Rev.MVZ Cordoba 17(3)

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Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba EDITOR

Marco González T. M.Sc. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COEDITOR CO-EDITOR

Salim Máttar V. Ph.D. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

ASISTENTES DEL EDITOR - ASSISTANT EDITORS Luis Carlos Salgado A. Ing. German Arrieta B, M.Sc. Diva Santana C, Lic. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COMITÉ EDITORIAL EDITORIAL COMMITTEE James N. Mills Nelson Alvis G. Raúl Poutou P. Oscar Vergara G.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA U. de Cartagena, Cartagena, Colombia Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá Universidad de Córdoba, Colombia

COMITÉ CIENTIFICO SCIENTIFIC COMMITTEE Nicholas Komar Maria Aguero R. Joaquín Quilez C. Claudio C. Fonseca Priscila V. Logato Marcelo B. Labruna

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA N. Y. Medical College, USA U. de Zaragoza, España U. Fed. de Vioçosa, Brasil U. Fed. de Lavras, Brasil U. de São Paulo, Brasil

Jorge Salazar B. Juan Carulla F. Henry Grajales L. Claudia Jiménez E. Agustin Góngora O. Sandra Pardo C.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

Texas Tech. University U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. de Los Llanos, Colombia U. Nacional, Colombia

Revista MVZ Córdoba La Revista MVZ Córdoba es el órgano oficial de difusión de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba. La revista publica artículos originales de investigación, artículos técnicos, revisiones de literatura, revisiones de tema, comunicaciones breves e informes de casos que a juicio del Comité Editorial sean de interés. Los temas que publica la Revista MVZ Córdoba están relacionados con la medicina veterinaria, zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias. La revista está dirigida a los profesionales de la medicina veterinaria, zootecnia, salud pública humana y animal, acuicultura, biología, ciencias básicas biomédicas y biotecnología.

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Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba

Categoría A1 Impresa desde Volumen 1, número 1, año 1994 Printed effective with Volume 1, issue 1, 1994 Publicación cuatrimestral Published triannualy ISSN 0122-0268 Rev.MVZ Córdoba © 2012 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.

Financiada por / Sponsored by: Universidad de Córdoba

Revista MVZ Córdoba Volumen 17

SEPTIEMBRE - DICIEMBRE

Número 3

CONTENIDO EDITORIAL Los evaluadores y su compromiso con la academia Marco González, Salim Mattar

3103

ORIGINAL Consumo, digestibilidad, y comportamiento ingestivo del ganado alimentado con diferentes niveles de torta de palma

Ana Fereira, Ronaldo Lopes, Adriana Regina, Gleidson Giordano, Raimundo Nunes, Paulo Andrade

Lipofundin 20% induce peroxidación lipídica hepática en conejos Nueva Zelanda blancos Livan Delgado, Ángela Fraga, María Bécquer, Ana Vázquez

3105 3113

Anticuerpos séricos contra la enfermedad de Newcastle e Influenza Aviar en aves rapaces de Chile

Daniel González-Acuña, Álvaro Gaete, Lucila Moreno, Karen Ardiles, Fabiola Cerda-Leal, Christian Mathieu, René Ortega

3118

Efecto nutracéutico del Anacardium occidentale en dietas de pollitas ponedoras de reemplazo Yordan Martínez, Orlando Martínez, Edwin Olmos S, Sandra Siza, César Betancur

3125

Efecto de la liberación controlada de nitrógeno sobre la fermentación y la degradabilidad in situ de Cynodon dactylon Álvaro Ojeda, Miguel Reyes, Williams Rodríguez

Efecto del nivel proteico de la dieta sobre el desarrollo de juveniles de Macrobrachium tenellun (Smith 1871) Luis Espinosa, Carlos Flores, Héctor Nolasco, Olimpia Carrillo, Fernando Vega

Aspectos preliminares del manejo reproductivo en cautiverio de la doncella (Ageneiosus pardalis Lütken, 1874) Pedro Contreras, Beatriz Zapata, Rafael Rosado

Evaluación ultrasonografica de las medidas dorsales y de anca y su relación con metabolitos lipícos en ganado Brahman Néstor Villa, Paulo Duque, Arabia Bermúdez, Ariel Jiménez, Alejandro Ceballos

Identificación de agentes infecciosos asociados con Diarrea Neonatal Bovina en la Sabana de Bogotá Dolly Pardo, Olimpo Oliver

Evaluación de métodos de extracción de ADN para detección de Listeria monocytogenes en productos cárnicos Lina López, Carlos Mejía

3133

3140

3147

3154

3162

3169

Revista MVZ Córdoba Volumen 17

SEPTIEMBRE - DICIEMBRE

Número 3

Actividad antibacteriana de la cáscara de cacao, Theobroma cacao L Oscar Cuéllar, Gloria Guerrero

Comparación de métodos para la determinación del valor energético de alimentos para rumiantes Sandra Posada, Ricardo Noguera, Norberto Rodríguez, Ana Costa

Murciélagos del área urbana en la ciudad de Montería, Córdoba - Colombia Jesús Ballesteros, Javier Racero

Respuesta productiva de gallinas semipesadas inducidas al descanso ovárico en diferentes edades Luis Galeano, Mónica Estrada, Luis Restrepo, Juan Sorza

Implantación de hidroxiapatita-lignina en canal medular de conejos: evaluación macroscópica y difractográfica Mastoby Martinez, Andrea Pacheco, Mauricio Fontes

Ecología trófica del Liso (Rhamdia quelen Quoy & Gaimard, 1824) en el río Sinú, Colombia Charles Olaya-Nieto, Liliana Pacheco-Orozco, Julieth Ochoa-Arteaga

3176

3184

3193

3200

3209

3217

Títulos de anticuerpos contra Leptospira sp. en primates del zoológico Matecaña, Pereira, Colombia Marlyn Romero, Miryam Astudillo, Jorge Sánchez, Lina González, Néstor Varela

3224

COMUNICACIÓN BREVE Efectos de la sobredosificación con láser de arseniuro de galio sobre el cuádriceps de ratas Mónica Mercado, Cristina Pallares, Sebastián González, Marcelo Toledo

Evaluación de tres dietas con harina de hoja de bore (Alocasia macrorrhiza) en pollos de engorde Fredy López, Alex Caicedo, Gustavo Alegría

3230

3236

CASO CLÍNICO Plasmocitoma extramedular nasal en un perro Carlos Giraldo, Catalina López, Jorge Carmona

3243

Instrucciones para los autores

3248

Journal MVZ Córdoba Volume 17

SEPTEMBER - DECEMBER

Issue 3

CONTENTS EDITORIAL

The referees and their commitment to the academy Marco González, Salim Mattar

3103

ORIGINALS Intake, digestibility and intake behaviour in cattle fed different levels of palm kernel cake

Ana Fereira, Ronaldo Lopes, Adriana Regina, Gleidson Giordano, Raimundo Nunes, Paulo Andrade

Lipofundin 20% induces hepatic lipid peroxidation in New Zealand white rabbits Livan Delgado, Ángela Fraga, María Bécquer, Ana Vázquez

3105

3113

Serum antibodies against Newcastle disease and Avian Influenza in birds of pley in Chile

Daniel González-Acuña, Álvaro Gaete, Lucila Moreno, Karen Ardiles, Fabiola Cerda-Leal, Christian Mathieu, René Ortega

3118

Nutraceutical effect of Anacardium occidentale in diets of replacement laying pullets Yordan Martínez, Orlando Martínez, Edwin Olmos S, Sandra Siza, César Betancur

Effect of controlled-release of nitrogen on fermentation and in situ digestibility of Cynodon dactylon Álvaro Ojeda, Miguel Reyes, Williams Rodríguez

Effect of dietary protein level on the development of juveniles of Macrobrachiun tenellum (Smith, 1871) Luis Espinosa, Carlos Flores, Héctor Nolasco, Olimpia Carrillo, Fernando Vega

Preliminary aspects of the reproductive handling in captivity of doncella (Ageneiosus pardalis Lütken, 1874) Pedro Contreras, Beatriz Zapata, Rafael Rosado

Ultrasonographic evaluation of back and hip measurements and their relationship to lipid profile in Brahman cattle Néstor Villa, Paulo Duque, Arabia Bermúdez, Ariel Jiménez, Alejandro Ceballos

Identification of infectious agents associated with Bovine Neonatal Diarrhea in the Sabana de Bogotá Dolly Pardo, Olimpo Oliver

Evaluation of DNA extraction methods for detection of Listeria monocytogenes in meat products Lina López, Carlos Mejía

3125 3133

3140

3147

3154

3162

3169

Journal MVZ Córdoba Volume 17

SEPTEMBER - DECEMBER

Antibacterial activity of the cacao bean husk, Theobroma cacao L Oscar Cuéllar, Gloria Guerrero

Comparison of methods to determine the energy value of feeds for ruminants Sandra Posada, Ricardo Noguera, Norberto Rodríguez, Ana Costa

Urban bats from the city of Monteria, Cordoba - Colombia Jesús Ballesteros, Javier Racero

The productive performance of brown egg-laying hens induced to molt at different ages Luis Galeano, Mónica Estrada, Luis Restrepo, Juan Sorza

Implantation of hydroxyapatite-lignin in the medullary canal of rabbits: macroscopic and difractografic evaluation Mastoby Martinez, Andrea Pacheco, Mauricio Fontes

Trophic ecology of Liso (Rhamdia quelen Quoy & Gaimard, 1824) in the Sinu river, Colombia Charles Olaya-Nieto, Liliana Pacheco-Orozco, Julieth Ochoa-Arteaga

Antibody titers against Leptospira sp. in primates from Matecaña zoo, Pereira, Colombia Marlyn Romero, Miryam Astudillo, Jorge Sánchez, Lina González, Néstor Varela

Issue 3 3176 3184

3193 3200

3209

3217

3224

SHORT COMMUNICATION Effects of gallium arsenide laser irradiation overdose on the quadriceps of rats Mónica Mercado, Cristina Pallares, Sebastián González, Marcelo Toledo

Evaluation of three bore leaf meal (Alocasia macrorrhiza) diets in broilers Fredy López, Alex Caicedo, Gustavo Alegría

3230

3236

CLINICAL CASE Nasal extramedular plasmacytoma in a dog Carlos Giraldo, Catalina López, Jorge Carmona

3243

Instructions to the authors

3248

Rev.MVZ Córdoba 17(3):3103-3104, 2012.

EDITORIAL

Los evaluadores y su compromiso con la academia The referees and their commitment to the academy Como es conocido por todos los involucrados en la publicación de artículos científicos o manuscritos, hoy también llamados “compuscritos”, el proceso de revisión de los mismos es fundamental para evaluar la calidad científica antes de su posible publicación.

Este procedimiento se conoce como “arbitraje” o “juicio de pares o evaluadores” ya que en el proceso intervienen dos o más investigadores o científicos expertos en una temática específica, a quienes justamente se les denomina árbitros (referees), pares, revisores o evaluadores, con gran responsabilidad en el juzgamiento de la calidad de los manuscritos que se van a publicar en caso de que ellos sean aprobados. Los árbitros pueden aprobar un manuscrito en términos generales tal como está escrito, aprobarlo con modificaciones menores o mayores y definitivamente pueden rechazarlo. En todos los casos los autores deberán adelantar las correcciones hechas por los árbitros, las cuales deberán ser revisadas y comprobadas por el editor, quien previamente pedirá la relación de las mismas de acuerdo con el número de árbitros que hayan participado, así como algunas claves que ayuden a identificar las modificaciones. Teniendo en cuenta que mínimo deben ser dos árbitros los que participen en el proceso, en caso de recibir un rechazo, el editor deberá solicitar otro concepto o más si es necesario para definir la aprobación o rechazo final del manuscrito en cuestión (1).

Es pertinente resaltar que al momento de enviar los manuscritos a los árbitros, estos no llevan el nombre o nombres del autor o autores, filiación institucional, fuentes de financiación, agradecimientos o cualquier información adicional que pueda ayudar a la identificación del autor o los autores. Por otra parte, los autores tampoco conocen en ningún momento del proceso de sometimiento los nombres de los árbitros asignados.

Cuando el editor recibe el concepto o dictamen del manuscrito por parte de los árbitros, el editor informa al autor los resultados de la evaluación sin revelar los nombres de los mismos. De todas maneras existe la posibilidad de que las partes intervinientes (autores, árbitros, lectores) hagan hipótesis o cábalas, sobre quien o quienes son los autores o los árbitros, en especial cuando esta responsabilidad recae exclusivamente en los miembros de un comité editorial numeroso. Por esta razón, es preferible un comité editorial de un reducido número de miembros y recurrir a evaluadores externos y ojalá internacionales. También es conveniente cuando la revista es multitemática como es el caso de la Rev.MVZ Córdoba que publica temas que estén relacionados con la medicina veterinaria, zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias. Esta misma característica per se obliga a la utilización de árbitros de diversas disciplinas, los cuales sería imposible reunirlos en un comité editorial.

3105

3104

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

Los árbitros o pares deben reunir una serie de condiciones y características generales.

Una de ellas, condición sine qua non, es que primero se es investigador y luego par o árbitro. Adicionalmente, los árbitros o evaluadores deben ser imparciales, deben evitar divulgar y utilizar material inédito de las investigaciones para uso propio o de otros grupos de investigación, deben mantener absoluta confidencialidad de la información inédita que les llega, deben estar activos publicando manuscritos, al menos durante los dos últimos años al momento de participar en un arbitraje y deben ostentar grados de M.Sc., o mejor aun de Ph.D. En sus informes o fichas de evaluación deben pronunciarse sobre las virtudes o méritos del trabajo, así como los defectos o debilidades y sugerir, en caso de ser posible, la forma de mejorar el manuscrito arbitrado. Tampoco es ético hacer ningún tipo de comentarios con otros investigadores sobre el manuscrito evaluado, bien sea a favor o en contra del mismo (2).

Indudablemente el papel que tienen los árbitros, pares o evaluadores en el proceso de sometimiento de manuscritos en una revista científica es insustituible, y ellos, definitivamente colaboran tanto con autores, editores y lectores, pues estos últimos son los usuarios de la información que se publica (1). Creemos que nadie duda la importancia de la revisión de los manuscritos por expertos y hoy día es una herramienta reconocida como un buen método para evaluar y quizás garantizar la calidad de la publicación de los resultados de las investigaciones. No obstante, también es posible que se cometan errores y no todo lo que se publique sea válido, existe por tanto, la posibilidad de estar o no de acuerdo con lo publicado. ¿Donde están los árbitros, pares o evaluadores? No es fácil conseguirlos, pues por su condición sine qua non de investigadores, siempre están ocupados, llenos de mucho trabajo y cumpliendo con múltiples compromisos, y a pesar de ello, logramos conseguir la colaboración de un gran número de ellos. Nuestros reconocimientos por su loable labor.

Marco González T. M.Sc. Salim Mattar V. Ph.D.

REFERENCIAS 1. Maria Palucci Marziale. El papel del investigador como productor y evaluador de artículos científicos. [En Linea]. Rev. Latino-Am. Enfermagem 2012; 20(2).

URL Disponible en: http://www.scielo.br/ pdf/rlae/v20n2/es_01.pdf

2. J. Gérvas, M. Pérez Fernández. La revisión por pares en las revistas científicas.

Atención Primaria 2001; 27(6):432-439.

URL Disponible en: http://es.scribd.com/ doc/36312468/La-Revision-Por-Pares-enLas-Revistas-Cientificas

Rev.MVZ Córdoba 17(3):3105-3112, 2012.

