadístico SAS ® (9), mediante el siguiente modelo:

yijklmn = µ + α i + δ j + θ k + ϕl + γ m(l ) + ε n(ijklm )

Donde: Yijklmn es la variable respuesta (β0, Tpico y Ymax ó Ymin) en las variables producción de leche y porcentajes de grasa y proteína; µ es la media general; αi, δj, θk, φl son los efectos fijos de número de parto (i= 1, 2,…, ≥6), época de parto (j=1, 2,…, 4), año de parto (k= 2007, 2008 y 2009) y hato (l= 1, 2,…, 19), respectivamente; y γm(l) y εn(ijklm) son los efectos aleatorios de animal anidado en hato y el error asociado a cada observación, respectivamente.

2517

En las figuras 1, 2 y 3 se muestran las curvas de lactancia para producción de leche y para los porcentajes de grasa y proteína estimadas en cada uno de los partos.

RESULTADOS En las variables porcentaje de grasa y proteína el modelo de Wood presentó el PAIC, PBIC y PR2 más altos. Para la producción de leche el modelo de Wilmink presentó el PAIC y PBIC más alto, sin embargo presentó el PR2 más bajo de los cuatro modelos (Tabla 2). Tabla 2. Criterios de comparación para escoger el mejor modelo que ajuste la curva de producción de leche y los porcentajes de grasa y proteína de vacas Holstein en Antioquia. Variable

Producción de leche

Porcentaje de grasa

Modelo

PCCON PCSIG PAIC

PBIC

PR2

Wood

65.15

65.95

40.23

36.34

97.37

58.24

Brody

17.29

89.61

5.90

5.23

93.96

17.43

Wilmink

99.39

68.63

43.02

48.18

76.66

1.74

Papajcsik y Bodero

97.39

99.06

10.85

10.25

91.95

22.59

Wood

93.22

97.25

49.97

49.83

98.04

57.22

Brody

57.02

97.45

35.66

35.73

98.82

37.00

Wilmink

100

39.29

3.96

4.37

55.60

0.74

Papajcsik y Bodero

100

99.73

10.41

10.07

94.61

5.04

Wood

94.90

99.19

64.67

64.73

99.18

66.62

63.33

98.52

29.15

99.31

29.62

100

22.83

1.95

2.22

45.53

0.54

100

99.87

4.23

3.90

95.15

3.22

Brody Porcentaje de proteína Wilmink Papajcsik y Bodero

Porcentaje de curvas que convergieron; PCSIG: Porcentaje de curvas significativas (p<0.05); PAIC: Porcentaje de curvas con el valor más bajo de AIC; PBIC: Porcentaje de curvas con el valor más bajo de BIC; R2: Coeficiente de determinación y PR2: Porcentaje de curvas con el valor más alto de R2.

Figura 1. Curvas de lactancia según el modelo de Wood para producción de leche de vacas Holstein en Antioquia.

Las mayores producciones de leche fueron alcanzadas en los partos 3, 4 y 5, obteniendo las mayores producciones iniciales y al pico de producción. El parto 1 obtuvo las menores producciones durante toda la lactancia (Figura 1). En el porcentaje de grasa, los valores iniciales más altos fueron en los partos 5 y 6, en el porcentaje de proteína fueron en los partos 2 y 5. Las curvas de lactancia para porcentaje de proteína, a diferencia de las curvas para porcentaje de grasa, se caracterizaron por presentar después del pico mínimo de producción una producción muy constante durante toda la lactancia. Por el contrario, los valores porcentuales de la grasa incrementaron hacia el final de la lactancia (Figuras 2 y 3). Los estimativos para las derivadas de las curvas de lactancia del modelo de Wood se encuentran en la tabla 3. La variable días al pico (tpico) no presentó diferencias significativas (p>0.05) entre cada uno de los partos y años de parto en las características producción de leche y porcentaje de grasa y proteína (Tabla 3). Para la producción de leche las variables β0 y Ymax presentaron distribuciones muy

2518

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Figura 2. Curvas de lactancia según el modelo de Wood para porcentaje de grasa de vacas Holstein en Antioquia.

similares, donde los mayores valores se encontraron en el parto 3 y el menor valor en el parto 1 con diferencia significativa (p<0.05). Caso contrario se observa en los porcentajes de grasa y proteína, donde para las variables β0 y Ymax los mayores valores se observan en animales de primer parto y los menores valores en animales de tercer parto (Tabla 3).

Figura 3. Curvas de lactancia según el modelo de Wood para porcentaje de proteína de vacas Holstein en Antioquia.

Las características β0 y Ymax han disminuido en el transcurso de los años pero sin diferencia significativa (p>0.05), en los porcentajes de grasa y proteína β0 y Ymax han aumentado presentando inclusive diferencias significativas (p<0.05) entre los años 2007 y 2009 (Tabla 3).

Tabla 3. Medias y Desviaciones Estándar de variables asociadas a la producción de leche estimadas en seis partos y en tres años de partos en vacas Holstein de Antioquia. Producción de Leche

Porcentaje de Grasa

Porcentaje de Proteína

β0

tpico

Ymax

β0

tpico

Ymin

β0

tpico

Ymin

Media ± SD

16.8c ± 0.60

35.5a ± 1.55

27.4c ± 0.50

4.79a ± 0.18

71.9a ± 2.87

3.13a ± 0.04

3.40a ± 0.07

87.0a ± 3.21

3.04a ± 0.01

19.3b ± 0.55

29.3a ± 1.42

31.9b ± 0.46

4.66a ± 0.17

70.0a ± 2.78 3.04ab ± 0.03 3.31a ± 0.07

85.9a ± 3.15

3.02a ± 0.01

20.0a ± 0.60

28.1a ± 1.55

33.3a ± 0.49

4.54b ± 0.19

69.6a ± 3.09

2.98b ± 0.04

3.25a ± 0.08

84.3a ± 3.43

3.02a ± 0.02

19.9a ± 0.67

31.4a ± 1.73

33.1a ± 0.56

4.61ab ± 0.21 63.2a ± 3.37

3.02b ± 0.05

3.27a ± 0.09

84.2a ± 3.74

3.00a ± 0.02

19.1b ± 0.76

29.7a ± 1.96

33.1a ± 0.63

4.70a ± 0.22

73.4a ± 3.54 3.07ab ± 0.05 3.21a ± 0.09

86.1a ± 4.15

3.00a ± 0.02

≥6

18.9b ± 0.75

32.7a ± 1.95

32.4b ± 0.62

4.90a ± 0.22

70.4a ± 3.53

3.21a ± 0.05

3.39a ± 0.09

86.9a ± 3.74

3.03a ± 0.03

4.42b ± 0.15

72.8a ± 4.41

2.91b ± 0.06

3.09b ± 0.12

85.1a ± 5.23

2.95b ± 0.02

Parto

Año de Parto 2007

20.3a ± 0.60

32.9a ± 1.56

32.5a ± 0.50

2008

19.4a ± 0.38

31.1a ± 0.97

31.5a ± 0.31

2009

19.1a ± 0.52

29.5a ± 1.49

31.0a ± 0.48

4.63ab ± 0.11 68.9a ± 1.84 3.10ab ± 0.02 3.20ab ± 0.05 82.6a ± 1.99 3.02ab ± 0.01 4.89a ± 0.27

67.6a ± 2.46

3.15a ± 0.03

3.34a ± 0.06

80.6a ± 2.80

3.06a ± 0.01

Letras diferentes en la misma columna indican diferencia significativa según la prueba de Tukey - Kramer (p≤0.05). β0=Coeficiente que está relacionado con la producción inicial de leche o con el porcentaje inicial de grasa y proteína (modelo de Wood). tpico = Día en la cual se alcanza el pico de producción máximo (producción de leche) o mínimo (porcentaje de grasa y proteína) (modelo de Wood). Ymax o Ymin = Producción de leche en el pico máximo o porcentaje de grasa y proteína en el pico mínimo de lactancia (modelo de Wood).

Cañas - Modelación para producción de leche, grasa y proteína en bovinos

DISCUSIÓN Los valores de PAIC, PBIC y PR2 encontrados en el modelo de Wood para las variables porcentaje de grasa y proteína indican que es el modelo más apropiado para modelar curvas de lactancia en grasa y proteína. En la producción de leche, pese a que el modelo de Wilmink presentó los valores más altos de PAIC y PBIC, no es el modelo más apropiado debido al bajo valor que presentó de PR2, siendo este el más bajo de los cuatro modelos (Tabla 2). Para grasa y proteína, Quinn et al (10) compararon entre los modelos de Wood, Wilmink y Guo & Swalve, el modelo de Wilmink obtuvo mejor bondad de ajuste y capacidad para predecir la producción total de grasa y proteína. Estos resultados difieren a los encontrados en este trabajo, donde el modelo de Wilmink presentó los peores ajustes (Tabla 2). Esto puede explicarse debido a que el modelo de Wilmink, en comparación con el modelo de Wood, no presenta buenos ajustes cuando la curva tiene una forma opuesta a la de producción de leche; además tiende a sobrestimar la producción al final de la lactancia, especialmente en los porcentajes de proteína (2, 10). Las gráficas de producción de leche en comparación con las gráficas de porcentaje de grasa muestran una relación inversa, donde los mayores valores de producción coinciden con los menores valores de porcentaje de grasa. Gráficas similares fueron encontradas por Silvestre et al (7) y Quinn et al (10), quienes mostraron esta relación inversa entre la producción de leche y los porcentajes de grasa y proteína. Sin embargo, estos autores muestran una gráfica de porcentaje de proteína que incrementa sus valores hacia el final de la lactancia, resultados que difieren a los obtenidos en este trabajo, donde el porcentaje de proteína después del pico de lactancia permanece constante (Figuras 1, 2 y 3). Esta premisa es debida a que el porcentaje de proteína no se ve fuertemente afectado por cambios en la dieta, ni por efectos de

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dilución cuando la producción de leche disminuye al finalizar la lactancia. Según Silvestre et al (7), en los porcentajes de grasa y proteína, el punto más bajo (Ymin) aumenta del primer al segundo parto y permanece constante durante los demás partos. En este trabajo se observó que la proteína permanece constante entre los diferentes partos pero en el caso de la grasa se observaron diferencias significativas entre los partos (Tabla 3). A medida que aumenta la edad o el número de lactaciones aumenta la producción de leche y desciende los porcentajes de grasa y sólidos totales. A partir de la cuarta lactación los porcentajes de los componentes sólidos vuelven a incrementarse, principalmente en el porcentaje de grasa, el contenido proteico apenas se modifica (7, 10, 11). Rodríguez et al (11), analizando producción de leche en ganado Holstein encontraron que hembras de primer parto presentan un pico de producción bajo comparadas con hembras multíparas. Resultados similares a los obtenidos en este trabajo (Tabla 3). En conclusión, el modelo de Wood fue el modelo que mejor explicó las curvas de lactancia para producción de leche y para los porcentajes de grasa y proteína. En este modelo los factores de número y año de parto fueron los más influyentes en cada uno de los parámetros estimados. La curva de lactancia para el porcentaje de proteína se caracterizó por ser muy consistente y no presentar mayores fluctuaciones durante toda la lactancia.

Agradecimientos Los autores agradecen al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y al Fondo Nacional del Ganado por la financiación de este trabajo e igualmente al apoyo dado por la Corporación Antioquia Holstein y de cada una de las haciendas en la elaboración del control lechero. Este artículo hace parte del proyecto de grado de maestría en Ciencias Animales del primer autor.

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REFERENCIAS 1. Pérez PL, Anrique GR, González VH. Factores no genéticos que afectan la producción y composición de la leche en un rebaño de pariciones biestacionales en la décima región de los lagos, Chile. Agr Tec Chile 2007; 67(1):39-48. 2. Quintero JC, Serna J, Hurtado N, Rosero R, Cerón M. Modelos matemáticos para curvas de lactancia en ganado lechero. Rev Col Cienc Pec 2007; 20:149-156. 3. García SC, Holmes CW. Lactation curves of autumn- and spring-calved cows in a pasture-based dairy system. Livest Prod Sci 2001; 68:189-203. 4. Wood PDP. Algebraic model of the lactation curve in cattle. Nature 1967; 216:164-165. 5. Wilmink JBM. Comparison of different methods of predicting 305 – day milk yield using means calculated from within herd lactation curves. Livest Prod Sci 1987; 17:1-17. 6. Brody S, Ragsdale AC, Turner The relation between the initial and the subsecuent decline of secretion following parturition. J Physiol 1924; 6:541-545.

CW. rise milk Gen

7. Silvestre AM, Martins AM, Santos VA, Ginja MM, Colaço JA. Lactation curves for milk, fat and protein in dairy cows: A full approach. Livest Sci 2009; 122: 308-313. 8. Papajcsik IA, Bodero J. Modeling lactation curves of Friesian cows in a subtropical climate. Anim Prod 1988; 47:201-207. 9. SAS/STAT: Guide for Personal Computer [programa de ordenador]. Versión 9.1 Cary (NC): SAS Institute Incorporation; 2006. 10. Quinn N, Killen L, Buckley F. Modelling fat and protein concentration curves for Irish dairy cows. Irish J Agr Food Res 2006; 45:13-23. 11. Rodríguez ZL, Ara GM, Huamán UH, Echevarría CL. Modelos de ajuste para curvas de lactación de vacas en crianza intensiva en la cuenca de Lima. Rev Inv Vet Perú 2005; 16(1):1-12.

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Rev.MVZ Córdoba 16(2):2521-2527, 2011.

ORIGINAL

Eficiencia de la respuesta superovulatoria del ganado Brahman al protocolo P-24 Efficiency of superovulatory response to P-24 protocol in fixed time embryo transfer in Brahman cattle Roger Salgado O,1* M.Sc, Andrés Mejía A,2 MVZ, Pablo Suárez S,2 MVZ. Univesidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Ciencias Pecuarias A.A 354 Montería, Colombia. 2MVZ Ejercicio particular. *Correspondencia: rdsalgado@sinú. unicordoba.edu.co. 1

Recibido: Octubre de 2009; Aceptado: Diciembre de 2010.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la eficiencia de la respuesta superovulatoria del ganado Brahman al protocolo P-24. Materiales y métodos. Se utilizaron doce vacas Brahman donadoras con más de 60 días postparto, a las cuales se les realizó un total de 21 tratamientos superovulatorios con base en el protocolo P-24. Se realizó la colecta de los embriones a través del método convencional y los embriones fueron clasificados (IETS). Resultados. Se obtuvo un promedio de 9.1 estructuras, 4.4 embriones transferibles, 3.7 embriones congelables y 3.2 embriones degenerados recuperados por colecta. Los estadíos de desarrollo que predominaron fueron mórula (32.6%), blastocisto temprano (38%) y blastocisto (18.5%). Se presentó efecto (p<0.05) del número de superovulaciones sucesivas sobre la producción de embriones congelables. Sin embargo, no hubo efecto (p>0.05) sobre las demás variables estudiadas. Se presentó efecto (p<0.05) de la producción promedio de estructuras recuperadas, embriones transferibles y congelables entre las donadoras con una producción mayor o igual a 5, y menor a 5 embriones transferibles. Por el contrario, no hubo efecto (p>0.05) de la producción promedio de embriones degenerados y ovocitos sin fecundar entre ambos grupos. No obstante, la proporción de éstos fue mayor en las donadoras con una menor producción de embriones transferibles (50 y 22.4%) vs. las donadoras con mayor producción (39.3 y 14%) para embriones degenerados y ovocitos sin fecundar respectivamente. Conclusiones. El ganado Brahman tuvo una respuesta superovulatoria eficiente al protocolo P-24 para transferencia de embriones a tiempo fijo. Palabras clave: Brahman, ganado, superovulación, transferencia de embriones. (Fuente: AIMS).

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ABSTRACT Objective. To evaluate the efficiency of superovulatory response to P-24 protocol in fixed time embryo transfer in Brahman cattle. Materials and methods. Twelve Brahman cows donors with more than 60 days postpartum were used. Twenty one cows received a superovulatory treatment based in Protocol P-24. Embryos were collected through the conventional method, and the embryos were classified (IETS). Results. An average of 9.1 embryos were collected, 4.4 were considered for direct transfer, 3.7 were considered for freezing and 3.2 were classified as degenerated. According to the stage embryos were classified as: morulae (32.6%), early blastocyst (38%) and blastocyst (18.5%). Effect was presented (p<0.05) in the number of successive superovulations on the production of frozen embryos; however, there was no effect (p>0.05) on the other variables studied. Effect was presented (p<0.05) in the average production of structures recovered, and transferable and frozen embryos among the donors with an output greater than or equal to 5, and less than 5 transferable embryos. By contrast, there was no effect (p>0.05) on the average production of degenerate embryos and unfertilised oocytes among both groups. Nevertheless, the proportion of these ones is greater in the donors with a lower production of transferable embryos (50 and 22.4%) vs. donor with the highest production (39.3 and 14%) for degenerated embryos and unfertilised oocytes respectively. Conclusions. The Brahman cattle has an efficient superovulatory response to P-24 protocol for fixed time embryo transfer. Key words: Brahman, cattle, embryo transfer, superovulation. (Source: AIMS).

INTRODUCCIÓN En Colombia y en Latinoamérica existe una creciente demanda para multiplicar animales de alto valor genético, de razas Bos taurus indicus por su capacidad de adaptación y de producción bajo condiciones climáticas de trópico bajo. La transferencia de embriones está siendo cada vez, la técnica más utilizada en todo el mundo para aprovechar el potencial genético de animales superiores (1). Esta técnica consiste en inducir ovulaciones múltiples mediante tratamientos hormonales en hembras donantes, que son inseminadas y siete días después son colectados los embriones, los cuales pueden ser congelados o transferidos en fresco a hembras receptoras que sirven de madres sustitutas. El éxito de un programa de transferencia de embriones se mide por el número de terneros que nacen vivos por hembra donante en un determinado lapso de tiempo (2). Una de las limitantes de la transferencia de embriones es la variación existente en la respuesta súper estimulante en bovinos (3).

La sincronía de la ovulación es uno de los factores reportados como causa de pobre respuesta superovulatoria (2). Existen algunos estudios en donde se han utilizado inductores de ovulación para asegurar un pico preovulatorio de LH en vacas superovuladas y se ha realizado el retraso del retiro del dispositivo intravaginal de progesterona, en el cual la fuente de progesterona se mantiene hasta 24 ó 36 horas después de la aplicación de PGF2α, con el propósito de que los folículos mas pequeños tengan mayor tiempo para adquirir la capacidad ovulatoria, y mejorar así la sincronía de la ovulación en las donadoras (1-3). Estos trabajos han sido realizados principalmente en hembras de raza Nelore, necesitando evaluar su efecto en las hembras de raza Brahman (1). El objetivo de este trabajo fue evaluar la eficiencia en la respuesta superovulatoria en bovinos de la raza Brahman al protocolo P-24.

Salgado - Eficiencia de la respuesta superovulatoria del ganado Brahman

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. Se realizó un estudio de tipo experimental, descriptivo y prospectivo, el cual se llevó a cabo entre los meses de Mayo y Octubre de 2008. Sitio de estudio. Se realizó en la granja de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba, ubicada en el corregimiento de Berástegui, Municipio de Ciénaga de Oro, departamento de Córdoba. La zona corresponde a bosque húmedo tropical, altitud de 10 msnm, temperatura promedio de 32°C, humedad relativa de 84% y precipitación anual de 1100 mm. Unidades experimentales y normas de manejo. Se utilizaron 12 vacas Brahman comercial, cíclicas, multíparas; con edades entre 6 y 7 años; de más de 60 días posparto; con un puntaje de condición corporal de 3.5 (escala de 1 a 5) obedeciendo al criterio adoptado por Parker (4); y que se encontraban aptas reproductivamente para programas de transferencia de embriones (Clínicamente sanas, libres de enfermedades reproductivas, adecuado estado anatómico y fisiológico del tracto reproductivo en general). Los animales fueron manejados en condiciones de pastoreo, en potreros con oferta forrajera de Angleton (Dichantium aristatum), disposición permanente de agua y sal mineralizada a voluntad, fueron previamente desparasitadas y se les aplicó vitaminas y minerales (Calfosvit Se California®, 20 cm por vía intramuscular durante 3 días), antes de comenzar la superovulación. Todos los animales recibieron el protocolo hormonal P-24, diseñado por Zanenga et al (5): Día 0. Aplicación de un dispositivo intravaginal de progesterona (DIBSintex®), más 2.5 mg de benzoato de estradiol (Sintex®) y 50 mg de progesterona (Gestavec, Vecol®), ambos por vía intramuscular. Día 4: Inicio del tratamiento superovulatorio utilizando una dosis total de 240 mg de FSH (Foltropin-V, Bioniche®), con un esquema de ocho inyecciones por vía intramuscular

2523

(6:00 a.m. y 6:00 p.m.) dosificadas en forma decreciente (40%,30%, 20% y 10% de la dosis total). Día 6: Aplicación intramuscular de dos inyecciones de 150 µg de D+cloprostenol (Calier®) (6:00 a.m. y 6:00 p.m.). Día 7: Retiro del DIB por la mañana (6:00 a.m.). Día 8: Aplicación intravenosa de 0.25mg de GnRH (Fertagyl, Intervet®) por la mañana (6:00 a.m.) e inseminación artificial a tiempo fijo a las 12 y 24 horas después de la aplicación de la GnRH (Día 8: 6 p.m. y Día 9: 6 a.m.) con semen congelado de probada calidad del mismo toro y del mismo lote. Las donadoras se superovularon en grupos de 3, aquellas vacas que fueron sometidas al experimento para obtener embriones más de una vez, tuvieron un periodo de descanso de 2 meses entre episodios de superovulación, para un máximo de 3 tratamientos superovulatorios por vaca. De las 12 donadoras que se manejaron en el experimento, 12 fueron superovuladas por primera vez, 6 por segunda vez y 3 por tercera vez, para un total de 21 tratamientos de superovulación. Colecta, clasificación y calificación de embriones. El día 15 por la mañana (7 días después de aplicado el inductor de ovulación) se realizó la colecta de los embriones a través del método convencional, en donde se evaluó la respuesta ovárica al tratamiento superovulatorio con ayuda de un ecógrafo, dotado de un transductor lineal de 7.5 Mhz; se realizó la anestesia epidural de la donante y luego se introdujo y se fijó un catéter armado a partir de una sonda de Foley en la curvatura mayor de cada cuerno uterino (6). Esta sonda a su vez se conectó a un circuito cerrado de 2 vías, a través de una de ellas, fue introducido el medio de lavado (PBS+1% de Suero Fetal Bovino) de forma interrumpida, en cantidades de 30 a 50 ml hasta completar 500 ml por cada cuerno; y a través de la otra se recogió el medio con los embriones en un filtro plástico en donde se colectaron los embriones (6). El volumen de la solución que contuvo los embriones fue depositado en placas de Petri en donde se realizó la búsqueda, clasificación y calificación de

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los embriones según las normas de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (IETS)(7).

una producción promedio mayor o igual, y menor a 5 embriones transferibles se realizó a través de una prueba T de Student.

Determinación del número de estructuras recuperadas, embriones transferibles y congelables por colecta. La búsqueda y clasificación de los embriones de acuerdo a su estadio, se realizó en el Laboratorio de Reproducción Animal Tropical (LABRA) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba, y se determinó por medio de un estereoscopio Nikon SMZ645 y aumentos utilizados de 100 x, el número total de estructuras recuperadas y el número de embriones transferibles, congelables y degenerados por colecta.

RESULTADOS

Respuesta a los tratamientos de superovulación sucesivos. Para efectos de evaluar las respuestas a los tratamientos de superovulación sucesivos realizados, se agruparon las respuestas de los animales superovulados por primera, segunda y tercera vez. Respuesta superovulatoria de donadoras con una producción promedio mayor o igual a 5, y menor a 5 embriones transferibles. Se agruparon las vacas de acuerdo con la producción promedio de embriones transferibles (mayor o igual a 5 y menor a 5), durante los 21 lavados realizados, con el fin de comparar la respuesta superovulatorias en ambos grupos. Análisis estadístico. La determinación del número de estructuras recuperadas, estadio de desarrollo embrionario, número de embriones transferibles, congelables y degenerados del total de colectas, se realizó a través de estadística descriptiva.

Número de estructuras, embriones transferibles, congelables y degenerados recuperados por colecta de las donadoras. Los resultados de la tabla 1 muestran que el número de estructuras, embriones transferibles, congelables y degenerados recuperados por colecta fue de: 9.1, 4.4, 3.7 y 3.2 respectivamente. Tabla 1. Número de estructuras, embriones transferibles, congelables y degenerados (promedio ± desviación) del protocolo P24 en donadoras Brahman. P-24 en donadoras Brahman* Número de animales Número de Estructuras

12 9.14±5.62

Embriones Transferibles

4.4±3.87

Embriones Congelables

3.71±3.85

Embriones Degenerados

3.19±3.09

* Los resultados expuestos corresponden al promedio de un total de 21 réplicas.

Estadio de desarrollo de los embriones. En la figura 1 se muestra el porcentaje encontrado para cada uno de los estadios de desarrollo embrionario obtenidos. Los resultados muestran que los estadios de desarrollo embrionario predominantes

La evaluación del efecto que ejerce el número de superovulaciones sobre la respuesta ovárica se realizó a través de un análisis de varianza (ANAVA) y se establecieron diferencias significativas por medio de la prueba de Duncan. La evaluación de superovulatoria de las

la respuesta donadoras con

Figura 1. Estadios de desarrollo embrionario obtenidos con el protocolo P-24.

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Salgado - Eficiencia de la respuesta superovulatoria del ganado Brahman

fueron los estadios de mórula, blastocisto temprano y blastocisto con 32.6, 38 y 18.5% respectivamente. En menor grado se encontraron los estadios de blastocisto expandido y eclosionado, con 9.8 y 1.1% respectivamente. Número de superovulaciones (1º, 2º y 3º repetición) y su efecto sobre la respuesta superovulatoria en ganado Brahman. Se presentó efecto (p<0.05) del número de superovulaciones sobre la producción de embriones congelables en los tratamientos sucesivos, (Tabla 2). Sin embargo, no hubo efecto (p>0.05) del número de tratamientos sucesivos sobre las demás variables que hacen parte de la respuesta superovulatoria (embriones transferibles, degenerados y ovocitos sin fertilizar). Tabla 2. Efecto del número de tratamientos superovulatorios sucesivos sobre la respuesta superovulatoria en donadoras Brahman. Donadoras 1a Donadoras 2a Donadoras 3a Superovula- Superovula- Superovulación* ción** ción***

Valor de P

Nº de Estructuras

8.91±6.08a

8.66±4.80a

11.07±7.0a

0.838

Embriones Transferibles

5.58±4.46a

2.66±1.75a

3.0±3.6a

0.163

Embriones Congelables

5.33±4.2a

2.16±1.60b

0.33±0.57bc

0.034

Embriones Degenerados

2.0±2.17

4.16±3.31

6.0±4.3

Ovocitos sin Fertilizar

1.33±2.3

1.83±2.4

2.0±2.64

Tabla 3. Respuesta superovulatoria de donadoras con una producción promedio mayor o igual a 5, y menor a 5 embriones transferibles. Donadoras con producción ≥ a 5 embriones transferibles

Nº animales Nº Estructuras por donadora Embriones transferibles por donadora Embriones congelables por donadora Embriones degenerados por donadora Ovocitos sin fertilizar

Donadoras con producción < a 5 embriones transferibles

12.93±5.05ª

5.19±3.32b

6.97±2.27ª

1.95±1.30b

6.0±2.85ª

1.88±1.17b

4.03±2.47ª

1.83±1.59a

2.60±1.67ª

1.40±2.96a

Letras diferentes en una significativamente (p<0.05).

misma

fila

difieren

En cuanto al número de embriones degenerados y ovocitos sin fertilizar, no se presentó efecto (p>0.05) de ambos grupos sobre el promedio de éstos (Tabla 4). Tabla 4. Proporción de embriones degenerados y ovocitos sin fertilizar de donadoras con una producción promedio mayor o igual a 5, y menor a 5 embriones transferibles. Donadoras con producción ≥ a 5 embriones transferibles

Donadoras con producción < a 5 embriones transferibles

Total estructuras

139

0.575

Total embriones recuperados

117

0.768

Proporción embriones degenerados (%)

46/117 (39.3)

21/42 (50)

18/139 (12.94)

12/53 (22.64)

Letras diferentes en una misma fila indican diferencia estadística (p<0.05). *Los resultados son de un total de 12 réplicas. **Los resultados son de un total de 6 réplicas. ***Los resultados son de un total de 3 réplicas

Comparación entre la respuesta superovulatoria de donadoras con una producción promedio mayor o igual a 5, y menor a 5 embriones transferibles en los tratamientos superovulatorios realizados. Se presentó efecto (p<0.05) entre el promedio de estructuras y el promedio de embriones transferibles y congelables colectados por donadora de ambos grupos, tal como se observa en la tabla 3. Sin embargo, no hubo efecto (p>0.05) entre el número de embriones degenerados y el número de ovocitos sin fertilizar en ambos grupos.

Proporción de ovocitos sin fertilizar (%)

DISCUSIÓN El número de estructuras recuperadas por colecta que se obtuvo en el presente estudio fue similar a lo comunicado por Martins et al (8) y Baruselli et al (3) en vacas Nelore con promedios de 7.4 y 10.6 respectivamente; y por Bo et al (9) en vacas y novillas Angus y Brangus con un promedio de 9.1 estructuras recuperadas. El número de embriones transferibles recuperados por colecta en vacas Brahman, fue similar a lo reportado por Bo et al (9) en

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

vacas Angus y Brangus quienes obtuvieron 5.4 embriones transferibles por donadora. De igual manera Martins et al (8) y Baruselli et al (3) obtuvieron promedios similares de 6 y 6.5 embriones transferibles en vacas Nelore. En cuanto al número de embriones congelables obtenidos por colecta en el presente estudio, resultados similares han sido reportados por Martins et al (8) y Baruselli et al (3) con un promedio de 5.6 y 5.7 respectivamente, en vacas Nelore. El número de embriones degenerados obtenido en vacas Brahman es similar a lo comunicado por Zanenga et al (5) en vacas Nelore con un promedio de 4.8, sin embargo, Martins et al (8) reportaron un promedio inferior (0.7 embriones degenerados por donadora), en vacas Nelore. Con relación al estadio de desarrollo, los resultados obtenidos siguen el mismo patrón porcentual a lo reportado por Linder et al, citado por Palma (6), quienes obtuvieron una mayor cantidad de embriones en los estadios de mórula, blastocisto temprano y blastocisto con un 37, 30 y 23% respectivamente, y en menor grado reportaron los estadios de blastocisto expandido con un 6% y blastocisto eclosionado con un 1%. Resultados similares también han sido comunicados por Kauffold et al citado por Palma (6), en donde predominaron los estadios de mórula, blastocisto temprano y blastocisto con un 32.9, 26.4 y 19.1% respectivamente, y en menor grado reportaron un 0.9% de blastocistos expandidos y un 0.4% de blastocistos eclosionados. Estos resultados demuestran que el protocolo P-24 ejerce un efecto positivo sobre la sincronía de la ovulación, lo cual se ve reflejado en una mayor proporción de embriones con estadios de desarrollo de mórula, blastocisto temprano y blastocisto recolectados, en el día 7 pos inseminación. Los resultados relacionados con la producción de embriones transferibles obtenidos en el presente trabajo, coinciden con lo reportado por Hasler (10), quien no

encontró efecto negativo sobre la producción de embriones transferibles en vacas Angus superovuladas en promedio 13.8 veces; y a lo reportado por Donaldson y Perry, citados por Palma (6), quienes no hallaron variación en la producción de embriones transferibles a lo largo de 10 tratamientos sucesivos. No obstante, Warfield et al, citado por Palma (6), encontraron disminución en la producción de embriones transferibles a partir del tercer tratamiento. Un importante hallazgo en el presente estudio fue que los tratamientos sucesivos disminuyeron significativamente la producción de embriones congelables. Este hecho podría ser atribuido al incremento en la dosis de gonadotropina empleada de un tratamiento a otro; resultado coincidente con lo comunicado por Donaldson (11). Adicionalmente se podría considerar una asincronía en el crecimiento folicular, donde los folículos más maduros serían los primeros en producir grandes cantidades de estrógenos. Por lo tanto, los oocitos dentro de estos folículos estarían expuestos a altas concentraciones de estrógenos por largos periodos antes de la ovulación; esto podría ser la causa de la disminución en la calidad embrionaria (6) La mayor producción de embriones transferibles se obtuvo a partir de vacas que tuvieron mejor respuesta superovulatoria; a pesar que en el presente estudio no se estudiaron las poblaciones foliculares de los animales, el hecho que existiera un grupo de animales con una mejor respuesta superovulatoria (> 5 embriones) podría ser atribuido a la variación en el número de folículos durante las onda, dado que las vacas que presentan gran número de folículos durante las ondas foliculares responden mejor a la superovulación; adicionalmente estas poblaciones foliculares durante la onda tiene una alta repetibilidad (0.84) dentro de individuos (12). Por otra parte, el grupo de vacas con pobre respuesta superovulatoria (< 5 embriones transferibles) tuvo alta repetibilidad, resultados similares han sido reportados por Peixoto et al, citado por Palma (6), quienes encontraron que las respuestas pobres a un primer tratamiento superovulatorio en ganado Bos taurus

Salgado - Eficiencia de la respuesta superovulatoria del ganado Brahman

indicus, oscilo entre moderada y alta. Los resultados obtenidos con el protocolo P-24 en vacas Brahman se encuentran dentro del rango de producción de estructuras recuperadas, embriones transferibles, congelables y degenerados publicados en la literatura reportada. En conclusión estos hallazgos sugieren que el protocolo P-24 es viable para obtener

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una respuesta superovulatoria eficiente en programas de superovulación y transferencia de embriones a tiempo fijo en donadoras de raza Brahman.

Agradecimientos A la Universidad de Córdoba, y al CIUC por la financiación de este proyecto FMV-06-04.

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Zanenga CA, Marques MO, Santos IC, Valentin R, Baruselli PS. Comparacao entre dois protocolos de superovulacao com inseminacao artificial em tempo fixo em vacas Nelore (Bos indicus). In: XVII Reuniao anual da sociedade brasileira de tecnología de embrioes; 2003, Fortaleza, Brasil. Acta Sci Vet; 2003.

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10. Hasler JF. Comparation between conventional in vivo and in vitro production of embryos in bovine embryo transfer programs. En: Congreso de Reproducciòn Animal, Rosario, Argentina; 2000. 11. Donalson L. Dose of FSH-p as a source of variation in embryo production from superovulated cows. Theriogenology 1984; 22:205-212. 12. Ireland JJ, Ward F, Jimenez F, Ireland JLH, Smith GW, Lonergan P et al. Follicle numbers are highly repeatable within individual animals but are inversely correlated with FSH concentrations and the proportion of good – quality embryos after ovarian stimulation in cattle. Human Reproduction 2007; 22: 1687-95.

Rev.MVZ CórdobaREVISTA 16(2):2528-2537, 2011. • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 2528 MVZ CÓRDOBA

ORIGINAL

Evaluación química y organoléptica del ensilaje de maralfalfa (Pennisetum sp.) más yuca fresca (Manihot esculenta) Chemical and organoleptic evaluation of maralfalfa silage (Pennisetum sp.) plus fresh cassava (Manihot esculenta) Libardo Maza A,

M.Sc, Oscar Vergara G,

Ph.D, Elisa Paternina D,

MVZ.

Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Semillero de Investigación en Nutrición y Alimentación Animal “TALENTO”, Montería, Colombia. 2Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Grupo de Investigación en Reproducción Animal, Montería, Colombia. *Correspondencia: overgara@sinu.unicordoba.edu.co

Recibido: Octubre de 2009; Aceptado: Diciembre de 2010.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la composición química y características organolépticas del ensilado de maralfalfa (Pennisetum sp.) más diferentes proporciones de yuca fresca (Manihot esculenta). Materiales y métodos. Se evaluaron 4 tratamientos (T) de ensilaje de maralfalfa más diferentes proporciones de yuca fresca: 0% (Tratamiento 1, Control), 5% (Tratamiento 2), 10% (Tratamiento 3) y 15% (Tratamiento 4). Se determinaron las proporciones de fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente ácido (FDA), lignina, fracción de materia seca (MS), extracto etéreo (EE), cenizas y proteína bruta (PB). Además, se evaluaron las características organolépticas. Para evaluar las variables nutricionales del ensilaje, se utilizó un diseño completamente aleatorizado y los datos se analizaron a través de un análisis de varianza y la prueba de polinomios ortogonales. Para la evaluación del consumo y variables organolépticas se utilizaron 20 novillas, a las que se les ofreció 30 kg de ensilaje por cada tratamiento, analizando los resultados a través de estadística descriptiva. Resultados. Las variables nutricionales mostraron diferentes tipos de tendencias polinómicas. La MS y EE tuvieron comportamiento lineal, la lignina cuadrático y la PB, cenizas, FDN, FDA y pH comportamiento cúbico. Las características organolépticas para T3 y T4, fueron excelentes. El consumo promedio de T1, T2, T3 y T4 fue 4.66, 4.42, 4.58 y 4.74 kg, respectivamente. Conclusiones. La inclusión de raíz de yuca contribuyó favorablemente en la calidad nutricional del ensilaje de maralfalfa y sus características organolépticas. Palabras clave: Calidad del producto, ensilaje, materia seca, proteína cruda, pruebas organolépticas, suplementos nutricionales. (Fuente: CAB).

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Maza - Evaluación química y organoléptica del ensilaje de maralfalfa

2529

ABSTRACT Objective. To evaluate the chemical composition and the organoleptic traits of maralfalfa silage (Pennisetum sp.), containing different proportions of fresh cassava (Manihot esculenta). Materials and methods. Four treatment (T) groups of maralfalfa silage containing different percentage of fresh cassava were compared: 0% (Treatment 1, Control), Treatment 5% (Treatment 2), 10% (Treatment 3), and 15% (Treatment 4). Neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF), lignin, fraction of dry matter (DM), ether extract (EE), ash, and crude protein (CP) were analyzed by an analysis of variance and orthogonal polynomials. In addition, consumption and organoleptic traits were also analyzed using descriptive statistics, in 20 heifers, that received 30 kg of silage per treatment. Results. Nutritional variables showed different types of polynomial trends. DM and EE were linear trends, lignin was quadratic, and CP, ash, NDF, ADF, and pH were cubic trends. Organoleptic traits for T3 and T4 were excellent. The average consumption for T1, T2, T3 and T4 was 4.66, 4.42, 4.58, and 4.74 kg, respectively. Conclusions. The inclusion of fresh cassava root contributed positively in the nutritional quality of maralfalfa silage and organoleptic traits. Key words: Crude protein, dry matter, nutritional supplements, organoleptic traits, product quality, silage making. (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN En el trópico bajo colombiano la principal fuente de alimento para el ganado son las pasturas, ya sean nativas o mejoradas, en las cuales la calidad y/o cantidad son características necesarias para llenar los requerimientos nutricionales de los animales. Sin embargo, estas dos propiedades son variables durante el año, ya que dependen de los períodos climáticos (seco y lluvioso) y de las características físico-químicas del suelo. Ante la escasez de forrajes que se presenta en la época seca, los pastos de corte se utilizan como alternativa alimenticia en la producción bovina, proporcionando un rendimiento por hectárea mayor. Recientemente se ha iniciado el uso del pasto maralfalfa (Pennisetum sp) como pasto de corte en la alimentación de ganado de leche, doble propósito y carne en el trópico, quizás por el interés que ha generado en los productores por su buena calidad y alta producción de biomasa, características importantes para ser ensilado (1-3). Sin embargo, varios son los estudios que muestran las imitaciones de este pasto, relacionados con su contenido nutricional y producción de forraje (2,4-8).

Por otra parte, el ensilaje es el proceso mediante el cual se conserva forraje verde, preferiblemente de alta calidad y alto contenido de carbohidratos solubles, almacenándose en un lugar llamado silo. El proceso de conservación se realiza por medio de la fermentación láctica y su éxito radica en permitir una degradación dentro de límites cortos de tiempo que impidan bruscas transformaciones en la composición del producto que se va a conservar (9,10). La calidad del ensilaje depende principalmente del grado de compactación y la cantidad de oxígeno que ha quedado en el material ensilado. Sin embargo, los niveles de materia seca y carbohidratos solubles son determinantes en la fermentabilidad de un ensilaje (11, 12), por lo que la inclusión de un mayor contenido de carbohidratos solubles, facilita la capacidad de fermentación y degradación de otros sustratos, por estimular el crecimiento de bacterias ácido lácticas (7). De acuerdo a lo anterior, se consideró de gran importancia realizar un estudio, en el cual se evaluó ensilaje de maralfalfa, al que se le adicionó diferentes proporciones de yuca fresca, para mejorar sus

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características fermentativas (13), como alternativa de alimentación bovina bajo las condiciones del trópico bajo colombiano. El objetivo de esta investigación fue evaluar la composición química y organoléptica del ensilaje de maralfalfa (Pennisetum sp.) más yuca fresca (Manihot esculenta) con el fin de proporcionarle a los productores información sobre el ensilaje de este pasto.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. El estudio se realizó en la hacienda Pamplona, en el municipio Planeta Rica, Córdoba. Esta zona pertenece a la clasificación de bosque seco tropical (14), presenta una temperatura promedio de 28ºC, precipitación promedio anual de 1850 mm y a una altura de 180 m.s.n.m. La maralfalfa utilizada para hacer el ensilaje se cosechó de un cultivo de 1.5 hectáreas, con 60 días de rebrote. La yuca se obtuvo de un cultivo de 2 hectáreas, con una edad de 8 meses, cosechando la raíz de la planta para adicionarla al ensilaje. Diseño experimental. Los tratamientos de los ensilajes evaluados fueron: T0=100% pasto maralfalfa; T1=95% pasto maralfalfa + 5% de yuca fresca; T2=90% pasto maralfalfa + 10% de yuca fresca; y T3=85% pasto maralfalfa + 15% de yuca fresca. Para cada tratamiento se utilizaron tres repeticiones, las cuales estaban constituidas por ensilajes depositados en tanques herméticos con capacidad de 40 litros que fueron distribuidos aleatoriamente en un sitio destinado para tal fin. El ensilaje fue compactado manualmente y se mantuvo en condiciones anaeróbicas por 21 días (10). Luego de destapado, se tomó una muestra de 500 g mezclando porciones de la parte inferior, media y superior de cada tanque por cada tratamiento y llevadas al laboratorio. Análisis de laboratorio. A las muestras se les determinó materia seca, por medio de deshidratación a 105°C por secado directo en una estufa al vacío, en el laboratorio de nutrición y alimentación animal de la Universidad de Córdoba.

