Rev.MVZ_Cordoba_17(1) by Revista MVZ Córdoba

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

Diseño y Diagramación Luis Carlos Salgado Arroyo Ingeniero de Sistemas luis_salga2@hotmail.com

Impresión Gráficas del Caribe Ltda. Cra. 1B No. 40-42 Tel. (57) (4) 782 6622 Telefax (57) (4) 782 7688 email: diseno@graficaribe.co

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Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba EDITOR

Marco González T. M.Sc. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COEDITOR CO-EDITOR

Salim Máttar V. Ph.D. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

ASISTENTES DEL EDITOR - ASSISTANT EDITORS Luis Carlos Salgado A. Ing. German Arrieta B, M.Sc. Diva Santana C, Lic. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COMITÉ EDITORIAL EDITORIAL COMMITTEE James N. Mills. Nelson Alvis G. Raúl Poutou P. Oscar Vergara G.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA U. de Cartagena, Cartagena, Colombia Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá Universidad de Córdoba, Colombia

COMITÉ CIENTIFICO SCIENTIFIC COMMITTEE Nicholas Komar. Ph.D. Maria Aguero R. Ph.D. Joaquín Quilez C. Ph.D. Claudio C. Fonseca. Ph.D. Priscila V. Logato. Ph.D. Marcelo B. Labruna. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA N. Y. Medical College, USA U. de Zaragoza, España U. Fed. de Vioçosa, Brasil U. Fed. de Lavras, Brasil U. de São Paulo, Brasil

Jorge Salazar B. Ph.D. Juan Carulla F. Ph.D. Henry Grajales L. Ph.D. Claudia Jiménez E. Ph.D. Sandra Pardo C. Ph.D. Agustin Góngora O. Ph.D.

Texas Tech. University U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. de Los Llanos, Colombia

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

Revista MVZ Córdoba La Revista MVZ Córdoba es el órgano oficial de difusión de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba. La revista publica artículos originales de investigación, artículos técnicos, revisiones de literatura, revisiones de tema, comunicaciones breves e informes de casos que a juicio del Comité Editorial sean de interés. Los temas que publica la Revista MVZ Córdoba están relacionados con la medicina veterinaria, zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias. La revista está dirigida a los profesionales de la medicina veterinaria, zootecnia, salud pública humana y animal, acuicultura, biología, ciencias básicas biomédicas y biotecnología. Manuscritos y correspondencia: Enviar por correo electrónico al Editor o Coeditor de la Revista MVZ Córdoba. Correos: revistamvz@gmail.com revistamvz@unicordoba.edu.co Preparación de manuscritos: En la sección instrucciones a los autores, se puede obtener la información al respecto. También el documento se puede conseguir directamente en el sitio web: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Suscripción: La Revista MVZ Córdoba se publica cada cuatro meses y circula los meses de abril, agosto y diciembre. Los números de un año se agrupan en un volumen comenzando por el del mes de abril. La suscripción anual tiene un valor de $20.000 (US $10) para América Latina y el Caribe; US $15 para USA y Canadá; US $25 para otras regiones. Para suscribirse, diligencie el formulario que aparece al final de cada revista. Reproducción e impresos: Se autoriza la fotocopia de artículos para fines de uso académico o interno de las instituciones, citando la fuente. Para impresos dirija la solicitud a Revista MVZ Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Apartado aéreo No 354. Publicidad: La Revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba aclaran que la aceptación de publicidad no compromete la aprobación ni el respaldo de los productos o servicios que contraten pautas comerciales o de difusión. Teléfonos: (57) (4) 7561167 / 7560710, Montería, Colombia. Acceso en línea: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Disponible desde el volumen 5 número 1 enero-junio de 2000, texto completo, instrucciones a los autores y suscripciones.

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Journal MVZ Córdoba The Journal MVZ Córdoba is the official diffusion organ of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of the Universidad de Córdoba. The Journal MVZ-Córdoba is devoted to the publication of original research articles, technical articles, literature revisions, especific reviews, short comunications and presentations of cases interest to Editorial Committee. The Journal publishes topics that are related with veterinary medicine, zootechny, aquaculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences and other subjects of interest of the agricultural sciences. The journal is directed to professionals of the veterinary medicine, zootechny, human and animal public health, aquaculture, biology, biomedical basic sciences and biotechnology. Papers and correspondence: Papers should be sent by via e-mail to the Editor or Coeditor of the Journal MVZ Córdoba. e-mails: revistamvz@gmail.com revistamvz@unicordoba.edu.co Preparation of manuscripts: Information can be found in instructions to authors section. The document can be also obtained at following web-site: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Subscription: The Journal MVZ Córdoba is published triannually and circulates the months of April, August and December. The numbers of one year group in a volume beginning with the month of April. The annual subscription has a value of US$10 for Latin America and the Caribbean; US $15 for USA and Canada; US$25 for other regions. To subscribe, obtain the form that appears at the end of each journal. Reproduction and forms: Photocopies of articles is authorized for institutional or academic purposes. To obtain printed copies, please address your request to: Journal MVZ Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Apartado aéreo No 354. Publicity: The Journal MVZ Córdoba and the Universidad de Córdoba clarify that commercial of advertising does not imply the approval nor backing of such respective products or services. Telephones: (57) (4) 7561167 / 7560710, Montería, Colombia. On-line access: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm Available from the volume 5, number 1 January-June of 2000, full text, instructions to authors and subscriptions.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba Indexada por: Indexed by:

Categoría A1 Impresa desde Volumen 1, número 1, año 1994 Printed effective with Volume 1, issue 1, 1994 Publicación cuatrimestral Published triannualy ISSN 0122-0268 Rev.MVZ Córdoba © 2012 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Financiada por / Sponsored by: Universidad de Córdoba

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Revista MVZ Córdoba Volumen 17

ENERO - ABRIL

Número 1

CONTENIDO EDITORIAL Manuscrito duplicado o redundante: conducta impropia Marco González, Salim Mattar

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ORIGINALES Parásitos protozoarios y metazoarios de la tilapia del Nilo Oreochromis niloticus criadas en Brasil Wanderson Pantoja, Ligia Neves, Márcia Dias, Renata Marinho, Daniel Montagner, Marcos Tavares-Dias

Efecto de Debaryomyces hansenii en la respuesta antioxidante de juveniles de camarón blanco Litopenaeus vannamei María Pacheco, Ángel Campa, Gabriel Aguirre, Antonio Luna, María Guzmán, Felipe Ascencio

Prevalencia de Listeria monocytogenes en carnes y derivados de la industria porcícola colombiana

Andrea Gamboa-Marín, Sonia Buitrago, Karol Pérez-Pérez, Marcela Mercado, Raúl PoutouPiñales, Ana Carrascal-Camacho

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Crustáceos decápodos asociados a ensamblajes macroalgales en el litoral rocoso de Córdoba, Caribe colombiano Jorge Quirós, Pedro Dueñas, Néstor Campos

2834

Determinación de factores de virulencia en cepas de Aeromonas spp., aisladas a partir de pescado William Suárez, Fanny Herrera

2846

Técnica para aislamiento de bacteriófagos específicos para E.coli DH5α a partir de aguas residuales Gabriel Gaviria, María González, Jhon Castaño

2852

Caracterización de propóleos provenientes del municipio de Caldas obtenido por dos métodos de recolección Julián Martínez, Carlos Garcia, Diego Durango, Jesús Gil

2861

Parámetros genéticos de características de tipo y producción en ganado Holstein del departamento de Antioquia Juan Corrales, Mario Cerón-Muñoz, Jhon Cañas, Cristina Herrera, Samir Calvo

2870

Comparación de metodologías moleculares para identificar el gen de la kappa caseína en ganado Holstein Carlos Solarte, Carol Rosero, Yohana Eraso

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

Revista MVZ Córdoba Volumen 17

ENERO - ABRIL

Número 1

Predicción del porcentaje de proteína total a partir de muestreos parciales y ajuste de efectos medioambientales María Ceballos, Guillermo Correa, Julián Echeverri

Crecimiento en pastoreo rotacional de toretes de razas criollas Romosinuano y Blanco Orejinegro en Colombia Jaime Quiceno, Rodrigo Martínez, Henry Mateus, Jaime Gallego, Pedro Medina

Evaluación de la degradabilidad in situ en bovinos especies arbóreas

2884

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suplementados con cuatro

María Roa, Javier Muñoz

Efecto del colesterol y la dimetilformamida sobre parámetros posdescongelación en espermatozoides de caballos criollos colombianos Ana Mesa, Guillermo Henao

Prevalencia de anticuerpos para Trypanosoma cruzi en caninos de dos municipios endémicos de Boyacá Diego Manrique-Abril, Fred Manrique-Abril, Myriam Lorca, Juan Ospina

2900

2908

2916

COMUNICACIÓN BREVE Reporte de las serpientes del municipio de Tamalameque, Cesar - Colombia Oscar Ruiz

2924

REVISIÓN DE LITERATURA ¿Están preparadas las ciencias veterinarias y zootécnicas para el futuro?: una visión desde Colombia Fernando Nassar-Montoya

Bienestar animal durante el transporte y su relación con la calidad de la carne bovina

2928

Marlyn Romero, Jorge Sánchez

2936

Instrucciones para los autores

2945

2807

Journal MVZ Córdoba Volume 17

JANUARY - APRIL

Issue 1

CONTENTS EDITORIAL Duplicate manuscript or redundant: misconduct Marco González, Salim Mattar

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ORIGINALS Protozoan and metazoan parasites of Nile tilapia Oreochromis niloticus cultured in Brazil

Wanderson Pantoja, Ligia Neves, Márcia Dias, Renata Marinho, Daniel Montagner, Marcos Tavares-Dias

Effect of Debaryomyces hansenii on the antioxidant response of juvenile white shrimp Litopenaeus vannamei María Pacheco, Ángel Campa, Gabriel Aguirre, Antonio Luna, María Guzmán, Felipe Ascencio

Prevalence of Listeria monocytogenes in pork-meat and other processed products from the Colombian swine industry Andrea Gamboa-Marín, Sonia Buitrago, Karol Pérez-Pérez, Marcela Mercado, Raúl PoutouPiñales, Ana Carrascal-Camacho

Decapod crustaceans associated with macroalgae assemblages on the rocky coastline of Córdoba, Colombian Caribbean Jorge Quirós, Pedro Dueñas, Néstor Campos

Determination of virulence factors in strains of Aeromonas spp., isolated from fish William Suárez, Fanny Herrera

Bacteriophages specific for DH5α strain of E. Coli from wastewater isolation techniques Gabriel Gaviria, María González, Jhon Castaño

Characterization of propolis from municipality of Caldas obtained through two collection methods Julián Martínez, Carlos Garcia, Diego Durango, Jesús Gil

Genetic parameters of type traits and production in Holstein cattle from the Department of Antioquia Juan Corrales, Mario Cerón-Muñoz, Jhon Cañas, Cristina Herrera, Samir Calvo

Comparison of molecular methodologies to indentify the kappa casein gene in Holstein cattle Carlos Solarte, Carol Rosero, Yohana Eraso

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2808

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

Journal MVZ Córdoba Volume 17

JANUARY - APRIL

Prediction of total protein percentage from partial sampling and adjustment of environmental effects María Ceballos, Guillermo Correa, Julián Echeverri

Growth in rotational grazing of young bulls from Romosinuano and Blanco Orejinegro creole breeds in Colombia Jaime Quiceno, Rodrigo Martinez, Henry Mateus, Jaime Gallego, Pedro Medina

Evaluation of in situ degradability in cattle supplemented on four tree species María Roa, Javier Muñoz

Effect of cholesterol and dimethiyl-formamide on post-thawing parameters in Colombian creole stallion sperm Ana Mesa, Guillermo Henao

Prevalence of antibodies for Trypanosoma cruzi in canines from two endemic municipalities of Boyacá Diego Manrique-Abril, Fred Manrique-Abril, Myriam Lorca, Juan Ospina

Issue 1

2884

2891 2900

2908

2916

SHORT COMMUNICATION Snake Report of the Municipality of Tamalameque, Cesar – Colombia Oscar Ruiz

2924

LITERATURE REVIEW ¿Are the colombian zootechnics and veterinary sciences prepare for the future? : A vision from Colombia Fernando Nassar-Montoya

Animal welfare during transport and its relationship with meat quality

2928

Marlyn Romero, Jorge Sánchez

2936

Instructions to the authors

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Rev.MVZ Córdoba 17(1):2809-2811, 2012.

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EDITORIAL

Manuscrito duplicado o redundante: conducta impropia Duplicate manuscript or redundant: misconduct La Organización de las Naciones Unidas para la Educación, la Ciencia y la Cultura (UNESCO, por su sigla en inglés), dentro de las categorías de artículos, los originales, los describe como aquellos en donde se informa sobre los resultados obtenidos, se describen métodos, aparatos, se expresan nuevas ideas, etc., y por lo tanto, se constituyen en la principal de las colaboraciones primarias destinadas a publicaciones periódicas. Un texto de un manuscrito pertenece a la categoría de “publicaciones originales” cuando éste contribuye a ampliar considerablemente el conocimiento o la comprensión de un problema y además, está escrito de tal manera que un investigador cualquiera pueda repetir los experimentos, cálculos o razonamientos teóricos del autor o autores y juzgar sus conclusiones, así como la precisión de su trabajo (1). En Colombia, el Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación (COLCIENCIAS) considera que el Artículo de investigación científica y tecnológica, es aquel que presenta de manera detallada los resultados originales de proyectos terminados de investigación. La estructura generalmente utilizada contiene cuatro apartes importantes: introducción, metodología, resultados y conclusiones, habida consideración de la revisión del estado del arte del tema plasmada en el cuerpo del manuscrito, así como en la sección de referencias (2). Teniendo en cuenta las definiciones anteriores, se puede afirmar que el producto final de una investigación, debe ser en todos los casos, la divulgación de los resultados mediante la escritura y publicación de un artículo científico, el cual es clasificado o categorizado en el mundo académico, como artículo original. Esta clasificación, aunque parezca simple, significa entre otras muchas cosas, nada más y nada menos que los resultados son inéditos, fidedignos y reproducibles; es decir, que ellos no han sido publicados ni total ni parcialmente y que además, son ciertos, lo que responsabiliza de manera absoluta a los autores firmantes, pues en caso contrario, se incurriría en comportamientos aberrantes como el plagio o autoplagio, por referirnos a un solo calificativo de las conductas impropias relacionadas con la ética de las publicaciones. Sancho (3) considera como publicación duplicada o repetida aquel manuscrito que es publicado varias veces y que en últimas se puede clasificar como un autoplagio. Igualmente comenta esta autora que quizás, desde el punto de vista de la ciencia, es el menor de los fraudes, ya que no distorsiona ni falsea los resultados obtenidos en el primer trabajo. No obstante, consideramos que desde la óptica de editores y usuarios de la información como son los lectores, esta práctica debe ser proscrita y rechazada tajantemente dentro de las políticas editoriales de todas las revistas científicas del mundo, sancionando de alguna manera a quienes incurran en ella. De acuerdo con los Requisitos de Uniformidad de las Revistas Biomédicas –a los cuales se acoge la Rev.MVZ Córdoba– contenidos en las Normas de Vancouver, la publicación 2809

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

redundante o duplicada consiste en la publicación de un artículo que coincide sustancialmente con otro ya publicado. Adicionalmente, se enfatiza en dichas normas que los lectores de las revistas biomédicas –creemos que cualquiera– deben tener la garantía de que aquello que están leyendo es original (4). Por otra parte, el International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), clasifica como publicación duplicada o redundante aquella que se solapa o coincide sustancialmente con un manuscrito ya publicado, bien sea en versión impresa o electrónica, y que hoy día es relativamente fácil detectar esta última en la WEB, descubriendo por lo tanto a los infractores (5). Los editores de seis Revistas de Cirugía Cardiotorácica (6), ante la gravedad y presencia indiscutible del mal, han discutido el tema y publicado las siguientes condiciones para declarar una publicación como redundante o duplicada: Hipótesis similar, la población de estudio o el tamaño de la muestra es similar, la metodología es idéntica o casi igual, los resultados son parecidos, como mínimo uno de los autores es común en ambas (o varias) publicaciones y por último, la novedad de la información proporcionada es mínima o casi nula. Creemos que pueden existir muchas razones para desarrollar esta conducta impropia. Probablemente, este comportamiento en algunas casos se deba a diversas presiones a que son sometidos los investigadores por las mismas instituciones, entes financiadores, competencia entre investigadores o entre grupos de investigación, productividad científica, acceso a recursos, mejora del currículum vítae, clasificación interna de investigadores dentro de institutos, centros de investigación o universidades, así como mejoras laborales o ascensos en la jerarquía del organigrama institucional y laboral. Tampoco debemos desconocer que quizás en algunos casos pueda primar el interés económico sobre el académico y por lo tanto, algunos investigadores se ven tentados a incurrir en faltas a la ética de publicaciones, fraccionando sus investigaciones o como se comenta en los corrillos, optan por publicar manuscritos en serie, recurriendo al uso de sinónimos en apartes de los títulos o a pequeñas modificaciones en alguna sección o secciones del artículo, bien sea agregando o quitando pero conservando lo medular del primer manuscrito publicado. Otra causa probable que también induce a los investigadores a realizar publicaciones duplicadas, es el desconocimiento de las normas que rigen las actividades de publicación y en especial en lo que tiene que ver con la ética, tal como lo consagra en sus directrices la World Association of Medical Editors (7) instando a los miembros de Comités Editoriales y a Editores de las revistas de dicha asociación –a la que también pertenece la Rev.MVZ Córdoba– para que desarrollen e implementen unas claras políticas editoriales, incluidas las faltas a la ética de la publicación en todos sus espectros, así como la sanción social o académica a que se hacen acreedores aquellos que caigan en esas conductas impropias. También es evidente que existen áreas del la ciencia que pueden ser más vulnerables, en donde entran a jugar un papel importante la política, la comercialización, los medicamentos y la salud entre otras, en donde se pueden ver involucradas investigaciones clínicas con pacientes de diverso orden. En este sentido Sancho (3) comenta que puede existir presión para que se dupliquen los artículos con resultados positivos acerca de nuevos medicamentos o por el contrario, retrasar la publicación de los resultados negativos, sobreestimando así la eficacia y seguridad de los mismos, lo cual puede dar lugar a posteriores análisis incorrectos de riesgos-beneficios. Es importante mencionar también, que bajo ciertas circunstancias es posible realizar publicaciones duplicadas, siempre y cuando las partes (autores y revistas) estén absolutamente de acuerdo. Por comentar un solo ejemplo de los múltiples que hay, un editor de una revista técnica, puede solicitar permiso para publicar un manuscrito ya publicado, al editor de una revista científica. Obviamente, la redacción del manuscrito para

Manuscrito dublicado o redundante: conducta impropia

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las condiciones de la revista técnica deberá ser modificada, teniendo en cuenta el público para el cual está dirigida. En cualquier caso, creemos que estos permisos deberán estar plenamente sustentados, oficializados y firmados por los interesados. Con relación al oficio de editor, estas malas prácticas hacen perder dinero, tiempo y recursos de toda índole durante el proceso de sometimiento de un manuscrito, que dicho sea de paso; siempre es largo y desgastante para las partes. Además, también involucra a los pares, quienes realizan dicha labor solo por convicción, formación y colaboración académica, pues cuando mucho, reciben una mención de agradecimientos al final de cada número de la revista, habiendo invertido un valioso tiempo y esfuerzo que francamente agradecemos y valoramos, pero que para los infractores, no tiene valor alguno. Realmente, es una falta de respeto y consideración proponer para posible publicación un manuscrito duplicado o “seriado” como hemos querido llamarlo nosotros, pues con esta denominación, incluimos aquellos que superan la barrera de la duplicación. En un país que parece haberse acostumbrado en la última década a ver actos de corrupción y faltas a la ética, la academia no puede seguir ese rumbo equivocado de ausencia de valores, de vida fácil y de menor esfuerzo para alcanzar lo que se quiere. Queremos finalizar este editorial, evocando uno de los tantos proverbios populares: no basta parecerlo, hay que serlo. Marco González T. M.Sc.

Salim Mattar V. Ph.D.

REFERENCIAS 1. UNESCO. Guía para la redacción de artículos científicos destinados a la publicación. 2 ed. París: UNESCO, 1983. URL Disponible en: http://unesdoc.unesco. org/images/0005/000557/055778SB.pdf 2. Documento Guía. Servicio Permanente de Indexación de Revistas de Ciencia, Tecnología e Innovación Colombianas Base Bibliográfica Nacional – BBN. Índice Bibliográfico Nacional Publindex – IBN. Bogotá: Colciencias, Publindex. URL Disponible en: http://201.234.78.173:8084/publindex/ docs/informacionCompleta.pdf 3. Sancho R. Publicación duplicada: [En línea]. Instituto de Estudios documentales sobre Ciencia y Tecnología – IEDCYT-CSIC. 2008 URL disponible en: http://www. Madrimasd.org/informacionIdi/análisis/ análisis/análisis.asp?id=36354 4. Estilo de Vancouver. Requisitos de Uniformidad para Manuscritos enviados a Revistas Biomédicas. URL Disponible en: http://www. fisterra.com/herramientas/recursos/ vancouver/#CUESTIONESPREVIAS

5. International Committeee of Medical Journals Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to biomedical journals: Writing and editing for biomedical publication [documento en Internet]. Vancouver: ICMJE; 2008 [consultado: 5-04-2012]. URL Disponible en: http:// www.metodo.uab.cat/docs/Requisitos_ de_Uniformidad.pdf 6. Cho BK, Rosenfeldt F, Turina MI, Karp RB, Ferguson TB, Bodnar E, et al. Joint statement on redundant (duplicate) publication by editors of the undersigned cardiothoracic journals. Ann Thorac Surg 2000; 69:663. 7.

World Association of Medical Editors. World Association of Medical Editors (WAME) recommendations on publication ethics policies for medical journals. Arch Med Res 2004; 35(4):361-67.

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Protozoan and metazoan parasites of Nile tilapia Oreochromis niloticus cultured in Brazil Parásitos protozoarios y metazoarios de la tilapia del Nilo Oreochromis niloticus criadas en Brasil Wanderson Pantoja MF,1 Fishing Engineer, Ligia Neves R,1 Fishing Engineer, Márcia Dias RD,1,2 Biologist, Renata Marinho GB,1,2 Zoo Technician, Daniel Montagner,1 M.Sc, Marcos Tavares-Dias,1* Ph.D. 1Embrapa Amapá, Laboratório de Aquicultura e Pesca, Macapá, AP, Brasil. 2Universidade Federal

do Amapá (UNIFAP), Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical, Macapá, AP, Brasil. Correspondence: marcostavares@cpafap.embrapa.br Recibido: Marzo de 2011; Aceptado Diciembre de 2011.

ABSTRACT Objective. This study describes the parasitic fauna and relative condition factor (Kn) in Nile tilapia Oreochromis niloticus L. (Cichlidae) from fish farms in the State of Amapá. Material and methods. 123 fish from four fish farms in the state of Amapá, Brazil were necropsied for parasitological and Kn analysis. Results. 64.2% of the examined fish, had the gills infected with Cichlidogyrus tilapiae Paperna, 1960 (Monogenoidea: Dactylogyridae); Ichthyophthirius multifiliis Fouquet, 1876 (Protozoa: Ciliophora), Trichodina Ehrenberg, 1830 and Paratrichodina africana Kazubski & El-Tantawy, 1986 (Protozoa: Trichodinidae). The highest prevalence found corresponded to Monogenoidea C. tilapiae while the lowest corresponded to Trichodinidae. However, I. multifiliis was the parasite that presented the greatest intensity and abundance. The differences found in the infection rates of the different fish farms due to causes further discussed. The parasitism did not influence the relative condition factor (Kn) of fish. This was the first record of P. africana in Brazil and occurred in the Eastern Amazon. Conclusions. In Brazil, Lamproglena sp. is an emerging parasite in the Southern and Southeastern regions, but this crustacean was not found in the Nile tilapia in the State of Amapá. The parasitic infections in Nile tilapia farmed in Brazil are caused by protozoan, monogenoidea, crustacea and digenea species, and the regional differences on their prevalence and intensity rates are discussed in this study. Key words: Freshwater fishes, parasites, prevalence, Oreochromis niloticus (Source: CAB).

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Pantoja - Protozoan and metazoan parasites of Nile tilapia

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RESUMEM Objetivo. Describir la parasitofauna y el factor de condición relativa (Kn) de la tilapia del Nilo Oreochromis niloticus L. (Cichlidae) en granjas piscícolas del estado de Amapá. Materiales y métodos. 123 peces, de cuatro granjas piscícolas del Estado del Amapá, Brasil, fueron necropciados para realizarles un análisis parasitólogico y el análisis Kn. Resultados. De los peces examinados, 64.2% estaban con las branquias infectadas por Cichlidogyrus tilapiae Paperna, 1960 (Monogenoidea: Dactylogyridae), Ichthyophthirius multifiliis Fouquet, 1876 (Protozoa: Ciliophora), Trichodina Ehrenberg, 1830 y Paratrichodina africana Kazubski & El-Tantawy, 1986 (Protozoa: Trichodinidae). La mayor prevalencia fue de Monogenoidea C. tilapiae, mientras que la menor fue de los parásitos Trichodinidae. Sin embargo, I. multifiliis fue el parásito que mostró la mayor intensidad y abundancia. Las diferencias encontradas estuvieron en las tasas de infección parasitaria de diferentes granjas piscícolas debido a las causas aquí discutidas. El parasitismo no influenció el factor de condición relativa (Kn). Este fue el primer registro de P. africana para el Brasil, en la Amazonía Oriental. Conclusiones. En el Brasil, Lamproglena sp es un parásito emergente en las regiones del Sur y Suroeste, pero este crustáceo no fue encontrado en la tilapia del Nilo del Estado de Amapá. En la tilapia del Nilo criada en el Brasil, las infecciones parasitarías son causadas por especies de protozoarios, monogenoideas, crustáceos y digenéticos; las diferencias regionales en las tasa de prevalencia e intensidad son discutidas aquí. Palabras clave: Parásitos, peces de agua dulce, prevalencia, Oreochromis niloticus (Fuente:CAB).

INTRODUCTION The freshwater aquaculture in Brazil has been growing, driven especially by fish farming, which represents the bulk of the domestic production. The Nile tilapia Oreochromis niloticus is the species making the greatest contribution to the growth of this production, representing 39% of all fish from freshwater fish farming (1). Culture of this fish occurs mainly in the Northeastern, Southern, Midwestern and Southeastern areas, but the largest production is found in the Northeast (1). This production at high stocking densities is done mainly in tanks, besides ponds. In northern Brazil, the production of Nile tilapia is small, since it is cultured only in the States of Rondônia, Acre, Pará and Amapá. In the state of Amapá, the Nile tilapia was introduced in the early 90’s by the former Aquiap (Aquaculturers of Amapá Association). The choice for the cultivation of this non-native fish in the state of Amapá was due to its rapid reproduction rate which allows the quick replenishment of the tanks of the pirarucu Arapaima gigas. Thus, the production of the Nile tilapia grew from 2004 to 2007, going from 10 to 30 tons (1). The fish live in balance with the parasites, but this balance can be broken, mainly by environmental disturbances, among which the changes in the water quality have a relevant role (2,3), as well as inadequate management and high stocking densities of fish (3,4). Therefore, in systems of intensive culture, problems of infections caused by protozoan and metazoan are quite frequent. Protozoan parasites are

common in farmed fish and can cause economic losses in fish farms. Metazoan are parasites that can cause gill infections, damage to eyes and internal organs, starvation, inflammation of the swim bladder, and inhibited oxygen exchange across gill lamella. They provide portals of entry for bacteria in fish. Therefore, these parasites can be limiting factors for the development of fish farm as they cause low growth of fish and diseases, reducing profitability and increasing the costs of production due to treatments. Thus, epidemiological studies in fish farms are important for adapting the management techniques and providing sanitary guidelines. In Brazil, the parasitic fauna in Nile tilapia has been studied primarily in fish farms in the states of São Paulo, Santa Catarina and Paraná, but the information are scattered in the literature. In addition, there is no information about the parasitic fauna in this cichlid cultured in the North, so some important issues remain open. Thus, the objectives of this study were to determine the prevalence rate and mean intensity of protozoan and metazoan parasites, as well as the condition factor in O. niloticus cultured in the State of Amapá (Northern region).

MATERIAL AND METHODS Study site. Specimens of Nile tilapia were collected from August 2009 to March 2010 in four fish farms in the city of Macapá, state of Amapá (Brazil) for parasitological analysis.

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Conservation fishes. In ponds of different sizes, the fish were maintained with an artificial diet and ignored stocking density, since they were not sexually reversed. Parasitological analysis. All fish were collected with net, weighed (g) and measured (cm). Then, they were necropsied for parasitological analysis. Each specimen had its mouth, opercula, gills and gastrointestinal tract examined. The methodology used for collection, fixation and quantification of parasites followed previous recommendations (5,6). Identification of parasites was done in accordance to suggestions from the literature (7-9). The ecological terms were according to Bush et al (10) and Rhode et al (11). Data analysis. With the weight and total length data, the relative condition factor (Kn) of the parasitized and non-parasitized fish was determined. The differences between parasitized and non-parasitized fish were compared through the test t (p<0.05). Spearman’s rank (rs) correlation coefficient was used to determine possible correlations between the total length and weight of the hosts and the number of parasites. At each fish collection, the potential for hydrogen (pH), the temperature and dissolved oxygen concentration (DO) of the nurseries were measured with digital (YSI) equipments, respectively.

RESULTS The temperature and the pH of ponds water were similar; however, the dissolved oxygen levels were lower in the fish farm 2 and 3 (Figure 1). A total of 123 Nile tilapia were examined in four fish farms in Macapá (State of Amapá) and weigh and total length mean ± standard deviation are described on Table 1. In the four fish farms, 64.2% of fish were parasitized by one or more parasites (Table 1), such as: Ichthyophthirius multifiliis Fouquet, 1876 (Protozoa), Paratrichodina africana Kazubski & El-Tantawy, 1986 (Protozoa: Trichodinidae), Trichodina

Figure 1. Physicochemical parameters of water quality in ponds from four fish farms in the State of Amapá.

Ehrenberg, 1830 (Protozoa: Trichodinidae) and Cichlidogyrus tilapiae Paperna, 1960 (Monogenoidea: Dactylogyridae). The highest prevalence of parasitic infection was observed in the fish farm 2 and the lowest prevalence in the fish farm 4. In the other fish farms (1 and 3) there was not a significant difference in the prevalence, which was of 73.6% and 76.0% respectively (Table 1). Infections by I. multifiliis were observed in Nile tilapia cultured in three of the four fish farms investigated. However, the lowest rates of parasitism occurred in the fish farm 1 and the highest in the fish farm 3. The rates of infection by Trichodinidae were similar in the three fish

Table 1. Mean values ± standard deviation of weigh and total length of Nile tilapia collected in four fish farms from the state of Amapá. EF: examined fish; PF: parasitized fish, P: Prevalence. Fish farms

Geographic coordinates

Weight (g)

Length (cm)

P (%)

0°02’31.4”S, 051°07’34.4”W

44.0 ± 31.7

12.6 ± 2.7

73.6

0°00’58.1”S, 051°06’31.8”W

51.1 ± 44.9

12.9 ± 3.7

90.6

0°00’36.8”S, 051°06’13.7”W

135.8 ± 36.7

19.1± 2.0

76.0

0°00’04.5”N, 051°05’52.1”W

55.2 ± 68.8

12.6 ± 4.2

10.7

Total

123

64.2

Pantoja - Protozoan and metazoan parasites of Nile tilapia

2815

Table 2. Parasitological indices of Ichthyophthirius multifiliis and Trichodinidae on the gills of Nile tilapia from four fish farms from the state of Amapá. Parasites Fish farms EF PF

Ichthyophthirius multifiliis

Trichodinidae

34.2

53.1

76.0

7.9

3.1

4.0

700.8

7183.9

75.198,4

1957.3

6800

9894

239.7

3816.5

57.150,8

1545

206.1

395.7

Range

1202550

4.10014.800

13.108282.785

7353180

TNP

9110

122.127

1.428.770

5872

P (%)

EF: examined fish; PF:parasitized fish; P:Prevalence; MI:Mean intensity of infection; MA:Mean abundance; TNP:Total number of parasites.

farms in which there was parasitism (Table 2) and two species were identified. P. Africana was found in the fish farm 1 and Trichodina sp. was found in the fish farms 2 and 3. In tilapia from the fish farms 3 and 4, infection rates for C. tilapiae were lower than the ones from the fish farms 1 and 2 (Table 3). Table 3. Parasitological indices of Cichlidogyrus tilapiae on the gills of Nile tilapia from four fish farms in the state of Amapá. 1

Fish farms

P (%)

73.7

68.7

8.0

10.7

12.3

7.6

3.5

11.0

9.0

5.2

0.28

1.2

Range

2-51

3-17

1-6

4-23

TNP

343

168

EF:examined fish; PF:parasitized fish; P:Prevalence; MI:Mean intensity of infection; MA:Mean abundance; TNP:Total number of parasites.

The Protozoan I. multifiliis was the parasite with the greatest abundance and relative dominance (Table 4) and it showed a positive correlation with the weigh and length of O. niloticus (Figure 2). Table 4. Total parasitological indices in Nile tilapia in the state of Amapá. C. tilapiae

I. multifiliis

Trichodinidae

Parasites

123

P (%)

44.7

39.8

4.1

10.0

31.836,9

4513.2

4.5

12.683

183.5

TNP

551

1.560,007

22.566

MRD

0.0003

0.9854

0.01425

EF: examined fish; PF: parasitized fish; P: Prevalence; MI: Mean intensity of infection; MA: Mean abundance; TNP: Total number of parasites; MRD: Mean relative dominance.

Figure 2. Intensity ratio of Ichthyophthirius multifiliis with the total length and weigh in Nile tilapia (N=48) cultured in the state of Amapá.

On the other hand, Trichodinidae P. africana and Trichodina sp. were the less prevalent parasites and showed a higher relative dominance when compared to C. tilapiae (Table 4). Kn of parasitized (0.999±0.012) and nonparasitized (1.00±0.03) O. niloticus showed no significant difference (p=0.676).

DISCUSSION In Brazil, Trichodinidae are the most common protozoan affecting cultivated Nile tilapia, especially in the South where their culture has been intensified (Table 5). However, few species are described in Brazil, since in general, they are described as Trichodina sp (3,5,12-23). These parasites are important agents causing diseases in Nile tilapia and most Trichodinidae species do not show host specificity (24). In Nile tilapia grown in Bangladesh, Trichodinidae were the most frequent parasites, with a prevalence ranging from 24.2–90.2%, depending on the fish farm and the time of the year. In addition, the high prevalence proved to be correlated with the high stocking density of fish and with the physicochemical parameters of the water (2). Therefore, these results indicate the aggregate pattern of distribution of the Trichodinidae, causing these high prevalence rates when fish are kept in high stocking densities during culture.

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Table 5. Parasites of Nile tilapia cultured in different Brazilian states. Group/Species

Culture/State

Prevalence (%)

Mean Intensity

References

I. multifilis

Feefishing (SP)

4.0

76.0

I. multifilis

Net cage (SP)

3.2

I. multifilis

Fish farm and Feefishing (PR)

21.3-25.0

I. multifilis

Feefishing (PR)

1.8-2.5

I. multifilis

Fish farm (PR)

26.0

Trichodina sp.

Feefishing (PR)

15.8-18.3

Trichodina sp.

Fish farm (PR)

43.0

Trichodina sp.

Fish farm (PR)

62.5-72.5

Trichodina sp.

Fish farm (PR)

17.0-72.0

Trichodina sp.

Net cage (PR)

13.3-50.0

Trichodinidae

Net cage (PR)

13.9-17.4

Trichodina sp.

Net cage (SP)

24.0-38.1

Trichodina sp.

Fish farm (SP)

8.0

243

Trichodina sp.

Feefishing (SC)

1.6

Trichodina magna

Fish farm (SC)

24.7

Trichodina compacta

Fish farm (SC)

24.7

T. compacta and T. magna

Fish farm (SC)

10.0-51.0

55.1-621.9

T. compacta and T. magna

Fish farm (SC)

81.0

T. compacta and T. magna

Fish farm and Feefishing (SC)

0.6-1.7

Fish farm (RJ)

12.8

1.1

Net cage (SP)

52.8-83.3

65.6-112.8

Fish farm (SP)

6.7-43.8

3.6-7.3

PROTOZOA

MONOGENOIDEA Cichlidogyrus sp. Dactylogyrus sp. Cichlidogyrus sclerosus Cichlidogyrus sp.

and

Dactylogyridae

Fish farm (PR)

3.3-10.0

Dactylogyridae

Feefishing (PR)

25.8-53.3

Dactylogyrus sp.

Fish farm (PR)

49.0

0.8

Gyrodactylogyridae

Feefishing (PR)

0.8

Cichlidogyrus sp. and C. sclerosus

Feefishing (SC)

13.3

4.2

Cichlidogyrus sp., C. sclerosus and Gyrodactylus sp.

Fish farm (SC)

28.0-83

1.3-34.5

Cichlidogyrus sp., C. sclerosus and Gyrodactylus

Fish farm (SC)

76.0

Cichlidogyrus sp. and C. sclerosus

Feefishing (SC)

13.2-16.5

0.8-2.6

Clinostomum complamatum

Fish farm (RS)

100

Diplostomum sp.

Net cage (SP)

4.8

Ergasilidae

Fish farm (SP)

18.0

3.4

Ergasilus sp.

Fish farm (RJ)

18.2

2.0

Lamproglena sp.

Fish farm (RJ)

60.0

3.4

Lamproglena sp.

Fish farm (SP)

67.4

5.2

Lamproglena sp.

Feefishing (SC)

3.3

1.5

Lamproglena sp.

Fish farm (SC)

3.0-22.0

0.3-0.8

Lamproglena sp.

Fish farm (SC)

9.0

Lamproglena sp.

Fish farm (SC)

0.5-1.7

0.1-0.2

Argulus spinulosus

Fish farm (SC)

33.0

1.7

Dolops carvalhoi

Net cage (SP)

1.6

DIGENEA

CRUSTACEA

Pantoja - Protozoan and metazoan parasites of Nile tilapia Several species of Trichodinidae are distributed worldwide due to the transcontinental introduction of fish (24). Martins & Ghiraldelli (22) mention that the Trichodina, Trichodinella and Paratrichodina have been described parasitizing tilapia. Trichodina compacta is common in the skin and gills of several families of freshwater fish from Africa, Taiwan and Philippines, but it has a clear preference for Cichlid species (24). Paratrichodina africana occurs in 100% of tilapia from Lake Vitoria in Kenya and in 64.7% of tilapia from the Nile Delta in Egypt (8,9). In tilapia O. niloticus from three fish farms in the state of Amapá, rates of infection by Trichodina sp. and P. Africana were similar. However, the prevalence was lower than that reported for the same host grown in other regions of Brazil, while the intensity was higher (Table 5). Trichodinidae reproduction is favored by the excess of organic matter in the culture ponds (3,21,22) and by the high temperatures (2,3) such as the ones that occur in the region of this study. Ichthyophthirius multifiliis is one of the biggest responsible for significant economic losses in fish farms worldwide (28). In Nile tilapia reared in several localities in Brazil, it is the second protozoan causing infections (Table 5), which proves its great adaption also in tropical areas. In the gills of O. niloticus cultivated in the State of Amapá, the intensity of I. multifiliis was positively correlated with weigh and length, which indicates an increase of parasitism according to the growth of fish. An increase in the number of parasites is due to cumulative process since the gills increase their surface area in proportion to an increase in fish growth (25). There is a proportional increase in habitat for reproduction of this protozoan. The ichthyophthiriasis often manifests itself after handling operations during cold seasons and in other stressful situations (5). High rates of infections by I. multifiliis were found in tilapia from three fish farms in the state of Amapá, in the eastern Amazon, where temperatures are higher and more constant than in other Brazilian regions. However differences in the abundance and prevalence for the same host in different regions may be due to the balance between the host immune system and the performance of the parasite. Monogenoidea is the main metazoan parasite infecting cultured tilapia in Brazil, mainly Cichlidogyrus Paperna, 1960 (Table 5). However there are few records of mortality caused by severe infections in cichlid fish. These parasites have been responsible for 80.0% of the infections in Nile tilapia grown in the state of Santa Catarina; 40.0% in the ones grown in the state of São Paulo and 16.0% in the ones grown in the state of Paraná (29).

2817

Parasitism by C. tilapiae was high only in tilapia from two of the investigated fish farms. However the indices were similar to the ones described for this same host grown in the southern Brazil (Table 5). Banu & Khan (2) have demonstrated that in tilapia grown in Bangladesh, Monogenoidea was the second most frequent parasite throughout the year and that their prevalence was correlated with the physicochemical parameters of the water. In a polluted environment, there is a decrease in the abundance of Cichlidogyrus sclerosus, as well as in the immunological resistance of tilapia, thereby increasing the persistence of this infection. Therefore, in tropical environments, this parasite and its host are useful bio indicators of the impact of environmental quality (30). Nevertheless, the severity of the disease also depends on the pathogenicity of the Monogenoidea species (3) and the nutritional conditions of the host. In Nile tilapia from the states of São Paulo, Rio de Janeiro and Santa Catarina (Brazil), the emerging parasite Lamproglena sp. (Table 5) has been found since 2000. In the southeast, this crustacean parasite has arisen with the intensification in tilapia culture in cages. However, Lamproglena sp. has not been reported in the Brazilian Amazon, including the state of Amapá. Besides, other parasites have been known to infect this cichlid species in Brazil (Table 5). In Brazil, the diversity of digenean and other crustacean parasitizing Nile tilapia is low (Table 5), but it has also acquired parasites common in native fish, such as o Clinostomum sp., Diplostomum sp., Ergasilus sp., Argulus spinulosus and Dolops carvalhoi. In conclusion, this study highlights that the diversity of parasites reported for O. niloticus grown in Brazil was higher than the one found in the state of Amapá, probably due to differences in size and age of fish, water quality, management and culture system for each fish farm. In Brazil, the parasitic fauna in tilapia is composed by protozoans, monogenoideans, crustaceans and digeneans. However, Trichodinidae are the most frequent protozoan in fish in the south and southeast, while I. multifiliis was more abundant in the state of Amapá, in the north. This was the first report of P. africana in O. niloticus in the eastern Amazon, what broadens its distribution and confirms the presence of this protozoan in Brazil. Acknowledgements We are grateful to CNPq by financial support (grants # 578159/2008-2 and 556827/2009-0) and for supporting a fellowship to M. Tavares-Dias (grant # 300472/2008-0).

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Pantoja - Protozoan and metazoan parasites of Nile tilapia

2819

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Rev.MVZ 2820 Córdoba 17(1):2820-2826, REVISTA MVZ CÓRDOBA 2012. • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012 ORIGINAL

Efecto de Debaryomyces hansenii en la respuesta antioxidante de juveniles de camarón blanco Litopenaeus vannamei Effect of Debaryomyces hansenii on the antioxidant response of juvenile white shrimp Litopenaeus vannamei María Pacheco M,1 M.Sc, Ángel Campa C,1 Ph.D, Gabriel Aguirre G,2* Ph.D, Antonio Luna G,3 Ph.D, María Guzmán M,1 Ph.D, Felipe Ascencio,1 Ph.D. 1Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, Mar Bermejo No. 195, Col. Playa Palo de Santa Rita, La Paz, BCS, México. 2Universidad Autónoma de Tamaulipas. Facultad Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Km. 5 Carr. Cd. Victoria - Mante, Cd. Victoria, Tamps, México. 3Centro

Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional-Instituto Politécnico Nacional. Blvd Juan de Dios Bátiz Paredes 250, Guasave, Sin., México. *Correspondencia: gabaguirre@uat. edu.mx. Recibido: Enero de 2011; Aceptado: Agosto de 2011.

RESUMEN Objetivo. Determinar la respuesta antioxidante [actividad de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT)] así como la cuenta total de hemocitos (CTH) y el contenido de proteínas (CP) en camarones (Litopenaeus vannamei) expuestos a diferentes dosis y cepas de la levadura Debaryomyces hansenii (DH5, DH6, LL1), y un inmunoestimulante comercial (LAM). Materiales y métodos. Las levaduras fueron cultivadas y suministradas diariamente en concentraciones diferentes (104 – 106 UFC/ mL) directamente a los tanques de cultivo de los camarones (8 ± 0.2 g) mientras que LAM fue aplicado una vez a la semana (0.5 mg/L). Los organismos fueron mantenidos bajo condiciones de laboratorio (28°C, 35%, 80% de recambio diario de agua, dieta comercial para camarón ad libitum). Los tratamientos fueron distribuidos por duplicado y los resultados evaluados a los 15 días con un análisis de varianza y una prueba de Tukey. Resultados. Se registró un CTH significativo (p<0.05) en los tratamientos con DH6 y LL1 (106 UFC/mL) comparada con el control, mientras que las cepas DH5 y DH6 revelaron un incremento significativo (p<0.05) de CP con la dosis de 104 UFC/mL. Los camarones tratados con LAM incrementaron significativamente (p<0.05) los valores de SOD y CAT. Conclusiones. Los resultados obtenidos demuestran que D. hansenii incrementa la respuesta antioxidante y CTH en camarones. Palabras clave: Debaryomyces hansenii, inmunoestimulación, Litopenaeus vannamei (Source: CAB).

2820

Pacheco - Efecto de Debaryomyces hansenii en la respuesta antioxidante

2821

ABSTRACT Objective. To determine the antioxidant response [superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity], as well as the total haemocyte count (CTH), and protein level (CP) in shrimp Litopenaeus vannamei exposed to different doses and yeast strains of Debaryomyces hansenii (DH5, DH6, LL1), and a commercial immunostimulant (LAM). Materials and methods. The yeast strains were cultured and administered daily directly into the shrimp tanks (8 ± 0.2 g) in different concentrations (104 – 106 CFU/mL), while the LAM was administered weekly (0.5 mg/L). The organisms were kept under laboratory conditions (28°C, 35‰, 80% daily water exchange, commercial diet for shrimp fed ad libitum). Each treatment was twice distributed and the results were evaluated through variance analysis and the Tukey method. Results. A significant THC (p<0.05) was detected for the treatments with DH6 and LL1 (106 CFU /mL) compared to the control group, whereas strains DH5 and DH6 presented a significant increase (p<0.05) in the value of CP for the 104 CFU/mL dose. SOD and CAT values increased significantly (p<0.05) for shrimp exposed to LAM. Conclusions. The results of this study illustrate that D. hansenii increased the antioxidant response, and CTH of shrimp. Key words: Debaryomyces hansenii, immunostimulation, Litopenaeus vannamei (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN Como todo invertebrado, el sistema inmune de los camarones peneidos está mediado por hemocitos (hialinos, granulares y semigranulares) los cuales poseen capacidad citotóxica y de comunicación intercelular, lo que les facilita realizar funciones de reconocimiento de antígenos, coagulación, fagocitosis, melanización, formación de nódulos y encapsulación (1). El sistema inmune de los camarones cuenta también con la presencia de varios efectores plasmáticos (péptidos antimicrobianos, histonas, enzimas lisosomales, proteínas de reconocimiento de glucanos y lipopolisacáridos), sistema profenoloxidasa, y la cascada de coagulación que favorece la destrucción de los patógenos (1,2). Para activar el sistema inmune de los camarones y describir los mecanismos de funcionamiento del mismo se han empleado microorganismos y/o sus derivados (ß-glucano, laminarina, lipopolisacáridos, y péptidoglucanos) (3). El suministro de estos productos incluido en el alimento o aplicados en forma directa (inyección, inmersión, bio-encapsulación, o intubación) sugiere que pueden ser usados como una medida de protección en contra de los patógenos que afectan al camarón (4). Levaduras como Candida sake, C. tropicalis, Debaryomyces hansenii, Rhodotorula rubra, R. glutinis, Saccharomyces cerevisiae, y Schizophyllum commune han sido empleadas como activadores del sistema inmune del camarón (Fenneropenaeus indicus, Penaeus monodon) y peces (Channa striata, Sparus aurata) en contra de agentes patógenos.

Miles et al (5) observó que los bio-productos derivados de levadura mejoran la respuesta inmunológica de Ch. striata en contra de Aphanomyces invadans (A. piscicida) causante del síndrome epizoótico ulcerativo en estos peces. Los organismos alimentados o expuestos a las levaduras y/o sus derivados fueron menos susceptibles a bacterias oportunistas y virus y además presentaron una mejor supervivencia y crecimiento. Esto resultados sugieren la posibilidad de usar estos microorganismos como inmuno-estimulantes y fuente de bio-productos empleados para ese fin (6-9). En los crustáceos, muchos mecanismos de defensa celulares dependen de la producción controlada de radicales libres (10), como respuesta al estrés oxidativo, en donde el metabolismo aerobio de los crustáceos genera sustancias reactivas al oxígeno que son eliminadas por un sistema de defensa antioxidante que incluye a las enzimas superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y peroxidasa (10,11). Estos metabolitos también están involucrados en el control de agentes patógenos, como en la fagocitosis de Vibrio harveyi que desencadena un incremento de la SOD (10, 12). Reyes-Becerril et al (7) proporcionaron a cabrilla sardinera (Mycteroperca rosacea) una dieta enriquecida con D. hansenii (106 UFC/g) para estimular su respuesta inmune durante el cultivo de este organismo en un medio con dinoflagelados patógenos (Amyloodinium ocellatum). Los organismos alimentados con esta dieta presentaron una sobrevivencia significativa mayor comparada con el grupo control, mostrando además niveles

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significativos en la actividad de la enzima SOD y una relación importante de este parámetro con la actividad de la enzima CAT. En S. aurata también aumentó la actividad de la SOD al ser alimentados con una dieta enriquecida con D. hansenii (106 UFC/g)(8). El objetivo del presente trabajo fue determinar la respuesta antioxidante [actividad de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT)] así como la cuenta total de hemocitos (CTH) y el contenido de proteínas (CP) en camarones (Litopenaeus vannamei) expuestos a diferentes dosis y cepas de la levadura Debaryomyces hansenii (DH5, DH6, LL1), y un inmunoestimulante comercial (LAM).

MATERIALES Y MÉTODOS Cepas de microorganismos e inmunoestimulantes. Las tres cepas experimentales fueron obtenidas de la colección de levaduras del Centro Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR). Dos de las cepas utilizadas fueron aisladas del medio marino [Debaryomyces hansenii (DH5 y DH6)] y la otra de cítricos [D. hansenii (LL1)]. Previo a los bioensayos, las cepas mantenidas por crio-conservación (-80°C) fueron descongeladas y cultivadas en placas con agar YPD (2% dextrosa, 2% peptona, 1% extracto de levadura, 2% agar) a 30°C por 24 h. Las colonias fueron extraídas del agar y suspendidas en tubo de ensayo con 10 mL de agua de mar estéril (filtrada con filtros con retención de partículas poro de 0.2 µm), la suspensión de levaduras fue concentrada hasta alcanzar una absorbancia de 1.0 a una densidad óptica de 540 nm (colorímetro, Linson 3) equivalente a 1x109 UFC/mL. Además, se empleó laminarina (LAM) extraída de la macroalga Laminaria digitata (Sigma, L-9634) como inmunoestimulante comercial. Bioensayos. Se usaron dos lotes de camarones juveniles de L. vannamei (8±0.2 g) provenientes del laboratorio de larvicultura del CIBNOR. Los organismos fueron aclimatados durante 15 días en tanques de fibra de vidrio de 1500 L con agua de mar filtrada (5 μm) a 28°C y aireación continua. Los camarones fueron alimentados ad libitum mañana y tarde (9:00 y 17:00 h) diariamente con una dieta comercial (PIASA, 35% de proteína). El primer bioensayo tuvo una duración de 15 días. Los organismos experimentales fueron seleccionados al azar y distribuidos en tinas de fibra de vidrio de 60 L (7 camarones/tina) con agua de mar filtrada (5 µm) a 28°C y aireación constante. Los tratamientos se hicieron por

duplicado. La alimentación diaria fue ad libitum con la dieta comercial y horario antes señalados (13). Mediante sifoneo se eliminó diariamente la materia particulada del fondo de las tinas, recuperando enseguida el volumen de agua perdido (80%). La temperatura del agua se registró diariamente a la misma hora. Además, los organismos estuvieron sujetos a fotoperiodo natural. Los inmunoestimulantes se inocularon en el agua del sistema de cultivo de acuerdo con los siguientes tratamientos: 1) Control, sin tratamientos; 2 y 3) DH5 (1x104, y 1x106 UFC/mL, respectivamente); 4 y 5) DH6 (1x104, y 1x106 UFC/mL, respectivamente); 6) LAM (0.20 mg/mL). Las dosis de levaduras suministradas estuvieron de acuerdo a las reportadas por Reyes-Becerril et al (7). Las dosis de laminarina se basaron en el trabajo de Campa-Córdova et al (11). La inoculación de los tratamientos en el agua de cultivo se repitió después de cada recambio. El segundo experimento tuvo la misma duración y condiciones de cultivo que se señalaron en el primer bioensayo. Los tratamientos utilizados fueron los siguientes: 1) Control, sin inmunoestimulante; 2, 3, y 4) LL1 (1x104, 1x105 y 1x106 UFC/mL respectivamente); 5) LAM (0.20 mg/mL) adicionada cada siete días. Extracción de la hemolinfa. La hemolinfa se obtuvo en el periodo de intermuda y se extrajo con jeringas para insulina (27 G x 13 mm) a partir de la región ventral del primer segmento abdominal. La jeringa se cargó con una solución isotónica para camarón y EDTA como anticoagulante (SIC- EDTA-Na2) (NaCl 450 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EDTA-Na2 10 mM, pH 7.3, 850 mOsm/kg) previamente enfriada a 4°C (15, 16) en una proporción 2:1 (2 volúmenes de SIC-EDTA por cada volumen extraído de hemolinfa) (11). Conteo total de hemocitos (CTH). El CTH se realizó conforme a la técnica descrita por Campa-Córdova et al (11) en donde se aplican 400 µL (1:4) de formaldehido al 4% a 100 µL de hemolinfa con anticoagulante. Los hemocitos se cuantificaron en una cámara Neubauer, utilizando un microscopio óptico (400x). Cuantificación de proteína (CP). La CP en los hemocitos provenientes de la hemolinfa (mg/mL) se determinó en un lector de placa y una prueba de micro-determinación de proteína (Bio-Rad, USDA) realizándose la lectura a una longitud de onda de 595 nm (8). Se efectuó una curva a partir de los reactivos estándares que posee la prueba antes señalada.