ORIGINAL

Intake, digestibility and intake behaviour in cattle fed different levels of palm kernel cake Consumo, digestibilidad, y comportamiento ingestivo del ganado alimentado con diferentes niveles de torta de palma Ana Carolina Fereira,1* M.Sc, Ronaldo Lopes O,1 Ph.D, Adriana Regina B,2 Ph.D, Gleidson Giordano Pinto de C,1 Ph.D, Raimundo Nunes Vaz S,1 Ph.D, Paulo Andrade O,2 M.Sc. Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA. Animal Science Dept, EMEV. 2Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, UFRB/Cruz das Almas-BA. *Correspondence: caroltecnia@gmail.com 1

Recibido: Diciembre de 2011; Aceptado: Marzo de 2012.

ABSTRACT Objective. The potential use of palm kernel cake was evaluated as a replacement for soybean and corn meal in cattle feed, by investigating their intake, digestibility levels and the intake behaviour of cattle fed diets containing different levels of palm kernel cake concentrate. Materials and methods.

The experiment was conducted at the Experimental Farm of the Federal University of Bahia, between August and October 2009. Five crossbred Holstein × Zebu adults, were used. A 5 × 5 Latin square experimental design was used. The animals were fed Tifton-85 Bermudagrass, which made up 65% of their diet, plus one of five different levels of palm kernel cake concentrate (0, 7, 14, 21 and 28%).

Results. A linear decrease in dry matter (kg/day) was observed due to the lower palatability and higher fiber content of the palm kernel cake. Neutral detergent fiber intake by the animals showed a quadratic behavior. The coefficients of fractional digestibilities of the analyzed feed, did not differ due to the inclusion of palm kernel cake. The ingestive behavior of the animals was not influenced by the inclusion of palm kernel cake in the diet. Conclusions. Palm kernel cake can be used as an alternative feed supplement in ruminant production systems to reduce feed costs without changes in the studied variables.

Key words: Biodiesel, by-products, feeding, neutral detergent fibre, ruminant (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Se evaluó el uso potencial de la torta de palma como sustituto de harina de soja y harina de maíz en la alimentación del ganado mediante el estudio de su consumo, niveles de digestibilidad y el comportamiento ingestivo de los bovinos alimentados con dietas con diferentes niveles de torta de palmiste. Materiales y métodos. El experimento se realizó en la Granja Experimental de la Universidad Federal de Bahía, entre agosto y octubre de 2009. Cinco animales cruzados Holstein x Cebú, fueron utilizados. Se utilizó un diseño experimental de cuadrado latino 5x5. Los animales fueron alimentados con heno de Tifton-85 Bermuda (65% de la dieta). Además, cinco niveles diferentes de concentrado de palma torta de palmiste (0, 7, 14, 21 y 28%). Resultados. Se observó una

3105

3106

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

disminución lineal en la materia seca (kg/día) debido a la palatabilidad inferior y al contenido de fibra superior de la torta de palmiste. La ingesta de fibra en detergente neutro por los animales mostró un comportamiento de segundo grado. Los coeficientes de digestibilidad fraccional de los alimentos analizados no fueron diferentes debido a la inclusión de la torta de palma. El comportamiento ingestivo de los animales no fue afectado por la inclusión de hasta 28% de torta de palma en la dieta. Conclusiones. La torta de palma se puede utilizar como un suplemento alimenticio alternativo en los sistemas de producción de rumiantes para reducir los costos de alimentación, sin cambios de las variables estudiadas.

Palabras clave: Alimentación, biodiesel, fibra en detergente neutro, rumiantes, subproductos (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

Co-products are used in ruminant feed to minimize production costs. Cakes from the extraction of biodiesel have qualitative characteristics satisfactory for use as a feed supplement. The use of these cakes in animal feed, also prevents the possible inefficient disposal of these wastes and its consequent damage to the environment.

Study site. The experiment was conducted at the Experimental Farm of the Federal University of Bahia, located in São Gonçalo dos Campos, Bahia, in the region of Recôncavo and is characterized by a mean annual temperature of 26ºC, relative humidity of 85%, and annual precipitation of about 1200 mm. This experiment was udertaken during the period between August and October 2009, comprising an experimental period of 55 days.

Palm kernel cake, resulting from the extraction of palm oil, is a good alternative feed for ruminant animals. This ingredient has a high concentration of fiber and protein, thus it can reduce costs and achieve satisfactory animal performance (1).

Assessment of the nutritional value of feed is the basis for the formulation of diets, especially when the incorporation of new feed into ruminant diets is required. Furthermore, knowledge of the amount of dry matter intake is important to ensure the availability of the proper nutrients for an animal’s physiological processes, and consequently productive performance.

The co-products used in traditional feed such as soybean and corn meals can affect the intake and digestibility of feed and microbial activity in the rumen. Thus, consumption and digestibility measures are the most important parameters for assessing the nutritional value of new ingredients (2).

The aim of this study was to evaluate the potential use of palm kernel cake as a feed supplement for cattle and its best level of inclusion in the diet by investigating consumption and digestibility of the feed and intake behaviour and response to bio-climatological variables of Holstein-Zebu cattle.

Animals and treatment. Five crossbred Holstein × Zebu adults were used. These animals were castrated, rumen fistulated and had an average weight of 527 kg ± 41.47.

They were housed in individual pens equipped with feeders and drinkers. At the beginning of the experiment, the animals were dewormed, weighed and identified. The first ten days were used to allow the animals to adapt to the diets and pens. The experiment began shortly after the trial period and consisted of five evaluation periods of 11 days each, the last four of which were used to collect data. The diets consisted of a mixture of roughage, concentrate and minerals, which were formulated to be isonitrogenous (13% CP), with a forage to concentrate ratio of 65:35, as recommended by the NRC (3) for maintenance (Table 1). Mineral salt was offered ad libitum in separate troughs and consisted of 240g Ca, 174g P, 5.270 mg Zn, 2000 mg Mg, 1795 mg Fe, 1.740 mg F, 1.250 mg Cu, 100 mg Co, 90 mg I and 15 mg Se, for each kg of product.

Tifton-85 Bermudagrass was used as forage, comprising 65% of the total diet. The animals were fed at 8:00h and 16:00h, with daily adjustments of 10 to 15% of leftovers.

The forage and concentrate were provided together. Daily consumption was determined by measuring the difference between the feed supplied and the feed left per animal during

3107

Fereira - Intake, digestibility and intake behaviour of cattle Table 1. Chemical composition of the experimental diets.

Ingredients Corn Meal

Analytical Fractions Dry matter Mineral matter1 Ether extract1

Palm Soybean Kernel Meal Cake

Analytical Tifton -85 Hay

86.0

89.5

93.2

83.9

2.8

1.1

2.1

3.2

4.0

5.4

12.2

0.9

15.2

12.5

71.1

75.0

Acid detergent fibre

4.2

11.2

26.1

13.3

Crude protein1

8.0

46.6

13.

8.0

NDIN2

12.8

4.5

20.3

44.8

ADIN2

6.4

3.28

19.3

8.12

70.2

34.1

4.5

19.2

0.9

8.3

8.9

10.9

Neutral detergent fibre1 1

Non-fibrous carbohydrates1 Cellulose1 Hemicellulose1

11.0

1.3

45.0

61.6

Lignin1

3.3

2.9

17.1

2.4

Silica3

-

-

0.4

-

NDIN = Neutral detergent insoluble nitrogen, ADIN = acid detergent insoluble nitrogen.

1 Values expressed in dry matter. 2Values expressed in Total Nitrogen.

3 The analysis of silica was made only for the palm kernel cake

each collection period. A 5×5 Latin square experimental design was used, with five animals and five periods and controlled local factors.

There were five evaluation periods for each of the five treatments, which consisted on the following inclusion levels of palm kernel cake: 0, 7, 14, 21 and 28% (Tables 2 and 3).

Table 2.

Percentages of ingredients in the diet (% DM).

Inclusion Percentage of Palm Kernel Cake 0 (control)

7

14

21

27.4

21.7

15.9

10.1

Soybean meal

6.7

5.4

4.2

Ammonium sulphate

0.1

0.1

0.1

Urea

0.8

0.8

Palm kernel cake

0.0

7.0

65.0

65.0

65.0

Ingredient Corn meal

Hay

2.9

Table 3. Chemical composition of the experimental diets.

28 4.2 1.8

0.1

0.1

0.8

0.8

0.8

14.1

21.1

28.1

65.0

65.0

Samples of leftovers were collected on the last four days of each experimental period and subjected to a pre-drying process in a forced air chamber at 60 ± 5ºC for 72 h. After this, composite sampling was performed and these samples were ground in a Wiley type mill with a 1 mm sieve, and analyzed for dry matter (DM), mineral material (MM), crude protein (CP), ether extract (EE) neutral detergent fiber (NDF), neutral detergent insoluble nitrogen (NDIN) and acid detergent insoluble nitrogen (ADIN) contents according to the methods described by the AOAC (4). The percentage of non-fiber carbohydrates (NFC) was calculated using the equation: NFC (% DM) = 100 - (% MM + % CP + % NDF + % EE) and the analysis of acid detergent fiber

Fractions Dry matter

Inclusion Percentage of Palm Kernel Cake in The Total Diet 0

7

14

21

28

84.9

85.3

85.8

86.3

86.7

Mineral matter

1.0

0.9

0.9

0.9

0.8

Crude protein

13.0

13.0

12.7

12.6

12.4

Ether extract1

2.0

2.6

3.1

3.7

4.3

NDF

53.7

57.7

61.7

65.6

69.6

ADF

10.6

12.0

13.5

14.9

16.4

NIDN2

32.9

33.6

34.2

34.8

35.4

ADIN2

7.2

8.2

9.1

10.1

11.0

23.0

21.2

19.3

17.5

15.6

7.9

8.4

8.8

9.3

9.8

43.1

45.6

48.1

50.6

53.1

NFC Cellulose1 Hemicellulose1 Lignin1 TDN

2.6

3.6

4.6

5.6

6.6

58.6

58.0

56.3

53.4

51.6

NDF = Neutral detergent fibre, ADF = acid detergent fibre, NDIN = neutral detergent insoluble nitrogen, ADIN = acid detergent insoluble nitrogen, NFC = non-fibrous carbohydrates, TDN=total digestible nutrients. 1Values expressed in dry matter. 2Values expressed on Total Nitrogen.

(ADF), hemicellulose, cellulose and lignin contents was conducted according to the methodology described by Silva and Queiroz (5).

Total digestible nutrient levels were obtained through adding the digestible fractions obtained by the equation proposed by Weiss (6): TDN = dCP + dDF × 2.25 + NDF, where dCP, dEE, dNDF are digestible crude protein, digestible ether extract, and digestible neutral detergent fiber, respectively.

In order to determine the amount of fecal dry matter excreted, two stool samples per day were collected during four consecutive days at 8.00 a.m. and 18.00 p.m. as these were the best times for predicting with greater accuracy the fecal dry matter production during the day.

Stool samples, collected from the rectum of each animal, were stored at -20°C until analysis.

The indigestible NDF (iNDF) was used as an internal indicator to estimate the total digestion of dry matter. Samples of the different feeds, leftovers and feces were ground in a 2 mm sieve and incubated in situ in non-woven textile bags made from polyester 100 (100 g of raw material/m² final product) and in rumen cloth bags of tulle sewn with synthetic thread. The percentage of iNDF in the feeds, leftovers and feces was measured after 144 h. The remaining material from incubation was subjected to an extraction with a neutral detergent solution and the residue was considered iNDF. Estimates of fecal excretion was obtained through the equation proposed by Smith and Reid (7): FE = I/[If], where FE (g/day) corresponds to the daily fecal excretion; I (g/day) represents the

3108

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

daily indicator offered/consumed, and [If] represents the concentration of indicator in fecal dry matter (g/g).

On the eighth day of each experimental period the animals were visually observed to assess their feeding behavior by recording the time spent on eating, ruminating and resting. Observations of these activities were made every 5 min for 24 consecutive h.

The observations began at 8.00 p.m. on the day feeding behavior was assessed in each experimental period, and the environment was lit with artificial light for night observations.

Adaption to the night light was allowed during the four days preceding the day of observation.

Counting the number of chews (number/bolus) and recording the time spent ruminating for each bolus was performed by observing six ruminal bolus in two periods of the day, using a stopwatch. The total time spent ruminating was divided by the average time spent ruminating each bolus to obtain the number of cakes ruminated daily. Dry matter intake (DMI) and consumption of neutral detergent fiber (NDF)/cake variables were obtained by dividing the average individual consumption of each fraction by the number of ruminated bolus per day (24 h).

The intake (EI) and rumination (ERU) efficiencies of DM and NDF and total chewing time (TMT min/day) were calculated according to the method described by Burger et al (8), using the following equations: EIDM = DMI/IT; EINDF = NDF/IT; where EIDM is the efficiency of DM intake (g DM intake/h), DMI (g) is the daily intake of dry matter, NDF (g) the intake of NDF, and IT the time spent on the daily intake; REDM = DMI/RT; RENDF = NDF/RT, where REDM is the rumination efficiency of DM (g DM cud/h), RT is the daily time spent ruminating (h), RENDF is the rumination efficiency of NDF (NDF ruminated g/h), and RT is the time spent ruminating daily: TCT: + TI + RT; where TCT is the total chewing time (min/day).

Data analysis. The variables were subjected to variance and regression analysis using the Statistical Package for Social Sciences - SPSS (9), and a 5% level of significance. Linear and quadratic models were studied. Coefficient of determination (R2), p-values of t-test for regression parameters were used as criterion for choose the best fit.

RESULTS A linear decrease in dry matter intake was observed (p<0.05) (Table 4), which yielded an intake average reduction of 1.37 kg per day for each 7% palm kernel cake included in the total diet. A linear decrease (p<0.05) was observed for crude protein.

Despite the high levels of EE found in the palm kernel cake (Table 1), the consumption of this fraction was not altered by inclusion of the cake due to the low consumption of the concentrate.

The NFC intake, expressed as g/animal/day, % BW and g/kg MW (metabolic weight), was reduced (p<0.05) by the inclusion of palm kernel cake (Table 4) due to the reduction of nutrient contents in the diet (Table 3) and the reduction of DM intake.

Table 4. Average daily intake values of the nutritional fractions by cattle fed different levels of palm kernel cake, produced in the biodiesel extraction process, in the total diet.

Intake

Inclusion Percentage of Palm Cake 0

7

14

21

kg/day

12.54

11.93

12.10

8.12

% LW

2.35

2.26

2.28

1.47

108.78

71.26

Effect

28

R2

L

Q

7.22

*

NS

0.54

1.34

*

NS

0.82

63.56

*

NS

0.52

Dry matter (DM)

g/kg MW 110.65 110.13

Crude protein (CP) kg/day

1.22

1.15

1.02

0.60

0.35

*

NS

0.82

% LW

0.23

0.22

0.19

0.11

0.07

*

NS

0.71

10.88

10.53

9.30

5.49

3.39

*

NS

0.75

g/kg MW

Ether extract (EE) kg/day

0.52

0.82

1.02

0.84

1.03

NS

NS

-

% LW

0.10

0.15

0.19

0.16

0.19

NS

NS

-

g/kg MW

4.56

7.52

9.25

7.69

9.35

NS

NS

-

Neutral detergent fiber (NDF) kg/day

8.25

8.71

9.38

7.62

6.06

NS

*

0.51

% LW

1.56

1.64

1.77

1.64

1.14

NS

*

0.50

99.10

97.38

85.47

86.20

59.70

NS

*

0.51

g/kg MW

Non-fibrous carbohydrates (NFC) kg/day

2.45

1.25

0.68

0.32

0.11

*

NS

0.86

% LW

0.46

0.24

0.13

0.06

0.02

*

NS

0.53

g/kg MW

4.83

1.93

0.85

0.52

0.28

*

NS

0.93

Total Digestible Nutrients (TDN) kg/day

8.96

8.99

9.10

6.87

6.00

*

NS

0.40

% LW

1.69

1.70

1.72

1.30

1.13

*

NS

0.40

79.38

82.58

82.16

62.81

53.82

*

NS

0.37

g/kg MW

L= Linear effect, Q = quadratic effect, NS = not significant, *significant at 5% probability.