En el laboratorio de bromatología de la Universidad Nacional, Sede Medellín, se realizaron los análisis de FDN, FDA y lignina por medio del método descrito por Van Soest y Wine (15). En los laboratorios de PREMEX (Medellín) fueron evaluados los contenidos de nitrógeno por medio del método de micro Kjeldahl (16). Las proporciones de extracto etéreo se evaluaron por el método de Soxhlet y cenizas por medio del método de residuo mineral fijo descritos por la AOAC (17). Evaluación de las características organolépticas. Se evaluaron al momento de destapar los ensilados, teniendo en cuenta la tabla de evaluación de ensilajes propuesta por Chaverrra y Bernal (18) (Tabla 1). Tabla 1. Características organolépticas para la evaluación de la calidad de ensilajes. INDICADOR EXCELENTE

BUENA

REGULAR

MALA

COLOR

Verde aceituna o amarillo oscuro

Verde amarillento. Tallos con Verde tonalidad oscuro mas pálida que las hojas

OLOR

A miel o azucarado de fruta madura

Agradable, con ligero olor a vinagre

Fuerte, Ácido olor a vinagre, (ácido butírico)

Desagradable, a mantequilla rancia.

Igual al anterior

Se separan las hojas fácilmente de los tallos tienden a ser transparentes y los vasos venosos muy amarillos.

No se observa diferencia entre tallos y hojas. Es más amorfa y jabonosa. Al tacto es húmeda y brillante.

TEXTURA

Conserva sus contornos continuos

Marrón oscuro, casi negro o negro.

Prueba de consumo. Para realizar la prueba de consumo, se escogieron aleatoriamente 20 novillas de la raza Brahman con edades de 20 a 24 meses, con un peso vivo promedio de 280 kg. Estos animales fueron distribuidos aleatoriamente en los tratamientos (5 por tratamiento). A cada grupo se le ofreció en horas de la mañana 30 kg ensilaje en una única ración por un lapso de 60 minutos. Antes del suministro del ensilaje, los animales se encontraban pastoreando en praderas de Brachiaria decumbens. El pesaje del ensilaje se realizó en una báscula colgante de reloj cada 15 minutos, por cada tratamiento evaluado, hasta terminado el lapso de tiempo.

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Maza - Evaluación química y organoléptica del ensilaje de maralfalfa

Para EE se encontró respuesta lineal (p<0.05), observándose una disminución de éste a medida que aumentaba la inclusión de yuca fresca al ensilaje (Figura 3). 2,25 2,20

%EE

Análisis estadístico. Para el análisis de las características nutricionales se realizó un análisis de varianza, a través del procedimiento GLM del paquete estadístico SAS 9.0 (19), para determinar si existía o no diferencia estadística entre los tratamientos. Además, se realizó la prueba de polinomios ortogonales para determinar la tendencia de las variables nutricionales, de acuerdo con el porcentaje de yuca fresca adicionado al ensilaje. Las características organolépticas y consumo se evaluaron por medio de estadística descriptiva.

2,15 2,10 y = -‐0,0079x + 2,214 R² = 0,42

2,05 2,00

RESULTADOS

% Yuca

Se observó una tendencia lineal (p<0.05) de la MS de acuerdo con los niveles de inclusión de yuca fresca (Figura 1), aumentando la MS a medida que aumentó el porcentaje de yuca fresca. 24 23 22

%MS

21 y = 0,25x + 19,56 R² =0,72

20 19

Figura 3. Regresión lineal del porcentaje de EE de acuerdo con el porcentaje de yuca fresca

En lo que respecta a las cenizas, estas tuvieron un comportamiento cúbico (p<0.001), según el porcentaje de yuca adicionado al ensilaje (Figura 4). Se puede notar que las concentraciones de cenizas tienden a ser similares en T0, T1 y T2 y tiende a aumentar en T3.

18 17

Figura 1. Regresión lineal del porcentaje de MS según el porcentaje de yuca fresca.

% PB

La tendencia de la PB según la inclusión de yuca fresca en el ensilaje fue cúbica (p<0.01). En la figura 2, se puede apreciar que el pico de PB se alcanza en T1, disminuye hacia T2 y tiende a aumentar en T3. 8 7 6 5 4 3 2 1 0

y = 0,0034x3 -‐ 0,087x2 + 0,514x + 6,424 R² = 0,83

% Yuca

Figura 2. Regresión cúbica del porcentaje de PB de acuerdo con el porcentaje de yuca fresca.

% Cenizas

% Yuca

10 8 6

y = 0,0058x3 -‐ 0,091x2 + 0,354x + 9,41 R² =0,99

4 2

0 0

% yuca

Figura 4. Regresión cúbica del porcentaje de cenizas según el porcentaje de yuca fresca

La figura 5 muestra la tendencia cúbica de FDN (p<0.001), según los niveles de inclusión de yuca fresca al ensilaje. Se puede notar que la mayor concentración de FDN se presentó en T0, disminuyendo hacia T1 y T2 y tendió a aumentar en T3. Las concentraciones de FDA presentaron tendencia similar que FDN (p<0.001).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 3,76

80 70

3,72

y = 0,0225x3 -‐ 0,464x 2 + 0,922x + 69,2 R² = 0,97

3,68 3,64

40 y = 0,0096x3 -‐ 0,147x 2 -‐ 0,645x + 48,6 R² = 0,98

3,56

%FDN

Figura 5. Regresión cúbica de FDN y FDA según el porcentaje de yuca fresca

Respecto al color, los tratamientos experimentales presentaron una cualificación excelente (tonalidad verde aceituna), mejor que los del tratamiento testigo (tonalidad verde amarillento). En cuanto al olor, T2 y T3 presentaron un olor excelente, similar al de fruta madura, característico de ensilajes de excelente calidad, superior al encontrado en T0 y T1. La textura tuvo un comportamiento bueno para T0, T1 y T2, mientras que para T3 fue excelente. En ninguno de los tratamientos se observó degradación del material ensilado, mostrando un buen nivel de conservación para todos los tratamientos. De acuerdo a lo anterior, se puede notar (Figura 8) que el aumento de los niveles de inclusión de yuca, mejoró significativamente las características organolépticas del ensilaje.

11 10

9 8

y = 0,017x2 -‐ 0,441x + 10,09 R² = 0,99 0

para el tratamiento en que se adicionó 15% de yuca, en el cual las características fueron excelentes. La figura 8 muestra las características organolépticas evaluadas en cada tratamiento.

Para la lignina se encontró tendencia cuadrática (p<0.001) y mostró una disminución a medida que los niveles de inclusión de yuca aumentaron a 5, 10 y 15% (Figura 6).

Figura 7. Regresión cúbica del pH según el porcentaje de yuca fresca

% Yuca

%FDA

% Lignina

y = 0,0003x3 -‐ 0,009x2 + 0,058x + 3,627 R² =0,92

3,6

% Yuca Figura 6. Regresión cuadrática del porcentaje de lignina según el porcentaje de yuca fresca

Excelente Bueno

El pH tuvo tendencia cúbica (p<0.001) y mostró un aumento de T0 a T1, luego disminuyó en T2 (pero a niveles mayores que en T0) y posteriormente aumentó en T3 (Figura 7). Los resultados obtenidos en este estudio, mostraron para las características organolépticas un mejor comportamiento

Regular Malo

Tratamientos Color

Olor

Textura

Figura 8. Características organolépticas para los diferentes tratamientos.

Maza - Evaluación química y organoléptica del ensilaje de maralfalfa

En la tabla 2 se observan los diferentes consumos promedios cada 15 minutos, mostrando homogeneidad entre las cantidades consumidas de cada tratamiento. Tabla 2. Consumo acumulado de ensilaje (kg de materia seca) cada 15 minutos para cada tratamiento. Tratamiento

Tiempo (min) 15 2.30 2.46 2.38 2.56

T0 T1 T2 T3

30 2.78 3.12 2.98 3.34

45 3.84 3.74 3.86 3.70

60 4.66 4.42 4.58 4.74

T0: 100 ensilaje de maralfalfa; T1: 95% ensilaje de maralfalfa más 5% yuca fresca; T2: 90% ensilaje de maralfalfa más 10% yuca fresca; T3: 85% ensilaje de maralfalfa más 15% yuca fresca

Se puede notar que durante los primeros 15 minutos se dio un consumo rápido, obteniendo una aceptabilidad inmediata de todos los tratamientos por parte de los animales. Posteriormente, el consumo se mantuvo con un crecimiento paulatino hasta lograr un consumo promedio por animal máximo de 4.66 (T0), 4.42 (T1), 4.58 (T2) y 4.74 (T3). En la figura 9, se muestra el comportamiento del consumo promedio acumulado de ensilaje, por parte los animales a través del tiempo. 25

Consumo (kg)

20 15 10 5 0 0

TIiempo (min) T0

Figura 9. Cantidad

de ensilaje consumido en el tiempo (60 min) para cada tratamiento.

DISCUSIÓN Las concentraciones de MS no fueron óptimas en ninguno de los tratamientos (12), obteniéndose un máximo de materia seca en T3 (23.01%) con un

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15% de inclusión de yuca y un mínimo para T0 (19.05%), sin inclusión de yuca. Los resultados de MS son menores a los encontrados por Acosta (5), Eichelberger (20) y Lara (21) en ensilajes de maíz y mixtos de maíz más leguminosas; efecto que es atribuido a que el pasto maralfalfa posee una concentración de materia seca muy baja (24% a los 60 días de rebrote). Contenidos de MS inferiores al 30%, puede originar problemas de contaminación e incremento de las pérdidas del ensilaje, porque se favorece la actividad bacteriana (especialmente Clostridium) y aumenta la producción de ácido butírico (12). La tendencia a disminuir los niveles de PB al aumentar la inclusión de yuca fresca al ensilaje, puede ser originado por la baja concentración de proteína presente en la raíz de yuca fresca (22). Las concentraciones de proteína halladas fueron superiores a los reportados en ensilaje de maralfalfa más caña de azucar (7) y similares a las encontradas en ensilaje de pasto elefante (Pennisetum purpureum) más harina de yuca (23), por lo que se puede afirmar que los pastos Pennisetum y la yuca proporcionan mayor cantidad de proteina al ensilaje, además del contenido de azucares. La concentración de EE en los diferentes niveles de inclusión de yuca fresca permitiría una adecuada digestibilidad de la fibra, ya que contenidos elevados de lípidos en la dieta de los rumiantes podría ocasionar envolvimiento físico de la fibra (mayor al 7%), dificultando el ataque microbiano, y por lo tanto reduciendo la digestibilidad del ensilaje (24, 25). El contenido de EE en las diferentes inclusiones de yuca fresca al ensilaje fue inferior al encontrado en ensilaje de maralfalfa más caña de azucar (7) y similar al reportado en ensilaje de pasto elefante (Pennisetum purpureum) más harina de yuca (13). Las concentraciones de cenizas halladas en este estudio, son mayores a las encontradas por Acosta (5), Eichelberger (20) y Lara (21) en ensilajes de maíz y mixtos de maíz más leguminosas y muy cercanas a las reportadas por Lara (21) en ensilajes de

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leguminosas. Estas altas concentraciones pueden ser atribuidas a que el pasto maralfalfa posee concentraciones altas de cenizas (2), sumado probablemente a la presencia de trazas en la raíz de yuca, provenientes del suelo, que al no realizar un lavado previo del material mantuvo partículas de suelo, el cual es altamente rico en minerales, pudiendo esto causar probablemente un mayor efecto en T3. La tendencia a disminuir la FDN en el ensilaje a medida que se aumenta la inclusión de yuca fresca, está muy asociada al poco aporte de fibra que hace la raíz de yuca al ensilado (26). Sin embargo, los niveles fueron superiores a los encontrados por Acosta (5) y Blanco et al (27) en ensilajes de maíz sorgo y trigo y avena, sauco y acacia, respectivamente, quizás porque las condiciones ambientales donde se realizaron estas investigaciones son muy diferentes a las de este estudio y las gramíneas en condiciones de trópico alto son plantas C3, las cuales poseen niveles de fibra menores y un menor aporte de fibra por parte de los granos en las plantas de maíz. Los T2 y T3 mostraron menor porcentaje de FDN, con respecto a los reportados por Eichelberger (20) y Oliveira et al (28) en ensilaje de maíz, lo cual es atribuido a la mayor concentración de raíz de yuca y por ende un menor a porte de FDN (22). Al igual que la FDN, la FDA mostró una disminución gradual a medida que se aumentaron los niveles de yuca en los tratamientos; efecto producido por los niveles bajos de fibra contenidos en la raíz de yuca (22). No obstante, estos niveles siguen siendo más altos que los reportados por Acosta (5) y Blanco et al (27) en ensilajes de maíz y gramíneas con leguminosas, respectivamente; efecto que de igual manera, es atribuido a un menor aporte de fibra por parte de los granos encontrados en este tipo de especies. La disminución de lignina en el ensilaje, puede ser causada porque los niveles de fibra y lignina en la raíz de yuca son muy bajos (26), contribuyendo favorablemente con la calidad del ensilaje, volviéndolo más

digestible en el rumen. Sin embargo, estos resultados son mayores a los encontrados por Eichelberger (20) en ensilajes de maíz, maíz más soya y maíz más fríjol (4.77, 4.85 y 5.54%, respectivamente) y Oliveira et al (28) en ensilaje de maíz (5.9%). Efecto que puede ser atribuido a que la planta de maíz para ser conservada por medio del proceso de ensilaje, debe estar a una edad no mayor de 70 días, en el cual los niveles de lignificación de la planta son mínimos y el estado de los granos de la planta se hallan entre lechoso y semiduro. Por otra parte, las especies leguminosas son plantas tipo C3, los cuales poseen una pared celular mucho más delgada y mayor contenido celular que las plantas tipo C4, al cual pertenece el pasto maralfalfa. Las condiciones del material a ensilar en todos los tratamientos, especialmente la concentración de carbohidratos, fueron adecuadas para que el pH disminuyera a un nivel adecuado para la preservación del ensilaje (29). De acuerdo a resultados encontrados por Pires et al (13), en ensilajes de pasto elefante (Pennisetum purpureum) y pasto elefante más harina de yuca, reportaron que en este tipo de ensilajes el ácido láctico posee un mayor poder de acidificación en comparación con los ácidos acético y butírico, lo que ayuda a la conservación del ensilaje. La excelente calidad del ensilaje, de acuerdo a las características organolépticas, puede se debido a un aporte significativo de la raíz de yuca en cuanto a carbohidratos solubles y materia seca, lo cual concuerda con lo informado por Schroeder (10) y Cisneros et al (11), quienes afirman que los niveles de materia seca y carbohidratos solubles son determinantes en la fermentabilidad del ensilaje. El color excelente del ensilaje en los tratamientos a los cuales se les adicionó yuca fresca, puede ser atribuido a la mayor concentración de carbohidratos solubles en la yuca, que permitió una mayor ensilabilidad y conservación del ensilaje. Al igual, que los valores bajos de pH, que oscilaron entre 3.63 y 3.75 en los diferentes tratamientos, lo cual evitó el crecimiento

Maza - Evaluación química y organoléptica del ensilaje de maralfalfa

de bacterias saprofitas. En relación al olor y textura, no se apreciaron olores desagradables ni degradación del material, quizás por el mismo efecto de valores de pH bajos, mencionado anteriormente. Respecto al comportamiento ingestivo en la prueba de consumo de ensilaje, no se observó una tendencia marcada de los animales a consumir un tratamiento específico, lo que sugiere que la aceptabilidad de los diferentes ensilajes por parte de los animales fue similar, por lo tanto, la diferencia entre los tratamientos estaría determinada principalmente por el contenido nutricional y las variables organolépticas, más que por la gustosidad del ensilaje. Como conclusión, se puede afirmar que la inclusión de yuca al 15% mejora la calidad

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del ensilaje de maralfalfa, principalmente por el contenido de PB aceptable, reducción en los contenidos de FDA, FDN y lignina y un pH adecuado para la fermentación y conservación. Además de presentar excelentes características organolépticas y mayor aceptabilidad por parte de los animales. Para incrementar los niveles de proteína suministrado a los animales a través de los diferentes ensilajes evaluados, se puede adicionar nitrógeno no proteico al momento de la oferta.

Agradecimientos A los Medicos Veterinarios Zootecnistas Amilkar Causil Vergara y Alejandro Reza Cordero y al Laboratorio de Nutrición Animal de la Universidad de Córdoba por facilitar los medios para la realización de esta investigación.

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Rev.MVZ CórdobaREVISTA 16(2):2538-2548, 2011. • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 2538 MVZ CÓRDOBA

ORIGINAL

Evaluación de Lactobacillus plantarum en intestino grueso de lechones por microscopía electrónica y química sanguínea Evaluation of Lactobacillus plantarum in large intestine of piglets by transmission microscopy and blood chemistry Henry Jurado G,1* Ph.D, Diana Castaño Z,

Bacteriol, Cristina Ramírez T,

Ph.D.

Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Pecuarias, Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Programa de Zootecnia. Pasto, Colombia. 2Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia, 3 Universidad del Valle, Escuela de Ingeniería de Alimentos, Grupo de Investigación en Microbiología y Biotecnología Aplicada y Grupo de Investigación en Ingeniería de los Procesos Agroalimentarios y Biotecnológicos GIPAB. Cali, Colombia. *Correspondencia: henryjugam@gmail.com 1

Recibido: Marzo de 2010; Aceptado: Enero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la presencia de Lactobacillus plantarum en intestino grueso de lechones. Materiales y métodos. 50 lechones fueron asignados al azar a 5 tratamientos (n=10). (T0: sin probiótico; T1: con L. plantarum 1 H1; T2: con L. plantarum 1 H2; T3: con probiótico comercial; T4: sin probiótico comercial). Después de los tratamientos, 3 lechones de cada grupo fueron seleccionados aleatoriamente para obtener muestras de intestino grueso para análisis por microscopía electrónica y suero para química sanguínea. La inmunoglobulina A (IgA) se hizo por turbidimetría; colesterol total y nitrógeno ureico (BUN) por espectofotometría. El recuento diferencial de leucocitos y polimorfonucleares (PMN) neutrófilos mediante extendido de sangre. Resultados. Se comprobó la adhesión de L. plantarum 1 H1 y y L. plantarum 1 H2 en el intestino grueso. Se observó secreción de mucina y en la lámina propia inflamación y edema del tejido conectivo. La IgA mostró concentraciones altas en T2 (L. plantarum 1 H1) con 333 mg/100 mL y T3 (L. plantarum 1 H2) con 300 mg/100 mL. Los valores en T3 y T2 en los polimorfonucleares neutrófilos fueron elevados (65% y 55% respectivamente). El colesterol total fue menor en T2 y T3 con valores de 113.83 y 93.8 mg% respectivamente. El BUN para T2 y T3 fue el más bajo con 7.83 y 8.76 mg% respectivamente. Conclusiones. La utilización de probióticos con L. plantarum 1 adicionado en la ración mostró un efecto positivo en la colonización y adhesión en el intestino grueso, así como, una respuesta positiva en su sistema inmune. Palabras clave: Inmunoglobulinas, Lactobacillus plantarum, lechón, inmunológico. (Fuentes: AIMS, CAB, DeSC).

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probióticos, sistema

Jurado - Evaluación de Lactobacillus plantarum en intestino grueso de lechones

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ABSTRACT Objective. To evaluate the presence of Lactobacillus plantarum in large intestine of piglets. Materials and methods. Fifty piglets were randomly allocated into 5 (n=10) treatment groups (T0: without probiotics; T1:with L. plantarum 1 H1; T2:with L. plantarum 1 H2; T3: with commercial probiotics; T4:without commercial probiotics). After treatment, 3 piglets, from each group, were randomly selected and large intestine samples were taken and analyzed by transmission electron microscopy and serum for blood chemistry. The determination of immunoglobulin A (IgA) was made by turbidimetric method; and the total cholesterol and blood ureic nitrogen (BUN) by espectrophotometry. The differential leukocyte count and polymorphonuclear neutrophils (PMN) was examined in blood smears. Results. Adhesion of L. plantarum 1 H1 and L. plantarum 1 H2 was found in the mucosa of the large piglet intestine. Was observed secretion of mucin, and inflammation in the lamina propria and connective tissue edema as part of the immune response. IgA showed high concentrations in T2 (L. plantarum 1 H1, 333 mg/100 ML) and T3 (L. plantarum 1 H2, 300 mg/100 mL). The T2 and T3 values in polymorphonuclear neutrophils were elevated (65% and 55% respectively). Total cholesterol was lower in T2 (113.83%) and T3 (93.8%). T2 and T3 showed the lowest BUN values (7.83 and 8.76 mg% respectively). Conclusions. The use of probiotics with L. plantarum 1 added in the ration showed a positive effect in the colonization and adhesion in the large intestine, as well as, a positive response in their immune system. Key words: Immunoglobulins, immune system, Lactobacillus plantarum, piglet, probiotics. (Sources: AIMS, CAB, DeSC).

INTRODUCCIÓN Los experimentos en modelos animales como en lechones en fase de precebo, indican que la microflora intestinal supone una gran cantidad de microorganismos, como las bacterias probióticas con beneficios para el sistema inmune, como lo es la respuesta inmunitaria de la mucosa (1). Isolauri et al (2) sostienen que la prevención contra la colonización de patógenos en el tracto gastrointestinal se da por la “exclusión competitiva”, a nivel del intestino delgado y grueso sin sufrir pérdidas en su viabilidad. Además, sintetizan compuestos inhibitorios por parte de estos microorganismos (3). Pathmakanthan et al (4) afirman que Lactobacillus plantarum es capaz de promover la síntesis y secreción de citocina antiinflamatoria IL-10 en los macrófagos y células T que proceden del colon inflamado. La flora endógena intestinal sintetiza los polisacáridos capsulares zwitteriónicos (PSZ), los cuales, emplean el sistema de presentación del complejo mayor de

histocompatibilidad II (MHC) para activar las células T mediante su reconocimiento por las proteínas receptoras alfa/beta de dichas células T (5). Así, por ejemplo, células T CD4+ humanas estimuladas por estas moléculas in vitro y transferidas a ratas in vivo protegen contra abscesos intraabdominales provocados con un estímulo bacteriano viable. El peptidoglicano de bacterias grampositivas estimula las proteínas NOD, (receptores específicos citoplasmáticos) y caracterizados por presentar repeticiones ricas en leucina (LRR). Los receptores NOD1 y NOD2 pueden estimular el factor de transcripción NFκB. La presencia de regiones activadoras de caspasa en proteínas NOD es importante en la apoptosis (6). Lactobacillus plantarum se ha utilizado en cerdos para el control de bacterias entéricas (7), motivo por el cual este estudio, pretendió evaluar la adhesión de

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Lactobacillus plantarum en el intestino grueso de lechones en fase de precebo mediante microscopía electrónica de transmisión y química sanguínea.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. El presente estudio se realizó en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Universidad del Cauca (Popayán, Cauca), en el Laboratorio de Bacteriología Especializado para Diagnóstico Veterinario de la ciudad de Cali y en la finca “La Sierra”, (Villa Gorgona, Candelaria, Colombia). Toma de muestras. Se trabajó con un total de 50 lechones, distribuidos en cinco tratamientos, 10 lechones por tratamiento. Se evaluaron 3 lechones por tratamiento al final de la fase de precebo (sexta semana), provenientes de: T0 (Control) sin adición de probiótico ni antibiótico, únicamente con concentrado de iniciación; T1: L. plantarum 1 H1, junto con el concentrado de iniciación; T2: L. plantarum 1 H2, junto con el concentrado de iniciación; T3: probiótico comercial, junto con el concentrado de iniciación; T4: Sin adición de probiótico. Se usó el concentrado de preiniciación e iniciación con antibiótico. Los resultados de las diferentes mediciones fueron reportados como promedio para cada uno de los tratamientos evaluados. Obtención y procesamiento de las muestras para microscopía electrónica. Se realizaron cortes de aproximadamente 1 cm de largo y 1 cm de ancho del colon del intestino grueso y fijadas en glutaraldehído al 2.5%. Posteriormente, fueron refrigeradas y transportadas al laboratorio de microscopía electrónica. De las muestras se tomaron secciones más pequeñas, que fueron lavadas tres veces por 5 minutos cada una con Fosfato de Milloniq. Se fijaron con tetróxido de osmio al 2% por una hora; y lavadas tres veces por 5 minutos cada una con fosfato de Milloniq.

Posteriormente, fueron sometidas a un proceso de deshidratación por 15 min para cada una con alcohol así: alcohol de 30%; 50%; 70%; 80%; 90%; 95%; 100%. La deshidratación continuó con mezclas de etanol-oxido de propileno en relaciones: 3:1; 1:1; 1:3 (20 min cada una), óxido de propileno puro (20 min); óxido de propileno puro (20 min). Durante el proceso de preimbibición se utilizó una mezcla de óxido de propileno: resina Polybed relación 3:1 (2 horas); 1:1 (2 horas); 1:3 (2 horas). Enseguida el proceso de imbibición con resina pura (toda la noche) en nevera, y se polimerizaron en horno a 65°C (48 horas). Polimerizadas las muestras, en ultramicrótomo (Leica modelo UCT), se sacaron cortes semifinos de 1 µm de grosor para ser observadas en Microscopía Óptica de Alta Resolución (MOAR) marca NIKON (Eclipse 80i, Nikon Instruments Inc. USA), se tiñieron con azul de toluidina (en portaobjetos). La captura de las imágenes se hizo con el sistema de captura y análisis de imágenes NIS-Elements F 2.30, la cámara utilizada fue NIKON DIGITAL SIGHT DS-2Mv. Para el estudio por Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) marca JEOL (JEM 1200 EX), se utilizaron cortes de 90 nm de grosor (ultramicrótomo), recogidos en rejillas de Niquel o cobre, contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las fotos fueron tomadas en películas Kodak especiales para Microscopia Electrónica. El proceso de revelado de los negativos es el utilizado para blanco y negro con revelador y fijador Kodak (4-5 minutos en revelador, 30 segundos en agua y 10 minutos en fijador, lavado con agua corriente por media hora). Luego los negativos fueron escaneados en un Scanner para negativos marca Epson (Epson perfection 4490 Photo). Análisis de química sanguínea. La obtención de la muestra de sangre se hizo con tubos al vacío con anticoagulante EDTA, haciendo una ligera presión longitudinal en

Jurado - Evaluación de Lactobacillus plantarum en intestino grueso de lechones

la oreja para conseguir un mayor flujo de sangre. Posteriormente con una lanceta estéril se efectuó la punción. Se descartó la primera gota para el llenado de las pipetas requeridas. Se mezcló la sangre en el tubo por inversión varias veces, para una muestra homogénea. El análisis de sangre se hizo por el método de los dos portaobjetos, colocando una pequeña gota de sangre sobre un portaobjetos a 2 cm aproximadamente de unos de sus extremos. Se colocó el canto de otro portaobjetos por la parte anterior a la gota de sangre, formando un ángulo aproximadamente de 45° y desplazándolo suavemente hasta que alcance la gota de sangre. Se esperó a que por capilaridad toda la sangre se distribuya uniformemente y posteriormente se deslizó suavemente un portaobjetos sobre el otro, hasta que la gota de sangre quede bien extendida. Se dejó secar el frotis al aire y se coloreó con Tinción de Wright. Inmunoglobulina A (IgA). Se determinó mediante la técnica de Turbidimetría. BUN. Se realizó por medio de un espectrofotómetro. El parámetro medido se transformó en úrea multiplicando por 2.14 y ésta en BUN por 0.467. La muestra de sangre se centrífugó a 1500 rpm (10 minutos) para obtener el suero. Valores de referencia del BUN: 5-25 mg/dL (8).

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Recuento de glóbulos blancos. Se realizó con hematocitómetro y microscopio óptico. Se mezclaron 10 µL de la muestra anticoagulada con EDTA y 190 µL de ácido acético al 3%. Se leyó en objetivo de 40X. Posteriormente, el total de células se multiplicaron por el factor 50 obtenido de dividir el factor de dilución por el volumen total utilizado para el recuento. Para el recuento diferencial de leucocitos se examinó el extendido de sangre periférica utilizando el objetivo de 10x y con el de 100x el recuento diferencial contando 100 células, observándose la morfología de las células blancas.

RESULTADOS Los resultados de la evaluación de epitelio intestinal y adhesión bacteriana de los tratamientos T1 (L. plantarum 1 H1) y T2 (L. plantarum 1 H2), mediante microscopia electrónica de transmisión (TEM), se muestran en dos fases: una corresponde a las características histológicas de la mucosa intestinal y la otra a la adhesión de las bacterias estudiadas en el epitelio del intestino grueso. Las porciones seleccionadas fueron del colon. La figura 1 muestra el corte longitudinal de una glándula intestinal acompañada de la Lámina propia (Lp).

Colesterol total. La muestra se centrifugó 10 min a 1500 r.p.m. para obtener suero. Tanto el colesterol libre como los esterificados presentes en la muestra, originaron un complejo coloreado cuantificado por espectrofotometría. La muestra con el reactivo de color se mezclaron e incubaron a temperatura ambiente (10 min). Se leyó la absorbancia (A=500 nm) del patrón y la muestra frente al blanco de reactivo. Cálculo: A Muestra x C Patrón = C Muestra A Patrón Valores de referencia: Hasta 200 mg/dL (9). Para las mediciones de colesterol se acepta un % de inexactitud ± 5% y un CV ± 5% y otros laboratorios aconsejan que debe ser reducidas a ± 3% (10).

Figura 1.

Corte longitudinal de una glándula intestinal (Gi) acompañada de la lámina propia (Lp); que en conjunto forman la mucosa del intestino grueso del cerdo. También se aprecian cortes transversales de las glándulas y en su interior la secreción de mucina (M). Azul de Toloudina. 40x.

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En la figura 2 se observa la mucosa del intestino grueso del cerdo, acompañado de un pequeño grupo de bacterias. Ci

Figura 2. Corte transversal de la mucosa del intestino grueso del cerdo, observándose en la luz (L) del órgano un pequeño grupo de bacterias (B). Azul de Toloudina 100x.

En la figura 3 se evidencia el corte transversal de la mucosa intestinal y del infiltrado inflamatorio como respuesta del sistema inmune a un agente extraño.

Figura 3. Corte transversal de la mucosa intestinal de cerdo en cuya lámina propia se identifica claramente el infiltrado inflamatorio que se ha formado en respuesta del sistema inmune a un agente extraño. Azul de Toloudina 40x x

En la figura 4 se aprecia una microfotografía electrónica de L. plantarum 1 H1 con cápsula presente en la mucosa del intestino grueso del lechón.

Figura 4. Microfotografía Electrónica de L. plantarum 1 H1 (B) presentes en la mucosa del intestino grueso del cerdo. En la bacteria de la parte superior se observa la cápsula de la bacteria (Cp) la cual es muy electrodensa, con su citoplasma (Ci). 500 nm

En la figura 5 se puede ver una microfotografía electrónica de la mucosa del intestino donde se aprecian un conjunto de bacterias de L. plantarum 1 H2.

1 um Figura 5. Microfotografía Electrónica de la mucosa del intestino grueso del cerdo. Se observa un grupo de bacterias de L. plantarum 1 H2 acompañadas de núcleos de células epiteliales (Ce). 500nm

Jurado - Evaluación de Lactobacillus plantarum en intestino grueso de lechones

En la figura 6 se observan los resultados de la concentración de inmunoglobulina A (IgA) al final del tratamiento (final de la fase de precebo), indicando que los valores más altos se presentaron en T1 (L. plantarum 1 H1), T2 (L. plantarum 1 H2) y T3 (Probiótico comercial), con concentraciones de 333 mg/100 mL, 300 mg/100 mL y 300 mg/ 100 mL respectivamente, valores muy superiores a la concentración normal en cerdos que es de 200 mg/100 mL.

*Valor de referencia normal: 200 mg/100 mL

Figura 6. Concentración de inmunoglobulina A (IgA) en los lechones en la fase de precebo.

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Con respecto a los linfocitos, se pudo apreciar en la misma Figura 7 una ligera variación en el número de estos como respuesta favorable a los probióticos, lo que significa una mejor inmunidad específica. Esto corrobora la actividad de las cepas utilizadas, según Brizuela (11). En algunos casos, se observó la presencia de linfocitos atípicos que pueden presentarse en una variedad de situaciones, no siendo siempre patológico.

Otros resultados importantes se obtuvieron en los niveles de colesterol total y nitrógeno ureico (BUN) al final del experimento (Figura 8). Con respecto a los niveles de colesterol total para el caso de los tratamientos T1 y T2 los valores promedio fueron de 113.83 y 93.8 mg% respectivamente. Siendo estos valores los más bajos junto con el T4 (97,36 mg%). Los resultados de nitrógeno ureico (BUN) indicaron que para T1 y T2 los valores promedio fueron de 7.83 y 8.76 mg% respectivamente. Siendo estos valores los más bajos junto con el T3 (7.2 mg%).

En la figura 7 se aprecia cómo desde el punto de vista inmunológico fue una respuesta positiva al tratamiento efectuado con inóculos probióticos en la ración, por cuanto, produjeron una inmunidad positiva en el tratamiento T2 (Lactobacillus plantarum 1 H2) representada en los polimorfonucleares neutrófilos elevados del 65%, y para el caso de T1 (Lactobacillus plantarum 1 H1) fue del 55%. *VN Colesterol: Hasta 220 mg%, **VN BUN: Hasta 22 mg%

Figura 8. Concentraciones (mg%) de colesterol total y BUN de los lechones en fase de precebo.

Estos resultados a nivel de química sanguínea indicaron que no había cambios significativos en estos parámetros, puesto que son animales jóvenes con dietas balanceadas. *VN polimorfonuclear neutrófilo: 42 -75 %

Figura 7. Concentración de polimorfonucleares neutrófilos y linfocitos en los lechones en la fase de precebo.

En la tabla 1 se puede apreciar la viabilidad de los inóculos de L. plantarum 1 H1 (T1) y L. plantarum 1 H2 (T2), junto con el concentrado de iniciación elaborado en

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Tabla 1. Viabilidad de los inóculos de Lb. plantarum 1 H1 (T1) y Lb. plantarum 1 H2 (T2) junto con el concentrado de iniciación elaborado en la finca “La Sierra” comparado con el tratamiento control o testigo (T0) en ciego, colon y recto del intestino grueso de los lechones al final de la fase de precebo. Porción intestino grueso

UFC/mL (103)

L. plantarum 1 H2 (T2)

Ciego

2.35 x 105

L. plantarum 1 H2 (T2)

Colon transverso

1.5 x 105

L. plantarum 1 H2 (T2)

Recto

8.0 x 104

L. plantarum 1 H1 (T1)

Ciego

1.0 x 105

L. plantarum 1 H1 (T1)

Colon transverso

1.3 x 105

L. plantarum 1 H1 (T1)

Recto

1.1 x 105

Testigo (T0)

Ciego

Testigo (T0)

Colon transverso

Testigo (T0)

Recto

Probiótico

la finca “La Sierra”, comparado con el tratamiento control o testigo (T0) en ciego, colon y recto del intestino grueso de los lechones, al final de la fase de precebo.

DISCUSIÓN El género Lactobacillus, ha sido usado en animales para prevenir desordenes en el tracto gastrointestinal, como es el caso de la diarrea (12-13). Son microorganismos sin capacidad patógena, capaces de prevenir la adherencia y replicación de bacterias patógenas (14). El tracto gastrointestinal, es la superficie del cuerpo en continuo contacto con el medio externo; posee mecanismos para prevenir la entrada de microorganismos y compuestos patógenos al animal. Así, la monocapa epitelial y el revestimiento de moco que la recubre, junto con las uniones estrechas que mantienen unidos a los enterocitos, forma una barrera física que previene la entrada a la lámina propia de patógenos y antígenos luminales. Por otro lado, la inmunoglobulina (IgA) secretada por el intestino, bloquea la unión de patógenos al epitelio, evitando su acceso a la lámina propia intestinal, y además, aglutina bacterias y virus que son atrapados en la barrera de moco y eliminados en las heces (14).