Pacheco - Efecto de Debaryomyces hansenii en la respuesta antioxidante Actividad de la superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT). La SOD se determinó por el método descrito por ReyesBecerril et al (7,8); Campa-Córdova et al (11). Se utilizó NBT en presencia de riboflavina. Se colocaron 10 µL v/v de hemolinfa y buffer fosfato de potasio (50 mM, pH 7.8) con 200 µL de la mezcla de reacción (0.1 mM EDTA, 13 µM metionina, 0.75 mM NBT, 20 µM riboflavina, 50 mM buffer de fosfato, pH 7.8). Esta solución fue expuesta a luz fluorescente (1 min) o cuando el control lograra una densidad óptica de 0.2-0.25 a 570 nm. La actividad CAT se evaluó con una prueba comercial (Sigma, C-9284). El método determina el decremento de la concentración de peróxido de hidrógeno a una longitud de onda de 240 nm y un coeficiente de extinción de 40/M/cm. Se consideró que una unidad de CAT descompone 1 μmol de H2O2/min en 50 mM de buffer fosfato a pH 7 ajustando la absorbancia de la solución a 0.5±0.01. La actividad de CAT fue expresada en términos de unidades (μmoles de substrato transformado a producto/min) por miligramo de proteína.

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RESULTADOS Conteo total de hemocitos (CTH). El CTH obtenido en el presente trabajo tras la aplicación de las diferentes cepas y dosis de levaduras se observa en las tablas 1 y 2. Se detectó un incremento significativo (p<0.05) en los tratamientos con la dosis de 1x106 UFC/mL de las cepas DH6 (14x106 hemocitos/mL) y LL1 (6x106 hemocitos/mL) en comparación con los grupos controles (3-4x106 hemocitos/mL). La laminarina y demás dosis de levadura no generaron incrementos significativos de CTH comparados con sus respectivos grupos control (Tabla 1 y 2). Cuantificación de proteína (CP). El contenido de proteína de los hemocitos provenientes de juveniles de L. vannamei expuestos a la dosis de 1x104 UFC/mL de D. hansenii de origen marino (DH5 y DH6) reveló valores significativamente mayores (p<0.05) que el grupo control (Tabla 1). Los camarones expuestos a la cepa LL1 revelaron fluctuaciones de proteína en los hemocitos en sus diferentes dosis de aplicación, sin diferencias significativas con su respectivo grupo control (Tabla 2).

Análisis estadístico. Los resultados obtenidos fueron analizados por medio de un análisis de varianza (ANOVA) de una vía para detectar diferencias entre tratamientos (p<0.05). Se realizó la prueba de Tukey (HSD) para identificar diferencias (p<0.05), usando el software Statistica (Versión 6.0).

Actividad de la superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT). La actividad SOD en hemocitos de L. vannamei expuestos a la laminarina en el bioensayo 1 revela valores significativamente superiores comparados con el grupo control (Tabla 1). Contrariamente, los organismos expuestos la dosis de 1x104 UFC/mL de DH5 mostraron valores significativos inferiores

Tabla 1. Número de hemocitos, contenido de proteína, actividad superóxido dismutasa (SOD) y catalasa en juveniles de camarón blanco L. vannamei expuestos a diferentes cepas y dosis de D. hansenii o inmunoestimulante comercial.

Tabla 2. Número de hemocitos, contenido de proteína, actividad superóxido dismutasa (SOD) y catalasa en juveniles de camarón blanco L. vannamei expuestos a diferentes cepas y dosis de D. hansenii o inmunoestimulante comercial. Bioensayo 2

Bioensayo 1 Conteo de hemocitos (1 x 106 cel/ml)

Contenido de proteína (mg/ml)

Actividad de SOD (U/mg)

Actividad catalasa (U/mg)

Control

5.10 ±0.30

1.70 ±0.09

35.29 ±1.75

3087.30 ±197.33

DHA

7.59 ±1.37

3.30 ±0.21*

23.89 ±2.06*

1920.38 ±89.28*

DHB

7.54 ±1.21

2.21 ±0.37

31.00 ±3.91

2674.02 ±372.27

DHC

5.95 ±0.16

2.34 ±0.14*

30.34 ±4.06

2697.79 ±386.80

DHD

13.14 ±1.75*

1.86 ±0.14

29.33 ±8.12

2677.34 ±258.01

7.40 ±1.05

1.33 ±0.26

45.86 ±3.43*

3980.32 ±346.32*

Laminarina

Bioensayo 1 = DH5 y DH6 (104 o 106 UFC/mL) y Laminarina (0.05 mg/L). (*) denota diferencias significativas respecto al control (p<0.05).

Conteo de hemocitos (1 x 106 cel/ml)

Contenido de proteína (mg/ml)

Actividad de SOD (U/mg)

Actividad catalasa (U/mg)

Control

3.00 ±0.52

3.03 ±0.51

11.90 ±7.59

1635.77 ±291.91

LL1(104)

2.36 ±0.41

2.24 ±0.83

17.99 ±2.76

1018.36 ±600.69

LL1(105)

3.46 ±0.65

3.57 ±0.61

12.47 ±6.09

1381.99 ±207.50

LL1(106)

6.04 ±1.18*

2.57 ±0.06

14.32 ±1.00

2357.34 ±13.19*

2.37 ±0.53

2.43 ±0.12

13.20 ±5.34

2032.70 ±151.80

Laminarina

Bioensayo 2 = LL1 (104, 105, o 106 UFC/mL) y Laminarina: (0.05 mg/L). (*) denota diferencias significativas respecto al control (p<0.05).

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(p<0.05) comparados con el grupo control (Tabla 1). La cepa LL1 no generó diferencias significativas en la actividad SOD respecto al grupo control, presentando valores promedios desde 12±5 a 18±3 U/mg (Tabla 2). La actividad CAT proveniente de los hemocitos de L. vannamei del bioensayo 1 mostraron un patrón similar al observado en la actividad de SOD, registrando un incremento significativo en los camarones tratados con LAM (Tabla 1). La actividad de CAT obtenida de hemocitos de L. vannamei expuestos a la cepa LL1 revelan diferencia significativa (p<0.05) al ser expuestos a la dosis de 1x106 UFC/mL con respecto al grupo control (Tabla 2).

DISCUSIÓN La aplicación de levaduras en acuicultura se ha incrementado en los últimos años debido a su potencial benéfico (14). Tovar et al (15) reportaron que la incorporación del 1.1% de D. hansenii (cepa CBS 8339) en la dieta de larvas del pez Dicentrarcus labrax, incrementó en un 10% la supervivencia, duplicó el peso respecto al grupo control y redujo la proporción de malformaciones. Yang et al (14) observaron un incremento significativo en peso y supervivencia en juveniles de L. vannamei al ser alimentados con la levadura Rhodosporidium paludigenum incluida en la dieta al 1%. Shupantharika et al (16) reportaron un aumento significativo en la actividad fenoloxidasa en hemocitos de P. monodon, tratado con β-glucano extraído de levadura de cerveza. En el presente estudio, el suministro de la levadura marina D. hansenii vía inmersión a una dosis de 1x106 UFC/mL generó un incremento de hemocitos circulantes, lo cual es considerado como un posible aumento en la capacidad de respuesta inmune del camarón en contra de virus y bacterias (17). Sajeevan et al (13) observaron que las células completas de levaduras proporcionaron a F. indicus un mayor CTH al usar productos purificados (glucanos) en su dieta. Esto sugiere que las células completas de levaduras pueden tener otros elementos que fortalezcan la respuesta inmune (aminoácidos, vitaminas, minerales, etc.). Otros trabajos reportan concentraciones similares que han demostrado el beneficio de los probióticos (17,18). Sin embargo, se ha detectado que el CTH en crustáceos puede presentar variaciones importantes (19). Además, de que puede ser alterado por estrés, enfermedades y medio ambiente (20-22). La mayoría de los probióticos propuestos en acuicultura pertenecen a los géneros

Aeromonas sp. Bacillus sp, Carnobacterium sp, Flavobacterium sp, Lactobacillus sp, Pseudomonas sp, Vibrio sp, y a diferentes géneros de levaduras como Debaryomyces sp, Phaffia sp, Saccharomyces sp y Rhodosporidium sp (14). En el presente estudio, la utilización de D. hansenii a una concentración de 1x105 y 1x106 UFC/mL incrementaron el CTH, proteína y CAT. A pesar que no se incrementó significativamente la actividad SOD respecto al grupo control, en otros trabajos con probióticos se han reportado incrementos en la actividad de esta enzima asociando esta respuesta antioxidante como un incremento a la tolerancia a estrés oxidativo (17). La concentración de probióticos recomendada es entre 1x104 y 1x106 UFC/mL (18). En este estudio, la concentración de 1x104 UFC/mL de D. hansenii (cepa DH5) incrementó el contenido de proteína, lo cual podría indicar que otras inmunoproteínas podrían estar actuando en respuesta a la levadura (13). Downs et al (23) reportaron que el incremento en el contenido de proteína en hemocitos de camarón Palaemonetes pugio expuesto a estrés por temperatura se debió al incremento de diferentes proteínas relacionadas con el sistema inmunológico, principalmente citocinas y chaperoninas. Un buen estado de salud de los organismos se ha sugerido que esta asociado a un valor alto de proteínas presente en los hemocitos y la hemolinfa, lo cual está relacionado con el estado inmune de los mismos (21, 24). Entre las proteínas detectadas en hemocitos y hemolinfa se han encontrado moléculas asociadas a la coagulación, metabolitos moduladores del sistema inmune, profenoloxidasa, proteínas de reconocimiento, peneidinas, peroxinecticas, hemocianina, entre otras (1,25). Laria et al (21) observaron que el contenido de proteína en hemolinfa de L. schmitti no se ve afectada significativamente cuando los organismos se ven expuestos a diferentes dosis de formaldehido (10, 25, y 50 mg/L); mientras que Boonyaratpalin et al (19) observaron que los niveles de proteína en hemolinfa de P. monodon disminuyen por el efecto creciente del aflatoxina contenida en la dieta. Las dosis de 1x104 UFC/mL las cepas de levaduras marinas D. hansenii, DH5 y DH6, incrementaron significativamente los niveles de proteína en los hemocitos de L. vannamei. El incremento en los niveles de actividad antioxidante en las células se relaciona con una rápida respuesta desintoxicante, reflejando en consecuencia la importancia de las enzimas SOD y CAT para remover el exceso de Sustancias Reactivas de Oxigeno (ROS) de la célula (25).

Pacheco - Efecto de Debaryomyces hansenii en la respuesta antioxidante Los valores de actividad SOD en hemocitos fueron incrementados significativamente en los camarones tratados con laminarina presentando un comportamiento similar en la actividad de CAT en los camarones tratados con laminarina y D. hansenii (cepa LL1). Las levaduras, además de aportar ß-glucanos, mananooligosacaridos y otros componentes de la pared celular, son una fuente de antioxidantes, principalmente de SOD (7,8). Como era esperado, la laminarina generó un incremento de SOD y CAT en los hemocitos de los camarones tratados con este inmunoestimulante comercial (11), posiblemente la concentración de las cepas DH5 y DH6 de D. hansenii fue insuficiente para obtener un incremento en la actividad antioxidante. Liu et al (26) y Guertler et al (27) señalaron que la aplicación de laminarina en Astacus astacus, F. paulensis, L. schmitti y L. vannamei generó la activación de moléculas asociadas al sistema inmune de estos organismos y los niveles de SOD. Resulta interesante que la actividad SOD y CAT muestren comportamientos muy similares, mostrando la estrecha relación que existe entre estos dos componentes del sistema antioxidante. Existe gran variedad de inmunoestimulantes comerciales en el mercado. Sin embargo, la extracción y purificación de inmunoestimulantes de los microorganismos es caro en términos

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de energía, tiempo y dinero. Es por ello que la utilización de levaduras en los cultivos, en lugar de inmunoestimulantes comerciales como los glucanos, puede reducir el costo de producción acuícola y conferir mayor aporte nutricional y protección contra enfermedades potenciales (13). Los resultados obtenidos en la presente investigación mostraron que algunas cepas de D. hansenii pueden ser empleadas para incrementar el contenido de hemocitos circulantes en juveniles de camarón blanco e incrementar la actividad antioxidante. Sin embargo, para entender los procesos relacionados con el sistema antioxidante y el sistema de defensa del camarón, son necesarios mayores estudios involucrando la proteómica y técnicas moleculares para aportar resultados que auxilien en la búsqueda de medidas profilácticas que disminuyan la incidencia de enfermedades en los estanques de cultivo. Agradecimientos Este estudio fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT). SEP-CONACyT(25981). Agradecemos a Artemio Hernández Salmerón y a María Jesús Romero Geraldo por el apoyo brindado al presente trabajo.

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Rev.MVZ Córdoba 17(1):2827-2833, 2012.

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Prevalence of Listeria monocytogenes in pork-meat and other processed products from the Colombian swine industry Prevalencia de Listeria monocytogenes en carnes y derivados de la industria porcícola colombiana Andrea Gamboa-Marín,1 M.Sc, Sonia Buitrago M,1 Microbiol, Karol Pérez-Pérez,1 Bact, Marcela Mercado R,3 M.Epidemiol, Raúl Poutou-Piñales,2 Ph.D, Ana Carrascal-Camacho,1* M.Sc Pontificia Universidad Javeriana, Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. 1Laboratorio de Microbiología de Alimentos. 2Laboratorio de Biotecnología Molecular. Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI). 3Grupo de Enfermedades Infecciosas. Bogotá, D.C. Colombia. Correspondencia: acarrasc@javeriana.edu.co Recibido: Octubre de 2011; Aceptado: Diciembre de 2011.

ABSTRACT Objective. To determine the prevalence of L. monocytogenes in pork carcasses, meat cuts, and meat products (“chorizo”, sausage and ham). Materials and methods. Stratified sampling was implemented in meat-processed products. We analyzed 566 (37%) carcasses, 472 (31%) meat cuts, and 481, (32%) meat-processed products, distributed as follows: 169 (11%) sausage, 163 (11%) ham, and 149 (10%) “chorizo”, for a total of 1519 (100%) samples in a period of 18 months. The samples were processed using the ISO-17604, ISO-11290-1 and the USDA/FSIS (MLG-8.03) methods. Genus and species were confirmed by multiplex-PCR. Results. We obtained isolates of L. monocytogenes from 21 carcasses (10%), 160 (76%) from meat deboning, 10 (5%) from ham, 6 (3%) from “chorizo”, and 13 (6%) from sausage. The prevalence found was 3.7% and 33.9% in carcasses and meat deboning respectively. The prevalence in the meat-processed products was 4.03% in “chorizo”, 6.13% in ham and 7.69% in sausage. The overall prevalence of L. monocytogenes in the study was 13.82%. Conclusions. We found L. monocytogenes in different products analyzed, with particular interest in ham and sausage since both are consumed without previous heat treatment. Key words: L. monocytogenes, porcine, pork-meat, prevalence (Source:DeCS y TDC).

RESUMEN Objetivo. Determinar la prevalencia de L. monocytogenes en canales de cerdo, cortes de carne y derivados (chorizo, salchicha y jamón). Materiales y métodos. Se implementó un muestreo estratificado y se tomaron 566 muestras (37%) de canales, 472 muestras (31%) de cortes de carne y 481 muestras (32%) de derivados cárnicos distribuidos de la siguiente manera: 169 (11%) de salchicha, 163 (11%) de jamón y 149 (10%) de chorizo, para un total de 1519 (100%) muestras en un período de 18 meses. Las muestras se procesaron utilizando las normas ISO-17604 e ISO-112902827

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1 y el método USDA/FSIS (MLG-8.03). Posteriormente se confirmaron los aislamientos por PCRmúltiple para identificar el género y la especie. Resultados. Se obtuvieron 21 (10%) aislamientos de L. monocytogenes en muestras de canales, 160 (76%) en carne de desposte, 10 (5%) en jamón, 6 (3%) en chorizo y 13 (6%) en salchicha. La prevalencia encontrada fue de 3.7% y 33.9% en carne en canal y cortes de carne respectivamente, mientras que la prevalencia en los derivados fue chorizo 4.0%, jamón 6.13% y salchicha 7.69%. La prevalencia general de L. monocytogenes en el estudio fue 13.82%. Conclusiones. Se encontró L. monocytogenes en los diferentes productos analizados, siendo de especial interés el jamón y las salchichas porque ambos son consumidos sin ningún tratamiento térmico. Palabras clave: L. monocytogenes, porcino, carne de cerdo, prevalencia (Fuente:DeCS y TDC).

INTRODUCTION L. monocytogenes is a Gram-positive non-spore forming bacilli that can be found individually, in pairs or as short chains of 3 to 5 microorganisms with a V or Y shape. It lacks a capsule and mobilizes by means of peritrichous flagella with an optimum mobilization temperature between 20 and 25°C, with little or no mobility at 37°C (1). Although they are Gram-positive bacilli, old cultures can express pleomorphism. As a zoonotic and emerging microorganism in the food industry, L. monocytogenes causes listeriosis in humans and animals (1,2). This ubiquitous bacterium can contaminate water, concentrates and especially farm silos, resulting in dissemination of L. monocytogenes during animal breeding. It is known for swines to excrete the bacteria thorugh their feces, thus acting as reservoirs (3). L. monocytogenes has caused several food outbreaks, especially through a group of readyto-eat-food (REF), where meat- and dairyproducts are the most affected (4,5). In several international reports pork galantine and ham, among other contaminated foods, has been declared as an important source of outbreaks in France and Canada (1,6-8). Presently in Colombia there are no outbreak reports by meat product consumption. However, a recent study conducted by the National Institute of Surveillance and Control of Beverages, Medicines and Food (INVIMA) stated that meat products may be contaminated with this microorganism and could constitute a potential listeriosis’ vehicle (9). Recently, the INVIMA in its control and surveillance program reported the withdrawal of a batch of imported ham (“Serrano” type) due to the presence of L. monocytogenes. The Colombian legislation does not require searching for L. monocytogenes in meat derivates. However, the Institute of Technical Norms (Icontec), in its standard 1325 (sixth update), establishes the rejection of a product if 25 grams of the sample contain L. monocytogenes.

According to the national policy for safety and health regarding the pork chain (10), the Colombian porcine sector has experienced a significant growth with a considerable improvement in productivity. However, there are no reports determining the minimum permitted for this pathogen in the pork chain. One of the objectives stated in this work was to determine the prevalence of L. monocytogenes in meat derivatives, to help improve the porcine national chain health status. In Colombia prevalence reports of L. monocytogenes in meat derivates are scarce. This is most likely due to the fact that studies related with this microorganism have been focused on milk derivates. The few existing reports show prevalence of about 14.3% in meat derivates (11). The main objective of this work was to determine the prevalence of L. monocytogenes in pork carcasses, pork-meat and pork-meat processed products from the domestic pork industry.

MATERIALS AND METHODS Pork processing plant selection. Plants were selected according to the following criteria: 1) pork-only abbatoirs 2) plants that comply to regulations with Decree 1500, i.e. pay a fee for development 3) plants located in areas determined by Fedegan (10). At the time of this study 42 processing plants were throughout the country, this study included 23. Sample size. Sample size was calculated using the formula of timely estimate of prevalence, taking into account the following criteria. 1.) population size [1.927.273 slaughtered swines/ year], 2.) expected prevalence [50%], 3.) expected maximum difference [5%], 4.) error type I [1%], 5.) sample size [566], 6.) number of plants for sampling [23].

Gamboa-Marín - Prevalence of Listeria monocytogenes in pork-meat Pork meat selection. As the inclusion criteria we considered: 1.) markets that sell pork and 2.) points located in the pork-industry areas. The number of samples to study was 472, distributed in 58 lots. Selection of meat derivatives. For the selection of meat-processed products we took into account 1.) use of pork-meat as raw material and 2.) high consumption of pork-meat processed products. The products included were: cooked ham (sandwich type), low-cost sausage (cooked) and pre-cooked “chorizo”. The number of included samples were 481, distributed as follows: 169 (35%) sausages, 163 (34%) ham, and 149 (31%) “chorizo”. Sample collection. For pork carcasses, samples were collected using the nondestructive method described in standard ISO 17604 (12). Meat cuts were taken directly from market sale-points in different areas of the country, with a sample size of 500 g. Meatprocessed products were taken directly from the sale point in commercial presentations with an approximate size of 250 to 500 g. Microbiological analysis. The samples were transported to the Laboratory of Food Microbiology at the Pontificia Universidad Javeriana, under aseptic conditions to be processed immediately. The method used for the processing of pork carcasses was described by the Department of Agriculture of United States (USDA/FSIS) (13). ISO11290-1 method was used for meat cuts and meat-processed products. Briefly, 25 g of sample was taken and homogenized in 225 ml of Fraser-semi broth and incubated at 30°C for 48 hours. One hundred μl suspension was incubated in 10 ml Fraser broth and incubated for 40 hours at 35°C. L. monocytogenes was isolated in Ottaviani-Agosti and Palcam agar. Presumptive colonies were purified in TSAYE agar. Catalase test, sugar fermentation (mannitol, Xylose, rhamnose), hemolysis test and Camp test were carried-out. Isolates that biochemically corresponded to L. monocytogenes were subjected to molecular identification (genus and species). Master Cell Bank (MCB) development. A colony of each isolate was inoculated in 20 ml of BHI broth, and incubated at 35°C for 24 hours at 120 rpm. The culture was then mixed at a proportion of 1:1 with glycerol at 40% (v/v) and mixed thoroughly. One ml was placed in a cryopreservation vial, and stored at -20°C. Each MCB was periodically studied to verify the microbial purity and viability (14).

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Genomic DNA extraction (gDNA). For genomic DNA extraction, a frozen vial of each isolate was inoculated in 5 ml BHI broth supplemented with 0.5% (p/v) of glucose. Cells were cultured during 18 hours at 35°C and 120 rpm. One ml culture was centrifuged during 10 minutes at 5000 x g. Cells were washed with 1X TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0±0.2). DNA was extracted by using the "Wizard Genomic DNA Purification Kit" (Promega, Madison WI, USA). Genomic DNA (gDNA) quantitation. DNA purity and concentration were determined (NanoDrop 2000c Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) (15). L. monocytogenes molecular identification by Multiplex-PCR. Primers used for the PCR reaction were L1 (CTCCATAAAGGTGACCCT)/U1(CAGCMGCCGCGGTAA TWC) and LF(CAAACGTTAACAACGCAGTA)/LR (TCCAGAGTGATCGATGTTAA) (16). The final volume of the reaction was 35 ml, containing 1X PCR buffer, 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM each dNTP, 20 pmol each primer and 2U of GoTaqFlexi DNApol (Promega, Madison WI, USA), and 5 ml of gDNA (~120 ng). Reactions were carried out in a Gene CyclerTM (BioRad, Philadelphia PA, USA) programmed in the following way: 1 minute at 95oC, followed by 40 cycles (30 s at 94°C, 20 s at 51°C, 30 s at 72°C), and a final extension step of 8 minutes at 72°C. L. monocytogenes ATCC 19115 was used as positive control (16). Prevalence of L. monocytogenes. The following formula was used to calculate prevalence (17).

RESULTS Molecular identification of L. monocytogenes by Multiplex-PCR. All the isolates previously identified as L. monocytogenes amplified the two expected products of 938 bp and 750 bp, for genus and the species respectively (16). Figure 1 shows representational results. Pork carcasses. Figure 2-top depicts outcomes for each of the analyzed processing plants. L. monocytogenes was isolated in (8/23, 34.8%) plants. Plant PB18 presented the greatest number of positive samples (7/20, 35%). L. monocytogenes was not isolated in other plants (15/23, 65.2%). The overall prevalence in pork carcasses was 3.7% (21/566).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012 Sausage. Out of 169 samples analyzed, L. monocytogenes was isolated in thirteen. The prevalence was 7.69% (Figure 2-bottom). “Chorizo”. Six isolates of L. monocytogenes were obtained for a prevalence of 4.03% (Figure 2-bottom).

Figure 1. Molecular identification of L. monocytogenes. Representative samples of L. monocytogenes isolates in 1% (w/v) TAE agarose gel processed in Quantity One V. 4.6.9. (BioRad, Philadelphia PA, USA). The figure shows some of the amplification products obtained by Multiplex-PCR. Lane 1: L. monocytogenes ATCC 19115. Lane 2: Listeria spp. Lane 3: 100 bp molecular size marker (Promega, Madison WI, USA). Lanes 4, 5, 6: positive isolations for L. monocytogenes. Lane 7: Negative control for PCR reagents.

DISCUSSION L. monocytogenes is a food-transmitted pathogen with implications in the food industry due to its ubiquitous nature. This feature allows the bacterium to be disseminated in the environment, facilitating accession to meat-processing plants, in particular pork-meat processing product plants, favoring food contamination (18-20). In the present study the prevalence of L. monocytogenes in meat carcassess was 3.7%. These values are within the range of those published by other investigations: 2.0% in Finland (21), 4.1% in United States (22). Our results are lower than those presented by Gil and Jones who detected 8.3% in a Canadian plant. However, the Gil and Jones study only had 24 samples, which is not representative. Prevalence data from this research are consistent with several authors who have pointed out that processing plants are not a significant source of L. monocytogenes contamination. (23-27).

Meat cuts. Fifty eight lots of fresh pork meat were analyzed and L. monocytogenes was isolated in 40 lots (69%). Out of the 40 lots thirteen samples were contaminated with L. monocytogenes (22.4%). The bacterium was not isolated in the remaining 31% (18/58) of pork meat samples. There was an overall high prevalence (33.9%, 160/472), (Figure 2-middle). Pork meat processed products. Ham. L. monocytogenes was isolated in 10 ham samples, with 6.13% prevalence (Figure 2-bottom).

Prevalence (%)

100 80

Plants for benefit (meat carcasses)

60 40

15.0

10.0

1.3

Prevalence (%)

PB1

PB2

PB3

PB4

PB5

PB6

PB7

100 100 100 100 100 100 100

100

PB8

PB9

100 83 67

5.0

100

75 50

60 40

5.0

PB10 PB11 PB12 PB13 PB14 PB15 PB16 PB17 PB18 PB19 PB20 PB21 PB22 PB23

100 100 100

35.0

29.4

100 67

50 33 33

L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 L19 L20 L21 L22 L23 L24 L25 L26 L27 L28 L29 L30 L31 L32 L33 L34 L35 L36 L37 L38

Deboning plants (Meat cuts) Prevalence (%)

100 80 60 40 20

7.69

6.13

4.03

Sausage

Ham

"Chorizo"

Pork meat derivates

Figure 2. Prevalence of L. monocytogenes in carcasses, meat cuts and meat products from the Colombian swine industry.

Gamboa - Prevalence of Listeria monocytogenes in pork-meat The presence of the pathogen in swines is associated to the fact that these animals are carriers of L. monocytogenes. For example it has been shown that pork lodge this bacterium in tonsils and intestine (3, 21, 22, 28). For this reason if during evisceration there is organ rupture, the carcass can be contaminated with L. monocytogenes. Although it is frequent for L. monocytogenes to contaminate carcasses and processing plants, subsequent washing and disinfecting procedures should get rid of the contamination. Pathogen-free product depends on the effectiveness of these processes (21). In this study meat cuts had a prevalence of 33.9%. This percentage was the highest among all samples assayed. Our results agree with those reported by authors in different countries. Ochiai et al. reported an incidence of 35.7% in Tokyo (20). In contrast, other research shows lower prevalence and incidence: 0.15 - 1.2% in the United States (29), 4.0% in Finland (21), 5.0% in Bulgaria (30), and 24.0% in Canada (8). The low prevalence in these countries can be associated to control measures implementation during the stages of cleaning and disinfection. It has been determined during deboning there might be cross-contamination with utensils. In particular if this process is carried out at room temperature below 10°C. This favors the presence of L. monocytogenes due to its psychrotrophic nature (20, 28). The conditions of contact surfaces and equipment affect the persistence of L. monocytogenes. Stainless steel surfaces are used in the food industry to prevent contamination (26). In the present study prevalence of L. monocytogenes in sausage was 7.69%, similar to that found by Vera et al (11) in Bogotá in 2004 (document published in 2006). Vera et al (11) reported a prevalence of 8.7% with 21 positive samples of 239 evaluated sausages. Similar findings were reported by Karakolev et al (30) in 2009. They analyzed and determined prevalence in crude dried sausage (11.3%) and raw smoked sausage (8.6%) in Bulgaria (30). Other investigations have presented prevalence of 42.0% (31), 28.2% in fresh and fermented sausages (32), and 16.9% in dry cured sausage (33). These studies show that there is variability in the prevalence of L. monocytogenes in sausage, which may be related to preparation process and storage (29). It is noteworthy that L. monocytogenes’ prevalence is dependent on the country and the nature of the product-processing. As a case in point, raw fermented sausage or products without proper packaging can have a higher prevalence. In contrast, the samples evaluated in this study were sausages cooked and vacuum packed at the production plant.

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Sausages are regional products that vary depending on the country with regards to ingredients and production processes. In some cases they are considered a type of fermented sausage, making it difficult to compare porkmeat processed products from different origins, in particular with the international literature. The prevalence of L. monocytogenes in “chorizo” was 4.0%, less than what was stated by Vera et al (11). They reported in Bogotá (2004) a prevalence of 18.1% with two positive samples out of 11 assessed. Their results might be due to a low sampling number and sampling of precooked sausage. In the case of the ham the prevalence in the present research was 6.13%. This prevalence was higher than what was reported by Martins and Leal (0.8%) (20), but lower than that reported by Cabedo et al (33) (12.5%). Vera et al (11) also reported higher prevalence (16.8%) with 67 positive samples out of 398 analyzed. Ham contamination may occur during slicing and/or packaging probably due to the presence of the pathogen in equipment, when hygiene conditions are not appropriate (20,26). Chasseignaux et al. pointed-out to contamination of meat products with L. monocytogenes associated to cross-contamination with raw meat, equipment, processing areas (34), cooling areas, or even staff of the establishment. Therefore the incorporation of the microorganism in REF occurs after having subjected the product to thermal processes. Lastly, it is important to note that L. monocytogenes was found in different samples analyzed. This demonstrates the importance of pork meat products as a transmission vehicle for this bacterium. Acknowledgments This work was supported by grants from the Ministry of Agriculture and Rural Development (Isolation and molecular characterization of strains of Salmonella spp., and L. monocytogenes antimicrobial susceptibility and valuation of the microbiological risk of contamination in meat in carcasses, pork meat cuts, strategies for prevention and control in plants and processing registration code 2008 W4845), and Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia (00003120). The authors also like to thank Maria Lucia Gutiérrez for English editing the manuscript.

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Crustáceos decápodos asociados a ensamblajes macroalgales en el litoral rocoso de Córdoba, Caribe colombiano Decapod crustaceans associated with macroalgae assemblages on the rocky coastline of Córdoba, Colombian Caribbean Jorge Quirós R,1* M.Sc, Pedro Dueñas R,1 M.Sc, Néstor Hernando Campos,2 Ph.D. 1Universidad de Córdoba, Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías, Departamento de Biología. Grupo de Investigación Biodiversidad. Montería, Colombia. 2Universidad Nacional de Colombia, Sede

Caribe. CECIMAR. Santa Marta, Colombia. *Correspondencia: scaride@yahoo.com. Recibido: Febrero de 2010; Aceptado: Marzo de 2011.

RESUMEN Objetivo. Determinar la estructura de las poblaciones de crustáceos decápodos asociados a ensamblajes algales en el litoral rocoso del departamento de Córdoba. Materiales y métodos. Para la recolección de los especímenes se delimitó con un cuadrante de 625 cm2, un área con cinco repeticiones dispuestas al azar en cada estación. Para la separación de las macroalgas desde su disco de fijación en el sustrato, se empleó una espátula metálica. En un recipiente plástico se separaron los crustáceos decápodos del resto del material y se conservaron en alcohol al 70%. Resultados. Se identificaron representantes de 50 especies asociadas a los céspedes algales, agrupadas en 16 familias y 29 géneros. Especies como Acanthonyx petiverii, Epialtus bituberculatus, Eurypanopeus abbreviatus y Pachycheles serratus, presentaron un rango amplio de distribución, siendo características en las dos ecorregiones de estudio. Los cambios en cobertura de algas rojas como Gracilaria mammillaris, Hypnea musciformis y Acanthophora muscoides, determinaron la mayor asociación de crustáceos decápodos en la ecorregión Morrosquillo, mientras que los cambios en cobertura de G. damaecornis y Padina gymnospora, fueron las que determinaron la mayor asociación de crustáceos decápodos en el Darién cordobés. Conclusiones. Los resultados indicaron que las especies de crustáceos decápodos asociados a ensamblajes macroalgales, no se encontraron distribuidas de forma similar en las dos ecorregiones estudiadas, siendo P. armatus la especie con mayor porcentaje de abundancia en la ecorregión Morrosquillo, y E. bituberculatus en el sector comprendido entre los municipios de Moñitos y Los Córdobas. Palabras clave: Algas marinas, estructura de la población, recolección, especímenes (Fuente:CAB).

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ABSTRACT Objective. To determine the structure of decapod crustacean populations associated with algal assemblages on the rocky coast line of Córdoba. Materials and methods. A 625 cm2 quadrant, an area with five random repetitions in each station was used to collect the species. To separate the macroalgae from its substrate, a metallic spatula was used. The decapod crustaceans were separate from the rest of the material in a plastic container, and they were preserved in 70% alcohol. Results. 50 species associated with alagal lawns were reported, these were grouped in 16 families and 29 genera. Species such as Acanthonyx petiverii, Epialtus bituberculatus, Pachycheles serratus and Eurypanopeus abbreviatus presented a wide distribution range, being characteristic species in both study ecoregions. Changes in the red algal cover of Gracilaria mammillaris, Hypnea musciformis and Acanthophora muscoides determined the largest association of decapod crustaceans in the Morrosquillo ecoregion, while changes in coverage of G. damaecornis and Padina gymnospora were those that determined the largest association of decapod crustaceans in the Córdoba Darien ecoregion. Conclusions. The results indicated that decapod crustacean species associated with algal assemblages weren’t found distributed in similar way for the two studied ecoregions. P. armatus presented the highest percentage of abundance in the Morrosquillo ecoregion and E. bituberculatus in the sector between Moñitos and Los Córdobas. Key words: Picking, population structure, seaweeds, specimens (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN Dentro del contexto internacional, los litorales rocosos han sido bien estudiados, dada la facilidad de acceso en comparación con otros ecosistemas marinos, y por su facilidad de observación directa (1). Este ecosistema se desarrolla sobre las zonas de mareas, en la interfase entre el mar y la tierra, albergando una cantidad apreciable de especies de importancia comercial como algas, moluscos, crustáceos, entre otros (1,2). Desde el punto de vista económico, las macroalgas que viven sobre este ecosistema, representan un importante recurso, el cual se encuentra actualmente subutilizado y subvalorado (3). A nivel ecológico los litorales rocosos son hábitat exclusivo de muchas especies de invertebrados y algunos peces (4,5). Además no se evidencian estudios acerca del impacto de las actividades humanas sobre estos ecosistemas. Sin embargo se sabe que han sido afectados por contaminación de diversos tipos, como descarga de aguas continentales con pesticidas y organoclorados provenientes de ríos y arroyos aguas arriba en áreas de cultivo, deposición de basuras, derrame de hidrocarburos y sobrepesca. Factores que causan daños ecológicos indeseables y afectan directamente la economía de los pescadores de subsistencia (4,6). Los crustáceos decápodos han sido estudiados en numerosos trabajos en el departamento del Magdalena, destacándose los de Werding (7-9) en la familia Porcellanidae; Vélez (10) en los cangrejos arañas; Sánchez y Campos (11) en

los cangrejos ermitaños; Campos y Manjarrés (12) en los cangrejos partenópidos. Entre los estudios que relacionan las poblaciones de crustáceos decápodos con las macroalgas está el realizado por Campos (13), quien evaluó las poblaciones de crustáceos decápodos asociadas en tres comunidades algales de la región de Santa Marta, Campos (14), quien presentó un registro de los crustáceos decápodos en un área colonizada por Halimeda sp., en la Bahía de Chengue y Quirós y Campos (15), quienes estudiaron sobre la dinámica espacial de los crustáceos decápodos asociados a céspedes algales en la ecorregión Darién cordobesa. Sin embargo, y a pesar de la Política Nacional Ambiental para el desarrollo sostenible de espacios oceánicos y zonas costeras e insulares de Colombia, desde hace más de una década en la franja costera del departamento de Córdoba se ha venido observando un continuo deterioro ante presiones de tipo antrópico, procesos erosivos favorecidos por el oleaje, corrientes de deriva en dirección sureste, escaso aporte de sedimentos (16) y contaminación por descarga de productos químicos provenientes aguas arriba en áreas de cultivo (6). Por esto, el desarrollo de la presente investigación planteó como objetivo determinar las relaciones que presentan las poblaciones de crustáceos decápodos con las macroalgas en el litoral rocoso del departamento de Córdoba, considerando para ello los periodos climáticos del año.

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MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. Se realizó una investigación de tipo descriptiva. Sitio de estudio. El proyecto se ubica en el litoral Caribe del departamento de Córdoba entre 9°25’45” N - 75°42’21” W en el corregimiento de El Porvenir, y entre 8°54’86” N - 76°26’20” W en Punta Arboletes (Figura 1). El litoral costero cordobés en general, corresponde a una zona de bosque seco tropical, según el patrón de zonación de Holdridge (17); además presenta dos épocas climáticas al año, una seca que abarca los meses de diciembre hasta inicios de abril, y otra lluviosa que se prolonga desde finales de abril hasta noviembre. En julio se presenta una disminución de las lluvias, que se conoce como “Veranillo de San Juan”. Teniendo en cuenta que la extensión del litoral es de 140 km y está caracterizado a lo largo de su área, por la influencia de la actividad antrópica, así como también por el aporte de aguas continentales, la zona se dividió en dos ecorregiones (Tabla 1 y 2), de acuerdo con lo establecido por el Ministerio del Ambiente y Desarrollo Territorial (18). Tabla 1. Ubicación y tipo de sustrato del los puntos de muestreo en la ecorregión Morrosquillo. Puntos de muestreo

Localidad

Latitud N

Longitud W

Tipo de sustrato

El Porvenir

San Antero

9° 25.016

75° 42.235

Rocoso calcáreo

Punta Graw

San Antero

9° 25.037

75° 42.251

Rocoso calcáreo

Punta Bello

San Antero

9° 25.135

75° 42.857

Rocoso calcáreo

Tabla 2. Ubicación y tipo de sustrato del los puntos de muestreo en la ecorregión Darién. Puntos de muestreo

Localidad

Latitud N

Longitud W

Tipo de sustrato

Punta Broqueles

Moñitos

9° 13.095

76° 10.068

Rocoso calcáreo

Broqueles

Moñitos

9° 13.036

76° 10.144

Rocoso calcáreo

Cristo rey

Puerto Escondido

9° 03.201

76° 15.502

Rocoso sedimentario

Puerto Escondido

9° 00.406

76° 15.544

Rocoso sedimentario

Punta Arboletes

Los Córdobas

9° 53.735

76° 24.580

Rocoso artificial

Diseño de muestreo. Se realizaron muestreos trimestrales entre los meses de septiembre/06 y junio/07, con el fin de abarcar los dos periodos climáticos del año que se dan en las ecorregiones de estudio. Se colectó material en ocho estaciones, tres estaciones se ubicaron en la ecorregión Morrosquillo y cinco en Darién, cubriendo sustrato rocoso calcáreo,

sedimentario y artificial. En cada estación de muestreo se ubicó un cuadrante de 625 cm2 en cinco puntos (réplicas). En todos lo cuadrantes se evaluó la cobertura de las algas a nivel específico. Debido a la distribución de la cobertura algal sobre el sustrato rocoso, la ubicación del cinturón de cuadrantes se realizó de manera preferencial aleatoria, es decir, sobre sectores homogéneos de vegetación. Tratamiento de las especies recolectadas. La identificación taxonómica y determinación hasta especie del material recolectado, se realizó por medio de las claves taxonómicas de Rathbun (19), Lemaitre et al (20), Williams (21), Abele y Kim (22). Manejo de la información y análisis de datos. Con el fin de detectar variaciones en la estructura de las poblaciones de crustáceos decápodos asociados, las abundancias por especies en cada estación, se clasificaron en un análisis de agrupamiento normal utilizando el índice de similaridad de Bray-Curtis (23) y construyendo el dendrograma mediante la técnica de ligamiento promedio UPGMA. Para determinar las especies características por estaciones, se realizó el análisis inverso (24). Para ello se recalcularon las abundancias promedio y las frecuencias relativas de ocurrencia de cada especie en las estaciones. Cada especie se definió como característica de la estación en la que se encontró el 70% de su abundancia acumulada de mayor a menor. Además, se detectaron aquellos grupos en que cada especie tuvo una frecuencia de ocurrencia mayor al 67%. Luego, se reordenaron las especies para agrupar aquellas características del mismo grupo de estaciones siguiendo la jerarquía del dendrograma normal.

RESULTADOS Se identificaron 50 especies de crustáceos decápodos asociados a céspedes algales: 32 en la ecorregión Morrosquillo y 27 en Darién, las cuales están agrupadas en 16 familias y 29 géneros. En el Morrosquillo cordobés la especie más abundante fue Petrolisthes armatus (19.6%), seguida de Epialtus bituberculatus (16%), Mithraculus coryphe (15.6%), Pachycheles serratus (10.5%), Mithraculus forceps (8.9%), Pilumnus dasypodus (6.3%), Panopeus americanus (3.3%) y Clibanarius antillensis (3.4%) (Figura 2A). El resto de las especies de crustáceos decápodos presentaron una abundancia menor al 2%. En el Darién cordobés la especie dominante fue Epialtus bituberculatus (66.7%), seguida de

Quirós - Crustáceos decápodos asociados a ensamblajes macroalgales

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Figura 1. Área de estudio y ubicación de los puntos de muestreo en la franja costera del departamento de Córdoba. Ecorregión Morrosquillo; El Por: El Porvenir, PG: Punta Graw, PBell: Punta Bello. Ecorregión Darién; PBr: Punta Broqueles, Br: Broqueles; CR: Cristo Rey, PE; Puerto Escondido, PA: Punta Arboletes.

Pachygrapsus transversus (6.3%), Panopeus sp.2 (5.6%), Eurypanopeus abbreviatus (3.8%), Acanthonyx petiverii (3.6%) y Plagusia depressa (2.2%) (Figura 2B). El resto de las especies aportaron una abundancia menor al 2%.

En la ecorregión Morrosquillo se registraron 10 familias de las cuales Panopeidae presentó el mayor número de especies (8), seguida de Alpheidae (5), luego Porcellanidae y Pilumnidae (4), mientras Diogenidae y Pisidae registraron solamente una especie (Tabla 3); en esta ecorregión se registraron seis

Figura 2. Abundancia total relativa de individuos por especie, presentes para los crustáceos decápodos en las ecorregiones de estudio. (A) Ecorregión Morrosquillo. (B) Ecorregión Darién.

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Tabla 3. Familias, Abundancia (Nº ind) y riqueza (N° esp) de los crustáceos decápodos asociados a macroalgas en las dos ecorregiones del departamento de Córdoba, Colombia. Ecorregiones de Córdoba Familias

E. Morrosquillo

E. Darién

POR

P.G

P.BLL

P.Br

C.R

P.E

P.A

Eurypanopeus abbreviatus

Neopanope texana

Panopeus occidentalis

Panopeus sp1.

Panopeus sp2.

Panopeus sp3.

Micropanope nuttingi

Micropanope lobifrons

Panopeus americanus

Panopeus herbstii

Megalobrachium mortenseni

Megalobrachium roseum

Pachycheles serratus

Petrolisthes armatus

Pachycheles susanae

Pachycheles chacei

Pisidia brasiliensis

Lobopilumnus agassizii

Pilumnus caribaeus

Pilumnus dasypodus

Pilumnus sp1.

Pilumnus sp2.

Pilumnus holosericus

Alpheus sp.

Synalpheus apioceros

Synalpheus sp.

Synalpheus twonsendi

Synalpheus mcclendoni

Hippolyte curacaoensis

Lautreutes parvulus

Hippolyte sp.

Hippolyte pleuracanthus

Microphrys bicornutus

Mithraculus coryphe

Mithraculus forceps

Grapsus grapsus

Pachygrapsus gracilis

Pachygrapsus transversus

Acanthonyx petiverii

Epialtus bituberculatus

143

Clibanarius antillensis

Calcinus tibicen

Periclimenes longicaudatus

Periclimenes americanus

Menippidae

Menippe nodifrons

Palinuridae

Panulirus sp.

Plagusiidae

Plagusia depressa

Atyidae

Potimirim potimirim

Pisidae

Pelia mutica

Eriphiidae

Eriphia gonabra

Total de individuos

160

163

183

176

Total de especies

Panopeidae

Porcellanidae

Pilumnidae

Alpheidae

Hippolytidae

Mithracidae

Grapsidae

Epialtidae Diogenidae Palaemonidae

Especies \ Estaciones

*Ecorregión Morrosquillo; POR: El Porvenir, P.G: Punta Graw, PBLL: Punta Bello. Ecorregión Darién; P.Br: Punta Broqueles, Br: Broqueles; C.R: Cristo Rey, P.E; Puerto Escondido, P.A: Punta Arboletes.

Quirós - Crustáceos decápodos asociados a ensamblajes macroalgales nuevas especies; Periclimenes longicaudatus, Hippolyte curacaoensis, Acanthonyx petiverii, Epialtus bituberculatus, Microphrys bicornutus y Lautreutes parvulus. En la ecorregión Darién se registraron trece familias de las cuales Panopeidae y Porcellanidae presentaron el mayor número de especies (4,5), seguida por Grapsidae y Hippolytidae (3), luego Diogenidae y Epialtidae (2), mientras que las familias restantes estuvieron presentes solamente con una especie (Tabla 3). Para esta ecorregión se colectaron representantes de especies previamente registradas: Periclimenes longicaudatus, Hippolyte curacaoensis, Acanthonyx petiverii, Epialtus bituberculatus, y cinco especies más son nuevos registros; Grapsus grapsus, Pachygrapsus gracilis, Pachygrapsus transversus, Plagusia depressa y Pisidia brasiliensis. En la ecorregión Morrosquillo se recolectó un total de 506 individuos pertenecientes a 32 especies de crustáceos decápodos, las cuales presentaron una abundancia total promedio de 15.8 ± error estándar 4.65 ind/625 cm2, mientras que en la ecorregión Darién se recolectaron 504 individuos pertenecientes a 27 especies, y una abundancia total promedio de 18.6 ± error estándar 12.1 ind/625 cm2 (Tabla 4). Tabla 4. Resumen estadístico para los valores de abundancia, según las especies, de crustáceos decápodos asociados a macroalgas en las dos ecorregiones cordobesas. Sumario Estadístico Número de individuos Número de especies Media Mediana

E. Morrosquillo

E. Darién

506

504

15.8

18.6

Desviación estándar

26.3

62.9

Error estándar

4.65

12.1

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En el Morrosquillo cordobés, El Porvenir y Punta Graw registró el dominio de la familia Porcellanidae, a diferencia de Punta Bello, en la cual, se destacó la familia Mithracidae. La familia Panopeidae mostró la mayor abundancia en Punta Graw, y el menor valor en Punta Bello. Es importante anotar, que en las tres estaciones, la familia Pilumnidae presentó abundancias similares, mientras que la familia Alpheidae fue la menos destacada (Figura 3A). En el Darién cordobés, en todas las estaciones de muestreo excepto Broqueles, se registró un dominio de la familia Epialtidae, mientras que en esta última, se destacó por su abundancia, la familia Panopeidae. En Punta Broqueles, Broqueles, Cristo Rey y Puerto Escondido se presentó una abundancia relativamente similar de individuos de la familia Grapsidae, mientras en Punta Arboletes se registró solamente, un individuo de la especie Pachygrapsus transversus. Las familias Atyidae y Palaemonidae fueron las menos destacadas, con un solo individuo colectado en Puerto Escondido, mientras que en la familia Palinuridae solo se registró un espécimen en Cristo Rey (Figura 3B). El análisis de Bray-Curtis mostró la formación de tres grupos de estaciones (Figura 4). El primer grupo constituido por las estaciones Punta Graw (P.GW), El Porvenir (POR) y Punta Bello (P.BLL), presentó un porcentaje de similaridad del 55.8%; las estaciones de este grupo corresponden a la ecorregión biogeográfica de Morrosquillo; el segundo grupo corresponde a las estaciones Cristo Rey (C.R) y Puerto Escondido (P.E), mientras el tercer grupo lo conformaron Broqueles (Br), Punta Broqueles (P.Br) y Punta Arboletes (P.A). Los puntos de muestreo del segundo y tercer grupo registraron un porcentaje de similaridad del 46.1%, y hacen parte de la ecorregión Darién.

Figura 3. Abundancia promedio por familia presente por puntos de muestreo en las ecorregiones durante el estudio. (A): Ecorregión Morrosquillo; (B): Ecorregión Darién.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012 esta especie fue abundante y representativa para Puerto Escondido, siendo la responsables de la formación del grupo (Tabla 5).

Figura 4. Dendrograma de clasificación según el índice de similaridad de Bray-Curtis que muestra las asociaciones entre los puntos de muestreo durante el periodo de estudio, formada a partir de la matriz de abundancia de las especies de decápodos y con transformación (raíz cuarta). POR; El Porvenir, P.GW; Punta Graw, P.BLL; P. Bello, C.R; Cristo Rey, P.E; Puerto Escondido, Br; Broqueles, P.B; Punta Broqueles, P.A; Punta Arboletes.

Especies características en las dos ecorregiones. Se encontraron especies comunes para la mayoría de los puntos de muestreo, lo que las convierte en características para el área de estudio en general. Se presentaron especies con un rango amplio de distribución como Acanthonyx petiverii, Epialtus bituberculatus, Eurypanopeus abbreviatus y Pachycheles serratus, las cuales fueron colectadas en las dos ecorregiones de estudio (Tabla 5). Asociación ecorregión Morrosquillo. En esta asociación se registraron cinco especies características para los tres sitios de muestreo, destacándose Mithraculus coryphe, Mithraculus forceps, Petrolisthes armatus, Pilumnus dasypodus y Panopeus americanus, comunes para bosques de manglar, praderas marinas y céspedes algales (Tabla 5); estos ecosistemas aportan elementos esenciales para el desarrollo de macroalgas como Gracilaria damaecornis, G. cervicornis, G. mammillaris, Hypnea musciformis, Bryothamnion triquetrum y algas pardas como Padina haitiensis y Dictyota volubilis, capaces de desarrollar hábitats de alta productividad que brindan refugio, además de contribuir con la fijación de epifitos fuente directa e indirecta de alimento para muchas especies de crustáceos decápodos. Asociación Cristo Rey y Puerto Escondido. En este grupo se presentó una especie en común para los dos puntos de muestreo, Panopeus sp.2, la cual se distribuye en ambientes dinámicos con fuerte exposición al oleaje, corrientes oceánicas y periodo mareal, además

Asociación Broqueles, Punta Broqueles y Punta Arboletes. Esta asociación tiene dos especies características, Pachygrapsus transversus y Plagusia depressa, las cuales presentan tolerancia a condiciones de baja salinidad, influenciado por el aporte de aguas continentales provenientes de ríos y arroyos. Estas especies fueron abundantes en los puntos de muestreo, siendo las responsables de esta asociación para esta franja de la ecorregión Darién (Tabla 5). Sector entre El Porvenir y Punta Bello. La especie con el mayor porcentaje de abundancia en el componente macroalgal fue Petrolisthes armatus (44.8%), seguida de Epialtus bituberculatus (31.7%), Mithraculus coryphe (10.8%), Panopeus americanus (8.6%) y Pachycheles serratus (4.2%). El resto de las especies presentaron valores menores al 2% de asociación. De las cinco especies de crustáceos decápodos con mayor representatividad en el componente algal, Petrolisthes armatus se colectó asociada a cuatro especies algales, mientras Epialtus bituberculatus fue común para tres especies algales. El resto de las especies fueron comunes para dos y una especie algal en la ecorregión Morrosquillo (Tabla 6). Tabla 6. Abundancia relativa total de las especies de decápodos más representativos asociados en las principales especies macroalgales. Especies

Petrolisthes armatus Epialtus bituberculatus

70.6

77.8

APR (%)

58.3

92.3

42.9

44.8

41.7

Mithraculus coryphe

31.7 7.7

Pachycheles serratus Panopeus americanus Total de especies

57.1 25

29.4

22.2

10.8 4.2 8.6

(A): Gracilaria damaecornis; (B): G. cervicornis; (C): G. mammillaris; (D):Hypnea musciformis; (E): Acanthophora spicifera; (F): Padina haitiensis; (ART): Abundancia promedio relativa.

Sector entre Moñitos y Los Córdobas. La especie con el mayor porcentaje de abundancia en las macroalgas fue Epialtus bituberculatus (57.6 %), seguida de Pachygrapsus transversus (17.1%), Eurypanopeus abbreviatus (10.5%), Panopeus sp.2 (9.4%) y Acanthonyx petiverii (5.4%). El resto de las especies presentaron valores menores al 2% de asociación. De las cinco especies de crustáceos decápodos

Quirós - Crustáceos decápodos asociados a ensamblajes macroalgales

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Tabla 5. Análisis de clasificación inverso mostrando las especies características de cada punto de muestreo o agrupación definido por el análisis normal. Para los valores en negrilla la abundancia en los puntos de muestreo está dentro 70% acumulado del total de especies. Las especies exclusivas se demarcan con dos asteriscos. Especies

Agrupaciones POR

P.G

P.BLL

C.R

P.E

P.Br

P.A D

%Fr

2.2

5.8

Epialtus bituberculatus

143

412

6.7

Clibanarius antillensis

1.9

2.5

Hippolyte curacaoensis

0.9

2.5

Eurypanopeus abbreviatus

2.2

4.2

Neopanope texana

2.5

5.3

4.2

Mithraculus coryphe

7.5

2.5

Mithraculus forceps

4.2

2.5

Petrolisthes armatus

9.3

2.5

Pilumnus dasypodus

2.5

1.7

2.5

Ampliamente distribuidas Acanthonyx petiverii

Pachycheles serratus Características Morrosquillo

Panopeus americanus Características POR Micropanope lobifrons

1**

0.1

0.8

Megalobrachium roseum

6**

0.6

0.8

Periclimenes americanus

3**

0.3

0.8

Synalpheus sp.