DM(kg/day)= Ŷ= - 0.0747x + 3.27604; CP = Ŷ= -0.03810x + 1.94984; NDF = Ŷ= -0.00820x2 + 0.15616x + 6.24002; NFC = Ŷ = -0.0665x + 3.35852; TDN = Ŷ = -0.04020x + 9.5928.

3109

Fereira - Intake, digestibility and intake behaviour of cattle The apparent digestibility of total dry matter, crude protein, ether extract, neutral detergent fiber and non-fibrous carbohydrates did not differ (p>0.05) due to the inclusion of palm kernel cake (Table 5).

In relation to the behavioral activities of the animals, feeding, ruminating and resting activities (Table 6) were not influenced by the inclusion of up to 28% palm kernel cake in the concentrate (p>0.05).

The number of chews per bolus also was not influenced by the inclusion of palm kernel cake.

A quadratic behavior was found for RENDF at the higher cake inclusion of 10.99% and linear downwards trends for EDMI, ENDFI and REDM (Table 6).

DISCUSSION The decrease observed in intake of the palm kernel cake (Table 4) can be explained by the lower acceptability and the high fiber content of the cake. The content of neutral detergent fiber in the diet can reduce consumption primarily because of physical limitations, and this fraction in the palm kernel cake contained 70% of the DM in the feed. Moreover, the presence of small crystallized particles in this ingredient is evidence of the presence of silica, which is one of the factors responsible for reducing consumption of diets containing palm kernel cake. According to Van Soest (10), silica is a structural element present in most products and industrial by-products such as lignin, and thus can reduce fuel consumption and affect the digestibility of cell walls. According to the same author, silica is typically present when the ash content is greater than 2%. Palm kernel cake used in this study contained 0.46% silica,

Table 5. Apparent digestibility coefficients of the nutrients in the total diets containing different levels of palm kernel cake, originating from biodiesel production, in Holstein × Zebu cattle.

Coefficient of Digestibility (%)

Inclusion Percentage of Palm Kernel Cake 0

7

Dry matter

76.1

Crude protein

83.4

Effect

14

21

28

74.7

73.1

69.3

83.0

83.9

85.3

CV (%)

L

Q

76.2

NS

NS

13.6

82.6

NS

NS

7.4

Ether extract

80.8

87.1

81.6

91.6

82.5

NS

NS

9.7

NDF

70.5

70.8

70.1

71.1

72.6

NS

NS

14.5

NFC

94.3

93.3

94.7

88.5

89.9

NS

NS

6.3

NDF = Neutral Detergent Fiber, NFC = non fibrous carbohydrates. L= linear effect, Q = quadratic effect. NS = Not significant, p < 0.01. CV= coefficient of variation.

Table 6. Feeding behaviour parameters of Holstein-Zebu cattle fed diets with different levels of palm kernel cake that originated from biodiesel production.

Item

Inclusion Percentage of Palm Kernel Cake 0

7

14

21

28

14.6

13.1

15.5

14.6

17.4

Feeding (min/day)

354.0

359.0

379.0

359.0

Rumination (min/day)

523.0

553.0

493.0

Idle (min/day)

563.0

528.0

568.0

Ruminated meal (no./day)

566.4

601.1

55.4

EDMI (g DM/h)1

CV%

Effect L

Q

13.3

NS

NS

348.0

15.5

NS

NS

505.0

455.0

13.0

NS

NS

576.0

637.0

11.7

NS

NS

524.5

573.9

498.2

14.9

NS

NS

55.2

56.4

52.8

54.8

13.2

NS

NS

2208.5

2010.3

1934.8

1376.1

1222.8

24.8

*

NS

ENDFI (g NDF/h)2

1465.6

1486.2

1536.0

1295.4

1133.0

26.9

*

NS

REDM(g DM/h)

NS

NDFI/meal (g/day) in 24 h

Time chews/meal (s)

1429.4

1317.2

1475.3

923.9

941.4

19.9

*

RENDF (g NDF/h)4

959.2

966.3

1168.60

865.9

825.4

13.8

NS

*

TCT (min/dia)5

877.0

912.0

872.0

864.0

803.0

NS

NS

NS

3

NDFI = Neutral detergent fibre intake; EDMI = Efficiency of dry matter intake; ENDFI = Efficiency of neutral detergent fibre intake; REDM = Rumination efficiency of dry matter; RENDF = Rumination efficiency of neutral detergent fibre; TCT = Total chewing time of cattle fed diets containing different levels of palm kernel cake. NS = not significant, p < 0.01. DM = Dry matter, NDF = Neutral digestible fiber.

1 Ŷ=-13.06780x + 2294.08; 2 Ŷ=-4.84782x + 1552.23800; 3 Ŷ=-6.84667x + 1491.34760; 4 Ŷ=-0.11953x2 + 7.93602x + 925.11440, 5 Ŷ=865.6

3110

REVISTA MVZ CĂ&#x201C;RDOBA â&#x20AC;˘ Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

which probably contributed to the observed reduction in the DM. Reductions in the consumption of diets containing palm kernel cake were also observed by other authors, such as Silva et al (11), who worked with levels of up to 75% in concentrated feed for calves aged between 60 and 120 days, by Macome (12) and Costa et al (13), in experiments with up to 19.50% and 40% palm kernel cake for sheep, respectively, and by Carvalho (14), who assessed levels of 30% of palm kernel cake as feed for goats.

During the experiment, a diet selection by the animals, usually mainly fed hay rather than concentrate, when the levels of palm kernel cake increased, with a subsequent increase in NDF intake too was observed. The NDF intake showed a quadratic behavior (p<0.05), with a maximum consumption of 8.46 kg/day for a 9.5% inclusion of palm kernel cake. At this point, the NDF intake as a function of PV peaked at 1.6%, and ruminal filling caused by fiber was responsible for the reduced consumption of dry matter. The average intake of NDF in the present study was 1.13% of BW (body weight), which is within the range proposed by Van Soest (10) as being ideal, between 0.8% and 1.2% of cow BW, due to the factors previously mentioned.

Correia (15) noted that the inclusion of the latter resulted in the lowest DM intake (p<0.05) compared to others. Similarly, Costa et al (11), who assessed levels of up to 40% palm kernel cake in sheep concentrate, observed that the addition of around 30% cake allowed for greater consumption of the fibrous fractions.

As shown in table 4, a linear decrease (p<0.05) was observed for crude protein. This fact can be explained by the greater selectivity of animals in favor of hay, which contained a lower CP content than palm kernel cake (Table 1), besides the reduction observed in DM, with a resulting reduction in crude protein intake. The average CP intake in this study was 12.83 g/kg BW, which was higher than that proposed by the NRC (3), 3.8 g/kg BW, for cattle maintenance.

The lack of a significant effect on the consumption of EE, the most energetic fraction of the components of TDN, may have contributed to the reduction in TDN intake. This decrease was also reflected by the decrease in DM and NFC, which is capable of releasing a larger amount of energy via microbial fermentation in the rumen, being the fraction with the highest digestibility percentage.

The fact of NFC intake was reduced (p<0.05) by the inclusion of palm kernel cake (Table 4) due to the reduction of nutrient contents in the diet (Table 3) and the reduction of DM intake, are consistent with Nunes (16), who tested levels of up to 19.5% palm kernel cake in the diet.

At this study, no difference in relation to digestibility was found. Others authors Nunes, (16); Ribeiro et al (17), who evaluated palm kernel cake as feed for sheep and cattle, respectively, and no differences in digestibility were found. Besides this, Costa et al (13) also noticed no difference in the digestibility coefficients when using levels of palm kernel cake instead of concentrate for feeding lactating goats and sheep, respectively.

The average digestibility of DM in this study was 74.23%, which is considered high in comparison to the digestibility of by-products of fruit produced in the northeast of Brazil, from 24.12 to 76.97% (18). The absence of an influence of palm kernel cake on the digestibility of the diets may have been due to the high non-fibrous carbohydrate content of corn meal. Even with the reduction of this ingredient as the levels increased the palm kernel cake, corn meal was able to supply enough energy, so a significant effect on the digestibility of DM diets was not observed.

Thus, the high content of fibrous fractions of palm kernel cake at the respective levels in the diet did not interfere with the DM digestibility.

Furthermore, the digestibility of NDF was not affected by the inclusion of palm kernel cake, even though the fiber constituents were different compared to corn and soybean (the treatment with 0% of palm kernel cake), with a higher lignin content (Table 1). The increase in the NDF percentage in the diets with higher levels of palm kernel cake was not reflected in higher intakes of NDF due to the high selectivity of animals fed diets with 21 and 28% palm kernel cake. This also explains why the values of consumption and digestibility of the ether extract showed no significant increase, despite the palm cake having high values of EE (Table 1). These results corroborate those found by Nunes (16), who also found no difference in EE digestibility.

NFC digestibility was not different due to the inclusion of palm kernel cake, as found in a study conducted by Silva et al (19) with the addition of 40% palm kernel cake in the diet of sheep.

Fereira - Intake, digestibility and intake behaviour of cattle The results of behavioral activities are agreement with Carvalho et al (20), who found no differences in feeding behavior with levels of 30% palm kernel cake as feed for goats.

Although the reduction in intake was significant, the higher selectivity of the animals for diets with higher inclusion levels of the cake may have been responsible for the fact that feeding time (min/day) did not change. Although the animals consumed lower amounts of dry matter, they spent more time in selecting the diet.

The times observed for eating, ruminating and idling activities are within the range for standard feeding behavior in confined ruminants. The results were similar to Oliveira et al (21), who worked with cattle in a feedlot. These authors found times of 276 ± 55.8 min/day; 482.4±43.8 min/day and 606 ± 126 min/day for the eating, ruminating and idling activities respectively.

The number of chews per bolus was not influenced by the inclusion of palm kernel cake, averaging 54.92 chews per bolus, which was considered adequate when the ratio of

3111

concentrate:roughage used was taken into account.

According to Carvalho (20), ingestion and rumination efficiencies are primarily affected by the animal`s consumption and can cause implications for time spent on eating, ruminating and resting activities.

The effect of EDMI, ENDI and REDM (Table 6) may be explained by the fact that DMI was also decreased by addition of the palm cake.

The total chewing time was not affected by the inclusion of palm kernel cake: the values found in this study were similar to those obtained

by Correia (15), including 845.62 min/day for steers fed 100% palm kernel cake.

In conclusion, palm kernel cake can replace 28% of the corn and soybean meal concentrate in the total diet without adversely affecting the digestibility of dry feed or the fractions analyzed, with no change in the feeding behavior of the animals. However, the significant reduction in cake consumption in the present study may have implications for productive performance.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3113-3117, 2012.

ORIGINAL

Lipofundin 20% induces hepatic lipid peroxidation in New Zealand white rabbits Lipofundin 20% induce peroxidación lipídica hepática en conejos Nueva Zelanda blancos Livan Delgado R,1* M.Sc, Ángela Fraga P,1 M.Sc, María Bécquer V,1 M.Sc, Ana Vázquez L,2 Ph.D. Center of Studies for Research and Biological Evaluations, Pharmacy and Food Sciences College, University of Havana, Havana 13600, Cuba. 2Center of Molecular Immunology, Havana, Cuba. *Correspondence: ldelgado@ifal.uh.cu 1

Recibido: Septiembre de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

ABSTRACT Objective. The aim of the present work was to evaluate the effects of Lipofundin 20% on lipid peroxidation markers in the liver of New Zealand white rabbits. Materials and methods. The animals were treated with an intravenous injection (2 ml/kg) of the lipid emulsion during 8 days through the marginal ear vein. At the end of the experiment some lipid peroxidation parameters and lipid profile were tested through spectrophotography. Results. Lipofundin was found to induce a significant (p<0.05) increase of malondialdehyde, total hydroperoxides, and peroxidation potential.

Also, high levels of total cholesterol, triglycerides, LDL - cholesterol and HDL-cholesterol were observed in treated animals compared with the control group (p<0.05). Conclusions. Data proved that Lipofundin induces hepatic lipid peroxidation in rabbits, mainly through a mechanism which involves an induction of hyperlipidemia Key words: Hyperlipidemia, Lipofundin, lipid peroxidation, oxidative stress, rabbits (Source: DeCS).

RESUMEN Objetivo. El objetivo del presente trabajo fue evaluar los efectos del lipofundin 20% sobre marcadores hepáticos de peroxidación lipídica en conejos blancos Nueva Zelanda. Materiales y métodos. Los animales fueron tratados con una inyección intravenosa (2 ml/kg) de la emulsión lipídica durante 8 días por la vena marginal de la oreja. Al final del experimento algunos marcadores de peroxidación lipídica y el perfil lipídico fueron espectrofotométricamente determinados. Resultados. Se observó que el lipofundin indujo un incremento significativo (p<0.05) de malonildialdehído, hidroperóxidos totales y el potencial de peroxidación. También, altos niveles de colesterol total, triglicéridos, colesterol de LDL y colesterol de HDL fueron observados en los animales tratados respecto a los del grupo control (p<0.05). Conclusiones. Los resultados demostraron que el Lipofundin 20% induce peroxidación lipídica hepática en conejos, principalmente a través de un mecanismo que involucra la inducción de hiperlipidemia.

Palabras clave: Conejos, estrés oxidativo, hiperlipidemia, lipofundin, peroxidación lipídica (Fuente: DeCS).

3113

3114

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

INTRODUCTION Lipid peroxidation (LPO) was first studied in the 1930’s in relation to food deterioration, but since then, there has been increasing evidence showing the involvement of free radicals in biology, leading to renewed attention on LPO with a wider scope in the fields of chemistry, biochemistry, nutrition and medicine (1,2), amongst others. Further studies revealed that, like proteins, carbohydrates, and nucleic acids, lipids are targets of reactive oxygen species (ROS) and become oxidized to render cytotoxic products (3). Several oxidized products have been studied and also used as LPO biomarkers, such as malondialdehyde (MDA) and lipoperoxides (LOOH) (4).

Artificial fat emulsions are widely used in parenteral nutrition. The soya oil-based fat emulsions represent a major part of energy and are also a necessary source of essential fatty acids in the mentioned therapy (5,6).

Lipofundin 10% constitutes a frequently indicated fat emulsion as a source of calories for patients requiring parenteral nutrition, but preclinical investigations demonstrated that Lipofundin 20% induces atherosclerotic lesion formation in rabbits (7). Our group also demonstrated that this fat emulsion induces a systemic LPO in rabbits (8), but the effects on hepatic LPO have not been assessed.

Therefore, the purpose of the present work is to evaluate the effects of Lipofundin 20% on lipid profile and hepatic biomarkers of LPO in New Zealand White rabbits (NZB).

MATERIALS AND METHODS Animals. Standard NZW male rabbits, weighing 2.0-2.5 kg and 12 weeks old, were obtained from CENPALAB (Mayabeque, Cuba). Rabbits were housed under conventional conditions exposed to a 12 hr light-dark cycle with free access to water and food. Animal studies were performed with approval of the Pharmacy and Food Sciences College Institutional Animal Ethical Committee. All procedures were in accordance with the European Union Guidelines for animal experimentation.