Mare et al (15), investigaron qué porción del intestino de lechones lactantes y en precebo podrían ser colonizados por L. plantarum 423 y L. salivarius 241 en un modelo gastrointestinal. Se utilizó una técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH). Así, determinaron que L. plantarum 423 se adhería al íleon y colon posterior y L. salivarius 241 al duodeno en los lechones lactantes. La cepa 241 se adhirió al duodeno y colon posterior de los lechones en precebo, mientras que la cepa 423 se localizó en el íleon. Además, sostienen que L. plantarum 423 y L. salivarius 241 se adhieren al tracto intestinal, dependiendo de su edad. Estos resultados coinciden con L. salivarius en el sitio de adhesión de L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 en el colon, y difieren para L. plantarum 423. El interés por la adhesión y colonización de las BAL, ha hecho de los Lactobacillus efectivos para dirigirse a la mucosa, tal como el tracto gastrointestinal o las vías nasales, para provocar una respuesta inmune deseada contra el antígeno presentante en el animal. Además, poseen ciertas propiedades como: actividad adyuvante, propiedades de adhesión a mucosas (como se pudo apreciar en la presente investigación) y baja inmunogenicidad, intrínseca, y así, se pueden usar en vacunación oral. El conocimiento de la estructura y del modo de expresión de proteínas relacionadas con la superficie de Lactobacillus y su adherencia a la mucosa y/o a la matriz extracelular es importante para una vacunación efectiva. Los factores de adherencia pueden ser críticos para la apropiada presentación del antígeno con objeto de que cepas recombinantes de BAL provoquen respuestas de IgA en mucosas y/o de IgG en suero al antígeno expresado en un huésped. La inmunización oral es altamente deseable por la facilidad, bajo costo, almacenamiento y administración de la vacuna. Un vehículo u organismo de administración efectivo debe ser uno que esté normalmente presente en el tracto gastrointestinal del organismo hospedador y debe dirigirse con precisión a los sitios mucosales de infección y adherirse a la

Jurado - Evaluación de Lactobacillus plantarum en intestino grueso de lechones

superficie de las mucosas. Los Lactobacillus poseen ambas características. Un vehículo útil de administración vacunal debe, además, ser capaz de expresar antígenos de interés a niveles altos para inmunizar con éxito al huésped y no ser patogénico para el huésped (16). Además, estos Lactobacillus presentan una mayor prevención de transposición bacteriana, y aumento de la secreción de mucina protectora del intestino (17), propiedades de co-agregación y adhesión (18). Los resultados de las concentraciones de IgA para los tratamientos T1, T2 y T3 (333 mg/100 mL, 300 mg/100 mL y 300 mg/ 100 mL respectivamente), y son superiores a la concentración normal para los cerdos que es de 200 mg/100 mL. Esta IgA actúa junto con la IgM, en la exclusión inmunitaria (19). Esta IgA se encuentra en saliva y líquido intestinal. Protege las superficies corporales, y así, 90% de las células que contienen inmunoglobulina en la lámina propia intestinal, presentan IgA (20), siendo sintetizada y secretada por las células plasmáticas de la submucosa intestinal (criptas). Su accionar se da porque esta IgA se une a un receptor glucoproteínico de inmunoglobulina polimérica (pIgR) en la superficie basal de las células del epitelio intestinal; cuando llega a la superficie exterior, la vesícula endocítica se fusiona con la membrana plasmática y expone la IgA a la luz intestinal. Posteriormente, la porción extracelular del pIgR se separa por enzimas proteolíticas, de modo que la IgA, aún con el péptido receptor unido (SIgA) es liberada en la luz. Esto explicaría en parte, los valores altos presentados en los tratamientos con L. plantarum 1 como probióticos suministrados en la ración de iniciación en la fase de precebo, y que permitirían controlar infecciones entéricas, como la diarrea. Es eficaz contra enzimas virales y bacterianas, además, actúa como opsonina y en algunos sistemas de citotoxidad celular dependiente de anticuerpos. Su mayor contribución se da contra la adhesión bacteriana y viral a las superficies epiteliales (exclusión inmunitaria). De esta manera,

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por ejemplo, las bacterias patógenas como E. coli, no podrían adherirse a las células epiteliales del intestino, o pueden pasar de largo con el contenido intestinal sin causar ningún daño. También, esta IgA intracelular se caracteriza por excretar antígenos extraños, es decir, se une a antígenos que han penetrado a la submucosa. Una consideración importante es el mantenimiento de la función de barrera intestinal, lo constituye la enfermedad inflamatoria intestinal, en donde la integridad de la barrera epitelial está comprometida, permitiendo el paso de antígenos luminales a la lámina propia, desencadenando una respuesta inmune exagerada y contribuir en la perpetuación de proceso inflamatorio intestinal (21); esto, implicaría que L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 podrían contribuir muy posiblemente a facilitar la reversión de esta situación y normalizar la permeabilidad intestinal incrementada, mejorando así la respuesta inflamatoria intestinal. Schultz et al (17) sostienen que en circunstancias normales, la respuesta inmunitaria intestinal a las bacterias residentes se verá limitada por una respuesta inmunitaria supresora (respuesta TH2) con predominio de IgA y de la citocina antiinflamatoria IL-10. Hallazgos recientes han revelado que determinadas células T reguladoras, como las Th3, que producen factor transformador del crecimiento β (TGF-β), y las células Tr1, que producen IL- 10, regulan la respuesta inflamatoria de la mucosa. El déficit de citocinas o tipos celulares conduce a inflamación de la mucosa a causa de la respuesta anormal a la flora endógena intestinal. Se ha observado que los Lactobacillus previenen la aparición de colitis espontánea en los ratones con déficit de interleucina 10 y que la aportación continuada de Lactobacillus plantarum atenúa la inflamación en este modelo. Es importante tener en cuenta, que entre las células del sistema inmune intestinal, incluyen los linfocitos y eosinófilos y varios tipos de células presentadoras de Ag (CPA), presentes en el tejido conectivo de la lámina propia (LP) intestinal, entre otras. Ciertos

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linfocitos también se encuentran entre las células epiteliales del intestino (linfocitos intraepiteliales o LIE). Además, grupos de nódulos linfoides organizados (placas de Peyer, agregados linfoides), están en el tracto intestinal (22). Por lo tanto, es importante considerar que la microflora intestinal desempeña un papel fundamental en la salud del hospedero, de ahí la necesidad de su mantenimiento. Por esta razón, la utilización de L. plantarum 1 ayudaría a minimizar la presencia de diarreas y promover el crecimiento de cerdos al destete; estimulando la inmunidad protectora contra patógenos, aumentar la respuesta inmune de la mucosa intestinal, fortalecer muy posiblemente los mecanismos inespecíficos de defensa intestinal dados por la barrera mucosal que actúa en conjunción con el sistema inmune local. La información acerca de L. plantarum aún es limitado, y la variabilidad de su efecto puede estar relacionada con diferencias entre cepas y baja viabilidad antigénica. Por ello, el conocimiento del accionar de esta bacteria en el intestino estimulando las células responsables de la inmunidad ayudaría a mejorar su uso como sustancias moduladoras de la respuesta inmune (23). Además, se sugiere que las LAB y los Lactobacillus modulan la función de las células T mediante la modulación de la función de DC (24). Lim et al (25) y Charalampopoulos et al (20) afirman que la aplicación de los Lactobacillus reducen el colesterol en suero, y detienen la disfunción intestinal; coincidiendo con los resultados encontrados en los tratamientos T1 y T2. Investigaciones llevadas a cabo por Haberer et al (26); mostraron que alimentar lechones con dietas elevadas en colesterol y acompañadas con Lactobacillus, y posteriormente alimentarlos con dietas normales, la actividad de la enzima h-glucuronidasa y azoreductasa (indicadoras de actividad procarcinogénica), fue reducida durante cinco semanas de suplementación del probiótico. Pino y Dihigo (27) investigaron el efecto de probióticos sobre el hígado en cerdos de precebo, con un aumento del peso del hígado a (p<0.05), aumentando en un 30% con respecto

al control; dado por el aumento de su actividad. Resultados significativos con aumento del peso del ciego a (p<0.001), pudiendo estar dado por un aumento de su actividad al tratar a los animales con L. acidophilus. Se puede inferir, que es necesario la presencia del probiótico, en este estudio, a base de L. plantarum 1 en la dieta de forma constante para lograr la acción hipocolesterolémica. Los mecanismos de acción propuestos para lograr esta respuesta de los probióticos pueden ser: i) propician la formación de esteres de colesterol en el intestino favoreciendo su excreción (28), ii) asimilación del compuesto por la bacteria iii) actividad hidrolasa de sales biliares del probiótico (25). Con respecto a la acción de los probióticos de Lactobacillus plantarum 1 H1 y Lactobacillus plantarum 1 H2 contribuyen a una utilización más eficiente de la dieta y así, posiblemente reducir algunos compuestos tóxicos que se originan de ella. Los valores encontrados en el BUN son muy importantes por cuanto, un incremento por fuera de los límites normales de urea en sangre implicaría trastornos renales como la insuficiencia renal crónica y aguda; obstrucción de las vías urinarias; excesiva destrucción de proteínas como en estados de fiebre, toxicidad o sépsis extensa; hemoconcentración debida generalmente a graves vómitos o diarréas; y también una alteración de la función cardíaca que reduce el flujo de sangre a través de los riñónes (8). Estos resultados coinciden con investigaciones realizadas por Boucourt et al (29), indicando el efecto de Lactobacillus con menor nivel de urea en los grupos tratados. En conclusión, L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 adicionados en la ración de iniciación mostraron un efecto positivo en la colonización y adhesión en el tracto gastrointestinal de los lechones en la fase de precebo, así como, una respuesta positiva en su sistema inmune y mejoras en la salud al reducir los niveles de colesterol total y BUN de los animales tratados.

Agradecimientos A la empresa Cerdos del Valle S.A. (CERVALLE), Cali, Comobia, por la financiación de esta

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investigación que constituyen los resultados parciales del Trabajo de Investigación de Tesis de Doctorado desarrollado en la Universidad del Valle. A la Escuela de Ingeniería de Alimentos; al Dr. Germán Bolívar del Laboratorio de

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Microbiología y Biotecnología; al Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Universidad del Cauca y a la Dra. Sonia González. A todas personas que de una u otra manera colaboraron para el desarrollo de esta investigación.

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ORIGINAL

Comparación de los métodos Directo y de Friedewald para la determinación de los niveles de colesterol LDL en el equino Comparison of direct versus Friedewald methods for determing LDL cholesterol levels in the horse José Osório O,1* Ph.D, Luis Uribe-Velázquez,2 Ph.D. Universidad de Caldas, Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Laboratorio de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. 2Universidad de Caldas, Departamento de Salud Animal. *Correspondencia: jose.osorio_o@ucaldas.edu.co. 1

Recibido: Febrero de 2010; Aceptado: Enero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Comparar el método Directo con el método de precipitación de Friedewald para la determinación de colesterol LDL en una especie con patrón metabólico HDL. Materiales y métodos. Fueron tomadas en estado de ayuno, muestras de sangre de 200 equinos de diferente edad, raza y sexo. Luego de extraer el suero, fueron determinados los niveles de colesterol LDL mediante el método directo, posteriormente fueron determinados los niveles de colesterol LDL utilizando el método de Friedewald. Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante ANOVA de una vía. Resultados. El método directo reportó valores (mg/dl) de promedio, mínimo, máximo, rango y desviación estándar de 27.9; 14; 51; 37; 6.4 respectivamente, mediante el método de Friedewald se obtuvieron valores (mg/dl) de promedio, mínimo, máximo, rango y desviación estándar de 29; 11.2; 54.2; 43; 7.0 respectivamente. El valor de P en el test F fue mayor o igual a 0.05, por lo cual no se evidenció diferencia significativa a un nivel de confidencia del 95% entre los valores obtenidos por los dos métodos. Conclusiones. Pueden ser utilizados cualquiera de los dos métodos analizados para la determinación del colesterol LDL en especies con patrón HDL. Palabras clave: Colesterol LDL, equinos, lipoproteínas HDL, patrones metabólicos. (Fuente: CAB, DeCS).

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ABSTRACT Objective. To compare the Direct Method vs the Precipitation Friedewald Method for determing LDL cholesterol levels in the horse, specie with HDL pattern. Materials and methods. Blood Samples of 200 overnight fasted horses of different ages, breed and sex were obtained. Blood levels of LDL cholesterol were determined first by the Direct method and then by the precipitation Friedewald method. The results were analyzed using (one way ANOVA) and compared (F test <0.05). Results. There were no differences for determing LDL cholesterol levels between the Direct Method vs Friedewald Method (mean: 27.9 vs 29 mg/dl, minimal: 14 vs 11.2 mg/dl, maximal: 51 vs 54.2 mg/dl, range: 37 vs 43 mg/dl, and standard deviation: 6.4 vs 7.0 mg/dl respectively) Conclusion. According to these results both methods are recommended for determing LDL cholesterol levels in species with HDL pattern. Key words: Equines, LDL cholesterol, lipids, HDL lipoproteins, metabolic pathways. (Source: CAB, DeCS).

INTRODUCCIÓN Los métodos utilizados de manera rutinaria para la determinación del perfil lipídico en humanos una especie con patrón LDL, en la cual, un aumento de grasa y colesterol en la dieta se ven rápidamente reflejados en un aumento de las LDL (1), pueden ser inadecuados para la determinación del perfil lipídico en especies con patrón HDL, las que muestran aumentos de las HDL como respuestas al aumento de las grasas y colesterol en la dieta (2), debido a que su metabolismo lipídico es diferente. Teniendo en cuenta que en el mercado se encuentran normalmente varios métodos disponibles para determinar el colesterol LDL por mediciones de bioquímica clínica, el método de Friedewald o de fórmula utilizado de manera rutinaria para la determinación del perfil lipídico en humanos, una especie con patrón metabólico LDL, debe validarse para la determinación del perfil lipídico en especies con patrón HDL. El presente trabajo tuvo como objetivo, comparar el método directo con el método de Friedewald, para la determinación del colesterol LDL en una especie con patrón metabólico HDL.

MATERIALES Y METODOS Animales. Fueron tomadas en estado de ayuno, muestras de sangre de 200 equinos de diferentes edades sin discriminación de raza, edad o sexo.

Determinación de los niveles de colesterol. Luego de extraer el suero, fueron determinados los niveles de colesterol LDL. Método directo (3). Su fundamento es el siguiente: un detergente específico solubiliza el colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), las de muy baja densidad (VLDL) y los quilomicrones. Los ésteres de colesterol son hidrolizados por la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa mediante una reacción no formadora de color. Un segundo detergente, solubiliza el colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) de la muestra y el colesterol LDL se cuantifica espectrofotométricamente. Se determinaron los niveles de colesterol LDL utilizando el método de Friedewald. Método de Friedewald (4). Su fundamento es el siguiente: El colesterol HDL es precipitado en presencia de ácido fosfotungstico y determinado mediante el método enzimático-colorimétrico aplicado para la determinación del colesterol total de la muestra. Adicionalmente son determinados los niveles de triglicéridos mediante un método enzimáticocolorimétrico. Luego los valores de los triglicéridos son divididos entre 5 y este valor corresponde a los niveles de

Osorio - Validación del método de Friedewald de los niveles de colesterol LDL

colesterol-VLDL. Los valores de colesterol LDL son calculados mediante la siguiente fórmula: Colesterol LDL= colesterol total colesterol HDL - colesterol VLDL.

Análisis estadistico. Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante ANOVA de una vía, utilizando el programa Stat Graphics Centurium 15.14 (XV). Fue obtenido consentimiento informado de todos los criaderos. El trabajo contó con la aprobación del respectivo comité de ética.

RESULTADOS El método directo reportó valores (mg/ dl) de promedio, mínimo, máximo, rango y desviación estándar de 27,9; 14; 51; 37; 6,4 respectivamente. Con el método de Friedewald se obtuvieron valores (mg/dl) de 29; 11.2; 54.2; 43; 7.0 respectivamente. El valor de P en el test F fue mayor o igual a 0.05, por lo cual no se evidenció diferencia significativa a un nivel de confianza del 95% entre los valores obtenidos por los dos métodos. La figura 1 muestra la correlación positiva (Pearson), entre los dos métodos.

LDL mg/dl Métodofórmula Formula Método

LDL mg/dl

50 40 30 20 10 0 0

Método directo Método directo

Figura 1. Comparación de los valores de cholesterol-LDL en una especie con patron HDL, determinados por el método de Directo vs el método de Friedewald. Se observa correlación positiva entre los dos métodos usados.

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DISCUSIÓN De acuerdo con el metabolismo lipídico, las diferentes especies se incluyen en dos grandes patrones, con base en el tipo de lipoproteína encargada del transporte del colesterol al interior del organismo (5). El patrón LDL (LDL>HDL) se caracteriza por altos niveles de C-LDL, por lo que exhiben mayor riesgo aterogénico y el patrón HDL (HDL > LDL) que involucra a las especies donde la mayor parte del colesterol es transportado por las lipoproteínas de alta densidad, con menor riesgo de presentar aterogénesis (6). El perfil lipídico incluye la determinación en sangre de los niveles de colesterol total (CT), colesterol HDL (C-HDL), colesterol VLDL (C-VLDL), colesterol LDL (C-LDL) y triglicéridos en suero, el cual puede estar alterado en casos de hipotiroidismo, diabetes mellitus, obesidad, síndrome nefrótico, pancreatitis aguda, ictericia obstructiva, hiperadrenocorticismo, ciertas retinopatías, insuficiencia hepática, sindrome de mala absorción, errores innatos del metabolismo e hipertiroidismo entre otros (7). El método de Friedewald (8), utilizado tradicionalmente en humanos, es usado algunas veces en medicina veterinaria, en este método, el colesterol HDL es precipitado en presencia de ácido fosfotungstico y determinado mediante el método enzimático-colorimétrico aplicado para la determinación del colesterol total de la muestra y además son determinados los niveles de triglicéridos mediante un método enzimático-colorimétrico. Luego los valores de los triglicéridos son divididos entre 5 y este valor corresponde a los niveles de colesterol-VLDL. Los valores de colesterol LDL son calculados mediante la siguiente fórmula: Colesterol LDL = colesterol total - colesterol HDL - colesterol VLDL Pero hace falta estudiarlo más a fondo y validarlo en especies con patrón HDL, ya que es necesario saber si existe justificación para usar este método en animales que

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presentan una patrón metabólico diferente al del humano. El método de Friedewald no utiliza mediciones del colesterol LDL, sino que lo calcula mediante fórmula, mientras que otros métodos si lo hacen. Además está demostrado que el método de Friedewald no es adecuado, para hacer determinaciones de perfil lipidico en ciertas condiciones asociadas con hipertrigliceridemia, en hiperlipidemias tipo III y en ciertas dislipidemias secundarias, entre las cuales se incluye la uremia en humanos (9). Asimismo deben tenerse en cuenta, condiciones especiales en algunas especies con patrón HDL, por ejemplo, los caninos, una especie HDL, en la cual no se ha demostrado un papel apreciable actividad de la CETP en la circulación (10, 11) y por lo tanto, el intercambio de triglicéridos por ésteres de colesterol entre HDL y VLDL o LDL no debe ser considerado. Además, los caninos secretan VLDL que contienen apo-B48 (12), lo que explica un nivel bajo de lipoproteinas que contienen apo-B, como resultado de una mayor remoción hepática, dada el rápido reconocimiento y unión a los receptores hepáticos de estas partículas (13). Podría decirse que el método directo, en el cual un detergente específico solubiliza el colesterol de las lipoproteínas HDL, VLDL y quilomicrones y después un segundo detergente específico, solubiliza el colesterol de las lipoproteínas LDL de la muestra, para posteriormente cuantificar el colesterol de LDL espectrofotométricamente (3) es el más confiable aunque, este método presenta el inconveniente de los altos costos que representa su ejecución. En un estudio que buscaba evaluar el colesterol ligado a lipoproteínas de alta y baja densidad (C–HDL y C–LDL) en varias especies de animales domésticos,

se precipitaron las LDL con sulfato de polivinilo disuelto en polie-tilenglicol a pH 6,7, tras lo cual se procedió a determinar el colesterol en el sobrenadante (13). Este último, así como el colesterol total (incorporado para asegurar el estado de normocolesterolemia), fueron determinados mediante técnica enzimática de oxidasa–peroxidada. Los valores en ese trabajo un valor promedio total para colesterol LDL en mg/dl de 30±16, lo que corresponde a valores superiores a los aportados por los dos métodos (Directo 27.9±6.4 y Friedewald 29±7). Por otro lado, estudios recientes mostraron que existe diferencia significativa entre el método directo y el método de precipitación, sí como entre el método de Friedewald y el de precipitación para determinar valores de colesterol LDL en equinos, por lo que no se recomienda el método de precipitación para tal fin (14, 15). En la literatura consultada no se encontraron referencias relacionadas con la determinación del perfil lipídico completo en especies con patrón HDL. En conclusión se encontró que los dos métodos utilizados dieron valores significativamente similares, por lo cual se recomienda la utilización de cualquiera de los dos métodos de precipitación, para la determinación de los valores de colesterol LDL en especies con patrón HDL.

Agradecimientos A M.E. Álvarez de la Universidad de Caldas por su colaboración en la determinación de los perfiles lipídicos.

Osorio - Validación del método de Friedewald de los niveles de colesterol LDL

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Rev.MVZ CórdobaREVISTA 16(2):2554-2563, 2011. • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 2554 MVZ CÓRDOBA

ORIGINAL

Efectos de la concentración de glucosa sobre la activación de la movilidad espermática en bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces, Characiformes) Effect of glucose concentration on sperm motility activation in bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces, Characiformes) Gregorio Martínez,1 M.Sc, Víctor Atencio G,2 M.Sc, Sandra Pardo C,1* Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, FCA/DPA, Grupo de Investigación en Biodiversidad y Genética Molecular - BIOGEM, Sede Medellín, Calle 59A No. 63-020, Medellín, Colombia. 2Universidad de Córdoba, FMVZ/DCA, Centro de Investigación Piscícola – CINPIC, Carrera 6 No. 76-103, Montería, Colombia. *Correspondencia: scpardoc@unal.edu.co. 1

Recibido: Mayo de 2010; Aceptado: Enero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Determinar la concentración de glucosa no activadora de la movilidad espermática como componente de futuros diluyentes para la crioconservación de semen de Prochilodus magdalenae. Materiales y métodos. Se analizó semen inactivo de tres machos obtenido por inducción hormonal. Una submuestra de 0.25 µL de semen de cada macho fue depositada sobre una cámara de Makler y evaluada usando diferentes concentraciones de glucosa (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10%) mediante la adición de 75 µL de cada solución sobre el semen (n=3). De cada solución se determinó la osmolaridad, siendo de 0, 62, 124, 186, 250, 310, 360, 410, 472, 536 y 620 mOsm/kg, respectivamente, así como la del plasma seminal (~250–300 mOsm/kg). Mediante el software Sperm Class Analyzer (SCA) se determinó la velocidad curvilínea (VCL) y recta (VSL) (µm/seg), movilidad rápida (%), media (%) y lenta (%) y el porcentaje de espermatozoides inmóviles. El tiempo de activación de la movilidad (segundos) se obtuvo por cronometraje y visualización bajo microscopio de campo claro. Resultados. Concentraciones de 0 a 5% de glucosa produjeron activación de la movilidad espermática, no obstante, a partir de glucosa al 6% no fue detectada activación visual; sin embargo, SCA detectó movilidad total (7.2%), VCL (5.1 µm/seg) y VSL (1.7 µm/seg). A partir de glucosa al 7% el SCA detectó 100% de inmovilidad, no adquirida posteriormente con agua destilada. Conclusiones. La concentración de glucosa tiene efecto determinante en la viabilidad y activación de semen fresco. Una concentración de 6% de glucosa puede ser utilizada como solución no activadora de la movilidad espermática en futuros diluyentes para la crioconservación de semen de esta especie. Palabras clave: Concentración, conservación del semen, glucosa, motilidad espermática, peces, tolerancia a la glucosa. (Fuentes: AIMS, CAB, DeCS).

2554

Martínez - Efecto de la concentración de glucosa en la movilidad espermática en bocachico 2555

ABSTRACT Objective. To determine the concentration of non-activating glucose on sperm motility as a component of future extender for cryopreservation of Prochilodus magdalenae semen. Materials and methods. Inactive semen obtained by hormonal induction from 3 males was analyzed. From each male, 0.25 µL of semen was deposited on Makler’s chamber, and then a fixed amount of 75 µl of glucose solution was added to each drop given a final concentration of, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10%. Each male was checked 3 times (n=3). Osmolarity was determined in each seminal sample (~250-300 mOsm/Kg) and into each solution, (0, 62, 124, 186, 250, 310, 360, 410, 472, 536 y 620 mOsm/kg, respectively. The software Sperm Class Analyzer (SCA) was used to determine the curvilinear (VCL μm/sec) and straight (VSL, μm/sec) velocity (VSL, μm/sec), likewise, the rate of sperm motility (rapid, medium, and slow) was determined. Rate of immotile sperm was also determined. The activation time of motility (seconds) was obtained under light-field microscope. Results. Glucose Concentrations of 0 and 5% caused activation of sperm motility. Sperm activation was not visually detected in samples with glucose concentrations of 6% or higher. However, the SCA detected a total sperm motility of 7.2%, a VCL of 5.1 μm/sec and a VSL of 1.7 μm/sec. The SCA detected 100% non motile sperm in samples with 7% glucose solution and the motility was not subsequently acquired when distilled water was added. Conclusions. Glucose concentration has a determining effect on viability and activation of fresh sperm. Concentration of 6% glucose solution can be use as a non-activating solution for sperm motility in extenders for sperm cryopreservation in this specie. Key words: Concentration, fishes, glucose, glucose tolerance, sperm motility, semen preservation. (Sources: AIMS, CAB, DeCS).

INTRODUCCIÓN El bocachico, Prochilodus magdalenae, es un pez suramericano perteneciente a los Characiformes. En Colombia se encuentra distribuido en los ríos Magdalena, Cesar, San Jorge, Cauca, Ranchería y Sinú (1), convirtiéndose en uno de los peces de mayor importancia económica en el país. No obstante, en Colombia, de acuerdo con el INPA (2), en el periodo comprendido desde 1986 a 1995, su captura por pesca extractiva disminuyó de 28501 a 5690 toneladas respectivamente para cada año, presentándose una declinación cercana al 80%, por lo que el desarrollo de tecnologías biotecnológicas como la crioconservación espermática podrían aportar a la conservación de la especie. Dado que el semen fresco de bocachico, al igual que en la mayoría de peces de agua dulce, activa su movilidad al contacto con soluciones hipotónicas, es necesario antes y durante la crioconservación garantizar un medio que mantenga dicha inactivación de la movilidad, lo que podría mejorar la sobrevivencia espermática

posdescongelación y mejorar así el éxito de la fecundación. Para ello, la modificación del ambiente celular (osmolaridad) a través del uso de azúcares (3) y soluciones salinas (4) ha sido exitosa para algunas especies de peces de agua dulce. La osmolaridad se define como la concentración de solutos totales en una solución, con la propiedad de ejercer presión dentro de dicha disolución. Esta propiedad de los solutos está estrechamente relacionada con lo que se denomina presión osmótica, la cual está involucrada en la regulación del flujo de agua a través de una membrana, fenómeno llamado ósmosis. De este modo, cuando la concentración de solutos (mOsm/kg de agua) es menor en el medio donde se encuentra inmersa una célula que en su propio citosol (hiposmótica), esta tiende a aumentar su volumen, introduciendo agua del medio; mas, cuando la célula se encuentra inmersa en una solución concentrada (hiperosmótica), sufre reducción del tamaño y arrugamiento de

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la membrana por la salida de agua (5). En ambos casos, el flujo o eflujo de agua celular se da hasta regular la osmolaridad. En cuanto a la deshidratación de células espermáticas, si ésta es excesiva, la osmolaridad intracelular podría llegar a ser muy alta, intoxicando la célula, o la deshidratación podría impedir a la membrana plasmática recuperar su forma en el proceso de descongelación, lo cual impediría el desarrollo de las señales transduccionales mediadas por canales iónicos ubicados en la membrana y que dan lugar a la activación espermática (6). Por el contrario, la falta de la pérdida de agua para alcanzar el potencial de equilibrio por parte de la célula, desencadenaría el congelamiento intracelular (7) que finalmente puede provocar daños mecánicos a la ultraestructura, proteoma, genoma o a su conjunto.

el interrogante de qué puede ser más favorable para la célula espermática para lograr una eficiente deshidratación, ¿Que la presión osmótica extracelular sea hipotónica o hipertónica?. La utilización de diluyentes que faciliten la deshidratación celular (ligeramente hipertónicos) o que la impidan o controlen (ligeramente hipotónicos), son herramientas que permitirían el manejo de la formación de cristales intracelularmente, con el fin de garantizar el mejoramiento de algunas variables de viabilidad espermáticas afectadas negativamente por el criodaño. El objetivo del presente estudio fue determinar la concentración de glucosa inhibitoria de la activación de la movilidad espermática, como base protocolaria para la preparación de futuros diluyentes aptos para la crioconservación de semen de Prochilodus magdalenae.

Pegg (8) menciona que los eventos osmóticos que dan lugar a la pérdida de agua durante la congelación son muy importantes para el éxito de la crioconservación. Las investigaciones en semen relacionadas con la evaluación de niveles de osmolaridad extracelular del diluyente como factor de hidratación o deshidratación celular para preparar al espermatozoide para la congelación, no han sido reportadas ampliamente en la literatura nacional o internacional, y en los experimentos de crioconservación de semen en peces de agua dulce se hace necesaria la regulación de la osmolaridad externa de la célula, medio en el que permanecerán congeladas las células espermáticas; esto es para muchos autores, garantizar un medio isotónico (9) que impida la activación (movilidad) espermática por choque hiposmótico con el medio extracelular (10).

MATERIALES Y MÉTODOS

Así, la falta de la regulación de la osmolaridad extracelular, impediría la crioconservación y la garantía de viabilidad fecundante del espermatozoide al final del proceso de congelación; pues una vez activado, la movilidad durará poco tiempo (10). Al observar la teoría de Pegg (8), donde destaca la importancia de la pérdida de agua intracelular, surge

Especímenes. Fueron utilizados 3 machos adultos de bocachico P. magdalenae (uno por cada réplica de tratamiento, peso corporal 195±7.5g), para el experimento de inhibición de la movilidad espermática con glucosa. Todos los especímenes hicieron parte de un grupo de reproductores adaptados y mantenidos bajo condiciones de cautiverio en estanques del CINPIC (Centro de Investigación Piscícola de la Universidad de Córdoba, Colombia). Los ejemplares seleccionados fueron capturados y trasladados a recintos circulares de manejo (6 m3), donde permanecieron durante 24 horas, con el propósito de habituarlos a las condiciones experimentales, reducir la intensidad del estrés generado por la manipulación y cambio de ambiente. Maduración de gónadas. La maduración final de las gónadas y la espermiación se obtuvo con una inyección intramuscular de Extracto Pituitario de Carpa (EPC), equivalente a 4.5 mg/kg. Manejo de reproductores y extracción de semen. El semen se obtuvo entre 6 y 7 horas después de la inyección de EPC. Para la extracción los reproductores fueron

Martínez - Efecto de la concentración de glucosa en la movilidad espermática en bocachico

previamente tranquilizados por inmersión en una solución de 2-fenoxietanol (300 ppm, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) hasta evidenciar la pérdida del eje de nado. El semen fue obtenido mediante masaje abdominal en sentido cráneo-caudal, colectándolo directamente en un tubo plástico tipo Eppendorf de 1.5 mL, aforado, estéril y seco, evitando la contaminación con restos de agua, orina o heces. Evaluación seminal. Inmediatamente después se realizó la primera evaluación seminal, con el fin de conocer la calidad espermática, teniendo como criterio la movilidad total (%) y la movilidad rápida (%), con valores superiores a 80% y 75%, respectivamente. Simultáneamente, se tomó una muestra de 400 µL de semen de cada uno de los machos en forma separada, las cuales fueron centrifugadas en tubo tipo Eppendorf de 1.5 mL a 14000 gravedades durante 5 minutos para la obtención del plasma y posterior determinación de su osmolaridad en mOsm/kg, mediante osmómetro (Precision, Osmometer III, USA). Determinación del efecto de la glucosa. Para determinar el efecto de cada una de las concentraciones de glucosa sobre la inhibición de la activación de la movilidad espermática de P. magdalenae, muestras de semen fresco de cada uno de tres machos (n=3) fueron utilizadas para este fin. El semen de cada macho fue diluido una sola vez con diferentes soluciones de glucosa en agua desionizada (0 mOsm/kg) a concentraciones de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10%, determinándose simultáneamente las diferentes características de movilidad espermática con el fin de establecer el grado de inactivación del mismo, para obtenerse al final tres análisis de la movilidad espermática en respuesta a cada concentración de glucosa. La osmolaridad de cada solución de glucosa fue determinada previamente al inicio del experimento. Para esto, muestras individuales de 100 µL fueron analizadas en osmómetro (Precision, Osmometer III, USA).

2557

Caracteristicas seminales. Se estimaron características de movilidad espermática como: porcentaje de espermatozoides rápidos, medios y lentos, movilidad total (%), porcentaje de espermatozoides inmóviles, velocidad curvilínea (VCL) y lineal (VSL), además del tiempo de activación de la movilidad, Ti-Ac, (seg.), las cuales fueron utilizadas como variables respuesta para determinar el efecto de la concentración de glucosa sobre la movilidad espermática en semen fresco. Movilidad espermática. En todos los casos, para la estimación de la movilidad espermática, 0.25 µL de semen fresco fueron depositados sobre una cámara de conteo Makler (Sefi, Medical Instruments Ltd., Israel), posteriormente, la movilidad fue activada con 75 µL de agua destilada para obtenerse una relación final 1:301 (procedimiento previamente estandarizado con el software para capturar entre 300 y 400 espermatozoides por campo), procediéndose a analizar la muestra a través de microscopio óptico de contraste de fase (Nikkon, E50i, Japón) adaptado al sistema de análisis seminal asistido por computador Sperm Class Analyzer (SCA, VET 01, Microptic SL, España), obteniéndose un dato promedio por muestra, producto de dos análisis por campo, registrados dentro de los 4 segundos posteriores a la activación de la movilidad espermática. Tiempo de activación. Para la determinación del tiempo de activación de la movilidad espermática (Ti-Ac) fueron tomados 2 µL de semen (n=3) y ubicados sobre portaobjeto (25.4 mm x 76.2 mm). La muestra seminal fue activada con 10 µL de agua destilada e inmediatamente después evaluado el tiempo de activación por cronometraje del mismo hasta que aproximadamente el 90% de los espermatozoides en la muestra cesaran su movilidad. El tiempo de activación fue estimado en segundos (seg), utilizando microscopio de luz (Carl Zeiss, Axiostar, Alemania) a una magnificación de 10x, el cual poseía una cámara adaptada (Canon Power Shot G5, Japón) que permitía la captura y exportación de video hacia un

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monitor en tiempo real, para mejorar la visualización de la movilidad y por tanto la estimación del tiempo de activación.

Las osmolaridades correspondientes a las distintas soluciones de glucosa, respectivamente desde 0% hasta 10%, fueron: 0, 62, 124,186, 250, 310, 360, 410, 472, 536 y 620 mOsm/kg.

Análisis estadistico. Todos los datos fueron expresados como promedio ± desviación estándar. Los análisis estadísticos fueron realizados utilizando SAS versión 9.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Todas las características de movilidad espermática fueron probadas con el test de Brown y Forsythe (homogeneidad de la varianza) y su normal distribución fue probada usando el test de Kolmogorv-Smirnov. En caso de no tener una distribución normal, se transformaron con arco seno. Las diferencias significativas fueron probadas mediante ANOVA, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey (p< 0.05).

La movilidad espermática en P. magdalenae se vio activada casi completamente con la adición de glucosa 0% hasta 4% (0 – 250 mOsm/kg), donde la movilidad total se mantuvo entre 99.5 ± 0.5% y 100±0.0% (Figura 1a), el tiempo de activación de la movilidad (Ti-Ac) entre 31.99±3.25 seg. y 37.16±1.53 seg. (p>0.05) (Figura 1b) y el porcentaje de espermatozoides inmóviles (Figura 1c) estuvo cercano a 0% (0.1±0.03%) (p>0.05). Asimismo, se observó un descenso de casi 7% en la movilidad total cuando la concentración de glucosa alcanzó el 5% (93.2±5.8%) sin ser estadísticamente diferente de los anteriores tratamientos (p>0.05). No obstante, al alcanzarse la concentración de glucosa 6% (360 mOsm/kg), la disminución de la movilidad total fue significativa (p<0.05), llegando a valores de 7.23±2.52%. Concentraciones de glucosa superiores (7, 8, 9 y 10%), inhibieron la activación de la movilidad espermática hasta en un 100%, sin embargo, cabe señalar que la reactivación de la movilidad seminal mediante la adición de agua destilada, posterior a la

b 0

30 20

80 60 40

20 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentración de glucosa % (w/v)

9 10

Concentración de glucosa % (w/v)

Movilidad lenta (% de espermatozoides)

Movilidad media (% de espermatozoides)

Concentración de glucosa % (w/v)

100

10 9 10

100

40 20 0

b b 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentración de glucosa % (w/v)

100

50 0 -50

80 60

c 150

Movilidad rápida (% de espermatozoides)

100

Espermatozoides inmóviles (%)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentración de glucosa % (w/v)

30 20 10 0

b 0

2 3

5 6

7 8

9 10

Concentración de glucosa % (w/v)

250 Velocidad curvilínea (µm/seg.)

150

Ti-Ac (Seg.)

Movilidad total (% de espermatozoides)

El semen recién obtenido de los machos utilizados en el experimento (n=3) presentó las siguientes características: volumen seminal 0.64 ± 0.15 mL, movilidad total 99.98 ± 0.03%, movilidad rápida de 79.6 ± 3.1% y osmolaridad del plasma seminal de 278.67±21.06 mOsm/ kg (~250 - ~300 mOsm/kg).

200 150

100 50 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentración de glucosa % (w/v)

150 Velocidad lineal (µm/seg.)

RESULTADOS

a 100

ab 50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentración de glucosa % (w/v)

Figura 1. Características de movilidad y velocidad en semen fresco de bocachico Prochilodus magdalenae diluido con glucosa en diferentes concentraciones. a. Movilidad total (%); b. Tiempo de activación (Ti-Ac, seg); c. Espermatozoides inmóviles (%); d. Espermatozoides con movilidad rápida (%); e. Espermatozoides con movilidad media (%); f. Espermatozoides con movilidad lenta (%); g. Velocidad curvilínea; h. Velocidad lineal. Valores mostrados como media ± SD. Entre medias, letras distintas son significativamente diferentes (p<0.05). n=3.

Martínez - Efecto de la concentración de glucosa en la movilidad espermática en bocachico

inhibición de la activación con glucosa 7%-10% (410–620 mOsm/kg), fue nula a pesar de la adición excesiva de ésta, pero la reactivación sí fue posible para semen del tratamiento de glucosa 6%. Aunque la movilidad total no varió significativamente entre concentraciones de glucosa desde 0% hasta 5%, sí se afectó el tipo de movilidad, tiempo de activación de la movilidad y velocidad con que estos se desplazaban. Así, la movilidad rápida (Figura 1d) registrada en el tratamiento de glucosa al 5%, disminuyó significativamente (p<0.05) con respecto al grupo de tratamientos de 0-4%, llegando a valores de 0.97±0.6%, movilidad media de 11.3±5.1% (Figura 1b) y una movilidad lenta de 81.13±7.09% (Figura 1e), indicando claramente que en este tratamiento se inicia una lentificación significativa (p<0.05) de la movilidad espermática sin anularla totalmente, siendo el tratamiento glucosa 6% el que se constituye nuevamente en inhibidor de la movilidad, al generar una caída final del tiempo de activación de la movilidad (0 seg), de la movilidad rápida (0%), movilidad media (0%) y de la movilidad lenta (7.23±3.52%), este último valor que a la postre se convierte en el único índice de movilidad total en este tratamiento (Figura 1f). Por su parte, la velocidad espermática también confirma que la movilidad para P. magdalenae se redujo significativamente a partir del contacto con glucosa 5% (VCL=35.9±8.35 µm/seg, VSL=18.7±3.2 µm/seg), alcanzando éstas variables, sus menores valores en glucosa 6% (VCL=1.83±0.17 µm/ seg, VSL=0.7±0.21 µm/seg). Siendo anulada la velocidad en su totalidad en el intervalo de glucosa 7% - 10% (0 µm/ seg) (Figuras 1g y 1h).

DISCUSIÓN La activación de la movilidad espermática en peces de fertilización externa ocurre por los cambios iónicos y de osmolaridad que suceden cuando los espermatozoides entran en contacto con el agua una vez

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liberados en el proceso de reproducción (11). Asimismo, se ha encontrado que el inicio de esta puede depender de la presencia extracelular de iones como Na+, Ca2+ o K+ (6, 10, 12), y en algunos casos, sólo de la variación de la osmolaridad extracelular originada o no por iones (13). En el presente trabajo se observó que la activación espermática de P. magdalenae se genera, incluso, sin la presencia de iones en el medio (0 mOsm/kg = 0% glucosa), por lo que pudiera afirmarse que en este caso la activación depende solamente del choque hiposmótico no iónico, por simple disminución de la osmolaridad, tal como se reporta para peces ciprínidos (12), sin ser estrictamente necesario algún tipo específico de ión para inducir la transducción de la señal activadora de la movilidad, tal como se requiere en el caso de los salmónidos, donde la presencia de K+ extracelular es fundamental para la señal que resulta en la hiperpolarización membranal, la cual da inicio a la activación de la movilidad espermática (14). Una vez la movilidad espermática inicia, su duración es corta, frecuentemente menor a un minuto, terminando generalmente con una hidratación asociada a la hipotonicidad del medio de activación, que puede generar eventualmente daño celular (15). No obstante, este evento de daño no ocurre para células de P. magdalenae, a pesar que el semen fue activado en un medio extremadamente hipotónico, como lo fue el tratamiento de glucosa 0% (solo agua desionizada = 0 mOsm/kg). Contrario a ello, esta osmolaridad mantuvo siempre la movilidad espermática a niveles estadísticamente iguales al resto de tratamientos con osmolaridades superiores (glucosa 1,2,3 y 4%) y que generaron algún tipo de movilidad y velocidad, sin generar incluso muerte celular, considerando que la inmovilidad espermática también en esta osmolaridad alcanzó un valor promedio de tan sólo 0.5%. Este mismo comportamiento fue evidente durante la activación de la movilidad espermática de piabanha Brycon insignis, donde ésta se mantuvo constante (100%) desde osmolaridades de 0 hasta

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274 mOsm/kg (16). Es posible que este tipo de células posean una membrana con funciones fisiológicas y evolutivamente adaptadas para responder a un rango amplio de osmolaridades, incluyendo 0 mOsm/kg, sin que esto pueda afectar en gran medida la viabilidad espermática por daños como la ruptura de membrana. Esto puede evidenciarse cuando se observa la variación extrema en la constitución físico-química de sistemas lóticos colombianos (17), lo que pudiera sugerir dicha adaptación, sistemas naturales donde se llevan a cabo eventos reproductivos de diferentes especies de peces caraciformes. A pesar de no atribuírsele daño celular a una gran hipotonicidad del medio de activación, el tiempo de activación de la movilidad sí fue inferior a 1 minuto (31.99 seg. – 37.16 seg) mientras se observó activo (0%-4%), y es generalmente lo estimado para peces de agua dulce, especialmente atribuible al descenso rápido en los contenidos de ATP (18). Aunque el tiempo de activación en peces como Rhamdia quelem inicia a osmolaridades de 0 mOsm/kg (0% NaCl), su duración es estadísticamente igual a espermatozoides inmóviles (8‰ NaCl, 0 seg) y estadísticamente inferior a tratamientos que alcanzaron altas movilidades (2 y 6% NaCl) (19), lo que es contrario a lo acontecido con P. magdalenae, donde 0 mOsm/kg produjo un tiempo de activación de la movilidad espermática estadísticamente superior a los inmóviles (7%-10%) e igual al resto de tratamientos que generaron alta movilidad (1%-4%). Por otra parte, en este estudio se encontró que la declinación significativa de variables como el porcentaje de movilidad y la velocidad, inició, en forma general, cuando la concentración de glucosa fue del 5% (310 mOsm/kg), cayendo casi definitivamente cuando la glucosa asciende a 6% (360 mOsm/kg). Asimismo, considerando que la osmolaridad del plasma seminal de la especie se determinó en ~250–300 mOsm/kg, puede afirmarse que el inicio de la inmovilidad sólo puede alcanzarse cuando el medio de activación supera

entre ~10–60 mOsm/kg al plasma seminal, sin bastar incluso con que el mismo medio fuese siquiera isosmótico (glucosa 4%=~250 mOsm/kg), el cual activó también la movilidad espermática. Esto concuerda con estudios realizados en peces teleósteos de agua dulce como piabanha Brycon insignis (16) y el barbo Barbus barbus (Cyprinidae) (20) donde la disminución de la movilidad y la velocidad también iniciaron cuando la osmolaridad del medio de activación alcanzó valores de 342 y 350 mOsm/kg respectivamente, es decir, ~56 y ~70 mOsm/kg por encima de la osmolaridad del plasma seminal respectivamente de cada especie. Estas mismas investigaciones demuestran que las mayores velocidades y porcentajes de movilidad se alcanzan con osmolaridades menores y muy próximas a las del plasma seminal. En P. magdalenae, en el presente estudio, la movilidad rápida, media o las velocidades, muestran siempre que el valor óptimo se alcanza con glucosa 3%=~186 mOsm/kg, el tratamiento más próximo y menor a la osmolaridad del plasma en el experimento, esto último, considerando que el tratamiento glucosa 4% poseía una osmolaridad de ~250 mOsm/kg, igual a la del plasma. Es posible que siendo un pez de agua dulce y aunque su activación no depende de iones extracelulares, puede que el mecanismo de activación de la movilidad para esta especie, al igual que para Perca (21), tenga sus bases en el hecho que la entrada de agua al interior celular, luego del shock hiposmótico, genere la dilución de un ión específico, no necesariamente K+, como en el caso de zebrafish, cuya disminución en su concentración al interior de la célula, sea la señal que de inicio a la activación de la movilidad, pero que su punto de activación óptimo responde a una concentración también óptima del mismo ión. Sin embargo, esta osmolaridad óptima de activación puede no ser igual para todas las especies de peces de agua dulce. Así por ejemplo, el mayor porcentaje de movilidad espermática para B. barbus se

Martínez - Efecto de la concentración de glucosa en la movilidad espermática en bocachico

determinó entre 215–235 mOsm/kg (20), entre 125–235 mOsm/kg para el lucio Esox lucius (22), en Perca Perca fluviatilis entre 100–150 mOsm/kg (21), 100-300 mOsm/ kg en tilapia Sarotherodon melanotheron (23) y entre 0–150 mOsm/kg para barbo rosado Puntius conchonius (24), debido entre otros, a la misma naturaleza de factores composicionales del plasma (iones y osmolaridad) (24). Al parecer la inhibición total de la movilidad espermática en algunos caraciformes neotropicales inicia bajo un mismo nivel de osmolaridad. Esto es que en P. magdalenae, en este estudio, se encontró que a partir de 410 mOsm/ kg eran inhibidos en su totalidad todos los índices de movilidad, el mismo nivel que el hallado para B. insignis, en cuyo caso la movilidad total a partir de allí y hasta 547 mOsm/kg (la máxima) registró 0% (16). De otro modo, cabe señalar también que aunque valores en la concentración de glucosa iguales o superiores a 7% (410 mOsm/kg–620 mOsm/kg) lograron mantener la inmovilización espermática en P. magdalenae, éstas no permiten la reactivación de la movilidad posteriormente con agua destilada sin importar la dilución que se haga de dicha concentración de glucosa (dato no mostrado). Es posible que este rango de osmolaridad esté por fuera del rango máximo de tolerancia que pueden resistir las células espermáticas de esta especie, dada su

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adaptación a sistemas de agua dulce hipotónicos y no a sistemas de altas osmolaridades como en el caso de los peces marinos, cuya movilidad inicia con shocks hipertónicos que alcanzan valores alrededor de 1200 mOsm/kg (25), por lo cual, más que una inhibición de la activación de la movilidad espermática, estas osmolaridades pudieran estar generando una elevada deshidratación celular al punto de intoxicar a la célula por concentración de sus solutos citosólicos o debido a daños generados por cambios bruscos en las propiedades de la membrana, la cual se ha demostrado por varios estudios, es de vital importancia durante la activación, considerando que factores ambientales como los iones y la osmolaridad interactúan con ella para el inicio de la movilidad a través de cambios en su potencial osmótico y su conductividad iónica (6). En conclusión, podría sugerirse que concentraciones iguales o superiores al 6% permiten mantener la inactivación de la movilidad espermática de P. magdalenae, sin embargo, concentraciones de 7% a 10% no permiten activar después la movilidad con agua destilada a pesar de la adición abundante de ésta al medio seminal. No obstante, son necesarios estudios más profundos sobre los mecanismos iónicos que sustentan la movilidad espermática de la especie, de modo que puedan ser optimizados sus protocolos de inmovilización y activación, para procesos de biotecnología o reproducción.