1**

0.1

0.8

Micropanope nuttingi

0.3

1.7

Pilumnus sp1.

0.2

1.7

Microphrys bicornutus

0.6

1.7

Alpheus sp.

0.3

1.7

Synalpheus towsendi

0.2

1.7

Características P.G Synalpheus macclendoni

2**

0.2

0.8

Megalobrachium mortenseni

1**

0.1

0.8

Lobopilumnus agassizii

1**

0.1

0.8

Panopeus herbstii

6**

0.6

0.8

0.4

1.7

Pelia mutica

Características P.BLL Lautreutes parvulus

1**

0.1

0.8

Pilumnus caribeaus

3**

0.3

0.8

Synalpheus apioceros

3**

0.3

0.8

Características Br. P.B y P.A Pachygrapsus transversus

2.2

2.5

Plagusia depressa

0.6

2.5

1.7

Características C.R y P.E Panopeus sp2. Características C.R Hippolyte sp.

3**

0.3

0.8

Hippolyte pleuracanthus

3**

0.3

0.8

Grapsus grapsus

2**

0.2

0.8

Panulirus sp.

1**

0.1

0.8

Pachygrapsus gracilis

1**

0.1

0.8

0.2

1.7

Eriphia gonabra

Características P.E Calcinus tibicen

1**

0.1

0.8

Pachycheles chacei

3**

0.3

0.8

Potimirim potimirim

1**

0.1

0.8

Características Br 17**

1.6

0.8

Pisidia brasiliensis

1**

0.1

0.8

Pilumnus holosericus

1**

0.1

0.8

Pilumnus sp2.

1**

0.1

0.8

Panopeus sp3.

Características P.B Pachycheles susanae

7**

0.7

0.8

Menippe nodifrons

1**

0.1

0.8

* Ecorregión Morrosquillo; POR: El Porvenir, P.G: Punta Graw, P.BLL: Punta Bello. Ecorregión Darién; P.Br: Punta Broqueles, Br: Broqueles; C.R: Cristo Rey, P.E; Puerto Escondido, P.A: Punta Arboletes.

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Tabla 7. Abundancia relativa total de las especies de decápodos más representativos asociados en las principales especies macroalgales. Especies Epialtus bituberculatus Eurypanopeus abbreviatus Panopeus sp2.

APR (%)

71.4

77.8

57.6

10.5

28.6

9.4

Acanthonyx petiverii

22.2

Pachygrapsus transversus Total de especies

5.4 70

17.1

(A): Bryothamnion triquetrum; (B): Padina gymnospora; (C): Gracilaria damaecornis; (D): Sargassum polyceratium; (APR): Abundancia promedio relativa.

presentes con mayor representatividad en el componente algal, E. bituberculatus fue común para cuatro especies algales, mientras Eurypanopeus abbreviatus y Panopeus sp.2 fueron comunes para dos especies algales. El resto de las especies fueron comunes para una especie algal en la ecorregión Darien (Tabla 7).

DISCUSIÓN Al evaluar el patrón de diversidad macroalgal a lo largo de las ecorregiones geográficas que conforman el Caribe colombiano, la zona costera del departamento de Córdoba, que la integra las ecorregiones de Morrosquillo y Darién, presentó una baja diversidad (50 especies: 4.9%) al compararse con el Parque Natural Nacional Tayrona (365 especies: 35.7%), el sector sur del Caribe colombiano (217 especies: 21.2%) y el Archipiélago de San Andrés y Providencia (202 especies: 19.8%) (25,26). Las causas de esta baja diversidad macroalgal pueden ser simplemente el resultado del bajo esfuerzo de muestreo en esta área (26,27). Sin embargo, también es evidente que esta situación se puede revertir teniendo en cuenta que el área costera del departamento de Córdoba, cuenta con una importante variedad de ecosistemas, hábitats y microhábitats con abundante espacio disponible, que combinado con las condiciones oceanográficas, proporcionan en el área el escenario para una alta diversidad macroalgal (27) y de otros organismos marinos como moluscos (1,5) y crustáceos decápodos (15). Sector entre El Porvenir y Punta Bello. En este sector, se colectaron representantes de 32 especies de crustáceos decápodos, las cuales presentaron una abundancia total promedio de 15.8 ± error estándar 4.65 ind/625 cm2. De acuerdo con los criterios de Arias et al (3), la presencia en el sector de formaciones coralinas, bosques de manglar y praderas de fanerógamas marinas, aportan elementos esenciales para

desarrollo de especies macroalgales como Gracilaria mammillaris, G. damaecornis, G. cervicornis, Hypnea musciformis, Bryothamnion triquetrum y algas pardas como Padina haitiensis y Dictyota volubilis; capaces de desarrollar hábitats de alta productividad que brindan refugio y contribuyen con la fijación de epifitos, fuente directa o indirecta de alimento para muchas especies de crustáceos decápodos como los registradas en el estudio. La mayor abundancia de la familia Porcellanidae en Punta Graw y Punta Bello se debe probablemente al aporte de carga orgánica proveniente de los arroyos Bijao Chiquito y Carbonero que es acumulada por frondes algales y proporcionan las condiciones para el desarrollo de estas especies. La presencia de la familia Mithracidae se fundamenta en las presas potenciales que ofrece los céspedes algales en estos puntos de muestreo (10). Para la familia Epialtidae, se determinó la mayor abundancia en El Porvenir y Punta Bello respondiendo a la composición y diversidad algal, principalmente de rodófitas. Según Quirós (4) estos puntos se caracterizan por presentar familias de algas rojas como Gracilariaceae, Rhodomelaceae e Hypneaceae importantes en desarrollo y ciclo biológico reproductivo de la familia. La familia Alpheidae y Hippolytidae, estuvieron presentes; en cuanto al número de especies, se evidenció una relación entre estas familias con los céspedes algales. Endean (28) reportó especies de vida libre del género Alpheus y Hippolyte como características de fanerógamas marinas. Según Quirós (4) y Quirós y Campos (15), las comunidades algales, así como las praderas de fanerógamas marinas, proporcionan numerosos hábitats, refugio y alimento, ofreciendo una gama de alternativas para ser colonizadas por un gran número de camarones y otros crustáceos. La presencia de la familia Panopeidae con la especie Micropanope nuttingii significa que en estos sectores, donde se desarrolla, poseen una alta acumulación de restos calcáreos (21). Según Campos et al (29), esta especie además, presenta un rango de distribución amplio que se proyecta desde el intermareal hasta los 200 m, mientras Sánchez y Sandoval (30) la registran a 1 y 3 m. Lo anterior, sumado a las características coralinas justifica la presencia de la especie en los puntos establecidos. Una razón para la mayor abundancia de Petrolisthes armatus y Pachycheles serratus en la ecorregión es al aporte de partículas orgánicas en suspensión (FPMO;<1mm) provenientes

Quirós - Crustáceos decápodos asociados a ensamblajes macroalgales de los arroyos Bijao Chiquito y Carbonero, así como el efecto diferencial de las descargas de sedimentos producidas por las corrientes de arrastre del río Sinú que es acumulada por los frondes algales y proporcionan las condiciones necesarias para el desarrollo de estas especies. Werding (7) señala que la familia que agrupa estas especies es filtradora, además mantiene y modifica las características funcionales de un ecosistema con relación a su alimentación. De manera que es la encargada de regular la tasa de circulación de los nutrientes y la influencia de ascenso y descenso de la materia orgánica. Por otra parte, el gran porcentaje de abundancia de estas especies se vio favorecida por las condiciones propias de la época de lluvia, propiciando las condiciones adecuadas para el desarrollo de estas especies en la ecorregión durante el periodo de estudio. Al establecer la relación entre las especies de crustáceos de decápodos y las poblaciones algales a las que se asocian, se determinó que Gracilaria mammillaris, Hypnea musciformis y Acanthophora spicifera en el sector Morrosquillo, crecen y se desarrollan cerca a praderas de Thalassia testudinum, parches de corales y extensiones de manglares que se proyectan intermitentemente a lo largo de la franja costera (4), generando las condiciones para que especies de algas rojas como las descritas anteriormente aumenten sus coberturas (3) y permitan un incremento en la abundancia de P. armatus y P. serratus. Según Werding (7) estos decápodos se favorecen por el flujo de materia y energía entre estos ecosistemas. Sector entre Moñitos y Los Córdobas. En este sector, se colectaron 27 especies de crustáceos decápodos con una abundancia total promedio de 18.6 ± error estándar 12.1 ind/625 cm2. Esta tendencia comparada con los resultados obtenidos en el sector sur del golfo de Morrosquillo, muestra la dominancia de menos especies con un mayor número de organismos. Esta característica puede ser el resultado de las adaptaciones de ciertas especies a condiciones ambientales más exigentes como el oleaje que incide frontalmente sobre los acantilados, corrientes de deriva litoral, en sentido suroeste y el aporte de aguas continentales, que provocan una baja salinidad en ciertos segmentos de la línea costera de la región (15). En el estudio se observó una mayor abundancia de cangrejos de la familia Grapsidae y Plagusiidae, el cual sugiere la posibilidad de poblaciones mejor adaptadas a condiciones de mayor carga orgánica, aguas menos salobres y sustratos con una mayor incidencia de factores dinámicos.

2843

La presencia de familia Panopeidae se fundamenta en su tolerancia a la materia orgánica de diferente origen y resistencia a la incidencia de cuerpos de agua dulce (30); Pachygrapsus transversus se registró en todos los puntos de muestreo, lo que sugiere la capacidad para ajustare a diferentes ambientes litorales rocosos (4,15). Además, se alimenta de las algas adheridas a las sustratos duros (22). La familia Epialtidae fue dominante en este sector, debido a la disponibilidad sustrato, oferta alimenticia y tolerancia de la familia a condiciones hidrodinámicas extremas (15,30). Estas condiciones según lo descrito por Vélez (10), son las adecuadas para el establecimiento de especies como Epialtus bituberculatus y Acanthonyx petiverii, distribuyéndose principalmente en el intermareal y zona de incidencia del oleaje. Lo anterior se complementa con el estudio de Sánchez y Sandoval (30), quienes colectaron a E. kingsleyi y E. brasiliensis en sustrato rocoso artificial desde el intermareal hasta 3 m de profundidad. En este sector G. damaecornis y Padina gymnospora presentaron una asociación con E. bituberculatus y A. petiverii. Esto se explica, teniendo en cuenta que G. damaecornis y P. gymnospora crecen en condiciones más extremas, como son la de encontrarse sobre sustratos rocosos y de fuerte dinámica provocada por las corrientes litorales y el rompimiento de las olas, por otro lado, los altos niveles de iluminación en la ecorregión, probablemente favorecieron la tasa de crecimiento de estas macroalgas (3), influyendo en la presencia y aumento en el número de individuos de E. bituberculatus y A. petiverii. Lo anterior se complementa con el estudio de Vélez (10), quien menciona que especies de decápodos como los descritos, se adaptan anatómica y fisiológicamente sobre sustratos algales, justificando la relación planta animal. En conclusión, los resultados indicaron que las especies de crustáceos decápodos asociados a ensamblajes macroalgales, no se encontraron distribuidas de forma similar en las dos ecorregiones estudiadas, siendo P. armatus la especie con mayor porcentaje de abundancia en la ecorregión Morrosquillo, y E. bituberculatus en el sector comprendido entre los municipios de Moñitos y Los Córdobas.

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Agradecimientos A la Universidad de Córdoba, por el apoyo logístico e institucional brindado durante la realización del estudio. A la Oficina de Investigación y Extensión de la Universidad por el apoyo económico a través de los proyectos: Composición y cambios estacionales de las poblaciones de crustáceos

decápodos del departamento de Córdoba y distribución espacio temporal de las comunidades macroalgales asociadas al litoral rocoso del departamento de Córdoba, Caribe colombiano. Contribución No. 370 del Centro de Estudios en Ciencias del Mar, CECIMAR de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Caribe

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Quirós - Crustáceos decápodos asociados a ensamblajes macroalgales

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Rev.MVZ 2846 Córdoba 17(1):2846-2851, REVISTA MVZ CÓRDOBA 2012. • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

ORIGINAL

Determinación de factores de virulencia en cepas de Aeromonas spp., aisladas a partir de pescado Determination of virulence factors in strains of Aeromonas spp., isolated from fish William Suárez Q,1* M.Sc, Fanny Herrera A,1 Ph.D. 1Universidad de Pamplona. Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Básicas. Grupo de

Investigación en Microbiología y Biotecnología (GIMBIO). Ciudad Universitaria. Pamplona, Norte De Santander. Colombia. *Correspondencia: aquifex3@hotmail.com Recibido: Mayo de 2010; Aceptado: Junio de 2011.

RESUMEN Objetivo. Investigar la incidencia de cinco marcadores fenotípicos de virulencia en cepas de Aeromonas aisladas a partir de muestras de pescado expendido en Pamplona, Colombia. Materiales y métodos. Se utilizaron 47 cepas identificadas previamente. Se evaluaron: actividad hemolítica en agar sangre, suplementado con 5% de eritrocitos de cordero y agar sangre suplementado con 5% eritrocitos de sangre humana; actividad proteolítica en agar Mueller-Hinton suplementado al 10% (p/v) con leche descremada, actividad lipolítica en agar tributirina; actividad desoxirribonucleasas en agar DNAsa. Resultados. Se encontró que las cepas de A. hydrophila, A. veronii GH 8, A. jandaei, A. veronii GH 10 y A. eucrenophila, demostraron capacidad hemolítica, proteolítica, lipolítica y nucleasa. Todas las cepas de A. popoffii fueron β-hemolíticas en agar sangre humana, proteolíticas y con actividad DNAsa. Las cepas de A. caviae, coincidieron en ser hemolíticas y lipolitícas, mientras que la cepa de A. schubertii, manifestó la presencia de actividad hemolítica y DNAsa. Conclusiones. La frecuencia de los factores de virulencia en las cepas estudiadas fue: el 87% demostraron producción de nucleasas; el 83% fueron β-hemolíticas sobre eritrocitos humanos; el 68% expresaron producción de lipasas, el 63% fueron proteolíticas y el 53% resultaron ser hemolíticas sobre eritrocitos de cordero, indicando estos datos el posible potencial patógeno de las cepas. Estos resultados mostraron que el pescado comercializado en Pamplona, puede ser una fuente importante de especies de Aeromonas que expresan factores asociados a la virulencia para el hombre. Palabras clave: Aeromonas, desoxirribonucleasa, hemólisis, lipasa, pescado, virulencia (Fuente: CAB, DeCS).

2846

Suárez - Determinación de factores de virulencia en cepas de Aeromonas spp.

2847

ABSTRACT Objective. The aim of this study was to determine the incidence of five phenotypic virulence markers in isolated strains of Aeromonas in fish being sold in Pamplona, Colombia. Materials and methods. A total of 47 strains previously identified were used. Haemolytic activity on blood agar, supplemented with 5% sheep erythrocytes, and blood agar supplemented with 5% human erythrocytes; proteolytic activity in Mueller-Hinton agar supplemented with 10% (w/v) skim milk; lipolytic activity on tributyrin agar and deoxyribonuclease (DNase) activity on DNAse agar plates were evaluated. Results. Strains of A. hydrophila, A. veronii GH 8, A. jandaei, A. veronii GH 10 and A. eucrenophila demonstrated haemolytic, proteolytic, lipolytic and nuclease capacities. All A. popoffii strains were β-haemolytic, proteolytic and with DNase activity on human blood agar. Strains of A. caviae, also were haemolytic and lipolytic, whereas the strain of A. schubertii presented haemolytic and DNase activity. Conclusions. The frequence of the virulence factors in the studied strains was: 87% of the isolates presented nuclease production, 83% were β-hemolytic on human erythrocytes, 68% presented lipase production, 63% were proteolytic, and 53% were found to be haemolytic on sheep erythrocytes, these data indicate the possible pathogenic potential of the strains. These results also suggest that the fish sold in Pamplona, could be an important source of Aeromonas species expressing factors associated with virulence in humans. Key words: Aeromonas, desoxirribonucleases, fish, hemolysis, lipases, virulence (Sources: CAD,DeCS).

INTRODUCCIÓN El género Aeromonas está formado por bacilos Gram-negativos, oxidasa-positivos y anaerobios facultativos. Algunas especies han sido relacionadas como agentes de infecciones gastrointestinales y de infecciones extraintestinales. El género Aeromonas en la actualidad incluye 30 especies y 12 subespecies, con la inclusión de A. tecta (1). A. hydrophila, A. veronii biovar sobria, A. caviae, Aeromonas jandaei, A. schubertii y A. trota son las especies frecuentemente aisladas de muestras clínicas (2). En Colombia, por sus condiciones culturales y socioeconómicas, las enfermedades gastrointestinales son un gran problema de salud pública (3). Los estudios epidemiológicos relacionados con la función etiológica de Aeromonas spp., en episodios de diarrea son limitados, ya que pocos laboratorios de microbiología emplean técnicas y métodos específicos para su aislamiento e identificación (4); los procesos entéricos afectan a todos los grupos de edad, sin embargo la población infantil es la más afectada (5,6). La presencia de factores de virulencia en Aeromonas spp. es un hecho reconocido. Sin embargo, la patogénesis de las infecciones causadas por Aeromonas spp. se desconoce. Los factores de virulencia descritos en Aeromonas spp. incluyen tanto componentes estructurales como flagelos, pilis, cápsula, capa S, LPS y proteínas de la membrana externa y productos extracelulares como hemolisinas (7), enterotoxinas citotóxicas y citotónicas (8) proteasas, lipasas, desoxirribonucleasas y sideróforos (4,9,10).

El objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de marcadores fenotípicos de virulencia en cepas de Aeromonas aisladas a partir de muestras de pescado comercializado en la ciudad de Pamplona, Colombia.

MATERIALES Y MÉTODOS. Cepas. En un estudio realizado previamente, se analizaron muestras de pescado comercializado en Pamplona (Colombia), con el fin de determinar la presencia de Aeromonas, logrando aislar un total de 47 cepas. La adscripción a especie de estas cepas se realizó por métodos bioquímicos tradicionales (11). La tabla 1 indica las especies aisladas. Las cepas se conservaron congeladas en glicerol, Tabla 1. Especies de Aeromonas aisladas en muestras de pescado Especie

Número de cepas1

A. hydrophila

A. veronii GH 8

A. jandaei

A. veronii GH 10

A. popoffii

A. eucrenophila

A. caviae/A. media

A. schubertii TOTAL 1Cantidad de cepas aisladas de cada especie.

1 47

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de donde se tomaron 20 µL y se inocularon en Agar Base Rojo de Fenol incubando a 30ºC durante 18 horas, para confirmar la pureza del cultivo. Después las colonias fueron sembradas en Agar Nutritivo (AN), y se evaluaron las siguientes actividades: Actividad hemolítica. Se empleó el agar sangre suplementado con 5% eritrocitos de cordero y agar sangre suplementado con 5% eritrocitos de sangre humana. Para esto, a partir de cada una de las cepas cultivadas en el medio AN, se tomó una asada de cultivo y se sembró en spot en la superficie de cada uno de los dos tipos de medios de cultivo, incubando a 30°C durante 24 h. La presencia de zonas claras alrededor de las colonias indicó la actividad β-hemolítica. Actividad proteolítica. Se evaluó la actividad caseinolítica de las cepas de la siguiente manera. Las colonias cultivadas en el medio AN se inocularon en spot sobre la superficie de placas de petri conteniendo agar MuellerHinton suplementado al 10% (p/v) con leche descremada, y se incubaron a 30°C durante 24 h. La presencia de una zona transparente alrededor de las colonias indicó la actividad proteolítica. Actividad lipolítica. La actividad lipasa se determinó tomando una asada a partir del cultivo de las cepas en el medio AN, sembrando en spot en la superficie de placas de petri conteniendo agar Tributirina, e incubando a 30°C durante 24 h, la presencia de un halo opaco alrededor de las colonias, indicó la actividad de la lipasa. Actividad Desoxirribonucleasa. A partir de colonias de las cepas cultivadas en el medio AN, se transfirió una asada sobre el agar DNAsa, realizando siembra en spot y se incubó a 30°C durante 24 h. Posteriormente, se reveló inundando la caja con HCl 1 M, evaluando como

positivo las que presentaron un halo alrededor de las colonias.

RESULTADOS En la tabla 2, se relaciona la distribución de los factores de virulencia en las diferentes especies de Aeromonas analizadas. Como puede observarse, la gran mayoría de las cepas de A. hydrophila, A. veronii GH 8, A. jandaei, A. veronii GH 10, A. eucrenophila y A. popoffii, expresaron todos los factores de virulencia analizados, indicando esto, el posible potencial patógeno de las cepas. Con relación a la frecuencia de los factores de virulencia en las cepas analizadas, los resultados más altos se presentaron para producción de nucleasas (87%), para actividad hemolítica en eritrocitos humanos (83%), siendo menor la producción de lipasas (68%), la producción de proteasas (63%) y la actividad hemolítica en eritrocitos de cordero (53%). Las cepas de A. caviae no expresaron actividad caseinolítica y aquéllas identificadas como A. schubertii no presentaron β-hemólisis en eritrocitos de cordero y fueron negativas para la actividad proteasa, proteolítica y lipolítica.

DISCUSIÓN Aunque se han realizado numerosos estudios para esclarecer los mecanismos de patogenicidad en las infecciones causadas por Aeromonas spp., aún no se han dilucidado completamente (1,4). Sin embargo, se han identificado varios factores de virulencia entre los que se incluyen un gran número de enzimas extracelulares que parecen jugar un papel importante en la patogenicidad de estas bacterias (12,13); La producción de enzimas extracelulares es muy variable dentro de las especies de Aeromonas,

Tabla 2. Incidencia de cinco factores de virulencia en especies de Aeromonas. Número de cepas (%) CEPA

A. hydrophila

N° de cepas

β-hemólisis Sangre de cordero

Sangre humana

Proteólisis

Lipólisis

DNAsas

8 (57)

10 (71)

7 (50)

10 (71)

11 (79)

A. veronii GH 8

5 (56)

7 (78)

6 (67)

8 (89)

A. jandaei

4 (50)

8 (100)

6 (75)

7 (88)

A. veronii GH 10

4 (50)

6 (75)

5 (63)

3 (38)

8 (100)

A. popoffii

2 (67)

3 (100)

2 (67)

3 (100)

A. eucrenophila

1 (50)

2 (100)

A. caviae

1 (50)

2 (100)

0 (0)

2 (100)

1 (50)

A. schubertii

0 (0)

1 (100)

0 (0)

1 (100)

25(53)

39(83)

30 (63)

32 (68)

41 (87)

Total

Suárez - Determinación de factores de virulencia en cepas de Aeromonas spp. se considera que A. hydrophila y A. sobria los tienen con mayor frecuencia y A. caviae con menor frecuencia (7). Entre estos factores, la actividad hemolítica es la más relacionada con la enterotoxicidad de las cepas, siendo la aerolisina la hemolisina mejor estudiada (1). Las cepas de A. hydrophila aisladas en este estudio, demostraron una alta capacidad hemolítica, resultados que concuerdan con los hallados por otros autores (11,12); las cepas de A. caviae fueron hemolíticas en agar sangre humana y de cordero. Un estudio diferente reveló que el 52% de las cepas de A. caviae eran β-hemolíticas en agar sangre de cordero (11). El 50% de las cepas de A. jandaei aisladas aquí fueron hemolíticas en sangre de cordero. Resultados de otro ensayo demostraron que el 100% de las cepas de A. caviae y A. jandaei aisladas de pacientes con bacteriemia eran hemolíticas (12). De igual forma, se ha determinado que el 56.25% de cepas de A. hydrophila, el 26.05% de las cepas de A. caviae y el 100% de cepas A. veronii biovar sobria aisladas de niños menores de cinco años con enfermedad diarreica aguda, eran β-hemolíticas (14). Otra publicación reveló que el 100% de las cepas A. hydrophla y A. caviae, de origen ambiental y clínico expresaron esta actividad (15). En cuanto a las cepas de A. popoffii, un alto porcentaje de ellas demostró actividad β-hemolítica (Tabla 2), coincidiendo con los resultados encontrados por otros autores (16). Respecto a los sustratos empleados, el 83% de las especies de Aeromonas expresaron actividad hemolítica sobre eritrocitos humanos, mientras que el 53% lo hicieron sobre eritrocitos de cordero, aspecto que fue analizado previamente, indicando que los eritrocitos de cordero son menos sensibles que los eritrocitos de otros mamíferos (10). El 87% de las especies estudiadas demostraron actividad nucleasa (DNAsa) y, aunque no se conoce con precisión su posible función en la patogenia de Aeromonas, se sabe que son importantes para la nutrición bacteriana (16); estas enzimas son importantes para el establecimiento (invasión de las células huéspedes), desarrollo de la infección y, en otras bacterias como Streptococcus, se ha demostrado que las DNAsas están involucradas en infecciones bacterianas en humanos (17). Adicionalmente, se ha señalado que cepas de Aeromonas DNAsas positivas están relacionadas con septicemia en humanos (12,17); se considera a A. hydrophila como la principal especie productora de nucleasas aspecto que, si se tienen en cuenta el número de cepas aisladas

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pertenecientes a esta especie, fue ratificado con los resultados de este estudio. El 50% de las cepas de A. caviae aisladas demostraron actividad DNAsa (Tabla 2); Otros autores (13), detectaron actividad DNAsa en el 66% de cepas de A. caviae aisladas de muestras fecales de niños con diarrea aguda. Con relación a la producción de lipasas, el 68% de las cepas de Aeromonas evaluadas expresaron esta actividad; se cree que estas enzimas pueden alterar la membrana plasmática del huésped (16). Igualmente, se sabe que las lipasas interactúan con los leucocitos humanos y que la deleción en los genes que las codifican reducen los efectos letales de las cepas en ratones y peces (18,19); se reconoce a A. hydrophila como una importante productora de lipasas, lo que fue corroborado por los resultados del estudio en cuestión. Se ha reportado, además, que por lo menos el 91% de las cepas de A. hydrophila, A. caviae y A. veronii biovar sobria aisladas de pacientes con diarrea en Brasil demostraron actividad lipolítica (18). En conjunto, en el 63% de las especies se detectaron proteasas. Se considera que el papel principal de las proteasas es establecer y mantener la infección. Éstas son capaces de degradar diferentes compuestos como albúmina, fibrina, gelatina y elastina (20) y pueden estar involucradas en el mantenimiento de infecciones en heridas de humanos (20, 21). Resultados de otro estudio han indicado que el 100% de cepas de A. hydrophila, A. caviae y A. veronii biovar sobria aisladas de pacientes con diarrea demostraron actividad proteolítica (18). En el presente estudio, 50% de las cepas de A. hydrophila fueron proteolíticas (Tabla 2); Se ha reportado que el 90% de las cepas de A. hydrophila de origen clínico evidenciaron actividad proteolítica (22). En cuanto a las cepas de A. caviae, ninguna de ellas mostró actividad proteasa, resultado que no se relaciona con los hallazgos de otro ensayo, en el que se comprobó actividad proteasa en por lo menos el 58% de las cepas de A. caviae aisladas de infección intestinal en humanos (13). Es importante destacar, que un alto porcentaje de las cepas identificadas como A. veronii biovar sobria o A. veronii GH 8 (anteriormente, A. sobria), presentaron actividad hemolítica, proteolítica, lipasa y DNAsa, coincidiendo con los resultados obtenidos en diferentes estudios (18,23); Otros autores, encontraron que el 100% de A. veronii biovar sobria aisladas de pacientes con septicemia eran hemolíticas (12). Adicionalmente, se reportó que el 50% de aislamientos provenientes de procesos

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diarreicos en humanos correspondientes a A.veronii biovar sobria, arrojaron resultados positivos para actividad hemolítica (24). En total, el 83% de las cepas ensayadas fueron β-hemolíticas sobre eritrocitos humanos, 63% fueron proteolíticas, 68% expresaron producción de lipasas y el 87% demostraron producción de DNAsa, resultados que concuerdan con los hallados en un estudio realizado previamente, en el que se demostró actividad hemolítica, proteolítica, lipasa y DNAsa en el 60.5, 69.5, 73.6 y 68.6% respectivamente, de cepas de Aeromonas aisladas a partir de alimentos, señalando que estas cepas pueden representar un riesgo potencial para la salud del hombre (25).

En conclusión, en este estudio se logró determinar que un elevado porcentaje de cepas de Aeromonas, aisladas a partir de pescado consumido en la Ciudad de Pamplona (Colombia), demostraron marcadores fenotípicos de virulencia relacionados con la patogenicidad de las mismas en el ser humano. En todo caso, es importante investigar la presencia de genes que codifican factores de virulencia en las cepas estudiadas, como son hlyA, aerA, act, alt y ast, y así confirmar el rol de las cepas como vehículos de enfermedad en el hombre.

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ORIGINAL

Técnica para aislamiento de bacteriófagos específicos para E.coli DH5α a partir de aguas residuales Bacteriophages specific for DH5α strain of E. Coli from wastewater isolation techniques Gabriel Gaviria A,1 Biól, María González de S,1 M.Sc, Jhon Castaño O,1* Ph.D. 1Universidad del Quindío. Facultad Ciencias de la Salud. Centro de Investigaciones Biomédicas. Gru-

po de Inmunología Molecular (GYMOL). Carrera 15 Calle 12 Norte, Teléfono: +57(6) 7460168. Armenia, Colombia. *Correspondencia: jhoncarlos@uniquindio.edu.co Recibido: Septiembre de 2010; Aceptado: Junio de 2011.

RESUMEN Objetivo. Establecer una técnica para el aislamiento de bacteriófagos a partir de aguas residuales específicos para E. coli DH5α. Materiales y métodos. Se tomó como base el método 1601 de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos de América y un método de obtención de enterovirus a partir de aguas residuales. En el desarrollo del protocolo se realizaron múltiples pruebas utilizando como control positivo el bacteriófago T4 y los aislamientos de bacteriófagos obtenidos a partir de aguas residuales. Resultados. Se observó la formación de unidades formadoras de placa (UFP), se obtuvó la titulación de los bacteriófagos presentes en cada uno de los cultivos de E.coli DH5α, se determinaron las relaciones que existen entre la cuantificación de la formación de unidades formadoras de placa (UFP) del tratamiento control y el tratamiento experimental y las respectivas características de las (UFP) en cada uno de los experimentos realizados. Conclusiones. Se logró establecer un protocolo microbiológico para el aislamiento de bacteriófagos específicos para E. coli DH5α. Palabras clave: Aislamiento, bacteriófagos, E. coli (Fuente: CAB).

ABSTRACT Objetive. To develop an isolation technique for DH5α E. coli specific bacteriophages in wastewater. Materials and methods. The 1601 method of the Environmental Protection Agency of the United States of America and an wastewater enterovirus obtaining method were used as a reference. During the development of the protocol, multiple tests were performed using the T4 bacteriophage as positive control and the bacteriophage isolates obtained from wastewater. Results. Plaque-forming units (PFU) were observed; tittering of bacteriophages present in each of the DH5α E. coli cultures was obtained; the relationships between the quantification of PFU in the control and experimental groups, and their corresponding PFU characteristics were determined for each of the experiments. Conclusions. It was possible to establish a microbiological protocol for the isolation of bacteriophages specific for DH5α E. coli. Key words: Bacteriophage, isolation, E. coli (Source: CAB). 2852

Gaviria - Técnicas para aislamiento de bacteriófagos especificos para E.Coli

INTRODUCCIÓN Los bacteriófagos son virus que fueron descubiertos de forma independiente por los microbiólogos Frederick W. Twort (1) en 1915 y Félix d’Hérelle (2) en 1917. Siendo esta la última clase principal de virus en ser descubierta; este tipo de virus constituye un sistema simple y de gran abundancia en la naturaleza. En esencia, los bacteriófagos se encuentran de manera ubicua en el ambiente y en el lugar en que se encuentre su célula huésped (3). Los bacteriófagos son virus que infectan y se multiplican en la bacteria, llevando a la destrucción la célula hospedera con la liberación de bacteriófagos que re-infectan otras bacterias. Los bacteriófagos fueron descubiertos en las primeras décadas del siglo XX, pero su uso clínico no se extendió en países occidentales sino hasta la década del 80, debido a diferentes razones. A pesar de que se realizaron múltiples esfuerzos para generalizar su uso como agentes terapéuticos en las décadas de 1920 y 1930 fueron cayendo en el olvido por la ciencia de la época debido al descubrimiento de los antibióticos. Un papel muy importante jugó la Asociación Médica Americana, la cual recomendó que se debía dejar todo tipo de tratamiento a través de bacteriófagos. Este rechazo se dio por razones como el desconocimiento de la biología de los bacteriófagos para ese entonces, el diseño erróneo de los protocolos experimentales y la falta de controles adecuados en los diferentes experimentos realizados (2). Además, con el empleo generalizado de los antibióticos para combatir infecciones, durante casi cuarenta años se abandonó en occidente cualquier tipo de investigación sobre el uso de bacteriófagos como agentes terapéuticos, aunque se usaron de forma extensa para análisis genéticos y para establecer las bases de la biología molecular. Posteriormente, para la década de 1980, de nuevo se empezaron a usar los bacteriófagos en animales de experimentación en los países occidentales. En este sentido, los trabajos de Smith y Huggins (4) en la década del 80 se pueden considerar como un punto de inflexión, al retomar de nuevo la importancia de los bacteriófagos en la terapia animal, ya que de estos se habían obtenido resultados muy esperanzadores. Los bacteriófagos se componen de un solo tipo de ácido nucleico (ARN o ADN) encapsulado por una cubierta proteica que exhibe los elementos estructurales necesarios para una infección específica (5). Algunos presentan una envoltura

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lipídica que se deriva de la célula hospedera. La conformación y organización proteica de sus cápsides les confiere la habilidad de permanecer viables por largos períodos de tiempo en el ambiente en condiciones adversas, como la exposición a ADN-asas, variaciones de pH y temperatura (6). Los bacteriófagos han sido tomados como modelo para el estudio de la genética bacteriana y los mecanismos de control de la expresión génica, debido a que los hospederos bacterianos son fácilmente cultivables y manejables en el laboratorio (7). Los bacteriófagos, entre otras utilidades dentro de las ya conocidas, sirven como herramienta para la modificación genómica bacteriana y para la construcción de vacunas a nivel terapéutico. Además, en terapias alternativas, para el tratamiento de infecciones producidas por bacterias; dicha utilidad es sustentada por investigadores y científicos a través de estudios rigurosos, donde se han aislado bacteriófagos y posterior a esto se han caracterizado de forma específica, siendo utilizados respectivamente de acuerdo con el interés investigativo. Algunos de estos trabajos han sido realizados por varios autores (7-17). Debido a la adaptación de patógenos multirresistentes a los antibióticos se están retomando los estudios sobre fagoterapia (7,18). Se consideró importante el uso de aguas residuales para este estudio debido a su composición o naturaleza. Las aguas servidas consisten de dos componentes: un efluente líquido y un constituyente sólido en el que se asocian diferentes tipos de materiales particulados como sedimentos de residuos biológicos, lodo y otras sustancias. A este tipo de material se asocian microorganismos como bacterias, hongos y virus, los cuales tienen como sustrato los contenidos de este tipo de aguas (19). Debido a que, por el grado de contaminación que presentan, en las aguas residuales se encuentra gran cantidad de bacterias de diferentes especies y se espera encontrar también los bacteriófagos que infectan estas mismas bacterias, ya que estos últimos constituyen un control biológico para las colonias bacterianas. La presencia de bacteriófagos en aguas residuales se explica, además, por el hecho de que en el agua dulce, que constituye su base primaria, la abundancia de bacteriófagos es de 10 a 20 veces mayor que la de la cédula hospedera (20). Aunque en la actualidad en la región de estudio no se cuenta con gran experiencia en las metodologías de aislamiento y no se han reportado obtenciones de bacteriófagos a partir de aguas negras, por lo anterior se propone como objetivo estandarizar

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una técnica para el aislamiento de bacteriófagos específicos para E. coli DH5α a partir de aguas residuales.

MATERIALES Y METODOS Obtención de bacteriófagos. Para alcanzar los objetivos propuestos se desarrolló la siguiente metodología, se utilizaron 5 litros de agua residual para la obtención de bacteriófagos. Se realizaron 7 repeticiones de cada uno de los experimentos, siguiendo lo sugerido por varios autores (16,21,22). Esto se realizó para brindar una mayor confiabilidad de los resultados en cuanto a la estandarización de la técnica para el aislamiento de bacteriófagos a partir de aguas residuales. Sitio de estudio y toma de la muestra. Se tomó un litro de agua residual de un vertedero de aguas residuales del municipio de Salento, Quindío, utilizando una botella de plástico nueva y limpia. Se almacenó a 4ºC en una nevera de poliestireno expandido y luego se transportó al laboratorio para su procesamiento. Aislamiento de bacteriófagos. Una vez en el laboratorio, se llevó el litro de agua residual a centrifugación a 5100 x g a 4ºC durante 30 minutos, en una centrifuga de Marca IEC modelo B-22 M 34961048. Concluido este tiempo, el sobrenadante se transfirió a un frasco plástico de 1.5 L. El precipitado se resuspendió en 1 mL de extracto de carne y 1 mL de cloroformo y se almacenó en tubos de vidrio de 10 mL. Esta solución se homogenizó utilizando un vórtex durante 3 min y se centrifugó a 1050 x g a 4ºC durante 30 minutos. Una vez finalizado este ciclo, se colectó el sobrenadante, el cual se depositó en el frasco de plástico de 1.5 L que contenía el sobrenadante de la primera centrifugación. El precipitado restante se resuspendió en 1 mL de extracto de carne y se sometió nuevamente a centrifugación bajo las mismas condiciones antes mencionadas. Finalmente se tomó de esta etapa el sobrenadante y se almacenó en el frasco de plástico mencionado al inicio de este protocolo. Luego, al total de muestra almacenada en el frasco de 1.5 L, se le agregaron 17.5 g de cloruro de sodio (NaCl) y 80 g de polietilenglicol (PEG) y se dejó en reposo, almacenado a una temperatura de 4ºC durante 24 horas. Posteriormente se centrifugó esta solución a 5100 X g a 4ºC durante 45 minutos. Al finalizar este paso se descartó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió con 1 mL de solución amortiguadora de fosfato al 1x (PBS). Luego, para lavar el frasco donde se encontró

el precipitado se pipeteó varias veces y, finalmente, se obtuvieron aproximadamente 6 mL de la muestra, la cual se almacenó en tubos de vidrio y se le agregó medio volumen de cloroformo (50% de la muestra y 50% de cloroformo). Esta solución se homogenizó utilizando un Vórtex a una velocidad media durante 3 minutos y se centrifugó a 1050 X g a 4ºC durante 30 minutos. Después se coleccionó el sobrenadante en un tubo Falco de 15 ml y al precipitado resultante se le agregaron 2 mL de extracto de carne al 3% y se centrifugó nuevamente a 1050 X g a 4ºC durante 30 minutos. Luego se coleccionó el sobrenadante junto con la muestra mencionada en el paso anterior. Esta muestra se distribuyó en viales almacenando 2 mL del sobrenadante y se almacenó a 4ºC. Tratamiento para limpieza de las muestras final que contienen los bacteriófagos. Se tomaron 1300 μL de la muestra que se obtuvo en la fase de aislamiento y se almacenaron en un vial. Se les agregaron 100 μL de cloroformo, se agitaron por un tiempo de 3 min en el Vórtex a velocidad media y, posteriormente, se centrifugaron a 2500 x g durante 10 min. Una vez finalizada esta etapa se llevaron a la cabina de flujo laminar y el sobrenadante resultante se distribuyó en cantidades de 200 μL en viales y luego se almacenó a una temperatura de -70ºC. Cultivo de la bacteria anfitrión (E. coli DH5α). Se preparó como medio de cultivo para las bacterias caldo tripticasa de soya (CST). Se tomaron 5 mL de este, y se almacenaron en un tubo cónico de 15 mL, se les agregaron 100 μL de una solución de E. coli DH5α bacteria huésped, y se dejó crecer durante 24 horas en movimiento en un agitador orbital a 70 r.p.m. Posterior a esto, se realizó una resiembra. Se tomó 1 mL de las bacterias antes cultivadas y se inoculó en un tubo con 30 mL de caldo tripticasa de soya (CST) y se dejó crecer durante 4 horas. Preparación del inóculo viral en diluciones seriadas. Se tomaron 14 viales de 1.5 mL (Eppendorf), de los cuales 7 se utilizaron para el experimento con el bacteriófago control (Fago T4) donado por el Dr. KendDuor de la Universidad de California y 7 para la muestra de bacteriófagos obtenida a partir de aguas residuales mediante el protocolo antes descrito. Se marcó cada uno de los viales indicando su respectiva dilución. Luego, a cada uno se le agregaron 900 μL de caldo tripticasa de soya. A continuación, se inocularon en el vial #1 100 μL de la muestra que contiene los bacteriófagos. Se mezcló utilizando un Vórtex por un tiempo de 1

Gaviria - Técnicas para aislamiento de bacteriófagos especificos para E.Coli min. Luego se tomaron de esta primera dilución 100 μL de su contenido y se agregaron al vial # 2, realizándose el mismo procedimiento antes mencionado, y de esta forma se realizaron de forma sucesiva las 7 diluciones dobles seriadas. De igual forma se realizó para la solución que contenía el bacteriófago T4, el cual se tuvo en cuenta como control positivo en este protocolo. Fase de infección con bacteriófagos a las células bacterianas. Se tomaron 14 viales (Eppendorf) y se marcó doblemente cada vial respectivamente desde -1 hasta -7, representando cada una de las diluciones realizadas. Luego, a cada uno de los viales se le colectaron 500 μL de las diluciones realizadas. Estos contenidos se almacenaron en los tubos previamente marcados y a cada uno de ellos se les agregaron 100 μL de las bacterias repicadas con un tiempo de crecimiento de 4 horas. Al mezclarse los bacteriófagos con las bacterias se esperó un tiempo aproximado de 4 minutos, lo cual facilitó de cierta manera que muchos de los bacteriófagos infectaran gran cantidad de bacterias en esta siembra. Siembra de inóculos virales y bacterianos. Se tomaron 14 tubos cónicos de 15 mL, se marcaron doblemente los tubos de -1 hasta -7, se le agregó a cada uno de ellos agar suave tripticasa de soya previamente esterilizada y en solución. Se llevaron al baño María, en el cual se estabilizó su temperatura entre un rango de 45ºC y 50ºC. Luego se tomaron los inóculos previamente preparados en los viales de 1.5 μL y se vertieron en el agar suave tripticasa de soya. Se mezcló ligeramente, garantizando una buena distribución del inóculo en esta siembra. Se vertió el contenido total a cajas de Petri previamente marcadas, siguiendo el orden de cada una de las diluciones. Se dejaron solidificar y, posterior a esto, se les agregó una segunda capa de agar siguiendo las modificaciones para la siembra (21). Una vez solidificado todo el contenido de cada caja se sellaron con papel celofán o parafilm para evitar contaminación y se llevaron a la incubadora microbiológica durante 24 h a 37°C. Titulación de bacteriófagos. Se tomó cada una de las cajas de Petri y se registró en la bitácora de acuerdo con su número de dilución. A cada una se le determinó el número de unidades formadoras de placa (UFP), una vez determinado este, se multiplicó por el inverso de la dilución, para así saber el contenido de bacteriófagos en cada una de las muestras respectivamente (21).

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Análisis estadístico. Se tomó como modelo estadístico el análisis de interacción con dos factores. El análisis de ANOVA se realizó mediante el software estadístico Statgraphics Centurion XV. Se compararon los resultados entre los tratamientos control (FT4) y experimental (Bacteriófagos a partir de aguas residuales).

RESULTADOS En el conteo y observación de las UFP, que se realizaron al tratamiento control con el bacteriófago T4 y al tratamiento experimental de los bacteriófagos obtenidos a partir de aguas residuales, se encontró que no existe una diferencia significativa (p>0.05) entre los tratamientos, (Figura 1). Sin embargo, aunque la diferencia no fue marcada, en la lectura de placas del tratamiento control se observó un mayor número de estas. En los conteos realizados se cuantificó un mayor número de UFP dentro del experimento control que dentro de la prueba experimental.

Figura 1. Análisis de interacción de dos factores para la variación en los tratamientos control (FT4) y experimental (Bacteriófagos obtenidos a partir de aguas residuales) respecto a la lectura o titulación de placas (UFP) o calvas.

En la estandarización del protocolo se encontró que algunas variables, como la temperatura, afectan de manera directa la fase de infección viral, y por ende la titulación de los bacteriófagos. De las diluciones seriadas que se realizaron se tomó cada uno de los volúmenes del inóculo que se usó como muestra, tanto para la prueba control, como para la prueba experimental. Estas diluciones facilitaron las lecturas de las placas de lisis observadas. Se observó que, al realizar los ensayos experimentales en el laboratorio, se debe tener en cuenta no exceder las diluciones en una cifra superior a 1 x10-6, ya que en el momento de cuantificar los bacteriófagos no existen diferencias significativas entre las

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diluciones, a medida que estas se amplían a partir de este punto de dilución (Figura 2). Los resultados que se obtuvieron al comparar las medias de cada una de las diluciones entre la prueba control y la experimental presentaron un comportamiento igual a lo observado de forma cuantitativa en el momento en que se contaron las UFP. Figura 3. Análisis de interacción de dos factores para la variación de las diluciones seriadas realizadas en cada uno de los experimentos de detección de bacteriófagos, tanto para el tratamiento control como para el tratamiento experimental, respecto a la titulación o cuantificación de bacteriófagos que se realizó.

Figura 2. Análisis de interacción de dos factores para la variación de las diluciones seriadas realizadas en cada uno de los experimentos de detección de bacteriófagos respecto a la lectura o titulación de placas (UFP) o calvas.

El comportamiento resultante del modelo estadístico utilizado mostró también que entre cada una de las diluciones realizadas desde 1x102 hasta 1x10-6 existe diferencia significativa (p>0.005; Figura 2). Partiendo de este análisis estadístico se deduce hasta qué punto se deben extender las diluciones, una vez se ha iniciado un ensayo con bacteriófagos obtenidos a partir de aguas servidas específicos para E. coli DH5α.

no definidas o confluentes. En la gran mayoría de ensayos realizados se pudo observar de manera clara gran cantidad de unidades formadoras de placa (UFP) (Figuras 5 y 6). Dentro de los cultivos de la dilución 1x10-1 se observaron muchas UFP unidas entre sí y pocas claras y diferenciadas una de otra. Estas se observaron en diferentes puntos, los cuales no presentaron las características esperadas de la lisis celular en esta dilución por la gran cantidad de bacteriófagos que se debe encontrar en esta. Debido a esto, al llevar los datos al modelo estadístico donde se realizó el análisis de interacción con dos factores, está presente una inconsistencia, la cual se puede inferir como un error al momento de la toma de datos en la titulación fágica. Sin embargo, la aclaración antedicha de los datos encontrados y de lo que

La lectura de placas que se realizó en cada una de las diluciones hechas para el tratamiento control y para el tratamiento experimental mostró que entre la dilución 1x10-1 de ambos tratamientos no existió diferencia significativa (p>0.005; Figura 3), en las diferentes repeticiones que se realizaron para determinar la confiabilidad en la estandarización de este protocolo en esta dilución. Los datos de la titulación de los bacteriófagos aislados presentaron una desviación de la tendencia al realizar el análisis de la figura 3, donde se observan diferencias entre las diluciones realizadas y la lectura de placas, tanto para el tratamiento control, como para el tratamiento experimental (Figura 3). Entre los resultados que se obtuvieron se observaron UFP de forma circular (Figura 4), claras y de diferente tamaño y otras de formas

Figura 4. Observación de lisis generada por los bacteriófagos obtenidos a partir de aguas residuales en medios de cultivo de E. coli. DH5α.

Gaviria - Técnicas para aislamiento de bacteriófagos especificos para E.Coli

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Figura 5. Observación de unidades formadoras de placa (UFP) con forma circular y altamente diferenciadas una de otra.

Figura 6. Observación de unidades formadoras de placa(UFP) en una monocapa de E. coli DH5α, producto de la acción lítica de bacteriófagos obtenidos a partir de aguas residuales.

se observó en la primera dilución aclara cada uno de estos interrogantes y, por ende, facilita la comprensión del análisis en este caso (Figura 3).

1x 10-6, ya que se ampliaron y se encontró que no existe diferencia significativa entre ambas pruebas. Con esto se observó, además, que las características de las UFP y su titulo fágico eran muy similares. Dentro del trabajo de laboratorio se extendieron en algunos experimentos estas diluciones y se encontró que, en el momento en que se obtuvo el titulo fágico, se presentaron inconsistencias dentro del modelo matemático. Con lo que se encontró, se determinó como útil detallar las 6 primeras diluciones como óptimas para evidenciar la sensibilidad de la prueba o protocolo estandarizado para el aislamiento de bacteriófagos a partir de aguas servidas.

Los resultados del tratamiento control mostraron, en lo general, valores por encima del tratamiento experimental. Esto se presentó ya que en la mayoría de las repeticiones de los ensayos que se realizaron se encontró un mayor número de placas dentro del tratamiento control, cuyas características presentaron formas redondeadas y aisladas una de otra. Cuando se observaron algunas de ellas fusionadas y de forma irregular dentro de las primeras diluciones (1x10-1, 1x10-2, 1x10-3), para la discusión se consideraron sus características y cada una de las formas en las que se presentaron ensayo tras ensayo. Además, se encontró una diferencia significativa en cuanto a la lectura de placas entre el tratamiento control y el tratamiento experimental en la dilución 1x10-3 , como se muestra en la figura 3, en la cual se presenta un mayor número de UFP en el tratamiento experimental que en el tratamiento control. De igual forma, siempre se observó un mayor número de UFP en el control, tanto en el experimento, como en las diferentes repeticiones que se realizaron para confirmar la reproducibilidad y especificidad de la técnica que se estandarizó. Se encontraron las diluciones adecuadas donde se encuentra la sensibilidad de la técnica y, por ende, el factor de dilución hasta donde se deben extender los diferentes experimentos realizados bajo este protocolo. De acuerdo con las observaciones que se realizaron, se describe claramente en la figura 3 que las diluciones que se deben realizar para determinar la sensibilidad que se encontró en este experimento están dentro de 1x10-1 y

DISCUSIÓN En las observaciones y conteos que se realizaron al tratamiento control se determinó que éste obedece a las características propias de la muestra control, ya que, a medida que se encuentra el bacteriófago purificado, se espera una mayor acción lítica a las bacterias que se tienen como anfitrión, en este caso E. coli DH5α. Tanto la cantidad de unidades formadoras de placa(UFP), como la pureza en que encuentren los bacteriófagos, están directamente relacionadas con el tipo de bacteriófago que se utilice en la prueba control. Existen otros factores entre los que se cuenta la alta densidad bacteriana (20). Esto quiere decir que, a mayor densidad del hospedero, mayor es la oportunidad de infección y, por ende, mayor número de unidades formadoras de placa (UFP). Además, esto se relaciona con otro factor o, más bien, otra característica biológica, que es la alta especificidad que poseen los bacteriófagos frente a las células diana que ellos infectan. La característica de especificidad que tienen los

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bacteriófagos depende tanto de las propiedades de la cepa del bacteriófago, como de los receptores específicos situados en la superficie de la bacteria, debido a que la multiplicación de los bacteriófagos ocurre solo cuando el organismo tipo y el bacteriófago coinciden (23). De acuerdo con las observaciones realizadas a los cultivos bacterianos, se encontró la formación de unidades formadoras de placa (UFP) de forma clara y diferenciada, facilitando una mayor precisión en la cuantificación o titulación fágica para los diferentes experimentos realizados. El hecho de que se presente un comportamiento de este tipo, facilita la observación de la lisis que se presenta en cada uno de los cultivos bacterianos y, a su vez, facilita el proceso de titulación de bacteriófagos, no solo en experimentos de este tipo, sino en otros como son la caracterización de algunas bacterias a través de bacteriófagos y algunas relaciones biológicas que existen entre ellos (22). Los conteos que se realizaron en cada uno de los cultivos bacterianos infectados por los bacteriófagos, presentaron diferentes títulos fágicos, inclusive algunas diferencias significativas entre la muestra control y la muestra experimental, especialmente en la primera dilución. Esto se dio debido a que el conteo de las unidades formadoras de placa (UFP) que se realizó en la primera dilución es muy bajo, debido a que, por la gran concentración de bacteriófagos en esta dilución, las Unidades formadoras de placa (UFP) se mezclaron, lo cual hizo que se observaran unas pocas UFP diferenciadas en los cultivos, generadas por la abundante acción lítica en las monocapas bacterianas de E. coli DH5α. Para cada uno de los conteos de unidades formadoras de placa (UFP) se determinaron las características o formas de las UFP para cada cultivo, tanto en el tratamiento experimental, como en el tratamiento control, detallando con esto la titulación fágica como un método para determinar la concentración de bacteriófagos contenidos en cada uno de los ensayos realizados. La observación de la forma y disposición de las placas de lisis no solo permite la cuantificación, sino la determinación de la relación bacteriófago-bacteria (24). Se considera que las diferencias en las placas de lisis implica la presencia de diferentes tipos de bacteriófagos infectantes dentro de una muestra (25). Aunque este no es precisamente el caso del tratamiento control, ya que este es un bacteriófago ya purificado y caracterizado previamente, las particularidades de amorfía que se presenta en las UFP que se observaron

con el FT4 o bacteriófago control, se dan por las altas concentraciones de bacteriófagos que infectan y reinfectan las células bacterianas, haciendo que se tornen de una manera no definida las calvas que se dan por la acción lítica de los bacteriófagos en las bacterias. Sin embargo, lo planteado por Talledo et al(25) sí se ajusta a lo obtenido en el tratamiento experimental, en el cual se observaron y se titularon UFP con unas formas inconsistentes, pero aisladas una de otra, ya que una condición básica dentro de la titulación de bacteriófagos en cultivos sembrados en medio sólidos es que las unidades formadoras de placa(UFP) no necesitan ser precisamente de una forma circular perfecta. El hecho de que se presente una mayor cantidad de unidades formadoras de placa (UFP) en una dilución especifica permite inferir que los bacteriófagos que se titularon según su efecto lítico en esta dilución presentaron una mayor tasa de infección a las células bacterianas que crecieron en este experimento y, por ende, una mayor tasa de replicación de bacteriófagos. El aumento de las unidades formadoras de placa (UFP) en esta dilución se da debido a múltiples factores como son el número de bacterias que crecieron, el cual debe haber sido abundante para que estas bacterias hayan sido infectadas y, por consiguiente, haberse observado una mayor cantidad de unidades formadoras de placa UFP. Otro de los factores que están relacionados con este resultado es la fase logarítmica en la que se deben haber encontrado las bacterias para ser infectadas por los bacteriófagos, ya que si las bacterias se encuentran en el inicio de la fase de latencia o finalización de la fase logarítmica, el porcentaje de infección disminuye y, por ende, disminuye la aparición de unidades formadoras de placa(UFP). Por lo general, los resultados de las titulaciones fágicas siempre serán variables, ya que las condiciones de cada uno de los experimentos son complicadas, lo cual hace que la reproducibilidad de las técnicas de aislamiento de bacteriófagos presente dificultades. Además, se debe tener en cuenta que los resultados de la titulación pueden variar entre un ensayo y otro, por la resistencia que se puede generar por parte de las bacterias a la infección por bacteriófagos (21). Se plantea que para la titulación de bacteriófagos, tanto en razón de UFP por mL, como de unidades formadoras de placa por caja de Petri, se debe tener en cuenta el grado de amplificación de los bacteriófagos y, además, las técnicas de limpieza de cada una de las muestras de bacteriófagos aislados (16). Otro de los factores

Gaviria - Técnicas para aislamiento de bacteriófagos especificos para E.Coli de gran atención para la titulación son las diferentes diluciones realizadas en cada uno de los experimentos, ya que si se tiene un bacteriófago repetidamente amplificado en cultivos de bacterias en medios líquidos, se deben extender las diluciones a títulos de 1x10-6, 1x10-8, 1x1010 y 1x10-12, caso que se presentó en el trabajo de aislamiento de bacteriófagos específicos para R. sphaeroidesa partir de aguas, el cual facilitó el proceso de titulación realizado por este mismo autor. Al relacionar el protocolo de estandarización de aislamiento de bacteriófagos a partir de aguas residuales, se menciona que se

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tuvieron en cuenta factores como las repetidas amplificaciones de bacteriófagos y, además, el tipo de solventes que se utilizaron para la limpieza de cada una de las muestras de bacteriófagos aislados. Aunque en esta fase no se afectó la cuantificación de unidades formadoras de placa (UFP) por la utilización del cloroformo como solvente orgánico, se ha reportado en la literatura, a manera de recomendación, el uso de éter como un solvente orgánico adecuado para este tipo de protocolo, el cual no solo limpia las muestras sino que contribuye como evidencia primaria dentro de la caracterización de bacteriófagos (16).