Lipofundin composition. Lipofundin MCT/ LCT 20% (Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany) is a lipid emulsion containing soya oil 100 g, medium-chain triglycerides 100 g, glycerol 25 g, egg lecithin 12 g, α-tocopherol 170 ± 40 mg, and sodium oleate/water for injection in sufficient quantity to 1000 ml.

Experimental design. Two groups of 10 rabbits were used in the study. The first group received an intravenous injection of phosphatebuffered saline solution (PBS), pH 7,4 (control group), and the second one received a slow intravenous injection of 2 ml/kg of Lipofundin MCT/LCT 20%, as an infusion during 1-2 min (7). This procedure was repeated daily during a period of 8 days. On day 9, the animals were anesthetized with ketamine hydrochloride (5 mg/kg i.m.), and euthanized with an overdose of sodium pentobarbital (90 mg/kg, i.v.).

(Abbott Laboratories, México SA de CV, México).

Then, the liver was perfused with NaCl 0.9% solution at 4ºC. Liver homogenate preparation. The hepatic right lobe of each animal was extracted and homogenized in 20mM KCl/histidine buffer, pH 7.4, 1:10 w/v using a tissue homogenizer (Edmund Bühler LBMA, Germany) at 4ºC and centrifuged for 10 min at 12000 g. Supernatants were taken for biochemical determination.

Serum sample collection. Blood samples (1 ml) were obtained on day 0 and 9 (at the end of the study), for biochemical analyses. Blood was withdrawn from the rabbit’s marginal ear vein.

These samples were immediately centrifuged at 2500 g, at 4ºC for 10 min. The serum was collected and aliquots were stored at -80ºC until analysis.

Serum lipid assay.

Total cholesterol, triglycerides, LDL-cholesterol and HDL-cholesterol Serums were determined using commercial enzymatic kits (Randox, Crumlin, UK).

Redox biomarkers determination.

All biochemical parameters were determined through spectrophotometric methods using a Pharmacia 1000 Spectrophotometer (Pharmacia LKB, Uppsala, Sweden). Total protein levels were determined using the method described

by Bradford (9) with bovine albumin serum as standard.

Total hydroperoxides (ROOH) were measured through Bioxytech H2O2-560 kit (Oxis International Inc., Portland, OR, USA). The assay is based on the oxidation of Fe2+ to Fe3+ by hydroperoxides under acidic conditions.

Ferric ions bind with indicator xylenol orange (3.3`-bis(N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl)-o-cresolsulfone-phtalein, sodium salt) to form a stable colored compound, which can be measured at 560 nm.

MDA Concentration was determined using the LPO-586 kit obtained from Calbiochem (La Jolla,

Delgado - Lipofundin 20% induces hepatic lipid peroxidation in New Zealand CA, USA). In the evaluation, the production of a stable chromophore after 40 min of incubation at 45ºC was measured at 586 nm. For control, freshly prepared solutions of malondialdehyde bis [dimethyl acetal] (Sigma St Louis, MO, USA) were employed and evaluated under identical conditions (10).

In order to determine susceptibility to lipid peroxidation and total reactive antioxidant power (TRAP), the samples were incubated with a solution of copper sulphate (final concentration 2 mM) at 37ºC for 24 h. The peroxidation potential (PP) was calculated by subtracting the MDA levels before the induction of LPO from the one obtained at 24h (11).

Statistical analysis. Statistical analysis was performed using the SPSS program for Windows (version 11.5, SPSS Inc). Bartlett’s Box-test was used to test the homogeneity of variance.

Differences between groups were determined by independent student’s t-test (two-tailed).

Data was expressed as the mean ± standard deviation (SD). A P-value <0.05 was considered as statistically significant.

RESULTS Serum total cholesterol, triglycerides, LDLcholesterol and HDL-cholesterol levels showed a significant increase (p<0.05) in those animals who were treated during 8 days with the lipidrich emulsion Lipofundin, compared with the control (Table 1). These parameters were determined on day 0 and statistical differences were not shown (data not shown).

Table 1. Effects of Lipofundin 20% on serum lipids Control group

Lipofundin group

TC, mmol/L

Biomarkers

0.99 ± 0.05

2.89 ± 0.11*

TG, mmol/L

1.21 ± 0.03

2.66 ± 0.09*

HDLc, mmol/L

0.59 ± 0.09

1.18 ± 0.03*

LDLc, mmol/L

0.21 ± 0.03

0.96 ± 0.05*

Legend: The serum lipid levels were similar between groups at the beginning of the experiment, also it was observed no differences of lipid levels between day 0 and 9 in controls (data not shown). Data are the means ± standard deviation. Asterisks represent statistical differences (p<0.05). The samples were tested for triplicate in all performed assays. TC: total cholesterol, TG: triglycerides, HDLc: cholesterol of high-density lipoprotein, LDLc: cholesterol of lowdensity lipoprotein.

Table 2 shows the behavior of hepatic biomarkers of LPO in both groups. The damages on lipids were significantly (p<0.05) modified after 8 days of Lipofundin administration compared to the nontreated group. At the end of the experimental period the MDA levels, one of the end-products of LPO, were higher in lipofundin treated

3115

Table 2. Effects of Lipofundin 20% on hepatic lipid peroxidation biomarkers.

Biomarkers MDA (µmol/L/mgPr) TH (μmol/L/mgPr) PP (μmol/L of MDA/mg Pr)

Control group

Lipofundin group

3.89 ± 0.75

7.63 ± 0.31*

35.27 ± 4.22

67.32 ± 5.89*

5.06 ± 0.48

9.74 ± 0.42*

Legend: Data are the means ± standard deviation. Asterisks represent statistical differences (p<0.05). The concentration of all biomarkers is expressed per milligrams of total proteins (Pr). The samples were tested for triplicate in all performed assays. MDA: malondialdehyde, TH: total hydroperoxides, PP: peroxidation potential.

animals compared with controls. Total ROOH levels were also significantly higher (p<0.05) in the animals that were administered with lipofundin than in non-treated specimens.

Besides, lipofundin treatment also caused an increase in PP compared with the control group (p<0.05).

DISCUSSION After lipofundin administration, high levels of triglycerides, total cholesterol, LDL-cholesterol and HDL-cholesterol serums were observed.

Indeed, there is a causal relationship between elevated plasma lipids and the occurrence of LPO (12).

Lipofundin 20%-induced hyperlipidemia could be associated with the high content of triglycerides in this emulsion. High levels of exogenous triglycerides promote ApoB100 and cholesterol synthesis, and eventually the assembly of very low-density lipoproteins (VLDL) (13). In fact, these results are in accordance with our previous report (8), while it is known that lipofundin 10% caused a 60% increase in total serum cholesterol after parenteral administration in a human study (5).

In addition, there is a mutual lipid and apolipoprotein exchange between serum lipoproteins and infused triglyceride/ phospholipid particles (14). The increase of HDL-cholesterol may be determined by a physiological response against the elevated LDL-cholesterol levels.

This study demonstrated that lipofundininduced hyperlipidemia induces liver oxidative stress. Strong evidence of the involvement of increased free radical production in the onset of hyperlipidemia has been reported previously (15). Also, lipofundin was recently demonstrated to induce an increase of serum lipids in rabbits (7) and in rats (16).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

In vitro LPO mechanisms, dynamics, and products have been studied extensively and are now fairly well understood and documented (17). Lipid hydroperoxides and hydrogen peroxide (H2O2) generated by LPO play a central role in many diseases such as atherosclerosis, mainly during endothelial dysfunction (18).

Transition metals (iron or copper) may produce H2O2 decomposition and cause the generation of the highly toxic and reactive hydroxyl radical (•OH), which reacts with cellular components (19). High ROOH concentration detected in rabbits treated with lipofundin 20% may be a blank for free transition metals attack. ROOH decomposition affects the delicate balance between antioxidants and pro-oxidant factors, which can leads to oxidative stress states.

An increasing MDA level in those animals treated with lipofundin 20% was also detected in this study. Our data is in accordance with the criteria that this end-product of LPO and is strongly associated with the development of hyperlipidemia (20).

Lipofundin-induced high serum lipid levels, especially atherogenic ones such as cholesterol and LDL allow to explain, in part, the fact that these were higher in animals administered with LPO products than in controls. MDA is considered as a major epitope of oxidized LDL (21), suggesting that lipofundin 20% induces an increase in LPO closely associated with an elevation of LDL particles and related ApoB100containing lipoproteins. Also, PP increase in livers from treated rabbits reinforces the criteria that LPO is determinant in the loss of redox hepatic status in former animals which were under Lipofundin 20% treatment.

In conclusion, the present study demonstrated that lipofundin 20% induces hyperlipidemia, thereby promoting hepatic LPO. Our data shows novel evidences of lipofundin-induced oxidative damages on hepatic lipids. These results reinforce the attractive characteristics of lipofundin to be used as an experimental inductor of LPO in rabbits.

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Delgado - Lipofundin 20% induces hepatic lipid peroxidation in New Zealand

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3118-3124, 2012.

ORIGINAL

Anticuerpos séricos contra la enfermedad de Newcastle e Influenza Aviar en aves rapaces de Chile Serum antibodies against Newcastle disease and Avian Influenza in birds of pley in Chile Daniel González-Acuña,1* Ph.D, Álvaro Gaete,1 MV, Lucila Moreno,2 Ph.D, Karen Ardiles,1 MV, Fabiola Cerda-Leal,3 Ph.D, Christian Mathieu,4 MV, René Ortega,1 Ph.D. Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Veterinarias, Chillán, Chile. 2Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas, Concepción, Chile. 3Universidad del Bío-Bío, Departamento de Ingeniería en Alimentos, Campus Chillán, Chile. Avenida Andrés Bello, S/N. Chillán, Chile. 4Servicio Agrícola y Ganadero, Lo Aguirre, Santiago, Chile. *Correspondencia: danigonz@udec.cl 1

Recibido: Septiembre de 2011; Aceptado: Marzo de 2012.

RESUMEN Objetivo. Detectar la presencia de anticuerpos séricos sanguíneos contra los virus de la Enfermedad de Newcastle (ENC) e Influenza aviar (IA), para comprender la contribución de las aves silvestres en la transmisión de estos virus en Chile. Materiales y métodos. Se analizaron 63 aves pertenecientes a los órdenes Falconiformes y Strigiformes desde centros de rehabilitación de aves de las zonas central y sur de Chile. Se realizaron las pruebas de inhibición de la hemoaglutinación (IHA) para detectar anticuerpos contra el virus ENC e inmunodifusión en gel agar (IDGA) y ELISA para IA. Resultados.

Se detectaron 14 aves positivas (22.2%) para anticuerpos séricos contra el virus de la ENC. En cambio, no se registraron anticuerpos séricos sanguíneos para el virus de la IA. Conclusiones. La presencia de aves rapaces positivas en los centros de rescate a los anticuerpos séricos contra el virus de la ENC puede ser explicada por el consumo de carne de pollos que han sido vacunados contra ENC o consumo de aves que han adquirido directamente el virus vacunal a través de los distintos procedimientos de administración (aerosoles, bebederos) de la vacuna o por el ingreso a los centros de rescate de aves rapaces migratorias, las que podrían facilitar la diseminación de la infección desde los países de origen, hecho que debe ser investigado.

Palabras clave: Chile, enfermedad de Newcastle, enfermedades virales, influenza aviar, rapaces (Fuente: DeCS).

3118

González-Acuña - Anticuerpos séricos contra virus de Newcastle e Influencia Aviar

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ABSTRACT Objective. To detect the presence of blood serum antibodies against Newcastle disease (ND) and Avian influenza (AI) viruses, to understand the contribution of wild birds in transmission of these viruses in Chile. Materials and methods. Sixty-three birds belonging to orders Falconiformes and Strigiformes were analyzed from bird rehabilitation centers in central and south-central Chile.

Hemagglutination inhibition (HIA) was used to detect antibodies against the ND virus and further AI virus typing was done by agar gel immune-diffusion (AGID) and ELISA. Results. 14 birds we found (22.2%) with serum antibodies against ND virus; however, there were no blood serum antibodies to AI virus. Conclusions. Birds of prey from rescue centers have been detected positive for serum antibodies against ND virus. Birds of prey could have become positive via direct consumption of chickens vaccinated against ND or from chickens indirectly exposed to the vaccine through different administrative procedures (aerosols, water troughs) or after the admission of migratory birds to rescue centers, which could facilitate the spread of ND from their countries of origin, and should be investigated.

Key words: Chile, influenza in birds, newcastle disease, raptors, virus diseases (Source: DeCS).

INTRODUCCIÓN La enfermedad de Newcastle (ENC) y la Influenza aviar (IA) son importantes patologías que han sido documentadas en distintas partes del mundo, afectando una gran variedad de especies de animales incluyendo aves, reptiles y mamíferos, inclusive al hombre (1, 2). La enfermedad de Newcastle es causada por un virus de la familia Paramyxoviridae, cuyas cepas, han sido clasificadas en cinco grandes grupos basados en la virulencia y el tipo de enfermedad que provocan en las aves de corral (2).

Alrededor de 250 especies de aves son susceptibles al virus de la ENC, como resultado de infecciones naturales o experimentales; hecho que juega un rol importante en la diseminación de este virus (3). Las aves acuáticas son las más resistentes y los reservorios principales del virus; manteniendo cepas avirulentas en el medio ambiente (4). No obstante, varias especies de rapaces son conocidas por ser susceptibles al virus de la ENC, entre las que se mencionan a las familias Falconidae, Accipitridae, Aegypiinae, Cathartidae, Tytonidae y Strigidae de América, Asia y Europa (5-7).

Chile, se encuentra libre de la ENC velogénicaviscerotrópica desde 1975 y mantiene una vigilancia y un plan sistemático de vacunación a las aves domésticas y las ponedoras. Esta condición se reconfirmó en el año 2008, tras un brote ocurrido con una cepa mesogénica para pollos, pero filogenéticamente velogénica, en aves silvestres marinas (cormoranes y piqueros) registrado en la zona costera de la ciudad de Constitución (Región del Maule) (8).

El virus de la influenza aviar pertenece a la familia Orthomyxoviridae, al género influenzavirus (9). Se han descrito tres tipos (A, B y C), clasificados de

acuerdo a las diferencias antigénicas de la proteína de la matriz (M) y la nucleoproteína (NP) (9). El virus tipo A es el que puede causar enfermedad en aves y se ha presentado en cerca de 90 especies dentro de 12 órdenes de aves (10). Sin embargo, son las aves acuáticas, particularmente las especies de los órdenes Anseriformes (patos, gansos y cisnes) (3, 11) y Charadriiformes (gaviotas) (11) las que constituyen el mayor reservorio (3). Por el contrario, los informes de infección del virus de la IA en aves rapaces son escasos (12). A pesar de este hecho, se han reportado rapaces de los órdenes Falconiformes y Strigiformes positivas al virus de la IA en Asia, África y Europa (11, 12). En Chile, en el año 2002 se produjeron dos brotes, limitados a un sólo plantel en la Región de Valparaíso (Chile). En ambos focos, los aislados obtenidos fueron tipificados como H7N3 de alta patogenicidad. La hipótesis de mayor credibilidad fue la presencia de aves acuáticas silvestres migratorias en las cercanías de uno de los sitios donde se produjo el primer brote (13).