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Rev.MVZ CórdobaREVISTA 16(2):2564-2575, 2011. • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 2564 MVZ CÓRDOBA

ORIGINAL

Aislamiento y serotipificación de Salmonella sp. en estanques con Crocodylus intermedius y testudines cautivos en Villavicencio - Colombia Isolation and serotyping of Salmonella sp. in ponds with captive Crocodylus intermedius and testudines in Villavicencio – Colombia Diana Pachón C,

Mic. Agríc y Vet, Adriana Pulido V, 1* M.Sc, , Carlos Moreno T,

MV.

Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Unidad de Investigaciones Agropecuarias – UNIDIA – Línea de epidemiología y salud animal. Bogotá – Colombia. 2 Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Departamento de Ciencias para la Salud Animal. Laboratorio Clínico. Bogotá – Colombia. *Correspondencia: adriana. pulido@javeriana.edu.co 1

Recibido: Febrero de 2010; Aceptado: Enero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Determinar la presencia de microorganismos del género Salmonella sp. en el ambiente acuático de los ejemplares Crocodylus intermedius y testudines en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco (EBTRF). Materiales y métodos. En este estudio se utilizó la metodología estándar para aislar e identificar microorganismos del género Salmonella sp., a partir de muestras de agua y sedimento de 52 estanques (nEstanques Crocodylus=25; nEstanques testudines=27); se procedió a serotipificar los aislamientos por el método convencional de Kaufmann-White y se realizaron pruebas de sensibilidad a antimicrobianos por la técnica de Kirby Bauer. Resultados. Se determinó la presencia de Salmonella sp., en un 33% del total de estanques muestreados. El 29% de los aislamientos de Salmonella sp. serotipificados, correspondió al serogrupo B; los serogrupos C, C1, C2 y D1 presentaron menores porcentajes. Con las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos se determinó que el 100% de los aislamientos fueron sensibles a norfloxacina. Conclusiones. La ocurrencia de Salmonella sp., en los estanques de la EBTRF fue del 33%, con la mayor presencia del serogrupo B, donde se encuentran especies con características ampliamente zoonóticas. Con los resultados obtenidos es necesario el seguimiento de las normas de bioseguridad establecidas en la estación para el manejo de las poblaciones allí mantenidas y evitar de esa manera la ocurrencia de cuadros zoonóticos. Palabras clave: Crocodylus intermedius, testudines, Salmonella sp., serotipificación, zoonosis. (Fuente: AIMS).

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Pachón - Aislamiento y serotipificación de Salmonella sp., en estanques con Crocodylus

2565

ABSTRACT Objective. To determine the presence of Salmonella sp., in aquatic environment of Crocodylus intermedius and testudines at the Estación de Biología Tropical Roberto Franco (EBTRF). Materials and methods. Standard methodology was used to isolate Salmonella sp., from water and sediment samples of 52 ponds (nponds Crocodylus=25; nponds testudines=27). Salmonella, isolates were serotyped by the Kaufmann-White conventional method and tested for antimicrobial susceptibility by Kirby Bauer technique. Results. The presence of Salmonella sp., was found in 33% of the ponds checked, of which 29% corresponded to serogroup B. Serogrups C, C1, C2 and D1 were detected in a lower percentage. By means of the antimicrobial susceptibility test, 100% of isolates were sensitive to norfloxacin. Conclusions. The predominant presence of Salmonella sp., at EBTFF ponds, corresponded to serogroup B (33%), including species of widely zoonotic characteristics. According to the results, it is necessary to establish biosafety standards at the Estación de Biología Tropical Roberto Franco to avoid zoonotic problems. Key words: Crocodylus intermedius, testudines, Salmonella sp., serotyping, zoonoses. (Source: AIMS).

INTRODUCCIÓN La Estación de Biología Tropical Roberto Franco (EBTRF), ubicada en la ciudad de Villavicencio – Meta, es un centro de recuperación de fauna silvestre, especialmente reptiles en amenaza y/o vía de extinción, que con el manejo de dichas poblaciones logra minimizar el riego de extinción de las especies (Tabla 1)(1); su labor se encamina al cuidado y recuperación de ejemplares de Crocodylus intermedius y Testudines, allí se llevan a cabo investigaciones en el ámbito reproductivo que permiten la repoblación de estos ejemplares. La Salmonella sp., es un microorganismo perteneciente a la familia Enterobacteriacea, un reconocido patógeno de mamíferos, pero que hace parte de la flora comensal del tracto gastrointestinal de los reptiles, por lo que éstos son considerados como portadores asintomáticos; sin embargo, puede comportarse como oportunista y colonizarlos también sistémicamente teniendo como vía de entrada el agua, el suelo, el alimento contaminado y/o mediante transmisión vertical (2). La susceptibilidad de los reptiles a patologías causadas por enterobacterias especialmente del género Salmonella sp, se

relacionan con estados de inmunodepresión en el animal, lo que se puede producir a causa del estrés por cautiverio, a la alteración en temperaturas medioambientales, al número de microorganismos presentes, la edad y el estado nutricional del animal entre otras (2-5). Cuando estas afecciones se presentan el resultado es la alteración de tejidos y fluidos por la generación de coagulación intravascular diseminada, edema, ulceraciones, necrosis, anemia, disminución de la actividad, pérdida de peso progresiva, anorexia, polifagia, regurgitación, diarrea, constipación y letargia (3). Aunque son escasos los reportes acerca de la presencia de Salmonella sp. en estas especies silvestres y específicamente en Crocodylus intemedius, se ha establecido que su presencia es constante, por lo que se deben conocer las serovariedades implicadas y la posible susceptibilidad que tienen tanto de los animales cautivos como de los salvajes, puesto que parece ser que en los centros donde los reptiles están en condiciones de cautiverio, hay mayor posibilidad de aislamiento de esta bacteria que en estado libre (6,7). Con base en lo anterior, es necesario tener en cuenta que el conocimiento de la presencia

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de patógenos tanto en el hábitat como en la población microbiana cloacal de estas especies, es fundamental para diagnosticar desórdenes en la flora digestiva, así como para prevenir infecciones secundarias que puedan poner en peligro la sobrevivencia de los ejemplares (8), todo ello dirigido a optimizar los respectivos programas de conservación. Reconociendo la transmisión de Salmonella sp., por agua y teniendo en cuenta la importancia clínica especialmente en animales inmunosuprimidos, se llevó a cabo el aislamiento e identificación de enterobacterias del género referido, a partir de muestras del agua y del sedimento de los estanques donde se encuentran los ejemplares, además se establecieron los serogrupos que predominan en dichas especies. A pesar de no ser uno de los objetivos planteados, durante la realización de este estudio se realizó una observación sobre la condición general de los ejemplares de Crocodylus intermedius y Testudines cautivos en la EBTRF, debido a que de acuerdo con las listas oficiales de especies amenazadas publicadas por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), son los reptiles las especies de vertebrados más amenazadas en Colombia (1,9); vale la pena aclarar que no sé realizó examen clínico a fin de evitar un “estrés” adicional por la manipulación de los ejemplares. El objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de microorganismos del género Salmonella sp., en el ambiente acuático de los ejemplares Crocodylus intermedius y Testudines en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco (EBTRF).

MATERIALES Y MÉTODOS Análisis de datos. Los datos obtenidos fueron analizados mediante estadística descriptiva y su interpretación se facilitó con la elaboración de tablas, histogramas y gráficos circulares, entre otros.

Sitio de estudio. Esta investigación se llevó a cabo en la EBTRF ubicada en la ciudad de Villavicencio Meta, centro de investigación de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá. Las condiciones climáticas muestran un régimen de lluvias unimodal con una precipitación media anual de 4085 mm; temperatura promedio de 27°C y una humedad relativa de 77.8% (9). La EBTRF, cuenta actualmente con una colección viva que supera los 300 ejemplares de tortugas terrestres nativas del país, distribuidas en más de 20 especies (Tabla 1) y adicionalmente un número mayor a 200 ejemplares de Crocodylus intermedius distribuidos en diferentes grupos etáreos entre los que se encuentra una gran cantidad (80%) de neonatos y juveniles, producto de investigaciones en el área reproductiva. Población muestreal. El muestreo se realizó sobre la totalidad de estanques (N=52) de la Estación. El total de animales muestreados en forma indirecta fue de 29 caimanes adultos (4 años en adelante) distribuidos en 8 estanques, 118 ejemplares juveniles (3–4 años) ubicados en 8 estanques y 80 caimanes neonatos (1–2 años) distribuidos en 9 estanques (nEstanquesCrocodylus=25). Se muestrearon un total de 342 individuos del Orden Testudinea distribuidos en 19 especies (Tabla 1) de las cuales 14 se encuentran en diferentes grados de riesgo de extinción (1); cabe resaltar que dichos ejemplares se encontraban ubicados en 27 estanques (nEstanques testudines=27). A pesar de haberse realizado un muestreo indirecto con el fin de evitar el estrés por captura, fue evidente que todos los ejemplares se encontraban clínicamente sanos. En la EBTRF, no se han presentado brotes epidemiológicos de salmonelosis en los ejemplares. Muestreo. Se realizaron tres muestreos seriados con un rango de diferencia de 15 días cada uno, dada la característica

Pachón - Aislamiento y serotipificación de Salmonella sp., en estanques con Crocodylus

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Tabla1. Ejemplares colección viva EBTRF Especies Nombre Científico Caimanes

Nombre Común

Crocodylus intermedius

Caimán del Orinoco / Caimán Llanero

Caiman crocodylus

Babilla

Tortugas

Nº Estques Muestreados

Nº Ejempls Muestreados

227

342

Grado de Riesgo (1) Peligro Crítico Preocupación menor

Rhinoclemmys melanosterna

Palmera

Casi amenazado

Rhinoclemmys diademata

Inguensa

Vulnerable

Rhinoclemmys nasuta

Sabaletera

Híbrido Rhinoclemmys

Híbrido

115

Geochelone denticulata

Morroco Amar

Geochelone carbonaria

Morroco Negro

Phrynos gibbus

Hedionda

Sin Peligro

Phrynos geoffroanus

Bachala

Sin peligro

Kinosternon sp.

Tapaculo

Vulnerable

Peltocephalus dumerilianus

Cabezon

Casi amenazado

Chelus fimbriatus

Mata Mata

Casi amenazado

Podocnemis unifilis

Terecay

En peligro / Peligro crítico

Podocnemis vogli

Sabanera

Casi amenazada

Podocnemis expansa

Charapa

En peligro / Peligro crítico

Podocnemis lewyana

Lewyana

En Peligro

Trachemys scripta ornata

Pecho carey

Casi Amenazada

Trachemys scripta callirostris

Icotea

Rhinoclemmys funerea

Sin Peligro

de excreción intermitente de la bacteria por parte del animal (10-13). En caso de reportarse la presencia de Salmonella sp., el estanque positivo fue excluido para el siguiente muestreo y los estanques negativos se muestrearon nuevamente de acuerdo con lo programado. Durante este periodo se suspendió el recambio de agua de los estanques. Recolección de muestra de agua y sedimento de los estanques. Crocodylus intermedius neonatos y testudines. Una vez se homogenizó por agitación el agua de los estanques, se introdujo una jeringa estéril de 50 ml a la cual previamente se le había conectado una sonda estéril de 50 cm de longitud y se realizó aspirado del fondo del estanque obteniendo una muestra total de 250 ml de agua y sedimento, esta se depositó en bolsas de cierre hermético. Se empleó una jeringa y una sonda por cada estanque. Crocodylus intermedius adultos y juveniles. La toma de muestras se realizó a partir de los canales de desagüe, se abrieron los sistemas de evacuación y se

Datos insuficientes Sin peligro En peligro / Vulnerable Peligro crítico

Vulnerable

tomaron aproximadamente 250 ml de agua y sedimento directamente en la bolsa de cierre hermético. Todas las muestras se remitieron debidamente identificadas y fueron transportadas en refrigeración (4°C) por un periodo menor de 6 horas (14-16) para inmediatamente ser procesadas en el laboratorio de microbiología veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá. Aislamiento e identificación de Salmonella sp. El cultivo de la bacteria fue realizado de acuerdo con la norma ISO 6579:2002/Amd 1:2007, con adición de algunos medios de cultivo que han demostrado dar buenos resultados en la recuperación del microorganismo (17-19). Las muestras fueron procesadas para evaluar la presencia de Salmonella sp., siguiendo cuatro pasos en el procedimiento: Pre-enriquecimiento no selectivo. A cada muestra se le adicionaron 250 ml de caldo lactosado estéril e inmediatamente se llevó a incubación a una temperatura de 37ºC, durante un periodo de 18-24 horas (14, 17).

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Enriquecimiento selectivo. A partir del caldo de pre-enriquecimiento no selectivo, se obtuvo con una jeringa estéril 10 ml de la suspensión y se llevó a un tubo de ensayo con 10 ml de caldo tetrationato que se incubó en baño serológico a 43±0.5°C por 24 h (14). Aislamiento en medios selectivos y diferenciales: Se evaluaron dos medios de cultivo selectivos con diferentes fundamentos de identificación: Agar MacConkey (Mck)BD® y CHROMagar OrientaciónBD®, la siembra se realizó mediante técnica de aislamiento o agotamiento de colonias; las cajas se incubaron a una temperatura de 37°C durante 24 h. Transcurrido este tiempo, las colonias compatibles con el género Salmonella sp. se detectaron en agar MacConkeyBD® por su característica macroscópica de ser lactosa negativo y en CHROMagar OientaciónBD® por ser incoloras debido a que no se presenta reacción con los sustratos cromógenos del medio; adicionalmente, en los medios empleados las colonias presentaban borde definido, tamaño aproximado de 1 a 1.5 mm de diámetro y ligeramente convexas (18,19). Identificación preliminar. Las colonias compatibles de Salmonella sp. fueron aisladas en medios diferenciales como Agar Hektoen Entérico (H.E) (17,18) y CHROMagar SalmonellaBD®. Macroscópicamente en H.E las colonias se clasificaban como sospechosas de

Salmonella sp. por su característica lactosa negativo evidenciándose en ella una coloración verde - azulada con precipitado negro en el centro debido a la producción de sulfuro de hidrógeno, lo que le da la apariencia de colonia en “ojo de pescado”. En CHROMagar SalmonellaBD® debido a diferencias metabólicas en la presencia de cromógenos del medio, las colonias de Salmonella sp. se observan de color rosa – púrpura, mientras que los microorganismos pertenecientes a otros géneros se observan con pigmento verde – azulado o son completamente inhibidos (Figura 1) (18). Identificación bioquímica. El reconocimiento definitivo de los microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. se realizó mediante el sistema de identificación BD BBL CrystalBD® para bacterias entéricas/no fermentadoras siguiendo las indicaciones del productor (20,21). Serotipificación. Los aislamientos de Salmonella sp. fueron serotipificados hasta antígeno somático con antisueros polivalentes específicos (B y C) y antisueros monovalentes de grupo (B, C1, C2 y D1), se identificaron de acuerdo al esquema de Kauffman – White (2, 22). Susceptibilidad a antibióticos. La prueba de sensibilidad a antimicrobianos se realizó mediante el método de Kirby – Bauer. Los antibióticos evaluados fueron

Figura 1. Identificación de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios de cultivo selectivos y diferenciales (A. Agar Hektoen, B. CHROMagar SalmonellaBD® y C. CHROMagar OrientaciónBD®).

Pachón - Aislamiento y serotipificación de Salmonella sp., en estanques con Crocodylus

Sulfatrimetoprim 25 µg, Norfloxacina 10 µg, Ampicilina 10 µg, Cloranfenicol 20 µg, Cefoxitin 20 µg, y Tetraciclina 30 µg (10, 18).

25 20

RESULTADOS

Positividad a Salmonella sp. en Estanques de Crocodylus y Testudines. Los N=52 estanques de la EBTFF, se encuentran distribuidos entre las especies de Crocodylus de diferentes grupos etáreos (nEstanques Crocodylus =25, así: 1 con Caiman Crocodylus (Babillas) y 24 con Crocodylus intermedius) y 27 estanques de Testudines (nEstanques Testudines=27). En la figura 2 se encuentran consignados los resultados obtenidos en la totalidad de estanques, donde se estableció que en 17 (33%) de los 52 estanques muestreados

Positivos 33%

Negativos 67%

Figura 2. Estanques positivos para el aislamiento de microorganismos del género Salmonella sp. (N=52)

2569

10 7

5 0 Testudines

Crocodylia

Muestras positivas

Muestras negativas

Figura 3. Muestras positivas y negativas para el aislamiento de Salmonella sp., según orden.

que conforman la colección viva de la EBTRF. (Figura 3) Es necesario aclarar que en el primer muestreo se remitieron al laboratorio 52 muestras de agua y sedimento, en el segundo muestreo 37 y en el tercero 36 muestras; esto debido a que si en alguno de los estanques evaluados se reportaba la presencia de Salmonella sp., no era relevante muestrear nuevamente dicho estanque ya que el estudio estaba condicionado a la evaluación de la presencia/ausencia de la bacteria Serotipificación. Los 17 aislamientos identificados por el método de CrystalBD® como Salmonella sp. se lograron clasificar con antisueros comerciales DIFCO®, hallando 6 serogrupos prevalentes en la Estación. En la figura 4 se observa que de los

fue posible recuperar microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. mientras los 35 (67%) restantes se encontraban negativos para la bacteria.

Grupo D1; 6%

Poli B; 12%

Poli C ; 6% Grupo C 2; 24%

En 9 de los 24 estanques con Crocodylus intermedius se hallo Salmonella sp., y el estanque ocupado con ejemplares de Caiman crocodylus (Babillas) fue igualmente positivo a la bacteria, lo que representa el 40% (n=10) de positividad. Por otro lado, de los 27 estanques de tortugas, 7 (25.9%) fueron positivos para Salmonella sp., encontrándose la presencia del microorganismo en 7 de las 18 especies

Grupo B; 29%

Grupo C 1; 23%

Figura 4. Serogrupos identificados hasta antígeno somático de las cepas aisladas en las muestras de agua-sedimento de los estanques de la E.B.T.R.F

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

aislamientos de Salmonella sp., hallados en las muestras de agua y sedimento, el 29% pertenecen al serogrupo B; mientras que la presencia de las bacterias clasificadas como pertenecientes al serogrupo C1 y serogrupo C2 fue de 23 y 24%, respectivamente. El porcentaje restante de los aislamientos pertenecen a serovariedades incluidas en los serogrupos que abarca el antisuero polivalente B (12%), serogrupo D1 (6%) y serogrupos pertenecientes al polivalente C (6%) Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos. Los resultados obtenidos en las pruebas de sensibilidad a partir de los aislamientos de Salmonella sp. provenientes de Crocodylus y testudines, se encuentran consignados en la tabla 2 y en la figura 5, donde se puede observar Tabla 2. Comportamiento de microorganismos del género Salmonella sp., frente a antibióticos. Sensible (n)

Moderado (n)

Resistente (n)

C**

Ampicilina

C** -

Cefoxitin

Cloranfenicol

Norfloxacina

Sulfatrimetoprim

Tetraciclina

*Testudines, **Crocodylia

Figura 5. Porcentaje de sensibilidad, resistencia y sensibilidad moderada de aislamientos de Salmonella sp. a partir de las muestras de agua-sedimento de Crocodylus y Testudines en la EBTFF.

el comportamiento de diferentes antibióticos.

la bacteria ante

Se puede establecer que existen diferencias notables para cada una de las especies, puesto que las Salmonella sp., obtenidas de muestras provenientes de caimán son mucho más sensibles a los antimicrobianos que las de testudines, donde varios de los aislamientos fueron resistentes a los antibióticos utilizados; por ejemplo, para cloranfenicol todas las cepas provenientes de caimán fueron sensibles mientras que en testudines 4 evidenciaron resistencia al antibiótico.

DISCUSIÓN Es de vital importancia tener en cuenta, que es muy poco lo que se ha investigado a nivel mundial acerca de la presencia de la Salmonella sp. en especies como Crocodylus intermedius, que se encuentran en peligro crítico de extinción (1) y que otros reptiles son el principal objetivo de los centros de conservación y mantenimiento de las especies mediante programas de reproducción. Por muchos años se han encaminado estudios hacia especies que son criadas como mascotas no convencionales o exóticas, tales como iguanas, lagartos, tortugas y serpientes (8, 23-28), pero no en animales con algún grado de amenaza o en vía de extinción; adicionalmente las investigaciones acerca de la presencia de Salmonella sp. en los animales y en su hábitat natural son insuficientes. Si bien es cierto que Salmonella sp. hace parte de la flora normal intestinal de los reptiles y que su aislamiento en testudines de diferentes familias ha sido reportado con mayor frecuencia (8,23,25,26-29) que en Crocodylus; no se puede ignorar que para todos los individuos evaluados tanto tortugas como caimanes, las condiciones de cautiverio donde son mantenidos crean cuadros de inmunosupresión marcada donde la enterobacteria es excretada de manera intermitente (10-13, 30, 31) y que puede llegar a colonizar el tracto digestivo hasta producir cuadros patológicos con estados de letargia, anorexia, septicemia, neumonía,

Pachón - Aislamiento y serotipificación de Salmonella sp., en estanques con Crocodylus

celomitis, abscesos, shock hipovolémico y bajo circunstancias extremas, la muerte del ejemplar (32-34). Aunque todos los reptiles son considerados portadores naturales de Salmonella sp., lagartos, serpientes y tortugas en particular, son reservorios de esta bacteria (23,24,35); sin embargo, no es claro como estas especies son colonizadas de forma natural por serovariedades de Salmonella sp. Respecto de la transmisión, en algunos estudios se ha evaluado la capacidad de colonización de la bacteria en útero, contaminación perinatal, por ingestión de presas contaminadas y/o contacto con heces de otros reptiles (32, 36); según Kourany y Telford (33), la predisposición a condiciones de estrés y escases de alimento hacen que la bacteria atraviese la barrera sanguínea y linfática llegando a oviducto, causando así la contaminación de los huevos; sin embargo, Mitchell y Shane (26), sugieren que la contaminación de los huevos se da por abrasión del mismo cuando entra en contacto con el suelo y cáscaras remanentes, descartando así la transmisión vertical puesto que no lograron el aislamiento del microorganismo a partir de ovarios, oviducto y saco embrionario. Respecto de la transmisión horizontal, la mayoría de investigaciones concluyen que la ingesta de agua contaminada con heces es la principal vía de infección por el ambiente, considerándose el medio acuático favorable para ello (31) sin llegar a subestimar que el alimento y el contacto con otros reptiles también son una importante vía de transmisión. Las altas tasas de ejemplares portadores de Salmonella sp., se relacionan con el comportamiento de coprofagia por parte de las crías, lo que a su vez asegura la transmisión prematura de dichos microorganismos (3). De acuerdo con algunos estudios, las muestras de origen ambiental permiten un mayor porcentaje de recuperación del microorganismo dado que la bacteria no es excretada de manera continua; realizar únicamente muestreos de hisopado cloacal no asegura la obtención de resultados positivos puesto que no es posible determinar si el ejemplar en estudio está excretando la

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bacteria en el momento de la recolección de la muestra (9, 36). Salmonella sp. es altamente resistente fuera de su hospedero y permanece viable después de 89 días en el suelo y/o agua y 30 meses en materia fecal, lo que permite inferir que todo el ambiente del encierro es fuente para aislamientos positivos para la enterobacteria en mención (30). La resistencia a antimicrobianos por parte de los aislamientos de Salmonella sp. a partir de muestras de origen animal es un problema emergente; estas bacterias pueden ser una fuente de plásmidos de resistencia para otras bacterias y producir alteraciones en el tratamiento antimicrobiano clave para combatir enfermedades en medicina humana y veterinaria (37,38). Simultáneamente se puede asegurar que el antibiótico de elección para tratar casos sintomáticos en la EBTRF es norfloxacina debido a que todos los aislamientos de Salmonella sp. enfrentados a este antimicrobiano tienen un alto grado de sensibilidad (Figura 5); de igual manera se establece que tetraciclina tiene un comportamiento de sensibilidad intermedia para todos y que cloranfenicol es un antimicrobiano que tendría alto rendimiento contra los microorganismos de este género obtenidos a partir de ejemplares de caimán; sin embargo, dicho antibiótico tiene restricciones al ser suministrado por generar alteraciones y degeneraciones a nivel de médula ósea (9). No se puede olvidar que el uso de antibióticos de amplio espectro como las quinolonas (norfloxacina) que mostraron un 100% de efectividad frente a los aislamientos de la estación (Figura 5), son ampliamente utilizados en medicina herpetológica y pueden ser causa de alteración momentanea grave de la flora Gram negativa y Gram positiva que se encuentra en el tracto gastrointestinal de estas especies; existen datos bibliográficos que demuestran una cierta tendencia a la anorexia o a alteraciones digestivas en reptiles herbívoros tras terapias prolongadas de antibióticos (39). A la importancia médica de las infecciones por Salmonella sp. en centros de conservación/ zoocría y en el hábitat natural, se le suma el

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potencial zoonótico, ya que los aislamientos de la bacteria a partir de reptiles se han considerado como patógenos para humanos, al poseer factores de patogenicidad cruciales en el desarrollo de una gastroenteritis (20). Los serogrupos de Salmonella sp. hallados en agua y sedimento de los estanques de la EBTRF han sido frecuentemente reportados en reptiles; teniendo en cuenta que el grupo B fue el serogrupo de mayor ocurrencia (29%) y el serogrupo D1 fue hallado en un 6%, es posible inferir en la hipótesis de encontrar serovariedades con alto potencial zoonótico, puesto que en estos serogrupos se encuentran incluidas especies como Salmonella typhimurium (Grupo B) y S. enterididis (Grupo D), dos de los serovares comunmente implicados en aproximadamente el 50% de los casos de salmonelosis en personas de los Estados Unidos (33) , lo que permite plantear que el personal que labora en la Estación se encuentra en riesgo de contraer el patógeno. Adicionalmente, según Popoff y Le Minor (12) y Grimont y Weill (13), en el serogrupo C2 se encuentran incluidas serovariedades como S. newport y S. muenchen que son agentes causales de salmonelosis en humanos, reptiles y caprinos, entre otras especies (12, 13, 26, 28). Por otra parte, los antisueros polivalentes B y C, incluyen serovariedades de Salmonella que han sido aisladas constantemente a partir de muestras de reptiles, allí se encuentran S. oranienburg, S. berta, S. panama, S. rubislaw, entre otras; muchas de las cuales se han reportado como agentes etiológicos de patologías gastrointestinales en los reptiles y algunas veces asociadas a salmonelosis en humanos, producidas por contacto directo con el animal asintomático (5, 17, 18, 24). Cabe resaltar, que aún sin la serotipificación completa de los aislamientos de Salmonella sp. obtenidos en la EBTRF, es pertinente considerar que el personal que labora allí se encuentra en inminente riesgo de contraer salmonelosis, por lo tanto, como método de prevención es necesario el seguimiento de las normas de bioseguridad establecidas para el manejo de las poblaciones allí mantenidas.

Este documento es el primer reporte sobre microbiología del ambiente en ejemplares de Crocodylus intermedius en Colombia, siendo de importancia para la medicina de reptiles y aportando al conocimiento del riesgo zoonótico en el personal a cargo de este tipo de ejemplares. En conclusión, se logró aislar e identificar mediante análisis microbiológicos la presencia de enterobacterias del género Salmonella sp., en muestras de agua-sedimento de estanques con ejemplares de Testudines y Crocodylus mantenidos en cautiverio en la Estación de Biología Tropical Roberto en la Ciudad de Villavicencio; estableciendo su ocurrencia en el 33% de los estanques. Los ejemplares de la EBTRF son portadores asintomáticos de Salmonella sp.; sin embargo, se deben implementar buenas prácticas de manejo en los animales de manera que se minimice el potencial patógeno oportunista del microorganismo y se evite el desencadenamiento de cuadros clínicos asociados con salmonelosis en los reptiles. La norfloxacina es el antibiótico ideal para tratar los ejemplares de la Estación Roberto Franco que puedan presentar sintomatología asociada a salmonelosis, aunque su administración debe ser cuidadosa con el fin de evitar alteraciones en la flora digestiva natural de los reptiles. La presencia de Salmonella sp. en el ambiente, hace necesario el seguimiento de las normas de bioseguridad establecidas en la Estación para el manejo de las poblaciones allí mantenidas y evitar de esa manera la presentación de cuadros zoonóticos.

Agradecimientos Al Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia. A Becton Dickinson Colombia Ltda. por la dotación de medios de cultivo, kit de identificación y sensidiscos. Al equipo humano de la Estación de Biología Tropical Roberto Franco por toda su colaboración y especialmente a su directora profesora María Cristina Ardila por sus aportes al trabajo.

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ORIGINAL

Presencia de Spiroplasma penaei en plancton, bentos y fauna acompañante en fincas camaroneras de Colombia Presence of Spiroplasma penaei in plankton, benthos and fauna in shrimps farms of Colombia José Altamiranda M,1 Acuicultor, Marcela Salazar V,1 M.D, Boris Briñez R,1,2* M.Sc. Centro de Investigaciones para la Acuacultura de Colombia (Ceniacua), Cra 9 C No. 114 – 60, Bogotá, Colombia. 2Universidad Estatal de Campinas – UNICAMP, Departmento de Genética, Evolución y Bioagentes. Instituto de Biologia, Brazil. Correspondencia:*borisbrinez@hotmail.com. 1

Recibido: Junio de 2010; Aceptado: Febrero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Determinar la presencia de Spiroplasma penaei en el plancton, bentos y fauna acompañante en 2 fincas comerciales de camarones. Materiales y métodos. Fueron colectadas 200 muestras para identificación de lesiones características de Spiroplasma, a través de la técnica de histología, mientras que para la técnica de PCR se tomaron 326 muestras de plancton, bentos y fauna acompañante. Las muestras colectadas fueron preservadas en tubos estériles con etanol al 95% para análisis de PCR y en solución Davidson para análisis histológicos. Resultados. En los muestreos realizados en las dos fincas camaroneras fue detectada la presencia de Spiroplasma en una muestra de un representante de los dípteros (mosca de agua) a través de la técnica de PCR en tiempo real, el cual arrojo una Tm=84, similar a la del control positivo de Spiroplasma utilizado. Esta muestra fue secuenciada y comparada con secuencias de bacterias almacenadas en el banco de datos GenBank usando el algoritmo BLAST, encontrando 100% de homología con un fragmento de los genes ribosomales 16S de la bacteria Spiroplasma penaei. Conclusiones. La mosca de agua es portadora de Spiroplasma penaei, sin embargo no se puede afirmar que este organismo sea el transmisor de la infección, por lo que se recomienda realizar ensayos de tipo experimental con moscas de agua infectadas con Spiroplasma penaei, en camarones libres de patógenos, para evaluar si en realidad es el vector de infección. Palabras clave: Bentos, PCR, Penaeus vannamei, pláncton, Spiroplasma. (Fuente: AIMS).

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ABSTRACT Objective. To determine the presence of Spiroplasma penaei on plankton, benhtos and fauna samples, in two commercial shrimp farms. Material and methods. A total of 526 samples of plankton, benthos and fauna were collected; 200 samples were used for histological examination to identify the typical lesions of Spiroplasma, and 326 samples were used for PCR. The samples collected were keep in sterile tubes and preserved in Davidson solution for histological analyses and in 95% ethanol solution for PCR. Results. The presence of Spiroplasma was detected in a water fly through the technique of real time PCR with a melting temperature Tm=84, similar to the positive control used. This sample was sequenced and compared with sequences of bacteria stored in the GenBank database using the BLAST algorithm, founding 100% homology with a fragment of the 16S ribosomal genes of the bacterium Spiroplasma penaei. Conclusions. The water fly can carry the Spiroplasma penaei, however more experimental assays are required, using water flies infected with Spiroplasma penaei and pathogen-free shrimp to prove this findings. Key words: Benhtos, PCR, Penaeus vannamei, plankton, Spiroplasma. (Source: AIMS).

INTRODUCCIÓN En el comercio internacional el producto acuícola de mayor importancia es el camarón marino. Aproximadamente el 26% del producto total proviene de las especies de Peneidos criados en estanques (1), siendo el predominante el Penaeus (litopenaeus) vannamei, por lo que la industria camaronera colombiana es generadora de importantes divisas para el país a través de las exportaciones de camarones cultivados (2). El cultivo de estos animales en estanques a altas densidades conlleva a situaciones de enfermedad por confinamiento (3). Por lo general las enfermedades más severas del camarón son causadas por virus y bacterias, ocasionando de este modo grandes pérdidas económicas a los cultivadores (4). La causa de las enfermedades bacterianas está relacionada con el tipo de manejo que se aplique y a las condiciones medioambientales presentes. En sistemas semi-intensivo e intensivo, el incremento de la densidad de cultivo, las heces y el recambio inapropiado de agua, hacen susceptibles a los peneidos para que sean atacados por bacterias (5). Dentro del grupo de las bacterias que afectan el monocultivo de camarón encontramos al

Spiroplasma. La mayoría de las especies de Spiroplasma son naturalmente patógenos de plantas y artrópodos, principalmente insectos (6-7), la cual se ha aislado de la hemolinfa de los mismos (6). La detección de Spiroplasma en crustáceos es relativamente nueva. El primer reporte de este patógeno fue hecho por Wang et al (7-8) quienes demostraron la presencia de este patógeno en el cangrejo Eriocheir sinensis, el cual causa la enfermedad de “tremor” (7). Wang y Gu (9) encontraron que esta enfermedad se presenta en temperaturas relativamente altas (28ºC) y las principales sintomatologías son debilitamiento, anorexia y muerte. En el mismo año Zbinden y Cambon-Bonavita (10) reportaron Spiroplasma en el camarón Rimicaris exoculata. Mortalidades atípicas y severas aparecieron en una finca camaronera colombiana localizada en la costa Atlántica. Durante los meses siguientes estanques adicionales experimentaron altas mortalidades, donde la sobrevivencia fue de 40%. El diagnóstico presuntivo para las mortalidades sufridas fue atribuido a una infección bacteriana severa. Este fue confirmado a través de la hibridación in situ y bioensayos. La infección fue causada por una nueva especie del género Spiroplasma, denominada S. Penaei. Esta especie de Spiroplasma es considerada como el agente

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causal del “síndrome del muerto parado”, el cual ocasiona sintomatologías como: tracto digestivo vacío, nado errático y producción de gas en el cefalotórax, lo que origina una flotación vertical anormal del animal (11). El último reporte acerca de este género fue realizado por Wang et al (12), catalogándolo como causante de patologías en la langosta de agua dulce Procambarus clarkii, el cual produjo severas mortalidades estimadas entre 92 y 96% en el sudeste de China. De este mismo modo Nunan et al (13) reportaron mortalidades en cultivo de camarón Penaeus (litopenaeus) vannamei en piscinas que presentaban valores de salinidad bajos y altas temperaturas Spiroplasma es una bacteria gram positiva que por estar asociada con artrópodos, principalmente insectos (6), es probable que estos animales sean los transmisores de esta enfermedad en camarones teniendo en cuenta que la dieta de estos es omnívora (14-15). Debido a que en la columna de agua y sobre la superficie de las piscinas camaroneras se encuentra además de plancton y bentos, una gran variedad de insectos, es posible que estos estén actuando como vectores de infección, por lo que el objetivo de este trabajo fue la identificación de los vectores de Spiroplasma.

MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio. El estudio fue realizado en dos fincas camaroneras ubicadas en el municipio de San Antero, en el norte del departamento de Córdoba, Colombia, a 5 metros sobre el nivel del mar y cuyas coordenadas geográficas son 09° 23’ de latitud Norte y 75° 46’ de longitud oeste de Greenwich con temperatura promedio de 28ºC. Toma de muestras. Fueron muestreadas piscinas que presentaron antecedentes de Spiroplasma, y dos piscinas control en cada finca. Se tomaron muestras de plancton, bentos y fauna acompañante cada 15 días durante dos ciclos de cultivo (240 días). Las muestras colectadas fueron colocadas en

tubos eppendorf estériles con etanol al 95% para análisis de PCR y se fijaron camarones con solución Davidson para histopatología. También se tomaron muestras de plancton y fauna acompañante del manglar y del canal de entrada que surte de agua a las piscinas. Identificación de las muestras. Las muestras de plancton fueron montadas al microscopio con el fin de identificar los organismos hasta el nivel taxonómico más bajo posible. Las muestras de bentos, fauna acompañante e insectos, fueron observadas individualmente al estereoscopio para su identificación. Parte de las muestras fueron enviadas al laboratorio de biología molecular, para la extracción del ADN y respectiva amplificación con los iniciadores específicos para Spiroplasma. Extracción y amplificación de ADN. El ADN extraido y la PCR fueron realizados conforme a lo propuesto por Nunan et al (11). El fragmento fue amplificado por el par de primers CSF: 5’ TAG CCG AAC TGAGAG GTT GA 3’ y CSR 5’ GAT AAC GCT TGC CACCTA TG 3’ con 520 pares de bases aproximadamente. El volumen de la reacción de PCR fue de 25 ul, conteniendo Tris-KCl (20 mM Tris-HCl pH 8.4 com 50 mM KCl), 2.0 mM MgCl2, 2.5 µM de cada primer, 0.1 mM de cada dNTP, 2.5 U de Taq DNA polimerasa, 15 ng de ADN e água Milli-Q para completar el volumen a 25 µL el mix fue colocado en termociclador y el DNA desnaturado a 94°C por 5 minutos. La amplificación fue en 35 ciclos a 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos, seguido de una extensión final de 72°C por 4 minutos. El ADN de las muestras que presentaron fragmentos amplificados de tamaño similar al control positivo de Spiroplasma fueron amplificadas por PCR en tiempo real en un termociclador Opticon (MJ Research, Hatboro, USA). Como fluorómetro se empleó Sybr Green el cual se une a la hebra de ADN de doble cadena y emite fluorescencia a una longitud de onda de 530nm. Fueron realizados análisis de las curvas de disociación para verificar la especificidad del producto amplificado.