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Rev.MVZ Córdoba 17(1):2861-2869, 2012.

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ORIGINAL

Caracterización de propóleos provenientes del municipio de Caldas obtenido por dos métodos de recolección Characterization of propolis from municipality of Caldas obtained through two collection methods Julián Martínez G,1 M.Sc, Carlos Garcia P,1 Ph.D, Diego Durango R,1 M.Sc, Jesús Gil G,1,2* Ph.D. 1Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Escuela de Química, Grupo de Química de los Productos Naturales y los Alimentos, Medellín, Colombia. 2Universidad Nacional de Colombia,

Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ingeniería Agrícola y Alimentos. Medellín, Colombia. *Correspondencia: jhgilg@unal.edu.co. Recibido: Mayo de 2010; Aceptado: Junio de 2011.

RESUMEN Objetivo. Determinar las características fisicoquímicas y la actividad antimicrobiana de propóleos de Apis mellifera, provenientes del municipio de Caldas, obtenidos por dos métodos de recolección. Materiales y métodos. Se utilizaron dos métodos de recolección: de raspado y trampa plastica. Se estableció el contenido de cera, ceniza, material insoluble y resina de los propóleos crudos. Al extracto etanólico de los propóleos se les determinó el perfil cromatográfico (GC-MS) y el espectro UV; además, se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro frente a hongos (Aspergillus sp., Penicillium sp., Colletotrichum acutatum y C. gloesporioides), y bacterias (Salmonella tiphy, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Escherichia coli). Resultados. El material obtenido mediante malla matrizada presentó un perfil químico amplio, buena actividad antimicrobiana y mejores parámetros de calidad, de acuerdo con estándares establecidos por normas internacionales que los propóleos obtenidos por el método de raspado. Además, pudo observarse que la acción antimicrobiana de los propóleos fue dependiente de la concentración del extracto y del hongo o bacteria evaluada. Conclusiones. La composición química y la actividad antibacteriana y antifúngica de los propóleos están relacionadas con el método de recolección. El presente estudio aporta información para la selección de la técnica de cosecha del propóleo de acuerdo con la aplicación que se desee dar. Palabras clave: características, propiedades antibacteriales, propiedades fisicoquímicas, propóleos (Fuente:CAB).

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ABSTRACT Objective. To determine the physicochemical characteristics and the antimicrobial activity in propolis from Apis mellifera, collected in the municipality of Caldas through two harvesting procedures. Materials and methods. Two harvesting methods were used: Scraping and plastic screens. The wax, ash, insoluble material and resin in raw propolis contents were established. The chromatographic profile (GC-MS) and the UV spectra of the ethanolic extract of propolis were recorded. In addition, In vitro antimicrobial activity of ethanolic extract of propolis was evaluated for fungi (Aspergillus sp., Penicillium sp., Colletotrichum acutatum and C. gloeosporioides) and bacteria (Salmonella tiphy, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Escherichia coli). Results. The material obtained through the use of the plastic screen presented a broad chemical profile, high antimicrobial activity and better quality parameters compared to the propolis obtained by scraping, according with international regulations. Moreover, the study indicated that the antimicrobial action of this propolis is dependent on the concentration of the extract used and the microorganism evaluated. Conclusions. The chemical composition and antibacterial and anti-mycotic activity of propolis is related to the harvesting method. This study provides information for selecting the propolis harvesting method, according to its desired application. Key words: antibacterial (Source:CAB).

properties,

characteristics,

physicochemical

properties,

propolis

INTRODUCCIÓN El propóleos es una sustancia obtenida por las abejas mediante la adición de cera y secreciones salivares al material gomoso o balsámico, que recolectan de las hojas y grietas en la corteza de numerosas especies vegetales. Además de ser el material de construcción de la colmena, el propóleos es empleado por las abejas como “arma química” contra los microorganismos patógenos; la presencia de esta sustancia al interior de la colmena proporciona un ambiente inadecuado para el crecimiento de bacterias y otros microorganismos. A este producto apícola le atribuyen efectos antiinflamatorios (1), inmunomodulatorios (2), hepatoprotectores (3), anticariogénicos (4), carcinoestáticos, (5), antimicrobianos (6), antivirales (7), antioxidantes (8) y antifúngicos (9); con aplicaciones a micosis dermatológica restringida casi exclusivamente al género Candida (10). Sin embargo, en alimentos son escasos los estudios relacionados con el control de hongos fitopatógenos o como posible preservante (9,11). El propóleos es una mezcla compleja de sustancias naturales que contiene una gran variedad de compuestos químicos (12); entre las moléculas farmacológicamente activas se destacan flavonoides y ácidos fenólicos y sus ésteres (13). No obstante, en muestras provenientes de países del trópico, que también presentan una actividad biológica similar, se han encontrado moléculas del tipo terpenoide, derivados prenilados de ácidos r-cumáricos, lignanos, y benzofenonas preniladas, lo cual sugiere que la actividad es debida a la combinación

y sinergias de diferentes compuestos (14). La composición del propóleos depende en gran medida del origen botánico (15), especie de abeja (14), época y método de recolección. Con respecto a este último factor, aunque existen varios métodos de recolección de este material, se han utilizado principalmente el método tradicional de raspado y el empleo de mallas plásticas. Generalmente, del primero se obtienen propóleos con gran cantidad de impurezas (16) y contaminantes, como metales pesados (plomo, hierro y cobre) que pueden provenir de la atmósfera o ser incorporados en la cosecha y la extracción (17). Por su parte los propóleos en bruto obtenidos de las mallas, normalmente presentan mejor calidad, con pocas impurezas y libres de contaminantes (18). Como resultado de la diversidad en la composición química de este producto apícola y el empleo generalizado en la industria, se ha hecho necesario el control de calidad y la normalización del propóleos crudo y sus productos. Con este fin, se han establecido metodologías de trabajo en diferentes normas internacionales, entre las que se incluyen el reglamento técnico para la fijación de identidad y calidad de propóleos del Ministerio de Agricultura de Brasil (19). En el presente trabajo se evaluó la composición química y la actividad antimicrobiana de los propóleos provenientes del municipio de Caldas (Antioquia, Colombia), colectados en un mismo apiario por los métodos: tradicional de raspado y malla matrizada.

Martínez - Caracterización del propoleos proveniente del municipio de Caldas

MATERIALES Y METODOS Sitio de estudio y obtención de propóleos. Los propóleos se obtuvieron en el apiario La Alianza del municipio de Caldas (AntioquiaColombia), ubicado a 22 km de Medellín y a una altura de 1759 msnm. Las muestras se colectaron en época de verano, durante los meses de junio-julio de 2007, por los métodos de raspado (CR) y malla plástica (CM) (malla flexible con orificio romboide de 3 x 3 mm) hasta obtener una muestra representativa del apiario y en cantidad suficiente para los análisis. La vegetación predominante alrededor de los apiarios consiste de Eucalyptus glóbulos, Pinus patula, Cupressus lusitánica Miller y rastrojo nativo. El material se almacenó bajo refrigeración y en ausencia de luz, en el laboratorio de Productos Naturales de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín. Previo al análisis, las muestras se trituraron y homogenizaron. Preparación de los extractos. Se pesaron 30 g de los propóleos crudos, los cuales se sometieron a extracción exhaustiva con etanol destilado del 96% (3 x 100 mL) durante 48 h a temperatura ambiente y en ausencia de luz. Seguidamente, la mezcla se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min y se filtró por gravedad. Al filtrado obtenido se le adicionó 10 mL de agua destilada y se dejó en refrigeración hasta precipitar las ceras (12 h, aproximadamente). El ciclo de refrigeración se repitió hasta no observar ceras precipitadas. Después de filtrar, el extracto etanólico se sometió a un proceso de evaporación al vacío y temperatura de 40°C, hasta sequedad. La resina obtenida fue envasada en viales ámbar y refrigerada a -12°C hasta posterior utilización. Propiedades fisicoquímicas. Los análisis se realizaron por triplicado. Los métodos utilizados correspondieron a los reportados en normas internacionales (19), los cuales se describen brevemente: Cenizas; consiste en calcinar una porción de muestra en mufla a 500°C, y llevar a peso constante. La norma fija un contenido máximo del 5%. Humedad; se determinó mediante método termogravimétrico, que consiste en secar una porción de muestra en estufa a 105 ± 2°C, y llevar a peso constante. La norma establece un contenido máximo del 10%. Extractables en éter; se realizó por gravimetría del residuo obtenido mediante una extracción con éter de petróleo (40-60°C) en un equipo Soxhlet, durante 8 h, posterior destilación del solvente y secado del extracto en estufa a 105°C hasta peso constante. Se establece un contenido máximo del 40%. Extractables en etanol; se determinó por gravimetría de las

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resinas obtenidas mediante una extracción con alcohol etílico (96%), en un Soxhlet, a partir del residuo sólido obtenido en el dedal después de determinar el material extractable con éter de petróleo. Posteriormente se destiló el alcohol a presión reducida y la resina obtenida se secó en estufa a 105°C; se llevó a peso constante. Se define un contenido mínimo del 30%. Material insoluble; después de la extracción con etanol, el residuo remanente en el dedal se secó en una estufa a 40°C hasta peso constante. La norma plantea para este parámetro un máximo del 25%. Puntos de fusión; se determinó en un fusiómetro Fischer Scientific. Índice de oxidación; se realizó de acuerdo con la metodología descrita por Salamanca et al (20), con algunas modificaciones. Se pesó 0.2 g de propóleo en un frasco ámbar con tapa; posteriormente se adicionó 3 mL de etanol destilado (96%) y se dejó en agitación por 48 h a 25°C. La mezcla obtenida se filtró lentamente a través de un papel de filtro. Seguidamente, se tomó 1 mL del filtrado y se diluyó con agua destilada hasta 25 mL en un balón aforado. De esta disolución se vertieron 0.5 mL a un tubo de ensayo, se adicionó 0.5 mL de agua destilada y 1 mL de H2SO4 al 20% y se agitó durante 1 min. Seguidamente se añadió 50 μL de solución de KMnO4 (0.1 N). El índice de oxidación se reportó como el tiempo de decoloración de la solución del KMnO4 medido en segundos. Las pruebas se realizaron a temperatura ambiente y por triplicado. Absorbancia específica del espectro UV-Vis; se obtuvo para el extracto etanólico por el método de Miyataka et al (21). El espectro de absorción UV-Vis y la absorbancia a la longitud de onda de máxima absorción (λmax), a partir de la cual se calculó el valor 1% ( E1c se midieron en un espectrofotómetro m ), Shimadzu UV 1800. Los extractos etanólicos del propóleos al 1% fueron diluidos con etanol del 95% hasta obtener soluciones en el rango de absorbancia de 1 a 2.5 unidades. Perfil cromatográfico. El análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) se realizó en un cromatógrafo de gases Varian 3800 acoplado a un detector de masas Saturn 2000 (tipo trampa de iones). La separación se llevó a cabo en una columna HPS-MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm, Agilent Technologies). Las muestras de propóleos, previo al análisis, fueron derivatizadas (metilación) usando el método descrito por Markham et al (22); una alícuota de 400 μL (10 mg mL-1) del extracto de propóleo, se combinó con una solución de CH2N2 (400 μL) en un vial de vidrio; la mezcla resultante se refrigeró durante 4 horas para permitir la metilación completa. Un volumen de muestra de 1 μL se inyectó y analizó mediante CG-EM. La temperatura inicial de la columna

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fue de 100°C, la cual se elevó a 280°C y se mantuvo por 15 min, siendo 45 min el tiempo total de análisis. La inyección se realizó en modo splitless a 250°C. Se utilizó helio como gas de arrastre a un flujo de 1 mL min-1. Los picos fueron identificados por comparación con la base de datos Nist 02. Actividad antifúngica in vitro. Se empleó el método de la placa perforada. En cajas de Petri estériles (90 mm de diámetro) se adicionó 15 mL de medio de cultivo (PDA), previamente esterilizado, a una temperatura de 50ºC. Seguidamente, se adicionó el extracto etanólico del propóleo disuelto en un mezcla etanol/tween (1 mL/0.5 g), a 5 niveles de concentración (50, 100, 250, 500, 1000 mg/L) y se dejó gelificar a temperatura ambiente. Posteriormente, se colocaron inóculos del hongo de 6 mm de diámetro, en el punto medio de cada caja Petri que contenía el medio de cultivo (PDA) con la cantidad necesaria del extracto a evaluar. Las placas se incubaron 6 días a 25ºC y se midió en milímetros el diámetro micelial cada 24 h. Adicionalmente, se realizaron los respectivos controles absoluto y solvente. Las cepas de las tres especies de hongos utilizadas (Aspergillus sp., Penicillium sp., Colletotrichum acutatum y C. gloesporioides), fueron donadas y caracterizadas morfológicamente por el Laboratorio de Sanidad Vegetal de la Universidad Nacional de Colombia. Para el análisis de los datos se empleó el programa STATGRAPHICS Centurión y se aplicó Análisis de Varianza (ANOVA) con tres factores (tiempo en horas, tipo de hongo y tratamiento). Para los factores que resultaron significativos se analizaron las diferencias de los niveles con la prueba de comparaciones LSD “Diferencia Mínima Significativa”. Se utilizó un nivel de confianza del 95%, y un nivel de potencia para detectar diferencias significativas del 85% en el análisis de varianza. Los tratamientos se realizaron por triplicado. En la tabla 1 se presenta la conformación del diseño experimental.

Tabla 1. Factores y niveles del diseño experimental. Factores

Niveles

Tiempo (horas)

24, 48, 72, 96, 144, 168

Hongo

C. acutatum, C. gloeosporiodes Penicillium sp. Aspergillus sp.

Tratamiento (ppm)

100, 250, 500, 1000 Blanco absoluto Blanco etanol/tween

Actividad antibacteriana in vitro. La actividad antibacteriana se evaluó por el método de difusión en disco en agar Mueller-Hilton inoculado con la cepa indicadora correspondiente. En la superficie del agar se depositaron discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro y tamaño de poro de 100 µm previamente esterilizados. Los discos fueron impregnados con 20 µL de la solución etanólica del propóleos y las cajas incubadas durante 18 h a 37ºC. La actividad se expresó como la diferencia, en milímetros, entre el radio del halo de inhibición y el radio del disco de papel filtro. Adicionalmente, se realizó un control conteniendo sólo etanol. Las cepas indicadoras utilizadas fueron: Salmonella tiphy, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Escherichia coli, obtenidas del laboratorio de Microbiología Industrial de la Universidad Nacional de Colombia. Todas las cepas fueron recuperadas en medio BHI a 37°C por 24 h.

RESULTADOS Propiedades fisicoquímicas. La extracción del propóleos crudo con etanol se realizó a temperatura ambiente y en la oscuridad con el fin de evitar alteraciones en los metabolitos secundarios presentes en el material. Mediante el enfriamiento a -20ºC y centrifugación de la disolución etanólica se logró un refinamiento del extracto, debido a la precipitación de las ceras, las cuales son insolubles en agua y en el solvente de extracción (etanol 96%) a bajas temperaturas. Los resultados del análisis fisicoquímico para los propóleos colectados en el municipio de Caldas, se presentan en la tabla 2.

Tabla 2. Propiedades fisicoquímicas de los propóleos recolectados en el municipio de Caldas, Antioquia-Colombia. Parámetros

Caldas raspado (CR)

Caldas malla (CM)

Cenizas (%)

0.78 ± 0.22

4.77 ± 0.45

Máximo 5%

Humedad (%)

2.88 ± 0.18

1.72 ± 0.04

Máximo 10%

Extractable Éter (%)

59.31 ± 0.78

48.27 ± 1.61

Máximo 40%

Extractable EtOH(%)

10.44 ± 1.97

35.92 ± 2.98

Mínimo 30%

Insolubles (%)

28.23 ± 1.87

14.37 ± 3.37

Máximo 25%

Índice de oxidación (s)

17.75 ± 2.69

37.93 ± 4.05

22 s

66-82

65-80

Rango de fusión (°C)

Límites de calidad en norma internacional

Martínez - Caracterización del propoleos proveniente del municipio de Caldas El análisis del espectro de absorción UV-Vis para los extractos etanólicos de los propóleos se presenta en la figura 1. Ambas muestras presentan un perfil de absorción semejante con una banda amplia a longitudes de onda máxima de 296 (CM) y 280 nm (CR), y un hombro leve a 309 nm. En general, este rango de absorciones se asocia con la presencia de compuestos fenólicos y flavonoides.

2865

Tabla 3. Comparaciones múltiples (LSD) del crecimiento microbiano según el tipo de hongo y de propóleo. Crecimiento micelial (mm)*

Hongo (propóleo evaluado) Penicillium sp. (Caldas Malla)

23.65 ± 0.15 a

Penicillium sp. (Caldas Raspado)

23.90 ± 0.15 a

C. acutatum (Caldas Malla)

23.65 ± 0.15 a

C. acutatum (Caldas Raspado)

25.50 ± 0.15 b

C. gloeosporiodes (Caldas Malla)

31.38 ± 0.15 c

C. gloeosporiodes (Caldas Raspado)

39.90 ± 0.15 e

Aspergillus sp. (Caldas Malla)

31.79 ± 0.15 c

Aspergillus sp. (Caldas Raspado)

35.19 ± 0.15 d

* Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05) según la prueba de diferencias mínimas significativas (LSD).

Para todos los hongos, el propóleo CM presentó diferencias significativas sobre el crecimiento del microorganismo respecto al tratamiento con CR (a la misma concentración) y a los controles absoluto y solvente (Tabla 4). Figura 1. Espectros de absorción de los extractos etanólicos del propóleos de Caldas.

Perfil cromatográfico. A través de la comparación del perfil cromatográfico (GC-MS) se encontró que la muestra CM contiene mayor número de compuestos, y en cantidades relativas superiores, que el extracto CR. Actividad antifúngica in vitro. La actividad del propóleo para el control de hongos fitopatógenos ha sido poco explorada. Los microorganismos utilizados en los bioensayos se seleccionaron de acuerdo con la incidencia y la importancia económica que estos representan en el departamento de Antioquia. El análisis de varianza para la actividad antifúngica de los propóleos obtenidos en el municipio de caldas (CM y CR), presenta diferencias significativas (p<0.05) en cuanto a la inhibición del crecimiento, el tipo de hongo, el tratamiento aplicado (100-1000ppm) y las respectivas interacciones. Ambos extractos de propóleos mostraron la mayor actividad antifúngica contra los hongos C. acutatum y Penicillium sp., para todas las concentraciones y durante las 168 horas de evaluación (Tabla 3).

Tabla 4. Comparaciones múltiples (LSD) del crecimiento microbiano según la concentración y el tipo de propóleo. Tratamiento (µg/mL) y Propóleos

Crecimiento (mm) * 24.81 ± 0.26 a

1000 (Caldas Malla) 500 (Caldas Malla)

25.35 ± 0.26 a

250 (Caldas Malla)

26.65 ± 0.26 b

100 (Caldas Malla)

26.57 ± 0.26 b

1000 (Caldas Raspado)

28.43 ± 0.26 c

500 (Caldas Raspado)

29.58 ± 0.26 d

250 (Caldas Raspado)

29.92 ± 0.26 d

100 (Caldas Raspado)

30.72 ± 0.26 e

Control solvente (Caldas Malla)

30.96 ± 0.26 e

Control absoluto (Caldas Malla)

31.82 ± 0.26 f

Control solvente (Caldas Raspado)

33.85 ± 0.26 g

Control absoluto (Caldas Raspado)

34.24 ± 0.26 g

* Letras diferentes por fila indican diferencias significativas (p<0.05), según la prueba de diferencias mínimas significativas (LSD).

Actividad antibacteriana in vitro. Las zonas de inhibición del crecimiento microbiano con la fracción extractable en EtOH de los propóleos del municipio de Caldas, se presentan en la tabla 5.

Tabla 5. Actividad antibacteriana del propóleos recolectado en el municipio de Caldas, Antioquia-Colombia. Extracto etanólico del propóleo

Concentración (mg/mL)

Control

Inhibición (mm) S. aureus

B. subtilis

E. coli

S. tiphy

0.1

2.00 ± 0.58

3.00 ± 1.53

4.00 ± 0.58

2.00 ± 1.53

6.00 ± 0.58

5.00 ± 0.00

5.00 ± 1.15

9.00 ± 0.58

6.00 ± 1.15

5.00 ± 0.58

0.1

3.00 ± 0.58

6.00 ± 1.00

5.00 ± 1.00

3.00 ± 0.58

6.00 ± 1.15

5.00 ± 0.00

3.00 ± 0.58

5.00 ± 0.58

6.00 ± 0.58

3.00 ± 0.58

6.00 ± 1.15

6.00 ± 0.58

2866

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

DISCUSIÓN Propiedades fisicoquímicas. Se observó que ambos propóleos presentaron bajos contenidos de humedad y se encuentran dentro de los límites establecidos por normas internacionales (10%). Sin embargo, la humedad del propóleo CR es superior a la encontrada en la muestra CM. Un mayor contenido de humedad es un factor desfavorable si se tiene en cuenta que pueden ser condiciones propicias para el desarrollo de algunas especies de mohos y de fermentaciones durante el almacenamiento de las muestras crudas. El contenido de cenizas es mayor en el propóleos CM; no obstante, los valores para ambos propóleos son inferiores al 5%, que es el máximo permitido de acuerdo con la norma internacional (19). La determinación del contenido de cenizas es particularmente importante para las muestras crudas de propóleos, ya que puede indicar la existencia de un alto contenido de impurezas mecánicas como madera, tierra, fragmentos vegetales, insectos, entre otros, o una posible adulteración del material bruto mediante la adición de impurezas (23). El contenido de ceras en ambos propóleos superó el límite establecido por la norma de Brasil (máximo 40%), siendo superior en el material colectado mediante raspado (CR). Un alto contenido de ceras, en muestras de propóleos crudo, es desfavorable porque en esta fracción no se encuentran presentes los compuestos fenólicos, que son los metabolitos secundarios a los cuales se asocia la actividad biológica. Además del contenido de ceras, otro parámetro que influye notablemente en la calidad del propóleos es el contenido de resina soluble en etanol. Cuanto mayor sea el valor de esta fracción mejor será, en términos de rendimiento, la calidad del producto final, puesto que es allí donde se encuentran los compuestos con actividad biológica (24). En los propóleos evaluados se encontró que el límite establecido para el contenido de sustancias extractables con etanol (resina) sólo se alcanza para CM; en éste, el valor es aproximadamente tres veces mayor (35.92±2.98) que en el propóleos obtenido por raspado (10.44±1.97). El bajo contenido de sustancias extractables en etanol posiblemente esté asociado a que las especies vegetales circundantes a la colmena no son muy ricas en resinas con sustancias fenólicas (12); o que durante la recolección, especialmente por el método de raspado, se presente un manejo poscosecha inapropiado por parte del apicultor, mezclando el propóleo con ceras e impurezas mecánicas inherentes al

proceso. Lo anterior, estaría en concordancia con los altos valores obtenidos de sustancias extractables en éter de petróleo para ambos propóleos y el mayor contenido de impurezas mecánicas en la muestra CR. Del mismo modo que ocurre con las ceras, las impurezas mecánicas no contienen principios activos, depreciando el valor biológico del producto; valores superiores al 25% reflejan una baja pureza del propóleo (24). Sin embargo, a pesar del alto contenido de sustancias extractables en éter de petróleo y la baja proporción de resinas, el propóleo CR presentó un índice de oxidación inferior al valor máximo establecido en la norma (22 s). A partir de la información se puede deducir que el propóleos CR posee una buena cantidad de compuestos oxidables; a mayor concentración de este tipo de compuestos menor tiempo de decoloración y por lo tanto mejor calidad del producto en aplicaciones como antioxidante o antiinflamatorio. De otro lado, el propóleo obtenido mediante malla presentó un índice de oxidación mayor que 22 s; lo anterior, puede ser el resultado de la presencia de algunos metabolitos que pueden modificar la respuesta esperada y confieren propiedades diferentes al producto, como ha sido reportado por Souza et al (25) para muestras con tiempos de oxidación atípicos. El punto de fusión de la muestra es bajo y se encuentra en el rango determinado frecuentemente para propóleos (60100°C) (12). 1% Por su parte, el valor E1cm es un parámetro ampliamente utilizado para evaluar los propóleos, ya que se relaciona con algunas de las actividades biológicas y la presencia de compuestos fenólicos. La intensidad de la absorción a lmax en el propóleo CM 1% 1% ( E1c =250.8) es mayor que en CR ( E1c = 140.8), m m lo que denota una concentración cualitativamente superior de compuestos fenólicos en el propóleos obtenido por trampa. Palomino et al (8) reporta una 1% diferencia similar en el valor E1c m de muestras colectadas en el mismo apiario, la cual correlacionó positivamente con el contenido de fenoles y flavonoides totales, y la actividad inhibidora de radicales y antioxidante in vitro.

Perfil cromatográfico. En particular, CM exhibió la presencia de diterpenos tipo labdano tales como: 13-epi manool, ácido cummunico, esclareol, ácido isopimárico, ácido agatólico, agatadiol, 13-epi-torulosol; además del totarol y una isoflavona. Por su parte, en el extracto de CR se observó la presencia de esteres metílicos de ácidos grasos como el palmítico, linoléico, oleico y esteárico; además de manool, ácido cummunico, ácido isopimárico y ácido abiético. La presencia de diterpenos tipo labdano ha

Martínez - Caracterización del propoleos proveniente del municipio de Caldas

2867

sido reportada recientemente en propóleos colombianos (26), griegos (27) y sicilianos (28). Diferentes plantas han sido mencionadas por estos autores como posible fuente de los propóleos (Cupressus sempervirens y Pinus sp.), destacándose las especies Pinaceae y Cupressaceae que corresponden con la vegetación predominante (Pinus patula, Cupressus lusitánica Miller) cercana a los apiarios de donde se colectó la muestra. Actividad antifúngica in vitro. Se determinó, para todos los microorganismos, que los menores crecimientos corresponden al tratamiento con CM; presentando, en comparación con CR, diferencias significativas en el crecimiento de los hongos, a excepción de Penicillium sp. Los extractos etanólicos de los propóleos evaluados son relativamente más eficientes en el control de hongos fitopatógenos respecto a aquellos de origen Nigeriano, los cuales presentaron inhibiciones del crecimiento micelial del hongo Colletotrichum lindemutianum a concentraciones mayores al 5% (29). Adicionalmente, se encontró que el crecimiento radial para todos los hongos es dependiente de la concentración del extracto; un aumento en la concentración incrementa la inhibición del crecimiento micelial. Particularmente, el propóleo CM tiene el mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de los hongos evaluados a los niveles de concentración empleados (Tabla 4). Las diferencias en la actividad antifúngica posiblemente estén asociadas a una mayor concentración de los metabolitos bioactivos tipo diterpénico, flavonoide y fenólico presentes en el extracto CM (9), como lo confirman el perfil cromatográfico y el espectro de absorción UV-Vis. Actividad antibacteriana in vitro. La acción antibacteriana fue dependiente de la concentración, tipo de propóleos y de la especie evaluada. En general, las bacterias E. coli, S. tiphy y S. aureus no fueron sensibles al efecto de los propóleos evaluados, presentándose en todo el rango de concentraciones, inhibiciones semejantes al control. No obstante, el extracto etanólico del propóleo colectado por trampa (CM) presentó un efecto bacteriostático a 1.0 mg/mL y bactericida a 10 mg/mL, con un halo de inhibición de 9 ± 0.58 mm (Figura 2) contra la bacteria esporulada B. subtilis. Es importante mencionar que B. subtilis ha demostrado resistencia a algunos antibióticos en el pasado. El extracto del propóleos CR, no presentó inhibición sobre esta bacteria bajo las condiciones de evaluación, lo que indica una baja concentración de metabolitos antibacterianos.

Figura 2. Efecto bacteriostático y bactericida del extracto etanolico de los propóleos del municipio de Caldas contra B. subtilis; a) 1 mg/mL y b) 10 mg/mL.

Los resultados de la actividad antibacteriana concuerdan con aquellos reportados por Sforcin et al (30), quienes observaron una marcada acción de los propóleos contra bacterias Gram-positivas (por ejemplo, B. subtilis) y una actividad limitada contra aquellas Gramnegativas (por ejemplo, E. coli y S. tiphy). Es conocido que bacterias Gram-negativas como E. coli, poseen una membrana adicional denominada “Estructura OM” la cual les confiere un mayor grado de resistencia a los agentes antimicrobianos. Es necesario, sin embargo, evaluar el efecto de los propóleos de Caldas en un número mayor de cepas bacterianas. En conclusión, las propiedades físico-químicas de los propóleos recolectados en el municipio de Caldas por los dos procedimientos (raspado y malla) presentaron variaciones en las características evaluadas. La muestra que más se ajustó a los parámetros de calidad internacional fue la recolectada por el método de malla. También se observó que los extractos etanólicos de propóleos provenientes del municipio de Caldas (Antioquia) son una fuente potencial de sustancias con actividad antifúngica y antibacteriana; encontrándose

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

que el material recolectado por el método de malla presentó el mayor efecto inhibitorio en el crecimiento de los hongos fitopatógenos y de la bacteria B. subtilis. Los resultados obtenidos en este estudio complementan estudios previos, con relación a que los propóleos obtenidos por el método de malla matrizada exhiben mejores características fisicoquímicas y biológicas, que los propóleos obtenidos por raspado; por lo tanto, se sugiere que los apicultores utilicen trampas para obtener materiales de mejor calidad, exentos de impurezas y contaminantes. Sin embargo, es necesario realizar estudios

sistemáticos complementarios que permitan obtener mayor información relacionada con el efecto del método de recolección de propóleos sobre la calidad del mismo. Actualmente, se están adelantando trabajos en esta dirección. Agradecimientos A la Universidad Nacional de Colombia a través de la dirección de investigaciones para la realización de esta investigación. 1. Paulino N, Abreu SR, Uto Y, Koyama

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Martínez - Caracterización del propoleos proveniente del municipio de Caldas

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ORIGINAL

Parámetros genéticos de características de tipo y producción en ganado Holstein del departamento de Antioquia Genetic parameters of type traits and production in Holstein cattle from the Department of Antioquia Juan Corrales A,1,2 Zoot, Mario Cerón-Muñoz,1* Ph.D, Jhon Cañas A,1 Zoot, Cristina Herrera R,1 Zoot, Samir Calvo C,1 Zoot. 1Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias. Grupo de Investigación en Genética, Mejoramiento y Modelación Animal, Medellin, Colombia. 2Joven investigador Colciencias,

programa jóvenes investigadores e innovadores “Virginia Colombia.*Correspondencia: mceronm@agronica.udea.edu.co

Gutiérrez

Pineda”,

Medellin,

Recibido: Mayo de 2010; Aceptado: Febrero de 2011.

RESUMEN Objetivo. Estimar heredabilidades, correlaciones fenotípicas y genotípicas entre 24 características de tipo y producción de leche en vacas Holstein del departamento de Antioquia. Materiales y métodos. Se analizaron un total de 2395 registros de vacas Holstein. Se estimaron componentes de varianza mediante el procedimiento de máxima verosimilitud restricta con modelos animales bicaracterísticos. Para las características de tipo, el modelo incluyó los efectos fijos de finca, año de nacimiento y país de origen del padre de la vaca, el grupo contemporáneo (año-mes-clasificador) y la covariable edad a la clasificación. Para la producción de leche el modelo incluyó los efectos fijos de finca, año de parto, país y año de nacimiento del padre. Resultados. Las heredabilidades encontradas para las características de tipo variaron de 0.04 a 0.44 y para producción de leche fue de 0.22, los errores estándar de la heredabilidad fueron inferiores a 0.06. Las correlaciones genéticas de producción de leche con las características profundidad de la ubre (-0.72) fue alta, mientras las correlaciones más altas entre las características de tipo fueron entre extremo anterior y tamaño (0.90), ángulo de la pezuña y profundidad del talón (0.98), profundidad del talón y uniformidad de pezuñas (0.85); y ligamento suspensorio medio y colocación de pezones posteriores (0.76). Conclusiónes. Se encontró una considerable variación genética en características de tipo dentro de la población Holstein de Antioquia. Las correlaciones genéticas entre algunas características de tipo fueron altas e indican la posibilidad de reducir el número de características evaluadas en cada animal. Palabras clave: Correlaciones genéticas, ganado lechero, heredabilidad (Fuente:CAB, AIMS).

2870

Corrales - Parámetros genéticos de caracteristicas de tipo y producción

2871

ABSTRACT Objective. To estimate heritability, phenotypic and genetic correlations among 24 type traits and milk production in Holstein cows from Antioquia. Materials and methods. The data analyzed included 2395 holstein cow records. Variance components were estimated through the procedure of maximum restricted likelihood using bi-characteristic animal models. For the type traits, the model included the fixed effects such as, herd, father’s year of birth and country of origin, contemporary group (year-month-classifier) and the classification age covariate. For milk production the model included fixed effects such as herd, calving year and father’s year and country of birth. Results. The heritability found for the type traits varied from 0.04 to 0.44 and for milk production was 0.22, standard errors for heritability were lower than 0.06. Genetic correlations between milk production and udder depth (-0.72) were high, while the highest correlations for the type traits were between height at front end and size (0.90), foot angle and heel depth (0.98), heel depth and hoof uniformity (0.85) and median suspensory ligament with rear teat placement (0.76). Conclusions. Considerable genetic variation in type traits in Holstein populations from Antioquia was found. Genetic correlations between some type traits were high and indicate the possibility of reducing the number of features evaluated in each animal. Key words: Dairy cattle, genetic correlation, heritability (Source:CAB, AIMS).

INTRODUCCIÓN Tradicionalmente la selección genética se ha realizado para producción de leche, hecho que ha provocado una reducción en el mérito genético de la salud y fertilidad en vacas lecheras (1,2).

y salud de la vaca con el objetivo de lograr un progreso genético que conduzca a un mejoramiento de la productividad y la funcionalidad de las vacas lecheras en los hatos (10).

Las características de tipo (CT) se han propuesto como indicadores indirectos para el mejoramiento de los parámetros productivos, reproductivos y sanitarios (3-6). La clasificación lineal es el procedimiento por el cual se valora visualmente cada una de las CT de un individuo, donde cada característica se describe en un rango de 1 a 9 y se clasifican en grupos asociados con el cuerpo, anca, patas y pezuñas, y ubre (7).

El objetivo de este estudio fue estimar heredabilidades, correlaciones genéticas y fenotípicas entre las características de tipo evaluadas en vacas de primer parto en el departamento de Antioquia.

La estimación de heredabilidad y correlaciones genéticas es importante para la realización de un programa de mejoramiento (2,8). Las heredabilidades para las características del cuerpo se han encontrado en el rango de 0,10 a 0.43 (7,9), para las características de patas y pezuñas un rango de 0.12 a 0.17 (2,7) y las características de la ubre se encuentran en el rango de 0.13 a 0.38 (2,7). Diferentes estudios han mostrado la existencia de correlaciones genotípicas medias entre la producción de leche con estatura (0.42), profundidad del cuerpo (0.36), angularidad (0.48), ancho de isquiones (0.46), altura de la ubre posterior (0.48), e inserción anterior de la ubre (0.32) (7). Internacionalmente se ha propuesto la utilización de índices de selección, los cuales incluyen la producción de leche y características de tipo (CT) que se relacionan con la producción, reproducción

MATERIALES Y METODOS Sitio de estudio y caracterización de la muestra. Se utilizaron 2395 registros de vacas Holstein de primer parto, pertenecientes a 49 hatos ganaderos del departamento de Antioquia, con clasificación lineal realizada entre los años 2000 y 2008 por la Asociación Holstein de Colombia. Cada registro contenía la información de producción de leche ajustada a 305 días y edad adulta (11) y de 24 características de tipo las cuales fueron evaluadas asignándole un puntaje de 1 a 9 a cada característica (Tabla 1). Los padres de las vacas eran de diferentes orígenes: 44 de Canadá, 21 de Colombia y 212 de Estados Unidos Estimación de los parámetros genéticos. Para las características de tipo se utilizó un modelo animal bi-característico que incluyó los efectos fijos de finca, año de nacimiento del padre, país de nacimiento del padre y grupo contemporáneo (año-ronda-clasificador), la covariable edad a la clasificación y el efecto aleatorio del animal. Para la producción de leche se consideró en el modelo los efectos

2872

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

Tabla 1. Abreviaturas y estadística descriptiva para las características de tipo y producción de leche en vacas Holstein del departamento de Antioquia. Característica

Abreviatura

Puntaje = 1

Puntaje = 9

Media

EST

Corta

Alta

6.13±1.27

20.72

EXAN

Bajo

Alto

4.98±0.99

19.88

TAMAN

Pequeño

Grande

5.78±1.3

22.49

ANPE

Estrecho

Ancho

5.01±1.41

28.14

Profundidad del cuerpo

PFCUER

Superficial

Profundo

5.58±1.18

21.15

Fortaleza del lomo

FORLO

Débil

Fuerte

5.75±1.25

21.74

Colocación ísquiones

COLIS

Altos

Bajos

4.89±1.13

23.11

ANIS

Estrecho

Ancho

5.56±1.4

25.18

Angulo de la pezuña

ANPEZU

Bajo

Empinado

4.84±1.26

26.03

Uniformidad de pezuñas

UNIPEZU

Poco uniforme

Uniforme

5.36±1.11

20.71

PFTAL

Superficial

Profundo

4.85±1.27

26.19

Calidad de hueso

CALHUES

Toscos

Planos

5.89±1.48

25.13

Colocación de los miembros

COLMIEM

Derechas

Curvas

5.73±1.28

22.34

VISPOS

Juntos

Derechas

5.26±1.62

30.8

Profundidad de la Ubre

PFUB

Profunda

Superficial

5.46±1

18.32

Textura de la ubre

TEXU

Carnosa

Suave

6.29±1.27

20.19

Medio suspensorio

LSUM

Débil

Fuerte

6.38±1.27

19.91

Inserción anterior

INSA

Débil

Fuerte

5.38±1.59

29.55

Colocación del pezón

CPAN

Afuera

Adentro

4.73±1.08

22.83

Largo del pezón

LPEZ

Corto

Largo

4.9±1.19

24.29

Altura de la inserción

AIPOS

Bajo

Alto

6.39±0.91

14.24

Ancho de la inserción

ANIN

Estrecho

Ancho

4.49±1.62

36.08

Colocación del pezón

CPPO

Afuera

Adentro

6.29±1.07

17.01

Angularidad

ANGU

No-angular

Angular

6.2±0.96

15.48

Producción de leche (Litros)

P305

7155.67±1935.52

27.05

Estatura Extremo anterior Tamaño Ancho de pecho

Ancho del isquion

Profundidad del talón

Vista posterior de los miembros

fijos finca, año de parto, año de nacimiento del padre y país de nacimiento del padre, y el efecto aleatorio del animal. El análisis fue realizado por el procedimiento máxima verosimilitud restricta libre de derivadas mediante el software MTDFREML desarrollado por Boldman et al (12). y i = Xβ i + Zα i + ei

Donde, i=Característica de tipo desde la 1 hasta la característica de tipo 24 o producción de leche. Xβi= βi son los efectos fijos de finca, año de nacimiento del padre, país de nacimiento de padre, grupo contemporáneo (año-rondaclasificador) y edad a la clasificación para las características de tipo, para producción de leche los efectos fijos de finca, año de parto, año de nacimiento del padre y país de nacimiento del padre. Zαi= es el efecto aleatorio del animal ei= Residuos.

Análisis de componentes de varianza. Se realizaron cuatro análisis de componentes de varianza separados en grupos que relacionaban la ubicación de las características de tipo en el animal. De esta manera, el cuerpo incluyó las características (estatura, extremo anterior, tamaño, ancho de pecho, profundidad del cuerpo y fortaleza del lomo), el anca incluyó (ancho de ísquiones y colocación de ísquiones), las patas y pezuñas (ángulo de la pezuña, uniformidad de pezuñas, profundidad del talón, calidad de hueso, colocación de los miembros y vista posterior de los miembros) y la ubre incluyó (profundidad de la ubre, textura de la ubre, ligamento suspensorio medio, inserción anterior, colocación de pezones anteriores, largo del pezón, altura de la inserción posterior, ancho de la inserción y colocación de pezones posteriores). Las heredabilidades se obtuvieron por medio de análisis uní-característicos. Las correlaciones genéticas y fenotípicas entre las características de cada grupo se realizaron por medio de análisis bi-caracteristicos. En estos análisis se utilizaron para todas las características los mismos efectos fijos.

Corrales - Parámetros genéticos de caracteristicas de tipo y producción Para estimar las correlaciones fenotípicas entres las diferentes características, se utilizó la siguiente ecuación de acuerdo con Falconer y Mackay (13).

Donde: rp1,2=Correlación fenotípica entre características 1 y 2 rg1,2= Correlación genética entre características 1 y 2 ra1,2= Correlación ambiental entre características 1 y 2 h12 = heredabilidad de la característica 1 h22 = heredabilidad de la característica 2

2873

Las características colocación de ísquiones y ancho de ísquiones tuvieron la misma heredabilidad (0.44) con un error estándar de 0.062 y 0.058, respectivamente. La correlación genética de la característica colocación de ísquiones con P305 fue de 0.02, mientras el ancho de ísquiones tuvo una correlación genética de 0.04 con P305 (Tabla 3).

las las

Tabla 3. Heredabilidades de las características del anca (sobre la diagonal), correlaciones fenotípicas (en la diagonal) y correlaciones genéticas (encima de la diagonal) evaluadas en vacas Holstein de Antioquia.

las

Características

RESULTADOS

COLIS

ANIS

P305

0.44 ± 0.06

0.23 ± 0.11

0.15 ± 0.04

ANIS

0.07

0.44 ± 0.06

0.09 ± 0.15

P305

0.02

0.04

0.17 ± 0.00

COLIS

Las medias y desviaciones estándar de las características de tipo (CT) se pueden observar en la tabla 1. La media para la producción de leche fue de 7155.67±1935.52. La característica ancho de la inserción presentó la mayor variabilidad (36.08), el menor coeficiente de variación fue en la característica altura de la inserción posterior (14.24)

COLIS=Colocación de ísquiones, P305=Producción de leche.

ANIS=Ancho

ísquiones,

Las heredabilidades para patas y pezuñas variaron entre 0.04 para vista posterior y 0.22 para calidad de hueso. Se presentó una alta correlación genética entre profundidad del talón con ángulo de la pezuña (0.98) y uniformidad de pezuñas (0.85) y una correlación negativa entre colocación de los miembros con profundidad del talón y vista posterior de los miembros (-0.46 y -0.45, respectivamente) como se puede observar en la tabla 4.

En la tabla 2 se puede observar las heredabilidades, correlaciones genéticas y fenotípicas para las características del cuerpo. Las heredabilidades variaron entre 0.17 para ancho de pecho y 0.37 para estatura, la correlación genética varió de -0.30 entre producción de leche y extremo anterior a 0.90 entre tamaño y extremo anterior, mientras que las correlaciones fenotípicas se encontraron entre 0.03 a 0.58.

Las heredabilidades para las características de ubre (Tabla 5) variaron de 0.12 a 0.28 las cuales fueron de medias a bajas. El ligamento suspensorio medio presentó una

Tabla 2. Heredabilidades de las características del cuerpo (en la diagonal), correlaciones fenotípicas (debajo de la diagonal) y correlaciones genéticas (encima de la diagonal) evaluadas en vacas Holstein de Antioquia. Características EST

EXAN

TAMAN

ANPE

PFCUER

FORLO

ANGU

PL305EM

0.37 ± 0.06

0.39 ± 0.15

0.69 ± 0.10

0.01 ± 0.18

0.47 ± 0.15

0.69 ± 0.10

0.50 ± 0.13

0.02 ± 0.17

EXAN

0.22

0.22 ± 0.05

0.90 ± 0.11

0.42 ± 0.18

0.63 ± 0.18

-0.19 ± 0.23

0.24 ± 0.18

-0.30 ± 0.22

TAMAN

0.54

0.38

0.20 ± 0.05

0.58 ± 0.14

0.74 ± 0.13

-0.01 ± 0.24

0.52 ± 0.17

-0.09 ± 0.22

ANPE

0.14

0.24

0.58

0.17 ± 0.05

0.61 ± 0.16

-0.17 ± 0.25

0.03 ± 0.19

0.18 ± 0.22

PFCUER

0.29

0.21

0.52

0.39

0.18 ± 0.05

0.05 ± 0.25

0.70 ± 0.14

-0.03 ± 0.07

FORLO

0.54

0.05

0.08

0.03

0.17

0.20 ± 0.05

0.26 ± 0.21

-0.16 ± 0.27

ANGU

0.35

0.2

0.23

0.08

0.34

0.28

0.24 ± 0.06

0.14 ± 0.19

PL305EM

0.08

0.04

0.13

0.12

0.18

0.07

0.19

0.17 ± 0.00

EST

EST= Estatura, EXAN= Extremo anterior, TAMAN= Tamaño, ANPE= Ancho de pecho, PFCUER=Profundidad del cuerpo, FORLO=Fortaleza del lomo, ANGU=Angularidad, PL305EM=Producción de leche ajustada a 305 días y edad madura.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

Tabla 4. Heredabilidades de las características de patas y pezuñas (en la diagonal), correlaciones fenotípicas (debajo de la diagonal) y correlaciones genéticas (encima de la diagonal) evaluadas en vacas Holstein de Antioquia. Características ANPEZU

UNIPEZU

PFTAL

CALHUES

COLMIEN

VISPOS

P305

ANPEZU

0.14 ± 0.05

0.46 ± 0.34

0.98 ± 0.09

-0.46 ± 0.23

- 0.23 ± 0.23

0.41 ± 0.37

0.07 ± 0.23

UNIPEZU

0.19

0.05 ± 0.04

0.85 ± 0.41

- 0.12 ± 0.31

- 0.04 ± 0.33

0.67 ± 0.56

0.13 ± 0.33

PFTAL

0.59

0.20

0.12 ± 0.04

- 0.20 ± 0.23

- 0.46 ± 0.21

0.56 ± 0.38

0.19 ± 0.24

CALHUES

-0.1

-0.01

-0.09

0.22 ± 0.06

0.15 ± 0.20

-0.02 ± 0,34

-0.13 ± 0.21

COLMIEN

-0.05

-0.01

-0.22

0.11

0,17 ± 0.05

-0.45 ± 0.31

0.01 ± 0.21

VISPOS

0.09

-0.01

0.12

-0.01

-0.26

0.04 ± 0.04

0.35 ± 0.35

P305

0.04

0.09

0.01

-0.04

0.10

0.17 ± 0.00

ANPEZU=Angulo de la pezuña; UNIPEZU= Uniformidad de pezuñas; PFTAL=Profundidad del talón; CALHUES=Calidad de hueso; COLMIEM=Colocación de los miembros; VISPOS=Vista posterior de los miembros.

Tabla 5. Heredabilidades de las características de la ubre (en la diagonal), correlaciones fenotípicas (debajo de la diagonal) y correlaciones genéticas (encima de la diagonal) evaluadas en vacas Holstein de Antioquia. Características PFUB

TEXU

LSUM

INSA

CPAN

LPEZ

AIPOS

ANIN

CPPO

P305

PFUB

0.18 ± 0.05

0.50 ±0.21

0.25 ±0.20

0.55 ±0.17

0.29 ±0.17

-0.29 ±0.16

0.25 ±0.22

- 0.27 ±0.19

0.58 ±0.17

-0.72 ±0.13

TEXU

0.09

0.15 ±0.05

0.51 ±0.18

0.38 ±0.19

0.40 ±0.16

- 0.16 ±0.18

0.52 ±0.18

0.22 ±0.20

0.38 ±0.18

0.03 ±0.23

LSUM

0.05

0.30

0.17 ±0.05

0.24 ±0.20

0.26 ±0.17

- 0.10 ±0.18

0.57 ±0.23

0.36 ±0.20

0.76 ±0.17

0.38 ±0.43

INSA

0.17

0.29

0.10

0.17 ±0.45

0.08 ±0.18

- 0.04 ±0.18

0.57 ±0.21

0.05 ±0.20

0.02 ±0.19

-0.27 ±0.19

CPAN

0.05

0.14

0.23

0.18

0.25 ±0.05

- 0.05 ±0.15

0.36 ±0.20

-0.03 ±0.18

0.42 ±0.15

-0.15 ±0.05

LPEZ

-0.07

-0.01

-0.04

-0.01

-0.07

0.28 ±0.05

0.15 ±0.19

0.05 ±0.18

- 0.37 ±0.15

0.16 ±0.04

AIPOS

0.16

0.24

0.12

0.13

-0,02

0.01

0.12 ±0.04

0.34 ±0.21

0.40 ±0.21

-0.19 ±0.21

ANIN

-0.12

0.14

0.09

0.05

0.04

-0.01

0.20

0.16 ±0.04

- 0.04 ±0.19

0.32 ±0.19

CPPO

0.02

0.16

0.36

0.06

0.31

-0.1

0.02

0.22 ±0.05

-0.34 ±0.19

P305

-0.30

0.07

0.08

-0.02

0.02

0.08

0.05

0.04

0.06

0.17 ±0.00

PFUB=Profundidad de la ubre; TEXU=Textura de la ubre; LSUM=Ligamento suspensorio medio; INSA=Inserción anterior; CPAN=Colocación de pezones anteriores; LPEZ=Largo de pezones; AIPOS=Altura de la inserción posterior; ANIN=Ancho de la inserción; CPPO=Colocación de pezones posteriores.

alta correlación con colocación de los pezones posteriores (0.76) y altura de la inserción posterior (0.57), igualmente se presentó una correlación alta entre profundidad de la ubre con colocación de pezones posteriores (0.58) y textura de la ubre (0.50). La característica ancho de la inserción presentó una correlación positiva (0.34) con producción de leche.

DISCUSIÓN En este estudio las heredabilidades de las características del cuerpo se encontraron entre 0.17 (ancho de pecho) y 0.37 (estatura). La heredabilidad para ancho de pecho difiere de otros estudios en los cuales la heredabilidad encontrada estuvo entre 0.26 y 0.36, mientras para la estatura se encontró un valor similar al

reportado por otros investigadores con un rango entre 0.35 y 0.59 (2,9,14). La heredabilidad para la profundidad del cuerpo (0.18) no difiere de manera significativa de la encontrada en otros estudios con un rango de 0.20 a 0.34 (2,6,9,14). Las correlaciones genéticas entre tamaño y estatura (0.69), y tamaño y profundidad del cuerpo (0.74) se encuentran cercanas a las reportadas por Degroot et al (5). La angularidad o forma lechera y profundidad del cuerpo, cuya correlación genética encontrada en este estudio fue de 0.70 es similar a lo reportado por Berry et al (7) y diferente a la reportada por DeGroo et al (5) quienes encontraron una correlación genética de -0.07. Estas diferencias pueden explicarse debido al tipo de selección que por años se ha llevado a cabo en Colombia debido

Corrales - Parámetros genéticos de caracteristicas de tipo y producción a que el productor ha seleccionado estas dos características de una manera conjunta y por ende las correlaciones genéticas son altas y positivas. Las características ancho de pecho y angularidad presentaron correlaciones positivas con producción de leche, las cuales están de acuerdo con estudios previos (5,7,15). Las características colocación de isquiones y ancho de isquiones no presentaron una alta correlación genética con producción de leche. Wall et al (16) encontraron que vacas con colocación de los isquiones altos presentan mayor intervalo entre partos y vacas anchas de isquiones presentan una mayor actividad luteal. Lo anterior indica que en Antioquia se puede realizar selección para la característica colocación y ancho de Ísquiones favoreciendo la eficiencia reproductiva sin afectar la producción de leche. Para las características de patas y pezuñas importantes en los sistemas de pastoreo debido a que las vacas necesitan una mejor locomoción que permita un pastoreo más eficiente y movilidad del potrero al sitio de ordeño (7) se encontraron heredabilidades para el ángulo de la pezuña y colocación de los miembros de 0.14 y 0.17, respectivamente; los cuales coinciden con resultados reportados para la raza Holstein (2,3,6). La alta correlación genética entre profundidad del talón y ángulo de la pezuña (0.98) y profundidad del talón y uniformidad de las pezuñas (0.85) está indicando la alta relación genética que existe entre las características y que el aumento en la profundidad del talón genéticamente aumenta el ángulo y la uniformidad de pezuñas. La correlación de las características de las patas y pezuñas con producción de leche se encontró en un rango de -0.13 con calidad de hueso y 0.35 con vista posterior de los miembros. Algunas de las correlaciones estimadas en este estudio concuerdan con las reportadas por Berry et al (7) quienes encontraron correlaciones genéticas de 0.07 entre ángulo de la pezuña y producción de leche. La correlación genética encontrada entre vista posterior de los miembros y producción de leche indica la relación que existe debido a que vacas con baja calificación pueden tener menores producciones de leche debido a la movilidad reducida que presentan (17). Las heredabilidades para las características de la ubre estuvieron en el rango de 0.12 a 0.28.