Debido a la importancia de conocer el posible rol de las aves rapaces en Chile como potenciales portadores de virus, el presente estudio tuvo como objetivo detectar la presencia de anticuerpos séricos contra los virus de la enfermedad de Newcastle e Influenza aviar, en ejemplares de los órdenes Falconiformes y Strigiformes, en centros de rehabilitación de aves de las zonas central y centro sur de Chile.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de muestreo y recolección de las muestras. Entre los meses de Octubre de 2004 y Diciembre de 2005, se realizó un muestreo

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

dirigido a 63 ejemplares de los órdenes Falconiformes y Strigiformes que ingresaron al Centro de Rescate y Rehabilitación de Fauna Silvestre del campus Chillán de la Universidad de Concepción (36°35’42,21’’S; 72°05’01,39’’O), al Centro de Rehabilitación de Aves Rapaces de Talagante (33º39’59,51’’S; 70º55’20,05’’O) y al Zoológico de Quilpué (33º02’25,33’’S; 71º27’05,03’’O). A cada ave, se le realizó un examen físico completo, incluyendo peso y condición corporal, presencia de parásitos y signos clínicos de algún tipo de enfermedad. Se extrajeron muestras de sangre de la vena braquial o vena yugular derecha, dependiendo del tamaño del ave. El suero fue separado por centrifugación (2500 rpm por 10 min.), posteriormente, una cantidad estándar de 0.5 ml de suero fue depositada en tubos microcentrífuga de 1.5 ml, los cuales fueron almacenados a –80°C hasta la realización de las pruebas de diagnóstico en el Laboratorio de Virología Pecuaria del Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) del complejo Lo Aguirre, Santiago (Chile). Las tres pruebas de diagnóstico realizadas fueron: inhibición de la hemoaglutinación (IHA) para la enfermedad de Newcastle e inmunodifusión en gel agar (IDGA) y la prueba de ELISA-MS para Influenza aviar.

Pruebas de diagnóstico. Inhibición de la hemoaglutinación (IHA). Se realizaron los siguientes procedimientos: (i) Preparación del lavado de glóbulos rojos de gallo (Gallus gallus), para esto se colocaron de 3 a 5 ml de sangre de gallo con solución de Alsever en un volumen 1:1 en un tubo de ensayo de 10 ml, completándose con PBS (buffer fosfato salino), luego se centrifugó (10 min/1800 rpm) y se extrajo el sobrenadante. Este procedimiento se repitió en dos ocasiones dejando finalmente sólo los eritrocitos en el tubo de ensayo (14).

Los eritrocitos lavados fueron diluidos y llevados a dos concentraciones, 0.5% (100 μl de sangre lavada en 20 ml de PBS) y 10% (100 μl se sangre lavada en 900 μl de PBS) (14). (ii) Tratamiento de suero problema: con el objeto de eliminar las posibles aglutininas que pueden tener los sueros problemas, en una microplaca de 96 pocillos con fondo en forma de “U”, se adicionó a cada uno de ellos 100 μl de PBS, 50 μl de cada suero problema y finalmente 50 μl de eritrocitos de gallo diluido al 10% con PBS. La placa se incubó a temperatura ambiente por 30 minutos (14), donde finalmente se observó un botón de eritrocitos en el fondo de cada pocillo. (iii) Titulación del antígeno: para realizar el procedimiento de titulación se utilizó un

virus Newcastle lentogénico (cepa La Sota) de referencia para el Laboratorio de Virología Pecuaria del Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) del complejo Lo Aguirre. En una microplaca de 96 pocillos con fondo en forma de “U”, se colocaron 50 μl de PBS en 2 filas de 12 pocillos. Después, se agregaron 50 μl del antígeno en duplicado en los primeros pocillos con una micropipeta multicanal y se realizaron las diluciones del antígeno, seriadas dobles (1:2 hasta 1:2048) hacia la derecha de la microplaca, dejando el último pocillo sin antígeno para que sirva como control de glóbulos rojos. En seguida se agregaron 50 μl de glóbulos rojos de gallo diluidos al 0.5% en cada pocillo, luego se agitó moderadamente la placa para mezclar los reactivos, después se cubrió e incubó a temperatura ambiente por 30 min hasta cuando se formó un botón distinguible en el fondo del pocillo de control de glóbulos rojos (14). El punto final de la titulación es la dilución más alta del antígeno que cause 100% de hemoaglutinación, la cual es considerada como una unidad hemoaglutinante (UHA) (14). Para realizar la prueba de inhibición de la hemoaglutinación (IHA) se necesitan 4 UHA en 25 μl (14). El punto final de la titulación del antígeno fue de 1:1024 (12.7 ml de PBS con 100 μl del antígeno). (iv) Confirmación de unidades hemoaglutinantes: se debió realizar una confirmación de la UHA a partir del antígeno diluido usado en la prueba, comprobando que existan 4 UHA en 25 μl. Posteriormente, se agregaron 50 μl de PBS a 8 pocillos. Luego se adicionaron 50 μl del antígeno diluido al primer pocillo y se realizaron diluciones dobles hasta el último pocillo. Posteriormente, se agregaron 50 μl de glóbulos rojos de gallo al 0.5% (15). Se dejó una columna control de glóbulos rojos, donde se agregaron a cada pocillo, 50 μl de PBS y 50 μl de glóbulos rojos de gallo al 0.5%. La placa se incubó a temperatura ambiente hasta que se formó un botón distinguible en el fondo del pocillo de control de glóbulos rojos. El resultado de la confirmación de UHA, se distinguió con una zona nubosa (de aglutinación) en cada pocillo. (v) Procedimiento de la prueba de IHA: consistió en agregar 25 μl del antígeno apropiado (4 UHA en 25 μl), obtenidos de 12.7 ml de PBS con 100 μl del antígeno, a todos los pocillos de la microplaca de fondo en forma de “U”. Luego se agregaron 25 μl de cada suero pre-tratado en los 12 pocillos de la primera fila de la microplaca de fondo en forma de “U” y luego se realizaron diluciones seriadas desde la primera hasta la última columna (14). Además, se incluyó un pocillo control de sueros para detectar

González-Acuña - Anticuerpos séricos contra virus de Newcastle e Influencia Aviar si persisten aglutininas no específicas. Este pocillo control contenía 25 μl de PBS y 25 μl del suero tratado, luego se incubaron las placas a temperatura ambiente por 10 a 15 minutos y se agregaron a cada pocillo 50 μl de glóbulos rojos de gallo al 0.5%. Se cubrió la placa y finalmente se agitó e incubó a temperatura ambiente por 25 a 30 minutos para obtener los resultados finales (14).

Inmunodifusión en gel Agar (IDGA). El antígeno (cod. 136-ADV) y el suero control positivo (cod. 433-ADV) fueron suministrados por el laboratorio de referencia Diagnostic Virology Laboratory (DVL), National Veterinary Services Laboratory (NVSL) pertenecientes al United States Department of Agriculture (USDA), Estados Unidos. En una placa Petri con gel agarosa (0.9%) se procedió a realizar cinco moldes de siete pocillos cada uno, utilizando una roseta, a los cuales se les extrajo el agar con una bomba de vacío dejando así los pocillos listos para su llenado. Se le adicionaron 32 µl de la muestra problema (suero) en pocillos alternos y 32 µl del suero control positivo en los posillos alternos restantes. Posteriormente, se incubó la placa Petri a 37°C en la cámara de humedad por 24 horas, para finalmente observar la presencia o ausencia de bandas de precipitación en gel agar.

ELISA. Para la realización de la prueba de ELISA, se utilizó el kit Flockchek®, IDEXX para IA (según indicaciones del fabricante).

RESULTADOS De los 63 sueros analizados, 14 (22.22%) resultaron positivos a anticuerpos contra Paramixovirus-1, serotipo causante de la ENC. De éstas, 5 (7.9%) pertenecieron al órden Falconiforme y 9 (14.3%) a Strigiforme (Tabla 1). El detalle de las especies seropositivas fueron: tres águilas (Geranoaetus melanoleucus), un peuco (Parabuteu unicinctus), un traro (Caracara plancus), siete tucúqueres (Bubo magallanicus), un nuco (Asio flammeus) y una lechuza (Tyto alba).

En dos muestras de tucúqueres (B. magallanicus) y una muestra de nuco (A. flammeus) se obtuvieron títulos de 1:16, 1:64 y 1:32 respectivamente. Estas tres especies, provenientes del Centro de Rescate y Rehabilitación de Fauna Silvestre del campus Chillán de la Universidad de Concepción, se encontraban vivas sin haber presentado en todo el tiempo que se les mantuvo en dicho centro, algún signo clínico para la Enfermedad de Newcastle.

3121

Tabla 1. Especies seropositivas a la Enfermedad de Newcastle, procedencia y título a la prueba de diagnóstico Inhibición de la Hemoaglutinación (IHA).

Procedencia

Título a la IHA

Tucúquere (B. magallanicus)

Chillán1

1:16

Tucúquere (B. magallanicus)

Chillán1

1:64

Nuco (A. flameus)

Chillán1

1:32

Lechuza (T. alba)

Talagante2

1:8

Tucúquere (B. magallanicus)

Talagante2

1:16

Tucúquere (B. magallanicus)

Talagante2

1:32

Tucúquere (B. magallanicus)

Talagante2

1:32

Tucúquere (B. magallanicus)

Talagante

1:32

Tucúquere (B. magallanicus)

Talagante2

1:128

Águila (G. melanoleucus)

Talagante2

1:8

Águila (G. melanoleucus)

Talagante2

1:8

Águila (G. melanoleucus)

Talagante2

1:32

Talagante2

1:8

Zoológico de Quilpue

1:8

Especies seropositivas

Traro (C. plancus) Peuco (P. unicinctus)

2

(C.E.R.E.F.A.S. U. de C. Chillán): Centro de Rescate y Rehabilitación de Fauna Silvestre del campus Chillán de la Universidad de Concepción.

2 (C.R.A.R Talagante): Centro de Rehabilitación de Aves Rapaces de Talagante.

1

En el Centro de Rehabilitación de Aves Rapaces de Talagante se obtuvo muestras positivas de las siguientes aves: una lechuza (T. alba) (1:8); cinco ejemplares de tucúqueres (B. magallanicus) (1:16, 1:32, 1:32, 1:32 y 1:128), tres águilas (G. melanoleucus) (1:8, 1:8 y 1:32) y un traro (C. plancus) (1:8). Las diez aves no presentaron ningún síntoma clínico a la enfermedad al momento de tomar la muestra sanguínea.

Se obtuvo una muestra positiva de peuco (P. unicinctus) (1:8) proveniente del Zoológico de Quilpué. Esta ave no presentaba ningún signo clínico cuando se le extrajo la muestra sanguínea (Tabla 1).

Los 63 sueros analizados frente a la presencia de anticuerpos contra el virus de la Influenza aviar resultaron negativos, tanto por la técnica de IDGA como por la prueba de ELISA.

DISCUSIÓN En el presente estudio se plantean diferentes hipótesis para explicar la seropositividad de las 14 aves. Una de ellas es que los ejemplares seropositivos durante su vida libre o incluso en cautividad, cazaron o recibieron como alimento aves de producción, que se encontraban en un programa de vacunación o aves silvestres

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que tuvieron contacto con la vacuna de los planteles productivos. Es muy común que en zoológicos y centros de rescate se alimente a las aves rapaces con carne de pollo fresca que procede de planteles avícolas, la cual no es sometida a ningún análisis para ENC antes de ser entregada como alimento. Otra hipótesis es que las aves seropositivas hayan adquirido directamente el virus vacunal a través de los distintos procedimientos de administración (aerosoles, bebederos) de la vacuna en las aves productivas. En Chile, los planteles de producción aviar, utilizan vacunas vivas contra la ENC con las cepas La Sota y Hitchner. Se ha reportado la presencia de la cepa La Sota en lechuzas (T. alba) (6), en halcones peregrino (Falco peregrinus) en Europa (16) y en águila calva (Haliaeetus leucocephalus) y búho (Bubo virginianus) en Estados Unidos (5). Esta cepa se considera no patógena tanto para las aves de corral como para aves silvestres (17). Schettler et al (6) presumen que hay vectores, tales como ratones (vector mecánico), que pueden transportar el virus después de haber tenido algún contacto con aves de producción que se encuentren en un programa de vacunación. Considerando que la lechuza (T. alba) y el nuco (Asio flammeus) consumen casi exclusivamente roedores (18), lo que respalda la teoría propuesta por Schettler et al (6). Otra posibilidad para los reaccionantes en ENC se puede deber al contacto que tuvieron las aves con cepas naturalmente lentogénicas que existen en la naturaleza.

La existencia de aves rapaces migratorias en los centros de rescate, es otra posible causa de la presencia de anticuerpos contra la ENC. Las aves migratorias facilitan la diseminación de la infección desde los países de origen (6). Entre las aves rapaces migratorias se destacan el vari ceniciento (Circus cinereus), el aguilucho (Buteo polyosoma), el aguilucho chico (Buteo albigula), el halcón peregrino (Falco peregrinus) y el águila pescadora (Pandion haliaetus) (18), por lo que se asume que las aves analizadas en el presente estudio pudieron tener contacto con estas aves migratorias, asimismo las aves seropositivas procedentes de un determinado centro de rescate, pudieron contagiarse entre ellas.

Se debe tener en consideración, que las aves rapaces por su condición de depredadoras, poseen la capacidad de alimentarse de otras aves (aves ornitófagas), en especial de aves acuáticas, siendo estas el principal reservorio de la ENC (19). Estudios realizados en el peuquito (Accipiter chilensis), por ejemplo, han encontrado en su dieta aves acuáticas como el churrete (Cinclodes patagonicus) (20); por otro lado el peuco (P. unicinctus) caza palomas adultas y pichones (18).

Es por ello, que otra probable explicación a los presentes resultados es que las aves seropositivas, en algún momento de su vida libre capturaron algún ave acuática u otra ave silvestre infectada con el virus de la ENC. La ausencia de signos clínicos de la enfermedad en las aves seropositivas analizadas, signos que dependen de la variedad del virus y del hospedador (2), no llama la atención, ya que el período de incubación del virus de la ENC puede variar de 2 a 15 días (2). Infecciones inaparentes han sido observadas en varias especies de rapaces (Strigiformes y Falconiformes) (21); sin embargo, especies de la Familia Accipitridae han mostrado cursos subagudos a crónicos incluyendo desórdenes del sistema nervioso central, diarrea e inapetencia. Curso agudo y fatal ha sido notificado en halcones y búhos (21).

Los títulos de anticuerpos de los individuos muestreados por la prueba de diagnóstico (IHA) tuvieron un rango de 1:8 a 1:128. En aves de corral, la respuesta obtenida a un virus vacunal lentogénico puede producir títulos en la prueba de IHA de 1:2048 o más (22). Por otro lado, los anticuerpos son generalmente perceptibles en el suero en el plazo desde 6 a 10 días hasta 3 a 4 semanas en pollos (G. gallus) que han tenido la infección y han sobrevivido (2). Aún así, se sigue desconociendo el comportamiento inmunológico en las aves rapaces ante el virus de la ENC, ya que, no se pueden extrapolar los datos de las aves de corral con relación a las aves rapaces (aves silvestres). Queda la incógnita por saber cuál es la cantidad de anticuerpos máximos que pueden ser registrados en las aves rapaces y por cuánto tiempo se mantiene la inmunidad humoral.