Altamiranda - Presencia de Spiroplasma penaei en plancton

Secuenciamento. Las muestras que mostraron curvas de disociación similares al del control positivo del Spiroplasma fueron secuenciadas en un secuenciador automático MegaBace (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando el primer CSF: 5’ TAG CCG AAC TGAGAG GTT GA 3’. Las secuencias obtenidas fueron alineadas utilizando el programa CLUSTAL W (16) y editadas manualmente con el programa BIOEDIT (17). Estas secuencias fueron comparadas con las bases de datos públicas, usando la herramienta Blast2-NCBI (18).

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Histología. Los camarones y poliquetos respectivamente fijados en solución Davidson, fueron remitidos al laboratorio de histología de CENIACUA en Cartagena, en donde fueron realizados micropreparados coloreados con eosina y hematoxilina según el protocolo estandarizado por CENIACUA.

RESULTADOS Reacción en cadena de la polimerasa. Un total de 326 muestras fueron analizadas por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Fue detectada la presencia de Spiroplasma en: 4 muestras de músculo de camarón, 1 muestra de plancton y en 10 de insectos (mosca de agua, Hesperocorixa, Uca, Callinectes sapidus, Orthóptera sp1 y Lepidóptera sp2). Los camarones que fueron positivos por PCR también presentaron las lesiones típicas de espiroplasma por histopatologia (Figura 1). Las muestras de plancton, bentos, fauna acompañante e insectos de los muestreos realizados durante los dos ciclos de cultivo, usando iniciadores específicos de 16S de rRNA de Spiroplasma mostró la presencia de la bacteria en las muestras de Hesperocorixa, mosca de agua perteneciente al orden Díptera, representantes del orden Lepidóptera (sp2) y representantes del orden Orthóptera (sp1). Resultados no detectables fueron encontrados en las muestras de Upogebia y Uca.

Figura 1. Corte trasversal del músculo de un camarón con lesiones típicas de Spiroplasma: A (la flecha indica cuerpos eosinófilos en el músculo), B (la flecha indica infiltración en el músculo).

PCR en tiempo real. Los resultados positivos por PCR fueron procesados a través de PCR en tiempo real. El organismo en el que se observó presencia de Spiroplasma por PCR en tiempo real fue la mosca de agua con una Tm = 84, similar a la del control positivo de Spiroplasma utilizado (Figura 2). Esta muestra fue secuenciada para verificar la presencia de esta especie de bacteria. Secuenciación – Blast. En este estudio sólo se procesaron las muestras de la mosca de agua puesto que fue la única que resultó positiva a través de PCR en tiempo real. Esta muestra fue comparada con secuencias de bacterias pertenecientes al GenBank usando el algoritmo BLAST, encontrando 100% de homología con un fragmento de los genes ribosomales 16S de la bacteria Spiroplasma penaei.

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Figura 2. Curva de disociación de las muestras en las que se detectó Spiroplasma, a través de PCR. La mosca de agua (color azul) es un resultado que coincide con el control positivo de Spiroplasma (color rojo), con una Tm = 84; mientras que Hesperocorixa (color verde) y el orthóptero sp1 (color fucsia) son resultados que coinciden con el control negativo de Spiroplasma (color naranja), con una Tm = 73.

DISCUSIÓN Las piscinas comenzaron a presentar mortalidades en la época de lluvia, momento en el cual la salinidad bajó considerablemente en el primer ciclo de 27.6 ± 0.86 UPS hasta 16 y 17 UPS en todas las piscinas, además para este periodo la temperatura en las horas de la tarde no bajó de los 30.8°C, mientras que en el segundo periodo la salinidad llegó a bajar hasta 11 UPS y la temperatura no bajó de 31.7°C en las horas de la tarde, lo que coincide con lo reportado por Wang y Gu (9), quienes encontraron mortalidades hasta del 90% en cultivo del cangrejo de agua dulce Eriocheir sinensi, con temperaturas relativamente altas, al igual que lo reportado por Wang et al (12) quienes detectaron la presencia de Spiroplasma en la langosta de agua dulce Procambarus clarkii, en periodo de verano, donde las temperaturas son elevadas. De este mismo modo Nunan et al (13) reportaron mortalidades en cultivo de camarón Penaeus (litopenaeus) vannamei en piscinas que presentaban valores de salinidad bajos y altas temperaturas. En las fincas muestreadas los valores de temperatura variaron entre 28.9 ± 1.36°C y 35.1 ± 0.94°C, observándose altos valores en los meses de junio y julio, mientras que los valores de salinidad variaron entre 21.0 ± 1.73 UPS y 29.5 ± 0.50 UPS. Los

valores más bajos se observaron en el mes de junio y julio. En el mes de julio se presentaron mortalidades ocasionadas por Spiroplasma, lo que confirma que esta bacteria se encuentra presente en aguas de baja salinidad con elevadas temperaturas. En los muestreos realizados se detectó la presencia de Spiroplasma en el (4.6%) de las muestras procesadas, dentro de estos sobresalieron los insectos pertenecientes al orden Orthóptera, Lepidóptera, espécies del género Hesperocorixa y un representante de los Dípteros (mosca de agua). Hesperocorixa fue positivo por PCR en todas las piscinas muestreadas, al igual que las moscas de agua. En todas las piscinas muestreadas se detectó Spiroplasma por PCR en las muestras de músculo de camarón Litopenaeus vannamei. CENIACUA en muestreos realizados en años anteriores detectó Spiroplasma en muestras de callianassa; sin embargo en el presente estudio en ningún momento se encontraron callianassas sintomáticas y no se detectó la presencia de la bacteria por las técnicas de histología y PCR, por lo que se descarta la posibilidad de que las callianassas sean vectores de infección.

Altamiranda - Presencia de Spiroplasma penaei en plancton

Aunque se piensa que el manglar de algún modo influye con la incidencia de la bacteria, dado que las primeras piscinas en presentar síntomas de la enfermedad son las cercanas a este, no se pudo detectar la presencia de Spiroplasma al igual que en el canal reservorio; sin embargo no se descarta la posibilidad de que la bacteria está asociada al manglar.

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Al comparar esta muestra con secuencias de bacterias pertenecientes al GenBank usando el algoritmo BLAST, se encontró 100% de homología con un fragmento de los genes ribosomales 16S de la bacteria Spiroplasma penae, acceso gb|AY771927.1. A través de este método se comprobó que la mosca de agua es portadora de S. penaei; sin embargo no se puede afirmar que este organismo sea el vector de la infección, puesto que para comprobarlo se sugiere realizar ensayos experimentales con moscas de agua infectadas con Spiroplasma penaei en camarones libres de patógenos, y así determinar si son transmisores de la enfermedad.

La PCR de bacterias utilizando iniciadores de genes 16S pueden presentar coamplificación con otros géneros como Micoplasma hominis y Micoplasma mycoides que poseen homología con la secuencia de Spiroplasma en algunos pares de bases Gasparich et al (19). Además, debido a la elevada sensibilidad del método, el riesgo de contaminación es considerable, por lo que existe la posibilidad de obtener resultados falsos positivos (20). Por esto es necesario procesar los resultados positivos a través de PCR en tiempo real, debido a que por medio de esta técnica además de cuantificar la cantidad de ADN amplificado, se puede evaluar la especificidad al calcular la fluorescencia versus temperatura en una curva de disociación. Estas curvas dan lugar a la temperatura de disociación (Tm) que depende sobre todo de la composición de las bases y de la longitud de la secuencia amplificada, pudiéndose diferenciar la secuencia blanco de otras secuencias amplificadas como dímeros de iniciadores que se disocian a menores temperaturas (21-22).

El género Spiroplasma se ha logrado aislar de varias especies de plantas y de insectos pertenecientes a los órdenes Díptera, Himenóptera, Coleóptera, Lepidóptera, Homóptera y Hemíptera (6-23-24). Fletcher et al (23) reportaron a los insectos Circulifer tenellus, Circulifer hematoceps y Circulifer opacipennis como vectores de infección de S. citri en árboles cítricos; mientras que Tsai (25) encontró que S. kunkelli, patógeno del maíz es transmitido a través del género Dalbulus. En general los insectos son infectados con Spiroplasma a través del polen de la flor, causando de este modo grandes pérdidas económicas a más de 300 especies de plantas agrícolamente importantes (26).

El organismo en el que se observó presencia de Spiroplasma por PCR en tiempo real fue la mosca de agua. A pesar que Hesperocorixa y el representante del orden orthóptera (sp1) arrojaron resultados positivos por PCR, no se pudo comprobar que estos eran portadores de la bacteria por PCR en tiempo real. Otro aspecto a tomar en cuenta es el hecho de que los primers están diseñados para secuencias del género Spiroplasma a partir de una región 16S, por lo que no se puede asegurar que el Spiroplasma detectado en la mosca de agua, sea el mismo que afecta a los camarones de cultivo. Por tal razón fue necesario secuenciar esta muestra para verificar la presencia de esta especie de bacteria.

Como conclusión, se plantea la probabilidad de que la mosca de agua sea el vector de infección de S. penaei en camarones, teniendo en cuenta que el camarón es omnívoro (14-15) y que la mayoría de los vectores de Spiroplasma son los insectos (6-23-24). Como los organismos involucrados con Spiroplasma fueron los insectos, se hace recomendable evaluar las muestras pertenecientes a este grupo con bioensayos ex situ. Además de tomar ciertas medidas de bioseguridad en las fincas tales como limpiar la maleza que se encuentra en el terraplén y alrededor de las piscinas, para destruir el hábitat de organismos indeseables en el ciclo de cultivo de camarón.

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ORIGINAL

Dinámica de impregnación al vacío en apio (Apium graveolens L.) y pepino (Cucumis sativus L.) Vacuum impregnation dynamic on celery (Apium graveolens L.) and cucumber (Cucumis sativus L.) Yisell Martelo C,1* M.Sc, Misael Cortés R,1 Ph.D, Diego Restrepo M,1 M.Sc. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ingeniería Agrícola y de Alimentos, Medellín, Colombia. *Correspondencia: mcortesro@unal.edu.co. 1

Recibido: Agosto de 2009; Aceptado: Enero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la respuesta a la impregnación al vacio (IV) en apio y pepino, con soluciones isotónicas de NaCl. Materiales y métodos. Se determinaron variables de impregnación en troncos de apio y rodajas de pepino (3 posiciones diferentes a lo largo de su estructura), considerando, fracción y deformación volumétrica en la etapa de vacío (X 1 y g1) y atmosférica (X y g), y la porosidad disponible (Ee) al proceso IV. Resultados. El apio y pepino no presentaron diferencias estadísticas por efecto de la posición. En las etapas de proceso se obtuvieron para el apio y el pepino valores de X1 (-14.32 ± 2.75 y -5.51±1.76%, g1 (-0.587±0.69 y -0.079±0.99%), X(13.49±2.32 y 6.72±2.72%), g (-1.40±1.042% y -2.33±1.26%) y Ee (15.73±2.31 y 9.35±2.57%), respectivamente. Estos resultados indicaron una salida de líquido nativo (X 1<0) y una ligera contracción volumétrica de las estructuras (g y g1<0), lo cual se evidenció microestructuralmente. Conclusiones. La respuesta a la IV en apio y pepino, permite identificar estas matrices alimentarias, como aptas para la incorporación de componentes que le proporcionen un valor agregado a estos productos. Palabras clave: Apium graveolens, Cucumis sativus, hortalizas, procesamiento de alimentos. (Fuente: AIMS).

2584

Martelo - Dinámica de imprengnación al vacío en apio y pepino

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ABSTRACT Objective. To evaluate the response to vacuum impregnation (IV) in celery and cucumber, with isotonic NaCl. Materials and methods. Impregnation variables were determined in celery sticks and cucumber slices (3 different positions along their structure), considering, fraction and volumetric deformation in the vacuum stage (X 1 and g1) and atmospheric (X and g), and the available porosity to the process IV (Ee). Results. Celery and cucumber were not statistically different for effect of the position. In the stages process were obtained for the celery and the cucumber values of X 1 (-14.32±2.75 and -5.51±1.76%, g1 (-0.587±0.69 and -0.079±0.99%), X (13.49±2.32 and 6.72±2.72%), (-1.40±1.042% and -2.33±1.26%) and Ee (15.73±2.31 and 9.35±2.57%), respectively. These results indicated a native liquid output (X1<0) and a slight volumetric contraction of the structures (g and g1<0), which was evidenced microstructurally. Conclusions. The dynamics of IV in celery and cucumber, to identify those food matrices, as suitable for the incorporation of components that provide a value added to these products. Key words: Apium graveolens, Cucumis sativus, food processing, vegetables. (Source: AIMS).

INTRODUCCIÓN Actualmente existe una considerable demanda en países desarrollados y subdesarrollados, de productos vegetales por el importante papel que estos cumplen en la dieta humana. En este sentido vegetales y hortalizas troceadas, empacadas y refrigeradas (productos mínimamente procesados), podrían ofrecer en el presente y futuro, una interesante incursión de nuevas líneas de alimentos, modificados en su estructura y composición, adicionados con nutrientes, antioxidantes, antimicrobianos, crioprotectores, entre otros, con el objeto de mejorar su calidad y extender su vida útil. La técnica de impregnación al vacío (IV) hace posible la incorporación de sustancias disueltas, emulsificadas o en suspensión directamente dentro de estructuras porosas, de una forma controlada, permitiendo la obtención de rápidos cambios composicionales y estructurales en las matrices que así lo permiten, como es el caso de frutas, hortalizas, tubérculos, entre otros, las cuales poseen características porosas en su estructura, permiten el proceso de incorporación de componentes mejoradores de textura, sabor, color o de componentes fisiológicamente activos (CFA) (1,2). Diferentes aplicaciones de la técnica

IV han sido realizados en el campo de los alimentos (3-6), donde la mayoría de las publicaciones se relacionan principalmente con frutas (7-12) y pocas en hortalizas (1317). El modelo matemático para el proceso IV ha sido desarrollado en términos de la respuesta del tejido de la planta al proceso IV: fracción y deformación volumétrica de impregnación, tanto en la etapa de vacío (X1:m3 de solución impregnada/m3 de muestra inicial y g1 m3 de deformación en la muestra/m3 de muestra inicial), así como en el proceso global con el restablecimiento de la presión atmosférica (X, g) y la porosidad eficaz o disponible (Ee: m3 de gas/m3 de muestra), el cual describe el acoplamiento del mecanismo hidrodinámico (MHD) y el fenómeno deformación-relajación (FDR) de las matrices alimentarias porosas cuando son inmersas en líquidos al ser sometidos a cambios de presión (18). Estos parámetros de impregnación dependen de las condiciones del proceso, de propiedades mecánicas y estructurales del tejido, así como de la viscosidad del líquido de impregnación (1). Desde el punto de vista de anatomía microscópica el apio presenta en su mayoría células colenquimáticas con paredes celulares mucho más gruesas y

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normalmente largas y empaquetadas en fibras, a modo de cuerdas comunes en regiones subepidérmicas de los tallos; y el pepino es un fruto con numerosas células parenquimatosas. Estos vegetales son conocidos como los de menor valor energético, ocupando el apio el segundo lugar después del pepino, con un aporte de 14 y 20 kcal respectivamente. El apio es un vegetal cuyas partes son todas comestibles, con contenidos de vitamina C y vitamina A de 32.0 y 0.207 mg/100 g respectivamente, y rico en potasio (280.00 mg) (19). Para pepinos frescos, el contenido de agua es muy alto (96%), con un aporte de 4.7 mg de ácido ascórbico, 14 mg calcio, 149 mg potasio, 17 mg de fósforo y 11 mg magnesio por 100 g de producto fresco (20). Comparado con el promedio de las hortalizas, el contenido en vitamina C, A, tiamina y fibra es menor (19). Debido al gran consumo de estos alimentos en la elaboración de ensaladas, se genera un interés industrial por la facilidad de adaptación de estos al procesamiento IV (15,16). El objetivo de este trabajo fue evaluar la respuesta a la aplicación de la técnica IV en apio y pepino, con soluciones isotónicas de NaCl.

MATERIALES Y MÉTODOS Materias primas. Se utilizaron apio criollo (Apium graveolens L .var. dulce) y pepino cohombro (Cucumis sativus L.), obtenidos de un mercado local, sin defectos o daños causados por plagas, de coloración uniforme; los pepinos con longitudes entre 20 y 30 cm. Las formas experimentales para el apio fueron de un grosor (J) entre 3-4 cm., espesor del tallo (K) entre 1 y 1.5 cm. y altura (H) de 2 cm. Se consideraron 3 posiciones a lo largo del pecíolo, posición 1: zona lado cercano a las hojas, posición 2: zona media, posición 3: zona cercana al cuello de la raíz. Para el pepino las formas consistieron en rodajas cilíndricas del tejido del mesocarpio, sin semillas, de 1 cm de espesor (F) y diámetros interno (Φint)≈2.5–3.0 cm, y externo (Φext)≈3-5 cm. Se consideraron 3 posiciones, posición 1: extremo lado ápice, posición 2: zona media, posición 3: extremo contrario

al lado ápice. Las posiciones 1 y 3 se fijaron aproximadamente a 8.5 cm de los extremos. La figura 1 ilustra las formas correspondientes de cada hortaliza.

Figura 1. Formas experimentales de pepino y apio para tratamiento IV con solución isotónica.

Análisis fisicoquímicos. Se determinó el contenido de humedad (% p/p) a 105ºC hasta peso constante según la norma AOAC 7.003-84 (21); para el pH, se usó un titulador automático por inmersión del electrodo en la muestra (Hanna Istruments pH 211, Chula Vista, USA), previa calibración con soluciones tampón de pH 2, 4, 7 y 10 a 25ºC AOAC 981.12 (22); el contenido de sólidos solubles (ºBrix) por lectura refractométrica AOAC 932.12 (22) en un refractómetro (Atago, Tokyo, Japón), a 20ºC; la acidez por titulación con NaOH 0.1N, utilizando fenolftaleína como indicador; el valor de acidez se expresó en gramos de ácido cítrico por 100 g de muestra según la norma AOAC 942.15 (22); la actividad de agua (aw) según la norma AOAC 978.19B (23), con un higrómetro de punto de rocío a 25ºC (Aqualab Decagón modelo CX3±0.03, Pullman, WA, USA); la densidad de las disoluciones impregnación (ρdis) por el método del picnómetro AOAC 945.06 (23); la densidad aparente (ρapm) por la relación de masa de la muestra y volumen desplazado por la misma en una probeta.

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Martelo - Dinámica de imprengnación al vacío en apio y pepino

Análisis microestructural. Se utilizó la técnica de observación por microscopía electrónica de barrido (SEM) (JEOL JSM 5950 LV, Jeol Tokio, Japón), 25 Pa de vacío y 15 kv de corriente eléctrica, para observar los espacios intercelulares del tejido de las hortalizas a impregnar, con el objeto de analizar su potencial porosidad para alojar la solución de impregnación (SI). Una sección transversal y longitudinal de cada hortaliza fue tomada de la zona media de cada muestra y sometida a proceso de liofilización para retirarle el 97% de contenido de agua. Antes de su observación por SEM, las muestras fueron sometidas a vacío y recubiertas con una fina capa de oro para tener la capacidad de reflejar los electrones que distribuyen la intensidad de las señales en la observación. Proceso de impregnación al vacio (IV). Los experimentos de IV fueron llevados a cabo en un equipo diseñado en la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, el cual consiste en una cámara de vacío de acero inoxidable con un sistema electromecánico en su interior para desplazar la muestra dentro y fuera del recipiente que contiene la SI, además un sistema de vibración para eliminar la SI adherida en la superficie de las mismas (Figura 2).

Ee. La relación de los parámetros de IV se ilustra en la ecuación 1 (24), donde r representa la relación de compresión (P2/P1). La metodología y el cálculo de los parámetros de impregnación, ha sido descrito por algunos autores (18,24). Ee (g-1) = (X - g)r + g1 (1) Las SI utilizadas para apio y el pepino fueron de características isotónicas (aw SI=aw vegetal), NaCl al 1.00% y 1.22% p/p respectivamente. Análisis de datos. Los resultados fueron analizados a partir de ANOVA, utilizando el método LSD (mínimas diferencias significativas) como método de comparaciones múltiples, con un nivel de confianza del 95% (α=0.05). El análisis de varianza fue realizado con el paquete estadístico STATGRAPHICS PLUS versión 5.1.

RESULTADOS Caracterización fisicoquímica. La tabla 1 presenta los valores medios más las desviaciones estándar de las propiedades fisicoquímicas del apio y pepino frescos. Tabla 1. Caracterización fisicoquímica de apio y pepino fresco. Característica Humedad (%) pH º Brix

94.1±1.7

96.8±0.3

5.3±0.6

5.7±0.3

4.4±1.1

3.4±0.5 0.05±0.02

0.996±0.011

0.997±0.019

ρapm (kg/m3)

0.951±0.039

0.962±0.025

ρdis (kg/m )

1.022±0.006

1.012±0.001

El vacío aplicado fue de 5.9" Hg, verificado en un vacuómetro (0–30" Hg), el tiempo de cada etapa de proceso fue de 5 minutos, donde se determinó la evolución del peso y volumen de la muestra y de la SI en cada etapa. La respuesta a la IV se expresó en términos de X1, g1, X, g y

Pepino

0.06±0.02

Acidez (%)

Figura 2. Muestras de apio y pepino durante el proceso IV.

Apio

Caracterización del proceso de impregnación al vacío. La figura 3 presenta el comportamiento de las variables de respuesta a la IV en las posiciones 1, 2 y 3 para los vegetales en estudio. Caracterización microestructural del apio y pepino. La figura 4, presenta micrografías tomadas por SEM de los

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 Apio APIO

Pepino PEPINO 0,7 0,4

-0,5

y1 (%)

g1 (%)

-1

0,1 -0,2 -0,5

-1,5

-15,5 1

2 APIO Posición

-1

y (%)

g (%)

PEPINO 2 Posición

-1

-1,5

-1,5 -2 -2,5 -3

APIO 2

Posición

-3,5

PEPINO 2

9,5

Posición

8,5

X ( %)

-6

-0,5

-2

14 13 12

7,5 6,5 5,5

APIO 2

Posición

4,5

12,5

Posición

11,5

Ee (%)

-5

-8

-0,5

15 14

10,5 9,5 8,5

13 12

-7

2 PEPINO

Posición

-4

-14

-2,5

-3

-12,5

-17

-0,8

X1 (%)

-11

2 APIO Posición

Posición

7,5

Posición

Figura. 3. Valores medios con intervalos LSD (95%) de los parámetros de impregnación en apio y pepino en función de la posición.

(a) (Apio fresco)

(b) (Apio IV)

(d) (Pepino IV)

Figura. 4. Imágenes por SEM de los tejidos de apio y pepino en estado fresco (a) y (c) e impregnados (b) y (d) respectivamente.

Martelo - Dinámica de imprengnación al vacío en apio y pepino

tejidos de apio y pepino en estado fresco e impregnados, entre 1000 y 5000 aumentos.

DISCUSIÓN Caracterización fisicoquímica. Los resultados obtenidos para las propiedades fisicoquímicas concuerdan con valores los reportados por otros autores para las dos matrices alimenticias (16,19,20,25), presentando coeficientes de variabilidad aceptables. Caracterización del proceso de impregnación al vacío. Para el apio y el pepino, el ANOVA no mostró diferencias significativas (p>0.05) en ninguna de las variables de impregnación con respecto al factor posición. Se observan valores promedios negativos para el parámetro X1 en el apio (-14.32±2.75%) y en el pepino (-5.51±1.76%), lo cual representa una pérdida de líquido nativo desde el interior de la estructura durante la etapa de vacío, atribuido principalmente al tiempo y presión de vacío aplicado, que hace que el alto contenido de humedad en los espacios intercelulares migre hacía el líquido de impregnación. En el apio, la posición 3 presenta una tendencia de menor pérdida de líquido nativo, lo cual podría asociarse a que esta zona es más cercana al punto de disposición final del agua que es conducida hacia las hojas por el sistema vascular del tallo; para el caso del pepino este fenómeno fue más uniforme. La salida de líquido nativo como respuesta al proceso IV en estructuras vegetales, ha sido reportado en zanahoria, berenjena y remolacha (13), en uchuva impregnada con soluciones de microorganismos probióticos (26), en plátano impregnado con soluciones antipardeantes (27), en hongos Pleurotus ostreatus impregnados con soluciones conservantes (28), entre otros. La deformación volumétrica (g1 y g) presentó bajos coeficientes de variabilidad en ambas estructuras, dentro de un rango similar de valores; y no se observaron diferencias significativas con respecto a la posición (p>0.05). La deformación

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volumétrica se asocia al acoplamiento del MHD y al FDR que producen la contracción en la estructura del tejido vegetal (3, 13, 12), siendo baja para ambas estructuras. Para el apio se observó una ligera deformación hasta un 1% en la etapa de vacío (g1), causado por la salida de líquido nativo que induce a un colapso estructural (contracción volumétrica); mientras que el restablecimiento de la presión atmosférica contribuye a incrementar la deformación volumétrica global (g) (-1.41±1.03%), donde las células alargadas poligonales con paredes de espesor irregular pertenecientes al colénquima de la estructura, a pesar de verse rígidas presentan cierta flexibilidad en los amplios espacios intercelulares (29). El pepino no presentó cambios volumétricos apreciables en la etapa de vacío (g1), pero la presión positiva inducida por el líquido de impregnación en la etapa atmosférica, incide sobre la células parenquimatosas densamente empacadas, sufriendo una mayor deformación global (g) (-2.33±1.26%) que el apio, debido a la menor rigidez de sus paredes celulares. Un fenómeno similar ha sido observado en plátano verde (Musa paradisiaca) (27). Las fracción volumétrica de impregnación (X), muestra al apio como una estructura de mayor capacidad de impregnación (X = 13.49±2.32%) debido a la mayor porosidad disponible para el proceso IV (15.35±3.40%). Para el pepino, la estructura a pesar de presentar menores valores de X (6.72±2.72%) y menor porosidad disponible al proceso IV (9.35±2.57%) que el apio, se considera igualmente una estructura adecuada para incorporar a través de la SI, CFA, mejoradores de textura y componentes que modifiquen el perfil sensorial de sabor u otros atributos de calidad. Caracterización microestructural del apio y pepino. La figura 4(a) presenta las células colenquimáticas del tejido vascular del apio, formando cordones discretos que circunscriben cavidades continuas en formas elípticas por debajo de la epidermis, de tamaño irregular que oscila entre (20 x 40µm) y (10 x 15μm), optimas para alojar

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la SI, en compañía de la fase líquida original presente del tejido fresco. En la figura 4(b) se observa el tejido de apio sometido al proceso IV, donde las cavidades denotan una estructura ligeramente diferente al tejido fresco, debido a una contracción volumétrica de la estructura durante la etapas del proceso, siendo coherente con los valores negativos de g1 y g; esta situación resulta como se comentó anteriormente a la salida de líquido nativo en la etapa de vacío y la contracción por efecto de la restauración de la presión atmosférica en la etapa final. Para el pepino fresco, la figura 4(c), permite apreciar las células del colénquima densamente empacadas debajo del corte transversal de la rodaja, siendo éstas, la estructura sostén que le confiere un carácter elástico y la propiedad de hinchar su pared celular al momento de hidratarse (30). El tejido impregnado, ilustrado en la figura 4(d), permite apreciar las células con un

mayor grado de aglomeración, debido a una mayor contracción volumétrica (superior al apio), alcanzada en la etapa final, con valores de g = -2.33±1.26%. En conclusión, la aplicación de la técnica de IV en apio y pepino, permitió identificar estas estructuras como adecuadas para la incorporación de un líquido de impregnación de carácter isotónico al interior del tejido, lo cual es relevante por sus posibles aplicaciones futuras en la incorporación de otros componentes que permitirían mejorar sus atributos de calidad, ampliar su vida útil y además proporcionar un mayor valor agregado, por ejemplo componentes con actividad fisiológica, como vitaminas, minerales, probióticos, prebióticos, entre otros. El proceso IV, confiere cambios microestructurales en los tejidos (contracción volumétrica), presentando una mayor aglomeración de las células colenquimáticas.

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Rev.MVZ Córdoba 16(2):2593-2604, 2011.

ORIGINAL

Influencia del empaque y envasado sobre las propiedades fisicoquímicas del hongo comestible Pleurotus ostreatus Influences of the packing and packed about physiochemical properties of edible mushroom Pleurotus ostreatus. Misael Cortés R,*1 Ph.D, Marilza Ruiz R,1 M.Sc, Luís Henriquez,1 Ing. Agrícola. Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ingeniería Agrícola y de Alimentos, Calle 59ª No. 63 – 20, Medellín, Colombia. *Correspondencia: mcortesro@unal.edu.co 1

Recibido: Agosto de 2009; Aceptado: Diciembre de 2010.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la influencia de diferentes empaques y atmósferas sobre las propiedades fisicoquímicas del hongo comestible Pleurotus ostreatus. Materiales y métodos. Los hongos fueron almacenados durante 15 días a 4ºC, utilizando tres empaques: 1) espuma de poliestireno con película de recubrimiento de polivinil cloruro (empaque comercial), 2) Polietilentereftalato con películas de recubrimiento de polipropileno biorientado y 3) polietileno de baja densidad y tres atmósferas de envasado: 1) Aire, 2) 100% N2 y 3) 10% O2, 10% CO2 y 80% N2. Después de almacenados se derminaron los posibles cambios de las variables fisicoquímicas (pH, acidez, °Brix, humedad, cloruros, color y textura) Resultados. Las muestras presentaron diferencias estadísticas en los parámetros fisicoquímicos del hongo fresco por efecto de los factores tiempo, empaque y atmósfera. Los rangos de variación se consideraron aceptables debido a las características propias del producto, como ente biológico que continua con sus procesos metabólicos. Los cambios de color en las condiciones de control (Grupo 1: Empacado Comercial y Grupo 1: Atmósfera Aire) no fueron muy acentuados, siendo instrumentalmente más apreciable, sin llegar a serlo para el observador. La textura en todos los casos presentó una disminución en la resistencia mecánica, debido a los posibles procesos fermentativos y al deterioro por la alta tasa metabólica. Conclusiones. Los resultados permiten identificar que no hubo un efecto apreciable del empaque y de las atmósferas modificadas en las propiedades fisicoquímicas del hongo Pleurotus ostreatus, lo que hace que el empaque comercial sea más práctico por efecto de costos de producción. Palabras clave: Atmósfera, hongo, Pleurotus ostreatus, propiedades fisicoquímicas. (Fuente: AIMS). 2593

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ABSTRACT Objective. To determine the effect of different packings and modified atmospheres on the physiochemical properties of a comestible mushroom (Pleurotus ostreatus) in fresh state. Materials and methods. Mushrooms were stored at 4ºC during 15 days, using three different forms of packings: 1) Polyestiren foam with polyvinyl chloride film cover (commercial packing), 2) Polyethylene terephthalate with polypropylene bioriented film cover and 3) Polyethylene of low density film cover and three different atmospheres: 1) Air, 2) 100% N2 and 3) 10% O2, 10% CO2, and 80% N2. After stored possible changes in the physicochemical variables (pH, acidity, °Brix, moisture, chlorides, color and texture were determined. Results. There was an effect of time, packing and atmosphere on the physiochemical properties of fresh mushrooms. The range of variations was considered acceptable due to the characteristics of the mushrooms, such as biological entity that continuous with their metabolic processes. The changes in color (Group1: commercial packing and Group 1: Air stored) were not very appreciable, for the observer in all groups. The texture presented a decrease in the mechanical resistance, these may be due to the possible fermentative processes and deterioration for the high metabolic rate. Conclusions. There was not an appreciable effect of packing and environmental atmospheric conditions on the physiochemical properties of the mushroom Pleurotus ostreatus. It was also found that the commercial packing is more practical by issues of production costs. Key words: Atmosphere, Mushroom, Pleurotus ostreatus, physiochemical properties. (Source: AIMS).

INTRODUCCIÓN El Pleurotus ostreatus es un hongo comestible, reconocido por su alto valor nutritivo. En los últimos años, debido al cambio en los hábitos alimenticios, se ha registrado un aumento creciente en su consumo per cápita, asociado a su bajo aporte calórico, una baja relación de ácidos grasos saturados a insaturados, 2.04.5:1, una relación fibra dietaría total a fibra cruda mayor que la de los vegetales, una buena digestibilidad (67.75±0.54%) (1,2), al contenido en compuestos funcionales (betaglucano y glucosamina), aminoácidos esenciales, minerales, vitaminas y provitaminas (3,4). Además se le atribuyen propiedades medicinales (anticolesterolémica y antitumorales) y antioxidantes (5-7). El consumo per cápita mundial de setas y hongos en el 2001 se estimó en 0.44 Kg por persona al año, con un crecimiento promedio anual de 3.8%. Este consumo es jalonado por países asiáticos, aunque en los últimos años, ha tendido a generalizarse a países occidentales, presentando un interesante potencial de mercado (8).

La calidad de los hongos es influenciada por diferentes parámetros, como el estado de desarrollo, las condiciones pre y poscosecha y el tipo de sustrato en el que son cultivados. El Pleurotus ostreatus es un hongo con un alto contenido de humedad, susceptible al ataque microbiológico, a las reacciones de pardeamiento enzimático (9) y al daño mecánico, debido a su estructura epidérmica delgada y porosa. La respiración de los hongos en general, es alta (200–500 mg/kg h a 20°C), comparado con otras verduras y frutas (10), por lo que requieren mecanismos de empaque más selectivos que promuevan el mantenimiento de las características organolépticas y nutritivas. Para su comercialización, los hongos comestibles son empacados normalmente en bandeja de poliestireno (icopor), recubiertos con una película elástica de polietileno o cloruro de polivinilo (PVC), la cual es adherida al empaque y almacenados en refrigeración a 4°C (11). Algunos autores han evaluado el efecto producido por el envasado en atmosfera modificada (EAM) en frutas y vegetales

Cortés - Influencia del empaque y envasado del hongo Pleurotus ostreatus

durante los últimos años con resultados positivos (12). Algunas investigaciones realizadas en diferentes variedades de hongos comestibles EAM, han demostrado un efectivo control sobre su deterioro: Agáricus bisporus (10,13-16) Agrocybe chaxingu (17); Shiitake Lentinula edades (18). Estudios específicos, han establecido atmósferas modificas de 5-10 kPa O2 + 2.5-5 kpa de CO2 en Agaricus bisporus (19), 5% O2, 3% CO2 (15) 5% O2 + 10% CO2 (14) y de 1 kPa O2 + 5 kPa CO2 a 4°C por 14 días (20), 1 kPa O2,/30 kPa CO2 (21), 12-15 kPa O2 + 5 kPa CO2 (11) para Pleurotus sp. Por otro lado, algunos autores han encontrado que el EAM puede tener un efecto negativo en algunas variedades de hongos, causado por la respiración anaeróbica como potencializador del crecimiento de microorganismos patógenos o por la acumulación excesiva de dióxido de carbono dentro del empaque, causando daños fisiológicos y severo pardeamiento (11,14,17). Investigaciones específicas, sobre el efecto en la vida útil del Pleurotus ostreatus, son escasas, aunque se ha confirmado que bajo este tratamiento se puede lograr una extensión de la vida útil, debido a la reducción del agua condensada, aunque sin llegar a eliminarse completamente (11). El objetivo de este estudio fue evaluar la influencia de diferentes empaques y atmósferas modificadas sobre las propiedades fisicoquímicas del hongo comestible Pleurotus ostreatus en estado fresco.

MATERIALES Y MÉTODOS Materia prima. Se utilizaron hongos enteros comestibles de la variedad Pleurotus ostreatus con un rango de peso de 3 a 12 g, suministrados por la empresa Bioecológicos S.A (Rionegro, Antioquia), seleccionados por apariencia y calidad.

2595

Caracterización fisicoquímica. Se determinó la acidez expresada en % de ácido cítrico por 100 g de producto fresco, por titulación con NaOH 0.1N, según la norma técnica colombiana NTC 4623 (22); el % cloruros por el método de Mohr NTC 210 (23); el % de humedad (base húmeda: H) por la norma de la AOAC 7.003 y 930.15 adaptado (24); pH con potenciómetro (Hanna Instruments, Hanna 211, USA); sólidos solubles según NTC 4624 expresados como ºBrix a 20°C (Refractómetro Carlzeiss Jena, USA) (22); actividad de agua (aw) con un higrómetro de punto de rocío (Aqualab Decagón 3TE, USA). El color se determinó sobre las caras lisas (CL) superficie superior del sombrero y rugosas (CR) laminillas en la parte inferior del sombrero, cada una como un factor para análisis estadístico, debido a las características únicas de reflexión de la luz de cada una de las caras, utilizando espectrocolorímetro (X-RITE SP64,BUSA) iluminante D65 y observador de 10° como referencia; a partir de los espectros de reflexión se obtuvieron las coordenadas de color del CIE-L*a*b, donde L* es un indicador de la luminosidad, a* [cromaticidad verde (-) a rojo (+)] y b* [cromaticidad azul (-) a amarillo (+)]. La textura (dureza) del producto, se determinó en la CL, a partir de ensayos de punción utilizando un analizador de textura (TA.XT2i Stable Micro Systems, USA), embolo metálico de 2 mm de diámetro y una velocidad de penetración de 4 mm/s hasta una distancia 5 mm. Almacenamiento. Las muestras de hongo fresco fueron almacenadas a 4°C con tiempos de control de 0, 3, 6, 9, 12 y 15 días, utilizando tres tipos de empaque y tres atmósferas modificadas, con un peso aproximado de 150 g/empaque. Se empleó una empacadora al vació (Komet SD 320, Talsa S.A, Colombia) para realizar el sellado de la película a la bandeja, y un mezclador de gases en acero inoxidable (Pbi Dansensor Map Mix 9000, USA). Las condiciones ambientales para las muestras envasadas a presión atmosférica fueron T≅20ºC y HR≅65%. Se evaluó la estabilidad de las muestras respecto a los parámetros fisicoquímicos. Las características de las

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atmósferas 1, 2 y 3 fueron ambiente (presión atmosférica), 100% N2 y mezcla (10% O2, 10% CO2, 80% N2) respectivamente. Para los empaques: Empaque 1. Bandeja de espuma de poliestireno (icopor) con dimensiones 12x20x1.5 cm, recubiertas con película trasparente de cloruro de polivinilo (PVC), permeabilidad al vapor de agua: 0 g/m2/24h/ atm, T=25°C; O2:620 cm3/m2/24h/atm, CO2: 4263 cm3/m2/24 h/atm (Alico S.A). Los hongos frescos almacenados en el empaque 1 y atmósfera 1 (envasado comercial) se utilizaron como muestra control. Empaque 2. Bandeja de polietilentereftalato/ polietileno de baja densidad (PET/LDPE, permeabilidad despreciable), con dimensiones 13x18x4.5 cm, recubierta con laminado de polipropileno biorientado/polietileno de baja densidad (BOPP/LDPE) con 54 μm de espesor, permeabilidad al vapor de agua: 0.3 g/m2/24h/atm, T=25ºC; O2: 3400 cm3/ m2/24 h/atm, CO2: 12000 cm3/m2/24 h/ atm (Alico S.A). Empaque 3. Bandeja de polietilentereftalato/ polietileno de baja densidad (PET/LDPE, permeabilidad despreciable), recubierta con laminado polietileno de baja densidad (LDPE) con permeabilidad al vapor de agua: 23.2 g/m2/24 h/atm, T=25ºC; O2: 4000 cm3/m2/24 h/atm, CO2 8000 cm3/ m2/24 h/atm, y dimensiones 13x18x4.5 cm (Alico S.A). Las combinaciones generan 7 tratamientos a evaluación: Atmósfera 1Empaque 1 o muestra control; Atmósfera 1- Empaque 2; Atmósfera 1- Empaque 3; Atmósfera 2- Empaque 2; Atmósfera 2- Empaque 3; Atmósfera 3- Empaque 2; Atmósfera 3- Empaque 3.

Caracterización del espacio de cabeza. Se determinó el contenido O2 y CO2 presentes en el espacio de cabeza de los empaques y atmósferas modificadas durante el tiempo de almacenamiento, utilizando un chequeador de gases en acero inoxidable (Pbi Dansensor Map Mix 9000, Dansensor, USA). Análisis estadístico. Se utilizó la herramienta estadística STATGRAPHICS plus versión 5.1, a partir de un modelo multifactorial completamente aleatorizado de tres factores de efectos fijos: empaque, atmósfera de envasado y tiempo de almacenamiento. Para cada tipo de atmósfera se realizó un análisis independiente a partir de ANOVAS, utilizando el método LSD (mínimas diferencias significativas) como método de comparaciones múltiples, con un nivel de confianza del 95%.

RESULTADOS Evolución de los parámetros fisicoquímicos. Las tablas 1, 2 y 3 presentan los valores medios y las desviaciones estándar de los parámetros fisicoquímicos para las muestras almacenadas en los empaques 1, 2 y 3 respectivamente, envasadas en las atmósferas 1, 2 y 3. Para todos los empaques, se encontraron diferencias significativas (p<0.05) por efecto del tiempo de almacenamiento y la atmosfera de envasado en los parámetros °Brix y pH, mientras que para la H se presentaron diferencias por efecto del tipo de atmósfera de envasado para los empaques 2 y 3.