2875

La heredabilidad para todas las características son cercanas a las encontradas por Dal Zotto et al (2) quienes reportaron heredabilidades en un rango de 0.12 a 0.24. La característica ligamento suspensorio medio presentó una heredabilidad de 0.52 en el estudio realizado por DeGroot et al (5), mientras en el de Berry et al (7) la heredabilidad fue inferior a 0.18 al igual que el encontrado en este estudio donde la heredabilidad para ligamento suspensorio fue de 0.17. Las características profundidad de la ubre, ligamento suspensorio medio, inserción anterior, ancho de la inserción y colocación de pezones posteriores fueron las que presentaron mayor correlación genética con producción de leche. Las correlaciones negativas indican que vacas con alta producción tienen una ubre más débil debido a que presenta mayor profundidad, una inserción anterior débil y pezones posteriores hacia afuera. Teniendo en cuenta que en la clasificación lineal una calificación de 9 para profundidad de la ubre corresponde a una ubre superficial y la calificación de 1 corresponde a una ubre profunda. La correlación genética negativa entre profundidad de la ubre y producción de leche, indica que vacas con ubres muy profundas pueden tener mayor producción pero presentar mayores problemas sanitarios en la ubre y por ende un mayor riesgo de descarte como lo indicaron Nash et al (18). La correlación positiva entre las características ancho de la inserción y ligamento suspensorio medio se presentan porque ubres anchas de la inserción se relacionan con mayor capacidad de almacenamiento de la leche. Además, el productor ha seleccionado vacas de alta producción con ligamentos suspensorios fuertes que garanticen una mayor permanencia del animal en el hato (6). Los resultados de este estudio indicaron una considerable variación genética existente para las características de tipo dentro de la población Holstein de Antioquia. Las correlaciones genéticas encontradas entre algunas características de tipo indican la posibilidad de reducir el número de características a evaluar en cada animal. Características como ángulo de la pezuña y profundidad del talón con una correlación genética de 0.98 están indicando que la selección para una de las dos características estaría involucrando la selección para la otra característica. Las correlaciones genéticas encontradas para

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

producción de leche y las características de tipo indican que la conformación del animal tienen de media a baja relación genética con producción de leche, a excepción de la característica profundidad de la ubre que tuvo una alta correlación negativa que indica que las vacas de alta producción tienden a tener unas ubres más profundas por efecto del peso de la leche. Lo anterior indica que es posible seleccionar individuos para características de tipo sin

afectar la producción de leche y de esta manera tener vacas funcionales con una larga vida productiva y pocos problemas sanitarios. Agradecimientos Este trabajo fue posible gracias al apoyo del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, FEDEGAN. Universidad de Antioquia, Asociación Holstein de Colombia y Corporación Antioquia Holstein.

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Rev.MVZ 2878 Córdoba 17(1):2878-2883, REVISTA MVZ CÓRDOBA 2012. • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012 ORIGINAL

Comparación de metodologías moleculares para identificar el gen de la kappa caseína en ganado Holstein Comparison of molecular methodologies to indentify the kappa casein gene in Holstein cattle Carlos Solarte P,1* Ph.D, Carol Rosero G,1 Ph.D, Yohana Eraso C,1 Zoot. 1Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Pecuarias, Programa de Zootecnia, Programa de

Mejoramiento Genético, Ciudadela Universitaria Torobajo. Pasto. Colombia. *Correspondencia: csolarte@udenar.edu.co. Recibido: Octubre de 2010; Aceptado: Junio de 2011.

RESUMEN Objetivo. Comparar las metodologías moleculares, PCR-RFLPs y PCR-SSCP, para identificar las variantes alélicas del gen de la kappa caseína (CSN3) en bovinos Holstein del trópico alto de NariñoColombia. Materiales y métodos. Se escogieron al azar 50 vacas Holstein y mediante punción en la vena coxígea media se tomaron muestras de 5cc de sangre, que se almacenaron y preservaron en tarjetas FTA® para su posterior análisis en el laboratorio. El ADN se amplificó por PCR utilizando cebadores específicos. Los cambios en la conformación de cadena sencilla (SSCP) fueron visualizados en geles de poliacrilamida al 12%; mientras que los RFLPs se obtuvieron por digestión con tres enzimas de restricción y se visualizaron en geles de agarosa al 4%. Resultados. La metodología PCR-RFLPs fue útil para detectar mutaciones puntuales y por lo tanto se identificó un mayor número de alelos, lo que contribuye a una mejor estimación de las medidas de diversidad genética en poblaciones seleccionadas, ya que evita problemas de sobreestimación de los valores en las frecuencias alélicas. Por su parte, la técnica PCR-SSCP resultó más sencilla y económica, ideal para investigaciones en las que no existe información previa sobre los genotipos de las poblaciones bovinas y en estudios con bajos presupuestos. Conclusiones. Las dos metodologías evaluadas son herramientas moleculares que contribuyen a la orientación de los procesos de selección en los bovinos para leche, ya que identifican los alelos del gen CSN3. La diferencia radica en el costo de las mismas y en el número de variantes identificadas. Palabras clave: Colombia, genotipos, kappa caseína, PCR (Fuente: CAB).

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Solarte - Metodologías moleculares para identificar el gen de la Kappa caseína

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ABSTRACT Objective. Compare the PCR-RFLP’s and PCR-SSCP’s molecular techniques in order to identify the allelic variants of the kappa casein (CSN3) gene in Holstein cattle in Nariño-Colombia. Materials and methods. 50 female Holstein cows were randomly chosen and 5cc of blood samples were obtained from the animals´ medium coccygeal vein. The samples were stored and preserved in FTA® cards for further lab analysis. and were analyzed in the molecular laboratory. The DNA was amplified through PCR using specific primers. The changes in the single strand of DNA were visualized in 12% polyacrylamide gels, whereas the RFLPs were obtained through digestion with three restriction enzymes and visualized in 4% agarose gels. Results. The PCR-RFLP’s technique was useful to detect punctual mutation and to identify a greater number of alleles which contributed to a better estimate of the genetic diversity measurements on a selected populations, because it avoids the over estimation of values in allelic frequencies. On the other hand, the PCR-SSCP’s technique was simpler and cheaper, ideal for research where there is no previous genotype information on cattle populations or in studies that are limited by budget. Conclusions. Both evaluated methodologies are molecular tools which contribute to the design of selection procedures on dairy cattle because they correctly identify the alleles of CSN3 gene. The difference lies in the cost and the number of identified variants. Key words: Colombia, genotypes, kappa casein, PCR (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN En la mayoría de los sistemas especializados en producción de leche de varios países, incluido Colombia, la raza predominante es la holstein, la cual se considera la más lechera del mundo. Esta condición se ha logrado luego de un proceso selectivo de varias generaciones, donde el objetivo de mejoramiento está orientado a incrementar el volumen por lactancia, lo que a su vez ha contribuido con el detrimento de la calidad composicional de la leche (1). La baja calidad composicional de la leche, es una de las limitantes para la competitividad en el trópico alto de Nariño, donde el ganado holstein de esta región produce leche con baja calidad composicional, especialmente en contenido total de proteína, el cual está alrededor de 3.01%, por lo que es muy importante mejorar este rasgo (2). Para cumplir este objetivo, se debe tener en cuenta que el porcentaje de proteína en la leche está determinado fundamentalmente por el potencial genético del animal y las condiciones ambientales, especialmente el manejo nutricional. Por lo tanto, es necesario integrar los componentes genéticos y alimenticios al sistema productivo, con el fin de incrementar los porcentajes de sólidos en la leche, especialmente proteína. En el manejo genético debe tenerse en cuenta que, en la actualidad, la selección clásica de reproductores se puede complementar con la utilización de técnicas moleculares para identificar genes relacionados con la calidad de la leche. De esta manera se contribuye al incremento del progreso genético, por efecto de

la disminución del intervalo generacional, debido a que no es necesario esperar los resultados del desempeño productivo, en al menos una lactancia, puesto que los genotipos pueden identificarse incluso en estado embrionario (3). En el trópico alto de Nariño se viene desarrollando un programa donde se utilizan metodologías tradicionales de evaluación genética, complementadas con la identificación de los alelos de CSN3 mediante las técnicas PCR-SSCP y PCR-RFLP. La identificación de estos alelos es importante, puesto que algunas variantes alélicas como la B, están relacionadas con mayores contenidos de proteína y mejores rendimientos industriales para la producción de queso (4,5). Desde 1983 hasta el 2007, en Bos taurus, se han reportado 11 variantes alélicas para la CSN3, denominadas A, B, C, E, F, G, H, I, A1, A2 y A3, (6-9), estableciéndose la necesidad de identificarlos correctamente y determinar en ambientes específicos su relación con las variables de calidad composicional de la leche. Por un lado la técnica PCR-SSCP es una técnica rápida, sencilla y de bajo costo que se basa en la migración diferencial de cadenas desnaturalizadas de ADN, debido a que las cadenas simples adquieren estructuras secundarias complejas que depende de la secuencia de nucleótidos (10), mientras que en la PCR-RFLP se amplifica una región del gen de CSN3 para la detección de las variantes alélicas las cuales se digieren con enzimas de restricción que aunque son de alto

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costo, resultan altamente sensibles en la identificación de los puntos mutación, lo que a su vez garantiza la correcta identificación de los alelos (11). El objetivo principal de esta investigación, consistió en el uso de dos herramientas moleculares PCR-RFLP (Reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción) y PCRSSCP (Reacción en cadena de la polimerasapolimorfismo en la conformación de ADN de cadena única), con el fin de identificar los genotipos para CSN3 en animales holstein del trópico alto de Nariño-Colombia y comparar las ventajas y desventajas de cada una de ellas en dicho proceso.

MATERIALES Y MÉTODOS Toma de muestras. Se utilizó una muestra poblacional aleatoria de 50 hembras holstein del departamento de Nariño, sur occidente de la República de Colombia. Se tomaron 5 cc de sangre total, mediante punción en la vena coxígea media. Las muestras se almacenaron en tarjetas FTA® y posteriormente se transportaron para su análisis en el Laboratorio de Mejoramiento Genético de la Universidad de Nariño, Colombia. Obtención de ADN. Para la obtención del ADN desnudo se siguió el protocolo descrito por Solarte et al (12), utilizando el kit comercial FTA® de Whatman Bioscience. Diseño de cebadores. Las secuencias utilizadas para la amplificación del gen de la CSN3 fueron las descritas por Barroso et al (13), para la cadena adelantada 5`-TGT GCT GAG TAG GTA TCC TAG TTA TGG-3` y para la cadena atrasada: 5`-GCG TTG TCT TCT TTG ATG TCT CCTTAG-3, los cebadores utilizados permitieron el reconocimiento del gen, equivalente a un fragmento de 453pb. Amplificación por PCR. En un volumen de 20µl se utilizó un disco de ADN, buffer PCR 1X, 2.0mM de Mgcl2; 0.2mM de dNTPs; 2U de taq polimerasa (Promega) y 0.75µM de cada cebador. El programa de amplificación fue: un ciclo de cinco minutos a 94ºC; seguido de 35 ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 65ºC, dos minutos a 72ºC y se finalizó con un ciclo de cinco minutos a 72ºC.

PCR-RFLP. Los polimorfismos de restricción se obtuvieron a partir de la digestión del producto amplificado utilizando tres enzimas de restricción: HinfI, MaeII y HaeIII. La digestión, por separado, consistió en una incubación a 37°C por dos horas utilizando 2μl de enzima, 2μl de Buffer R 10X, 18μl de agua y 10μl del producto amplificado. La visualización de cada PCR y de los polimorfismos de digestión se hizo en geles de agarosa al 2% y 4% respectivamente, preparados con solución TAE 1X y bromuro de etidio como colorante. PCR-SSCP. Los polimorfismos en la conformación de ADN de cadena única se visualizaron en geles no denaturantes al 12% (relación de acrilamida-N`N bis-acrilamida 100:1), previa desnaturalización a 94ºC por tres minutos. Las muestras se corrieron durante 16 horas a 160 voltios y la tinción de los geles se realizó con hidróxido de sodio y nitrato plata. Estudio de costos de las técnicas. Una de las principales desventajas en el uso de herramientas moleculares para el conocimiento de la caracterización y diversidad genética de las poblaciones naturales se relaciona con su costo. La implementación del Programa de Mejoramiento Genético de la Universidad de Nariño en Colombia, ha permitido el uso de técnicas de ADN para el estudio de poblaciones bovinas, cuyos resultados pioneros en la región han sido un valioso aporte para el mejoramiento de la cadena láctea, además de permitir que pequeños agricultores del trópico alto de Nariño, quienes dependen económicamente de la actividad lechera, puedan acceder al conocimiento del genotipo de los animales de su hato. Por está razón se consideró importante determinar el costo de cada técnica para cada muestra analizada, para ello se empleó el método contable orden de producción (14) incluyendo en el costo total de cada técnica, los reactivos empleados en el desarrollo del proceso, desde la reacción en cadena de la polimerasa hasta la determinación del genotipo.

RESULTADOS La determinación de genotipos se realizó mediante las técnicas PCR-RFLPs y PCR-SSCP. Inicialmente se verificó la amplificación del gen de CSN3, acorde con el patrón indicado en la figura 1 y posteriormente se identificaron los genotipos.

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De igual forma, fue posible la correcta identificación de los patrones de bandas con la técnica PCR-SSCP y así determinar los alelos A y B al igual que los genotipos resultantes de la combinación de estos, alelos que son los de mayor importancia para la raza holstein (Figura 3).

DISCUSIÓN

Figura 1. Amplificación por PCR del gen de la CSN3 con un peso molecular de 453 pares de bases.

Se logró determinar polimorfismos de restricción con las tres enzimas utilizadas en este estudio (Figura 2) y los pesos moleculares de los fragmentos digeridos fueron acordes con lo reportado inicialmente por Barroso et al (13). Con la enzima HaeIII claramente se identificaron los alelos A, B y C. Los alelos A, B y E fueron identificados con la MaeII y para HinI fue posible la visualización de los alelos A, B, C y E.

Ventajas y desventajas de los métodos utilizados. Los dos métodos utilizados en esta investigación permitieron la identificación de las variantes alélicas de la CSN3. En relación al uso de la metodología PCR-RFLPs, el empleo de la PCR-SSCP resultó más sencilla y económica en la determinación de las variantes alélicas A y B, sin embargo, se presentaron algunas dificultades en la visualización de los genotipos resultantes de la conformación de cadena sencilla de ADN. En total, se logró estimar que esta técnica requiere siete horas por encima del tiempo empleado en la obtención de genotipos con la PCR-RFLPs.

Figura 2. Digestión del gen de CSN3 mediante las enzimas de restricción HinfI, MaeII y HaeIII.

Figura 3. Patrón de bandas generado por SSCP para el gen de CSN3.

Adicionalmente, uno de los factores críticos en la aplicación de la PCR-SSCP fue la visualización de los alelos previamente teñidos con nitrato de plata, tinción que resultó altamente sensible a la calidad de agua empleada para la preparación de las soluciones involucradas; hecho que implicó un incremento en el tiempo de obtención de los genotipos, de hasta 18 horas. Es importante mencionar, que la calidad de agua incluso afecta la lectura de los genotipos, debido a la baja nitidez de las bandas resultantes de la amplificación de cada alelo, lo que conlleva a la repetición de los procesos para la obtención de estos fragmentos, sobre todo en los alelos que discriminan el genotipo heterocigoto AB de los homocigotos.

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Una desventaja adicional de la técnica PCRSSCP, radicó en que con los cebadores utilizados (13) solo fue posible identificar las variantes A y B, a diferencia de la PCR-RFLP que permitió identificar, a partir de la digestión de un único producto de PCR, las variantes C y E sin ambigüedades, hecho que le confiere cierta ventaja en cuanto a la correcta identificación de los genotipos, no obstante, es necesario aclarar que utilizando otro tipo de cebadores también es posible identificar dichas variantes con la PCR-SSCP lo que confirma la mayor ventaja económica de esta técnica. Respecto a PCR-RFLP, pese al proceso laborioso que resulta en la obtención de cada variante alélica, la digestión específica con enzimas de restricción permitió identificar un mayor número de alelos y por ende de genotipos, lo que resulta más adecuado para efectos del conocimiento y estimación de los índices de diversidad genética de la población holstein distribuida en el Trópico Alto de Nariño. Estos resultados además permiten entender más claramente la estructura de la población estudiada, en cuanto a la distribución real de los porcentajes de variación genética, y que pueden sobreestimar las frecuencias alélicas de la población respecto a los alelos A y B, con el uso de la técnica PCR-SSCP.

Finalmente los resultados permiten concluir que las dos metodologías usadas en este estudio son aplicables en la identificación correcta de los genotipos para las variantes alélicas A y B. Asimismo se recomienda el uso de la metodología PCR-RFLPs, la cual resultó más sensible en la identificación de mutaciones puntuales representadas en un mayor número de alelos y genotipos; mientras que la técnica PCR-SSCP se recomienda en los casos en los cuales se requiera minimizar los costos de la investigación. Costos en las dos técnicas utilizadas. Los costos de identificación del genotipo de cada individuo utilizado en la presente investigación, con una conversión de pesos a dólares al valor de la tasa representativa del mercado (TRM) publicada en la fecha del estudio por el Banco de la República (15) para la técnica PCR-SSCP el análisis molecular para la identificación del gen CSN3 es de US$ 4.8 y con PCR-RFLPs el valor se incrementa hasta US$ 14.36 por muestra. Agradecimientos Al Ministerio de Agricultura, Colácteos y la Universidad de Nariño por permitir el desarrollo de esta investigación.

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Predicción del porcentaje de proteína total a partir de muestreos parciales y ajuste de efectos medioambientales Prediction of total protein percentage from partial sampling and adjustment of environmental effects Maria C Ceballos B,1* Zoot, Guillermo Correa L,2 Ph.D, Julián Echeverri Z,3 Ph.D. 1Fundación CIPAV. Grupo BIOGEM, Medellín, Colombia. 2Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Medellín, Colombia. 3Universidad Nacional de Colombia. Facultad de

Ciencias Agropecuarias, Departamento de Producción Animal. Grupo BIOGEM. Medellín, Colombia. *Correspondencia: mceballos30@gmail.com Recibido: Junio de 2010; Aceptado: Agosto de 2011.

RESUMEN Objetivo. Hallar una ecuación matemática para estimar el porcentaje de proteína promedio total (PPPT), a partir de la producción parcial (PP) y otros factores ambientales que afectan esta característica. Materiales y métodos. La investigación fue realizada en tres fincas lecheras del departamento de Antioquia, Colombia. Se muestrearon 182 vacas Holstein; la captura de información se llevó a cabo mediante muestreos mensuales de dos ordeños diarios. Se tomó información relacionada con hora de entrada al ordeño, producción de leche, número de parto, época del parto y los días en lactancia. El análisis estadístico se realizó mediante un modelo de regresión múltiple donde se determinaron las fuentes de variación significativas sobre el porcentaje de proteína total del día. A partir de los coeficientes de regresión estimados se generó un modelo de predicción para la variable antes mencionada. Resultados. Los efectos número de parto, días de lactancia, producción de proteína parcial (pm), producción de leche, expresión cuadrática de la producción de proteína parcial (am), producción de proteína parcial (am) y el intervalo entre ordeños tuvieron un efecto significativo (p<0.05) sobre el porcentaje de proteína total del día; a partir de estos efectos se generaron dos modelos de predicción de PPPT a partir de un muestreo parcial (am y pm). Conclusiones. El PPPT está afectado por diversos factores medioambientales que deben ser ajustados para los modelos de predicción. Estos modelos pueden ser aplicados para ajustar datos de un muestreo parcial (am o pm) y ajustarlos posteriormente a un valor de producción de proteína promedio día, en los programas de mejoramiento genético. Palabras clave: Ecuaciones, factores ambientales, matemáticas, mejoramiento genético (Fuente: CAB).

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Ceballos - Predicción del porcentaje de proteina total a partir de muestreos parciales

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ABSTRACT Objective. To find a mathematical expression for calculating the average percentage of total protein (APTP) from the partial production (PP) and other environmental factors that affect this characteristic. Materials and methods. The study was conducted on three dairy farms in the department of Antioquia, Colombia. 182 Holstein cows were sampled; the data capture was carried out through monthly sampling of the two daily milking sessions. Milking activity beginning time, milk production, number of births produced, season of parturition and days in lactation were recorded. The statistical analysis was conducted using a multiple regression model which identified significant sources of variation on the total daily protein content. Based on the estimated regression coefficients a prediction model for the aforementioned variable was generated. Results. The number of births produced, days in lactation, partial protein production (pm), milk production, quadratic expression for partial protein production am, partial protein production (am) and milking intervals had significant effects (p<0.05) on the total daily protein percentage content. Two models for APTP prediction from a partial sample (am and pm) were generated from these effects. Conclusions. The APTP is affected by various environmental factors that must be adjusted for prediction models. These models can be implemented to adjust data from a partial sample (am or pm) and further adjusted to a reliable average daily protein production in genetic breeding programs. Key words: equations, environmental factors, genetic improvement, mathematical (Source: CAB).

INTRODUCCION El porcentaje de proteína valora la calidad biológica y económica de la leche (1) siendo fundamental para el rendimiento económico de los hatos lecheros. Gran parte del esfuerzo en la selección se ha dedicado al incremento de la producción de proteína (2). Desde hace algunos años la demanda de lácteos ha forzado a los criadores a buscar la selección de ganado lechero con otras características, además de la producción abundante de leche (3,4). En países de referencia como Estados Unidos, según USDA (5) la producción nacional de leche entre 2009 y 2010 fue de 15,3 billones de libras, mientras que la producción en Colombia estimada al 2009 fue 5760 millones de litros, es decir, cerca de 16 millones de litros diarios (6-9). El aporte directo al producto interno bruto (PIB) de la ganadería de leche en Colombia es de 3.6%. En general la ganadería aporta el 26% del total del PIB del sector agropecuario y el 60% del total del sector pecuario (8,10). El uso de parámetros genéticos como la heredabilidad, repetibilidad y valores de cría son de gran importancia para la selección, ya que aseguran el progreso genético (11). Los componentes de la leche tienen una variación específica en cada raza de ganado, sin embargo estos pueden ser modificados por dos factores generales: El mejoramiento genético y el efecto ambiental (4). El ambiente está constituido por todos los factores que no sean genéticos, debidos a la fisiología (por ejemplo: sexo, edad,

etc.) y factores ajenos al animal, relacionados al clima, al manejo, al sistema de producción entre otros. A pesar de lo sencillo que parece, este modelo es bastante complejo ya que la medición del componente genético y ambiental trae implícitos muchos elementos (12). En la evaluación genética de los bovinos productores de leche es necesario corregir fuentes de variación ambiental que influyen sobre las características de importancia económica, estas correcciones permiten reducir el error de las comparaciones entre animales y aumentar la precisión de los valores genéticos predichos (13). Dentro de estas fuentes de variación se encuentran el número de partos, etapa de lactancia, raza, el efecto de intervalo entre ordeños, la época de parto, el año de parto, el efecto del hato, el número de ordeños entre otros. Varios de estos factores actúan en forma conjunta produciendo interacciones (1,13-15). Los factores de ajuste fueron creados con el fin de minimizar el error medio ambiental en comparación de animales con diferencias marcadas en cuanto a edad, raza, año, época de parto y otros. El ajuste para efectos causa una disminución de la varianza ambiental, disminuyendo así la sobre-estimación del valor genético de algunos animales y subestimación de otros (13,15,16). Para el control de producción de leche y de otras características como producción de grasa, proteína y recuento de células

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somáticas el Official Dairy Herd Improvement (DHI), recomienda que como mínimo deben muestrearse los hatos lecheros 10 veces en el año y ojalá hacer un muestreo mensual. Sin embargo, la demanda por parte de los productores para disminuir los costos de muestreo y de incrementar la habilidad de las técnicas por parte de DHI para abarcar más hatos sin tener la necesidad de hacer los muestreos normales ha estimulado la investigación y la implementación de métodos de prueba alternativos que tengan la credibilidad de la oficial DHI sin comprometer la exactitud de la prueba. Las variaciones en las estrategias incluyen la frecuencia de pruebas y, también, si la muestra se obtiene por supervisor oficial o por el dueño del hato. La exactitud de las estimaciones del rendimiento de la lactancia depende de la exactitud de las estimaciones del muestreo del rendimiento día. Participar en las pruebas de DHI involucra muestrear regularmente el peso de la leche y colectar la composición de la leche de las vacas individualmente usando la producción estimada a 24 horas de cada característica como producción de leche, grasa, proteína y conteo de células somáticas en el modelo de predicción de múltiples rasgos de rendimiento para la predicción de la lactancia. El esquema alternado mañana – tarde (am – pm) involucra un solo ordeño probado cada día de la prueba, alternando mañana y tarde de prueba a prueba; la información de esta medida de ordeño se multiplica por un factor que depende del intervalo anterior, para estimar la producción del ordeño no medido. Algunas investigaciones tienen como objetivo evaluar los esquemas de la comprobación alternativos para asegurar que el rendimiento a 24 horas está estimándose con exactitud razonable, además de ser a un menor costo (17-20). Este estudio fue realizado con el objetivo de hallar una expresión matemática que permita calcular el porcentaje de proteína promedio en un día, considerando la producción parcial am o pm y otros factores ambientales que afectan esta característica. Además, se tuvo en cuenta, estimar los factores de corrección que permitieran ajustar los datos de tal manera que se pudieran comparar hatos de clima tropical que tuvieran la información de muestreos parciales am o pm, ya que los estudios actuales para esta característica se han realizado en climas templados.

MATERIALES Y METODOS Sitio de estudio. La investigación fue realizada en tres fincas de ganadería de leche de la raza Holstein en el departamento de Antioquia. Una ubicada en el municipio de Medellín, corregimiento Santa Elena, la cual presenta una temperatura promedio de 14°C, una altura de 2500 m.s.n.m y una precipitación media de 2500 milímetros por año. Las otras dos estaban ubicadas en el municipio de San Pedro de los Milagros, veredas El Despiste y Alto Medina, las cuales presentan una temperatura promedio de 14°C, una altura de 2475 m.s.n.m y una precipitación media de 1935 milímetros por año. Recolección de información. Para llevar a cabo la investigación, se evaluaron las lactancias de 182 vacas distribuidas dentro de las tres fincas de la siguiente forma: Santa Elena: 117 vacas, Vereda el Despiste: 47 vacas y Alto Medina: 18 Vacas. La captura de información se llevó a cabo mediante muestreos mensuales en los dos ordeños diarios, a todas las vacas en producción en la unidad productiva. Además se tomó la información de la hora de entrada de la vaca al ordeño, la producción de leche, número de parto, época del parto y los días en lactancia. Este muestreo se realizó durante un periodo de un año y dos meses, con el objetivo de alcanzar toda la curva de lactancia de las vacas, realizados a partir de diciembre del 2008 hasta febrero de 2010. Las muestras fueron depositadas en viales especiales para su análisis en el laboratorio. A cada muestra se le añadió bronopol para conservar las características composicionales de la leche y evitar su degradación por presencia de microorganismos. El análisis químico se realizó en laboratorio, donde se analizaron las muestras de leche individuales a partir de las cuales se determinó el porcentaje de proteína mediante el milkoscan FT 120. Metodología estadística. La metodología utilizada fue similar a la de algunos autores que han propuesto modelos estadísticos para estimar a partir un muestreo parcial (am o pm), el porcentaje promedio de producción de proteína del día (17-19). Para la elaboración de este estudio se realizó un análisis inicial mediante un modelo de regresión múltiple donde se determinó qué fuentes de variación tenían efecto significativo sobre la variable dependiente (Porcentaje de proteína total del día). El modelo inicial fue el que se describe a continuación:

Ceballos - Predicción del porcentaje de proteina total a partir de muestreos parciales Y = β0 + β1Xi + β2Sj + β3ZK + β4Wl + β5Wm + β6Vn Donde: Y: Estimado del porcentaje de proteína total el día de muestreo β0: Intercepto β1: Coeficiente de regresión estimado para el efecto número de parto Xi: Efecto numero de parto i (i = 1 -12) β2: Coeficiente de regresión estimado para el efecto días de lactancia Sj: Efecto días de lactancia j β3: Coeficiente de regresión estimado para el efecto producción de proteína parcial am o pm ZK: efecto producción de proteína parcial am o pm K β4: Coeficiente de regresión estimado para el efecto intervalo entre ordeños Wl: Efecto Intervalo entre ordeños l (l = 1-7 siendo 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7: 9, 9.5, 10,10.5, 11, 11.5 y 12 horas de intervalo, respectivamente) β5: Es el coeficiente de regresión estimado para el efecto época de parto Wm: Efecto época de parto m (m = 1-2) β6: Coeficiente de regresión estimado para el efecto producción de leche (am o pm) Vn: Efecto producción de leche n. Se exploraron las distribuciones cuadráticas y cúbicas para cada una de las fuentes de variación y los niveles de significancia para definir el modelo definitivo para el análisis, así como su coeficiente de determinación (R2). El modelo anterior fue ejecutado mediante el software Stat Graphics (Statistical Graphics Corp. Rock ville, MD, USA). Para cada una de las variables significativas incluidas en el modelo definitivo se estimó el coeficiente de regresión correspondiente con el objetivo de construir las ecuaciones de predicción del porcentaje de proteína promedio día con base en las fuentes de variación significativas. Se diseñó un modelo para predecir el porcentaje de proteína promedio día a partir de la producción de proteína am y otro para pm, de acuerdo con los parámetros de significancia obtenidos luego de la ejecución del primer modelo. Además, se efectuó el análisis de residuales estudentizados y la correlación entre los valores predichos o estimados y los reales para determinar el ajuste del modelo.

RESULTADOS El valor medio para el porcentaje de proteína de la mañana, tarde y total fue diferente con valores de 3.05, 3.10 y 3.08 respectivamente,

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los coeficientes de variación para esta misma característica fueron similares y con una tendencia baja. En la tabla 1 se muestran la media, desviación estándar y coeficiente de variación para cada una de las variables incluidas en el modelo. Tabla 1. Media de producción, desviación estándar y coeficiente de variación para porcentaje de proteína total, porcentaje de proteína en el muestreo parcial am y pm, producción de leche total, producción parcial de leche am y pm, intervalo entre ordeños, número de parto y días de lactancia. Media

C.V

Porcentaje de proteína total (%)

Fuente de Variación

3.08

0.50

16.23

Porcentaje de proteína am (%)

3.05

0.46

15.06

Porcentaje de proteína pm (%)

3.10

0.65

20.99

Producción leche total(L)

17.1

6.92

40.56

9.3

3.85

41.64 40.68

Producción de leche am (L) Producción de leche pm (L)

7.8

3.18

Intervalos entre ordeños (h)

10.8

0.54

5.03

Número de partos

3.3

2.12

64.53

Días de lactancia

193.3

128.31

66.38

La época de parto no presentó efecto significativo (p>0.05) sobre el porcentaje de proteína de la leche en ninguno de los modelos analizados. Para el modelo de predicción a partir de la proteína am no presentaron significancia los efectos número de parto y producción de leche (p>0.05), por tanto, no fueron incluidos en el modelo de predicción definitivo. Para el modelo de predicción a partir de la producción parcial am se estimaron los siguientes coeficientes de regresión con respecto al porcentaje de proteína total (Tabla 2). De acuerdo con lo anterior se construyó el siguiente modelo de predicción a partir de la proteína parcial am y las demás fuentes de variación significativas. Tabla 2. Coeficientes de regresión estimados para los efectos incluidos en el modelo de predicción a partir de la producción am. Parámetro

Estimado

Significancia

0.518037

β2 (coeficiente de regresión estimado para el efecto días de lactancia)

-0.000102314

β3 (coeficiente de regresión estimado para el efecto producción de proteína parcial am)

0.921604

β4 (coeficiente de regresión estimado para el efecto intervalo entre ordeños.)

-0.023197

β0 (intercepto)

** Altamente significativo: (p <0.01); * Significativo: (p<0.05)

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Y = 0. 518037 - 0.000102314 Sj + 0.921604 ZK0.023197Wl Donde: Y: Estimado del porcentaje de proteína promedio en el día de muestreo Sj: Efecto días de lactancia j ZK: Efecto producción de proteína parcial am K Wl: Efecto intervalo entre ordeños l (l = 1 -7 Siendo 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7: 9, 9.5, 10,10.5, 11, 11.5 y 12 horas de intervalo respectivamente). El coeficiente de determinación (R2) para este modelo fue 0.860 lo que significa que el porcentaje de proteína promedio día está explicado en un 86.0% por los efectos días de lactancia, producción parcial de proteína am y el intervalo entre ordeños. Se estimaron los residuales estudentizados con los siguientes resultados (Figura 1). Residual Plot

Studentized residual

6 4 2 0 -2 -4 -6 2.2

3.2

4.2 predicted protprom

5.2

6.2

Figura 1. Gráfica de residuales estudentizados para el modelo predicción de proteína promedio a partir de la producción parcial de proteína am.

Con base en esta estimación, la correlación obtenida entre los datos reales y los predichos a partir del modelo anterior fue 0.928. Para el modelo de predicción a partir de la proteína pm no presentó significancia el efecto del intervalo entre ordeños (p>0.05). Por lo tanto, no fue incluido en el modelo de predicción definitivo. Para el modelo de predicción a partir de la producción parcial pm se estimaron los siguientes coeficientes de regresión con respecto al porcentaje de proteína total (Tabla 3). De acuerdo con lo anterior se construyó el siguiente modelo de predicción a partir de la proteína parcial pm y las demás fuentes significativas. Y = 0.871924 + 0.00720369Xi + 0.00720369Sj + 0.000206742ZK + 0.763206Vn + 0.001314 To Donde: Y: Estimado del porcentaje de proteína promedio en el día de muestreo

Tabla 3. Coeficientes de regresión estimados para los efectos incluidos en el modelo de predicción a partir de la producción pm. Parámetro

Estimado

Significancia

0.871924

β1 (coeficiente de regresión estimado para el efecto número de parto)

0.00720369

β2 (coeficiente de regresión estimado para el efecto días de lactancia)

0.00720369

β3 (coeficiente de regresión estimado para el efecto producción de proteína parcial am)

0.000206742

β6 (coeficiente de regresión estimado para el efecto producción de leche am).

0.763206

β7 (Efecto de la distribución cuadrática para la fuente de variación producción parcial de proteína Pm)

0.001314

β0 (intercepto)

** Altamente significativo: (p <0.01); * Significativo: (p<0.05)

Xi: Efecto número de parto i (i = 1 -12). Sj: Efecto días de lactancia j. ZK: Efecto producción de proteína parcial pm K Vn: Efecto producción de leche n. To: Es la expresión cuadrática de la producción parcial de proteína en el muestreo pm: producción parcial de proteína pm * producción parcial de proteína pm. El coeficiente de determinación (R2) para este modelo fue 0.907 lo que significa que el porcentaje de proteína promedio día esta explicado en un 90.7% por los efectos número de parto, días de lactancia, producción parcial de proteína pm, producción de leche parcial pm y la expresión cuadrática de producción parcial de proteína pm. Se estimaron los residuales estudentizados con los siguientes resultados (Figura 2). Con base en esta estimación, la correlación obtenida entre los datos reales y los predichos a partir del modelo anterior fue 0.95. Residual Plot 5.1

Studentized residual

2888

3.1 1.1 -0.9 -2.9 -4.9 2.2

3.2

4.2 predicted protprom

5.2

6.2

Figura 2. Gráfica de residuales estudentizados para el modelo predicción de proteína promedio a partir de la producción parcial de proteína pm.

Ceballos - Predicción del porcentaje de proteina total a partir de muestreos parciales

DISCUSIÓN De las variables evaluadas, la que resultó con mayor variación entre los datos fue días de lactancia, con un coeficiente de variación mayor a 40 (66.38) indicando que los datos son muy heterogéneos. La variable con menor variación fue el intervalo entre ordeños con un coeficiente de variación de 5%. Indicando alta homogeneidad de los datos para esta variable. Los altos coeficientes de variación para la producción de leche son un indicativo del alto componente ambiental que existe para esta característica y de la importancia que tiene efectuar programas de mejoramiento genético que ayuden a seleccionar los animales con genotipos favorables para el mejoramiento de la misma. Contrario a esto, el porcentaje de proteína presentó un coeficiente de variación medio a bajo que podría ser un indicativo de que el componente ambiental es menor para esta característica como lo indica su heredabilidad, esto es un incentivo adicional, ya que se sabe que un programa de selección tendría como resultado un rápido progreso genético para esta característica. Los efectos que presentaron efecto significativo sobre la variable en estudio son similares a los obtenidos por Quijano y Echeverri (21) quienes encontraron que el número de parto de la vaca y la producción de leche tuvieron un efecto altamente significativo (p<0.01) sobre el porcentaje de proteína lácteo, además de los días en lactancia que fueron significativos en esa investigación (p<0.05). Por otro lado, Delorenzo y Wiggans (17) reportaron valores significativos para los efectos intervalo entre ordeños y días de lactancia. Otro estudio reportado por Liu et al (19) mostró que la producción de proteína parcial (am o pm), el intervalo entre ordeños, el número de parto y la producción de leche tuvieron un efecto significativo sobre el porcentaje de proteína total. En concordancia con los hallazgos de este trabajo, Pérez et al (14) reportaron que la época del año no tuvo efecto significativo sobre el porcentaje de proteína lácteo. En el caso del segundo modelo los efectos que tuvieron efecto significativo sobre el porcentaje de proteína de la leche estuvieron más cerca de los reportados en la literatura anteriormente citada, efectos como el número de parto y la producción de leche solo tuvieron efecto sobre la producción de leche total cuando se incluyó el efecto de la producción de leche de la tarde. Esto puede ser resultados del corto periodo de tiempo que transcurre entre el ordeño de la mañana y la tarde en la mayoría de los hatos incluyendo los

2889

utilizados en esta investigación, esto ocasiona que el limitante genético de la ubre para producir leche no se supere en tan corto tiempo y que los limites de los animales no se alcancen. Por el contrario el intervalo de tiempo transcurrido entre el ordeño de la tarde y la mañana es muy largo y el límite genético se alcanza, ocasionando que algunas vacas detengan el proceso fisiológico de producción concentrando mas la proteína que aquellas que siguen produciendo porque tienen una mayor capacidad, bien sea genética, o determinada por el numero de lactancia. Los resultados de esta investigación son concluyentes en que bajo las condiciones del estudio, el número de parto, días de lactancia, producción de proteína parcial (pm), producción de leche, expresión cuadrática de la producción parcial de proteína, producción de proteína parcial am y el intervalo entre ordeños fueron los efectos que mas afectaron la variación fenotípica de la PPPT. A partir de esos efectos significativos se generaron dos modelos que permitirán ajustar los datos de un muestreo parcial (am o pm) y estimar un dato confiable de producción promedio día. Para el modelo am se tiene un nivel de seguridad de 92.8% y para el modelo pm se tiene el 95.2% derivados de los coeficientes de correlación entre los valores reales y los predichos. Los resultados de esta investigación se constituyen en un importante paso para la realización de evaluaciones genéticas para el área de estudio. La posibilidad de ajustar mediciones parciales a mediciones totales reduce el costo de los programas de mejoramiento y a la vez ayuda en la toma de decisiones en los hatos y también por parte de los investigadores, es además un aporte para los investigadores que hasta ahora solo disponían de información científica obtenida de trabajos realizados en zonas de clima templado. Este es un paso para la evaluación genética en la región, ya que a partir de estos factores ajustados en el trópico se reduce el efecto ambiental que se presenta cuando se realizan las mediciones en campo y a la vez permite realizar comparaciones y tomar decisiones en cuanto a la utilización de los resultados obtenidos en Colombia y trabajos que se han desarrollado en climas templados y utilizados en clima tropical. En conclusión, el PPPT está afectado por diversos factores medioambientales que deben ser ajustados para los modelos de predicción. Estos modelos pueden ser aplicados para ajustar datos de un muestreo parcial (am o pm) y ajustarlos posteriormente a un valor de producción de proteína promedio día, en los programas de mejoramiento genético

2890

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Rev.MVZ Córdoba 17(1):2891-2899, 2011.

2891 ORIGINAL

Crecimiento en pastoreo rotacional de toretes de razas criollas Romosinuano y Blanco Orejinegro en Colombia Growth in rotational grazing of young bulls from Romosinuano and Blanco Orejinegro creole breeds in Colombia Jaime Quiceno A,1* Esp, Rodrigo Martinez S,2 Ph.D, Henry Mateus E,1 Agrólogo, Jaime Gallego G,1 MV, Pedro Medina G,2 M.Sc 1Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, CORPOICA, Estación Experimental El Nus, San Roque, Antioquia, Colombia. 2Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, CORPOICA Centro

de Investigaciones Tibaitatá, Mosquera, Colombia. *Correspondencia: jquiceno@corpoica.org.co Recibido: Septiembre de 2010; Aceptado: Agosto de 2011.

RESUMEN Objetivo. Evaluar el crecimiento de toretes de las razas Romosinuno (ROMO) y Blanco Orejinegro (BON) en una prueba de comportamiento en pastoreo rotacional. Materiales y métodos. La prueba fue desarrollada en la Estación Experimental El Nus, en la Región Andina Colombiana, donde se evaluaron 20 toretes BON y 16 ROMO provenientes de quince ganaderías comerciales, los cuales fueron mantenidos en un solo grupo durante 221 días en pastoreo rotacional en franjas con periodos cortos de ocupación, de los cuales 56 días fueron en pastoreo no suplementado y 165 días bajo tres diferentes fases de pastoreo suplementado en el potrero. Se realizaron pesajes cada 28 días y se evaluaron variables como: la evolución en peso, la ganancia total y diaria, la diferencia entre pesajes, la relación consumo peso vivo y la tasa de consumo. Resultados. El peso inicial en la raza BON fue 180.4±36.9 kilos con 9.6±1.74 meses de edad y en la raza ROMO fue de 171.8±32.6 kilos con 10.1±3.2 meses de edad. El incremento general de los individuos entre pesajes fue 0.497 kilos por día para los individuos de raza BON, y 0.366 kilos por día para la raza ROMO. En la prueba de eficiencia la tasa de consumo de suplemento alcanzada fue 64.8% y 71% para BON y ROMO respectivamente, equivalentes a una ingestión de materia seca de 0.47% y 0.53% con relación al peso vivo. Conclusiones. Este trabajo evidencia un mayor desempeño de los individuos de la raza BON comparados con los animales de la raza ROMO e indica una alta variabilidad en la respuesta a un manejo semi-intensivo en las poblaciones en evaluación. Palabras clave: Ganancia de peso, mejoramiento genético, pastoreo rotacional (Fuente:CAB).

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ABSTRACT Objective. Evaluate the growth performance of young Romosinuano (ROMO) and Blanco Orejinegro (BON) bulls under a rotational grazing system. Materials and methods. The test was performed at the El Nus Experimental Facility, in the Colombian Andean region, where. 20 BON and 16 ROMO young bulls from fifteen commercial livestock farms were evaluated. The animals were kept as one whole group during 221 days in a rotational grazing strip with short occupation periods, out of which they were fed for 56 days through simple grazing and for 165 days under three different grazing phases with food supplements. Weight was taken at 28-day intervals and variables such as: weight evolution, total and daily weight gain, weight differences and the relationship between body weight and intake rate were evaluated. Results. The initial average weight for the BON breed was 180.4±36.9 kg for 9.6±1.74 months of age, and 171.8±32.6 kg for the ROMO breed at an average age of 10.1±3.2 months. The general increase for individuals between intervals was 0.497 kg/day for the BON breed and 0.366 kg/day for the ROMO breed. In the efficiency test the food intake rates were 64.8% and 71% for BON and ROMO respectively, which represent a dry matter intake of 0.47% and 0.53% in relation to live body weight. Conclusions. This work presents a higher performance in BON breed individuals compared to the ROMO breed and indicates a high variability in the response to a semi-intensive grazing system in those evaluated populations. Key words: Genetic improvement, rotational grazing, weight gain, (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN Desde el año 2005, la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria - CORPOICA inició un plan nacional de fomento y multiplicación de las Razas Criollas para realizar investigación participativa integrando el sector público y los ganaderos del país con el propósito de multiplicar, mejorar y fomentar las razas bovinas como la Blanco Orejinegro, Romosinuano, Costeño con Cuernos y Sanmartinero (1). Este plan busca promover la utilización de estos valiosos recursos entre los ganaderos, así como también realizar pruebas de comportamiento y finalmente contribuir al mejoramiento genético de los hatos de ganado criollo del plan de fomento y con la participación de poblaciones comerciales (2). La selección de toros obedece a varios criterios, entre ellos las medidas de crecimiento, clasificación lineal y valores genéticos para diferentes caracteres. La evaluación de la ganancia posdestete ha sido un método útil para comparar toros bajo condiciones estandarizadas, pero este tipo de evaluaciones tiene varios rasgos que permiten comparaciones validas para determinar el mérito genético asumiendo que las diferencias debidas a condiciones no genéticas predestete no influencia el ordenamiento final para el merito genético del crecimiento posdestete (3). Las pruebas de comportamiento consisten en la evaluación del potencial del crecimiento después del destete en animales de edades semejantes, mantenidos bajo condiciones ambientales uniformes y pueden utilizarse

para la identificación de animales superiores desde el punto de vista genético, Moore et al (4), para su posterior empleo en programas de mejoramiento, aunque el crecimiento después del destete es medianamente heredable en las razas criollas Romosinuano y BON (5, 6). Los productores de ganado de carne buscan incrementar sus rendimientos mediante la selección para caracteres de crecimiento, pero aunque estas metas de selección han sido importantes, sigue siendo necesario tener una mayor presión de selección para la eficiencia de conversión alimenticia, puesto que se ha determinado que las diferencias entre animales en su capacidad para convertir alimento en ganancia de peso son importantes en la determinación de los ingresos de los productores (4). Tradicionalmente, una medida de eficiencia del crecimiento es determinada por la eficiencia alimenticia, la cual ha sido establecida como la proporción de alimento, ganancia diaria (conocida por sus siglas en inglés; feed conversión ratio: FCR= CMD/GMD consumo medio diario/ ganancia media diaria) y Feed:Growth, que es la proporción de alimento consumido con respecto a la ganancia de peso, la cual es el reciproco de la eficiencia de ganancia (Growth:Feed), y por esto se incrementa a medida que la eficiencia de la ganancia se disminuye y viceversa. Esta característica esta altamente correlacionada con el crecimiento y se puede confundir con los patrones de madurez de los animales (7,8). Una forma para maximizar la ganancia de los

Quiceno - Crecimiento en pastoreo rotacional de toretes sistemas de producción de ganado de carne es minimizar los costos de producción puesto que el suministro alimenticio es uno de los mayores costos de producción (9), por tal motivo, la estimación de la eficiencia alimenticia individual ha sido un aspecto de amplio interés en los últimos años. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad de crecimiento de toretes de las razas criollas Romosinuano y Blanco Orejinegro bajo pastoreo rotacional, realizando una prueba de eficiencia, como componente de una prueba de comportamiento.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. La prueba se realizó en la Estación Experimental el Nus de CORPOICA, ubicada en el en el Municipio de San Roque, departamento de Antioquia y localizada geográficamente a 6° 29’ de latitud norte y 70° 09’ de longitud oeste, 800 msnm, temperatura media de 23.2°C, 2.200 mm/año de precipitación y 84% de humedad relativa. Animales. Se evaluaron 20 toretes de la raza BON y 16 de la raza ROMO provenientes de quince ganaderías comerciales, seleccionados por los propietarios en las fincas de origen. Luego del arribo de los animales a la Estación, fueron mantenidos en observación en corrales provistos con bebederos y se les realizó examen clínico, pesaje y control de parásitos con un producto a base de ivermectina dosificado de acuerdo al peso. Además, se realizó control de ectoparásitos con producto a base de amitraz, con una repetición a los 120 días. Los toretes fueron vacunados contra fiebre aftosa y carbón sintomático en la época de vacunación general de la región. Además, se realizaron tratamientos contra anaplasma y babesia, con un producto a base de oxitetraciclina, diaminazina y fenildimetil- pirazolona. Pesaje. El sistema de pesaje fue potrero báscula a intervalos de 28 días, previa recogida y descanso de una hora, para un total de doce pesajes realizados en el mismo horario, ocho en la prueba de comportamiento y cuatro en periodos intermedios de la prueba de eficiencia alimenticia. Mediciones. Se realizó la medición del perímetro testicular por dos veces, así como las medidas morfométricas de altura a la cruz, altura a la cadera, longitud escápulo humeral – tuberosidad isquiática y longitud de la grupa, y las medidas por ultrasonido de área del ojo

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del lomo (AOL), espesor de la grasa dorsal y profundidad del lomo utilizando un ecógrafo Aloka SSD-500 (MR) con un transductor lineal de 3.5 MHz de 12 centímetros (Aloka Inc., Wallingford, CT, EUA). Clasificación fenotipica. Los animales fueron valorados y clasificados por un experto de la Asociación Colombiana de Ganado Criollo de acuerdo con el tipo, teniendo en cuenta la apariencia general, los indicadores de adaptación, el desarrollo músculo esquelético y la aptitud reproductiva. Métodos de campo. Los toretes fueron mantenidos en pastoreo como un solo grupo en 6.4 hectáreas, las cuales correspondieron a 13 franjas en un sistema rotacional. Cada franja fue ocupada por dos a tres días, de acuerdo con el peso total de los animales y la disponibilidad de forraje. Se manejó un registro programado por franja que incluía: fecha de entrada, de salida, días de ocupación y acumulados para mantener periodos de descanso regulados entre 29 y 31 días. El suministro de agua se hizo con bebedero automático de 250 litros y el de sal en un saladero portátil con tapa para que el animal la abra y la cierre, con capacidad para diez kilos y fue utilizada sal mineral del 6.5% de fósforo. Fases de la prueba. En la fase primera los animales fueron mantenidos en pastoreo durante 56 días, la segunda, en pastoreo con suministro de suplemento en el potrero en forma masiva y libre, la tercera, con suministro de suplemento en potrero a grupos de seis animales; estas duraron 145 días y la cuarta, o prueba de eficiencia alimenticia en pastoreo con programación y control individual sobre el consumo de suplemento, con una duración de 23 días. Suplementación. El suplemento alimenticio contenia 80% maíz molido, 15% soya estrusionada molida y 5% melaza, con un valor de 88.5% de materia de seca y aporte de 119 gramos de proteína y 2.85 megacalorías de energía metabolizable por kilogramo de materia seca. El suplemento siempre se dio en el potrero en comederos plásticos portátiles de 370 cm de perímetro y capacidad para 250 kilos y se repartió en dos porciones, una en la mañana y otra en la tarde. En la segunda y tercera fase se suministraron 1.3 kg/animal/día. En la cuarta fase se suministró calculado por individuo. Cuando se ofreció el suplemento en forma masiva y libre, se utilizaron tres y luego seis comederos plásticos. Cada comedero permitió alimentar simultáneamente seis o siete

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animales, los toretes accedieron libremente y el consumo dependió de la habilidad de cada uno para permanecer en el comedero asignado o pasar por los demás. Con el propósito de favorecer el consumo, se pasó a suplementar por grupos de seis animales, para lo cual con bastones e hilo eléctrico en la franja en donde se encontraba el ganado se aislaron áreas para los comederos. Eficiencia alimenticia. Esta prueba se realizó con el propósito de dar lugar a la capacidad de ganancia de peso de cada animal ante una oferta determinada de suplemento. La ración se calculó de acuerdo con el peso de cada animal, la materia seca del forraje y del suplemento, tendiendo como referencia una ingestión de 3.2% con relación al peso vivo animal. La cantidad de suplemento programada fue equivalente al 30% de la ración total, para no exceder los carbohidratos fácilmente fermentables que pudieran producir alteraciones en el rumen. Los aportes de proteína y energía se calcularon utilizando un programador NRC1989 con base en los requerimientos de mantenimiento y una producción deseada de mil gramos animal/día. La conversión alimenticia fue calculada según Nkrumah et al (7). En la última fase para el suministro de suplemento a cada individuo en la franja, se utilizó el mismo sistema con bastones e hilo eléctrico para aislar áreas con comedero por animal. Además cada día un monitor estuvo encargado de entregar la ración en porciones de 400 gramos, hasta completar lo programado, registrando el tiempo de consumo a cada torete. Durante el periodo de la prueba alimenticia se hicieron cuatro pesajes en periodos cortos para cuantificar la ganancia diaria, establecer la diferencia entre el consumo programado y el realizado o tasa de consumo y calcular un cociente de eficiencia equivalente a la relación consumo ganancia. Análisis estadístico. Debido a que las fases se manejaron inicialmente como factor de adaptación, solamente se realizó análisis de comparación de medias utilizando el Procedimiento PROC MEANS del programa estadístico SAS (10) Para las características de peso se realizó un análisis de modelos mixtos con medidas repetidas en el tiempo y utilizando como covarianza la edad del animal y como efecto fijo la raza. El modelo de análisis fue: Yïj= μ + yrj + βi (xil + x..) + ak + eij

Donde: Yïj= variable dependiente, μ = promedio general, yrj= efecto de raza, βi = es la pendiente de la covariable edad del animal; xil es el valor de la covariable para iesima raza en la jesima edad, x = es el promedio de la covariable, ak= efecto aleatorio del kesimo animal y eij= error experimental. Los datos fueron analizados utilizando el procedimiento Proc MIXED, utilizando una estructura de (co)varianza autoregresiva 1, que presentó el mejor valor de AIC, se calcularon los componentes de (co)varianza y las soluciones para los efectos fijos y aleatorios, pero en este caso sólo se muestra la significancia de los efectos fijos y para las ecuaciones de crecimiento se realizaron análisis de regresión polinomial, pero las ecuaciones de regresión lineal fueron las que presentaron el mayor ajuste a la variación de la característica. El análisis se realizó utilizando el programa estadístico SAS (10). RESULTADOS La prueba de evaluación productiva incluyó 20 toretes BON procedentes de diez ganaderías colombianas, con peso promedio de 180±36.9 kg y edad promedio de 9.6±1.74 meses y 16 animales de la raza ROMO, procedentes de otras cinco ganaderías colombianas, con un peso promedio de 171.8 ± 32.6 kg y edad promedio de 10.1±3.2 meses al inicio de la prueba. Relación suplemento peso vivo. La relación entre la ingestión de suplemento y el peso vivo en las fases segunda de alimentación masiva y tercera por grupo se mantuvo entre 0.65% y 0.50% para la raza BON, (Tabla 1), mientras que para la raza ROMO estuvieron entre 0.71% y 0.57%, respectivamente.