El virus de la influenza aviar se encuentra de manera natural en las poblaciones de aves silvestres, donde por lo general se encuentran como subtipos de baja patogenicidad (23). La ausencia de anticuerpos contra la enfermedad de IA en el total de aves analizadas, podría ser explicada por el bajo número de muestras recolectadas, ya que no es un número representativo para descartar la presencia e incidencia de la infección con este virus en las aves rapaces en Chile. Por lo tanto, estos resultados, no nos dan la certeza de que las aves rapaces que habitan el territorio Chileno no estén expuestas a adquirir el virus de la IA, más aún, por la gran cantidad de focos que se han reportado del virus desde fines de 2003 hasta mayo de 2006 principalmente en Asia, África y Europa, con el subtipo H5N1 (HPAI), lo que aumenta el riesgo de diseminación de la enfermedad por el mundo; especialmente cuando la transmisión del virus H5N1 a través

González-Acuña - Anticuerpos séricos contra virus de Newcastle e Influencia Aviar de regiones extensas es posible con la ayuda de las aves migratorias (24).

Teniendo en consideración que la mayoría de especies de aves domésticas y silvestres parecen ser susceptibles al virus de la IA (25), la presencia de un foco de IA altamente patógena en planteles avícolas, de la Región de Valparaíso, Chile, en el año 2002, sugiere el rol epidemiológico tan importante que juegan las aves de vida silvestre que habitan Chile.

En estudios no oficialmente publicados, se ha registrado la existencia de anticuerpos contra el virus de la IA en flamencos (Phoenicoparrus ssp.) en el norte de Chile (Regiones de Arica y Parinacota, Tarapacá y Antofagasta) y en el Zoológico Metropolitano de Santiago (15); además, de un cisne de cuello negro (Cygnus melanocoryphus), en el río Cruces, Región de los Ríos, Chile (4). Se recomienda continuar realizando investigaciones en diferentes especies de aves silvestres para

3123

determinar así el rol que juega el virus IA en términos epidemiológicos, tanto en Chile como en otros países.

Los procesos por los cuales pueden aumentar las infecciones emergentes en la vida salvaje pueden ser por alteraciones naturales o antropogénicas de los ecosistemas (26). Debido a que las aves rapaces son buenos indicadores de la salud de los ecosistemas (27), se propone seguir investigando las posibles consecuencias que podría ocasionar el virus de la ENC e IA en las aves rapaces, ya que además de ser enfermedades zoonóticas, son un reservorio infeccioso para la producción avícola. Se propone realizar estudios de confirmación (aislamiento viral) de la presencia del virus de Newcastle, para comprobar si el virus se mantiene en la población seropositiva estudiada y así mismo conocer el comportamiento de la cepa aislada in vivo.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3125-3132, 2012.

ORIGINAL

Efecto nutracéutico del Anacardium occidentale en dietas de pollitas ponedoras de reemplazo Nutraceutical effect of Anacardium occidentale in diets of replacement laying pullets Yordan Martínez A,1 Ph.D, Orlando Martínez Y,1 Ph.D, Edwin Olmos S,2 MVZ, Sandra Siza I,2 MVZ, César Betancur H,3* M.Sc. Universidad de Granma, Bayamo, Granma. Cuba. 2Universidad Técnica de Cotopaxi. Cotopaxi, Ecuador. 3Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Departamento de Ciencias Pecuarias. Montería, Colombia.*Correspondencia: betanci@yahoo.com 1

Recibido: Marzo de 2011; Aceptado: Abril de 2012

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto nutracéutico del polvo de hojas y retoños de Anacardium occidentale (AO) en dietas de pollitas ponedoras de remplazo. Materiales y métodos. Se utilizaron 240 pollitas White Leghorn (L-33) de un día de edad, que se ubicaron durante 35 días, según diseño completamente aleatorizado, con niveles de adición de 0, 0.5, 1.5 y 2.5% de polvo de hojas y retoños de Anacardium occidentale en las dietas. Se determinaron en las pollitas, los indicadores productivos, peso absoluto y relativo de los órganos inmunes, vísceras, accesorios e intestinos, la hipersensibilidad intestinal y la glucosa sérica. Resultados. El peso vivo final, consumo de alimento, peso del timo, bolsa de Fabricio y colon + recto en las aves con el tracto gastrointestinal vacío y lleno, fue favorable con la adición de 0.5% de polvo AO, con diferencias significativas (p≤0.05). El consumo acumulado, el consumo de polvo AO y taninos se incrementaron en las aves con la adición de 1.5 y 2.5% de polvo AO con respecto al control; no obstante los indicadores productivos para estos animales se deprimieron. La adición del polvo de AO, no deterioró el peso relativo de las vísceras (corazón, hígado y riñón) en las aves, además redujo la hipersensibilidad intestinal y la glucosa sérica. Conclusiones. La adición de 0.5% de polvo de hojas y retoños de AO como nutracéutico en las dietas de pollitas ponedoras de remplazo, mejoró los indicadores productivos y el peso de los órganos inmunes; además, la adición del polvo AO en las dietas disminuyó la hipersensibilidad intestinal y la glucosa sérica.

Palabras clave: Inmunidad aviar, marañón, promotor de crecimiento (Fuentes: DeCS, AIMS).

3125

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ABSTRACT Objective. To assess the nutraceutical effect of powder from leaves and shoots of Anacardium occidentale (AO) in the diets of replacement laying pullets. Materials and methods. 240 day-old White Leghorn chicks (L-33), were placed for 35 days, according to a completely randomized design with addition levels of 0, 0.5, 1.5 and 2.5% of leaves and shoots powder of AO, in their diets. In the case of chicks, production indicators, absolute and relative weight of immune organs, viscera, innards and intestines, intestinal hypersensitivity and serum glucose were determined. Results.

The final body weight, the cumulative feed intake, the weight of thymus, bursa of Fabricio, and colon + rectum with empty and full gastrointestinal tract in the birds, were favorable with the addition of 0.5 % of AO powder with significant difference between (p≤0.05). Cumulative intake, consumption of AO powder and tannins were increased in birds with 1.5 and 2.5% of AO powder compared to the control group; however, the production indicators for these animals were reduced.

The addition of AO powder did not impair the relative weight of the viscera (heart, liver and kidney) in birds; also, the intestinal hypersensitivity and serum glucose were reduced. Conclusions. The addition of 0.5% of powder from leaves and shoots of AO as nutraceutical in diets for replacement pullets and laying hens, improved the productive indicators and weight of immune organs, plus the addition of three levels of dust in the diets, decreased intestinal hypersensitivity and serum glucose.

Key words: Avian immunity, cashew nuts, promoter of growth (Sources: DeCS, AIMS).

INTRODUCCIÓN En los últimos años, la comunidad científica internacional ha manifestado una alarmante preocupación por el uso indiscriminado de los antibióticos como promotores de crecimiento en las aves, aunque muchos países restringen su utilización, países en vías de desarrollo lo utilizan con gran frecuencia (1).

Los antibióticos se emplean en los primeros días de vida de las aves con el objetivo de aumentar la exclusión competitiva sobre la microflora del tracto gastrointestinal (TGI), controlando procesos entéricos de naturaleza subclínica frecuentes en la producción intensiva, lo que incrementa entre 1 y 5% las ganancias de peso y el índice de conversión. No obstante, los antibióticos pueden aumentar el número de cepas resistentes, así como transferir resistencias cruzadas a otros microorganismos; la premisa futura de los investigadores es obtener alternativas naturales para contrarrestar el uso indiscriminado de los antibióticos como preventivos en las aves (2).

En la industria avícola se han investigado muchos alimentos funcionales o nutracéuticos como promotores de crecimiento tales como: prebióticos, probióticos, fortalecidos, enriquecidos y extractos de plantas; con el objetivo de mejorar el estado de salud, disminuir los microorganismos patógenos y modular una mejor respuesta inmunitaria. Los

aditivos de plantas son considerados como una alternativa para sustituir los antibióticos, desde el punto de vista técnico, económico y biológico por la seguridad de su inclusión y su nula residualidad (1).

El Anacardium occidentale (AO) es un árbol originario de Brasil, localizado en todo el mundo, con muchas propiedades medicinales como hipoglicemiante y antihipertensivo en ratas, moluscicida contra babosas (Biomphalaria glabrata) con actividad bactericida, antihelmíntico y antiinflamatorio (3, 4); específicamente el polvo de las hojas y retoños de AO se utilizó con efectividad para contrarrestar el síndrome diarreico en aves, cerdos, cobayos, ovinos, conejos, bovinos y humanos en la República de Cuba, ya que con sólo dos dosis fue positivo para mejorar el estado físico y metabólico del paciente (5).

Por todos estos beneficios medicinales, el polvo de las hojas y retoños del AO pudiera emplearse como nutracéutico (producto natural) en los primeros días de las aves, teniendo en cuenta la susceptibilidad y presencia de microorganismos patógenos latentes y la premura de la edad al primer huevo. El objetivo fue evaluar el efecto nutracéutico del polvo de retoños y hojas de Anacardium occidentale en las dietas de pollitas ponedoras de reemplazo White Leghorn L-33.

Martínez - Efecto nutracéutico del Anacardium occidentale en dietas de pollitas

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. La experimentación con pollitas ponedoras de reemplazo se desarrolló en el área de producción “Horacio Rodríguez” perteneciente a la Empresa Provincial Avícola Granma, Cuba.

Tabla 1. Composición y aporte de la dieta de pollitas ponedoras de reemplazo (1-35 días) (base húmeda).

Ingredientes (%)

Condiciones geo-climáticas. La humedad relativa media fue 78%, la temperatura mínima promedio de 23.30°C y la temperatura máxima promedio de 30.60°C. Toma de muestra. Se tomaron hojas y retoños del árbol de Anacardium occidentale Linneo, de 10 años de edad aproximadamente en la zona de Peralejo Bayamo-Granma, Cuba, caracterizado por una topografía llana y suelo ferralítico. Se tuvo en cuenta en la recolección la diversidad del tamaño y estructura de las hojas.

Las muestras fueron deshidratadas a 60 a 65°C durante 16 horas, luego se trituró 1 mm en molino eléctrico de cuchillas paralelas, las muestras se conservaron a temperatura ambiente en almacenes de alimento durante 90 días (5).

Animales, diseño experimental y tratamientos. Un total de 240 pollitas ponedoras de reemplazo White Leghorn (Híbrido L-33) de un día de edad se ubicaron durante 35 días según diseño completamente aleatorizado con cuatro tratamientos y cuatro repeticiones.

Los tratamientos consistieron en adiciones de 0, 0.5, 1.5 y 2.5% de polvo AO como aditivo nutracéutico. Las dietas se formularon según lo recomendado por la UECAN (6) (Tabla 1). Se tomaron en cuenta los resultados del polvo AO como terapéutico para seleccionar los niveles de adición como nutracéutico (5).

Condiciones experimentales. Cada repetición estuvo constituida por un cuartón con cama profunda de cascarilla de arroz y 18 aves/m2.

El alimento y el agua se ofertaron ad libitum en comederos tipo tolva y bebederos de niple, respectivamente. La nave se desinfectó según las normas de calidad medioambientales (6).

Se empleó calefacción alternativa mediante carbón hasta los 14 días de edad, se utilizó un sistema de iluminación de 24 horas luz. No se utilizaron medicamentos, ni atención veterinaria terapéutica durante toda la etapa experimental.

Las aves fueron vacunadas contra el Marek, Viruela (primer día), Gumboro (12 días) y Newcastle (14 días).

3127

Nivel de inclusión

Harina de maíz

55.70

Harina de torta de soya

37.60

Aceite vegetal

0.90

Fosfato dicálcico

1.85

Carbonato de calcio

2.50

BHT (Antioxidante)

0.01

DL-Metionina

0.15

L-Lisina

0.04

Sal común

0.25

Premezcla1

1.00

Aportes calculados (%) EM (Kcal/Kg MS)

2900

Proteína Bruta

21.00

Lisina

1.20

Metionina+cistina

0.80

Calcio

1.50

Fósforo disponible

0.48

Fibra bruta

3.90

Cada kg contiene: vit. A, 10 x 106 U.I.; vit.D3, 1.5x 106 U.I.; vit.K3, 2100 mg; vit. E, 10000 mg; tiamina, 800 mg; riboflavina. 2500 mg; ac. pantoténico, 10000 mg,; piridoxina, 2500 mg; ac. fólico, 250 mg; biotina, 100mg; vit. B12, 15 mg; manganeso, 60000 mg; cobre,8000 mg; hierro, 60000 mg; zinc, 50000mg; selenio, 200 mg; iodo, 800 mg; cobalto, 500 mg; Antioxidante, 125000 mg.

1

Indicadores productivos. La viabilidad de las pollitas ponedoras de reemplazo se determinó por los animales muertos entre los existentes al inicio del experimento. Se calculó la conversión alimenticia como la cantidad de alimento ingerido, para una ganancia de 1 g de peso vivo (PV). Se determinó el tamaño del tarso mediante un pie de rey Stanley. El peso inicial y el final se midió de forma individual al primer día y a los 35 de edad, además se determinó el peso semanal, con una muestra del 20% de la masa total, en una balanza digital SARTORIUS modelo BL 1500 con precisión ± 0.1 g, respectivamente. El consumo de alimento acumulado (CA), consumo acumulado de polvo AO (CA de polvo AO) y taninos (CA de taninos) se calcularon diariamente mediante el método de oferta y rechazo. Se tuvo en cuenta la concentración de taninos totales en el polvo AO (22.73 mg/g) y en la torta de soya (10 mg/g) (5).

Peso absoluto y relativo de los órganos digestivos, inmunes y vísceras. A los 35 días de edad las aves se sacrificaron por el método desangrado en la vena yugular 10 aves/ tratamiento en ayunas por 4 horas y 10 aves/ tratamiento consumiendo alimento ad-libitum, seguido se pesaron las vísceras (hígado, corazón y riñón), órganos inmunes (timo, bazo y bolsa de Fabricio), accesorios (proventrículo y molleja) y los intestinos (delgado y grueso).

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pH, necropsia de los intestinos y glucosa sérica. Seguido del sacrificio se determinó el pH del intestino delgado y ciegos de 10 aves/tratamiento en ayunas, mediante un potenciómetro digital Bantex modelo 300 A, calibrado con soluciones tampón de pH 7 y 10.

Además se realizaron necropsias a los intestinos (delgado y grueso) para evaluar la estructura fisiológica y se determinó la glucosa sérica a 10 aves/tratamiento en ayunas, empleando un espectrofotómetro ultravioleta, marca Humalyzer, con Kits enzimáticos comercializados por SPINREACT. SA. Análisis estadísticos. Los datos se procesaron mediante análisis de varianza (ANOVA) de clasificación simple en un diseño totalmente aleatorizado, antes de realizar el análisis de varianza se procedió a verificar la normalidad de los datos por la prueba de Kolmogorov Smirnov (7) y para la uniformidad de la varianza, la prueba de Bartlett (8), en los casos necesarios se empleó la Dócima de Duncan (9) para determinar las diferencias entre medias, según el software estadístico SPSS versión 17.1.

RESULTADOS La figura 1 muestra el incremento del peso vivo a partir de la segunda semana de vida en las pollitas ponedoras de reemplazo alimentadas con la adición de 0.5% de polvo AO, en comparación con el tratamiento control, 1.5 y 2.5% de polvo AO. En la tabla 2 se observa que la viabilidad y el tamaño del tarso, no mostraron diferencias significativas entre tratamientos (p≥0.05). El consumo acumulado fue mayoritario para el tratamiento con 0.5% de polvo AO, así como el consumo de polvo AO y taninos fue progresivo con el nivel de adición de polvo AO.