Tabla 1. Características fisicoquímicas del hongo fresco en empaque 1 - atmósfera 1. 0 días

3 días

6 días

9 días

12 días

15 días

H(%)

90.3 ± 0.9

89.2 ± 1.5

89.3 ± 1.4

90.5 ± 1.1

91.3 ± 0.8

91.8 ± 0.7

0.994±0.002

0.993±0.001

0.994±0.001

6.47 ± 0.03

6.44 ± 0.01

6.17 ± 0.02

6.13 ± 0.02

6.43 ± 0.03

6.19 ± 0.05

Acidez (%)

0.20 ± 0.01

0.21 ± 0.01

0.19 ± 0.01

0.2 ± 0.01

°Brix

4.3 ± 0.1

4.7 ± 0.1

7.0 ± 0.2

6.4 ± 0.1

5.0 ± 0.1

4.7 ± 0.1

Cloruros(%)

1.8 ± 0.1

2.0 ± 0.1

1.7 ± 0.2

2.1 ± 0.1

1.9 ± 0.1

1.8 ± 0.2

Cortés - Influencia del empaque y envasado del hongo Pleurotus ostreatus Tabla 2. Características fisicoquímicas del hongo fresco en empaque 2. Atmósfera 1 0 días

3 días

6 días

9 días

12 días

15 días

H(%)

94.3 ± 0.5

90.1 ± 1.3

91.6 ± 0.7

94.8 ± 0.6

91.7 ± 0.6

94.6 ± 0.4

0.994±0.001

0.996±0.001

0.997±0.001

6.25 ± 0.05

6.17 ± 0.05

6.03 ± 0.12

5.91 ± 0.05

6.22 ± 0.04

6.00 ± 0.08

Acidez (%)

0.15 ± 0.01

0.17 ± 0.01

0.16 ± 0.01

0.19 ± 0.01

°Brix

2.3 ± 0.3

3.0 ± 0.1

5.4 ± 0.1

4.6 ± 0.3

3.3 ± 0.2

2.9 ± 0.1

Cloruros(%)

2.0 ± 0.2

2.1 ± 0.2

2.3 ± 0.3

2.1 ± 0.1

2.1 ± 0.2

0 días

3 días

6 días

9 días

12 días

15 días

H (%)

94.3 ± 0.5

89.6 ± 1.7

91.9 ± 0.2

94.5 ± 0.6

91.5 ± 0.8

92.3 ± 0.7

0.994±0.001

0.996±0.001

0.997±0.001

0.996±0.001

Atmósfera 2

6.25 ± 0.05

6.08 ± 0.02

5.75 ± 0.07

5.80 ± 0.07

6.15 ± 0.03

5.98 ± 0.08

Acidez (%)

0.15 ± 0.01

0.19 ± 0.02

0.18 ± 0.01

0.19 ± 0.01

0.20 ± 0.03

°Brix

3.1 ± 0.1

3.7 ± 0.1

6.0 ± 0.2

5.2 ± 0.1

3.7 ± 0.1

3.6 ± 0.1

Cloruros(%)

2.0 ± 0.2

2.0 ± 0.1

2.1 ± 0.2

0 días

3 días

6 días

9 días

12 días

15 días

H (%)

94.3 ± 0.5

89.4 ± 1.7

92.2 ± 0.4

93.9 ± 1.2

92.3 ± 0.6

93.2 ± 0.5

0.994±0.001

0.996±0.001

0.997±0.001

0.996±0.001

0.997±0.001

Atmósfera 3

6.25 ± 0.05

6.21 ± 0.04

6.30 ± 0.02

6.11 ± 0.02

6.38 ± 0.05

5.96 ± 0.08

Acidez (%)

0.15 ± 0.01

0.19 ± 0.01

0.16 ± 0.01

0.17 ± 0.02

0.12 ± 0.01

°Brix

3.1 ± 0.1

3.4 ± 0.1

5.2 ± 0.1

4.1 ± 0.2

3.4 ± 0.1

3.0 ± 0.1

Cloruros(%)

2.0 ± 0.2

2.1 ± 0.1

2.3 ± 0.1

2.1 ± 0.1

2.0 ± 0.1

Tabla 3. Características fisicoquímicas del hongo fresco en empaque 3 Atmósfera 1 0 días

3 días

6 días

9 días

12 días

15 días

H (%)

92.4 ± 0.5

89 ± 1.1

91.2 ± 0.6

92.3 ± 0.9

89 ± 0.7

90.8 ± 0.5

0.995 ±0.001

0.995±0.001

0.996±0.001

6.33 ± 0.06

6.27 ± 0.06

6.36 ± 0.05

6.26 ± 0.07

6.15 ± 0.07

6.44 ± 0.08

Acidez (%)

0.24 ± 0.02

0.17 ± 0.01

0.18 ± 0.02

0.25 ± 0.01

0.21 ± 0.02

0.21 ± 0.01

°Brix

3.9 ± 0.3

3.8 ± 0.3

4.7 ± 0.4

4.2 ± 0.3

3.9 ± 0.1

3.8 ± 0.3

Cloruros(%)

2.2 ± 0.1

2.3 ± 0.2

2.3 ± 0.3

2.8 ± 0.2

2.4 ± 0.2

2.6 ± 0.3

Atmósfera 2 0 días

3 días

6 días

9 días

12 días

15 días

H (%)

92.4 ± 0.5

89.8 ± 1.1

90.1 ± 0.3

90.7 ± 0.4

90.7 ± 0.5

92 ± 0.7

0.995±0.001

0.997±0.001

0.996±0.001

0.997±0.001

0.996±0.001

6.33 ± 0.06

6.21 ± 0.07

6.33 ± 0.11

6.11 ± 0.04

6.10 ± 0.04

6.22 ± 0.04

Acidez (%)

0.24 ± 0.02

0.15 ± 0.02

0.18 ± 0.01

0.24 ± 0.01

0.20 ± 0.01

0.19 ± 0.01

°Brix

3.9 ± 0.3

3.4 ± 0.3

3.8 ± 0.2

3.5 ± 0.2

3.6 ± 0.2

Cloruros(%)

2.2 ± 0.1

2.1 ± 0.2

2.1 ± 0.1

2.5 ± 0.2

2.1 ± 0.2

0 días

3 días

6 días

9 días

12 días

15 días

H (%)

92.4 ± 0.5

89 ± 0.8

90.6 ± 0.6

93.9 ± 1.2

91.1 ± 1.0

93.0 ± 0.5

3.3 ± 0.2 2.1 ± 0.1

Atmósfera 3

0.995±0.001

0.997±0.001

0.996±0.001

6.33 ± 0.06

6.53 ± 0.15

6.21 ± 0.07

6.18 ± 0.08

6.16 ± 0.08

6.45 ± 0.06

Acidez (%)

0.24 ± 0.02

0.20 ± 0.00

0.17 ± 0.02

0.23 ± 0.03

0.22 ± 0.01

0.16 ± 0.01

°Brix

3.9 ± 0.3

3.8 ± 0.2

3.0 ± 0.7

3.3 ± 0.3

4.5 ± 0.4

3.1 ± 0.2

Cloruros(%)

2.2 ± 0.1

2.1 ± 0.1

2.1 ± 0.2

2.7 ± 0.2

2.4 ± 0.1

2.0 ± 0.2

2597

2598

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Evolución del color. Las figuras 1 y 2 presentan los valores medios para los parámetros L*, a* y b* en hongos comestibles Pleurotus ostreatus en la muestra control y el empaque 2 y 3 (atmósferas 1, 2 y 3). Para la muestra control, los factores tiempo y cara fueron significativos (p<0.05) en todos los parámetros, siendo las muestras CR < CL para L* y las CR > CL para a*y b*. Para los hongos envasados en empaque 2, los factores tiempo y cara, fueron significativos para los parámetros L* y a* en todas las atmósferas, mientras que para b*, solo tuvo efecto el tiempo. Para L*, se observaron valores relativamente similares en las 3 atmósferas, dentro de un rango de variación entre 70-79, que lo ubica dentro de una luminosidad clara. Para los hongos envasados en el empaque 3, los factores tiempo, atmósfera y cara fueron significativos (p<0.05) para las variables L*, a* y b*, pero en rangos de variación bajos. Para todas las atmósferas, la tendencia de los valores de L*, a* y b*

con el tiempo fue similar en ambas caras, siendo las muestras CL más clara y de menor saturación en la escala de los grises que las muestras CR Evolución de la textura. La figura 3 presenta los valores medios de la fuerza máxima o fuerza de ruptura de los hongos envasados en las atmósferas 1, 2 y 3 y empaques 1, 2 y 3 durante el almacenamiento. El ANOVA presentó diferencias significativas (p<0.05) por efecto del factor tiempo y el tipo de empaque en todas las atmósferas. Para la atmósfera ambiente, las muestras presentaron un comportamiento relativamente similar, manteniéndose en un rango de valores entre 1900 y 1300 gf. Para la atmósfera 2, existió una tendencia a disminuir la textura del producto en los empaques 2 y 3, a los 6 y 9 días respectivamente. En la atmósfera 3, el comportamiento de los empaques 2 y 3 fue similar, con coeficientes de variabilidad amplios y diferencias solo al tercer día.

Muestra control

Figura 1. Valores medios con los intervalos LSD (95%) de L*, a* y b* en hongos comestibles (Pleurotus ostreatus) para las caras lisa (CL) y rugosa (CR) de hongos frescos empacados en la muestra control y el empaque 2 (atmósferas 1, 2 y 3) durante el tiempo de almacenamiento.

Cort茅s - Influencia del empaque y envasado del hongo Pleurotus ostreatus

2599

Figura 2. Valores medios con los intervalos LSD (95%) de L*, a* y b* en hongos comestibles (Pleurotus ostreatus) para las caras lisa (CL) y rugosa (CR) de hongos frescos empacados en la muestra control y el empaque 3 (atm贸sferas 1, 2 y 3) durante el tiempo de almacenamiento.

Figura 3. Valores medios con los intervalos LSD (95%) del par谩metro de textura fuerza de penetraci贸n, para hongos comestibles (Pleurotus ostreatus) envasados bajo todos los empaques y atmosferas mencionadas durante el almacenamiento.

2600

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Cambios en la composición de los gases en el espacio de cabeza. La figura 4 presenta los cambios en la actividad respiratoria del hongo. C urva de R es pirac ión de P . Os treatus a 4º C 1200

y = 45.27x + 76.742 R 2 = 0.9829

1000

800 vol O22

600

vol C O22

400

1 y 3, siendo mayor los niveles de O2 que en el empaque 2. Los niveles de CO2 en la atmósfera 1 se incrementaron hasta un valor del 10%, mientras que en la atmósfera 3, inicia con el 10% del gas de envasado y presenta una reducción hasta valores de 0.5%. Para los empaques 2 y 3, la atmósfera 2 (atmósfera inerte), presentó como era esperado, niveles de O2 nulos, con una tasa de producción de CO2 hasta un 21% y 13.6%, respectivamente.

200 0 0

10 15 Tiempo en horas

Figura 4. Curva de respiración del hongo comestible (Pleurotus ostreatus) a 4°C, durante 24 horas.

La tabla 4 muestra los valores en el % de O2 y CO2 para cada combinación de atmósfera y empaque. Para el empaque 2, el comportamiento del O2 y el CO2 en el espacio de cabeza, alcanzó una condición de anaerobiosis (≈0 %O2) antes del día 4 en las atmósferas 1 y 3. La generación de CO2 alcanzó valores entre el 20 y 30% entre los días 4 y 12. Para el empaque 3, se alcanzó la condición de anaerobiosis el día 9 en las atmósferas Tabla 4. Valores de %O2 y CO2 para empaque 2 y 3, de acuerdo a la atmosfera de almacenamiento. Empaque 2 Tiempo

Atmósfera 1

Atmósfera 2

Atmósfera 3

CO2

0 días

20.9

10.0

4 días

21.6

12.3

21.0

9 días

0.1

24.7

18.9

25.5

12días

0.2

30.9

21.0

0.2

29.7

Empaque 3 Tiempo

Atmósfera 1

Atmósfera 2

Atmósfera 3

CO2

0 días

20.9

4 días

9.6

5,1

7.4

4.2

4.7

9 días

7.1

10.8

0.9

6.0

12días

0.1

10.3

13.6

10.3

0.5

DISCUSIÓN Evolución de los parámetros fisicoquímicos. Los cambios en los °Brix, durante el almacenamiento, están asociados principalmente al desdoblamiento de los carbohidratos presentes (rompimiento de los polisacáridos en monosacáridos) (25) y a la deshidratación progresiva del producto por la diferencia de potencial químico entre el producto y la atmósfera (26); cuyo resultado es el incremento del contenido de azucares en el producto durante los primeros seis días y posteriormente tiende a establecer el equilibrio al final del almacenamiento. Este comportamiento ocurrió en todos los empaques, con una mayor intensidad en el empacado comercial (muestra control), seguido del empaque 2 para la atmósfera 2, y concuerda con estudios previos realizados en Agrocybe chaxingu empacados en atmósfera modificada (5% O2, 10% CO2, 85% N2) (17). Para el hongo fresco (t=0) los parámetros de aw, humedad, pH y °Brix fueron similares a los reportados en otras investigaciones (27-29), mientras que la acidez presentó valores superiores (4.00±0.23% frente 1.95±0.01%). En general, todas las muestras presentaron diferencias estadísticas significativas en los parámetros fisicoquímicos del hongo fresco por efecto de los factores tiempo de almacenamiento, empaque y tipo de atmósfera; los rangos de variación se consideraron aceptables y enmarcados en

Cortés - Influencia del empaque y envasado del hongo Pleurotus ostreatus

las características propias del producto, como ente biológico que continua con sus procesos metabólicos. Evolución del color. Para la muestra control los datos obtenidos de L* mostraron valores en CR < CL y para los parámetros a*y b* valores en CR > CL. Estos últimos concuerdan con los reportados por Cortés et al (28) para los parámetros a* y b* en hongos de la misma variedad; sin embargo los valores de L* fueron mayores para ambas caras en el presente estudio. Estas variaciones se atribuyen a diversos factores como el sustrato utilizado durante la siembra, las condiciones de cosecha y la composición final del producto. La evolución de los parámetros de color con el tiempo, refleja una cinética similar para ambas caras, presentando inicios de pardeamiento al final del almacenamiento, lo cual se identifica por la disminución de L* a valores inferiores a 70 y el incremento de la cromaticidad a* y b*, pero permaneciendo en la cromaticidad de la escala de grises. Los bajos rangos de variación de L*, provocan diferencias difícilmente apreciables entre las caras del hongo y a través del tiempo de almacenamiento. Para a* y b*, el comportamiento fue similar para las atmósferas, en un rango de valores entre 4-7 (a*) y 16-20 (b*). Esta combinación de parámetros, produce un nivel de saturación de color bajo en escala de grises; así estas diferencias mínimas no son apreciables a simple vista y pueden no ser percibidas por el observador (como medidor subjetivo del color). Las diferencias entre las caras del hongo a través del tiempo de almacenamiento son atribuidas más a la variabilidad propia del producto y la irregularidad de la superficie de la CR, que a la interacción de los gases de la atmósfera con el sustrato alimentario. A pesar de los cambios detectados por el análisis estadístico en los parámetros de color, debido a los factores de tiempo, atmósfera y cara, los rangos de variación de L*, a* y b*- no representan diferencias apreciables para el observador, lo que

2601

permite concluir que las diferencias de color por el uso del empaque en las 3 atmósferas no son relevantes. Investigaciones realizadas por Villaescusa y Gil (11), reportan que el parámetro b* es el más representativo para detectar las diferencias en el color del hongo, lo cual sustenta lo expuesto anteriormente. En general, no se presentó pardeamiento enzimático ni diferencias de color apreciables a nivel del observador a través del tiempo en los empaques y atmósferas de estudio, contrario a lo reportado en otras variedades de hongos en atmósferas modificadas (14). Se pueden observar algunas ligeras fluctuaciones más por variaciones propias del producto. En conclusión los cambios de color fueron más acentuados en la muestra control, alcanzando un ligero pardeamiento al final del almacenamiento. Para los empaques 2 y 3, en las 3 atmósferas de envasado, se presentaron diferencias significativas por efecto de los factores de estudio con uniformidad en el rango estrecho de valores a través del tiempo de almacenamiento, sin llegar a ser realmente apreciables por el observador. Evolución de la textura. Para la atmósfera ambiente el rango de valores de la fuerza de ruptura entre 1900 y 1300 gf., corresponde a una ruptura de valor medio para este tipo de material (28). Las variaciones se atribuyen a los daños generados por los cambios metabólicos y de senescencia del producto (29), además de la acción de algunas enzimas del grupo de las hidrolasas, presentes en frutas, bacterias, hongos y levaduras (30). La tendencia a disminuir la textura del producto en la atmósfera 2 en combinación con los empaques 2 y 3, puede asociarse a un debilitamiento de la estructura celular debido a procesos fermentativos y a la respiración facultativa del hongo (30). Villaescusa y Gil (11), detectaron procesos fermentativos en Pleurotus ostreatus, envasado en empaques de PVC y polietileno de baja densidad (LDPE).

2602

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La textura presentó diferencias significativas por efecto de los factores tiempo y empaque en todas las atmósferas, con una disminución en la resistencia mecánica, debido a los posibles procesos fermentativos y al deterioro por la alta tasa metabólica. Cambios en la composición de los gases en el espacio de cabeza. Los valores encontrados en producción de CO2 se ajustan a los reportados por Kim et al (10), confirmando la alta tasa respiratoria del producto. La condición de anaerobiosis (≈0 %O2) antes del día 4 en las atmósferas 1 y 3 para el empaque 2, ocurre rápidamente al suplirse las demandas fisiológicas, provocando una alta tasa inicial de respiración, asociada a la tensión poscosecha (fuerza capilar y tasa de realización de procesos biológicos normales) debida al corte del pie (tallo) antes del almacenamiento. Resultados similares en hongos de la misma variedad fueron obtenidos por Villaescusa y Gil (11). El mayor descenso de O2 para la atmósfera 1, es ocasionado por las condiciones iníciales de la atmosfera que contiene un 11% más del mismo. Las altas concentraciones de CO2 (valores entre el 20 y 30%) acumuladas al interior del empaque son atribuidas al mismo fenómeno de respiración, lo cual es similar para la mayoría de los vegetales, por lo que la modificación del espacio de cabeza sucede rápidamente de acuerdo con las propiedades de permeabilidad al gas de la película (10). Los mayores niveles de O2 para el empaque 3 (comparado con el empaque 2) son debidos a su mayor permeabilidad. La reducción de los valores de CO2 para la atmósfera 3 es atribuido a los procesos de perdida por transpiración y permeabilidad del empaque.

El aumento en la concentración de CO2 para la atmósfera 2 (atmósfera inerte) en ambos empaques es debido a la facultad fermentativa del hongo. En general, los hongos son aeróbicos, pero también tienen la capacidad de ser microaerobios y en condiciones de almacenamiento con bajos niveles de O2, esta puede resultar en concentraciones insuficiente para un metabolismo aeróbico, donde los tejidos pueden iniciar una respiración anaeróbica, en la que la glucosa se transforma en ácido láctico o acetaldehído y etanol (fermentación). La concentración de O2 a la que se inicia la fermentación varía con los tejidos y se conoce como punto de extinción, el cual depende de numerosos factores como la especie, el cultivar, el grado de madurez y la temperatura pre y poscosecha (30). La estructura del hongo, presentó una alta tasa de respiración en las atmósferas 1 y 3. La generación de CO2 en el Pleurotus ostreatus, debida a procesos respiratorios alcanzó al final del almacenamiento niveles máximos del orden del 30% en el empaque 2; mientras que para el empaque 3, presentó una reducción desde el 10% hasta 0.5%, asociado al balance entre el proceso de transpiración y la permeabilidad de la película. La atmósfera 2, presentó una tasa máxima de producción de CO2 en el empaque 2, alcanzando niveles del 21%. En conclusión, los resultados obtenidos permiten identificar que los empaques y las atmósferas modificadas evaluadas, no influyen significativamente en las características fisicoquímicas y fisiológicas tratadas en esta investigación para el hongo Pleurotus ostreatus, lo que hace que el control (empaque comercial) sea más práctico por efecto de costos de producción.

Cortés - Influencia del empaque y envasado del hongo Pleurotus ostreatus

2603

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2605

Rev.MVZ Córdoba 16(2):2605-2615, 2011.

ORIGINAL

Genotoxicidad del agua contaminada por plaguicidas en un área de Antioquia Genotoxicity of water contaminated by plaquicidas in an area of Antioquia Flor Tobón M, 1* M.Sc, Luís López G,

M.Sc.

Universidad de Antioquia. Facultad de Química Farmacéutica y Facultad de Enfermería, Grupo de Investigación UNI-PLURI/VERSIDAD, Medellín, Colombia. *Correspondencia: jvm@une.net.co

Recibido: Junio de 2010; Aceptado: Enero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Determinar genotoxicidad del extracto orgánico de recursos hídricos de la vereda Monterredondo (Antioquia), contaminados por el uso de pesticidas en la agricultura, en la producción porcina y avícola como un diagnóstico de su calidad para entender su influencia en estas fuentes de agua en el municipio de San Pedro de Los Milagros (Antioquia). Materiales y métodos. Se empleó el ensayo cometa para establecer fragilidad osmótica de eritrocitos, viabilidad celular y alteración del ADN de linfocitos humanos al incubar estas células en agua recogida de tres fuentes hídricas de la vereda Monterredondo en el laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia. Resultados. El análisis de los datos de la longitud del cometa del extracto orgánico de las tres muestras, indicaron genotoxicidad. Este efecto fue dependiente de la concentración del extracto y del sitio de muestreo (p<0.001). La muestra de agua de la quebrada el Hato, presentó el mayor efecto genotóxico a 4 y 37ºC; la muestra de agua de la planta de tratamiento de la Hacienda La Montaña, presentó una alta genotoxicidad relativa, comparada con la muestra de agua de la quebrada Fray Juana. Conclusiones. El análisis de las tres muestras de agua recogidas en la vereda Monterredondo reveló genotoxicidad. Sin embargo, se sugiere en el futuro evaluar el grado de toxicidad de los componentes orgánicos concentrados y la genotoxicidad en personas que la consumen. Palabras clave: Agua, extracto orgánico, genotoxicidad, ensayo cometa, contaminación ambiental, Colombia. (Fuentes: AIMS, CAB).

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2606

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ABSTRACT Objective. Determining genotoxicity of organic extract from water resources contaminated by the pesticides used in agriculture, pig and poultry production in Monterredondo village (Antioquia), as a diagnosis of its quality to understand its influence on these water sources in San Pedro de Los Milagros (Antioquia). Materials and methods. Comet assay was used to establish osmotic fragility of erythrocytes, cell viability and DNA damage in human lymphocytes by incubating of these cells in three samples of water collected from sources in the village of Monterredondo in the laboratory of Biochemistry, Faculty of Medicine of the University Antioquia. Results. Data analysis of the comet’s assay length of the organic extract from the three collected samples, indicates genotoxicity. This effect is dependent on the concentration of the extract and the sampling site (p<0.001). The sample of water from the Hato River shows the highest genotoxic effect at 4 and 37ºC. The water sample, from treatment plant Hacienda La Montaña shows relative high genotoxicity, compared to the sample water taken from Fray Juana river. Conclusions. The analysis of the three water samples, collected in the Monterredondo village, reveals genotoxicity. However, further evaluation on the toxicity grade of the concentrated organic components and the genotoxicity in people who drink it, is suggested. Key words: Water, organic extract, genotoxicity, comet assay, environmental contamination, Colombia. (Sources: AIMS, CAB)

INTRODUCCIÓN Las actividades agropecuarias y los residuos de alimentos, entre otros; generan desperdicios tóxicos y sus vertimientos a fuentes hídricas ingresan en un ecosistema a una velocidad que excede la capacidad normal de éste para procesarlos y distribuirlos, constituyéndose en un problema de contaminación ambiental. Una forma de contribuir a prever y evitar este problema esencial, que es la determinación de genotoxicidad producida por vertimientos de algunos productos químicos en las fuentes hídricas que pueden desencadenar mutaciones, alterando los códigos en la secuencia del ácido desoxirribonucleico (ADN). Se entiende la genotoxicidad como la acción deletérea de un agente o sustancia que interactúa de una forma directa o indirecta con el ADN, modificándolo y afectando su integridad. El efecto genotóxico del agente o sustancia sobre el ADN genera cambio errático permanente (mutación) en el genotipo de determinada célula en el proceso de división celular, pudiendo producir o no un cáncer. Aunque, existen aspectos por aclarar en la relación compleja entre la exposición a un genotóxico y el desarrollo

de cáncer que puede ser o no cancerígeno. En el caso de ser cancerígeno, éste tiene una alta probabilidad de ser genotóxico (1). La contaminación resulta de la aplicación directa sobres bovinos, porcinos, aves y cultivos; además de otras sustancias provenientes de contribuciones de residuos que llegan a los afluentes por las aguas negras y de la atmósfera por lixiviación, escorrentía y precipitación. De acuerdo a publicaciones sobre genotoxicidad de estas sustancias químicas se ha determinado en diferentes especies, in vitro e in vivo; las relacion con la utilización indiscriminada de pesticidas y plaguicidas, también se asocian con la posibilidad de desencadenar mutaciones por la exposición crónica a dosis pequeñas en actividades ocupacionales o por circunstancias accidentales que en ocasiones inician un proceso carcinogénico (3,4). El uso del Glifosato, un herbicida total, no selectivo de amplio espectro, es un factor de riesgo para la salud y puede afectar el ADN en cientos de células en concentraciones normales en el agua potable; pero se requiere evaluar sus

Tobón - Genotoxicidad del agua contaminada por plaguicidas

efectos, tales como el tipo de cáncer y el período en que se convierte en un riesgo potencial para los seres humanos (2,5-7). Esta investigación, buscó ampliar el conocimiento de la problemática ambiental y contribuir a su contención mediante la evaluación de la genotoxicidad de las dos muestras de agua sin tratar y la muestra de agua tratada para que de una manera progresiva con fundamentos científicos, incentivar acciones hacia una disminución del uso indiscriminado de pesticidas y herbicidas, una preocupación global, por su alta toxicidad y consecuencia de sus efectos en la calidad del agua y la repercusión en la salud de la población. En este sentido, la agricultura basada en prácticas no apropiadas dependientes de plaguicidas (insecticidas, herbicidas, fungicidas) y fertilizantes tóxicos, es apoyada y promovida en Colombia por políticas nacionales e internacionales, desde la década de 1950. Dichas prácticas contaminan los ecosistemas acuáticos y terrestres, y los alimentos; causando graves problemas de salud a corto, mediano y largo plazo. Dichas prácticas inadecuadas contaminan las fuentes hídricas, alterando la biodiversidad de flora y fauna, desarrollando resistencia de plagas y aparición de enfermedades. Esto hace más costosa la agricultura, más pobres y enfermos a los agricultores; además de un impacto negativo a los ecosistemas (8-10). El objetivo de esta investigación fue determinar genotoxicidad del extracto orgánico de recursos hídricos de la vereda Monterredondo (Antioquia), contaminados por el uso de pesticidas en la agricultura, en la producción porcina y avícola como un diagnóstico de su calidad para entender su influencia en estas fuentes de agua en el municipio de San Pedro de Los Milagros (Antioquia).

MATERIALES Y MÉTODOS. Tipo de estudio. Investigación experimental cuantitativa en donde se evaluó la genotoxicidad de dos muestras de agua de fuentes hídricas sin tratar y una

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muestra de agua tratada de la Hacienda la Montaña de la Universidad de Antioquia, la cual se tomo como una estación importante dentro de la vereda. Sitio de estudio. Estas fuentes hídricas suministran agua a la vereda Monterredondo ubicada a 3 km de la cabecera municipal de San Pedro de los Milagros (Antioquia) y a 41 kilómetros de Medellín, a una latitud norte: 6° 27’ 41’’, longitud al oeste Greenwich: 75° 33’ 31’’. Limita por el norte con Belmira y Entrerríos; por el sur con Bello, Copacabana y Girardota; por el oriente con: Donmatías y por el occidente con Sopetrán y San Jerónimo. Temperatura promedio de 15°C y una altura de 2.350 a 2.500 msnm. Según la apreciación del 100% de las familias de la vereda, al hacerles una encuesta domiciliaria y por observación de los investigadores durante la misma; las fuentes hídricas están contaminadas. Los residentes de la vereda expresaron que utilizan de manera indiscriminada plaguicidas y pesticidas tóxicos en las actividades agropecuarias y que algunos emplean el agua de estas fuentes para uso doméstico (Tabla 1). Se utilizó el ensayo Cometa para determinar genotoxicidad de dos muestras de agua sin tratar, recogidas de las quebradas Fray Juana y El Hato, y una muestra de la planta de tratamiento de la Hacienda La Montaña de la Universidad de Antioquia, abastecida por la quebrada Fray Juana. Este método es útil para la valoración del biomonitoreo de daños genéticos (mutagenicidad y genotoxicidad). Análisis de genotoxicidad. Fue efectuado por el grupo de investigación del Laboratorio de Agua de Mar de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia, el cual determinó la fragilidad osmótica de eritrocitos, la viabilidad celular y el daño en el ADN de linfocitos de células humanas expuestas a los tres EO de las muestras de agua a 4 y 37°C (11, 12). Recolección y tratamiento de muestras. Las muestras de agua recolectadas (tratada y no tratada) fue de 100 L de agua de cada una de las fuentes hídricas mencionadas, depositados en recipientes

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Tabla 1. Distribución porcentual de los productos químicos de uso más frecuente por las familias encuestadas en la vereda Montenegro del municipio de San Pedro de los Milagros, 2008. Producto

Toxicidad

Uso

Frecuencia*

Límpido® (Hipoclorito de sódio 6%)

III Media

Desinfetante

82%

I Alta

Plaguicida

47%

IV Baja

Fertilizante de plantas

34%

Ráfaga® (Clorpirifos)

I Alta

Plaguicida

33%

Látigo® (Clorpirifos)

I Alta

Plaguicida

30%

Mediana

Plaguicida

27%

Alta acuática

Antiinfeccioso

26%

No aplica

Aporte de vitaminas

25%

Baja

Antiinfeccioso

22%

Triple quince® (N, P, K)

No aplica

Fertilizante de plantas

22%

Vitaminas Complejo B

No aplica

Aporte de vitaminas

19%

Lutalise® (PG F2 alfa)

No aplica

Estimular ovulación

18%

I Alta

Plaguicida

16%

Extrema Alta

Insecticida

15%

Media

Ectoparásitos

14%

Panacur ® (Fenbendazol )

Baja

Nematicida

12%

Karate® (D-Cyalotrina)

Baja

Plaguicida

11%

Barricada® (Cipermetrina)

Baja

Plaguicida

11%

Engeo® (Neonicotinoide+piretroide)

Baja

Plaguicida

10%

Extrema Alta

Plaguicida

No aplica

Antibiótico

Baja

Herbicida Total

No aplica

Aporte de vitaminas

III Mediana

Larvicida y antiséptico

Baja

Insecticida

Extrema Alta

Ectoparásitos

III

Plaguicida

Oxitocina

No aplica

Hormonas

Glifosato

Baja

Herbicida total

Lorsban® (Clorpirifos) Urea® ( Nitrógeno)

Manzate® (Ditiocarbamato) Curagan® (Fenol) Calmafox® (medicamento) Oxitetraciclina (medicamento)

Neguvon® (Metrifonato) Ganabaño® (Cipermetrina) Triatox® (Amitraz)

Furadán® (Carbofurán) Tetraciclina Roundup® (Glifosato) Vitamina Mk Lepecid® (Clorpirifos) Piretroides Ivermectina Genfar® Pirestar® (Permetrina)

*Menor o igual a dos meses.

plásticos de polietileno de alta densidad (HDPE) y transportados por vía terrestre a temperatura ambiente hasta el Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia para la determinación del efecto genotóxico. Tratamiento para las pruebas genotoxicidad y viabilidad

Concentración del EO. Los 100 L de agua recogidos de cada una de las quebradas y de la planta de tratamiento se concentraron porque los compuestos genotóxicos pueden estar a muy bajas concentraciones. La adsorción del EO no volátil contenido en estas muestras de agua se hizo por el método de adsorción en resinas styrene divinylbenceno amberlita XAD-2 y XAD-

7 no polares. Cada muestra se pasó por una columna que contenía 100 g de resina XAD-2 y 100 g de XAD-7 a una velocidad aproximada de 15 mL/min. La elución se realizó con 300 mL de acetona. El volumen del eluyente se retiró por rota evaporación a baja presión hasta eliminar la acetona y la porción acuosa se liofilizó. Se pesaron los extractos liofilizados, se diluyeron en dimetilsulfóxido al 50% y se guardaron a 4ºC. Las células humanas se trataron con EO obtenido de las aguas recolectadas para establecer viabilidad y genotoxicidad. Prueba de viabilidad del efecto citotóxico. Consiste en tomar una muestra de sangre de un donante sano, con su consentimiento informado y comprendido. La sangre total se trató con ácido

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dietilenodiaminotetracético y por el método de centrifugación en un gradiente de densidad de Ficoll, se aíslaron los linfocitos humanos. Luego, se evaluó la viabilidad por el método de exclusión del colorante azul tripano al 0.2% y se incubaron tres diluciones del EO de las muestras de agua a 4 y 37°C durante una hora. Acto seguido; se evaluó de nuevo la viabilidad de los linfocitos para establecer la concentración más alta de la muestra de agua en la cual no se presentó efecto citotóxico (13). Prueba de genotoxicidad. Realizada para cada dilución del EO de las muestras de agua por duplicado para determinar el daño producido por éste al ADN de los linfocitos de sangre total, mediante la técnica de Single Cell Gel Electrofóresis (SCGE), conocida como ensayo cometa. Este análisis consiste en someter los EO de las tres muestras de agua recolectadas en función de la concentración por duplicado a pruebas de electroforesis en agarosa del ADN nuclear de células individuales durante 30 min a 25 voltios y 300 mA para estimar la fragmentación del DNA de las células de los linfocitos humanos, producida por los EO comparada con un control positivo, el H2O2 (100 μM) y el buffer fosfato salino (PBS) como control negativo para permitir el desenrollamiento del ADN y expresión de sitios lábiles a álcalis. Acto seguido, las láminas con el ADN de los linfocitos, se colorearon con 50 μl de Bromuro de Etidio al 2% y después se examinaron en un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro de excitación de 515-560 nm y un filtro barrera de 590 nm, usando una magnificación de 40X (12). Análisis de genotoxicidad. El análisis de genotoxicidad causado por cada una de las muestras de agua se efectúo al menos con 50 células del ADN nuclear por cada concentración del EO, utilizando un programa de computador de análisis de imágenes del ensayo de la longitud del cometa que permite recolectar datos midiendo la longitud de la migración y la intensidad de la fluorescencia como Momento de Olive (MO), suministrando la relación de la distancia entre el centro de gravedad de la cabeza del cometa (CGH) al centro de gravedad de

su cola (CGT) y el porcentaje de DNA de la cola, utilizando el software Comet Score, versión 1.5 que proporciona el porcentaje de DNA transformado (14). Análisis estadístico de varianzas. El análisis estadístico de varianzas del promedio del logaritmo de la longitud del cometa con dos factores: la concentración del EO y el lugar de recolección de las muestras de agua con un nivel de significancia de (p<0.05), se realizó con el paquete estadístico STATISTICA 7.0 (Stat Soft, Inc. Tulsa, OK, USA) (15).

RESULTADOS Los resultados del efecto genotóxico de los EO de las muestras hídricas recolectadas en la vereda Monterredondo, sobre los linfocitos humanos, en función de la concentración, el sitio de recolección y la temperatura a 4 y 37ºC, mostraron significancia estadística. (Tablas 2 y 3). El análisis de varianzas de las medias del efecto genotóxico de las concentraciones de 40, 120 y 200 mg/mL de los EO sobre Tabla 2. Valores promedio de la longitud del cometa de los linfocitos humanos incubados en función de la concentración de tres extractos orgánicos de agua de la vereda Monterredondo de San Pedro de los Milagros (Antioquia), Colombia, a 4ºC. Sitio de la Muestra* Quebrada Fray Juana

Planta de tratamiento Hacienda la Montaña Quebrada Hato

C o n t r o l negativo Control positivo

C** en mg/l

Nº de Células

Promedio de Longitud del Cometa µm

108.90

25.80

120

121.00

20.30

200

133.10

23.80

127.90

2.20

120

119.60

26.00

200

128.50

32.80

107.10

22.60

120

133.60

28.00

200

147.10

30.60

000

99.60

15.70

H2O2 100μM

119.40

31.70

*Efecto del sitio: F=3.65, p=0.02; **Efecto de la concentración: F=67.3, p<0.001. Efecto de la interacción entre el sitio de recolección de la muestra frente a la concentración: F=7.67, p<0.001. C=concentración. St=Desviación estándar.

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Tabla 3. Valores promedio de la longitud del cometa de los linfocitos humanos incubados en tres extractos orgánicos de agua de la vereda Monterredondo de San Pedro de los Milagros (Antioquia), Colombia, en función de la concentración, a 37ºC. Sitio de la Muestra* Quebrada Fray Juana

Planta de tratamiento Hacienda la Montaña Quebrada Hato

Control negativo Control positivo

C ** mg/L

Nº de Células

Promedio de Longitud del Cometa µm

111.4

21.8

120

130.4

23.0

200

139.6

21.2

119.3

23.6

120

179.6

34.7

200

181.6

24.7

143.5

30.4

120

164.4

29.9

200

180.8

25.1

000

109.9

21.6

H2O2 100μM

113.7

23.9

*Efecto del sitio: F=86.96, p<0.001. **Efecto de la concentración: F=229.05, p<0.001. Efecto de la interacción del sitio de la muestra frente a la concentración: F=22.48, p<0.001. St: desviación estándar.

Figura 2. Análisis de varianzas de medias del logaritmo de la longitud del cometa de linfocitos humanos incubados en tres extractos orgánicos de agua de la vereda Monterredondo de San Pedro de los Milagros (Antioquia), Colombia, en función de la concentración, a 37°C.

Las figuras 3 y 4 muestran el agua del sitio de recolección.

los linfocitos humanos expuestos por una hora a 4 y 37ºC, evidenció daño genotóxico significativo (p<0.001), dependiente de la interacción entre la concentración, el sitio de recogida y la temperatura. (Figuras 1 y 2).

Figura 3. Toma de nuestras de la quebrada el Hato.

Figura 1. Análisis de varianzas de medias del logaritmo de la longitud del cometa de linfocitos humanos incubados en tres extractos orgánicos de agua de la vereda Monterredondo de San Pedro de los Milagros (Antioquia), Colombia, en función de la concentración, a 4ºC.

Figura 4. Toma de nuestras de la planta de tratamiento de la Hacienda La Montaña.

Tobón - Genotoxicidad del agua contaminada por plaguicidas

Los resultados de esta investigación son un indicador del efecto genotóxico de esta agua; el mayor efecto de genotoxicidad y mutagenicidad se observó en los linfocitos humanos expuestos al EO de concentración de 200 mg/mL a 37ºC por

Figura 5.

Electroforesis de linfocitos humanos incubados a 37°C en EO de agua de la vereda Monterredondo.

una hora (Figura 5). Este análisis se aproxima a lo observado en ensayos in vitro y en poblaciones expuestas, reportados en la literatura, utilizando el ensayo cometa (15-18).