Tabla 1. Relación entre la cantidad de suplemento alimenticio y el peso vivo en los diferentes periodos de pesaje de acuerdo con el promedio de peso de los toretes de las razas BON y ROMO. RAZA

Primera fase

Segunda fase

Tercera fase

Cuarta fase

P 1%

P 2%

P 3%

P 4%

P 5%

P 6%

P 7%

BON

0.65

0.62

0.57

0.53

0.50

0.47

ROMO

0.71

0.68

0.64

0.60

0.57

0.53

P=Pesaje; ND= No disponible, periodo sin suplemento.

Quiceno - Crecimiento en pastoreo rotacional de toretes En la prueba de eficiencia alimenticia la tasa de consumo fue 64.8% para la raza BON y 71.01% para la raza ROMO, estos valores correspondieron a un reemplazo en la materia seca de la ración de 19.42% y 20.89% respectivamente, los cuales fueron equivalentes a una ingestión de materia seca con respecto al peso vivo de 0.47% y 0.53% para cada raza, respectivamente. Aunque todos los animales consumieron suplemento, ningún individuo consumió la cantidad programada.

2895

Evolución de la ganancia de peso en la raza BON. En la figura 1, se muestra la tendencia del peso individual promedio, el cual se incrementó por período de 28 días en 13.9 kg, que corresponde a la pendiente de la curva de crecimiento, la cual tuvo un peso promedio inicial de 180.4 kg y un peso promedio final de 279.25 kg, con una edad promedio de 17 meses.

En la tabla 2, se muestra la cantidad de forraje, proteína cruda (PC) y energía metabolizable (EM) aportadas con el forraje y el suplemento alimenticio suministrado, calculado de acuerdo al consumo promedio por raza, lo que indica que la raza ROMO presentó un menor consumo de forraje y por ende menor suministro proteico y energético; lo mismo ocurrió con el consumo de suplemento. Tabla 2. Aporte del forraje y el suplemento en la prueba de eficiencia para la raza BON y ROMO en prueba de comportamiento. Forraje Raza

EM (Mcal)

PC (g)

Cantidad (kg/ms/día)

BON

13.55

831.38

6.52

ROMO

11.60

781.50

5.60

Suplemento EM (Mcal)

PC (g)

Cantidad (kg/ms/día)

BON

3.96

165.46

1.39

ROMO

4.19

154.72

1.30

Eficiencia alimenticia BW075

GMD

FCR

BON

68.26±

746±24

14.5±5.6

ROMO

62.11±

745±31

14.3±7.2

EM: Energía metabolizable; PC: Proteína cruda; BW075: Peso metabólico, GMD: Ganancia media diaria en g., FCR: Feed conversión ratio en kg de materia seca por kg de ganancia.

En este trabajo se encontraron valores de peso metabólico mayores para la raza BON comparada con la raza ROMO, pero con consumos de alimento y forraje inferiores, por lo que la ganancia media diaria y la eficiencia alimenticia fueron similares y no hubo diferencias significativas entre razas. La eficiencia alimenticia tuvo un valor promedio de 14.5 kg de materia seca por kg de ganancia, los valores encontrados para la raza ROMO en ganancia media diaria de peso (745 g de GMD por kg de ganancia) fueron inferiores que los presentados en la raza BON, para los cuales los menores valores se encontraron cerca a 870 g, que correspondieron a los animales clasificados en los primeros lugares de la prueba.

Figura 1. Evolución en peso y tendencia del individuo promedio de la raza BON.

En la tabla 3, se presenta el comportamiento promedio y se describen los valores superiores presentados en el grupo de prueba de la raza BON, teniendo en cuenta las temporadas de lluvia o periodo seco que se presentaron durante el desarrollo. Los pesajes 3 y 4, coincidieron con el final del periodo de lluvia y fueron los que presentaron las menores ganancias promedio, valores incrementados Tabla 3. Relación entre épocas, ganancias de peso máxima y superior a 0.7 kg, para la raza BON. Lluvia Pesaje

Sep - Oct

Oct - Nov

Nov - Dic

Peso 1

Peso 2

Peso 3

Peso 4

180±37

197±37

200±39

211±41

Significancia

0.001

0.02

0.05

0.08

Ganancia día promedio

607±392

82±315

400±254

Peso máximo kg

238

262

257

275

Ganancia día Máxima. kg

1.392

678

1.179

Ene - Feb

Feb - Mar

Mar - Abr

Abril

Peso 5

Peso 6

Peso 7

Peso 8

Peso promedio

Seco Pesaje

Peso promedio

Dic- Ene

Lluvia

229±46

245±52

262±54

279±56

Significancia

0.07

0.09

0.06

0.002

Ganancia día promedio

648±300

577±328

595±194

621±178

Peso máximo kg

300

330

346

376

Ganancia día Máxima. kg

1.321

1.089

911

1.143

2896

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para el periodo seco, donde se presenta el mayor valor de ganancia promedio (648±300 g/animal/día), valor similar al presentado en el pesaje 8, que correspondió al segundo periodo de lluvias (621±178 g/animal/día). En cuanto a los valores máximos, el mejor comportamiento se dió en el primer período de lluvia, con valores de 1.392 y 1.179 g/animal/ día, para los pesajes 2 y 4, pero igualmente en el primer pesaje del período seco se presentó una ganancia similar (1.321 g/animal/día) y en el último pesaje del segundo período de lluvia (1.143 g/animal/día), que correspondió con un individuo que alcanzó 376 kg a los 17 meses de edad. Evolución de la ganancia de peso en la raza ROMO. En la figura 2, se presenta una ganancia de peso individual por periodo de 28 días de 10.2 kg, que corresponde a la pendiente de la curva de crecimiento, donde el peso promedio inicial correspondió a 171.8 kg y un peso promedio final de 245.8 kg, con una edad promedio de 18 meses.

Tabla 4. Relación entre épocas de lluvia y seca y ganancias de peso promedio y máxima de la raza ROMO. Lluvia Pesaje

Sep – Oct

Oct - Nov

Nov - Dic

Dic - Ene

Peso 1

Peso 2

Peso 3

Peso 4

172±33

183±35

183±32

190±34

0.001

0.05

0.08

395±228

46±340

330±247

253

237

253

821

571

714

Ene – Feb

Feb - Mar

Mar - Abril

Abril

Peso 5

Peso 6

Peso 7

Peso 8

202±40

216±44

230±47

246±51

0.09

0.06

0.002

486±248

511±342

527±261

578±177

Peso máximo. kg

277

300.5

333

353

Ganancia día Máxima. g

857

1.053

1.160

964

Peso promedio Significancia Ganancia promedio Peso máximo. kg

233

Ganancia día Máxima. g Seco Pesaje

Peso promedio Significancia Ganancia promedio

Lluvia

DISCUSION

Figura 2. Evolución en peso y tendencia del individuo de la raza ROMO.

En la tabla 4, se muestra la comparación entre medias de los pesos alcanzados por los individuos ROMO. Los pesos del final de la primera temporada de lluvia fueron los menores de todo el período de crecimiento, significativamente inferiores (p<0.05) (46±340 y 330±247 para los pesos 3 y 4 en la raza ROMO), igualmente para pesajes posteriores de la época seca, sólo hasta el sexto pesaje, los animales de esta raza lograron sobrepasar una ganancia de 500 g/animal/día, valor que es inferior al presentado en la raza BON en más de 100 g. Por el contrario, en el último pesaje de la etapa de suministro individual de suplemento, se presentó un valor promedio de ganancia diaria de 578±177 g/animal/ día, valor que sólo es superado en 43 g. por el valor presentado en la raza BON pero sin diferencias significativas (p>0.05).

Se evidenciaron diferencias marcadas en el desempeño de los animales en las diferentes fases de la prueba (pastoreo, pastoreo con suplementación y prueba de eficiencia alimenticia), puesto que las ganancias medias diarias se incrementaron en más de 120 g/ animal/día, en términos promedio, este efecto ha sido evidenciado por otros autores como ha sido descrito por Schoeman y Jordaan (11) quienes indicaron que las evaluaciones de la eficiencia en dietas de forrajes y dietas altas en concentrado deberían ser consideradas como dos características independientes en los programas de selección. En la relación entre la ingestión de suplemento y el peso vivo en las fases segunda de alimentación masiva y tercera por grupo, los rangos diferentes permitieron establecer que los individuos de la raza ROMO mantuvieron un consumo del suplemento alimenticio más alto con respecto al peso. Los resultados encontrados en la cuarta fase o prueba alimenticia sugieren que para mantener un mejor equilibrio en la relación ingestión de suplemento y peso, se deben hacer ajustes de la dieta después de cada pesaje, además, los animales de la raza ROMO presentaron un

Quiceno - Crecimiento en pastoreo rotacional de toretes mayor consumo en general, y la diferencia se incrementó, cuando los animales fueron sometidos a la prueba de eficiencia alimenticia. En las pruebas de comportamiento, diferentes medidas de eficiencia alimenticia han sido propuestas y tradicionalmente, la eficiencia ha sido definida como una proporción de alimento/ ganancia o ganancia/alimento (12). Algunas de estas características de eficiencia de crecimiento conversión y eficiencia de mantenimiento han sido caracterizadas genéticamente (12-14) y se han encontrado valores significativos para el componente genético (15). Por lo que aquellos animales más eficientes consumen menos alimento que el esperado, basado sobre sus requerimientos de mantenimiento y crecimiento de tal forma que los animales más eficientes tienen menores valores para estos índices de conversión (7), en este caso, la raza ROMO presentó menores valores de consumo, pero no se evidenciaron diferencias en la eficiencia alimenticia entre razas. La incorporación de estas medidas de eficiencia alimenticia dentro de los objetivos de mejora, como puede ser el caso del programa de mejoramiento de estas razas criollas colombianas, puede incrementar el potencial genético de los animales para que tengan menos consumo mientras que sostienen el mismo nivel de producción, puesto que se ha demostrado que los animales más eficientes presentan múltiples beneficios, tales como disminución de consumo de materia seca, menos producción de estiércol y menos emisión de metano (16,17). En la tendencia del peso individual promedio del individuo BON, es importante resaltar que los pesos tres, cuatro y cinco estuvieron por debajo de la línea de tendencia, debido a la incidencia de hemoparásitos y los efectos del inicio del fenómeno del niño. Al final, en los pesos siete y ocho, el comportamiento del animal promedio superó la línea de tendencia, hecho que puede ser explicado por el efecto del consumo de suplemento individual, dosificado y controlado. En la raza Romo, con respecto al incremento promedio de peso, se nota un desempeño por debajo de la línea de tendencia, tal como sucedió en la raza BON, pero con la diferencia que el alejamiento de la línea de tendencia fue más amplio, lo cual indicó que la incidencia ambiental y los efectos sanitarios (hemoparásitos) afectaron más fuertemente a los individuos de raza ROMO. Asímismo, en el pesaje final coincidente con la prueba de eficiencia alimenticia, se nota el incremento en el desempeño de los animales

2897

que presentaron valores superiores a la línea de tendencia y dicha variación también fue más amplia que la presentada para la raza BON, lo cual explicó el mejor efecto del suplemento en la prueba de eficiencia con suministro individual, dosificado y controlado para el grupo ROMO. En la relación entre épocas, ganancias de peso máxima y superior a 0.7 kg del BON en cuanto a los valores máximos, es de resaltar, que el segundo periodo de pesaje presentó los mayores valores de ganancia diaria, posiblemente debido a un efecto de ganancia compensatoria de algunos animales que se presentaron en la prueba. Mientras que en el ROMO los pesos del final de la primera temporada de lluvia fueron los menores de todo el período de crecimiento, posiblemente debido a efectos ambientales severos, que afectaron en mayor medida, significativamente inferiores. En cuanto al peso máximo presentado en el primer pesaje, no fue significativamente diferente entre razas, pero este fue cambiando posteriormente, debido a efectos ambientales y en el cuarto pesaje la diferencia fue de 20 kg, tendencia que se mantuvo durante los pesajes sucesivos hasta el sexto pesaje donde la diferencia alcanzó los 30 kg; para el último pesaje esta diferencia retornó a los 23 kg (p<0.05). En esta prueba de comportamiento los animales han sido obtenidos de quince ganaderías localizadas en diferentes regiones de Colombia, animales que fueron sometidos probablemente a diversas condiciones de manejo factor de gran importancia, ya que se ha reportado que el hato de origen o el tratamiento predestete tiene un efecto significativo sobre el peso y ganancia diaria posdestete a 49 y 77 días posdestete, pero también presentó efectos importantes hasta los 189 días posdestete (18). Lo anterior indica que se debe tratar de homogenizar las condiciones de manejo previas al ingreso a la prueba con el fin de eliminar efectos ambientales que puedan interferir en la definición del efecto genético para la selección de los mejores animales en la prueba de comportamiento. Se puede concluir que las pruebas de comportamiento en peso a potrero, constituyen una herramienta de primera mano para la valoración productiva de los animales a nivel de trópico y los resultados solo sirven para la comparación de los individuos que en ella participen. Es por esto que el periodo de pastoreo no suplementado es necesario para lograr la adaptación de los animales al sistema, a la nueva oferta de forraje, al manejo y a las presiones endémicas de la zona, que en este

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

caso afectaron significativamente el desempeño de los animales y pudieron tener un mayor efecto sobre el comportamiento de la raza ROMO, que presentaron un mayor descenso posterior a la presentación de la afección. En las fases en las cuales se utilizó suplemento, tanto en las de consumo libre como controlado, se demostró que la ingestión de materia seca del suplemento con relación con el peso vivo fue inferior para la raza BON, pero la eficiencia alimenticia no fue significativamente diferente entre razas. Se sugiere en las fases de consumo libre, la utilización de cantidades ajustadas con los pesos obtenidos durante la prueba, para mantener una suplementación más equilibrada.

En conclusión, este trabajo evidenció un mayor desempeño de los individuos de la raza BON comparados con los animales de la raza ROMO e indica una alta variabilidad en la respuesta a un manejo semi-intensivo en estas poblaciones en evaluación. Agradecimientos A los ganaderos participantes en la prueba de comportamiento y al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, por el financiamiento del proyecto mediante convenio 2008H710371634, Contrato: 945.

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Rev.MVZ 2900 Córdoba 17(1):2900-2907, REVISTA MVZ CÓRDOBA 2012. • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012 ORIGINAL

Evaluación de la degradabilidad in situ en bovinos suplementados con cuatro especies arbóreas Evaluation of in situ degradability in cattle supplemented on four tree species María Roa V,1* M.Sc, Javier Muñoz M,2 MVZ. 1Universidad de los Llanos, Escuela de Ciencias Animales Km 12 vía a Apiay, Villavicencio, Meta, Colombia.2Centro Educativo Rural calle16 No 1A-52, Restrepo, Meta, Colombia. *Correspondencia:

ligiaroa2607@gmail.com.

Recibido: Junio de 2010; Aceptado: Septiembre de 2011.

RESUMEN Objetivo. Evaluar degradabilidad in situ en rumen de cuatro especies forrajeras: Acacia Roja (Delonix regia), pízamo (Eritryna glauca), Cratilia (Cratylia argentea) y casco de vaca (Bahuinia variegata), para determinar su calidad nutricional. Materiales y métodos. Cuatro hembras rumino-fistuladas en un diseño de sobrecambio simple, pastoreando en Brachiaria decumbens, suplementadas en la mañana con tres kg de hojas deshidratadas de las cuatro especies mencionadas, de un año de establecidas y podadas cada 3 meses. En las pruebas in situ se utilizaron bolsas de nylon, adicionando 5 g de MS de cada arbórea/bolsa, incluyendo braquiaria, en diferentes horas (6, 12, 24, 48 y 72). Se evaluó la degradabilidad de la materia seca (DMS), fibra detergente neutro (DFDN) fibra detergente ácido (DFDA), nitrógeno total (DNT) y nitrógeno adherido a FDN (DNFDN). En el líquido ruminal se midió nitrógeno amoniacal a las 0, 4, 8 y 12 y pH a las 0, 3, 6, 9 y 12 horas. Resultados. La DMS fue mayor (p>0.05) para casco de vaca (53.3%) y acacia roja (56.1%) con relación a pízamo y cratilia. La DMS de braquiaria fue mayor (p>0.05) en 18.6% suplementando con casco de vaca con relación a las otras arbóreas. La DFDN potencial fue menor (p>0.05) para pízamo (7.6%) en comparación con cratilia. La DFDN de braquiaria fue similar en todas las forrajeras. Conclusiones. Algunos componentes de las arbóreas tienen efecto asociativo en la cinética de la tasa de degradación de MS y FDA del pasto, siendo superiores (p>0.05) cuando se suplementó con casco de vaca. Palabras clave: Alimentación, follaje, rumiantes (Fuente:CAB).

2900

Roa - Evaluación de la degradabilidad in situ en bovios

2901

ABSTRACT Objective. Evaluate the ruminal in situ degradability of four forage species: Flamboyant (Delonix regia), Indian Coral Tree (Erithryna glauca), Cratylia (Cratylia argentea) and Camel’s Foot Tree (Bahuinia variegata) to determine their nutritional value. Materials and methods. Four rumenfistulated bovine females distributed in a simple crossover design, grazing on Brachiaria decumbens were supplemented in the morning with three kg of dried leaves of the four mentioned species. The tree species were one year old, and pruned every three months. Nylon bags with 5 grams of tree MS in each bag including B. decumbens were used for the in situ testing, at different times (6, 12, 24, 48 and 72). The degradability of dry matter (DDM) , neutral detergent fiber (DNDF), acid detergent fiber (DADF), total nitrogen (DTN) and nitrogen attached to FDN (DNANDF) were evaluated. Ammonia nitrogen was measured at 0, 4, 8 and 12 and pH at 0, 3, 6, 9 and 12 hours was measured in the ruminal fluid. Results. The DMS was greater (p>0.05) for B. variegata (53.3%) and (56.1%) for D. regia compared to E. glauca and C. argentea. The B. decumbens DMS was higher (p>0.05) with 18.6% supplement of B. variegata compared to the other trees. The potential DFDN was lower (p>0.05) for E. glauca (7.6%) compared with cratylia. The DFDN of B. decumbens was similar for all forages. Conclusions. Some components of the tree species have association effects on the kinetics of the the B. decumbens DM and ADF degradation rates, being higher (p>0.05) when supplemented with B. variegata. Key words: Fodder, food, ruminants (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN Los sistemas agroforestales tienen como objetivo central manejar de forma integrada especies arbóreas y actividades agropecuarias sin detrimento de los recursos naturales, por lo tanto,se recomienda utilizar árboles forrajeros en la producción ganadera. Los forrajes como las especies arbóreas contienen fibra, la cual es degradada por bacterias que producen la celulasa y que pertenecen al género Ruminococcus Bacteroides y Butyrivibrio, cuya población se puede ver afectada por factores como: tipo de dieta y forraje, tasa de pasaje, tamaño de partículas y otros. La fibra tiene como función mantener cercano a la neutralidad el pH del rumen lo que favorece el incremento de la población de las bacterias celulolíticas y por tanto, la disponibilidad de ácido propiónico que es la principal fuente de energía del rumiante (1-3). Además, de la energía, es importante para la dieta del ganado las fuentes de proteína como son las leguminosas a las que pertenece la acacia roja (Delonix regia), también conocida como: flamboyant, flamboyán, flamboyanttree, flamboyán rojo y árbol de fuego por las flores de varios colores; se encuentra distribuido en todo el continente Americano. Además, de ser utilizada para ornamentación y sombrío se viene empleando para la alimentación de animales como lo demuestran investigaciones realizadas en México, donde en ciertas épocas el pasto para el ganado escasea, mientras que la acacia roja produce una alta cantidad

de hojas y vainas, lo que la convierte en una alternativa forrajera para dichos periodos (4). En Colombia, se ha venido investigando la acacia roja en cuanto a su uso como árbol forrajero en la alimentación de ganado. Se ha reportado que el contenido de proteína de sus hojas es del 17.0% y de fibra detergente neutra de 40.3%, con una degradabilidad ruminal de la materia seca a las 72 h de 65.2%, además, tiene gran aceptabilidad por parte del ganado y se adapta muy bien a las condiciones del Piedemonte Llanero (5,6). Se realizaron análisis nutricionales en las hojas de: Pízamo (Erithryna glauca) y acacia roja (Delonix regia), cuyos resultados fueron: Proteína cruda (20.0 y 16.8%), FDN (55.7 y 28.0%), FDA (8.9 y 17.8%) y digestibilidad in vitro de la MS (59.0 y 40.1%), respectivamente. Se resalta que el pízamo tiene un mayor contenido nutricional en sus hojas, aunque la acacia se adapta mejor a condiciones críticas (7). En trabajos con pízamo (Erithryna glauca) en bovinos fistulados se evaluó la degradabilidad ruminal de tres especies de árboles en las que se incluyó el pízamo; se encontró que la degradabilidad de la materia seca a las 72 h fue mayor para el Hibiscus rosa-sinensis (91.3%) en comparación con las Erythrina glauca y E. poeppigiana: 44.3 y 52.0% respectivamente. En pízamo, la degradabilidad a las 72 h de la fibra detergente neutro fue de 27.0% y de nitrógeno total 59.0% (8). El nitrógeno en las primeras

2902

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

seis horas tiene una degradación rápida que llega al 33%, siendo más lenta en las siguientes horas [12, 24, 48 y 72] (8,9). El pízamo es una leguminosa que al ser sembrada en buenos suelos se puede realizar su primer corte a los 6 meses con podas posteriores entre 3 y 4 meses. Esta especie fue ofrecida a cabras y la producción de leche aumentó en 5% a medida que se incrementó la proporción de hojas de pízamo en una dieta básica de Kinggrass y banano de desecho. También se han observado buenos resultados al suministrarlo mezclado con los pastos como imperial (Axonopus scoparius) y elefante (Pennisetum purpureum) (9). En investigaciones con cratilia (Cratylia argentea), se valoró la degradabilidad ruminal de la materia seca para comparar su composición nutricional y además, aprovechamiento, se observó que las composición química de la cratilia (Cratylia argentea) varía de acuerdo a la madurez y parte de la planta, reportando un contenido de proteína cruda de sus hojas entre el 11.0 y 17.0%, con una digestibilidad in vitro de proteína entre el 42.0 y 44.0% (10). Otras investigaciones con cratilia, utilizando vacas Holstein en pastoreo con Brachiaria decumbens se comparó con otro grupo que fue suplementado con ésta leguminosa en pastoreo restringido 2 h/día lo que incrementó la producción de leche y las cantidades de urea en éste producto y la sangre, los niveles de urea fluctuaron entre 14.9 y 18.7 mg/% vs 12.2 y 16.9 mg/% de grupo testigo. Las vacas permanecieron 50% del tiempo consumiendo leguminosa, estimando un periodo de pastoreo efectivo de media hora en la mañana y media en la tarde (11-13). El casco de vaca (Bahunia variegata), es un árbol nativo de la India, se encuentra en todos los climas; puede llegar a una altura de 10 m (14), su nombre se debe porque sus hojas tienen forma del casco de una res. Se ha investigado los componentes químicos de esta especie, encontrando una sustancia similar a la insulina que se utiliza principalmente en la medicina para controlar los niveles de glucosa en la sangre. Actualmente, no solamentese se sigue utilizando para las personas con problemas de diabetes, sino para tratar enfermedades renales. Aunque este árbol es consumido por el ganado, es poco lo que se ha investigado para determinar su potencial forrajero (14,15). El contenido de proteína es aproximadamente del 15.0%, fibra detergente neutro 61.0% con una degradabilidad de la

materia seca a las 72 h de 61.7% (5). En otros estudios, donde se hizo una caracterización bioquímica de las hojas de Bauhinia variegata, se encontró un alto valor proteínico y lipídico 29.41 y 14.89%, respectivamente. También se observaron niveles elevados de: ácido linolénico y minerales, lo cual, la hace apta para ser usada como forraje, otros componentes detectados fueron: albúminas, globulinas, prolaminas, glutelinas ácidas y alcalinas, demostrado una actividad hipoglucimiante en conejos. Además del alto valor energético, de esta especie que le permite ser una fuente de alimentación, también desde el punto de vista farmacológico es una opción para el tratamiento de la diabetes y otras enfermedades cardiácas y renales (16). Es importante tener en cuenta que en la degradabilidad de los forrajes influye su contenido de FDN, en la cual se incluye la lignina, este componente no es degradado por los microorganismos ruminales, es así que el proceso digestivo de los rumiantes, debe tener una adaptación para lograr una utilización eficaz de la pared celular de los forrajes, constituyendo estrategias digestivas considerablemente variables para cada especie, dependiendo de su de forma de cultivo y su fitogenética (12). La fibra además de producir energía para los rumiantes, es indispensable para preservar el equilibrio neurovegetativo, promoviendo el funcionamiento normal del tracto digestivo y regulando el tránsito de la ingesta, al mismo tiempo influye en la fermentación y mantenimiento de la integridad en la mucosa intestinal, previniendo los graves problemas digestivos (12). El objetivo de esta investigación fue evaluar la degradabilidad in situ en bovinos fistulados de cuatro especies forrajeras: Acacia Roja (Delonix regia) pízamo (Eritryna glauca), Cratilia (Cratylia argentea), y casco de vaca (Bahunia variegata), estableciendo el efecto que tienen estas arbóreas en la eficiencia sobre la utilización ruminal de la pastura base con Brachiaria decumbens.

MATERIALES Y METODOS Sitio de estudio. Esta investigación se realizó en Villavicencio, en la finca de UNILLANOS, sede Barcelona y en el Laboratorio de Nutrición Animal, ubicados en el Km 12 vía Puerto López en la Vereda Barcelona, con una altitud de 465 m.s.n.m. temperatura de 27°C y precipitación anual entre 1900 y 3250 milímetros. En esta zona se presentan cuatro meses de época seca (Diciembre a marzo) y ocho de lluvias. Las plantas, tenían un año de establecidas, y se podaron cada tres meses, sus hojas se secaron

Roa - Evaluación de la degradabilidad in situ en bovios bajo techo para el suministro a los animales. Tratamiento de hembras. Se utilizaron cuatro hembras criollas cruzadas, fistuladas en rumen con un peso vivo de 350±24.5 kg, distribuidas en un diseño de sobrecambio simple con arreglo cuadrado latino (4X4). Las hembras fueron mantenidas en pastoreo continuo con braquiaria (Brachiaria decumbens), sal mineralizada y agua a voluntad. Los tratamientos fueron 3 kg de hojas secas suministradas en bateas de las siguientes especies: T1= acacia roja (Delonix regia), T2= pízamo (Erytrina glauca), T3= cratilia (Cratilia argentea) y T4= casco de vaca (Bahuinia variegata), para una mayor palatabilidad a éstas especies se les adicionó 300 g de melaza. Periodos experimentales. Se establecieron cuatro periodos experimentales de 12 días cada uno, distribuidos así: los primeros 8 días fueron de adaptación a los forrajes en las pruebas de consumo previo y así lograr la aceptabilidad total de los tres kg de forraje ofrecido. En los otros cuatro días se colocaron las bolsas a incubar en el rumen para determinar su degradabilidad. En las pruebas in situ en rumen se utilizó la técnica de las bolsas de nylon (17,18). Bolsas. El tamaño de las bolsas fue de 20x10 cm, con un poro promedio de 40 micras. Las bolsas se secaron previamente a 60°C por 24 h para llevarlas a peso constante y en cada una se colocaron 5 g de materia seca de forraje (arbóreas y pasto) por duplicado en diferentes horas (6, 12, 24, 48 y 72), para observar el efecto de la eficiencia ruminal de los árboles sobre la dieta base. Con esta información se establecieron las degradabilidades de la materia seca (DMS), fibra detergente neutra, (DFDN) fibra detergente ácida (DFDA), nitrógeno total (DNT) y nitrógeno adherido a (DNFDN). En el líquido ruminal se realizaron mediciones de pH a las 0, 3, 6, 9, 12 h para establecer si se mantiene el pH normal (entre 5.5 a 6.8), el cual favorece el incremento de las bacterias celulolíticas y nitrógeno amoniacal a las 0, 4, 8 y 12 h. Forrajes secos. A los forrajes secos de: braquiaria, acacia roja, pízamo, cratilia y casco de vaca se les realizó un análisis nutricional preliminar, en el cual se determinó a cada uno materia seca (MS), extracto etéreo (EE), nitrógeno total (NT), cenizas, fibra cruda (FC), fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente ácido (FDA) y extracto no nitrogenado (ENN), cuatro repeticiones por muestra con el fin de conocer la caracterización bromatológica de cada forraje (19-21).

2903

Determinación de la tasa de degradación. Para la determinación de la tasa de degradación de la MS, FDN FDA, NT, NFDN, considerando el tiempo de incubación como variable independiente (X) y las variables potencialmente digestibles (Y), obteniéndose el coeficiente de regresión, aplicando el modelo matemático (22): Y= a+b (1-e–c*t). Donde: Y= degradación potencial. t = tiempo de incubación. a = intercepto con el eje “Y” en el tiempo cero. Representa el sustrato soluble completamente degradable que sale rápidamente de la bolsa de nylon. b = Representa la fracción que se degradó a las 6, 12, 24, 48 y 72 h. c = tasa de degradación. e= logaritmo natural Diseño estadístico. Fue un sobrecambio simple con arreglo cuadrado latino 4x4, variables evaluadas: degradación ruminal (6, 12, 24, 48 y 72 h) de la MS, FDN, FDA y NT, degradabilidad potencial aplicando modelo matemático (22). En el líquido ruminal se midió el pH y el nitrógeno amoniacal a las 0, 4, 8 y 12 h. Se realizó análisis de varianza, aplicando la prueba de Tukey con un nivel de confianza del 95%, para comparación de medias. Se utilizó el programa estadístico SPSS 10 (23). El Modelo estadístico aplicado fue: Yijk = μ + τi + fj + ck + εijk

donde:

Yijk es la lectura del tratamiento i-ésimo donde i= acacia roja, pízamo, cratilia y casco de vaca en la fila j-ésima, donde j= periodo 1,2,3, 4 y en la k-ésima columna, donde k=animal fistulado 1,2,3,4. μ es la media general τi es el efecto del tratamiento “i”, con i = 1,2,3,4. fj es el efecto del periodo ‘j”, con j = 1,2,3,4. Ckes el efecto del animal fistulado“k”, con k = 1,2,3,4. εijk es el error asociado con la lectura del i-ésimo tratamiento en el periodo j-ésimo y en el k-ésimo animal fistulado.

RESULTADOS En la composición nutricional de los forrajes se observó que las especies arbóreas tienen entre 17.0 y 18.0% de proteína, lo cual indica que pueden ser un suplemento en la

2904

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

alimentación de ganado, puesto que el pasto braquiaria tiene el 6.6% de proteína. La FDN fue mayor en el pasto braquiaria (67.8%) y la arbórea que mostró una FDN más alta fue casco de vaca (58.2%). La FDA fue superior en pízamo (38.5%) (Tabla1). Tabla 1. Composición nutricional (%). Promedio de cuatro repeticiones analizadas en cada forraje. Braquiaria

Acacia

Pízamo

Cratilia

Casco de vaca

Materia seca

27.3 ±0.9

35.0 ±1.2

26.8 ±0.9

31.8 ±1.1

41.7 ±1.4

Proteína

6.6 ±0.7

17.9 ±0.6

18.0 ±0.6

18.3 ±0.6

17.3 ±0.6

Grasa

2.1 ±0.3

3.5 ±0.1

4.3 ±0.1

2.7 ±0.1

5.7 ±0.2

Fibra cruda

37.0 ±1.4

19.3 ±0.7

28.0 ±0.9

18.9 ±0.6

19.2 ±0.6

ENN

41.6 ±1.5

48.3 ±1.8

3.9 ±0.6

51.9 ±1.7

47.8 ±1.6

Cenizas

4.6 ±0.4

8.5 ±0.7

37.8 ±1.3

5.7 ±0.2

7.0 ±0.3

FDN

67.8 ±2.6

57.5 ±2.2

51.1 ±1.7

49.2 ±1.7

58.2 ±2.0

FDA

32.5 ±1.2

30.2 ±1.2

38.5 ±1.3

32.7 ±1.1

36.7 ±1.4

Nutrientes

La degradabilidad materia seca (DMS) de la acacia fue superior 8.3% (p<0.05) en la mayoría de las horas en comparación con el pízamo y cratilia, pero a las 72 h la DMS de la acacia (56.1%) y el casco de vaca (53.0%) fueron similares y más altas (p<0.05) en comparación con los otros dos tratamientos (Tabla 2).

Tabla 3. Degradabilidad de la materia seca (%) del pasto braquiaria. Horas

Acacia

Pízamo

Cratilia

Casco de vaca

22.3bc

19.0ab

16.6a

24.2c

29.0ab

24.5ab

21.0a

30.1b

39.8b

33.9a

28.5a

54.5c

49.7ab

44.4a

55.5b

71.7c

58.8a

55.9a

60.8a

77.1b

Letras distintas los tratamientos son diferentes (p<0.05).

esta variable en éstas tres últimas (Figura 1). La DFDN del pasto fue similar en todos los tratamientos, siendo en promedio mayor con cratilia en 2.1%, lo que indica, que esta variable no se altera con el tipo de forraje (Tabla 4). Tabla 4. Degradabilidad de la FDN Y FDA (%) en diferentes horas de braquiaria. Horas

Acacia

Pízamo

Cratilia

Casco de vaca

12.5a

14.0a

14.6a

22.9b

12*

19.7ab

13.7a

24.0b

39.1c

24*

34.2b

21.6a

47.8c

50.1c

48*

51b

36.8a

59.3b

54.5b

72*

62.9a

58.7a

63.0a

61.0a

6**

15.2a

19.2a

24.8b

25.8b

12**

19.7a

24.4b

30.6c

26.3b

24**

25.7a

32.7b

30.3ab

37.0c

48**

32.8a

40.4b

38.4ab

43.7bc

72**

42.5a

44.1a

51.8b

54.3b

Letras distintas los tratamientos son diferentes (p<0.05).

Tabla 2. Degradabilidad de la materia seca (%) en diferentes horas. Horas

Acacia

Pízamo

Cratilia

Casco de vaca

34.2bc

16.7a

35.2c

31.0b

38.9c

20.6a

38.0c

35.3b

45.8b

26.9a

41.2b

36.5b

51.0b

44.6ab

43.6a

44.7ab

56.1b

52.1a

50.4a

53.0ab

Letras distintas los tratamientos son diferentes (p<0.05).

La DMS del braquiaria fue mayor (p<0.05) con casco de vaca a las 24 (54.5%), 48 (71.7%) y 72 (77.1%) horas en comparación con: acacia 18.0%, pízamo 23.0% y cratilia 18.0%, la DMS del pasto a las 72 horas fue similar en las otras tres especies (Tabla 3). La DFDN potencial de pízamo aplicando el modelo matemático, fue 66.3%, valor inferior (p<0.05) en comparación con acacia (70%), cratilia (76%) y casco (73%), siendo similar

Figura1. Degradabilidad potencial de la FDN.

La DFDN potencial en todos los tratamientos fue mayor que la DFDA, siendo ésta última menor (p<0.05) para pízamo en 3.6% con relación a las otras tres especies (Figura 2). La DFDA efectiva del pasto braquiaria fue más alta (p<0.05) con casco de vaca (54.3%) y cratilia (51.8%) en comparación con acacia (42.5%) y pízamo (44.1%), lo que indica que la gradación de la lignina y la celulosa del pasto está influenciada por la composición del árbol (Tabla 4). La DNT potencial fue inferior

Roa - Evaluación de la degradabilidad in situ en bovios

2905

Figura 2. Degradabilidad potencial de la FDA.

Figura 4. Degradabilidad potencial de la NFDN.

Figura 3. Degradabilidad potencial del NT.

degradación (% de forraje/hora) de la MS (0.70) y NT (1.0) fueron menores (p>0.05) en cratilia comparándola con las demás especies, (Tabla 6). La tasa de degradación de la FDN y FDA fueron menores (p>0.05) para pízamo y acacia. La tasa de degradación (% de forraje/hora) de la MS (1.1) y FDA (0.86) del pasto fueron superiores (p>0.05) para casco de vaca, mientras, la tasa de FDN de acacia pízamo y casco de vaca observaron similar comportamiento (Tabla 6).

(p<0.05) para cratilia (74.5%) con relación a los demás tratamientos: acacia (82.0%), pízamo (77.0%) y casco (79.6%) (Figura 3). La DNT del pasto fue superior (p>0.05) en casco de vaca, con relación a: cratilia (31.9%) acacia ( 22.4%) y pízamo (22.1%) (Tabla 5). La DNFDN fue similar (p>0.05) en todas las especies: acacia (58.0%), pízamo (60.5%), cratilia (62.0%) y casco (57.0%) (Figura 4). La DNFDN del pasto braquiaria fue mayor en 4.6% (p<0.05) en pízamo en comparación con casco de vaca; con las otras arbóreas, esta variable fue similar (Tabla 5). La tasa de Tabla 5. Degradabilidad de NT y NDFN diferentes horas de braquiaria. Horas

(%) en

Acacia

Pízamo

Cratilia

Casco de vaca

24.0a

28.5a

24.0a

26.3a

43.8c

39.4bc

30.7a

37.8ab

46.6a

48.9a

49.6a

50.9a

57.3b

61.8bc

50.1a

64.7c

64.5b

64.2b

54.7a

86.6c

9.6a

14.4ab

24.3b

17.9b

17.5a

37.3b

27.4ab

25.6ab

44.9a

55.9b

39.7a

41.1a

56.7ab

61.3bc

64.1c

52.4a

64.4ab

66.5b

64.9ab

61.9a

NT 6

Tabla 6. Tasa efectiva de degradación (% de forraje/ hora). Acacia

Pízamo

Cratilia

Casco de vaca

Materia Seca

Nutriente

0.78b

0.73ab

0.70a

0.74ab

FDN

0.97ab

0.92a

1.1b

1.0b

FDA

0.66a

0.64a

0.72b

0.69a

1.1b

1.0a

1.1b

NFDN

0.80ab

0.84ab

0.88bc

0.77a

Materia seca Pasto

0.82b

0.78a

0.84b

1.1c

FDN pasto

0.87b

0.81ab

0.88b

0.85ab

FDA pasto

0.59a

0.61a

0.72c

0.86d

Nitrógeno total

Letras distintas los tratamientos son diferentes (p<0.05).

Tabla 7. Nitrógeno amoniacal (NH3-N) (mg/100ml de líquido ruminal) y pH en líquido ruminal. Horas

NDFN

Acacia

Pízamo

Cratilia

Casco de vaca

23.4ab

22.5ab

13.7a

26.1b

23.8a

23.0a

16.8a

15.9a

21.8a

20.3a

17.3a

21.6a

18.5a

19.3a

17.2a

17.6a

6.5a

6.6a

5.9a

7.4b

6.9ab

6.8a

7.3b

NH3-N

Letras distintas los tratamientos son diferentes (p<0.05).

7.1b

7.2b

6.8a

7.0ab

6.9ab

7.1ab

6.6a

7.4b

6.8a

7.0ab

6.8a

7.3b

Letras distintas los tratamientos son diferentes (p<0.05).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

El pH a las 12 h fue mayor (p<0.05) para casco de vaca (7.3), mientras el nitrógeno amoniacal a las 12 horas fue similar para todos los tratamientos (entre 17.2 a 19.3 mg/100 ml de líquido ruminal) (Tabla 7).

DISCUSIÓN Ordoñez y Diaz (9) encontraron para el pízamo porcentajes de FDN, FDA, DMS inferiores a los hallados en este trabajo en 1.8%, 23.1% y 12.9% respectivamente, mientras la proteína del pízamo fue en unidades porcentuales 2% inferior en comparación a la analizada por Narváez (4) (20.0% vs 18.0%), lo cual indica que los suelos y la forma de cultivar influyen en el contenido nutricional de los forrajes, puesto que suelos del Valle del Cauca son diferentes a los del Piedemonte llanero, donde las condiciones hacen que las plantas desarrollen más fibra. A pesar de esta situación se observa una mejor DMS con relación a la encontrada por este autor (4). También es de resaltar que en la acacia fue mayor el porcentaje de proteína (17.9% vs 16.8%) comparándolas con el trabajo de Narváez y Lazcano (7). Evaluaciones con pízamo mostraron que fueron inferiores en unidades porcentuales: MS (11.7%), FDN (13.8%) y NT (2%) a las encontradas en esta investigación (9). Se deduce que el tipo de metodología y la forma de tratamiento del cultivo de esta especie influye en los resultados de estas variables. La DNT potencial de cratilia se observó en este trabajo que fue superior en 30% a la evaluada en forma in vitro (10), resultados que confirman lo expresado anteriormente, que los parámetros nutricionales pueden variar por el medio ambiente donde se establece la especies forrajera (10). Los análisis indicaron que la composición de las arbóreas está relacionada

con la cinética de degradación del pasto, puesto que la tasa de degradación de la MS fue mayor con el casco de vaca y menor que con pízamo lo que concuerda con Ibrahim et al (12), con relación a que las mezclas de forrajes pueden ocasionar efectos asociativos que modifican la degradación de los nutrientes de otros forrajes. En este caso el pasto braquiaria incrementó su DMS (p<0.05) cuando se suministró con casco de vaca (Tabla 3). En la cratilia se observó una mayor FDN, FDA, y NFDN potencial, con relación a las otras especies (Figuras 1, 2 y 4) lo que implica que las bacterias del rumen fueron eficientes para degradar su pared celular y hacer disponible el nitrógeno adherido, lo cual beneficia el crecimiento de microorganismos. La DNT potencial fue mayor con referencia a las otras arbóreas (Figura 3), lo que implica que los aminoácidos de esta leguminosa se convierten en alta proporción en nitrógeno para la población ruminal, disminuyendo la fracción de proteína sobrepasante. En conclusión, la proteína de las especies estudiadas fue similar, (18.0%), lo cual es ventajoso utilizarlas como suplemento para ganado en pastoreo con braquiaria (6.6%). La DMS de acacia roja fue superior en comparación con las otras forrajeras, pero la DMS de pasto braquiaria es mejor cuando se suministra casco de vaca. El comportamiento de la DFDN y DFDA potencial en la cinética del rumen es similar, siguiendo el orden de mayor a menor: cratilia, casco de vaca, acacia y pízamo. Se recomienda realizar pruebas de consumo utilizando bovinos suplementados con estas arbóreas, que de acuerdo con los resultados obtenidos pueden mejorar su capacidad productiva.

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Rev.MVZ 2908 Córdoba 17(1):2908-2915, REVISTA MVZ CÓRDOBA 2012. • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

ORIGINAL

Efecto del colesterol y la dimetilformamida sobre parámetros posdescongelación en espermatozoides de caballos criollos colombianos Effect of cholesterol and dimethiyl-formamide on post-thawing parameters in Colombian creole stallion sperm Ana M Mesa,1* M.Sc., Guillermo Henao R,2 M.Sc. 1Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, Facultad de Ciencias, Maestría CienciasBiotecnología, Grupo Biogem. 2Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, Facultad de ciencias

agropecuarias, Departamento de Producción Animal, Grupo Biotecnología de la Reproducción. *Correspondencia: mesa.anamaria@gmail.com Recibido: Noviembre de 2010; Aceptado: Octubre de 2011.

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto del colesterol y la dimetilformamida (DMF) sobre la criosupervivencia del semen de caballos criollos colombianos. Materiales y métodos. Se recolectó semen de diez caballos y se congeló bajo el mismo protocolo, con variaciones del crioprotector (glicerol 5% o DMF 5%) y la adición o ausencia de colesterol como modificador de membrana (1.5 mg ciclodextrinas con colesterol por cada 120 x 106 células). La criosupervivencia se evaluó estimando movilidad mediante el software SCA. La vitalidad e integridad de membrana posdescongelación se estimó usando eosina-nigrosina y test hipo-osmótico respectivamente. Resultados. Incubar el semen con el colesterol, tuvo un aumento significativo del porcentaje de movilidad total y progresiva, en la velocidad de los espermatozoides y el porcentaje de espermatozoides rápidos y una disminución del porcentaje de espermatozoides con movilidad lenta. Adicionalmente se incrementó el porcentaje de espermatozoides vivos y con integridad de membrana (p<0.05). La DMF como agente crioprotector, mejoró todos los parametros evaluados al ser comparada el glicerol (p<0.05). Conclusiones. Ambos procedimientos mejoraron los parámetros evaluados debido a efectos aditivos del crioprotector y del modificador de membrana, pero no hubo interacción entre estos dos factores. Palabras clave: Colesterol, criopreservación, dimetilformamida (Fuente:CAB).

ABSTRACT Objective. To evaluate the effect of cholesterol and dimethyl formamide on the cryosurvival of colombian creole stallion sperm. Materials and methods. Semen from ten stallions was collected and frozen using the same protocol, with variations in the cryoprotectant (glycerol 5% or 5% DMF) and the addition or absence of cholesterol as membrane modifier (1.5 mg cholesterol loaded cyclodextrins for each 120 x 106 cells). The cryosurvival was evaluated by estimating motility using the SCA software. The vitality and membrane integrity was estimated using eosin nigrosine staining and by hypo-osmotic test respectively. Results. Sperm incubated with cholesterol had a significant effect

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in improving the percentage of total motility, progressive motility, sperm velocity and percentage of rapid sperm along with a decreased percentage of sperm with slow motility. Additionally, there was an improvement in the percentage of live spermatozoa and spermatozoa with membrane integrity (p<0.05). Dimethyl formamide (DMF) as a cryoprotectant, improved all the evaluated parameters in comparison with glycerol (p<0.05). Conclusions. Both procedures improved the evaluated parameters due to the additive effects of the cryoprotectant and the membrane modifier, but there was no interaction between these two factors. Key words: Cholesterol, cryopreservation, dimethylfomamide (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN El uso de semen criopreservado en equinos ha adquirido gran importancia en las últimas décadas, debido a los beneficios que ofrece su utilización. Entre éstos se destacan la posibilidad de almacenar el material genético de reproductores sobresalientes, distribuirlo internacionalmente, controlar enfermedades venéreas y aumentar la eficiencia del sistema de cría al posibilitar la inseminación de múltiples yeguas con un solo eyaculado (1). Sin embargo, la tasa de preñez disminuye cuando se insemina con semen congelado en comparación con la utilización de semen fresco o refrigerado (2,3). Esto sucede porque el proceso de congelación y descongelación es potencialmente dañino, e incluso letal, para los espermatozoides (4-7). Los daños en la estructura de la membrana plasmática y el estrés osmótico al que son sometidos los espermatozoides durante la congelación, son dos de las principales causas que disminuyen la calidad del semen después de la congelación (2, 8-10). Por esto es importante modificar las técnicas existentes enfocando los cambios hacia las etapas más críticas para mejorar los parámetros espermáticos posdescongelación con el fin de aumentar la tasa de fertilidad al utilizar semen congelado. En el proceso de congelación ocurren daños significativos en la membrana plasmática de los espermatozoides, durante el descenso de temperatura, ésta comienza un estado de transición desde estado líquido a temperatura ambiente a un estado en gel, en el cual la membrana se vuelve más rígida y porosa (2), al haber una reorganización de los lípidos y proteínas, induciendo disrupciones y haciéndola más susceptible a moléculas extracelulares y daños producidos por cristales de hielo (10,11). La relación colesterol:fosfolípidos de membrana, es una característica asociada a la sensibilidad de las células durante el descenso de la temperatura; altas cantidades de colesterol en la membrana reducen la temperatura a la que ocurre la transición de fase, manteniendo así un estado más fluido a bajas temperaturas y

reduciendo potencialmente los daños (6,12). El colesterol ha sido adicionado a las membranas espermáticas de varias especies, mediante el uso de ciclodextrinas (13-17). Las ciclodextrinas son oligosacaridos cíclicos con un centro hidrofóbico capaz de transportar colesterol por gradiente de concentración desde y hacia las membranas plasmáticas (13). Cuando las ciclodextrinas cargadas con colesterol (CLC) fueron adicionadas al semen bovino antes de criopreservarlo, fueron recuperados mayores porcentajes de espermatozoides móviles y con membranas intactas después de descongelar, comparados con el tratamiento control (14,15). Este procedimiento también ha sido probado en semen de caballos, encontrando qué los espermatozoides tratados con colesterol mediante esta técnica aumentaron significativamente el porcentaje de movilidad, y de membranas intactas después de la criopreservación (13). El uso de crioprotectores alternativos se ha planteado como una medida para disminuir el estrés osmótico durante el proceso de congelación de semen equino, ya que se ha reportado que el glicerol parece tener efectos tóxicos en espermatozoides de esta especie (18,19). Estos efectos pueden ser disminuidos con el uso de otros compuestos con menor peso molecular como algunas amidas (18,20). La dimetilformamida (DMF) ha mostrado tener resultados crioprotectores similares (5,18) o superiores (21-23) al glicerol, adicionalmente, ha mostrado ser un crioprotector benéfico para espermatozoides de caballos con baja tasa de supervivencia posdescongelación, como los caballos de raza Mangalarga marchador (21). Es importante tener en cuenta que el componente genético parece influenciar las características seminales y la supervivencia posdescongelación (24). Esta investigación se llevó a cabo en caballos criollos colombianos, aprovechando su alto potencial como caballos de silla y la ausencia de datos publicados en este aspecto en este tipo de caballos.

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El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto del colesterol y la DMF sobre la criosupervivencia de espermatozoides de caballos criollos colombianos.

MATERIALES Y MÉTODOS Recolección del semen. Se emplearon diez caballos criollos colombiano de los cuales a cada uno se le recolectó un eyaculado. Los criterios de inclusión dentro de la población para muestreo fueron: buena condición corporal, rango de edad entre 4 y 16 años y buen estado de salud. Las muestras de semen fueron colectadas usando la metodología de colección con vagina artificial (modelo Hannover, Minitub; Landshut, Alemania) con la ayuda de una yegua en estro. La fracción de gel fue removida con un filtro que se incorporó a la vagina artificial. Todos los reactivos químicos fueron procedentes de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), excepto la metil-β-ciclodextrina de TCI América y, el colesterol de Alfa Aesar. Preparación de ciclodextrina cargada con colecterol (CLC). La solución de ciclodextrina cargada con colesterol fue preparada como lo describen Purdy y Graham (14). En un tubo de ensayo se disolvieron 200 mg de colesterol en 1 ml de cloroformo. En otro tubo de ensayo se diluyó 1 g de metil-β-ciclodextrina en 2 ml de metanol. Se adicionaron una alícuota de 450 µl de la solución de colesterol a la solución de ciclodextrina y se mezcló hasta que la solución estuviera homogénea. En una caja de Petri, se removió el solvente usando una corriente de nitrógeno gaseoso. Los cristales resultantes se dejaron secar 24h y luego se pasaron a un recipiente de vidrio y permanecieron almacenados a 22°C hasta su uso. La solución de trabajo CLC se preparó agregando 50mg de CLC a 1ml de TALP (medio Tyrodes-AlbuminaLactato-Piruvato modificado) mezclándolo vigorosamente en un vortex, e incubándolo en un baño serológico a 37°C hasta el momento de ser utilizado. Tratamientos, procesamiento, congelación y descongelación del semen. Se evaluó la concentración a cada eyaculado libre de gel (spermacue, Minitub; Landshut, Alemania) para diluirlo en TALP a una concentración final de 120x106 espermatozoides/ml. Posteriormente el eyaculado se dividió en cuatro alícuotas numeradas al azar según el tratamiento a realizar. El tratamiento 1 no tuvo adición de CLC y su diluyente contenía glicerol, el tratamiento 2 tuvo adición de CLC y su diluyente contenía

glicerol. El tratamiento 3 no tuvo adición de CLC y su diluyente contenía DMF, el tratamiento 4 tuvo adición de CLC y su diluyente contenía DMF. Los tratamientos con colesterol, se les adicionó solución de trabajo de CLC (1.5 mg de CLC/120x106 células) y fueron incubados a temperatura ambiente (~22°C) por 15 minutos. Todos los tratamientos se diluyeron a una concentración 1:1 (v:v) usando diluyente Kenney modificado (45% sucrosa, 29% glucosa y 26% leche descremada), las muestras fueron centrifugadas a 400 gravedades por 12 minutos. El sobrenadante fue removido y se estimó la concentración del precipitado, las células fueron resuspendidas en diluyente de congelación (60% solución lactosa al 11%, 24% yema de huevo, 9% glucosa, 0.8% citrato de sodio, 0.8% EDTA, 0.2% bicarbonato de sodio) y 6% del crioprotector (tratamientos 1 y 2 glicerol y tratamientos 3 y 4 DMF) a una concentración final de 200x106 espermatozoides/ml. El semen se empacó en pajillas de 0.5 ml. Posteriormente estas fueron puestas en forma horizontal sobre una gradilla de congelación de semen en una caja de porex, durante 15 minutos a 6 cm por encima del nivel de nitrógeno líquido, como lo describen Medeiros et al (20). Después de este tiempo, las pajillas se introdujeron en nitrógeno líquido donde permanecieron almacenadas por tres meses antes de ser descongeladas. La descongelación se hizo en agua a 37°C durante 30 segundos (18). Evaluación del semen. La concentración espermática fue estimada por espectrofotometría (spermacue, Minitub; Landshut, Alemania) en una alícuota de semen fresco, el resultado de esta medición se utilizó para determinar la cantidad de diluyente y tratamiento. Los parámetros de movilidad de espermatozoides descongelados se reportaron después de evaluar la muestra usando el software analizador de imagen SCA (Sperm Class Analyzer. Microptic SL, SCA VET 01), con la ayuda de un microscopio de contraste de fase (Nikon Eclipse 50i, Japón). Para su evaluación se diluyó el contenido de una pajilla en diluyente Kenney modificado a una relación 1:4 (v:v) y se estabilizó por 10 minutos a temperatura ambiente (13). Luego se depositaron 10 μl del semen diluido en una cámara Makler (Sefi Medical Instruments Ltd, Israel) y se enfocó en el microscopio de contraste de fase a un aumento de 10X donde fue analizado por el SCA. Al menos 500 espermatozoides fueron evaluados para cada muestra con la programación estándar (30 marcos adquiridos).