Tabla 2. Indicadores productivos de pollitas ponedoras de reemplazo alimentadas con diferentes adiciones de polvo AO. Adición de Polvo AO (%) Indicadores

0

0.5

1.5

2.5

Viabilidad (%)

100

100

100

100

EE Sig. ---

Tarso (cm)

59. 70

60.60

59.6

59.00

1.20

CA (g /ave)

784.00d

840.10a

795.00c

806.00b

0.54***

0

5.22c

15.67b

26.12a

3.89***

3.43d

3.78c

3.86b

4.10a

0.12***

2.78

2.80

2.95

3.00

0.05*

CA de AO (g /ave) CA de taninos (g /ave) Conversión alimenticia (g/g)

b

b

a

a

Medias con letras diferentes en la mismas fila difieren a p≤0.05 Duncan (9) *p≤0.05; ***p≤0.001. CA: consumo acumulado. a,b,c,d

La tabla 3 mostró que el peso absoluto y relativo del bazo, molleja y el relativo del intestino delgado y proventrículo, no mostraron diferencias significativas entre tratamientos (p≥0.05). La adición de 0.5% de polvo AO fue favorable para el peso absoluto y relativo de la bolsa de Fabricio y colon+recto. El peso del timo, intestino delgado y ciegos fueron mayoritarios con 1.5% de polvo AO, con relación a los demás tratamientos.

Tabla 3. Peso absoluto y relativo al PV (%) de los órganos inmunes y accesorios (TGI-vacío), en pollitas ponedoras de reemplazo alimentadas con diferentes adiciones de polvo AO. Adición de Polvo AO (%) Indicadores

0

0.5

1.5

2.5

EE± Sig.

Peso absoluto (g) Peso vivo

285.50b

296.60a

274.51c

264.63d

3.27**

Timo

1.07b

1.19ab

1.71a

1.27ab

0.18**

Bolsa de Fabricio

1.59ab

2.07a

1.59ab

1.13b

0.27*

0.77

0.70

0.62

0.72

0.06

Intestino delgado

16.54c

17.29b

18.59a

16.52c

0.27*

Colon+recto

1.23ab

1.58a

1.10b

1.16b

0.22**

Ciegos

1.86

2.26

a

2.46

2.14c

0.09**

Proventrículo

1.93a

1.94a

1.92a

1.78b

0.05**

Molleja

15.21

15.23

15.05

15.08

0.77

Timo

0.37b

0.40b

0.62a

0.48ab

0.06**

Bolsa de Fabricio

0.55b

0.69a

0.58b

0.42c

0.07*

Bazo

0.26

0.23

0.22

0.27

0.02

Intestino delgado

5.79

5.82

6.24

6.77

0.51

Colon+recto

0.43ab

0.53a

0.24b

0.28b

0.07**

Ciegos

0.65b

0.76ab

0.89a

0.81ab

0.03*

Proventrículo

0.67

0.65

0.70

0.67

0.03

Molleja

5.33

5.13

5.48

5.69

0.27

Bazo

d

b

Peso relativo (%)

Figura 1. Peso vivo semanal en las pollitas ponedoras de reemplazo alimentadas con diferentes adiciones de polvo AO.

Medias con letras diferentes en la mismas fila difieren a p≤0.05 Duncan (9) *p≤0.05; ***p≤0.01. a,b,c

Martínez - Efecto nutracéutico del Anacardium occidentale en dietas de pollitas En las pollitas que consumieron alimento, el peso absoluto del bazo, intestino delgado, ciegos y molleja no mostraron diferencias entre tratamientos (p≥0.05); no obstante, la adición de 0.5% favoreció el peso absoluto y relativo de la bolsa de Fabricio (Tabla 4), los otros órganos y accesorios no mostraron diferencias estadísticas en los pesos relativos (p≥0.05).

Tabla 4. Peso absoluto y relativo al PV (%) de los órganos inmunes y accesorios (TGIlleno) de pollitas ponedoras de reemplazo alimentadas con diferentes adiciones de polvo AO. Adición de Polvo AO (%) Indicadores

0

0.5

1.5

2.5

EE± Sig.

Peso absoluto (g) Peso vivo

285.89b

313.38a

266.93c

271.75c

4.67**

Timo

1.85a

1.89a

1.46b

1.53b

0.08**

Bolsa de Fabricio

1.65b

2.39a

1.51b

1.42b

0.23**

Bazo

0.62

0.80

0.64

0.77

0.07

Intestino delgado

19.74

22.06

19.67

17.98

1.39

Colon+recto

0.87

1.18

1.08

0.70

0.21**

Ciegos

2.61

2.39

2.23

2.27

0.27

Proventrículo

1.91

1.97

1.92

1.82

0.09

17.01a

17.15a

14.40b

14.08b

0.82**

ab

Molleja

a

ab

b

Peso relativo (%) Timo

0.64

0.60

0.54

0.56

0.10

Bolsa de Fabricio

0.57b

0.76a

0.56b

0.52b

0.003*

Bazo

0.21

0.26

0.23

0.28

0.03

Intestino delgado

6.90

7.04

7.36

6.61

0.48

Colon+recto

0.30

0.37

0.40

0.26

0.05

Ciegos

0.91

0.76

0.83

0.83

0.09

Proventrículo

0.66

0.63

0.67

0.72

0.30

Molleja

5.95

5.47

5.34

5.27

0.30

Medias con letras diferentes en la mismas fila difieren a p≤0.05 Duncan (9) *p≤0.05. a,b,c.

El peso relativo de las vísceras observado en la tabla 5 no mostró diferencias estadísticas (p≥0.05), tanto para el TGI lleno y vacío en las pollitas.

Tabla 5.

Peso relativo al PV (%) de las vísceras de pollitas ponedoras de reemplazo alimentadas con diferentes adiciones de polvo AO. Adición de Polvo AO (%)

Pesos relativos (%)

0

0.5

1.5

2.5

EE±

Hígado

2.97

2.95

2.97

2.94

0.14

Páncreas

0.46

0.44

0.44

0.43

0.05

Riñón

0.85

0.61b

0.62

0.76

0.09

Corazón

0.72

0.70

0.76

0.77

0.04

Hígado

3.14

2.97

2.97

3.52

0.22

Páncreas

0.48

0.48

0.47

0.45

0.03

Riñón

1.01

0.92

1.06

1.08

0.09

Corazón

0.75

0.68

0.70

0.78

0.07

TGI (Vacío)

TGI (Lleno)

3129

En la tabla 6 se muestra la hipersensibilidad intestinal para el tratamiento control, con respecto a los tratamientos con polvo AO.

Tabla 6. Hipersensibilidad y pH intestinal y glucosa sérica de pollitas ponedoras de reemplazo alimentadas con diferentes adiciones de polvo AO. Adición de Polvo AO (%) Indicadores

0

0.5

1.5

2.5

EE± Sig.

60a

20b

10b

20b

0.05**

pH Intestino delgado

6.18b

6.13b

6.35b

6.69a

0.10 **

pH Ciegos

6.55b

6.47b

6.49b

7.00a

0.07***

Glucosa sérica (mmol/L)

9.60a

8.50b

7.77c

6.60d

0.9***

Hipersensibilidad intestinal (%)

Medias con letras diferentes en la mismas fila difieren a p≤0.05 Duncan (9) **p≤0.01; ***p≤0.001. a,b

El pH del intestino delgado y ciegos se incrementó con 2.5% de polvo con respecto a los otros tratamientos. Mientras la glucosa sérica disminuyó proporcionalmente con el nivel de adición de polvo AO, con diferencias estadísticas (p≤0.001).

DISCUSIÓN El incremento de peso vivo en las pollitas en 19.5, 14.5, 34.0 y 18.77 g desde la segunda hasta la quinta semana de vida, con 0.5% de adición de polvo AO con respecto al control, mostró los beneficios de esta planta integral en pequeñas proporciones como nutracéutico y promotor de crecimiento natural, además la alta viabilidad demostró la inocuidad del polvo en las dietas para aves, teniendo en cuenta la mortalidad de las aves en los primeros días de vida por la baja actividad inmunológica (10).

El crecimiento compensatorio de las aves con 0.5%, pudo deberse a los compuestos químicos presentes en el polvo AO. Martínez et al (5) habían referido metabolitos secundarios, principalmente polifenoles totales, triterpenos, flavonoides y taninos totales, además reportes recientes de Sousa de Brito et al (11) muestran concentraciones elevadas de antocianidinas.

En este sentido, los taninos aunque son considerados factores anti-nutricionales, pequeñas proporciones en las dietas pueden ser eficientes bactericidas, fungicidas, antioxidantes y astringentes; además, al precipitar las proteínas, los sobrenadantes son trasferidos hasta los ciegos pudiendo mejorar el valor biológico de estas (12).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

También, la presencia de flavonoides en el AO y en las dietas de las aves, incrementa la digestibilidad de los nutrientes y el funcionamiento orgánico del cuerpo, así como activa la capacidad antioxidante (atrapadora de los radicales libres RH*) y modificación de la síntesis de eicosanoides (con respuestas anti-prostanoide y anti-inflamatoria) (13).

Además, las antocianidinas detectadas en el AO, ejercen efectos positivos en estados inflamatorios relacionados con su capacidad antioxidante, estimulan el sistema inmune, incrementan la proliferación de linfocitos y la secreción de citocinas (interleucina II), (14).

Por estas características benéficas se puede afirmar que hay un efecto directo de los metabolitos secundarios del polvo AO en las aves, teniendo en cuenta, que los animales y en especial las aves no los sintetizan.

A pesar de las características químicas del AO, la adición de 1.5 y 2.5% de polvo AO disminuyeron los resultados productivos comparado con 0.5% de polvo AO y el tratamiento control. Según Savón et al (12) los taninos en altas concentraciones son factores anti-nutricionales, impiden la absorción de los aminoácidos azufrados y de los minerales, especialmente el hierro (15), un mayor consumo de polvo AO y taninos con la adición de 1.5 y 2.5% (Tabla 2 ) pudo provocar alteraciones metabólicas y disminuir los indicadores productivos.

El consumo de alimento fue superior para las aves con la adición de 0.5% de polvo AO, por una mayor capacidad digestiva; no obstante, las aves con 1.5 y 2.5% de polvo AO, consumieron más alimento que el tratamiento control. Savón et al (12), refieren que un exceso de anti-nutricionales puede provocar pérdidas de energía digestible y nutrientes, sobre todo de aminoácidos y ácidos grasos, regulando el consumo voluntario de las aves.

El mayor peso del timo en pollitas con 1.5% de polvo AO (TGI-vacío) está determinado por la activación del sistema inmune, el timo produce las células T destruyendo de forma conjunta los macrófagos (15). No obstante, el timo en las pollitas con el TGI-lleno no mostró diferencias entre tratamientos, al parecer el vaciamiento digestivo activa en mayor medida la actividad de este órgano inmune por menores reservas nutricionales y defensa.

En este sentido, la bolsa de Fabricio mostró un mayor peso con la adición de 0.5% de polvo AO tanto para el TGI vacío como lleno. Esta bolsa de Fabricio estimula la inmunidad humoral y

produce anticuerpos de memoria con gran especificidad, el aumento del tamaño de este órgano significa más actividad inmunológica, teniendo en cuenta que involuciona partir de los 50 días de vida.

No obstante, el bazo como otro órgano inmune de las aves, no se incrementó con la adición de polvo AO, al parecer la mayor actividad se concentra en los órganos que producen la mayor cantidad de anticuerpos (células B y T) (16).

Esta actividad inmunológica está respaldada por un aumento de la exclusión competitiva en el TGI de las aves, teniendo en cuenta la propiedad bactericida del polvo AO comprobado por la concentración mínima inhibitoria frente a cepas de bacterias patógenas (5). Es conocido que las aves nacen con bacterias patógenas latentes, que pueden modular la respuesta inmunológica, específicamente durante los primeros 21 días de vida (10).

El mayor peso del intestino delgado y ciegos con 1.5% pudo estar asociado a astringencias provocadas por los taninos del AO. Kubena et al (17), obtuvieron resultados similares en el peso del ciego al incluir altos niveles de taninos en las dietas, con un incremento de la producción de ácidos grasos volátiles, especialmente de propiónico, pudiendo disminuir las colonias de bacterias patógenas.

La adición de polvo AO en las dietas de pollitas no afectó las vísceras, esto demuestra la efectividad del AO, teniendo en cuenta que estos órganos controlan las funciones orgánicas y enzimáticas de las aves, no obstante, Marzo et al (18) refieren un aumento del peso del hígado al incluir 2.5% de taninos en las dietas para aves.

Por las propiedades medicinales comprobadas en el AO; su adición en las dietas de las aves, disminuyó la hipersensibilidad intestinal, significando mayor salud intestinal; sin embargo, no se encontró una acidificación intestinal, justificado por el valor del pH (intestinos delgado y ciegos). Esto pudo deberse a la proliferación tardía de las bacterias benéficas (a partir de los 11 días) que producen ácidos grasos volátiles (AGV) y disminuyen el pH intestinal en las aves (10).

La reducción mmol/L con de polvo AO las hojas y

de la glucosa en 1.1, 1.9 y 3.0 la adición de 0.5, 1.5 y 2.5% en las pollitas, demuestra que retoños del AO también son

Martínez - Efecto nutracéutico del Anacardium occidentale en dietas de pollitas hipoglicemiantes, comprobado con la fruta del AO en ratas (4). El efecto astringente del polvo AO, provoca una lenta liberación intestinal y mantención de la glucosa dietética, necesitando menor concentración de insulina en sangre (19), una reducción de la glucosa en las aves puede favorecer a la disminución de la circulación sanguínea de los lípidos perjudiciales (2).

En conclusión, la adición de 0.5% de polvo de hojas y retoños de Anacardium occidentale como nutracéutico en las dietas de pollitas ponedoras de reemplazo, incrementó el peso

3131

vivo semanal, consumo de alimento y peso de los órganos inmunes, con respecto a los demás tratamientos. Además, la adición de tres niveles de polvo AO disminuyó la hipersensibilidad intestinal y la glucosa sérica en pollitas ponedoras de reemplazo.

Agradecimientos A los directivos y técnicos de la granja de ponedoras de reemplazo “Horacio Rodríguez”, Empresa Provincial Avícola Granma, Cuba, por su colaboración en el desarrollo de esta investigación.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3133-3139, 2012.

ORIGINAL

Efecto de la liberación controlada de nitrógeno sobre la fermentación y la degradabilidad in situ de Cynodon dactylon Effect of controlled-release of nitrogen on fermentation and in situ digestibility of Cynodon dactylon Álvaro Ojeda,1* Ph.D, Miguel Reyes,2 Ing, Williams Rodríguez,2 Ing. Universidad Central de Venezuela, Facultad de Agronomía, Instituto de Producción Animal, Maracay, Venezuela. 2Ejercicio particular. *Correspondencia: ajojeda99@yahoo.com 1

Recibido: Abril de 2011; Aceptado: Enero de 2012.

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto de una fuente no proteica de liberación controlada de nitrógeno (NnpLC) sobre algunos parámetros de la fermentación ruminal y degradabilidad in situ de Cynodon dactylon.

Materiales y métodos. 4 vacas fistuladas al rumen alimentadas con una dieta base de heno de Cynodon dactylon (4.8% proteína cruda y 78.4% fibra detergente neutra), 1 kg de melaza de caña y 55 g de mezcla mineral (tratamiento Control), y tratamientos experimentales con adición a la dieta base de 150 g urea (Urea), sustitución de Urea por NnpLC a razón de 50% del aporte de nitrógeno (Urea/ NnpLC) y 183 g NnpLC (NnpLC). En un Cuadrado Latino 4x4 y períodos de 17 días, se registró consumo del día 7 al 14. El día 15 fueron tomadas muestras seriadas de contenido ruminal para evaluar pH, nitrógeno amoniacal (N-NH3) y ácidos grasos volátiles. La degradabilidad de la materia orgánica (DMO48) y fibra detergente neutro (DFND48) a las 48 h fueron medidas con bolsas de nylon.