DISCUSIÓN El análisis de los resultados obtenidos son indicadores de la genotoxicidad de los EO expuestos a células humanas a 4 y 37°C de las tres muestras estudiadas contaminadas por vertimientos. Ello posiblemente por la bioacumulación y biomagnificación de toxinas en el ecosistema como resultado de ésta actitud y práctica agropecuaria con plaguicidas, herbicidas y disposición inapropiadas de los residuos. Los análisis de los valores de longitud del cometa de linfocitos humanos incubados en los tres EO de agua de la vereda Monterredondo en función de la concentración de 40, 120 y 200 mg/mL, expuestos por una hora a 4 y 37°C; mostraron un efecto significativo (p<0.001). Al igual que los análisis de

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las varianzas de los valores promedios de longitud del cometa que presentaron una interacción significativa (p<0.001) entre los factores: sitio de recolección del agua y concentración de 40, 120 y 200 mg/mL del EO de las muestras de agua a 4 y 37ºC. El análisis estadístico de estos datos permitió evidenciar las siguientes observaciones como resultado del efecto genotóxico directo de los EO de las tres muestras de agua de la vereda Monterredondo sobre linfocitos humanos de sangre total: 1) El efecto genotóxico es directamente proporcional a la concentración del EO, a mayor concentración (200 mg/mL), mayor probabilidad de genotoxicidad. 2) Se reveló que el EO de la muestra de agua de la quebrada el Hato presentó el mayor efecto genotóxico, resultado esperado, porque recoge aguas servidas muy contaminadas por plaguicidas, residuos de bovinos y porcinos. 3) La muestra de agua tomada de la planta de tratamiento de la Hacienda La Montaña, presentó una alta genotoxicidad relativa, comparada con la muestra de agua de la quebrada Fray Juana, cuya genotoxicidad, se observó particularmente a 37ºC. El análisis de varianzas de medias del Momento de Olive de linfocitos humanos incubados en los EO de las muestras de agua estudiadas en función de la concentración y el sitio de recolección, a 4 y 37 ºC (Figuras 1 y 4), confirma la hipótesis planteada y evidencia que los elementos tóxicos presentes en los efluentes derivados de vertimientos de las actividades agropecuarias, generan genotoxicidad y pueden estar incidiendo en la situación de salud pública de las comunidades que se sirven de estas aguas contaminadas. Las aguas utilizadas, provenientes de la producción porcícola, son vertidas a las quebradas de la vereda; siendo la principal receptora la quebrada El Hato. Esta actitud y práctica se relaciona con problemas ambientales bien conocidos a escala mundial, generados por la porcicultura, donde las excretas de los cerdos son contaminantes potenciales del agua superficial y del subsuelo por su alta concentración de gérmenes patógenos (bacterias, hongos, virus y parásitos),

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metales pesados (cobre y zinc) y materia orgánica con fósforo, potasio y nitrógeno, cuyos procesos biológicos y fisicoquímicos producen la formación de compuestos químicos y gases nocivos, como el dióxido de carbono (CO2), el amoníaco (NH3), el sulfuro de hidrógeno (H2S) y el metano (CH4) que afectan la salud humana y la de los porcinos, deteriorando los recursos naturales e incide negativamente en la calidad de vida. Esto puede estar relacionado con lo observado en algunas personas de la vereda durante las entrevistas, principalmente niños y adultos mayores, quienes expresaron alteraciones respiratorias, oftalmológicas y dermatológicas y la relacionaban con el contacto directo que tienen con el agua de uso doméstico (19-22). El ensayo cometa a 37°C muestra la mayor fragmentación del ADN, porque a esta temperatura se presenta el daño genotóxico y simultáneamente un proceso de reparación, el cual implica fragmentación del ADN. Mientras que en el ensayo a 4°C no se presenta actividad de las enzimas del sistema de reparación. Por tanto, el resultado se explica únicamente por el daño genotóxico del EO y éste, se aproxima a los reportes de la literatura sobre genotoxicidad producida por plaguicidas y pesticidas (11, 13, 15-17, 23). El efecto genotóxico sobre el ADN, genera errores en el proceso de su división celular (mitosis), lo que puede originar, replicación celular desordenada o mutaciones y el riesgo de generar algún tipo de cáncer (24). Desde esta perspectiva, el (los) agente (s) genotóxico (s) presente (s) en las fuentes hídricas y en el medioambiente de la vereda Monterredondo, reacciona (n) químicamente con el ADN. Esta interacción tiene la posibilidad de ocasionar mutación de los códigos de la secuencia del ADN; pudiendo dañar su replicación mediante un enlace irreversible (covalente), alterando así, la unión de la(s) enzima(s) al material genético, involucradas en dicha replicación que origina efectos negativos sobre la salud, lo que puede ocurrir por una fotodegradación de los compuestos orgánicos presentes en el agua (23).

El análisis estadístico de los resultados de esta investigación da lugar a que todos los entes gubernamentales ambientales, la Universidad de Antioquia y la comunidad de la vereda sean conscientes sobre el riesgo potencial de la actitud y práctica del uso indiscriminado y sin control de estos xenobióticos y adopten medidas de contención del mismo. Considerando que es una problemática reconocida en la literatura; la cual reporta: 1) contaminación del medio ambiente por xenobióticos y de sus efectos negativos en la salud de los seres vivos. 2) alteración de los ecosistemas. 3) aumento de resistencia de las plagas a los plaguicidas. 4) intoxicaciones y muertes producidas por el uso y contacto de los seres vivos con el agua contaminada. 5) teratogénesis y mutagénesis en diversos seres vivos (24-27). Asimismo, se necesita establecer medidas de mejoramiento de la gestión ambiental en esta región, una responsabilidad social de todos los involucrados; pero le concierne principalmente a las autoridades educativas y públicas competentes valorar y analizar el impacto riesgo/beneficio del uso de los plaguicidas y sus consecuencias, teniendo en cuenta todas las precauciones posibles para proteger el medio ambiente y la salud de la población, puntualizando decisiones sobre políticas públicas o ideológicas con un conocimiento científico más profundo y con mayor mesura para contribuir al mejoramiento de la calidad de vida de la región y del país. Esta situación requiere que se hagan los correctivos pertinentes para su impedimento en beneficio de la comunidad y el medio ambiente. En conclusión, la comparación del efecto genotóxico de las muestra de agua de las tres fuentes hídricas en la concentración de 200 mg/mL del EO a 4 y 37°C, permiten deducir que la muestra de agua de la quebrada el Hato (no tratada), presentó el mayor grado de genotoxicidad y el menor la muestra de agua de la quebrada Fray Juana (no tratada). La muestra de agua de la planta de tratamiento de la Hacienda la Montaña presentó una alta genotoxicidad relativa comparada con el grado de genotoxicidad de la muestra de

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agua de la quebrada Fray Juana. El mayor grado de genotoxicidad de la quebrada el Hato se correlaciona con lo observado, ya que recoge aguas servidas contaminadas con residuos avícola, porcícola, vacuno y de la agricultura. Se evidencia actitudes y prácticas en la vereda y en la Hacienda la Montaña, tales como la utilización inadecuadas de plaguicidas en las actividades agropecuarias y su vertimiento a las fuentes de agua de la vereda Monterredondo que repercute en su calidad, contribuyendo a incrementar la contaminación ambiental de la zona. También se reveló una exposición permanente de la comunidad a un riesgo para la salud por el uso inadecuado de plaguicidas. Esta investigación es un punto de partida para hacer otros estudios más profundos en torno a este aspecto de primordial interés global para conocer el impacto y la magnitud de los efectos de los elementos tóxicos presentes en el agua en los organismos vivos, que luego se convierten en alimento humano para la salud y el desarrollo del ámbito regional y nacional. Esta investigación sugiere una gestión preventiva que abarque aspectos integrales, que van desde los recursos hídricos disponibles en la vereda hasta las actitudes y las prácticas de los pobladores. Por tanto se sugiere que la Universidad de Antioquia en forma intersectorial, en cumplimiento

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de su responsabilidad social y ambiental debe: 1) a corto plazo, efectuar labores de capacitación a trabajadores y empleados de la hacienda con respecto al manejo adecuado de las aguas servidas y los residuos sólidos. 2) a mediano y largo plazo, estructurar una política ambiental, coordinada y articulada con las autoridades administrativas locales y la autoridad ambiental regional (Corantioquia) para realizar evaluación, control y seguimiento de la problemática del recurso hídrico que genera problemas al medio ambiente y afecta la salud pública en la vereda Monterredondo. Asimismo, se debe evaluar la efectividad y la calidad del proceso de tratamiento del agua de la planta de la Hacienda La Montaña y hacer los correctivos necesarios con el propósito de garantizar la potabilidad del agua de uso y consumo en las actividades productivas y domesticas de la misma. Se sugiere también efectuar nuevas pruebas de genotoxicidad en células humanas y en las personas de la vereda para ayudar a mejorar su calidad de vida. Agradecimientos A Vicerrectoría de Extensión, Banco Proyectos –BUPPE-, por su financiación, a Lissette Marcela Jaramillo Díaz y Mary Luz Flórez Castaño, estudiantes en desarrollo de formación investigativa y a Wilmar Soler T., el apoyo ofrecido con su grupo de investigación de Agua de Mar.

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Tobón - Genotoxicidad del agua contaminada por plaguicidas

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Rev.MVZ CórdobaREVISTA 16(2):2616-2627, 2011. • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 2616 MVZ CÓRDOBA

ORIGINAL

Medición de la eficiencia técnica relativa de las fincas asociadas a Coounión en Guasca Cundinamarca Measurement of the relative technical efficiency of the farms associated to Coounion in Guasca Cundinamarca Wilson Oviedo G,1 M.Sc, Gloria Rodríguez L,2* Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, Maestría en Administración, Ciudad Universitaria de Bogotá, Colombia. 2Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Económicas, Ciudad Universitaria de Bogotá, Colombia. *Correspondencia: girodriguezl@unal.edu.co. 1

Recibido: Mayo de 2010; Aceptado: Febrero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Medir la eficiencia técnica relativa en las fincas asociadas a la cooperativa COOUNIÓN mediante Data Envelopment Analysis DEA (Análisis Envolvente de Datos). Materiales y métodos. Se tomaron como muestra las doce fincas asociadas a la Cooperativa Coounión en el municipio de Guasca (Cundinamarca). La información se obtuvo durante el período comprendido entre el 1º de junio del 2008 y el 31 de mayo del 2009. Los datos se estructuraron en seis variables, de las cuales se plantean dos modelos, ambos con cuatro variables y que están orientados a las entradas con rendimientos constantes a escala (CRS). El primer modelo consta de tres entradas: nutrición, mantenimiento, ordeño, y una salida: leche; mientras que el segundo modelo cuenta con dos entradas: nutrición, mantenimiento y dos salidas: carne, crías. Resultados. De las doce fincas solo una presentó, la mejor eficiencia tanto en el modelo 1 como en el modelo 2. Por esta razón, se determinaron las mejores prácticas de esta finca con el fin de replicarlas en las demás. Conclusiones. Aplicar la metodología DEA en las fincas ganaderas es viable porque permite enfocarse principalmente en aquellas variables que son controlables por el ganadero como los insumos. Por consiguiente, la evaluación de la eficiencia técnica relativa se desarrolló orientada a estos; así se demostró que las fincas pueden mantener sus niveles de producción actuales haciendo reducciones significativas en sus costos. Palabras clave: Bovinos, carne de res, mejoramiento animal, nutrición animal, ordeño. (Fuente: AIMS).

2616

Oviedo - Medición de la eficiencia técnica relativa

2617

ABSTRACT Objective. To determine the relative technical efficiency using the data envelopment analysis DEA of farms associated to the Coounion. Materials and methods. A total of 12 farms associated to the Coounion Cooperative, municipality of Guasca (Cundinamarca) were studied. Data were obtained during a period of one year (June/01/2008 to May/31/ 2009) and structured in six variables, of which two models both appear with four variables that are oriented to the inputs with constant scale returns (CRS). The First Model consists of three entries: Nutrition, Maintenance, Milking, and one output: Milk. the Second Model has two entrances: Nutrition, Maintenance, and two outputs: Meat and Mreeding. Results. From the twelve farms studied only one presented the best efficiency, for both models (Model 1 and 2). Therefore, the best practices of this farm were considered to be applied on the others farms Conclusions. To apply the methodology DEA in cattle farms is viable because it allows to focus mainly in those variables that are controllable by the rancher like the consumables. Therefore, the evaluation of the relative technical efficiency was developed oriented to the consumables. It was demonstrated that the farms can maintain their present levels of production making significant reductions in their costs. Key words: Animal breeding, animal nutrition, beef, bovine, milking. (Source: AIMS).

INTRODUCCIÓN El ganado bovino desciende de especies salvajes que existieron en Europa y Asia en tiempos muy remotos. Con el tiempo, el hombre después de un periodo largo de domesticación, logró su dominio vinculándolo a su economía dada la variedad de productos que de éste podía obtener (1). Asimismo, la ganadería en Colombia es una actividad productiva desde los tiempos de la conquista a mediados del siglo XVI, cuando los españoles introdujeron las primeras cabezas de ganado al país. De hecho, ellos traían sus ganados, tomaban y elegían las mejores tierras para poner sus granjerías y aprovechaban las labores de las mujeres indígenas para la crianza de estos animales (2). Precisamente, la ganadería en los años de la conquista existía en el norte del continente americano y en el área de influencia del Imperio Inca con especies como el bisonte de Norteamérica y los camélidos medianos respectivamente. No obstante, el ganado bovino entró a Colombia por la Costa Atlántica provenientes de las islas del Caribe, entre estas la isla Española y la isla Margarita. Desde luego, el ganado existente en estas islas fue puesto allí por Cristóbal Colón y sus acompañantes (3).

Entonces la historia del ganado bovino en el Nuevo Mundo es reciente, porque no existía en el momento del descubrimiento por los primeros colonos españoles. De ahí que, los españoles introdujeron al país las razas: Andaluza, Pirenaica, Tundaca, Gallega, Berrenda Andaluza, Cacereña y Murciana. Por este motivo, las poblaciones bovinas en Colombia se constituyeron progresivamente a partir de estas importaciones diversas según la historia propia de cada región. Es así, como se desarrollaron y formaron las razas criollas en el país; a partir de la evolución de las razas traídas por los conquistadores (4). Sin embargo, la ganadería adquiere importancia económica desde la primera mitad del siglo XX. A partir de esa época, en Colombia se importaron razas europeas como: Holstein, Normando, Pardo Suizo, Ayrshire, Jersey, Limousin y Simmental; además de la raza Cebú originaria de TexasEstados Unidos, que se empleó a mediados del siglo pasado para cruzarla con razas europeas; y hacerlas más resistentes al clima tropical (3). Pero, esta actividad productiva ha sido muy golpeada por el conflicto armado. Por tanto, las condiciones de inseguridad extrema

2618

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en las áreas rurales, dan lugar a procesos significativos de expulsión de población campesina de sus parcelas, convirtiéndolos en grupos itinerantes de desplazados (5). Igualmente, el calentamiento global es un flagelo que no solo afecta a la ganadería sino a la economía en general. Ya que, este es el fenómeno natural que por degradación del medio ambiente ha llevado a lluvias extremas y oleadas de calor sin precedentes (6). Esto significa, que hay lugares en la tierra que se van a calentar, mientras que otros se van a enfriar (7). Indistintamente, la ganadería se afecta por el cambio climático porque se eleva la temperatura global; calentando los océanos, dando lugar a evaporación de los mares que genera nubes que sustraen la humedad al suelo haciéndolos desérticos e improductivos para el alimento de estos animales. Por ende, los lugares que fueron escogidos para la explotación de ganado bovino por su raza, están cambiando y haciéndose cada vez menos aptos para la cría de este ganado (6). En síntesis, estos cambios atmosféricos conllevan a la escasez de forrajes, agua y suplementos alimenticios. En consecuencia, “cuando la alimentación es deficiente en cantidad y calidad, el estado de salud del ganado se ve perjudicado. Surgen entonces alteraciones de todo tipo, tales como: disminución de la eficiencia productiva, retardo del crecimiento corporal, baja producción de leche, falta de vivacidad, pelo sin brillo y erizado, pérdida de peso, baja en las defensas orgánicas favoreciendo la aparición de enfermedades infecciosas” (8). Por las anteriores razones, es necesario hacer más eficientes los procesos productivos en las fincas ganaderas. Porque la ganadería aporta al crecimiento económico del país; entonces, es viable aprovechar los avances científicos en las ciencias administrativas y económicas a favor de la industria bovina. Teniendo en cuenta que Data Envelopment Analysis DEA (Análisis Envolvente de Datos) es la técnica de programación lineal que examina las relaciones entre los

inputs (entradas) y los outputs (salidas) utilizados en un proceso de producción para determinar los niveles de eficiencia (9), se ha determinado utilizarla en esta investigación para analizar la eficiencia técnica relativa de las fincas ganaderas en estudio. Modelo: Data Envelopment Analysis (DEA). DEA es una técnica que facilita la medición y comparación de la eficiencia de unidades como empresas agropecuarias, universidades, escuelas, hospitales entre otras, donde haya un conjunto relativamente homogéneo de unidades. Dentro del vocabulario del DEA, estas unidades organizacionales se denominan Decision Making Units ( DMU) (10). La medición de la eficiencia es importante para las empresas que quieren mejorar la productividad por medio de la racionalización de los recursos. Por consiguiente, las organizaciones investigan como hacer un uso adecuado de las entradas buscando encontrar el ahorro posible en la utilización de estas (11). Posteriormente se desarrolla el modelo de Charnes, Cooper and Rhodes (CCR) que es conocido como el modelo de rendimientos constantes a escala (CRS); y el modelo de Banker, Cooper and Rhodes (BCC) que incluye rendimientos variables a escala (VRS) (12). Los dos modelos de eficiencia se construyen por proyección radial. Concretamente, en el modelo orientado a los insumos, estos son proporcionalmente disminuidos, mientras que los productos permanecen fijos. Para el modelo orientado a las salidas, estas son proporcionalmente aumentadas, mientras que los insumos se mantienen constantes (12). La escogencia de la orientación del problema dependerá de la naturaleza de los objetivos que se planteen. Generalmente, los usos de DEA en investigaciones de ganadería han empleado el enfoque orientado a los insumos. Este enfoque permite el diagnóstico sobre la subutilización de los recursos con la tecnología y los recursos existentes. Esto no significa que no se hayan realizado investigaciones en las que la referencia de comparación son fincas con nuevas técnicas productivas (13).

Oviedo - Medición de la eficiencia técnica relativa

De hecho, el modelo DEA es una alternativa para medir la eficiencia técnica, que refleja la habilidad de una DMU para obtener el máximo nivel de producción con unos recursos dados. Esta eficiencia técnica es calculada para varias DMU que emplean los mismos insumos para producir los mismos productos. Por lo tanto, DEA toma los resultados de estas eficiencias técnicas y construye una frontera eficiente que es el conjunto de soluciones que dominan estratégicamente a las demás soluciones posibles, con el fin de determinar por medio de comparaciones la eficiencia relativa de cada DMU (14). Más aún, DEA es un programa lineal que deduce la función de frontera de producción de un conjunto de DMU, identificando la eficiencia técnica relativa de cada una de estas DMU, discriminando las eficientes de las ineficientes. Las DMU ubicadas sobre la frontera tienen una puntuación de 1, y la ineficiencia de las demás es hallada sobre la base de la distancia Euclidiana de sus proporciones de entrada y salida de la frontera de producción (15). Resumiendo, DEA es un modelo de optimización no paramétrico que evalúa el desempeño de las DMU. En su forma operativa básica, DEA es una metodología utilizada para medir la eficiencia comparativa de DMU que tienen un mismo fin en el mercado. Partiendo de insumos y productos, DEA provee un ordenamiento de estas DMU otorgándoles un puntaje de eficiencia relativa. De esta forma, las que obtengan el mayor nivel de producto con la menor cantidad de insumos, serán las más eficientes del grupo y, por ende, obtendrán los puntajes más altos (16). Las Variables de holgura. En DEA las variables de holgura tienen una relación directa con la solución del problema. Por este motivo, si la solución óptima del problema dado por el modelo resulta ser de eficiencia 1, significa que la finca evaluada es eficiente, en relación con las otras fincas; puesto que no es posible encontrar ninguna finca que obtenga

2619

al menos las salidas de la finca evaluada utilizando menos recursos. Siendo así, la finca es ineficiente cuando su eficiencia es menor de 1; entonces, el valor de holgura resulta al restarle a 1 el valor de la eficiencia relativa de la finca ineficiente (17). En consecuencia, toda finca de eficiencia 1 tiene un valor de holgura igual a cero. Es decir, toda finca que tenga un valor de holgura significa que tiene ineficiencias a escala. Entonces, entre mayor sea el valor de la holgura, menor será la eficiencia de la finca evaluada. Se analizaron doce fincas asociadas a la Cooperativa Coounión en el municipio de Guasca Cundinamarca. Estas fincas, se dedican a la producción de leche; crías; y venta de ganado en pie. El objetivo del estudio fue medir la eficiencia técnica relativa de estas fincas en la producción de carne, leche y crías, en bovinos; mediante el DEA.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. El estudio de caso se realizó en las doce fincas asociadas a Coounión que se encuentran localizadas en el municipio de Guasca-Cundinamarca, Colombia. Las coordenadas geográficas donde se encuentran ubicadas estas fincas éstan entre 5° 00’ de latitud Norte y 74° 00’ de longitud Oeste, con una altitud de 2.800 metros sobre el nivel del mar. Condiciones geoclimáticas. En el área geográfica donde se realizó el estudio el clima se caracteriza por una precipitación anual acumulada de 1000 mm, temperatura media promedio anual de 14°C, brillo solar anual acumulado de 1410 horas (con un máximo de 1700 horas y un mínimo de 1120 horas) y humedad relativa alrededor de 80% (18). Animales de estudio. Las razas de bovinos sobre los cuales se hicieron las mediciones de consumo, al igual

2620

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que los productos obtenidos de estos fueron: Holstein, Jersey, Pardo Suizo y Simmental. Periodo de evaluación. Del 1 de junio de 2008 hasta el 31 de mayo de 2009. Recolección de la información. La información se recolectó por medio de una encuesta. Se indagó los costos por finca con relación a la nutrición en lo que concierne al cuidado de los forrajes y los suplementos alimenticios como sales, concentrados, silos, henos, y agua. En cuanto a los costos de mantenimiento, se investigó sobre la sanidad entendida esta como la vacunación, la desparasitación, medicamentos, servicios veterinarios, reproducción; como también en estos costos se consideró el levante y el mantenimiento de las vacas secas. Por último, se consideraron los costos de ordeño. Toda esta información fue recogida directamente en cada finca. La información de producción de carne, leche y crías; fueron suministradas por la Cooperativa. Mediciones. De acuerdo con los insumos analizados y los productos obtenidos de cada finca, se determinaron seis variables; entre las que se tienen como variables de entrada (insumos): nutrición, mantenimiento y ordeño. De igual manera, se determinaron las variables de salidas (productos): carne, leche y crías. Estas variables fueron consideradas partiendo de las investigaciones sobre metodologías de costos de pequeñas fincas ganaderas de la sabana de Bogotá realizadas por la corporación de estudios ganaderos y agrícolas (19). Por esta razón, no se consideraron variables como la de investigación y desarrollo y la variable de tecnología; que son más comunes en medianas y grandes explotaciones ganaderas, debido a que estas explotaciones ganaderas en su mayoría no son proveedores de leche a pasteurizadoras; sino que llevan a cabo un proceso productivo de mayor complejidad.

Las variables de entradas y salidas se cuantificaron en pesos colombianos invertidos y percibidos respectivamente, generados mes a mes. Los valores agregados por variable se dividieron por el número de vacas de ordeño del respectivo mes. Aquí es importante anotar que el peso de las salidas en orden descendente tienen las siguientes ponderaciones en la cooperativa: leche 90.19%, carne 8.92% y crías 0.89%. Diseño experimental y software empleado. Con las anteriores variables, se plantearon dos modelos: el modelo 1, que combinó entradas como nutrición, mantenimiento y ordeño con la producción de leche; y el modelo 2 combinó las entradas de nutrición y mantenimiento con la producción de carne y crías. Por lo tanto, el modelo 1 mide la eficiencia en la producción de leche y el modelo 2 calcula la eficiencia en cuanto a la producción de carne y crías. El software empleado para correr los dos modelos fue el DEA FRONTIER, desarrollado por el profesor Joe Zhu; quien ha publicado y coeditado varios libros enfocados a la evaluación de desempeño de DMU e identificación de mejores prácticas usando el DEA. Por lo tanto, él es un experto en métodos de medición de desempeño y sus investigaciones propenden por las áreas de operaciones y productividad, evaluación de desempeño de DMU y mejores prácticas de éstas DMU. En efecto, el profesor Zhu se encuentra en el ranking de los 10 autores con más investigaciones en DEA (20). Planteamiento matemático. Como complemento a la metodología se específica en el planteamiento matemático los problemas de programación lineal pertinentes. En consecuencia, se deben minimizar los niveles de las variables de entrada (nutrición, mantenimiento y ordeño), manteniendo el nivel en las variables de salida (leche, carne y crías). Para el modelo 1, de tres entradas (nutrición, mantenimiento y ordeño) y una salida (leche); el planteamiento es,

2621

Oviedo - Medición de la eficiencia técnica relativa

sujeto a;

de entradas y salidas de todas las fincas j. Su restricción vienen dada por la última ecuación que supone que esté restringida a ser mayor o igual a una cantidad mínima ε, con el objeto de evitar que algunas de las entradas o la propia salida o salidas (modelo 2) sean totalmente ignoradas en la determinación de la eficiencia. ε es un valor no Arquímedeo diseñado para hacer cumplir estrictamente la positividad de las variables.

El modelo 2, de dos entradas (nutrición y mantenimiento) y de dos salidas (carne y crías), se plantea, sujeto a: Donde:

RESULTADOS Análisis de eficiencia. Las fincas son más eficientes en el modelo 1 (producción de leche); que el en modelo 2 (producción de carne y crías) (Tabla 1). Tabla 1. Resultados de eficiencia modelos 1 y 2. Modelo 1

Modelo 2

DMU

Eficiencia %

DMU Ref.

Eficiencia %

DMU Ref.

DMU 1

Santa Teresita

0.68

DMU 2

El Recuerdo

2,8,11

0.2

6,11

0.37

DMU 3

Amazonas

0.72

8,10,11

0.49

DMU 4

El Rubí

0.77

2,8,11

0.63

6,11

DMU 5

Casa Teja

0.75

8,10,11

0.36

6,11

y es la variable de salida, que son los productos de cada DMU; estas son:

DMU 6

Los Pinos

0.96

2,8,11

DMU 7

Los Arrayanes

0.53

6,11

DMU 8

El Porvenir

0.79

6,11

y1=leche, y2=carne, y3=crías.

DMU 9

El Desvare

0.71

2,11

0.21

6,11

DMU 10

Buena Vista

0.47

6,11

x es la variable de entrada, que son los insumos empleados por las DMU; estos son:

DMU 11

El Molino

DMU 12

El Dorado

0.67

x1 = nutrición, x2 = mantenimiento, x3 = ordeño.

Al mismo tiempo, para los dos modelos las DMU de eficiencia 1 son referenciadas a las DMU con ineficiencias; para que estas DMU mal evaluadas copien las mejores prácticas de las DMU eficientes, y así mejoren sus niveles relativos de eficiencia (Tabla 1).

k representa una finca de las doce asociadas a COOUNIÓN. θk escalar que multiplica el vector de las entradas (nutrición, mantenimiento y ordeño) de la finca k que se va a evaluar. El valor minimizado de θk teniendo en cuenta las tres primeras restricciones dará como resultado la eficiencia para esta finca. λ es el escalar que multiplica a la matriz

Eficiencia Media %

0.89

0.56

El modelo 1, muestra que el 50% de las fincas evaluadas fueron eficientes en los rendimientos constantes a escala; significa esto, que el 50% restante tienen ineficiencias a escala. En el modelo 2, el 17% de las fincas fueron eficientes; entonces, el

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83% restante tienen ineficiencias a escala (Tabla 1). La distribución de los resultados de eficiencia de los modelos 1 y 2 muestra que las eficiencias del modelo 1 se encuentran entre el rango del 61% y el 100%. Sin embargo, las eficiencias del modelo 2 están en el rango del 11% al 100%. De hecho, el 100% de las fincas en el modelo 1, tienen su eficiencia por encima del 67%. Situación que no se puede observar en el modelo 2, donde el 50% de las fincas tienen su eficiencia por debajo del 50% (Figura 1).

Figura 1. Distribución de los resultados de eficiencia en modelos 1 y 2.

Mejores prácticas en las DMU con eficiencia 1. Las fincas con eficiencia 1 en el modelo 1 son: EL Recuerdo, Los Arrayanes, El Porvenir, Buena Vista, El Molino y El Dorado; que corresponden a las DMU 2, 7,

8, 10, 11 y 12 respectivamente. En este modelo, el promedio de leche producida por vaca de ordeño es la característica común de estas DMU; este promedio está en el rango de 409 a 489 L/Vaca ordeñada al mes. No obstante, las fincas ineficientes que son las DMU 1, 3, 4, 5, 6 y 9; tienen el promedio en el rango de 304 a 384 L/Vaca ordeñada al mes (Tabla 2). En tanto, el modelo 2 tiene las fincas Los Pinos y El Molino con eficiencia 1, que son las DMU 6 y 11 respectivamente. Al observar los ítems de Carne y Crías, la DMU 6 es la mayor generadora de ingresos por venta de carne en pie con $11.000.000 al año, aventajando en un 46% a la que más se le aproxima que es la DMU 4 Finca El Rubí que tiene ventas anuales de Carne por $6.000.000; las demás DMU tienen ventas de Carne al año por debajo de los $3.600.000 (Tabla 2). Por su parte, la DMU 11 Finca El Molino, en Crías cuenta con el valor promedio de ventas de terneros más alto, al registrar $90.000 por ternero de Cría vendido al año; aventajando en un 20% a la DMU 4 que tiene un promedio de $72.000 por ternero de Cría vendido al año; las demás DMU son superadas por la DMU 11 en más del 30% en el valor de ternero de Cría vendido al año (Tabla 2). La DMU 6 Finca Los Pinos tiene 0.96% de eficiencia en el primer modelo y eficiencia

Tabla 2. Producción de carne, leche y crías. Modelo 1

Modelo 2

VACAS

LECHE L/ Vaca

%EFIC

CARNE al Año ($)

CRÍAS ($) Prom. Año

%EFIC

DMU

FINCAS

Santa Teresita

365

0.68

50.000

0.19

El Recuerdo

443

1.600.000

50.000

0.37

Amazonas

356

0.72

3.600.000

40.000

0.49

El Rubí

371

0.77

6.000.000

72.000

0.63

Casa Teja

304

0.75

3.600.000

50.000

0.36

Los Pinos

384

0.96

11.000.000

61.667

Los Arrayanes

449

3.600.000

52.000

0.53

El Porvenir

429

2.800.000

65.714

0.79

El Desvare

368

0.71

1.000.000

45.000

0.20

Buena Vista

409

2.700.000

48.000

0.47

El Molino

455

2.400.000

90.000

El Dorado

489

2.800.000

50.000

0.67

2623

Oviedo - Medición de la eficiencia técnica relativa

1 en segundo modelo; ocupando el primer puesto en producción de carne y el cuarto en producción de crías (Tabla 2). Análisis de la ineficiencia de holgura. En el modelo 1, las DMU 2, 7, 8, 10, 11 y 12 tienen valores de holgura igual a cero porque sus eficiencias son iguales a 1. Sucede lo mismo en el modelo 2 pero solo con las DMU 6 y 11 (Tabla 3). Ahora bien, la más ineficiente en ambos modelos es la Finca Santa Teresita DMU 1, ésta presenta los valores de holgura más altos 32.08% y 80.26% respectivamente. Esto significa que tiene niveles de utilización de recursos por encima de los considerados como eficientes. En otras palabras, las variables de holgura en las entradas significan que las entradas deben ser reducidas en este valor de holgura para obtener la misma cantidad de salidas; y solo así podría llegar a un nivel de eficiencia igual a 1 (Tabla 3). Nivel objetivo de entradas y fortalecimiento de las ineficiencias. Una vez determinada la eficiencia técnica relativa de cada finca, se consideran las ineficiencias de holgura con el fin de calcular sus niveles de entradas óptimos para lograr el nivel de eficiencia 1. Este cálculo se realiza tomando el valor inicial de las entradas y restarle el porcentaje del valor de holgura para obtener niveles óptimos de entradas para las DMU ineficientes.

Tabla 3. Valores de las holguras para los modelos 1 y 2. Modelo 1

Modelo 2

DMU

FINCAS

V. HOLGURA

%EFIC

V. HOLGURA

%EFIC

Santa Teresita

32.08%

67.92%

80.26%

19.74%

El Recuerdo

100%

63.26%

36.74%

Amazonas

28.22%

71.78%

51.01%

48.99%

El Rubí

22.52%

77.48%

37.09%

62.91%

Casa Teja

25.2%

74.8%

63.66%

36.34%

Los Pinos

4.37%

95.63%

100%

Los Arrayanes

100%

47.06%

52.94%

El Porvenir

100%

21.46%

78.54%

El Desvare

55.88%

70.72%

79.81%

20.19%

Buena Vista

100%

52.83%

47.17%

El Molino

100%

El Dorado

100%

32.91%

67.09%

Por ejemplo, en el modelo 1 la DMU 1 es la más ineficiente (Finca Santa Teresita), presentó un valor de holgura del 32.08% (Tabla 3); esta finca, tiene valores iniciales de entrada para nutrición, mantenimiento y ordeño de $93.466; $12.558 y $53.600 correspondientemente (Tabla 4). En efecto, el reporte de nivel objetivo de entradas arroja los valores: $63.477, $8.529 y $36.402 para nutrición, mantenimiento y ordeño respectivamente (Tabla 5); que es precisamente, tomar los valores iniciales y restarles el porcentaje arrojado por el valor de holgura de esta finca. De esta manera, la Finca Santa Teresita cumpliendo con los niveles óptimos arrojados

Tabla 4. Valores iniciales en pesos modelos 1 y 2 en términos de miles de pesos ($) Entradas Modelo 1

Entradas Modelo 2

DMU

FINCAS

Nutrición

Mantenim

Ordeño

Nutrición

Mantenim

Santa Teresita

93.466

12.558

53.600

93.466

12.558

El Recuerdo

122.455

7.766

46.366

122.455

7.766

Amazonas

66.010

11.739

54.041

66.010

11.739

El Rubí

69.437

13.069

41.138

69.437

13.069

Casa Teja

52.479

10.432

40.770

52.479

10.432

Los Pinos

65.875

9.020

42.611

65.875

9.020

Los Arrayanes

49.858

11.433

57.691

49.858

11.433

El Porvenir

55.833

8.083

56.916

55.833

8.083

El Desvare

124.250

15.250

38.687

124.250

15.250

Buena Vista

51.138

10.861

40.500

51.138

10.861

El Molino

64.333

13.760

33.104

64.333

13.760

El Dorado

49.986

16.583

47.569

49.986

16.583

2624

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Tabla 5. Niveles óptimos de entradas modelos 1 y 2 Niveles Óptimos de Entradas Modelo 1 ($)

Niveles Óptimos de Entradas Modelo 2 ($)

DMU

FINCAS

Nutrición

Mantenim.

Ordeño

Nutrición

Mantenim.

Santa Teresita

63.477

8.529

36.402

12.129

2.479

El Recuerdo

122.455

7.766

46.366

13.340

2.853

Amazonas

47.382

8.426

38.791

32.339

4.428

El Rubí

53.799

10.126

31.874

43.686

7.791

Casa Teja

39.254

7.803

30.496

19.070

3.288

Los Pinos

62.999

8.626

40.751

65.875

9.020

Los Arrayanes

49.858

11.433

57.691

26.394

3.736

El Porvenir

55.833

8.083

56.916

31.233

6.348

El Desvare

54.820

10.785

27.359

19.638

3.079

Buena Vista

51.138

10.861

40.500

24.119

3.900

El Molino

64.333

13.760

33.104

64.333

13.760

El Dorado

49.986

16.583

47.569

33.536

4.592

por el reporte de niveles de entradas óptimos (Tabla 4), llegaría a tener una eficiencia igual a 1. De igual manera, se debe hacer el análisis anterior para las demás DMU ineficientes de los modelos 1 y 2; para que puedan llegar a su máximo nivel de eficiencia (Eficiencia=1). Casos de éxito. Son aquellas fincas que fueron totalmente eficientes (Eficiencia=1), en los dos modelos. Es decir, no solo fueron eficientes en la producción de leche, sino que también lo fueron en la producción de carne y crías. Por lo tanto, de acuerdo a los resultados arrojados por DEA solo hubo una coincidencia en los dos modelos, la DMU 11 que corresponde a la Finca El Molino. Entonces, la DMU 11 sería el único caso de éxito de la evaluación de la eficiencia técnica relativa de las fincas asociadas a la Cooperativa Coounión (Tabla 1). Esta DMU cuenta con las mejores prácticas en producción de leche, carne y crías. Por esta razón, se utilizará como referencia para medir la eficiencia técnica relativa de las demás DMU; y al mismo tiempo, se aplicarán estas buenas prácticas a las DMU ineficientes para mejorar sus niveles desempeños.

DISCUSIÓN La medición de la eficiencia de las fincas asociadas a COOUNIÓN ha permitido

identificar los niveles promedios de eficiencia para cada modelo; y con esto, identificar las buenas prácticas que permitan mejorar el nivel de eficiencia actual de las fincas que aún no son totalmente eficientes. Esto es importante para las fincas de la sabana de Bogotá, en donde los cambios climáticos han quemado los pastos, haciendo que la nutrición para el ganado sea cada vez más costosa y como consecuencia el ganadero deba ser más eficiente haciendo combinaciones óptimas de alimentos para sus animales (Tabla 1). El valor promedio de la eficiencia para el modelo 1 es del 88%, significa que las fincas podrían producir la misma cantidad de producto con el 88% de las entradas que actualmente utiliza; es decir, están sacrificando un margen de ahorro del 12%. En el modelo 2, las cifras son menos alentadoras porque la producción actual la podrían hacer utilizando solo el 56% de las entradas actuales y estarían ahorrando un margen del 44% (Tabla 1). De hecho, lo anterior es la consecuencia de la especialización en la producción de leche del 80% de las fincas, actividad a la que dirigen todos sus recursos y esfuerzos. En cambio, la producción de carne y crías lo trabajan alternamente para generar ingresos adicionales no muy representativos. Según los propietarios la variable que más pesa es la nutrición con el 70% de los costos, que está orientada a aumentar la producción de leche. Razón

Oviedo - Medición de la eficiencia técnica relativa

por la cual, son más eficientes en su producción, que en la producción de carne y crías.

2625

Es definitivo que la mejor práctica es el mejoramiento genético. Esto se observa en la Finca El Molino (DMU 11) con eficiencia total en ambos modelos, porque hace mejoramiento genético orientado a razas lecheras europeas como Holstein, Jersey y Pardo Suizo. Es así, que cuenta con tan solo 4 vacas y tiene un promedio de 455 litros de leche por vaca al mes. Por ende, sus crías son demandadas para destinarlas a la producción de leche en Guasca-Cundinamarca (Tabla 2).

Por ende, se recomienda DEA para futuros estudios de evaluación de eficiencia en fincas ganaderas. Porque permite medir la eficiencia técnica relativa concentrándose bien sea en los insumos o en los productos según convenga para el caso. Generalmente, estos estudios se enfocan en los insumos porque son más controlables. De ahí que, las variables de salida están mediadas por factores que no son controlables por los ganaderos; tales como: el clima, las políticas del Gobierno, las enfermedades en los bovinos y hasta el mismo conflicto armado que ha sido el principal flagelo de la industria ganadera en Colombia.

Asimismo, la DMU 6 sobresalió por ser la mayor generadora de ingresos por venta de ganado en pie (carne) (Tabla 2), también debe su éxito al mejoramiento genético orientado al ganado de doble propósito (leche y carne) ganado Simmental, que años atrás ha venido implementando en su hato ganadero. Por eso, el mejoramiento genético en ganado doble propósito es una buena práctica que posiciona esta finca entre las mejores del estudio de caso.

Finalmente, como limitaciones del DEA se tiene en primera instancia que la comparación de los resultados de dos estudios aplicados a grupos de muestras diferentes no es significativo; puesto que se desconocen las diferencias existentes entre las prácticas empleadas por las DMU de cada una de las muestras. Y en segunda instancia, se tiene también que los resultados son altamente sensibles a la presencia de errores de medición en las entradas y salidas (21).

Por consiguiente, se observa en el modelo 1 y 2 que los niveles óptimos de entradas arrojados para cada DMU por DEA, se deben lograr para que aquellas fincas con ineficiencias a escala puedan alcanzar un nivel de eficiencia 1 (Tabla 5). Estos niveles óptimos de entradas para las DMU con eficiencia 1, son los mismos valores de entradas iniciales; esto se debe, a que sus valores de holgura son iguales a cero (Tabla 4). Por este motivo, las reducciones en las entradas se dan para las DMU ineficientes, las cuales deben hacer disminuciones en los recursos para llegar a los niveles óptimos de insumos conservando el mismo nivel de producción, y así lograr el nivel de eficiencia 1.

En conclusión, la evaluación de la eficiencia técnica relativa realizada a las doce fincas, se hizo orientado a las entradas lo que permitió demostrar que las fincas podrían mantener sus niveles de producción o salidas haciendo una reducción en sus entradas o insumos.

Agradecimientos A la Cooperativa Coounión y en especial a su gerente Nilson Morales quien dispuso de todo su tiempo y su conocimiento, para brindar la información necesaria para realizar esta investigación.

2626

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

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Oviedo - Medición de la eficiencia técnica relativa

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2627

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Rev.MVZ CórdobaREVISTA 16(2):2628-2633, 2011. • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011 2628 MVZ CÓRDOBA

COMUNICACIÓN BREVE

Efectividad de una mezcla de cipermetrina y clorpirifós para el control de la mosca Haematobia irritans Mixture of cipermetrina and clorpirifós to control Haematobia irritans fly Gustavo López V,1* M.Sc, Cristiano Grisi do N,2 M.Sc, Diego González C,3 MV. Instituto Colombiano de Medicina Tropical CES. Medellín, Colombia 2Ouro Fino Animal Health Gerente de Marketing/Marketing Manager, Brasil. 3Laboratorios Ourofino, Bogotá. *Correspondencia: gulova@ une.net.co 1

Recibido: Junio de 2010; Aceptado: Febrero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Determinar la eficacia de una mezcla de Cipermetrina y Clorpirifós contra la mosca de los cuernos Haematobia irritans. Materiales y métodos. Se utilizaron 24 novillas Holstein con infestación natural de moscas Haematobia irritans y se asignaron aleatoriamente a dos grupos, tratado y control, de 12 animales cada uno. El grupo tratado recibió el producto por aspersión en dilución 1:800, utilizando 1 litro por cada 100 kilos de peso. Se hicieron conteos de moscas antes del tratamiento y en los días 7, 14 y 21 postaplicación para evaluar la eficacia del producto. Resultados. Los porcentajes de eficacia del producto fueron de 89.9, 97.4 y 99.5%, para los días 7, 14 y 21 post-tratamiento, respectivamente. Conclusiones. La mezcla de Cipermetrina y Clorpirifós resultó altamente eficaz contra la mosca de los cuernos Haematobia irritans y surge como una nueva alternativa para el control del parásito, especialmente donde se presente resistencia a las diferentes moléculas que contienen los productos comerciales. Palabras clave: Bovinos, ectoparasitosis, Holstein, moscas, (Fuente: CAB)

2628

tratamientos químicos.