Mesa - Efecto del colecterol y la dimetilformamida Las variables de movilidad que se analizaron fueron: Porcentaje de movilidad, progresividad, velocidad curvilínea (VCL), velocidad lineal (VSL). El equipo consideró como espermatozoides con movilidad progresiva, aquellos que tenían una velocidad mayor a 90 μm/s. La integridad de membrana fue determinada con un test hipoosmótico en agua destilada, así: se incubó una alícuota de 100 μl de semen en 200 μl de agua destilada para una osmolaridad aproximada de 100 mOsm/L, a 37°C durante 5 minutos (25). Se observaron 200 células por muestra bajo un microscopio de contraste de fase con un objetivo de 40X. El porcentaje de espermatozoides vivos se determinó observando extendidos seminales teñidos con colorante eosina-nigrosina modificado (citrato de sodio al 3%), se contaron alrededor de 200 espermatozoides por muestra. Se consideraron como muertos los espermatozoides con coloración rosada y como vivos los transparentes. Análisis estadístico. Se utilizó un diseño de bloques completos al azar con 10 repeticiones bloqueando por caballos, con la intención de controlar la posible variabilidad entre ejemplares (6, 24), de manera que las medidas de los tratamientos fueran comparables. Los tratamientos se organizaron con base en una estructura factorial 2x2, siendo los factores el crioprotector (niveles: glicerol o DMF) y el modificador de membrana (niveles: presencia o ausencia de colesterol). Uno de los propósitos de este diseño fue identificar sí existía interacción entre ambos factores. Se realizaron análisis de varianza para determinar la diferencia entre cada nivel de los factores en cada una de las variables respuesta de porcentajes de movilidad, porcentajes de integridad de membrana y porcentajes de vitalidad. Al ser las variables respuesta proporciones binomiales, se requirió emplear una transformación angular en algunas de las variables para que éstas satisficieran los supuestos de normalidad. Para los análisis se utilizó el procedimiento GLM del programa estadístico SAS (versión 9.1 para Windows, 2003).

RESULTADOS El análisis de varianza no mostró interacción entre los factores. Para las seis variables evaluadas, con 9 grados de libertad, el valor p mínimo fue de 0.35 y el máximo 0.64. Por lo tanto los resultados se presentaran de manera

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independiente, es decir, se evaluaron los efectos simples de cada factor. El semen tratado con colesterol como modificador de la membrana plasmática aumentó significativamente el porcentaje de espermatozoides con movilidad total y progresiva post-descongelación al ser comparado con semen no tratados. Al utilizar DMF como agente crioprotector aumentó significativamente el porcentaje de espermatozoides con movilidad total y progresiva post-descongelación al ser comparado con semen congelado con glicerol (Figura 1).

Figura1. Efecto del uso de colesterol (i) y glicerol o DMF (ii) sobre la movilidad espermática posdescongelación. Las barras de error ilustran la desviación estándar. Los asteriscos indica diferencia significativa (Note que la comparación estadística es entre barras con la misma letra) (p<0.05).

Al calcular la trayectoria de cada una de las células para determinar la velocidad curvilínea y la velocidad lineal, se encontró que todos los tipos de velocidades posdescongelación fueron mayores al utilizar colesterol previo a la congelación y DMF como agente crioprotector (Figura 2). Al adicionar colesterol y usando DMF como agente crioprotector, hubo un aumento significativo en el porcentaje de espermatozoides vivos y con membrana integra (Figura 3).

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Figura2. Efecto del uso de colesterol (i) y glicerol o DMF (ii) sobre la velocidad curvilínea (VCL) y la velocidad lineal (VSL) posdescongelación. Las barras de error ilustran la desviación estándar. Los asteriscos indica diferencia significativa (Note que la comparación estadística es entre barras con la misma letra) (p<0.05).

Figura3. Efecto del uso de colesterol (i) y glicerol o DMF (ii) sobre el porcentaje de vitalidad e integridad de membrana posdescongelación, barras de error ilustran la desviación estándar. Los asteriscos indica diferencia significativa (Note que la comparación estadística es entre barras con la misma letra) (p<0.05).

DISCUSIÓN

de otras investigaciónes similares en otras razas equinas (13,25,27).

La relación colesterol:fosfolípidos en la membrana plasmática, juega un papel fundamental en la resistencia de las células al shock térmico (2,12). Las ciclodextrinas parecen proporcionar el vehículo necesario para modificar esta relación (13-16,25). Cuando se incubó el semen de caballos criollos colombianos con CLC antes de la congelación, se encontró un aumento significativo en el porcentaje de: movilidad total, progresiva, espermatozoides vivos, con integridad de membrana y aumentaron las velocidades promedio posdescongelación. Estos hallazgos coinciden con el concepto de que especies que tienen alta relación molar de colesterol:fosfolípidos son más resistentes al shock térmico (26). Ha sido demostrado que al aumentar la concentración de colesterol en la membrana se disminuye la temperatura de transición y de esta manera la membrana permanece más fluida (6) siendo menos susceptible a daños mecánicos, lo cual se refleja notablemente en su integridad, en la que los presentes resultados coinciden con los

Para los parámetros de movilidad espermática posdescongelación el efecto del colesterol es controversial. Los presentes resultados indican un aumento en la movilidad, coincidiendo con varias investigaciones semejantes en caballos (13,28) y en toros (14,16), sin embargo otros trabajos en caballos no encontraron tal diferencia (25,27); esto podría ser debido a que la reducción de la movilidad posdescongelación no necesariamente se debe atribuir a daños en la membrana (2). Zahn et al (27) encontraron una disminución en la fertilidad posdescongelación de espermatozoides tratados con CLC, pues al alterarse la composición de la membrana, además de afectarse la respuesta de los espermatozoides al proceso de congelación, también se afecta su capacitación y posterior reacción acrósomica, al ser el flujo del colesterol una de las primeras etapas de la capacitación espermática (29). Spizziri et al (30), no encontraron diferencias en fertilidad al

Mesa - Efecto del colecterol y la dimetilformamida inseminar yeguas con semen tratado y no tratado con CLC. Se deben llevar a cabo posteriores pruebas de fertilidad para determinar el momento óptimo de inseminación con semen tratado con colesterol precongelación, porque al aumentar la cantidad de colesterol en la membrana, el tiempo de capacitación aumenta y por ende el tiempo de inseminación debe adelantarse. Una alternativa planteada recientemente es la adición de ciclodextrinas posdescongelación para que por gradiente de concentración vuelvan a extraer el colesterol de las membranas (25). Sin embargo, en ese caso no se obtuvieron los resultados esperados. El glicerol es el agente crioprotector más frecuentemente utilizado para la congelación de semen en varias especies incluyendo caballos (10). A pesar de esto en el presente experimento todos los parámetros seminales evaluados mejoraron al utilizar la DMF como crioprotector alterno al glicerol. La capacidad superior como agente crioprotector de la DMF es consistente con trabajos previos (18,20,21,23,31). Para que un crioprotector sea efectivo debe tener bajo peso molecular, ser soluble en agua y causar baja toxicidad (32). El glicerol tiene mayor peso molecular que la DMF (92 vs 73), esto le permite a la DMF penetrar la membrana más rápido produciendo así un cambio en el volumen celular menos drástico o de menor magnitud que el que puede producir el glicerol, lo cual se pudo haber visto reflejado en el mayor porcentaje de movilidad, espermatozoides vivos e íntegros encontrados cuando se utilizó DMF. Además del estrés osmótico que ejerce el glicerol en los espermatozoides, se ha sugerido que también causa toxicidad por medio de efectos directos sobre la membrana y el metabolismo celular (10). Se ha descrito que el glicerol altera la bicapa lipídica modificando la tasa de permeabilidad de agua y los movimientos de iones transmembranales, igualmente el glicerol interacciona con proteínas y lipoproteínas de membrana y aumenta la demanda energética celular (10). En la revisión realizada no se ha reportado toxicidad de la dimetilformamida como agente crioprotector de espermatozoides. Los presentes hallazgos, en cuanto a la acción superior de la DMF coinciden con los de Gómes et al (21) y Gibb et al (33) quienes compararon la acción de amidas y glicerol como agentes crioprotectores en la congelación de semen en caballos, encontrando que los espermatozoides

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congelados con DMF tuvieron una movilidad total superior a los congelados con glicerol y al de otros tratamientos, sin embargo Gibb et al (33), solo encontraron diferencia en movilidad y no en integridad de membrana. Los experimentos que evalúan el efecto del glicerol contra DMF y aplicados conjuntamente tuvieron resultados controversiales. Vidament et al (23) encontraron que la movilidad no mejoraba al utilizar la combinación de estos crioprotectores y que el uso de la DMF presentaba resultados comparables con los del glicerol, mientras que Medeiros et al (20) reportan que la asociación de glicerol con DMF presentó resultados de movilidad mejores que los del glicerol solo, pero esta asociación no tuvo diferencia con el tratamiento que utilizó únicamente DMF. El uso de DMF como agente crioprotector es una alternativa para mejorar la movilidad espermática, la integridad de membrana y la vitalidad, especialmente si se tiene en cuenta que se ha reportado que el glicerol tiene un efecto contraconceptivo en yeguas (21). Son necesarias pruebas posteriores de fertilidad para verificar si el efecto benéfico sobre las características espermáticas posdescongelación se manifiestan en una mayor tasa de concepción. El análisis estadístico indicó que no hubo interacción entre la adición de colesterol y los dos crioprotectores evaluados. Se ha reportado que el colesterol además de prevenir los daños mecánicos disminuye el estrés osmótico (9,25) debido a que al aumentar la fluidez de las membranas a bajas temperaturas, aumenta también la permeabilidad de los crioprotectores a través de ella (9,34); al parecer en este caso la diferencia en el peso molecular de los crioprotectores no fue lo suficientemente grande para influenciar los parámetros posdescongelación. El tratamiento de espermatozoides al que le se le adicionó colesterol y DMF como agente crioprotector tuvo el mejor rendimiento de los parámetros evaluados, debido únicamente a los efectos aditivos de ambos. Agradecimientos A la empresa Embryotransfer LTDA y al laboratorio del procesamiento de semen, San Pablo de la Universidad Nacional por el financiamiento de este trabajo. Al Centro de Investigación Piscícola de la Universidad de Córdoba CINPIC por permitirnos la evaluación de las muestras en su laboratorio.

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Rev.MVZ 2916 Córdoba 17(1):2916-2923, REVISTA MVZ CÓRDOBA 2012. • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012 ORIGINAL

Prevalencia de anticuerpos para Trypanosoma cruzi en caninos de dos municipios endémicos de Boyacá Prevalence of antibodies for Trypanosoma cruzi in canines from two endemic municipalities of Boyacá

Diego Manrique-Abril,1 MVZ, Fred Manrique-Abril,1,2* Ph.D, Myriam Lorca H,3 Ph.D, Juan Ospina D,1 M.Sc. 1Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia Tunja. Grupo de Investigación en Salud Pública. Tunja, Boyacá, Colombia. 2Universidad Nacional de Colombia. Bogotá D.C. Colombia. 3Consultora

OMS, Director científico CAMPVS, Universidad de Chile. Santiago. Chile. *Correspondencia: fgma75@ hotmail.com Recibido: Agosto de 2010; Aceptado: Junio de 2011.

RESÚMEN Objetivo. evaluar la prevalencia de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi (T. cruzi) en una muestra de caninos domésticos residentes en dos municipios endémicos. Materiales y métodos. Se tomaron muestras séricas de 20 caninos procedentes de hogares donde residen mujeres gestantes seropositivas y 40 perros habitantes de hogares de mujeres gestantes seronegativas en Miraflores y Moniquira, Boyacá. El análisis se realizó mediante prueba diagnóstica rápida dipstick de InBios. Resultados. Se encontró prevalencia del 16.7% en Moniquirá y del 13.3% Miraflores respectivamente con una prevalencia general del 15% en los dos municipios. Se halló riesgo 3 veces mayor de que ocurra la infección en caninos, en los hogares donde residen gestantes seropositivas; además la infestación por pulgas y garrapatas en el animal, hábitat cercano a la vivienda, se relacionan con mayor seropositividad en el canino. Conclusiones. La raza, el sexo, la presencia de aves en la casa y al examen clínico general son considerados factores pronósticos en en la infección por Trypanosoma cruzi en caninos. Como factores protectores se identificó la desparasitación y vacunación de los animales. Palabras clave: Colombia, enfermedad de chagas, infección, perros (Fuente: CAB).

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Manrique - Prevalencia de anticuerpos para Trypanosoma cruzi

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ABSTRACT Objective. To assess the prevalence of antibodies to Trypanosoma cruzi (T. cruzi) in a sample of domestic dogs living in two endemic municipalities. Materials and methods. Serum samples were taken from 20 dogs from households with seropositive pregnant women, and 40 dogs from households with seronegative pregnant women in Miraflores and Moniquirá, Boyacá. The analysis was carried out through INBios RDT dipstick. Results. A prevalence of 16.7% and 13.3% in Moniquirá and Miraflores respectively was found, with an overall prevalence of 15% in the two municipalities. There is a risk of acquiring infection in dogs three times greater in households with sero positive pregnant women. Flea and tick infestation in the animal, and habitat near the house, were associated with higher prevalence in the canine. Conclusions. Breed, gender, presence of birds in the house and clinical examination are considered prognostic factors for the infection by Trypanosoma cruzi in canines. As protection factors de-worming and vaccination of animals were identified. Key words: Colombia, chagas disease, dogs, infection (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN La enfermedad de Chagas es una zoonosis causada por Trypanosoma cruzi, parásito protozoario flagelado que se localiza exclusivamente en el continente americano. (1) La Organización Panamericana de la Salud (OPS) ha estimado que de los 360 millones de personas que viven en países endémicos, 90 millones corren el peligro de contraerla y de 16 a 18 millones ya están infectados, y en un futuro podrían sufrir daños cardiacos, gastrointestinales y neurológicos; es así que la enfermedad de Chagas es considerada como la cuarta causa de mortalidad en América Latina, provocando unas 43 000 muertes cada año (2). Los perros están presentes en la familia Boyacense como compañía y guarda en los hogares, especialmente en las zonas rurales, pues se encuentran en el interior de las viviendas en altas proporciones, de hasta 76% de hogares (3), aunque las condiciones de higiene y cuidado de la mascota son sustancialmente diferentes, dado el estilo de vida y cultura de los habitantes de zonas urbanas. La convivencia con caninos representa significativos riesgos en la medida que las condiciones ambientales, particularmente en zonas endémicas favorecen múltiples infestaciones tanto por insectos vectores como por parásitos, lo que disminuye en el caso de la enfermedad de Chagas, la eficacia de las acciones de rociado con insecticidas al interior de las casas como medida preventiva de control de los vectores. Los riesgos derivados de la convivencia con perros han sido ampliamente documentados, y ya se les ha identificado y reconoce como reservorios de enfermedades que pueden ser

trasmitidas al hombre como la enfermedad de Chagas (4), leptospirosis, leishmaniosis, rabia, tuberculosis y otras. Los Perros domésticos desempeñan un papel importante en la epidemiología de la enfermedad de Chagas siendo portadores asintomáticos y de alta parasitemia en esta infección (5). En Boyacá a pesar de tener zonas endémica de la enfermedad solo se encuentra un estudio adelantado en Soatá y Berbeo, donde se demostró que 10.72% de perros domésticos estaban infectados por T. cruzi identificados mediante inunofluoresencia indirecta en una muestra de 261 perros (6). De la misma manera, en el área de Miraflores y Moniquira Boyaca un estudio de determinación de enfermedad de Chagas transmitida por vía transplacentaria reportó una prevalencia de infección en mujeres gestantes, de 33.28% (22 muestras positivas de 661), una prevalencia muy alta en América Latina. También se reportó por primera vez una caso de Chagas congénito; el T. cruzi involucrado fue de Linaje tipo I y II (7-11). En el marco de los programas institucionales de control vectorial que se adelantan en Colombia, también se ha identificado como un importante factor de riesgo la tenencia de mascotas, estudios realizados en diferentes regiones de Colombia han demostrado seroprevalencias en perros superiores al 27%, siendo estos animales con frecuencia, víctimas de la infección y lo más importante portadores de altas parasitemias , lo que mantiene una fuente de mantención y amplificación de la infección para los vectores cercanos al animal (6,7,12). En humanos, se considera que la transmisión congénita es frecuente en lugares con alta prevalencia de la enfermedad. Sin embargo,

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aún no se han adelantado estudios que permitan establecer si este mecanismo de transmisión también puede ocurrir en perros y si constituye un mecanismo amplificador de la infección y de mayor riesgo de infección para los vectores. En América latina, existe evidencia que demuestra elevadas prevalencias de enfermedad de Chagas en humanos, asociada con tenencia de reservorios animales caninos en sus casas (4,6,13). El objetivo del presente estudio fue determinar, en una muestra aleatoria, la frecuencia de ocurrencia de infección por T. cruzi en perros, evaluar factores de riesgo ambientales y de la vivienda y explorar posibles asociaciones correlacionadas con la prevalencia de la infección en humanos, y condiciones del habitat que podrían favorecer la enfermedad de chagas.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. Estudio de prevalencia analítica, En primer lugar se analiza como un estudio epidemiológico descriptivo y en un segundo momento se explora la fuerza de asociación entre diferentes variables de riesgo con factores que podrían interpretarse causalmente como asociados a la probabilidad del contagio, en un análisis bivariado y estratificado. Tamaño de muestra. El tamaño de la muestra fue calculado con base en la proporción de infestación reportada en otros estudios similares utilizando un nivel de significancia del 95% y una precisión del 2.5%. Así el tamaño de la muestra requerido fue de 60 individuos, los cuales se consideraron individualmente como unidades de observación y análisis del estudio. Selección de participantes y área geográfica. El estudio se realizo luego de conocer un estudio que determinó la prevalencia de enfermedad de Chagas en mujeres gestantes, financiado por Colciencias; a partir de la base de datos inicial, se seleccionaron veinte 20 caninos que residían como mascotas en hogares donde al menos una mujer gestante había sido encontrada positiva en el suero para T. Cruzi. Adicionalmente, fue evaluado un grupo control conformado por 40 perros residentes en hogares de mujeres gestantes que fueron reportadas como seronegativas a la enfermedad de Chagas, en los municipios de Miraflores y Moniquirá Boyacá. Técnicas usadas. Para la determinación de

la infestación mediante tamizaje se utilizó una prueba rápida para detectar anticuerpos contra T. cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas: RDT (Trypanosoma Detect, INBIOS InternationalTM, Seattle, USA)(14). La prueba está basada en un antígeno recombinante multiepitope mezclado con una solución de oro. El antígeno recombinante incluye las moléculas ITC-6 e ITC-8.2 derivados de diferentes antigenos de T. cruzi, inclusive los péptidos 2, TcD, TcF, TcLo, y SAPA. El procedimiento se efectuó de acuerdo a las instrucciones de la empresa fabricante. Entre 10 y 20 µl. de suero canino fueron dispuestos sobre la tira del “dipstick” y posteriormente se agregaron 3 gotas de la solución buffer reveladora, provista en el Kit. Después de 10 minutos se observó la línea de control rojo. Si el resultado fue positivo apareció una segunda línea por debajo del control en el campo donde se ubicó el antígeno. El reactivo INBIOS ha demostrado tener una sensibilidad de 99.3% con 0.01% de falsos positivos sobre el total de casos estudiados y una especificidad de 99.3% con un total de 0.7 de falsos negativos sobre el total de muestras, en un estudio doble ciego, en el que primero se estudiaron muestras de suero analizadas previamente con ELISA e Inmunofluorescencia indirecta (IFI), y a continuación con el RDT (14). También se aplicó, previo consentimiento informado, a las personas residentes en estos hogares, una encuesta que exploraba aspectos demográficos, sanitarios y etológicos de los animales para evaluar posibles relaciones con la infección. Análisis de datos. El análisis estadístico se realizó mediante SPSS® 11.5 El análisis exploratorio evaluó frecuencias, test de ANOVA para comparación de grupos y para evaluar la asociación de variables se realizaron pruebas de c2 y Test exacto de Fisher, se establecieron prevalencias y como medida del efecto, razones de prevalencia con sus correspondientes intervalos de confianza al 95%.

RESULTADOS Se encontró una prevalencia del 16.7% en Moniquirá y del 13.3% Miraflores respectivamente, con una prevalencia global de 15% en los dos municipios (Tabla 1). La distribución de seropositividad es mayor en animales criollos y de hábitat intradomiciliar, se observó mayor frecuencia de seropositividad para

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Tabla 1. Prevalencia de anticuerpos para Chagas en caninos procedentes del domicilio de maternas con y sin infección por T. cruzi de Miraflores y Moniquirá, 2009. Análisis estratificado. Caninos Positivos

Variables Municipio

Raza

Sexo

Hábitat

Material primordial del guacal

Caninos Negativos

TOTAL

Miraflores

13.3%

86.7%

Moniquirá

16.7%

83.3%

Cocker

.0%

100.0%

Criollo

23.7%

76.3%

Fila

.0%

100.0%

Fresh

.0%

100.0%

Labrador

.0%

100.0%

Mastín

.0%

100.0%

Mastín X Criollo

.0%

100.0%

Pastor

.0%

100.0%

Pincher

.0%

100.0%

Pitbull X Criollo

.0%

100.0%

Rotweiller

.0%

100.0%

Rotw x Pastor

.0%

100.0%

Hembra

16.7%

83.3%

Macho

14.3%

85.7%

Intradomiciliar (incluye dormitorios)

27.3%

72.7%

Domiciliar

11.8%

88.2%

Peridomiciliar

12.5%

87.5%

Cemento

4.0%

96.0%

Adobe

33.3%

66.7%

Madera

18.2%

81.8%

Metal Total

.0%

100.0%

15.0%

85.0%

Tabla 2. Factores de riesgo-protectores probablemente asociados a la prevalencia de enfermedad de Chagas en caninos. Miraflores y Moniquirá, 2009. Variable Municipio Materna en la vivienda Sexo Raza Domicilio Desparasitado Vacunado Presencia De Pulgas Presencia De Garrapatas Presencia De Gatos Presencia De Aves Vida Nocturna Estado Clinico

Caninos positivos

Caninos negativos

Moniquirá

Miraflores

Positivo

Negativo

Hembra

Macho

Criollo

Otra

Intra domicilio

Periferia

Caquéctico

Normal

Rp: Razón de prevalencias. Ic95%: Intervalo de confianza Al 95%.

Asociación IC 95%

1.25

0.37

4.21

0.71

3.00

0.71

12.74

0.13

1.20

0.26

5.44

0.81

14.49*

0.80

262.38

0.05

1.52

0.37

6.33

0.56

0.22

0.05

0.96

0.03

0.33

0.03

4.03

0.36

8.32

0.97

71.44

0.03

2.60

0.60

11.26

0.19

0.83

0.20

3.46

0.80

8.83*

0.48

161.0

0.08

2.25

0.51

9.99

0.28

3.45

115.97

0.00

c2: P Valor de Chi Cuadrado. *: Con corrección de Yates.

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el animal, en las viviendas construidas con adobe no cocido. Los resultados del análisis bivariado, si bien no fueron concluyentes, sugieren que en los hogares con gestantes seropositivas, es 3 veces mayor la probabilidad de encontrar la infección en caninos y viceversa. Se encontró asociación positiva con significancia estadística para la raza, la presencia de pulgas y el estado clínico. (p≤0.05, Tabla 2). La desparasitación como medida sanitaria en los animales, se halló como factor protector para el evento seropositividad para T. cruzi con significancia (p≤0.05). El sexo, la presencia de aves y el examen clínico general, en particular la frecuencia respiratoria (p=0.0048) y la condición clínica (p=0.0004), podrían ser considerados factores pronósticos en la aproximación al diagnóstico de infección por Chagas canino, especialmente en áreas geográficas endémicas (Tabla 3). Tabla 3. Variables cuantitativas clínicas por resultado de seropositividad de enfermedad de Chagas en caninos ( ;±). Resultado

EDAD

DISTAN

Positivo

34.4 ±24.57

3.4 ±3.0

34.2 ±4.9

87.6 ±5.8

2.7 ±0.7

38.2 ±0.75

Negativo

43.5 30.14

3.6 ±2.4

30.6 ±5.6

86.5 ±7.4

3.3 ±0.5

37.75 ±0.65

Total

42.1 ±29.36

3.6 ±2.4

31.1 ±5.6

86.6 ±7.2

3.2 ±0.6

37.81 ±0.68

FR= Frecuencia respiratoria; FC= Frecuencia cardiaca; CC= condición corporal; T= temperatura °C; De=Desviación estándar.

Las variables de condición fisiológica, medidas en los animales no presentaron cambios significativos entre los positivos y negativos, esto tiene relevancia ya que la enfermedad se presenta silenciosa sin signos patognomónicos.

DISCUSIÓN La prevalencia estimada es similar a lo reportado en Argentina por Gurtler (13,1518) y en Colombia por Gómez (6); aunque la literatura muestra cifras variables, probablemente relacionadas con la intensidad de la endemia y la técnica empleada, los reportes muestran diferencias significativas en prevalencia que van desde 1.4% en Tolima; en Estados Unidos: Texas 20.3% y Luisiana 4.7%; 27.7% en Costa Rica; 41.2% en Argentina; 17.5% en México (19).

La seropositividad encontrada en los caninos examinados es una señal de alerta para las autoridades sanitarias de las zonas endémicas en el departamento de Boyacá, particularmente en los encargados de los programas de control de zoonosis. La sectorización y los factores asociados que se evidencian en el entorno de la mayoría de los resultados positivos invita a profundizar investigaciones epidemiológicas más detalladas en las poblaciones de caninos domésticos en la localidad, en particular si se considera el papel preponderante que juegan los factores socioeconómicos como aspectos determinantes que podrían incidir significativamente en la dispersión de los contagios de esta enfermedad. Además, para los ámbitos académicos, estudios como el presente destacan la importancia de capacitar a los médicos veterinarios en las técnicas de control sanitario y vigilancia epidemiológica en la perspectiva de su participación en los programas de control de enfermedades zoonóticas. Se hace necesaria la implementación de programas de tamizaje en zonas endémicas tanto en población canina como humana y conocer la magnitud del problema realmente, ya que los mapas se basan en la infestación de vectores y se extrapola sin considerar realmente la infección. La información y el reconocimiento del ciclo biológico de T. cruzi debe ser prioridad en los planes de salud publica. Educar, comunicar e informar sobre la enfermedad debe ser política prioritaria en esta zona. Esto puede reducir de manera importante la transmisión a los humanos (20). La prevalencia hallada en el presente estudio confirma el papel que juegan los perros domésticos en el proceso de infección humana al identificarlo como reservorio de T. cruzi, y de su importancia en el sostenimiento del ciclo del parásito para el desarrollo de la infección en humanos. La presencia de mascotas caninas infectadas reviste profundo valor sanitario dada la proximidad de estos animales al entorno humano, sobre todo si se tiene en cuenta que los triatomíneos, aun siendo más afines a alimentarse con sangre humana no desechan la posibilidad de hacerlo a expensas de la sangre de otros mamíferos de sangre caliente, como se comprueba en estudios adelantados en Centro América en los que se reporta la presencia de sangre de perros en hasta un 50% de triatomíneos capturados y examinados (21).

Manrique - Prevalencia de anticuerpos para Trypanosoma cruzi

En relación con la variable sexo, llama la atención el hecho de que en otros estudios se ha encontrado un mayor porcentaje de infestación en los machos, diferencia que puede ser 3 ó 4 veces mayor, circunstancia que se explicaría por la mayor movilidad de los machos, lo que los expondría más al contacto con los triatomíneos en áreas peridomiciliarias y boscosas en los asentamientos rurales. Desde la perspectiva clínica, el hallazgo de seropositividad puede constituir un primer paso en la exploración de las manifestaciones de enfermedad cardiaca causada por T. Cruzi en los perros, habida cuenta de la asociación encontrada con la caquexia y aumento de la frecuencia respiratoria, hallazgos que en cierta medida coinciden con lo reportado respecto del estrés respiratorio como manifestación de la enfermedad en caninos (22). Una premisa importante que se desprende de los resultados del estudio tiene que ver con la necesidad de implementar estrategias para contrarrestar la asociación entre vector y perros (20), de los municipios de Moniquirá y Miraflores, puesto que en los lugares donde se han adelantado investigaciones, se ha encontrado una correlación significativa entre el mayor volumen de canes infectados y el número de personas enfermas. En este sentido se considera que el perro es un agente amplificador, es decir, es un mamífero que convive o habita en cercanía con los seres humanos, no tiene capacidad para evitar la picadura de los triatomíneos a la vez que estos mismos podrían picar al ser humano en el mismo hábitat, o en uno muy próximo, circunstancia que otorga prioridad epidemiológica a los perros respecto a otros animales silvestres (13,15-18,20). La circunstancia arriba descrita se corrobora con la fuerte asociación observada entre la presencia de mujeres gestantes infectadas y perros seropositivos en la misma vivienda, condición descrita con anterioridad por el equipo de investigación de salud pública de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (UPTC) (7,20,23), relación también documentada en estudios latinoamericanos (4,5,8,13,17,24). Desde la perspectiva de las medidas sanitarias de control y prevención esta relación reviste importancia en otra que tiene que ver con la

2921

probabilidad de que la presencia de mamíferos en o alrededor de las viviendas favorecería la proliferación de vectores triatomíneos por constituir una fuente importante de alimentación para ellos, aumentando en la infestación de las habitaciones cuando hay presencia canina alrededor de la vivienda (4,6,12,18,25). Si bien la transmisión transplacentaria de la tripanosomiasis en hembras de caninos no se ha documentado de manera concluyente, las similitudes descritas en los cuadros clínicos de la enfermedad en caninos y humanos invitan a proponer el estudio de la transmisión congénita en perros, teniendo en cuenta que la enfermedad por vía transplacentaria está cobrando significativa importancia en relación con el contagio vectorial en algunas zonas, por lo cual la transmisión vertical generacional se convertiría en el elemento a controlar tanto en reservorios como en humanos (7-11,26). En conclusión, se documentan altas prevalencias de infección en caninos, que se correlacionan significativamente con las infecciones en mujeres embarazadas, hallazgo que constituye una alerta epidemiológica para emprender medidas de control y prevención mediante tamizajes intensivos y educación a las comunidades sobre los riesgos de contagio que se incrementan para las personas que conviven con mascotas caninas en franca cercanía, debido a que los vectores tienen una fuente de alimentación auxiliar importante en periodos en que no hay población humana presente. La presencia de caninos infectados aumenta el riesgo de transmisión a los vectores, y de esta manera la probabilidad de infección en los humanos. Los perros podrían resultar buenos centinelas en los procesos de vigilancia en los programas de control vectorial. Agradecimientos A los laboratorios CAMPVS e InBios por los aportes en el campo científico y logístico en el desarrollo del presente estudio. A los integrantes del grupo de investigación en salud pública (GISP) por el apoyo académico y estructural, a los estudiantes que colaboraron en la recolección de las muestras y captura de datos. A las familias que visitamos por abrir sus puertas y brindarnos su valioso tiempo.

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Rev.MVZ 2924 Córdoba 17(1):2924-2927, REVISTA MVZ CÓRDOBA 2012. • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

COMUNICACIÓN BREVE

Reporte de las serpientes del municipio de Tamalameque, Cesar - Colombia Snake report of the municipality of Tamalameque, Cesar – Colombia Oscar Ruiz P, * Biólogo. Gobernación del Cesar. Secretaria de Educación Departamental. Institución Educativa Ernestina Pantoja. Área de Ciencias Naturales. Tamalameque, Colombia. *Correspondencia: oscarruiz1980@ hotmail.com.

Recibido: Junio de 2010; Aceptado: Agosto de 2011.

RESUMEN Objetivo. Identificar preliminarmente los ofidios del municipio de Tamalameque, departamento del Cesar-Colombia. Materiales y métodos. Entre enero y mayo de 2009, mediante búsqueda libre y captura manual se efectuaron muestreos de serpientes, con dos muestreos por mes y un esfuerzo de captura de cuatro horas/hombres. Resultados. Se reporta para esta localidad la presencia de tres familias de serpientes, distribuidas en 12 géneros y 13 especies; La familia Colubridae fue la mejor representada con el 76.93% de las especies reportadas, seguida de la familia Boidae 15.38% y Anomalepidae 7.69%. Conclusiones. Los resultados permiten deducir que la familia Colúbridae es un componente herpetológico importante para la Ciénaga del Cristo y que las amenazas antropicas para los ofidios en esta localidad son la destrucción de hábitat y falta de conocimiento ecológico y etológico por parte de los pobladores

Palabras clave: Serpientes, identificación, muestreo aleatorio (Fuente:AIMS). Abstract Objective. Preliminary identification of the ophidians of the municipality of Tamalameque, department of Cesar Colombia. Materials and methods. Between January and May of 2009, by means of free search and manual capture snake samplings were taken, with two samplings per month and a capture effort of four man-hour. Results. The presence of three snake families is reported for this locality, distributed in 12 genera and 13 species. The Colubridae family was the best represented one with the 76.93% of the reported species, followed by 15.38% Boidae and 7.69% Anomalepidae families. Conclusions. The results allow to deduce that the family Colubridae is an important herpetological component of the “Cienaga del Cristo” and that anthropic threats for ophidians in this locality are habitat destruction and lack of ecological and ethological knowledge by the community. Key Words: snakes, identification, random sampling (Source:AIMS).

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Ruiz - Reporte de las serpientes del municipio de Tamalameque - Colombia

INTRODUCCIÓN Se puede afirmar que las serpientes son lagartos especializados (1). Las serpientes carecen de oído y no pueden captar sonidos, los ojos carecen de párpados y no tienen extremidades, el maxilar y la mandíbula están articulados por ligamentos, lo que les permite tragar presas muy grandes (2). Para la región Caribe Sánchez et al (3), registraron seis familias distribuidas en 31 géneros y 48 especies. En total para Colombia se estiman 589 especies de reptiles, de los cuales aproximadamente 250 de estas son serpientes (4). El objetivo del presente estudio fue identificar preliminarmente los ofidios del municipio de Tamalameque, departamento del CesarColombia. Con este trabajo se contribuye al conocimiento de la ofidio fauna de la región Caribe colombiana ya que se reporta la presencia de 13 especies para el municipio de Tamalameque asociadas a las inmediaciones de la Ciénaga del Cristo en el departamento del Cesar.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. El municipio de Tamalameque se encuentra dentro de las coordenadas geográficas extremas 8°11’ de latitud Norte, 72º30’ de longitud oeste del meridiano de Greenwich, cuya extensión es de 400 Km2, presentándose una altura sobre el nivel del mar de 100 a 150 m. Al sur el municipio es bañado por la aguas del río Magdalena, el cual es responsable de la formación de varias ciénagas presentes en la zona, una de las cuales es la ciénaga del Cristo. La mayor parte de los muestreos realizados se llevaron a cabo en inmediaciones de este cuerpo de agua. Este ecosistema se caracteriza por la oferta de nichos que posee debido a los cambios que presenta a lo largo del ciclo anual de aguas altas y bajas. Muestreos. Los muestreos se realizaron dos veces al mes, en los meses de eneromayo de 2009, mediante la metodología de búsqueda libre y captura manual. Durante los recorridos se revisaron diferentes microhabitats (riachuelos, hojarasca, debajo de rocas, árboles caídos, borde de ciénaga, huecos en el suelo y en árboles, etc); en los muestreos también se tuvieron en cuenta especímenes hallados muertos o eliminados por los pobladores. En total se llevaron a

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acabo 10 muestreos, cada salida con un esfuerzo de captura de 4 horas/hombre, algunos ejemplares fueron preservados según lo estipulado por Páez (4). El material colectado fue determinado usando las claves taxonómicas de Janis A Roze (5) y Carlos Pérez Santos (6). Trabajo con la comunidad. A la par de los muestreos también se hicieron talleres de sensibilización con jóvenes de la comunidad, especialmente estudiantes de la Institución educativa Ernestina Pantoja, ubicada en la cabecera municipal, los jóvenes después de varias charlas donde se les mostraron especímenes vivos y conservados, para examinarlos y manipularlos; tuvieron la oportunidad de establecer diferencias morfológicas entre especies venenosas y no venosas. También se les dio información sobre el papel ecológico que desempeñan los ofidios en los lugares que habitan.

RESULTADOS Se reporta para el municipio de Tamalameque la presencia de tres familias de ofidios, distribuidas en 12 géneros y 13 especies (Tabla 1). Algunas especies registradas son: Boa Constrictor, Thamnodynastes gambotensis, Liophis lineatus, entre otras (Figura 1). La familia Colubridae representó el 76.93% de las especies reportadas, boidae el 15.38% y Anomalepidae el 7.69% (Figura 2). Tabla 1. Serpientes registradas para el Municipio de Tamalameque, Departamento del CesarColombia.

Familia Colubridae

Genero

Especie

Nombre común

Leptophis

L. ahaetulla

Bejuquilla

Leptodeira

L. septentrionalis

Mapana

L. melanotus

Guarda camino

L. lineatus

Guarda camino

Oxybelis

O. aeneus

Bejuquillo

Spilotes

S. pullatus

Toche, tigre

Pseudoboa

S. neuwiedii

Coral

Thamnodynastes

T. gambotensis

Patoco

Helicops

H. danieli

Mapana de agua

Chironius

C. carinatus

Amarilla

Boa

B. constrictor

Boa

Epicrates

E. cenchria

Candelilla

Liotyphlops

L. albirostris

ciega

Liophis

Boidae

Anomalepidae

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Figura 2. Fotografías de algunos de los ofidios registrados en Tamalameque-Colombia. A) Liophis linneatus; B) Thamnodynastes gambotensis; C) Leptophis ahaetulla; D) Pseudoboa neuwiedii; E) Oxybelis aeneus; F) Boa constrictor.

En la zona se presenta el caso de tráfico ilegal de fauna con la especie Boa constrictor (Boidae), la cual es cazada por los pobladores para ser vendida a intermediarios, el destino de estos animales es ser usados en la industria del cuero o ser vendidos como mascotas. Según información suministrada por cazadores una hembra preñada puede ser vendida entre U$25 y U$30. En Colombia el trafico de reptiles para el 2002 representó el 59% del tráfico ilegal de fauna, mientras que aves y mamíferos sumados, representaron 21% (9). Figura 1. Porcentaje de especies por familia de serpientes reportados para Tamalameque, Cesar-Colombia.

DISCUSIÓN El hecho de que la familia colubridae tuviera la mayor representación de especies, se podría explicar por las siguientes condiciones: la distribución de esta familia a nivel mundial es alta e incluye el 70% de todas las especies de serpientes del mundo (7) y además, esta familia se caracteriza por tener un amplio rango de habitats y hábitos alimentarios (6); son predadoras que pueden cazar ranas, sapos, lagartijas, peces, renacuajos, pájaros, mamíferos, moluscos, insectos e incluso otras serpientes (8).

El panorama para la otra especie de boa (Epicrates cenchria) reportada en la región no es alentador, debido a su coloración café-rojizo, los pobladores la llaman candelilla, atribuyéndole la capacidad de envenenar y matar; esta creencia errónea hace que esta especie sea exterminada. En general la amenaza más grave que enfrentan las serpientes en esta localidad es la pérdida de hábitat. En cuanto al número de especies reportadas, es posible que si se realizan trabajos donde se hagan muestreos durante todo el ciclo anual de aguas altas y bajas de la Ciénaga del Cristo, el número de estas para la localidad aumente, debido a que los cambios en la fisionomía del paisaje pueden ofrecer diversidad de nichos. La percepción que tienen los pobladores acerca de las serpientes, es parecida a la que se presenta en el resto de la región Caribe, miedo y desconocimiento, ya que para la mayor

Ruiz - Reporte de las serpientes del municipio de Tamalameque - Colombia parte de los miembros de la comunidad todas son venenosas y deben ser eliminadas de los ecosistemas; por lo tanto se enseñó a las comunidad que los ofidios son componentes importantes en los ecosistemas, ya que actúan como controladores de poblaciones de otras especies, y además, son fuente de alimento para otros organismos. Según Seigel (10) en muchas partes del mundo las serpientes son importantes debido a que poseen un amplio rango de especializaciones. Los talleres tuvieron gran acogida y despertó en los jóvenes el interés de saber más acerca de las serpientes y su importancia para los ecosistemas; con las actividades desarrolladas se logró enseñar a los estudiantes las características morfológicas que diferencian a las serpientes venenosas y no venenosas. El contacto directo con algunas especies colectadas permitió un acercamiento, que en muchos casos derrumbó falsas creencias negativas que giraban en torno a las serpientes y cambió la forma de pensar de

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muchos jóvenes. Alrededor de 300 estudiantes, de los grados 6 – 11 participaron en los talleres, los cuales se desarrollaron como parte de la asignatura de ciencias naturales y medio ambiente. En conclusión, los resultados permiten deducir que la familia Colúbridae es un componente herpetológico importante para la Ciénaga del Cristo y que las amenazas antropicas para los ofidios en esta localidad son la destrucción de hábitat y falta de conocimiento ecológico y etológico por parte de los pobladores Agradecimientos A los estudiantes de los diferentes grados que participaron activamente en los muestreos, al señor David Noriega, coordinador de la institución académica Ernestina Pantoja, por su apoyo incondicional y a Maideth Romero por su ayuda continúa.

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REVISIÓN DE LITERATURA

¿Están preparadas las ciencias veterinarias y zootécnicas para el futuro?: una visión desde Colombia ¿Are the colombian zootechnics and veterinary sciences prepare for the future?: A vision from Colombia Fernando Nassar-Montoya, M.Sc. Fundación Universitaria San Martín, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Bogotá, Colombia. Correspondencia: fernando.nassar@sanmartin.edu.co Recibido: Enero de 2011; Aceptado: Diciembre de 2011.

RESUMEN Se hace revisión de literatura de los ámbitos de aplicación de la medicina veterinaria y la zootecnia con el objetivo de entender su significado y acción en la sociedad actual y futura, con énfasis en la realidad colombiana. Se muestra cómo estas ciencias tienen competencias y responsabilidades importantes en diversos sectores como el ambiental, social, una salud y no únicamente en el agropecuario. La crisis ambiental y el gran dinamismo que caracteriza el mundo contemporáneo, han creado nuevas necesidades que representan una gran oportunidad para las ciencias veterinarias y zootécnicas, si éstas logran responder a los nuevos retos y aprovechar su rol natural en los sectores que ahora les competen. Su institucionalidad y hegemonía dependerá de su capacidad de adaptación, flexibilidad y liderazgo. Por lo tanto, es pertinente que las ciencias veterinarias y zootécnicas colombianas realicen una prospección colectiva disciplinaria para entender los nuevos retos y les permita prepararse para el futuro. Palabras clave: Ciencias agrícolas, competencia profesional, medicina veterinaria, servicios veterinarios, zootecnia (Fuente:CAB).

ABSTRACT A review of the Veterinary Medicine and Zootechnics is done aiming to understand their significance and performance in the current and future society, with main focus in the Colombian reality. The review shows the competences and responsibilities that these sciences have in diverse sectors such as the environmental, social and health, area, and not just in agriculture. The environmental crisis and the dynamics of the modern world have created new needs that represent a great opportunity for the Veterinary sciences and Zootechnics, if they can respond to new challenges and make use of their natural role in the sectors that now are of their competence. Their institutionally and hegemony will depend on their adaptation, flexibility and leadership capacity. Therefore, this is pertinent for the Zootechnics and Veterinary sciences to perform a collective disciplinary prospection to understand new challenges and prepare for the future. Key words: Agricultural sciences, occupational qualifications, veterinary medicine, veterinary services, zootechnics (Source:CAB). 2928

Nassar - ¿Están preparadas las ciencias veterinarias y zootécnicas para el futuro?

INTRODUCCIÓN La prospección global de las ciencias veterinarias se ha hecho principalmente con base en “para qué y cómo” mediante estudios orientados a entender el mercado de los servicios veterinarios e identificando necesidades técnicas para su aplicación en salud pública, producción de alimentos e investigación biomédica; quizás subestimando el “por qué”, a pesar que algunos autores han llamado la atención sobre la necesidad de hacer la resignificación profunda de sus profesiones para responder a las necesidades actuales y futuras de la humanidad (1,2). En un editorial de la Revista MVZ Córdoba (3), se hacía una pregunta básica para dar inicio a la discusión teórica: “¿Sabemos qué queremos de las ciencias veterinarias y zootécnicas de Colombia y qué necesita el país de éstas?”. El propósito era generar un diálogo no solamente a partir del final, es decir, sobre la calidad del producto del servicio veterinario y zootécnico como resultado del cumplimiento de las demandas de la sociedad; sino desde el principio: la identificación propia de lo que es y debería ser la medicina veterinaria y la zootecnia en el contexto local y global. Se visualizaba en el diálogo colectivo nacional una oportunidad para que éstas contribuyeran activamente, como líderes teóricos y prácticos, al destino del país; ya que si bien hay propuestas y acciones individuales que contribuyen a la proyección al nivel nacional como global, parecería que se careciera de una visión integradora multidisciplinaria e intersectorial que habría debilitado su hegemonía e institucionalidad (4). Lógicamente la construcción colombiana de un significado para las ciencias veterinarias y zootécnicas debe ser coherente con el pensamiento global, pues la ciencia es universal, aunque su aplicación tiene que ser lo suficientemente flexible para adaptarse a la diversidad de las necesidades locales. Es decir, hay que tender por una ciencia robusta conceptualmente pero con alta capacidad para visualizar, proponer y responder a las necesidades de la sociedad y el planeta. De la capacidad que demuestren estas ciencias para responder, dependerá su destino (2). Con el ánimo de contribuir a la construcción del significado y aplicación de las ciencias veterinarias y zootécnicas con énfasis en la realidad nacional colombiana, en el presente artículo se hace una revisión general de los sectores con los que están íntimamente relacionados en la actualidad, y los cuales deberían contemplarse en el análisis de lo que

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es y debería ser su papel presente y futuro; no sólo desde el saber y la técnica profesional aplicados, sino como actores analíticos desde el conocimiento científico con compromiso por el bien público y el progreso sostenible ambiental y social. Contexto de aplicación de las ciencias veterinarias y zootécnicas Producción de Alimentos. La seguridad alimentaria mundial está pasando por una serie de retos debidos a los cambios de paradigmas productivos por los nuevos requerimientos sociales, ambientales y de bienestar animal. Algunos de los factores importantes para entender las perspectivas actuales y futuras de las ciencias veterinarias y zootécnicas, son: Variaciones en las expectativas demográficas mundiales. Las expectativas de las necesidades para la producción de alimentos mundiales para el 2050 han variado, debido al cambio en las tasas de crecimiento demográfico previstas anteriormente, con un efecto heterogéneo entre las regiones (5). Impacto ambiental. La producción de alimentos tiene un alto impacto ambiental por deforestación, contaminación de aguas y suelos, degradación del suelo y, la coexistenciacompetencia con la flora y fauna silvestres (6). Por ejemplo, para el caso de Colombia se estima que al año 1998 se había deforestado el 35% del área total (sin incluir las sabanas naturales) debido a la agricultura (32%) y pastoreo de ganado (68%) (7). Por lo tanto, es necesario identificar e implementar nuevas opciones de producción animal más sostenibles y más eficientes (6). Mejoramiento genético y biotecnologías. El desarrollo de animales más especializados con un objeto productivo, incluye el manejo de tecnologías reproductivas, la manipulación del ácido nucléico y la fusión de células intertaxones. Actualmente, hay preocupación por regular el uso de biotecnologías para garantizar productos seguros (8), lo que se evidencia en el Protocolo de Cartagena (9). Nuevos paradigmas de bioseguridad. Algunos conceptos han ganado campo dentro de las políticas para la producción y consumo de alimentos como: trazabilidad (rastreabilidad) (10), inocuidad (11) y sostenibilidad (6). Éstos redefinen los procesos de producción, transporte, comercialización y consumo; lo que repercute en la implementación de políticas de calidad. En Colombia, los documentos Conpes

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3376 de 2005, 3458 de 2007 13) y 3468 de 2007 (12-14), enmarcan las políticas sanitarias y de inocuidad para las cadenas de la carne y leche bovina, la cadena porcina y la cadena avícola, respectivamente. Globalización y nuevos paradigmas comerciales. La intensificación del comercio internacional ha derivado en el lógico aumento en la preocupación sobre la movilización de los productos agropecuarios, lo que ha generado la firma de acuerdos internacionales (15) y de medidas para garantizar la inocuidad de los alimentos, la salud de los animales y la preservación de los vegetales (16). El marco de desarrollo de Colombia para adecuarse a las exigencias sanitarias del comercio internacional se consigna en el documento Conpes 3375 de 2005 (17). Nuevos paradigmas en el bienestar animal. La calidad de vida de los animales en las granjas y fincas (18) ha empezado a interesar a los consumidores y productores a nivel mundial, aunque parecería haber mayor preocupación en los países desarrollados occidentales; ya que por ejemplo el bienestar animal es un objetivo primordial en la Política Agraria Común europea. Pero más allá, es un momento coyuntural para que la veterinaria y la zootecnia como ciencias, retomen lo que fue su olvido primordial: entender el animal como el pilar fundamental de su conocimiento y no sólo como una máquina productiva, lo que subestima la relación bienestar-salud (4). Producción de biocombustibles. Ésta puede competir con la producción de alimentos y distorsionar la oferta y el precio. El impacto que tiene la carencia e incremento de los precios de las materias primas de los insumos para animales, repercute en los de los productos de las cadenas de lácteos y cárnicos. El efecto negativo es grande, ya que se estima que en Colombia en las estructuras de costos de las producciones pecuarias, los alimentos representan la mayoría del valor de producción: en la porcicultura aproximadamente el 75% del total en el ciclo completo, en la avicultura 66 % y en la piscicultura (por ejemplo, cachama y tilapia) 67-80% (19-21). Bienes y servicios. En Colombia en la actualidad, se ponderan como sectores socioeconómicos prioritarios del sector agropecuario, la producción de las Cadenas Alimenticias (cárnica y láctea), del Cuero, Calzado y Marroquinería y, Farmacéutica y Medicamentos (22). La veterinaria y la zootecnia han estado tradicionalmente

vinculadas a las cadenas cárnica y láctea, pero interesantemente, si se miran los documentos de la Agenda Interna (22), entre las debilidades de la Cadena del Cuero, Calzado y Marroquinera están precisamente elementos relacionados directamente con el ejercicio de estas profesiones “Considerar la piel como un subproducto de la carne” que lógicamente se relaciona con el “Mal manejo del ganado en los hatos, restándole calidad a las pieles”. El papel de las ciencias veterinarias y zootécnicas en la industria farmacéutica debe ser de alta importancia, si se considera que además de su contribución al crecimiento económico del sector, tiene responsabilidad directa en la salud animal y pública; hecho que se enfatiza por el papel que juega el cambio y adaptación de patógenos, incluyendo la aparición de microbios resistentes a los tratamientos, en la emersión de enfermedades infecciosas (23). También, un efecto muy importante y que ha sido poco estudiado en el país, es la bioacumulación de sustancias en las cadenas alimenticias que pueden generar alteraciones morfológicas, fisiológicas y disrupción endocrina en algunas especies, incluyendo al ser humano (24). Adicionalmente, la veterinaria y la zootecnia están íntimamente relacionadas con el desarrollo de otros sectores de relevancia socioeconómica potencial y que no han sido suficientemente definidos dentro de las cuentas económicas colombianas actuales (25), como lo son las cadenas de animales de trabajo, recreación y compañía. Éstos incluyen los zoológicos, acuarios y zoocriaderos. Bienestar y progreso social. El veterinario y el zootecnista se constituyen en moderadores naturales del vínculo de la sociedad con los animales. Según Wilson (26), el ser humano tiene una tendencia natural a interesarse en otros seres vivos y el grado de comprensión que éste tenga de otros organismos, contribuirá al valor que les dé a éstos y a sí mismo. Si esto es cierto, dentro del Modelo Dirigido por el Conocimiento de la categorización para definir los propósitos de uso de las ciencias (27), el papel del veterinario y zootecnista tiene que trascender de la pura atención del animal, que de por si es parte fundamental de la profesión, para asumir la responsabilidad humanística de liderar las bases culturales con las que la sociedad se relaciona con los animales y el medio ambiente. La función social de las ciencias veterinarias debe examinarse también dentro de sus aplicaciones en la salud pública. Adicionalmente

Nassar - ¿Están preparadas las ciencias veterinarias y zootécnicas para el futuro? a sus amplias y reconocidas funciones en la seguridad alimentaria y la prevención y control de zoonosis, en la actualidad se ha visto la importancia de que se consideren los beneficios que conlleva el contacto con animales: -“Nadie que mire la evidencia puede dudar que los animales mejoran la calidad de vida del ser humano moderno” (28). Las oportunidades de contribución serían muy altas, si se considera que de acuerdo con De Zubiría (29), la soledad es uno de los más grandes problemas sociales contemporáneos de importancia en salud pública. Salud. A nivel global se plantea una evolución conceptual en la salud que involucra a muchas disciplinas tradicionalmente ajenas al sector. Es así como otras áreas del conocimiento han, inclusive, ido más allá y empezado a apropiarse del concepto medicina, como lo son medicina ecológica y medicina geológica (30, 31). Por lo tanto, más que justificable es perentorio que los nuevos marcos conceptuales rompan la separación tradicional de la salud, para lo cual la práctica e investigación de la veterinaria tiene que contribuir al entendimiento de una medicina única que integre la salud animal, de los ecosistemas y la humana (32). La ampliación conceptual y aplicada de salud es una respuesta a las nuevas problemáticas modernas que han derivado en la explosión de enfermedades en la fauna silvestre, los animales domésticos y el ser humano; por los cambios ecológicos, el comportamiento de la población humana, el comercio y movilización de personas internacionalmente, la globalización y los cambios en la tecnología e industria, el cambio y adaptación parasitarios, y las fallas en los programas de salud pública (33). Es así como la emersión de las enfermedades zoonóticas es una prioridad compartida de organismos como por ejemplo, la Organización Mundial de la Salud, la Organización Mundial de Sanidad Animal, la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, y la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (34). El reto actual sobre la salud para las ciencias veterinarias es inmenso, quizás ahora más grande que nunca si se considera que es un área de conocimiento clave para el entendimiento de la nueva dinámica de los patógenos que involucra fauna silvestre-animal domésticoser humano. De acuerdo a Jones et al (35) el 60.3% de 355 eventos estudiados de emersión de enfermedades infecciosas en seres humanos correspondieron a zoonosis, de los cuales 71.8% se originó en la vida silvestre. Estos

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autores concluyen que la mayor probabilidad de emersión de enfermedades provenientes de la fauna se localiza en los países en desarrollo de las zonas tropicales de Asia, África y Latinoamérica debido a factores socioeconómicos, ambientales y ecológicos. Colombia es uno de los países que estaría bajo mayor riesgo por patógenos de origen en la vida silvestre y por los transmitidos por vectores; pero a excepción de uno pocos casos y de algunas propuestas de algunos grupos de investigación; el país no está preparado para prevenir o y/o responder enfermedades emergentes de vida silvestre; y menos a predecir la aparición de nuevos patógenos. Lo más grave, es que la aplicación de las políticas de investigación y acceso a la biodiversidad están entorpeciendo las iniciativas del sector público y privado para generar conocimiento y entender la situación del país. Biodiversidad y servicios ambientales. Actualmente es muy utilizado el término cambio global, que se refiere a los cambios de la superficie de la tierra y su uso, la declinación global de la biodiversidad, los cambios en la composición de la atmósfera y el cambio climático. Según Walter y Steffen (36) el más importante para los ecosistemas terrestres es el primero debido al incremento de las necesidades de alimento, situación que se agrava por factores como migración, pobreza e inequidad socioeconómica, y debilidad política. Entonces, indudablemente las actividades antropogénicas representan la mayor amenaza para la biodiversidad del planeta y a su vez el deterioro ambiental se presenta como un limitante para el progreso del ser humano (37). Es decir, la conservación es un asunto socioeconómico además de ambiental, por lo cual es prioritario que las ciencias veterinarias y zootécnicas colombianas definan la posición sobre su responsabilidad. En este sentido, es necesario identificar como éstas abordarán factores causantes de la extinción como, pérdida de hábitats terrestres y acuáticos, contaminación, introducción de especies, uso no sostenible de los recursos y cambios climáticos globales (38); sobre todo cuando Colombia se encuentra en el rango de dos hotspots de biodiversidad: Andes Tropicales y Tumbes- Chocó- Magdalena (39). También, tienen que clarificar sus roles en la emersión de enfermedades infecciosas con alto impacto en las poblaciones naturales (40) y en la problemática que representa la amenaza de extinción en que se encuentran algunas especies domésticas (41). Innovación y Tecnología. En algunos países, como Estados Unidos, hay lineamientos específicos para la investigación en ciencias

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veterinarias que responden a su amplio contexto de aplicación (32). Sin embargo, en Colombia no se ha abordado la temática desde lo disciplinario; sino sectorial, por lo que se han categorizado como ciencias agrarias. El sistema de gestión se organiza por cadenas productivas; considerándose como prioridades de investigación e innovación pecuaria: inocuidad alimentaria; conservación, caracterización y utilización de recursos zoogenéticos para la alimentación; aplicación de biotecnologías en mejoramiento y valor agregado de los sistemas pecuarios e, innovaciones que soporten la modernización de las distintas cadenas (22,42). Sin embargo, esto posiblemente subestima el potencial investigativo de la veterinaria y la zootecnia en los ámbitos que no están relacionados con los sistemas de producción pecuaria; lo que puede evidenciarse al revisar la Plataforma Scienti de Colciencias (43), en la que se encuentran registrados solamente 78 grupos de estas profesiones, lo que representa 30.1% de los grupos de ciencias agrarias y 1.8% del total de los grupos inscritos en Colombia. En el Sistema Nacional de Indexación y Homologación de Revistas Especializadas de Colombia están registradas 23 revistas en la Categoría A1, de las cuales dos están destinadas a la divulgación de la investigación en la medicina veterinaria y la zootecnia (44). Ambas están indexadas en Thompson Reuters Science Citation Index Expanded: la Revista de MVZ Córdoba, editada por la Universidad de Córdoba, y la Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias, editada por la Universidad de Antioquia. Éstas indudablemente son una fuente importante para entender el estado de la investigación de las ciencias veterinarias y zootécnicas colombianas e identificar necesidades hacía el futuro. Institucionalidad de las ciencias veterinarias y zootécnicas en Colombia La práctica de la medicina veterinaria y la zootecnia en Colombia. Ha sido descrita por García Alzate y Parra López (45). Hay un marco histórico real que le confiere institucionalidad, más allá de la normatividad que ampara y define su ejercicio (46-48). Sin embargo, las ciencias veterinarias y zootécnicas colombianas se encuentran en un momento decisivo en su historia debido a que parecería, por lo menos en algunos campos, se ha alejado de la situación socioeconómica y ambiental actual, y de las acciones de progreso (3). Ésta problemática no sería exclusivamente nacional de acuerdo al siguiente texto de Nielsen

(2) para la veterinaria: “La profesión tiene que aceptar que su cultura actual modelada solamente en la medicina humana, ha dejado de ser funcional.”. De acuerdo a Willis et al (49), la veterinaria pasa por un momento de transición debido a los cambios que están sucediendo en la sociedad y el planeta. Actualmente hay un replanteamiento permanente de los campos del conocimiento que hace dudar de la hegemonía tradicional que pudiera tener cualquier ciencia o disciplina. De esta manera, el médico veterinario y el zootecnista se ven abocados a competir con otras profesiones que los podrán reemplazar en aquellos ámbitos en los cuales no muestren la adaptación, flexibilidad, desarrollo y liderazgo suficientes para responder a las necesidades de la sociedad en los diferentes sectores que les competen (2, 4). Perspectivas al futuro. La revisión realizada muestra que la medicina veterinaria y la zootecnia son sensibles a los cambios socioeconómicos y ambientales que ocurren al nivel nacional y global. Esto representa una amenaza para su institucionalidad y hegemonía, pero también una gran oportunidad de desarrollo y de extensión en sectores no tradicionales para estas ciencias. Su éxito dependerá de su capacidad de adaptación y flexibilidad para entender los nuevos retos y responder a los paradigmas modernos de calidad, equidad y sostenibilidad; la capacidad de articulación con otras profesiones y saberes y, de la conceptualización de la ciencia, la investigación y su aplicación en Una salud (comprendida como la integración de la salud animal, humana y de los ecosistemas), bioseguridad, seguridad alimentaria, salud-bienestar-producción animal, animal-bienestar humano, biodiversidad-usoconservación, producción-sostenibilidad y sistema de producción animal. Por lo tanto, cuando se observa el potencial de aplicación de las ciencias veterinarias y zootécnicas que trasciende del sector agropecuario; se puede decir que es necesario pensar en un plan de desarrollo disciplinar nacional; pues el sectorial no tendrá la sensibilidad suficiente para comprender su complejidad. Desde este punto de vista, un plan disciplinar tendría que afirmar ante el país una unidad e identidad, respetando la diversidad de pensamiento, disciplina y cultura; caracterizar y profundizar el significado del humanismo para las ciencias veterinarias y zootécnicas e impulsarlo para estimular el ejercicio profesional ético y con calidad y, el reconocimiento científico, social, económico y político de las profesiones. Además, éste será pertinente para el país, si

Nassar - ¿Están preparadas las ciencias veterinarias y zootécnicas para el futuro? logra ser indicador para el progreso dentro del contexto nacional mediante la identificación de prioridades de investigación en las ciencias veterinarias y zootécnicas para garantizar que el conocimiento científico y tecnológico contribuya a responder ante las necesidades que presentan los diversos sectores de influencia. Pero sobre todo, se requiere de líderes teóricos, por lo que es una excelente noticia la creación de la Academia Colombiana de Ciencias Veterinarias en el año 2005, para la reflexión sobre los fundamentos y paradigmas de su ciencia, principalmente en lo concerniente a las relaciones ser humano-animal-ecosistema y, así promover actitudes activas para que la veterinaria y la zootecnia sean profesiones líderes conceptuales y aplicados de la sociedad.