López - Efectividad de una mezcla de cipermetrina y clorpirifós

2629

ABSTRACT Objective. To determine the effect of a mixture of Cypermethrin and Chlorpiriphos on the control of the Haematobia irritans fly (horn fly). Materials and methods. A total of 24 Holstein heifers, naturally infested with Haematobia irritans flies, were randomly allocated into two Groups (n=12): 1) Group Control and 2) Group Treated. The control group was not sprayed with any product and the treated group was sprayed with the product diluted (1:800), using 1 liter per 100 kilos of body weight. to evaluate the effect of the product. Flies were counts in each animal before treatment (day 0) and on days 7, 14 and 21 post application of the product. Total number of flies (%) were compared between groups and between days. Results. Efficacy of the product were 89.9, 97.4 and 99.5%, for days 7, 14 and 21 post-treatment, respectively. Conclusions. The mixture of Cypermethrin and Chlorpiriphos was highly effective against the horn fly and stands up as a new alternative for the control of the parasite, especially where resistance to different molecules of commercial products have occurred. Key words: Bovines, chemical treatment, ectoparasitoses, flies, Holstein. (Source: CAB) .

INTRODUCCIÓN En Colombia las pérdidas económicas ocasionadas por los ectoparásitos del ganado, moscas y garrapatas fueron estimadas a principios de esta década en más de $ 76.000 millones anuales (1); sin embargo, en la actualidad la información sobre pérdidas económicas relacionadas con garrapatas y moscas es muy escasa y se requieren estudios que determinen las pérdidas para cada parásito y por regiones, por cuanto los estudios clásicos relacionados con aspectos económicos de garrapatas y moscas fueron realizados en climas templados y las poblaciones y costos de tratamientos han aumentado considerablemente (2). En Colombia las moscas de mayor importancia veterinaria son conocidas como moscas picadoras o hematófagas y están representadas por dos especies: la mosca de los cuernos, Haematobia irritans (L., Díptera: Muscidae) y las mosca de los establos, Stomoxys calcitrans (L., Díptera: Muscidae) (1). Haematobia irritans es una mosca hematófaga, parásito obligado que ocasiona cuantiosas pérdidas en la ganadería. Se ha calculado que por esta mosca se puede perder hasta un 14% del peso de novillos en pastoreo (3,4). La moca de los cuernos Haematobia irritans (L) afecta casi exclusivamente al ganado bovino y llegó a América procedente de

Europa entre 1884 y 1886. En la actualidad presenta una amplia distribución en el continente americano (5). Este ectoparásito además de ser vector de hemoparásitos altera el bienestar de los animales en la mayoría de pisos térmicos, situación que exige la aplicación permanente de productos químicos como estrategia principal de control, constituyéndose en costos exagerados para la canasta ganadera (1). Haematobia irritans es una mosca pequeña con sus piezas bucales adaptadas para succionar sangre preferencialmente de bovinos, debido a sus requerimientos reproductivos y a la dependencia exclusiva de materia fecal bovina fresca para reproducirse, aunque en opinión de algunos autores (6), también puede alimentarse en otras especies animales como equinos, ovinos, caninos y hasta en humanos. H. irritans se localiza de preferencia alrededor de los cuernos o en la parte dorsal y en épocas cálidas de brillo solar intenso o en épocas lluviosas su localización preferencial es la porción inferior del vientre (7). El control de la mosca H. irritans en Colombia ha estado dirigido a la aplicación de productos fosforados y piretroides sintéticos mediante l sistemas de aspersión y con aretes u orejeras (8). En una encuesta realizada en Argentina

2630

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

en 806 predios de 11 provincias reportaron que el 94% de ellas utilizan mezclas de ivermectinas y organofosforados para el control de Haematobia irritans (9). El control con base en insecticidas está íntimamente ligado al proceso de resistencia, fenómeno que ha sido creciente en muchas áreas de producción ganadera (10). Recientemente se han diagnosticado en diferentes paises poblaciones resistentes a productos organofosforados, carbamatos y piretroides (4,10-12). Estudios realizados en México reportaron porcentajes de efectividad del 86 y 94% al utilizar Diazinón e Ivermectina inyectable respectivamente (13) aunque otros estudios reportan resultados muy variables de susceptibilidad de la mosca en pruebas in vitro (14). No se reportan en Colombia estudios sobre resistencia de la mosca de los cuernos Haematobia irritans a compuestos químicos. Los sistemas utilizados hasta la fecha, basados en compuestos químicos, si bien ayudan a disminuir las altas infestaciones, no son sostenibles a mediano y largo plazo por la resistencia que se ha desarrollado a la mayoría de ellos, situación que requiere determinar la efectividad de otros compuestos que hagan más sostenible y económico el control (15). Ante la ineficacia de la mayoría de los compuestos químicos para el control de garrapatas, algunos investigadores mencionan el uso de mezclas de principios activos para buscar sinergismo entre ellos y eliminar las cepas resistentes (15). No se conocen estudios en Colombia donde se utilicen mezclas de productos para el control y por esta razón se justificó estudiar la efectividad de la mezcla cipermetrina y clorpirifós en aspersión para el control de Haematobia irritans, la cual ha dado excelente resultado en el control de la garrapata común del ganado Rhipicephalus (Boophilus) microplus (16).

MATERIALES Y MÉTODOS Compuesto químico. Para el estudio se utilizó una mezcla de Cipermetrina, Clorpirifós y Citronela de acuerdo con la

siguiente concentración: Cipermetrina 15% , Clorpiriphos 25% y Citronela 1%. La dilución se hizo en la proporción de 1parte del producto por 800 de agua según recomendación del laboratorio productor (Ourofino Ltda). Animales experimentales. De un lote de 50 novillas Holstein de la hacienda El Puesto localizada en el municipio de la Ceja, departamento de Antioquia, se seleccionaron 24 y se dividieron en dos grupos tratado y control de 12 animales cada uno. Inicialmente se reunieron los animales en un corral de cemento y después de dejarlos en reposo se realizó un recuento de moscas individualmente en todo el animal. Como el grado de infestación por moscas no se ajusta a una distribución normal, se conformaron los grupos aleatoriamente por conveniencia dejando los más parasitados en el grupo que recibiría el tratamiento. Aplicación de los tratamientos. La aplicación del producto al grupo tratado se hizo utilizando una bomba de aspersión manual de palanca con una presión de 40 libras por pulgada cuadrada provista de boquilla de cono hueco y teniendo cuidado de humedecer muy bien todo el cuerpo de los animales, calculando 1 litro de la mezcla por cada 100 kilos de peso corporal. En la aplicación del producto se hizo énfasis de iniciar de atrás hacia delante del animal y de abajo hacia arriba, haciendo énfasis en las orejas, tabla del cuello, papada, axilas, ubre, entrepierna, dorso, vientre y región perineal. Los recuentos de moscas se realizaron los días 0, 7,14 y 21 post tratamiento. El grupo control se dejó sin tratamiento Después de la aplicación el grupo tratado se dejó en un potrero completamente separado y distante del grupo control por una cerca de alambre (cerca eléctrica) con el propósito de impedir que este último grupo estuviera en contacto con el tratado para evitar alteración de los resultados. Determinación del porcentaje de eficacia. El porcentaje de eficacia fue determinado, relacionando el número de moscas , antes y después de la aplicación,

2631

López - Efectividad de una mezcla de cipermetrina y clorpirifós

en el grupo tratado, con el número de moscas antes y después de la aplicación, en el grupo control, para cada una de las evaluaciones post-tratamiento. Para el efecto se aplicó la fórmula descrita por Roulston (17) para este tipo de evaluaciones ectoparasitarias, así: % de Supervivencia = {(a x d)/(b x c)} x 100 donde: a = número de moscas en animales del testigo absoluto, en evaluaciones anteriores a la aplicación b = número de moscas en animales del testigo absoluto, en evaluaciones posteriores a la aplicación c = Número de moscas en animales del grupo tratado en evaluaciones anteriores a la aplicación d = Número de moscas en animales del grupo tratado en evaluaciones posteriores a la aplicación. Eficacia (%) = 100 - % de Supervivencia (17).

no se determinaron las categorías de riesgo en humanos y se rigió de acuerdo a la resolución No. 008430 de 1993 emanada del Ministerio de Salud de la República de Colombia Titulo IV, en su Capitulo I, sobre la Bioseguridad de las Investigación y el manejo de material biológico que pueda contener microorganismos patógenos en los Artículos 63, 65, 66, 67 (literal c) y 69. La investigación debe cumplir con los aspectos éticos que figuran en la resolución 008430 de 1993 emanada del Ministerio de Salud en la cual en el Título II Capítulo 1, se establecen las normas éticas para la investigación en animales (21).

RESULTADOS En las tablas 1 y 2 se observa el total de moscas en el grupo tratado y control antes del tratamiento y a los 7, 14 y 21 días después del tratamiento. Tabla 1. Recuento de moscas Haematobia irritans en los grupos tratado y control.

Aspectos éticos. Los procedimientos realizados para los tratamientos en el ganado bovino se rigió de acuerdo a la Ley 84 de 1989, capítulo VI, artículos 23 (literales a, b, c) y 24 del estatuto nacional de protección de los animales y que regula el uso de animales vivos en experimentos e investigación (18). Asimismo para el cuidado, manejo y mantenimiento de animales se tuvieron en cuenta los protocolos y recomendaciones del IACUC (Institucional Animal Care and Use Committe) de la Universidad de Minnesota, en AVMA (American Veterinary Medical Association)(19), para la eutanasia y las recomendaciones sobre las buenas prácticas en la administración de sustancias y sangría de animales expuestas en el artículo EFPIA(European Federation of Pharmaceutical Industries Associations / ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods) (20). En esta investigación no se trabajó con muestras biológicas humanas por lo tanto

Tabla 2. Total de moscas Haematobia irritans en los grupos tratado y control durante el período experimental. Día experimental

Población grupo control

Población grupo tratado

156

662

120

137

667

Porcentaje de supervivencia para los días 7, 14, 21, al comparar los grupos tratado y control (Figura 1) según la fórmula: (a x d) / (b x c) x 100= Día 7: (156 x 56) / (120 x 662) x 100 = 10.1% Día 14: 156 x 15) /( 137 x 662 ) x 100 = 2.6%

2632

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 16(2), Mayo - Agosto 2011

Día 21: (156 x 14) / (667 x 662)x 100 = 0.5%

Figura 1. Comparación grupos tratado y control.

De acuerdo con los resultados, el porcentaje de efectividad del producto para el día 7 fue del 89.9%; para el día 14 el porcentaje de efectividad fue del 97.4% y para el día 21 fue del 99.5%.

DISCUSIÓN Los resultados demuestran que en las condiciones del trabajo la mezcla de Cipermetrina y Clorpirifós tuvo una efectividad sobre la mosca de los cuernos Haematobia irritans del 89.9 % a los 7 días de aplicado el producto, a los 14 días la efectividad fue del 97.4% y finalmente a los 21 de aplicado el producto la efectividad fue del 99.5%. Los resultados obtenidos al aplicar la mezcla de Cipermetrina y Clorpirifós sobre bovinos

naturalmente infestados con Haemmatobia irrtans permitieron observar una disminución en el grado de infestación en más del 99% a los 7 días de haber aplicado el producto. Resultados similares de efectividad fueron reportados cuando se aplicaron formulaciones de mezclas de organofosforados y piretroides y de Cipermetrina y Clorpirifós respectivamente en cepas de garrapatas resistentes a cada producto individualmente (22,23). Infortunadamente no se tienen reportes de efectividad de la mezcla en el control de la mosca de los cuernos Haematobia irritans. En conclusión, la prueba para determinar la eficacia del Cipermetrina y Clorpirifós sobre la mosca de los cuernos Haematobia irritans en el predio El Puesto, municipio de la Ceja, Antioquia, dio como resultado una efectividad del 99.5% a los 21 días de haber realizado el tratamiento. El porcentaje de efectividad a los 7 y 14 días pos tratamiento fue del 89.9 y 97.4% respectivamente. Este el primer reporte de la utilización de una mezcla de compuestos químicos para el control de la mosca Haematobia irritans. Sin embargo, con los resultados obtenidos, no podría concluirse sobre la presencia de una nueva formulación para el control de la mosca Haematobia irritans en Colombia y sería necesario replicar la investigación en diferentes pisos térmicos y con mayor número de repeticiones antes de generalizar recomendaciones para el control efectivo.

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CASO CLÍNICO

Polidactilia en los cuatro miembros, en una potranca mestiza en Chile Polydactyly in an all four limbs in a halfbred filly in Chile Onésimo Sepúlveda S, MV, Christian Rehhof V, MV, Reinaldo Ortiz R, MV, Lisandro Muñoz A, M.Sc.* Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Veterinarias, Departamento de Ciencias Clínicas, Av. Vicente Méndez 595, Chillán, Chile. *lismunoz@udec.cl Recibido: Diciembre de 2010; Aceptado: Julio de 2011.

RESUMEN La polidactilia es una anomalía congénita de muy baja incidencia en caballos. A una potranca mestiza de 6 semanas de edad con polidactilia en sus cuatro miembros se le realizó un examen clínico y radiológico. Los exámenes mostraron la presencia de un dígito supernumerario en ambos miembros anteriores, correspondiente a la primera y segunda falange del dígito II, con su respectivo hueso metacarpiano. En ambos miembros posteriores, se observó que un segundo dígito se originaba a nivel de la articulación metatarso-falángica; ambos dígitos eran del mismo tamaño y estaban formados por tres falanges, los que articulaban con el metatarsiano III. En ambos miembros posteriores, las primeras falanges estaban parcialmente fusionadas a nivel proximal. En el miembro posterior izquierdo había osteomielitis y fractura en el dígito lateral. Debido al compromiso del hueso y al dolor, se realizó eutanasia. No se realizó análisis citogenético. De acuerdo con la clasificación existente, la polidactilia encontrada en los miembros anteriores corresponde a la forma atavística y la encontrada en los posteriores a la forma teratogénica. Hasta lo que nosotros sabemos, este es el primer caso de polidactilia en los cuatro miembros registrado en América del Sur y en los últimos 55 años a nivel mundial. Palabras clave: Anomalías congénitas, caballos, órganos supernumerarios. (Fuentes: AIMS, CAB).

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Sepúlveda - Polidactilia en los cuatro miembros de una potranca mestiza

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ABSTRACT Polydactyly is a congenital anomaly of very low incidence in horses. A 6-week-old filly with polydactyly in all four limbs was admitted for a clinical and radiological examination. This examination showed the presence of a supernumerary digit for the digit II with respect to the metacarpal bone and the first and second phalanges in both forelimbs. In both hindlimbs a supernumerary digit was observed to originate at the level of the phalangic metatarsal joint. Both digits were the same size, and formed by three phalanges and were articulated with the metatarsi bone III. First phalanges of both digits were partially fused proximally. In the left hindlimb had osteomelitis, and a fracture in the lateral digit. Due to bone compromise and pain, euthanasia was performed. Cytogenic analysis was not performed. According to the used classification polydactyly described in the forelimbs corresponds to atavistic, and described in the hindlimbs to teratogenic form. As far as we know, this is the first case of polydactyly in all four limbs described in South America and the first in the world in the last 55 years. Key words: Congenital abnormalities, horses, supernumerary organs. (Sources: AIMS, CAB).

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

La polidactilia, se define como la presencia de uno o más dígitos extras (1). Aún cuando existen numerosos reportes, la polidactilia es poco frecuente, siendo estimada su incidencia en 0.066% (2). En Chile y América del Sur, no hay registro de polidactilia en equinos y a nivel mundial muy pocos de caballos con polidactilia en sus cuatro miembros, siendo el último en 1955, por lo que la descripción de este caso parece interesante considerando además, que es el primer caso en el que en un mismo individuo se presentan las 2 formas de polidactilia descritas.

Una potranca mestiza de 6 semanas de edad con polidactilia en sus cuatro miembros (Figura 1), ingresó junto a su madre al Hospital de Animales Mayores de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepción, Sede Chillán, Chile, para una evaluación clínica y posible resolución quirúrgica del caso.

RESULTADOS La anamnesis reveló que pese a las malformaciones, la potranca pudo ponerse de pie, caminar y alimentarse por si sola

Figura 1. Vista lateral izquierda y derecha de la potranca con polidactilia en sus cuatro miembros.

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desde el primer día de vida, aunque a los pocos días comenzaron a hacerse más evidentes las deformidades angulares en el miembro anterior y posterior derecho, así como también, la deformidad flexural en los cuatro miembros, razón por la cual, en el último tiempo la potranca pasó la mayor parte del día en decúbito esternal o lateral. Al examen clínico, durante la inspección a distancia, se observaba en ambos miembros anteriores aplomos de base ancha, deformidad flexural de la articulación interfalángica distal estado I, en que sólo el dedo del casco contactaba el suelo (apoyo en pinza) y polidactilia a partir del lado mediopalmar del nudo, en donde se originaba un dígito supernumerario completo con cuartilla y un casco de menor diámetro y tamaño que no tocaba el suelo y que alcanzaba aproximadamente hasta la mitad de la cuartilla del dígito III. Además, se observaba y palpaba el segundo hueso metacarpiano (Mc2), de menor diámetro que el Mc3. En el miembro anterior izquierdo el dígito III presentaba una desviación medial (valgus) severa a partir del nudo hasta tocar el suelo. En los miembros posteriores, la polidactilia se manifestó en forma diferente, ya que por palpación se detectó el desarrollo del Mc2 rudimentario normal, observándose el nudo aumentado de volumen y del cual se originaban 2 dígitos con casco. En el miembro posterior derecho, la separación de los dígitos se producía a partir de la mitad de la cuartilla, siendo éstos de largo similar pero con el dígito medial de diámetro menor, en la vista frontal, los cascos se veían muy aguzados parecidos a las pezuñas de los rumiantes y en que el apoyo lo realizaba con la superficie plantar de la cuartilla y los talones del casco. Además, en la cerneja presentaba una herida abrasiva infectada de forma ovoide de 6 x 4 cm, de consistencia firme, con presencia de tejido de granulación y una depresión central en donde se encontró tejido necrótico y una fístula con abundante secreción de tipo serosanguinolenta. En el miembro posterior izquierdo, el dígito medial era más largo que el lateral,

y se encontraba totalmente luxado hacia la parte medial. El dígito lateral era más corto, con la cuartilla muy edematizada, pero debido a la luxación del dígito medial su casco tocaba el suelo y soportaba gran parte del peso del miembro. En la superficie lateral de este dígito había una herida abrasiva infectada de 6 x 5 cm, además, en la superficie dorsal sobre el rodete coronario había una fístula muy dolorosa a la palpación, que secretaba gran cantidad de secreción purulenta. En la superficie medial del dígito medial, había una herida de 4 cm de diámetro de consistencia firme. La potranca evidenciaba mucho dolor al caminar debido a la luxación y presencia de las heridas infectadas en sus miembros. La madre no presentaba polidactilia, además al ser consultado el propietario por antecedentes de polidactilia en el padrillo y crías del éste y/o la yegua, éste señaló que no tenía antecedentes. Al examen radiológico, en los miembros anteriores se observó la presencia de un dígito supernumerario por medial (dígito II), con su respectivo hueso metacarpiano y la primera y segunda falange (P1, P2), el miembro anterior derecho (Figura 2) en el dígito supernumerario se observó sólo un hueso sesamoideo proximal, además la longitud de este dígito alcanzaba hasta

Figura 2. Radiografía dorsolateral-palmaromedial oblicua del metacarpo y dígitos del miembro anterior derecho.

Sepúlveda - Polidactilia en los cuatro miembros de una potranca mestiza

el nivel de la articulación interfalángica proximal del dígito III. En el miembro anterior izquierdo (Figura 3) el dígito supernumerario presentaba ambos huesos sesamoides proximales, y la longitud de este dígito alcanzaba hasta el nivel de la articulación interfalángica distal del dígito III.

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y que presentaban el hueso sesamoideo distal. No se pudo determinar cual era el dedo principal. En el miembro posterior derecho (Figura 4) la vista lateromedial permitió observar una deformación flexural

Figura 4. Radiografía dorsoplantar de las falanges del miembro posterior derecho.

Figura 3. Radiografía dorsomedial-palmarolateral oblicua del nudo y falanges del miembro anterior izquierdo.

También, se observó una desviación del eje del dígito III hacia medial en la articulación metacarpofalángica, con desprendimiento lateral a nivel de la fisis del cartílago de crecimiento proximal de la P2 y una fractura de tipo Salter Harris 2, con signos de reparación, además, había signos de osteolisis en la P3 del dígito III. En ambos miembros posteriores, se observaba un dígito supernumerario, el cual se originaba a nivel de la articulación metatarsofalángica, ambos dígitos estaban formados por tres falanges y se articulaban con el hueso metatarsiano III (Mt3), uno en la carilla articular lateral y el otro en la medial, la P1 de ambos dígitos en los dos miembros se encontraban parcialmente fusionados en proximal. También se observaba que el crecimiento de ambos dígitos era del mismo tamaño hasta distal

marcada hacia plantar a nivel de articulación interfalángica proximal, por luxación completa de esta articulación en ambos dedos (hiperextensión). En el miembro posterior izquierdo (Figura 5) en la vista dorso plantar se observó pérdida del eje

Figura 5. Radiografía dorsoplantar de las falanges del miembro posterior izquierdo.

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podofalángico normal visto de frente, con un quiebre hacia lateral (varus) en ambos dígitos y pérdida de arquitectura en ambas P3, especialmente en la zona del dedo. Además, se observó signos de osteolisis en la zona de fusión parcial de ambas P1. En el dígito lateral se observó una fractura de la primera falange, con signos de osteolisis severa. En la vista latero medial se observó una fractura de P1 en el dígito lateral, con signos de lisis ósea y presencia de aire o gas, concordante con osteomielitis. Debido al compromiso óseo y dolor, se decidió realizar eutanasia. No se realizó análisis citogenético.

DISCUSIÓN En 15224 necropsias de equinos realizadas en Estados Unidos, la adactilia y polidactilia mostraron tener una frecuencia muy baja de 0.066% (2). Ahora bien, la polidactilia en los cuatro miembros en equinos es menos frecuente, aún cuando en un estudio realizado por Lindermann en 1909, éste reportó que de 100 casos de polidactilia registrados en equinos, el 15% la presentaban en los 4 miembros (3). Sin embargo, desde el año 1909 hasta la fecha sólo se ha reportado un caso, el cual corresponde a una foto publicada en Alemania en 1955 (4). Diversas publicaciones revelan que son más frecuentes los casos de polidactilia medial y unilateral en los miembros anteriores (1,58), aún cuando, hay 3 casos de polidactilia bilateral en los miembros anteriores (3, 6, 9) y otro de polidactilia bilateral en los posteriores (2). Estos registros coinciden en cierta forma con las frecuencias de polidactilia reportadas por Lindermann en 1909, quien señaló que el 60% afectaban sólo a un miembro y el 24% a dos miembros (3). También, existen reportes de casos de polidactilia asociada a otras malformaciones congénitas como adactilia (8) y malformación craneal (2). La polidactilia ha sido reportada en diferentes razas y tipos de caballos entre ellas árabe, pura sangre, appalloosa, cuarto de milla, murgés, sangre templada alemán, poni Welsh, poni balcanés y también mestizo

como el presente caso (1, 3, 5, 7-8, 10). Se han reportado casos de polidactilia en Europa, Norte América y Australia (1-5, 7, 9, 10), por lo que este caso de polidactilia, es el primero publicado en América del Sur. La forma de polidactilia observada en este caso en los miembros anteriores, en que se hay desarrollo completo del Mc2 y su dígito, es similar a lo descrito por otros autores (1, 3, 8, 10), cuya corrección quirúrgica consiste en la extirpación del Mc2 y su dígito supernumerario, la que ha sido reportada con éxito por varios autores (3, 6, 10). La descripción de la polidactilia en los miembros posteriores, en que se observa la fusión parcial de las P1 con el desarrollo de 2 dígitos similares articulados al extremo distal del Mc3 es parecida a lo reportado en 2 equinos (6, 8), sin embargo, las fracturas, luxaciones y osteolisis encontrada en estos dígitos no hicieron recomendable la corrección quirúrgica descrita por otros autores (6). Lamentablemente, en este caso al no hacer un análisis citogenético no se pudo establecer o descartar si existía un problema a nivel de cromosomas. Sin embargo, de acuerdo a la clasificación propuesta por Stanek y Hantak (3) y posteriormente aceptada por Barber (5), la polidactilia descrita en los miembros anteriores corresponde a la forma atavística la que es definida como la formación de dígitos similares al dígito III presentes en antecesores y en que los dígitos supernumerarios usualmente se desarrollan desde la parte distal de los huesos metacarpianos o metatarsianos II y/o IV. Se entiende por atavismo la reaparición de caracteres de antepasados. En la evolución del equino su primer antepasado el Hyracotherium (=Eohippus) hace 55 millones de años poseía 4 dígitos en los miembros anteriores y 3 en los miembros posteriores que tocaban el suelo, los que evolucionaron y fueron regresando paulatinamente hasta hace 10 millones de años, en que el Pliohippus fue el primer antepasado del equino actual que sólo poseía un dígito desarrollado con los metacarpales

Sepúlveda - Polidactilia en los cuatro miembros de una potranca mestiza

y metatarsales II y IV rudimentarios (11). Este caso correspondería a este tipo de polidactilia e incluso es similar fenotípicamente a los casos confirmados cromosomalmente por otros autores como forma atavísitica (2, 3). Respecto a lo observado en los miembros posteriores, los hallazgos corresponden a lo clasificado como polidactilia de forma teratógénica, ya que, los dígitos supernumerarios resultan de la división de los elementos basipodales, en que la mayoría de los casos tienen todos sus huesos falángicos afectados y en que frecuentemente los huesos metacarpales o metatarsales II y IV son normales (3, 5), caso muy similar al reportado por Dore (7) y clasificado por este autor como de origen teratogénico, entendiendo como tal la malformación producida por factores ambientales durante el desarrollo embrionario o fetal (11). Es poco probable pero no imposible, que en un mismo caso

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se produzca polidactilia de diferentes tipos. Lo más probable es que este caso sea de origen atavístico, atribuible como señalan algunos autores, a una mutación autosomal dominante con penetración incompleta (1, 3), por lo que esta polidactilia tendría un origen hereditario, lo cual también fue considerado por otros autores (10) al recomendar no reproducir el potro con polidactilia por ellos reportado, ya que se trataba de una malformación que se transmitía genéticamente. En conclusión, la polidactilia en los cuatro miembros es de muy baja presentación y esta, es la primera reportada en Chile y América del Sur. Debido a la dificultad de clasificación de éste caso de polidactilia, parece necesario realizar futuros estudios de tipo cromosomal, para definir si la forma clasificada como teratogénica es tal.

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2641 1.6 Key Words: Palabras clave, deben ser iguales a las de español, pero en idioma ingles. 2. Introducción: Debe indicar claramente e l p r o p ó s i t o d e l a i nv e s t i g a c i ó n , relacionando igualmente en forma selectiva la literatura pertinente. No incluya datos ni conclusiones del trabajo que está dando a conocer. Al finalizar esta sección deberá hacerse con el objetivo general. 3. Materiales y métodos: Se debe describir claramente los procedimientos empleados en la investigación, incluyendo diseño estadístico y análisis de datos. Esta sección deberá ser estructurada indicando tipo de estudio, sitio, condiciones geo-climáticas, coordenadas del sitio de estudio, pacientes o animales de estudio, métodos de laboratorio, aspectos éticos, análisis de resultados, etc. Estas secciones deberán ir con negrilla y luego punto seguido en donde se inicia el texto de cada sección. 4. Resultados: Corresponde a la información de los hallazgos pero sin incluir comentarios ni referencias a otros trabajos. Se sugiere utilizar tablas y figuras, las cuales no deberán ser más de seis en lo posible. 5. Discusión: Es la interpretación de los resultados obtenidos y la contrastación de los mismos con otros estudios. Se debe destacar las limitaciones del estudio e igualmente evitar especulaciones. Resaltar las conclusiones del estudio, así como las recomendaciones para futuras investigaciones. 6. Agradecimientos: Mencionar las personas o instituciones que han colaborado con la investigación (financiera, logística, intelectual, entre otras.). 7. Correspondencia: Nombre completo del autor responsable, dirección laboral y residencial, correo electrónico, teléfono celular y teléfono fijo. Esta información puede ser suministrada en la carta remisoria o en una hoja al final del artículo remitido.

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• Autor Corporativo Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos amenazantes. Rev MVZ Córdoba 1997; 33: 31-40. • No se indica nombre del autor Cáncer in South África (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16. Los artículos deben escribirse en su idioma original si la grafía es latina. • Suplemento de un volumen Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117. • Suplemento de un número Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma. Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531. • Número sin volumen Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14. • Sin número ni volumen Browell DA, Lennard TW. Inmunologic status of the cancer fish patient and the effects ofblood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33. • Paginación en número romanos Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology. Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII. • Indicación del tipo de artículo según corresponda Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337.

Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN)(abstract). Kidney Int 1992; 42: 1285. • Documentos legales Leyes: Título de la ley. (Nombre del Boletín Oficial, fecha, año de publicación).

Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos Laborales. (Boletín Oficial del Estado, número 269, de 10-11-95). • Mapa Nombre del mapa (tipo de mapa). Lugar de publicación: Editorial; año. Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico). Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003. Material no publicado • En prensa Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007. • Artículo de revista en formato electrónico Autor. Título. Nombre de la revista abreviado (tipo de soporte) año (fecha de acceso); volumen (número): páginas o indicador de extensión. Disponible en: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia. MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/ mmwrhtml/00048303.htm • Monografía en formato electrónico Título. (Tipo de soporte). Editores o productores. Edición. Versión. Lugar de publicación: Editorial; año. Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CD-ROM). Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0. Hagenstown: Lippincolt-Raven; 1997. • Archivo informático Autor. Título. (Tipo de soporte). Versión. Lugar: Editorial; año. • Tesis de Maestría, doctorado y trabajos de grado Autor(es) título, Facultad, Departamento, año. Arrieta G. Producción de Verotoximas en Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

2643 9. F o t o g r a f í a s : S e p o d r á n u t i l i z a r fotografías, de excelente calidad, digital. La identificación, secuencia y títulos deben establecerse claramente para localizar el lugar que le corresponda en el contenido del artículo. Las fotografías deberán llevar el título de figura. 10. Evaluación de artículos: Los artículos recibidos para publicación, después de constatar que cumplen con las normas expresas de la Revista MVZ Córdoba, serán enviados a pares que conforman el Comité Científico para su respectiva evaluación. En caso de recibir algún manuscrito que por su especialidad de contenido no pueda ser evaluado por los miembros del comité, este será remitido a sendos evaluadores pertenecientes a la comunidad científica nacional o internacional. En la redacción del contenido deberán respetarse las normas internacionales para manuscritos científicos que regulan las abreviaturas, literatura citada, símbolos, n o m e n c l a t u ra s a t ó m i c a s , z o o l ó g i c a s , botánicas, químicas, entre otros. Los valores

deben informarse en unidades del sistema métrico decimal y de acuerdo con el Sistema Internacional de Unidades. La revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba no se responsabilizan por opiniones y resultados expresados por los autores, los cuales serán responsabilidad exclusiva de ellos. Conflicto de intereses. Los autores deben expresar los intereses posibles que posean en el trabajo que realizaron. Correspondencia: Los artículos, consultas, aclaraciones y correspondencia general se deben dirigir a la dirección abajo señalada, sin embargo, también los trabajos pueden ser remitidos en forma electrónica al editor o al coeditor. http:// www.unicordoba.edu.co Comité Editorial REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Teléfonos (094) 756 11 67, 756 07 10 http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/ revistamvz/index.htm Apartado Aéreo 354 Montería - Colombia Editor Marco González Tous. M.Sc. marcog@ escarsa.net.co

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Journal MVZ Córdoba Instructions to the Authors The Journal MVZ Cordoba is the official organ of diffusion of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of the Universidad de Cordoba, is a biannual publication and circulates in the international environment. The magazine publishes (sections) original articles of investigation, technical articles, literature reviews, topic revisions, brief communications, inform of cases and, others that to opinion of the Editorial Committee are from general interest. The topics that the Journal MVZ Cordoba publishes are related with the veterinary medicine and zootechny, aquaculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences and other topics of interest in the agricultural sciences.

Spanish or English. Authors should consult general guides described below. The Journal MVZ Cordoba is welcomed to the general requirements of uniformity for biomedical journals (Norms of Vancouver).

“The Journal MVZ Córdoba follows the policies of the World Health Organization (WHO) and of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) for clinical trial registration, recognizing the importance of those initiatives for international dissemination of information on clinical research, in open access. Accordingly, only articles of trials previously registered in one of the clinical Trial Registries that meet WHO and ICMJE requirements will be accepted for publication, starting in 2007. The list of registries accepted by WHO and ICMJE is available in ICMJE site. The trail registration number should be published at the end of teh abstract”.

1.2. Name: Last name of author(s). For the second name only be placed the first letter in capital followed by coma and each author´s highest academic degree or professional title. It should include the institution affiliation of authors, (Institution Name, address, city, country). It should also indicate the responsible person for the manuscript correspondence (e-mail included).

Interested in publishing will send to the Editor an introductory letter signed by all the authors declaring expressly that the remitted article has not been published previously and that the authors don’t have conflict of interests. Two printed copies will be sent of the article written on any of the programs for word processing, double space, paper size letter, in ink quarter note for a single face of the leaf, with arial letter, font size 12 and C.D. (these originals will not be returned) or by e-mail. Margin should not be inferior to 3 cm and pages will be numbered consecutively including the whole material. Journal accepts papers in either

1. Presentation: It should contain the following information: 1.1. Title of the article: It should be presented in Spanish and English language. The last one should appear below the first one double spaced and with a minor font size that the main one. The Title should be concisely but informative and be of up to 15 words.

1.3 Abstract: Should be structured and of approximately 250 words, indicating the paper’s objective clearly and including: objective, material and methods, results and conclusions. This section should be in boldface and then point followed by the text of the subsequent section. 1.4 Key words: Are short terms. These will be useful to classify the article. List 6 as maximum. Use the terms of the “Medical subject headings” (MeSH) list or another describer in agreement with the topic of their investigation. (DeCS, BIREME, NLM, etc.). 1.5 Abstract (summarize translated to English) it should possess a structure and content similar to the one of Spanish.

2645 1.6 Key Words: Key words, it should be similar to those of Spanish, but in English language. 2. Introduction: should indicate the paper’s objective clearly, relating equally in selective form the pertinent literature. Do not include data neither conclusions of the work that is giving to know. When concluding this section it will be made with the general objective. 3. Material and Methods: should be described clearly the procedures used in the investigation including statistical design and data analysis. This section should be structured indicating type of study, place, geo-climatic conditions, coordinate of the study place, patients or animals, laboratory methods, ethical aspects, result analysis, etc. These sections should be in boldface then point followed by the text of the subsequent section. 4. Results: Correspond to findings without comments no references to other works. The use of tables and figures is suggested which should be no more of six. 5. Discussion: is the interpretation of the obtained results followed by a comparison with other studies. It should stand out the limitations of the study and equally to avoid speculations. Point out conclusions and suggestions for further research. 6. Acknowledgements: Contributions from people or institutions who have collaborated with the investigation (financial, logistics, intellectual, among others) should appear under “Acknowledgements”. 7. Correspondence: Full names of the responsible author, affiliation address, postal address, cellular and telephone number, email addresses. This information should be include in the remission letter or in a single sheet at the end of the article. 8. References: Will be cited with a number correlative to the order in which they

appear in the text and should be numbered consecutively by means of Arabic numbers placed within parenthesis. The list of references will begin in separate sheets, in strict appearance order in the text; they were not in alphabetical order. Original articles should have no more than 30 references. For literature revisions up to 50 references. Presentation of cases and short communications will have only 12 references. As general guide examples of bibliographical references are given below. 8.1. Journals • Author’s names • Full title of the referenced article • International abbreviation of the journal name • Year • Volume • Included pages. International abbreviation must be search in Journals database of PubMed, Catalogue C17, DREV, Biomedical journals of Valencia IHCD. 8.2. Books and monographs • Author or editor • Title of book, publication place, editorial, year of publication and consulted pages. 8.3.

Examples for the bibliographical references according to the Vancouver norms Journal articles • Articles Author(s). Title of the article. International Abbreviation of the journal, year; volume (number): initial-final page of the article.

Examples: Díez Jarilla J, Cienfuegos Vázquez M, Suárez Salvador E. Ruidos adventicios respiratorios: factores de confusión. Rev MVZ Córdoba 1999; 109: 632-634.

• More than six authors Martín Cantera C, Córdoba García R, Jane Julio C, Nebot Adell M, Galán Herrera S, Aliaga M et al. Virus and public health J Vet Sci 1997; 109: 744-748.

• Corporate author Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos

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amenazantes. Rev MVZ Cordoba 1997; 33: 31-40. • The author’s name is not indicated Cancer in South Africa (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16. The articles should be written in their original language if the graph is Latin. • Supplement of a volume Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117.

• Supplement of a number Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma. Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531. • Number without volume Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14.

• Without number neither volume Browell DA, Lennard TW. Inmunologic status of the cancer fish patient and the effects of blood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33. • Paging in Roman numbers Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology. Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII.

Laborales. (Boletín Oficial del Estado, número 269, de 10-11-95).

Unpublished Material • In press Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007.

• Journal article in electronic format Author. Title. Name of the journal in abbreviate form (support type) year (access date); volume (number): pages or extension indicator. Available in: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia. MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/ mmwr/preview/mmwrhtml/00048303. htm

• Indication of the article type as it corresponds Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337. Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN) (abstract). Kidney Int 1992; 42: 1285.

• Legal documents Laws: LawTitle. (Name of the Official Bulletin, date, year of publication). Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos

• Map Name of the map (map type). Publication Place: Editorial; year. Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico). Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003.

• Monograph in electronic format Title. (Support type). Editors or producers. Edition. Version. Publication place: Editorial; year. Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CD-ROM). Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0. Hagenstown: Lippincolt-Raven; 1997.

• Informatics file Author.Title. (support Type). Version. Place: Editorial; year.

• Thesis of Master, Doctorate and under Graduate works Author(s) title, faculty, department, year. Arrieta G. Producción de Verotoximas en Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

9. Photographs: Pictures can be use, of excellent digital quality. The identification,

2647 sequence and titles should settle down clearly to locate the place that corresponds in the content of the article. The photographs will take the title of figure. 10. Evaluation of articles: Those manuscripts submitted to the Journal, after verifying that they fulfill the expressed norms of the Journal MVZ Cordoba will be subject to peer reviews of the Scientific Committee for its evaluation. In the event of receiving some manuscript that by its special content cannot be evaluated by the members of the committee it will be remitted to appraisers belonging to the national or international scientific community. In the writing of the content the international norms will be respected for scientific manuscripts that regulate the abbreviations, mentioned literature, symbols, atomic, zoological, botanical, chemical nomenclatures, among others. The values should be informed in units of the metric decimal system and in accordance with the International System of Units.

The Journal MVZ Cordoba and the Universidad de Córdoba don’t take the responsibility for opinions and results expressed by the authors, which will be exclusive responsibility of them. Conflict of interests. The authors should express the possible interests that possess in the work made by them. Correspondence: Articles, consultations, explanations and general correspondence should be sent to the address below, however, the works can also be remitted in electronic form to the editor or the coeditor. http://www.unicordoba.edu.co Editorial Committee REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Telephones: (094) 7561167, 756 07 10 http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/ revistamvz/index.htm Apartado Aéreo 354 E d i t o r M a r c o G o n z á l e z To u s . M . S c . editormvzcordoba@gmail.com

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Agudelo G. Divier, Ayala A. Alfredo, Betancourt L. Liliana, Cadavid Henry. Carulla F. Juan, Castañeda S. Rubiela, Conde Pulgarín Abelardo, Cotes Torres Alejandro, Cruz C. Anastasia, Diego Soler-Tovar, Gabriel Prieto S, Gaviria N. Ángela, Gennari Solange María, Gimeno Eduardo Juan, Giovanni Moreno Figueredo, Henao Restrepo Guillermo, Hernández V. Aureliano, Hidalgo Marylin, Landázuri Patricia, Loango Chamorro Nelsy, Lopera Cardona Seneida, Malambo García Dacia, Martínez B. Javier, Martínez H. Nicolás, Medina Robles Víctor Morales Salinas Elizabeth, Parra Henao Gabriel, Prieto G. Martha, Ramírez S. Rosa, Reyes Vélez Julián, Rodríguez V. Fernando, Romero Salas Dora, Solarte Portilla Carlos, Valbuena Gustavo, Valencia García Francia, Vásquez T. Wálter, Viveiros Ana TM, Zapata Tamayo Mario,

M.Sc. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. M.Sc. M.Sc. Ph.D. M.Sc. M.Sc. M.Sc. M.SC Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. M.Sc. Ph.D. M.Sc. M.Sc. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. M.Sc.

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