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En 2011 se presenta una buena oportunidad para promover la proyección disciplinaria en el país y otras partes del mundo, debido a que se está celebrando globalmente los 250 años de la medicina veterinaria. Es decir, aprovechar una tradición teórica y práctica que pesa para mirar hacia el futuro, en momento propicio para reinventar la ciencia, desde su significado de lo que es y lo que debería ser, más allá de aspectos puramente técnicos. Porque hay que confesar que éstos últimos son los que menos deben importar, ya que tanto la veterinaria y la zootecnia desde este punto de vista, han avanzado a la par de las innovaciones tecnológicas junto con otras ciencias. Agradecimientos Victoria Pereira-Bengoa por comentarios al manuscrito.

revisión

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REVISIÓN DE LITERATURA

Bienestar animal durante el transporte y su relación con la calidad de la carne bovina Animal welfare during transport and its relationship with meat quality Marlyn Romero P,1* M.Sc, Jorge Sánchez V,1 M.Sc. 1Universidad de Caldas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Programa Medicina Veterinaria y

Zootecnia, Departamento de Salud Animal. Manizales, Colombia. *Correspondencia: marlyn. romero@ucaldas.edu.co. Recibido: Marzo de 2010; Aceptado: Junio de 2011.

RESUMEN El bienestar animal (BA) es un elemento diferenciador en la comercialización de la carne bovina a nivel internacional, aunque no forma parte de los acuerdos comerciales, se pueden citar ejemplos de las experiencias de Chile, Argentina, Brasil y Uruguay con la Unión Europea, que los ha privilegiado para la exportación de carne fresca bovina con este valor agregado. Durante el transporte, cargue y descargue los bovinos son sometidos a factores estresantes que afectan su bienestar y la calidad de la carne, además de producir importantes pérdidas económicas a los productores. Este trabajo presenta una revisión sobre el bienestar animal durante el transporte, y su relación con la calidad de la carne bovina. Palabras clave: Bienestar animal, calidad de la carne, estrés, transporte (Fuente:CAB).

ABSTRACT Animal welfare is a distinguishing element within the international meat trade, although not part of trade agreements, there are examples of the experiences in Chile, Argentina, Brazil and Uruguay with the European Union that has favored the export of fresh meat with this added value. During transportation, loading and unloading, cattle is subjected to stress factors that affect their welfare and meat quality, aside from producing great economic loss to producers. This work presents a review on animal welfare during transport and its relationship to meat quality. Key words: Animal welfare, meat quality, stress, transport (Source:CAB).

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Romero - Bienestar animal durante el transporte y relación con la calidad de la carne

INTRODUCCION El bienestar animal (BA) se ha convertido en un importante atributo en el concepto de calidad sensorial y ética de los alimentos de origen animal, y un tema de interés en el comercio internacional de la carne bovina, debido a su importancia y contribución para la sanidad animal y la productividad de la ganadería, motivo por el cual la Organización Mundial de Sanidad Animal (1), ha recomendado que los servicios veterinarios de control oficial establezcan principios de bienestar en su legislación, reafirmando así la sanidad animal como un componente del BA (2,3). Adicionalmente, existe una creciente preocupación por parte de los consumidores que reclaman que los animales sean producidos en toda la cadena agroalimentaria (desde la granja hasta el beneficio) bajo estándares de bienestar aceptables, y manejados de forma humanitaria (2,4). En Sur América, la implementación de prácticas de BA en las cadenas productivas cárnicas no es una prioridad generalizada, debido a situaciones socio-económicas y culturales; sin embargo, los principales países exportadores de carne: Brasil, Argentina, Uruguay y Chile, han encontrado en el BA un elemento diferenciador para la comercialización de sus productos y como una oportunidad para incluir estos aspectos en sus programas de aseguramiento de la inocuidad y en la legislación sanitaria (4). Colombia tiene un sistema de comercialización del ganado bovino, que requiere trasladar los animales desde las zonas productoras hacia las centrales de beneficio, siendo necesario recorrer grandes distancias y afrontar diferentes condiciones geográficas, lo cual implica tiempos de transporte y de ayuno prolongado, factores que generan estrés y repercuten en la calidad de la carne (4,5). Se considera que el estrés es un indicador de la pérdida de BA; su aparición está relacionada con el cambio del comportamiento fisiológico de algunos bioindicadores hormonales como el cortisol, y variables sanguíneas como glucosa, creatinfosfoquinasa y urea, entre otros (5-7). El trasporte, embarque y desembarque son etapas que generan altos niveles de estrés en el bovino, provocando pérdidas económicas relacionadas con decomisos por contusiones de diferente grado, mortalidad animal, bajo rendimiento de la canal y alteración de las variables organolépticas de la carne, entre otros aspectos (8). Dada la importancia del BA y sus implicaciones en la calidad de la carne,

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el presente artículo pretende discutir sobre los factores desencadenantes de estrés durante el transporte, cargue, descargue, y su relación con la calidad de la carne bovina. Estrés y bienestar animal. El concepto de BA está basado en la relación armoniosa del animal con el medio; en esta relación entran a jugar un papel importante su estado físico y psicológico (7). Se han descrito como condiciones básicas que aseguran el bienestar de los animales cinco componentes que se han denominado “las cinco libertades”: 1) Libre de hambre, sed o un nivel de nutrición insuficiente; 2) No presentar dolor, heridas o enfermedad; 3) Libre de temor o angustia; 4) No presentar incomodidad; 5) libre de manifestar un comportamiento natural, las cuales deben regir el BA (1). La percepción de calidad de vida de los animales no sólo incluye la ausencia de sufrimiento, sino también la calidad de las relaciones de éstos con el ambiente de manera que puedan satisfacer sus necesidades preferenciales (9). Las actividades pre-sacrificio incluyen las prácticas y condiciones aplicadas al bovino durante el período comprendido entre la movilización y el trasporte desde la granja, hasta la insensibilización (10). Durante este período los animales son sometidos a factores desencadenantes de estrés que incluyen: 1) incremento del manejo, recolección y arreo con elementos punzantes o con tábano eléctrico, 2) mezcla de animales de diferente procedencia y contacto con personal extraño, 3) transporte y desafíos físicos como rampas, superficies resbaladizas, densidad de carga, movimiento, ruido y vibración del vehículo, 4) contacto con ambientes nuevos y no familiares, 5) privación de alimento y agua; 6) cambios en la estructura social, 7) cambios en las condiciones climáticas como temperatura, radiación y humedad, 8) imposibilidad de descanso, entre otros aspectos (10-12). Estos factores desencadenan reacciones inevitables en el animal que se traducen en estrés físico, fisiológico y psicológico (13). El primero se genera por el esfuerzo físico del animal durante el arreo, el cargue y descargue del camión, así como el intento para mantenerse en píe durante el movimiento del vehículo. El estrés fisiológico puede ser medido en términos de cambios de la homeostasis del animal, por la privación de alimento y agua, la capacidad de utilizar sus reservas en el mantenimiento de la temperatura corporal y actividad física, o para superar alguna lesión o enfermedad. El psicológico, es el percibido por la conciencia animal, siendo por lo tanto difícil de medir objetivamente (12,14,15).

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El estrés ha sido utilizado como indicador de la pérdida de BA y es definido como la acción de estímulos nerviosos y emocionales provocados por el ambiente sobre los sistemas nervioso, endocrino, circulatorio y digestivo de un animal, produciendo cambios medibles en los niveles funcionales de estos sistemas, en especial altera la homeostasis interna induciendo cambios en la actividad del sistema nervioso autónomo y el eje hipotálamo-pituitaria-adrenal-HPA (7). Se ha denominado “Diestrés” cuando la repuesta del animal al factor estresante pone realmente en riesgo su bienestar (16). De acuerdo con la duración y sus efectos el estrés puede ser agudo (transitorio) o crónico (de largo efecto)(17). En cualquier caso, una vez que el sistema nervioso central percibe una amenaza, se desarrolla una respuesta que consiste en una combinación de las cuatro respuestas generales de defensa biológica: comportamiento, sistema nervioso autónomo, inmune y neuroendocrino. A pesar de que los cuatro sistemas biológicos de defensa están disponibles para que el animal responda a un factor estresante, no todos los cuatro son necesariamente utilizados contra todos los factores de estrés. En particular, la homeostasis se mantiene cuando sólo los dos primeros mecanismos están involucrados; por el contrario, cuando los cuatro mecanismos de defensa han sido implicados, algunas de las funciones biológicas pueden verse modificadas adversamente y los animales estarán en peligro (diestrés) (17). Dentro de la respuesta neuroendocrina tienen vital importancia los sistemas: simpáticosuprarrenal-SS y el HPA, donde la activación de cualquiera de los dos depende del factor

estresante que está produciendo el estímulo (14,18). En la activación del primero denominado “Síndrome de emergencia”, el organismo se prepara para hacer frente a peligros súbitos generando una respuesta de carácter rápida y breve, que conlleva a la activación neuronal del hipotálamo y la liberación de adrenalina y noradrenalina desde la médula adrenal, encargadas de poner al animal en estado de alerta, preparándolo para luchar o huir, provocando un aumento de la frecuencia cardiaca, vasoconstricción periférica, hiperglicemia, midriasis, hiperventilación, aumento del volumen sanguíneo y del gasto cardiaco (17). En el eje HPA se presenta la liberación del Factor Liberador de Corticotropina (CRH) y la vasopresina en el hipotálamo, que actúan sobre la hipófisis anterior estimulando la liberación de la Hormona Adenocorticotrópica (ACTH), la cual es liberada al torrente sanguíneo para estimular la síntesis y secreción de glucocorticoides (GC), especialmente cortisol desde la corteza adrenal. Simultáneamente se estimula la liberación de catecolaminas (adrenalina, noradrenalina y dopamina) desde la médula adrenal, así como hormonas tiroideas (17). Por su parte, el cortisol aumenta la disponibilidad de energía y las concentraciones de glucosa en la sangre, porque estimula la proteólisis, lipolisis, la gluconeogénesis en el hígado, e inhibe la liberación de insulina (Figura 1)(17). En esta compleja respuesta fisiológica se presenta un proceso de retroalimentación negativa, permitiendo que el cortisol actúe sobre el hipotálamo y la hipófisis disminuyendo la producción de CRH y ACTH. En esta etapa el organismo intenta adaptarse o afrontar la presencia de los factores que percibe

Figura 1. Esquema de los mecanismos de estrés en el animal.

Romero - Bienestar animal durante el transporte y relación con la calidad de la carne como amenaza, en donde se presenta una normalización de los niveles de GC y por ende la desaparición del estado de estrés, etapa que se ha denominado “de resistencia o relajación” (16). El estrés crónico consiste en un estado de activación fisiológica en curso, que se presenta cuando el animal se expone a varios factores o a la exposición repetida a los mismos estresores agudos, etapa en la cual el sistema nervioso autónomo rara vez tiene la oportunidad de activar la respuesta de relajación. En este caso, se presenta una sobreexposición a las hormonas del estrés, que produce un costo biológico suficiente para alterar las funciones biológicas y producir diestrés. El estrés crónico coincide con un estado de larga duración del animal, como un problema de salud grave, que no permite su recuperación satisfactoria, en donde la intensidad y duración del sufrimiento contribuye a la severidad de la respuesta del animal. Por lo tanto, el estrés crónico es una condición de mala adaptación que puede estar asociada con una reducción directa en el nivel de BA. Por otra parte, esta condición puede afectar la susceptibilidad a las enfermedades o favorecer su progresión (17). Aunque la respuesta al estrés es muy variable y dependiente de la capacidad de cada animal para responder, resulta evidente que si el agente estresante actúa por largo tiempo (transporte y ayuno prolongado), el efecto encontrado será mayor, sea alta o baja la capacidad de respuesta de cada animal. Por ello, mientras más largo son los tiempos de transporte y ayuno, mayores probabilidades existen de presentar estrés, afectando negativamente el BA (19). Existe una variedad de parámetros de comportamiento, fisiológicos, bioquímicos, inmunológicos y patológicos que han sido propuestos para evaluar la capacidad de respuesta de los animales ante el estrés agudo (Tabla 1). Dentro de los biomarcadores descritos sobresalen la medición de cortisol sérico, las concentraciones de albúmina plasmática, urea, globulina, proteínas totales, la actividad de Creatin-fosfoquinasa (CK), ß-Hidroxibutirato (ß-OHB), actoglobina, fibrinógeno, el volumen celular empaquetado (VCP) y el conteo de leucocitos (5). Estas variables se utilizan como biomarcadores especialmente cuando se están comparando valores previos y posteriores a un determinado manejo que se cree induce estrés (19). Bienestar animal y transporte. En Sur América el transporte de los animales desde la granja a las plantas de sacrificio se hace generalmente por vía terrestre y es efectuado

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Tabla 1. Principales indicadores de estrés agudo en bovinos que permiten evaluar el Bienestar animal durante el transporte. Indicadores

Índices

Referencia

Comportamiento

Vocalización, agitación, lucha, dejar de avanzar, erizamiento y temblor.

Broom (7) Stockman (9) Herskin (18)

Hipertermia-hipotermia: Incremento y variabilidad de tasa cardiaca, presión sanguínea, tasa respiratoria, transpiración, temperatura corporal. Fisiológicos

Estrés fisiológico: mortalidad. Debilidad: aumento vasopresina.

Broom (7) Stockman (9) Mounier (21)

Marcadores de miedo/ excitación: Aumento tasa cardiaca. Desempeño

Reducción del rendimiento de leche, interferencia con la deyección láctea.

Knowles y Warriss (20)

Medidas endocrinas

Incremento de cortisol, oxitocina, catecolaminas (epinefrina y norepinefrina), CRH, ACTH, vasopresina, ß-endorfinas.

Mounier (21)

Indices de privación de alimento: Incremento de Ac. Grasos no esterificados, ß-hidroxibutirato, urea. Disminución de glucosa.

Marcadores bioquímicos

Indicadores de deshidratación,y/o hemoconcentración: Incremento de la osmolaridad, VCP, proteína total, albúmina. Índices de esfuerzo físico: Incremento de CK, lactato, lactato deshidrogenasa.

Broom (7) Stockman (9) Gupta (14) Amtmann (19) Cooke y Bohnert (22)

Indices de miedo/ excitación y la liberación de catecolaminas: Aumento VCP, glucosa, urea, ß-HOB. Indicadores de ayuno: peso vivo, ß-HOB, Ac. Grasos libres, glucógeno muscular. Adaptado de Knowles y Warriss (20).

por personal poco especializado o no capacitado en el transporte de bovinos (4,12,23). Estudios realizados en Chile reportan que la duración del transporte se encuentra entre 1 a 12 h, pero ocasionalmente puede incluir hasta 60 h. Los incrementos en el viaje se deben a las malas condiciones de mantenimiento de las vías y vehículos, características geográficas, variaciones climáticas, o a la cadena de intermediarios en la comercialización del ganado (24). El tiempo de transporte prolongado aumenta las pérdidas de peso vivo que pueden estar entre el 1.5 y 9%, los riesgos de caída, muerte y contusiones de los bovinos, que se traducen en pérdidas económicas por eliminación de tejido contuso, menor rendimiento en canal y descenso en la categoría de tipificación de las canales (4).

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Los hematomas y las marcas de elementos punzantes, palos, picanas eléctricas y otros elementos de arreo inadecuados, se observan fácilmente en el proceso post-mortem, en forma de hemorragias petequiales en las canales y lesiones de distinta forma, profundidad y extensión, que son un reflejo de deficientes condiciones de manejo de los animales y pobre BA (24). Estas se han clasificado en 3 categorías: Tipo 1, cuando sólo se compromete el tejido subcutáneo; Tipo 2, tejido subcutáneo y muscular, y Tipo 3, tejido subcutáneo, muscular y óseo (25). Se ha descrito una relación directamente proporcional entre la frecuencia de presentación de las lesiones y el tiempo o distancia del transporte (19). Una investigación realizada en África Occidental evaluó los tipos de lesiones más frecuentes en bovinos cebú comercial (Bos indicus), estableciendo que las heridas, contusiones y laceraciones localizadas a nivel de abdomen y tórax fueron las de mayor presentación, siendo menos significativas las fracturas, dislocaciones y la hernia abdominal. Estas lesiones llevaron al decomiso de tejidos superficiales y profundos que representaron en promedio entre un 1 y 3.2% del peso de la canal (12). Diferentes estudios han reportado que los altos porcentajes de lesiones de los bovinos durante el transporte están relacionados con la presencia de animales con cuernos; los golpes proferidos por los operarios con elementos contundentes; malas prácticas de conducción; mal diseño y mantenimiento de la carrocería de los vehículos, y la falta de sistemas de protección contra cambios climáticos, entre otros aspectos (12,23,26). Sin embargo por las condiciones de manejo de los animales en las plantas faenadoras, otros investigadores han observado que más del 50% de las contusiones sufridas por los animales se presentan después de haber ingresado a los establecimientos (10). Los bovinos durante el transporte pierden agua a través de la respiración, micción, heces y evaporación por termorregulación (27). En los viajes prolongados (≥ 18 h) se hace necesaria la provisión de agua y alimento en el vehículo, así como de paradas que garanticen el descanso de los bovinos, prácticas que son poco frecuentes en los países latinoamericanos y que en Colombia están incluidas en la legislación sanitaria (4,28). La disponibilidad de espacio permitida a los bovinos en los camiones, es otro factor que incide en el bienestar animal (7,10). Las altas densidades de carga, dificultan los movimientos de adaptación para mantener el equilibrio en el

vehículo en desplazamiento, reportándose que a menor espacio asignado por animal es mayor la incidencia de contusiones, se incrementa la tasa cardíaca y aumentan los movimientos del animal en el vehículo, lo que favorece las caídas y lesiones de los bovinos (8,10). Se ha recomendado asignar áreas que varían entre 0.7 y 1.7 m2 por animal, dependiendo de la raza, peso, localización geográfica, temperatura, entre otros aspectos (12,27). El cargue y descargue de los bovinos son actividades que pueden generar más estrés que el mismo transporte, sin embargo, no existen criterios claros que definan las condiciones apropiadas o el tiempo límite para estos procedimientos (3). Algunos estudios han sugerido que el cargue comparado con el descargue, presenta mayores efectos adversos al BA, haciendo énfasis en que la falta de capacitación del personal y el desconocimiento del comportamiento animal, serían uno de los factores que más inciden en estas etapas (7,29). Relación entre bienestar animal-estréscorte oscuro. El efecto del estrés crónico sobre la reducción de glucógeno muscular ha sido bien documentada, al igual que su asociación directa con la presentación de carne de corte “oscuro” o carne DFD (Dark, firm, dry), que se presenta especialmente en bovinos y se observa en las primeras horas después del sacrificio (4,10). El estrés agota las reservas de glucógeno muscular y disminuye la formación de ácido láctico, motivo por el cual el pH después del sacrificio permanece alto (≥5.8) (19). Un animal vivo, obtiene la energía requerida para la actividad muscular del glucógeno que se encuentra almacenado en el tejido muscular esquelético, y en mayor proporción en el hígado, en donde alcanza un valor del 2 al 10% del peso total del órgano (30). En un animal sano y descansado, el nivel de glucógeno muscular es alto (75 - 120 mmol/Kg), pero puede descender a valores críticos (45 - 57 mmol/Kg), y aún así se puede alcanzar un pH en la canal con un valor entre 5.6 y 5.8, el cual se considera como óptimo para el proceso de maduración de la carne (30). Cuando el animal es sacrificado, se interrumpe el suministro de sangre a los tejidos y por lo tanto de oxígeno y de nutrientes (31). El músculo intenta mantener el aporte de energía, activando las vías anaerobias que son insuficientes para cubrir la demanda energética, dando como resultado el consumo del glucógeno muscular y la posterior acumulación de acido láctico en el espacio intra y extracelular.

Romero - Bienestar animal durante el transporte y relación con la calidad de la carne La acumulación de hidrogeniones provenientes del ácido láctico es directamente responsable del descenso del pH y cesa hasta llegar al pH último (pHu), el cual se alcanza cuando se agotan las reservas de glucógeno, o se pierde la actividad enzimática por desnaturalización de las enzimas glucolíticas, proceso que ocurre en el músculo bovino entre las 18 y 36 horas postmortem (10,31). En el ganado bovino los valores bajos de glucógeno durante el pre-sacrificio se asocian a factores físicos y agentes estresantes (30), dentro de los cuales se reportan: el tiempo de transporte (32), tiempo de espera en la planta (15), alteraciones sociales en la manada (33), actividad física y fatiga, traumatismos (15), entre otros; así como a factores inherentes al individuo como género, raza, peso, y la alimentación (10). El color oscuro del músculo está relacionado con el mal sangrado de los bovinos y a la baja oxigenación de la mioglobina muscular, la sequedad se presenta por la elevada capacidad de retención de agua por parte de las proteínas sarcoplasmáticas (19,34). Estas carnes por su aspecto oscuro y consistencia dura y seca, son utilizadas para procesos industriales (elaboración de productos cárnicos), disminuyendo su valor comercial (7). En algunos países durante la inspección post-mortem, son decomisadas porque suponen un riesgo sanitario por la migración de microorganismos intestinales a las masas musculares profundas y posterior crecimiento microbiano, disminuyendo de esta forma la vida útil del producto (35). De otra parte, las carnes con elevado pH limitan las posibilidades de exportación y no son aptas para el empacado al vacío (19). Bienestar y su relación con la calidad sensorial de la carne. El transporte puede producir efectos adversos en las características de la canal en variables como el pH, color, textura y la capacidad de retención de agua (34). El pH a su vez influye en el color, la textura, el sabor, la capacidad de retención del agua y la vida útil de la carne; siendo el color de la carne una de las más importantes características que orientan la decisión de compra de los consumidores (25). Los tiempos de transporte superiores a 16 h y tiempos de espera prolongados reducen de manera marcada la calidad de las canales de novillos, aspecto que se evidencia por un incremento de aproximadamente un 10% en la aparición de carnes clasificadas como corte oscuro (pH≥5.8) y la disminución de peso de la canal (25). El color de la carne está influenciado

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por el nivel de glucógeno muscular antes del sacrificio y este se reduce cuando los animales han sufrido ayuno, produciendo carnes con pH alto y color oscuro, característica que se ve afectada además, cuando se incrementan las interacciones sociales de los bovinos (monta, embestida, empujones, confrontaciones, entre otros) durante el transporte y la estadía en la planta (6,25). Sin embargo, varias investigaciones han demostrado que transportes hasta de 6 h pueden afectar significativamente el pH, la textura, la jugosidad y el color de la carne (34). La terneza o textura de la carne es considerada como el factor más determinante de la satisfacción del consumidor (35). Esta cualidad organoléptica depende de factores biológicos como la especie animal, la edad, el sexo y el tipo de músculo; así como de factores ambientales como la nutrición, el estrés ante-mortem, las condiciones de sacrificio y refrigeración, entre otros aspectos. De otra parte, está asociada con la tasa de glucólisis, la disminución de la temperatura post-mortem y el pHu en los músculos bovinos (36). El máximo valor de dureza de la carne se encuentra en rangos de pH entre 5.8 y 6.3 (35). Aunque se ha reportado el aumento de la terneza en carnes con pH mayores a 6, atribuibles a la actividad de las enzimas calpainas; lo mismo se reporta con pH menores, pero relacionado con la acción proteolítica del músculo bovino (36). Se ha evaluado la relación entre el tiempo de transporte y la calidad de la carne, sugiriendo una relación indirecta, es decir a mayor tiempo menor terneza; asímismo, se ha indicado que cuando las condiciones de manejo durante el transporte son adecuadas, los animales son del mismo sexo, raza y el ambiente social se mantiene estable, no se afecta la calidad instrumental de la carne, pero estas condiciones no son las que predominan en las plantas de beneficio comerciales (6).

EL BIENESTAR ANIMAL EN COLOMBIA A partir del año 2007 se incluyó el concepto de BA en la legislación sanitaria en toda la cadena cárnica bovina. El Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural e Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), lo integraron a la producción primaria mediante la Resolución 002341 de 2007 (28); y durante el transporte hacia las plantas de beneficio: Decretos 3149 de 2006 (37) y 414 de 2007 (38), y la Resolución 002341 de 2007 (28); el Ministerio de la Protección Social en el proceso de faenado en el Decreto 1500 de 2007 (39) y la Resolución 2905 de 2007 (40).

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A pesar de existir una legislación actualizada e integral, investigaciones preliminares aún no publicadas por los autores, han dilucidado que el BA especialmente durante el transporte de animales en Colombia no es una actividad especializada, el diseño de los vehículos, en lo referente a la carrocería y el piso, favorece la presencia de elementos que producen contusiones a los animales, están desprovistos de agua y de sistemas apropiados para la eliminación de excretas. En la planta de sacrificio el diseño de las instalaciones como rampas de descargue, corrales de recepción, áreas de conducción y sistemas de insensibilización no facilita el manejo y el BA. Los bovinos son sometidos a tiempos de transporte prolongado (entre 12 - 24 h) y ayuno excesivo (77 h en promedio). De otra parte, el recurso humano evaluado no ha recibido capacitación específica para el transporte de animales, es generalizado el uso de elementos contundentes para el manejo de los bovinos, no se realiza una planificación del viaje y en general se desconoce el impacto del BA en la calidad e inocuidad de la carne, así como las pérdidas económicas relacionadas con éste. Necesidades de investigacion e implementacion. La investigación debe jugar un papel crucial en la determinación de la eficiencia y la mejora de los métodos de aturdimiento, de instrumentos para evaluar el BA en condiciones de campo y en el desarrollo de nuevos métodos de insensibilización para todas las especies. Con relación a las condiciones de infraestructura, es necesario trabajar en el diseño de equipos e instalaciones para el cargue, descargue y calcetas para movilizar los animales (29). Asímismo, estudios de tamizaje en el área de Metabolómica, transcriptómica y proteómica, para evaluar proteínas y otras moléculas presentes en la célula que pueden ser utilizadas para identificar a nivel celular los efectos del estrés durante el sacrificio y predecir su incidencia sobre la calidad de la carne (41). Otras áreas de interés en donde la academia puede dar aportes importantes al conocimiento del BA se presentan en la tabla 2. Tabla 2. Algunas necesidades de investigación en el ámbito de BA en Colombia. Necesidades de investigación Desarrollo de indicadores estandarizados que reflejen el estado actual de BA en los sistemas productivos. Establecer las condiciones sanitarias reales del transporte y el nivel de implementación de prácticas de BA. Evaluación del estrés mediante mediciones del comportamiento y variables sanguíneas, su relación con la calidad e inocuidad de la carne. Estudios de comportamiento animal bajo condiciones comerciales de manejo. Identificar las principales fuentes de estrés durante el transporte y el sacrificio para detectar necesidades de la industria. Estudios de biología molecular para identificar biomarcadores celulares de estrés.

Con relación a las estrategias requeridas para la implementación de prácticas de BA en la cadena cárnica bovina, la tabla 3 presenta algunas sugerencias que pueden ayudar a esta tarea. Tabla 3. Estrategias para la implementación de prácticas de bienestar animal en la cadena cárnica bovina. Estrategias de mejoramiento Reducir los manejos estresantes en la finca. Implementación de tecnología, prácticas de BA y mejoramiento de la infraestructura de las instalaciones y vehículos. Diseño de acuerdo con el comportamiento de la especie. Incentivos para los productores. Diferenciación de precios. Integrar el BA dentro de las políticas de inocuidad. Capacitación al recurso humano operativo, técnico y profesional. Certificación de transportadores de ganado a través de entrenamiento o acreditación de competencias. Mantenimiento de equipos de aturdimiento y uso de tecnologías que garanticen el BA en esta etapa.

Siendo importante resaltar que uno de los inconvenientes más destacados para la implementación de la normatividad relacionada con el BA tiene que ver con la falta de incentivos para los productores. En la Comunidad Europea y en Estados Unidos los productos obtenidos bajo estos criterios tienen un precio de mercado diferenciado y en este último país las granjas que han adoptado estos criterios reciben subsidios por parte del Estado (42). De otra parte, se requiere el entrenamiento y la capacitación específica del recurso humano responsable del manejo bovino en toda la cadena cárnica, que incluya el reconocimiento de incentivos, la validación de competencias y la certificación de los transportadores de ganado. Varios estudios han demostrado que la experiencia y la habilidad de los conductores reducen las lesiones del ganado durante el transporte (23,27). Es urgente la adopción de infraestructura, equipos y aplicación de lineamientos de diseño sanitario durante el presacrificio. Así como el desarrollo de investigación orientada a la resolución de problemas del medio externo, estrategia que ha demostrado en países como Canadá, Estados Unidos, Australia, Chile Uruguay y España, que es posible transferir conocimiento generado por los investigadores en el ámbito del BA e implementarlo en la producción pecuaria, lo cual ha generado posicionamiento de sus productos en el mercado, valor agregado, y el desarrollo de programas de entrenamiento y capacitación, que han permitido que el sector se fortalezca y mejore su productividad (27,32).

Romero - Bienestar animal durante el transporte y relación con la calidad de la carne En conclusión el BA durante el presacrificio es un requerimiento legal en Colombia y aunque su nivel de implementación es bajo, es necesario fortalecer la investigación en la cadena cárnica bovina, capacitar al recurso humano técnico y profesional, en especial a las nuevas

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generaciones de profesionales relacionadas con la salud y producción animal, mejorar la infraestructura del transporte y beneficio, e integrar este componente a la política de calidad e inocuidad de la carne.

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Revista MVZ Córdoba INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES La revista MVZ Córdoba es el órgano oficial de difusión de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba con periodicidad de publicación semestral y circula en el ámbito internacional. La revista publica (secciones) artículos originales de investigación, artículos técnicos, revisiones de literatura, revisiones de tema, comunicaciones breves, informes de casos y, otros que a juicio del Comité Editorial sean de interés general. Los temas que publica MVZ Córdoba están relacionados con la medicina veterinaria y zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias.

generales descritas abajo. La revista MVZ Córdoba se acoge a los requisitos generales de uniformidad para revistas biomédicas (normas de Vancouver).

“La revista MVZ Córdoba apoya las políticas para registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de esas iniciativas para el registro y divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente se eceptarán para publicación, a partir de 2007, los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por OMS e ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio del ICMJE. El número de identificación se deberá regiostrar al final del resumen”.

1.2. Nombre, apellido del autor o autores: Para el segundo apellido solo se colocará la inicial en mayúscula seguida de coma y el grado académico más alto o el título profesional. Se deberá incluir la filiación institucional de los autores (institución, dirección, ciudad, país). Se deberá indicar además, el responsable de la correspondencia del manuscrito suministrando su correo electrónico.

Los interesados en publicar deberán enviar al Editor una carta remisoria firmada por todos los autores declarando expresamente que el artículo remitido no ha sido publicado previamente y se indicará que los autores no tienen conflicto de intereses. El artículo se deberá enviar por correo electrónico, escrito en procesador de palabras, a doble espacio, con letra verdana a 12 puntos. Las márgenes no deben ser inferiores a 3 cm. y las páginas se numerarán consecutivamente incluyendo todo el material. Se aceptan artículos en español e inglés. Se recomienda observar las guías

1. Presentación: Debe contener la siguiente información: 1.1. Título del artículo: deberá ir en español e inglés. Este último deberá ir debajo del primero dejando doble espacio y en tamaño de letra menor que el principal. El título deberá ser preciso pero informativo y en lo posible no debe superar las 15 palabras.

1.3. Resumen: Deber ser estructurado y será máximo de 250 palabras. Deberá ofrecer una idea clara del contenido del artículo incluyendo: Objetivo, materiales y métodos, resultados y conclusiones. Estas secciones deberán ir con negrilla y luego punto seguido en donde se inicia el texto de cada sección. 1.4 Palabras clave: Son términos cortos que ayudan a la clasificación del artículo. Se sugiere emplear 6 como máximo. Utilice los términos de la lista “Medical subject headings” (MeSH) u otro descriptor acorde con el tema de su investigación. (DeCS, BIREME, NLM, etc.). 1.5 Abstract (resumen traducido al inglés) debe poseer una estructura y contenido igual al de español.

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1.6 Key Words: Palabras clave, deben ser iguales a las de español, pero en idioma ingles. 2. Introducción: Debe indicar claramente e l p r o p ó s i t o d e l a i nv e s t i g a c i ó n , relacionando igualmente en forma selectiva la literatura pertinente. No incluya datos ni conclusiones del trabajo que está dando a conocer. Al finalizar esta sección deberá hacerse con el objetivo general. 3. Materiales y métodos: Se debe describir claramente los procedimientos empleados en la investigación, incluyendo diseño estadístico y análisis de datos. Esta sección deberá ser estructurada indicando tipo de estudio, sitio, condiciones geo-climáticas, coordenadas del sitio de estudio, pacientes o animales de estudio, métodos de laboratorio, aspectos éticos, análisis de resultados, etc. Estas secciones deberán ir con negrilla y luego punto seguido en donde se inicia el texto de cada sección. 4. Resultados: Corresponde a la información de los hallazgos pero sin incluir comentarios ni referencias a otros trabajos. Se sugiere utilizar tablas y figuras, las cuales no deberán ser más de seis en lo posible. 5. Discusión: Es la interpretación de los resultados obtenidos y la contrastación de los mismos con otros estudios. Se debe destacar las limitaciones del estudio e igualmente evitar especulaciones. Resaltar las conclusiones del estudio, así como las recomendaciones para futuras investigaciones. 6. Agradecimientos: Mencionar las personas o instituciones que han colaborado con la investigación (financiera, logística, intelectual, entre otras.). 7. Correspondencia: Nombre completo del autor responsable, dirección laboral y residencial, correo electrónico, teléfono celular y teléfono fijo. Esta información puede ser suministrada en la carta remisoria o en una hoja al final del artículo remitido.

8. R e f e r e n c i a s : D e b e n n u m e r a r s e consecutivamente según el orden en que se mencionen por primera vez en el texto por medio de números arábigos colocados entre paréntesis. La lista de referencias se iniciará en hoja aparte, en estricto orden de aparición en el texto, no será en orden alfabético. Para los artículos originales no se aceptarán más de 30 referencias. Para revisiones de literatura hasta 50 referencias. Para la presentación de casos y comunicaciones breves hasta 12 referencias. Como guía general a continuación se presentan ejemplos de referencias bibliográficas. 8.1. Revistas • Nombre del autor o autores • Título completo del artículo referenciado • Abreviatura internacional del nombre de l a r e vi sta • Año • Vol ume n • Páginas incluidas. Las abreviaturas internacionales pueden consultarse en Journals database de PubMed, C a t a l o g o C 1 7 , DREV, Revistas de biomedicina del IHCD de Valencia. 8.2. Libros y monografías • Autor o editor • Título del libro, lugar de publicación, editorial, año de publicación y páginas consultadas. 8.3. Ejemplos para las referencias bibliográficas según las normas de Vancouver. Artículos de Revistas • Artículos Autor/es. Título del artículo. Abreviatura internacional de la revista, año; volumen (número): página inicial-final del artículo. Ejemplos: Díez Jarilla JL, Cienfuegos Vázquez M, Suárez Salvador E. Ruidos adventicios respiratorios: factores de confusión. Rev MVZ Córdoba 1999; 109: 632-634. • Más de seis autores Martín Cantera C, Córdoba García R, Jane Julio C, Nebot Adell M, Galán Herrera S, Aliaga M et al. Virus and public health J Vet Sci 1997; 109: 744-748.

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• Autor Corporativo Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos amenazantes. Rev MVZ Córdoba 1997; 33: 31-40. • No se indica nombre del autor Cáncer in South África (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16. Los artículos deben escribirse en su idioma original si la grafía es latina. • Suplemento de un volumen Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117. • Suplemento de un número Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma. Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531. • Número sin volumen Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14. • Sin número ni volumen Browell DA, Lennard TW. Inmunologic status of the cancer fish patient and the effects ofblood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33. • Paginación en número romanos Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology. Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII. • Indicación del tipo de artículo según corresponda Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337.

Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN)(abstract). Kidney Int 1992; 42: 1285. • Documentos legales Leyes: Título de la ley. (Nombre del Boletín Oficial, fecha, año de publicación).

Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos Laborales. (Boletín Oficial del Estado, número 269, de 10-11-95). • Mapa Nombre del mapa (tipo de mapa). Lugar de publicación: Editorial; año. Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico). Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003. Material no publicado • En prensa Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007. • Artículo de revista en formato electrónico Autor. Título. Nombre de la revista abreviado (tipo de soporte) año (fecha de acceso); volumen (número): páginas o indicador de extensión. Disponible en: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia. MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/ mmwrhtml/00048303.htm • Monografía en formato electrónico Título. (Tipo de soporte). Editores o productores. Edición. Versión. Lugar de publicación: Editorial; año. Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CD-ROM). Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0. Hagenstown: Lippincolt-Raven; 1997. • Archivo informático Autor. Título. (Tipo de soporte). Versión. Lugar: Editorial; año. • Tesis de Maestría, doctorado y trabajos de grado Autor(es) título, Facultad, Departamento, año. Arrieta G. Producción de Verotoximas en Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

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9. F o t o g r a f í a s : S e p o d r á n u t i l i z a r fotografías, de excelente calidad, digital. La identificación, secuencia y títulos deben establecerse claramente para localizar el lugar que le corresponda en el contenido del artículo. Las fotografías deberán llevar el título de figura. 10. Evaluación de artículos: Los artículos recibidos para publicación, después de constatar que cumplen con las normas expresas de la Revista MVZ Córdoba, serán enviados a pares que conforman el Comité Científico para su respectiva evaluación. En caso de recibir algún manuscrito que por su especialidad de contenido no pueda ser evaluado por los miembros del comité, este será remitido a sendos evaluadores pertenecientes a la comunidad científica nacional o internacional. En la redacción del contenido deberán respetarse las normas internacionales para manuscritos científicos que regulan las abreviaturas, literatura citada, símbolos, n o m e n c l a t u ra s a t ó m i c a s , z o o l ó g i c a s , botánicas, químicas, entre otros. Los valores

deben informarse en unidades del sistema métrico decimal y de acuerdo con el Sistema Internacional de Unidades. La revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba no se responsabilizan por opiniones y resultados expresados por los autores, los cuales serán responsabilidad exclusiva de ellos. Conflicto de intereses. Los autores deben expresar los intereses posibles que posean en el trabajo que realizaron. Correspondencia: Los artículos, consultas, aclaraciones y correspondencia general se deben dirigir a la dirección abajo señalada, sin embargo, también los trabajos pueden ser remitidos en forma electrónica al editor o al coeditor. http:// www.unicordoba.edu.co Comité Editorial REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Teléfonos (094) 756 11 67, 756 07 10 http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/ revistamvz/index.htm Apartado Aéreo 354 Montería - Colombia Editor Marco González Tous. M.Sc. marcog@ escarsa.net.co

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Journal MVZ Córdoba Instructions to the Authors The Journal MVZ Cordoba is the official organ of diffusion of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of the Universidad de Cordoba, is a biannual publication and circulates in the international environment. The magazine publishes (sections) original articles of investigation, technical articles, literature reviews, topic revisions, brief communications, inform of cases and, others that to opinion of the Editorial Committee are from general interest. The topics that the Journal MVZ Cordoba publishes are related with the veterinary medicine and zootechny, aquaculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences and other topics of interest in the agricultural sciences.

Spanish or English. Authors should consult general guides described below. The Journal MVZ Cordoba is welcomed to the general requirements of uniformity for biomedical journals (Norms of Vancouver).

“The Journal MVZ Córdoba follows the policies of the World Health Organization (WHO) and of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) for clinical trial registration, recognizing the importance of those initiatives for international dissemination of information on clinical research, in open access. Accordingly, only articles of trials previously registered in one of the clinical Trial Registries that meet WHO and ICMJE requirements will be accepted for publication, starting in 2007. The list of registries accepted by WHO and ICMJE is available in ICMJE site. The trail registration number should be published at the end of teh abstract”.

1.2. Name: Last name of author(s). For the second name only be placed the first letter in capital followed by coma and each author´s highest academic degree or professional title. It should include the institution affiliation of authors, (Institution Name, address, city, country). It should also indicate the responsible person for the manuscript correspondence (e-mail included).

Interested in publishing will send to the Editor an introductory letter signed by all the authors declaring expressly that the remitted article has not been published previously and that the authors don’t have conflict of interests. Two printed copies will be sent of the article written on any of the programs for word processing, double space, paper size letter, in ink quarter note for a single face of the leaf, with arial letter, font size 12 and C.D. (these originals will not be returned) or by e-mail. Margin should not be inferior to 3 cm and pages will be numbered consecutively including the whole material. Journal accepts papers in either

1. Presentation: It should contain the following information: 1.1. Title of the article: It should be presented in Spanish and English language. The last one should appear below the first one double spaced and with a minor font size that the main one. The Title should be concisely but informative and be of up to 15 words.

1.3 Abstract: Should be structured and of approximately 250 words, indicating the paper’s objective clearly and including: objective, material and methods, results and conclusions. This section should be in boldface and then point followed by the text of the subsequent section. 1.4 Key words: Are short terms. These will be useful to classify the article. List 6 as maximum. Use the terms of the “Medical subject headings” (MeSH) list or another describer in agreement with the topic of their investigation. (DeCS, BIREME, NLM, etc.). 1.5 Abstract (summarize translated to English) it should possess a structure and content similar to the one of Spanish.

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1.6 Key Words: Key words, it should be similar to those of Spanish, but in English language. 2. Introduction: should indicate the paper’s objective clearly, relating equally in selective form the pertinent literature. Do not include data neither conclusions of the work that is giving to know. When concluding this section it will be made with the general objective. 3. Material and Methods: should be described clearly the procedures used in the investigation including statistical design and data analysis. This section should be structured indicating type of study, place, geo-climatic conditions, coordinate of the study place, patients or animals, laboratory methods, ethical aspects, result analysis, etc. These sections should be in boldface then point followed by the text of the subsequent section. 4. Results: Correspond to findings without comments no references to other works. The use of tables and figures is suggested which should be no more of six. 5. Discussion: is the interpretation of the obtained results followed by a comparison with other studies. It should stand out the limitations of the study and equally to avoid speculations. Point out conclusions and suggestions for further research. 6. Acknowledgements: Contributions from people or institutions who have collaborated with the investigation (financial, logistics, intellectual, among others) should appear under “Acknowledgements”. 7. Correspondence: Full names of the responsible author, affiliation address, postal address, cellular and telephone number, email addresses. This information should be include in the remission letter or in a single sheet at the end of the article. 8. References: Will be cited with a number correlative to the order in which they

appear in the text and should be numbered consecutively by means of Arabic numbers placed within parenthesis. The list of references will begin in separate sheets, in strict appearance order in the text; they were not in alphabetical order. Original articles should have no more than 30 references. For literature revisions up to 50 references. Presentation of cases and short communications will have only 12 references. As general guide examples of bibliographical references are given below. 8.1. Journals • Author’s names • Full title of the referenced article • International abbreviation of the journal name • Year • Volume • Included pages. International abbreviation must be search in Journals database of PubMed, Catalogue C17, DREV, Biomedical journals of Valencia IHCD. 8.2. Books and monographs • Author or editor • Title of book, publication place, editorial, year of publication and consulted pages. 8.3.

Examples for the bibliographical references according to the Vancouver norms Journal articles • Articles Author(s). Title of the article. International Abbreviation of the journal, year; volume (number): initial-final page of the article.

Examples: Díez Jarilla J, Cienfuegos Vázquez M, Suárez Salvador E. Ruidos adventicios respiratorios: factores de confusión. Rev MVZ Córdoba 1999; 109: 632-634.

• More than six authors Martín Cantera C, Córdoba García R, Jane Julio C, Nebot Adell M, Galán Herrera S, Aliaga M et al. Virus and public health J Vet Sci 1997; 109: 744-748.

• Corporate author Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos

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amenazantes. Rev MVZ Cordoba 1997; 33: 31-40. • The author’s name is not indicated Cancer in South Africa (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16. The articles should be written in their original language if the graph is Latin. • Supplement of a volume Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117.

• Supplement of a number Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma. Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531. • Number without volume Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14.

• Without number neither volume Browell DA, Lennard TW. Inmunologic status of the cancer fish patient and the effects of blood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33. • Paging in Roman numbers Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology. Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII.

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Unpublished Material • In press Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007.

• Journal article in electronic format Author. Title. Name of the journal in abbreviate form (support type) year (access date); volume (number): pages or extension indicator. Available in: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia. MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/ mmwr/preview/mmwrhtml/00048303. htm

• Indication of the article type as it corresponds Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337. Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN) (abstract). Kidney Int 1992; 42: 1285.

• Legal documents Laws: LawTitle. (Name of the Official Bulletin, date, year of publication). Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos

• Map Name of the map (map type). Publication Place: Editorial; year. Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico). Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003.

• Monograph in electronic format Title. (Support type). Editors or producers. Edition. Version. Publication place: Editorial; year. Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CD-ROM). Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0. Hagenstown: Lippincolt-Raven; 1997.

• Informatics file Author.Title. (support Type). Version. Place: Editorial; year.

• Thesis of Master, Doctorate and under Graduate works Author(s) title, faculty, department, year. Arrieta G. Producción de Verotoximas en Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

9. Photographs: Pictures can be use, of excellent digital quality. The identification,

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(1), Enero - Abril 2012

sequence and titles should settle down clearly to locate the place that corresponds in the content of the article. The photographs will take the title of figure. 10. Evaluation of articles: Those manuscripts submitted to the Journal, after verifying that they fulfill the expressed norms of the Journal MVZ Cordoba will be subject to peer reviews of the Scientific Committee for its evaluation. In the event of receiving some manuscript that by its special content cannot be evaluated by the members of the committee it will be remitted to appraisers belonging to the national or international scientific community. In the writing of the content the international norms will be respected for scientific manuscripts that regulate the abbreviations, mentioned literature, symbols, atomic, zoological, botanical, chemical nomenclatures, among others. The values should be informed in units of the metric decimal system and in accordance with the International System of Units.

The Journal MVZ Cordoba and the Universidad de Córdoba don’t take the responsibility for opinions and results expressed by the authors, which will be exclusive responsibility of them. Conflict of interests. The authors should express the possible interests that possess in the work made by them. Correspondence: Articles, consultations, explanations and general correspondence should be sent to the address below, however, the works can also be remitted in electronic form to the editor or the coeditor. http://www.unicordoba.edu.co Editorial Committee REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Telephones: (094) 7561167, 756 07 10 http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/ revistamvz/index.htm Apartado Aéreo 354 E d i t o r M a r c o G o n z á l e z To u s . M . S c . editormvzcordoba@gmail.com