Resultados. No hubo diferencias (p>0.05) en consumo de materia seca (8.2±0.35 kgMS/animal/ día), pH (6.1±0.21), DMO48 (52.2±6.2%) y DFND48 (30.1±2.8%); aunque hubo diferencias (p<0.01) en valores medios de N-NH3 (19.1, 166.7, 181.6 y 281.8 mg/L; respectivamente). NnpLC incrementó (p<0.05) el ácido propiónico (27.3%), redujo el T1/2 (13.2%) y optimizó la relación P:E (22.0± 0.76). Conclusiones. El uso de una fuente NnpLC generó un perfil de ácidos grasos volátiles con patrón gluconeogénico, optimizó la concentración de N-NH3 y mejoró la relación P:E, por lo que debe considerarse una alternativa para manipular el medio ambiente ruminal de vacunos alimentados con recursos fibrosos.

Palabras clave: Ácidos grasos, nitrógeno amoniacal, rumen, urea (Fuente: AGROVOC).

3133

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ABSTRACT Objective. To evaluate the effect of a controlled-release non protein nitrogen source (CRNpn) on some parameters of rumen fermentation and in situ digestibility of Cynodon dactylon. Materials and methods. Four rumen fistulated cows fed a basal diet with Cynodon dactylon hay (4.8% crude protein and 78.4% neutral detergent fiber), 1 kg sugar cane molasses and 55 g mineral mix (Control), and experimental treatment plus 150 g urea (Urea), replaced Urea with CRNpn by 50% of the nitrogen contribution (Urea/CRNpn) and 183 g CRNpn (CRNpn), in a 4x4 Latin Square with periods of 17 days. Intake was measured between days 7 and 14, serial rumen content samples were taken to measure pH, ammonia nitrogen (N-NH3) and volatile fatty acids on day 15. Organic matter (OMD48) and neutral detergent fiber (NDF48) digestibility were measured with nylon bags at 48 h. Results. No differences (p>0.05) on dry matter intake (8.2±0.35 kgDM/animal/day), ruminal pH (6.1±0.21), OMD48 (52.2±6.2%) and NDF48 (30.1±2.8%) were observed. However, there were differences (p<0.01) in N-NH3 daily averages (19.1, 166.7, 181.6 and 281.8 mg/L; respectively).

CRNpn increased (p<0.05) the propionic acid (27.3%), reduced T1/2 (13.2%) and optimized the P:E relation (22.0±0.76). Conclusions. The use of a CRNpn source generated a volatile fatty acid profile with gluconeogenic pattern, optimized the N-NH3 concentration and improved the P:E relation, and therefore may be considered as an alternative to manipulate the ruminal environment of cattle fed with fibrous resources.

Key words: Ammonia nitrogen, fatty acids, rumen, urea (Source: AGROVOC).

INTRODUCCIÓN La proteína microbiana representa entre 70 y 90% de los aminoácidos que alcanzan el duodeno en un vacuno en pastoreo, y su síntesis requiere de aportes ruminales de energía y nitrógeno fermentables, adecuados en cantidad y aprovechables de modo sincronizado para garantizar así la disponibilidad oportuna de nitrógeno e hidratos de carbono para el crecimiento microbiano efciciente, y el flujo máximo de proteína metabolizable al tracto posterior (1-3).

Diversas fuentes de nitrógeno no proteico (NNP) en forma elemental han sido incorporadas en programas de suplemento nutricional de vacunos en pastoreo; sin embargo, la cantidad empleada es limitada debido a que la hidrólisis puede ocurrir a una tasa superior a la utilización del amonio por los microorganismos ruminales, lo que resulta en un aumento en la absorción del amoníaco ruminal y en la posterior conversión a urea en el tejido hepático (4,5). Este proceso demanda un gasto calórico para los rumiantes de 0.2 Mcal de energía neta de lactación por cada 16 g de exceso de nitrógeno (N) ingerido (1). Adicionalmente, un incremento del N ureico en plasma puede asociarse con el deterioro en el comportamiento reproductivo del animal (3), y un impacto negativo al medio ambiente debido a la excesiva excreción urinaria de N (5).

Para controlar la disponibilidad de nitrógeno en el ambiente ruminal, y facilitar el ajuste entre su disponibilidad y la energía dietaria, se ha

propuesto el uso de fuentes no proteicas de liberación controlada de nitrógeno (NnpLC); entre las que se encuentran el isobutiraldehido monourea, la acetilurea, el biuret, la urea protegida con aceite de linaza y la urea tratada con formaldehido, entre otras (4,6,7).

Recientemente, se ha utilizado el recubrimiento o encapsulado de partículas de urea con una película de polímeros de degradación lenta que reducen la solubilidad del material; generando una tasa menor de liberación de nitrógeno (8,9). Así cuando se suplementa la ración con NnpLC, disminuyen las concentraciones iniciales de nitrógeno amoniacal (N-NH3) en el medio ruminal y se regula su ingreso al flujo sanguíneo; lo que acorta el tiempo durante el cual el rumen evidencia exceso ó déficit de nitrógeno.

Lo anterior deriva en una mayor síntesis de proteína microbiana y consecuentemente, en un incremento en la digestión de la pared celular y producción de ácidos grasos volátiles (AGV), promoviendo mayor eficiencia en el funcionamiento del rumen (9).

El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de la incorporación de una fuente no protéica de liberación controlada de nitrógeno en la dieta de vacas de doble propósito, sobre parámetros de la fermentación ruminal (pH, concentración de N-NH3 y producción de AGV) y la degradabilidad ruminal aparente in situ de un heno de Cynodon dactylon.

Ojeda - Efecto liberación controlada de nitrógeno sobre la fermentación y degradabilidad 3135

MATERIALES Y MÉTODOS Ubicación. El estudio se realizó en la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela (10º16’24.6’’ N y 67º36’30.2’’ O), localizada en Maracay, Aragua. Las instalaciones se ubican en un área de bosque seco tropical, a una altura de 461 msnm y registros medios de 25.3°C de temperatura, 75.1% de humedad relativa y 1035.2 mm de precipitación anual (10).

Animales y manejo. Se emplearon 4 vacas con cánula ruminal permanente y peso vivo de 422 ± 93.5 kg, confinadas en corrales individuales semitechados de 16 m2 con comederos y bebederos individuales, estos últimos con suministro de agua ad libitum. Los animales fueron alimentados con una ración base de heno de Cynodon dactylon, y suplementados una vez al día (06:00 h) con 1 kg de melaza de caña de azúcar y 55 g de una mezcla mineral comercial. Se utilizó un diseño en Cuadrado Latino 4x4, cada uno con períodos de 17 días (14 de adaptación a las raciones experimentales y 3 de evaluación), para evaluar 4 tratamientos experimentales, a saber: Control: animales con ración base.

Urea: animales con ración base y adición de 150 g /día de urea.

Urea/NnpLC: animales con ración base y sustitución del 50% del aporte de nitrógeno vía urea por NnpLC (75 g urea y 91.7 g NnpLC).

NnpLC: animales con ración base y adición de 183 g /día de NnpLC. La adición de NNP se efectuó a razón de 69.9 g N/día, partiendo de urea perlada comercial (466 g N/kg) y una fuente de NnpLC (381 g N/ kg) suministrada por Alltech Venezuela S.C.S. (Valencia, Venezuela), la cual consistió de urea recubierta con un polímero poroso biodegradable que genera un patrón de liberación controlada del nitrógeno.

Muestreo ruminal. El día 15 de cada período experimental, y a partir del filtrado con liencillo de una fracción del contenido del rumen, se colectó una muestra del líquido ruminal inmediatamente antes del suministro de suplemento, y a las 1, 3, 6, 9, 12 y 18 h luego de ofrecer el mismo. Una vez registrado el pH, se tomaron 30 ml de dicha muestra y se les adicionó ácido sulfúrico al 97% hasta alcanzar un pH inferior a 4, almacenando a -4ºC este material para el posterior análisis de N-NH3 en la fase de destilación del método de Kjeldahl (11), y determinación de la concentración molar de los ácidos acético, propiónico y butírico,

empleando un cromatógrafo de gases (PYE UNICAM PU-4500) con ácido isocaproico como estándar interno (12).

Degradabilidad in situ y consumo. Siguiendo la técnica de la bolsa de nylon (13), 5 g de heno molido en una criba de 2.5 mm fueron introducidos en bolsas de nylon (7×14 cm y poro de 50 μm) e incubadas en el rumen por duplicado para cada tiempo y animal. Dichas bolsas se retiraron del rumen a las 0, 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h y fueron lavadas con agua, para posteriormente ser deshidratadas durante 48 h en estufa con circulación de aire a 100°C. Las muestras fueron evaluadas (14) de acuerdo al análisis químico proximal, calcio y fósforo; mientras que la fibra en detergentes neutro (FND) y ácido (FAD) se determinó de acuerdo a lo descrito por Van Soest et al (15).

La degradabilidad in situ de la materia orgánica y FND se obtuvo por diferencia entre el peso de la muestra introducida en la bolsa y el remanente en cada tiempo de incubación. La fracción soluble de la materia seca contenida en las bolsas fue obtenida luego de mantenerlas en agua a 38°C durante 1 h.

El tiempo al cual la mitad de la fracción de materia seca potencialmente degradable desapareció de la bolsa (T1/2) fue calculado mediante la ecuación T1/2 (h)= ln 2/c, donde “c” representó la tasa de degradación derivada de la pendiente obtenida por la representación gráfica de la desaparición del material (16).

El consumo diario de heno y del suplemento, estimados a partir de la diferencia de peso entre lo ofertado y rechazado, se obtuvieron del día 7 al 14 de cada período. La relación proteína:energía (P:E) fue calculada de acuerdo a lo propuesto por Castillo et al (17), considerando los gramos de nitrógeno degradable generados a partir de la fermentación de un kilogramo de materia orgánica (g N ferm/kg MO deg), tomando para el cálculo los valores de degradabilidad in vitro.

Análisis estadístico. La información fue examinada empleando el software SAS (18). El consumo de materia seca y su degradabilidad in situ se analizaron por medio de ANOVA para Cuadrado Latino 4x4 (PROC MIXED), de acuerdo al modelo lineal aditivo que se detalla a continuación: Yijk = μ + Ai + Pj + Tk + Єijk En donde μ es la media general; A, P y T los efectos debido al animal, período y tratamiento, respectivamente; y Є el término de error (distribuido normalmente con media=0 y

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

varianza constante). El pH ruminal y la concentración de N-NH3 fueron analizados como un Cuadrado Latino con medidas repetidas, considerando el animal como efecto aleatorio.

Las diferencias significativas (p<0.05) entre medias fueron evaluadas a través de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.

RESULTADOS Composición química. El heno de Cynodon dactylon (Tabla 1) presentó un aporte de nitrógeno limitado (0.77% N) y un contenido elevado de pared celular (78.4% FND), similar al tipo de recursos fibrosos frecuentemente empleados para animales en pastoreo durante la época seca en sabanas tropicales (11). La mezcla mineral exhibió un balance de sus fracciones de acuerdo a las necesidades sugeridas para el tipo de animal en evaluación (3).

Parámetros de la fermentación ruminal.

La incorporación de fuentes suplementarias de NNP no modificó (p>0.05) el pH del líquido ruminal, el cual se ubicó entre 5.9 y 6.3, con un valor medio de 6.2 ± 0.19.

Comparado con el control (19.1 mg N-NH3/L), se observó un aumento (p<0.01) del contenido de N-NH3 en el líquido ruminal de 9.1 veces para los tratamientos Urea y Urea/NnpLC, y de 14.8 veces en el tratamiento NnpLC. Los tratamientos que incluyeron suplementación con NNP generaron un incremento sostenido del N-NH3 durante las primeras 3 a 6 h posteriores a la ingesta del suplemento (Figura 1), alcanzando una media de 375.9 mg N-NH3/L. Sin embargo, la suplementación con NnpLC garantizó mayor uniformidad en la concentración ruminal de N-NH3 a lo largo del período en evaluación.

Tabla 1. Composición química de los alimentos.

Composición química (% BS) Fracciones Materia seca Proteína cruda Extracto etéreo

Heno

Melaza de caña

Mezcla Mineral1

87.5

73.7

96.0

4.8

4.3

1.8

0.12

FND

78.4

FAD

45.0

Cenizas

5.8

9.8

Calcio

0.71

0.74

15.8

Fósforo

0.33

0.07

8.2

Composición indicada por el fabricante: 9% Na, 0.5% Mg, 0.6% S, 0.5% Zn, 0.25% Cu, 20 ppm Se, 80 ppm I; entre otros.

1

Consumo. El consumo de materia seca (Tabla 2) no fue afectado por los tratamientos (p>0.05); alcanzando 8.2 ± 0.31 kg MS/animal/ día, equivalentes al 1.9% del peso vivo de los animales.

Tabla 2. Consumo y parámetros de la fermentación ruminal de vacunos suplementados con urea y/o una fuente no proteica de liberación controlada de nitrógeno.

Tratamientos Control

Urea

Urea/ NnpLC

NnpLC

Consumo (kg/día)

8.0

8.6

8.2

7.9

pH

6.3

6.3

5.9

6.2

19.1c

166.7b

181.6 b

281.8 a

Variables

N amoniacal (mg/L) AGV (mmol/L) Acetato

4.8b

6.0a

6.2 a

6.1 a

Propionato

1.0 b

1.2 b

1.4 a

1.4 a

Butirato

0.4

0.4

0.4

0.5

AGV (%) Acetato

77.4 b

78.9 a

77.5 b

76.3 b

Propionato

16.2 b

15.8 b

17.5 a

17.5 a

6.4

5.3

5.0

6.3

Butirato

Promedios con letras diferentes entre columnas, son estadísticamente diferentes (p<0.05)

Figura 1. Comportamiento del nitrógeno amoniacal ruminal en vacunos suplementados con urea y una fuente no proteica de liberación controlada de nitrógeno (NnpLC).

En general, todos los tratamientos presentaron un perfil de fermentación ruminal de carácter acetogénico (77.6 ± 1.3%), con una mayor (p<0.05) concentración de acetato en los tratamientos que incluyeron suplementación con fuentes de NNP (6.1 ± 0.1 mmol/L) respecto al control (4.8 mmol/L). No hubo diferencias en la concentración de butirato (0.4 ± 0.1 mmol/L), aunque respecto a los tratamientos restantes, la inclusión de NnpLC generó un incremento (p<0.05) en la fracción de ácido propiónico tanto en términos absolutos (27.3%), como en su proporción molar (9.4%).

Degradabilidad in situ. La degradabilidad aparente de la materia orgánica y la FND no se vieron afectadas por los tratamientos evaluados (p>0.05). Sin embargo, el T1/2 se redujo (p<0.05) un 13.2% en el tratamiento NnpLC (Tabla 3).

Comparado con el control (7.67 g N ferm/kg MO deg), la incorporación a la ración de las fuentes de NNP evaluadas mejoró (p<0.01) la relación P:E (22.0±0.76 g N ferm/kg MO deg).

Ojeda - Efecto liberación controlada de nitrógeno sobre la fermentación y degradabilidad 3137 Tabla 3. Degradabilidad in situ de Cynodon dactylon y relación proteína:energía (g N ferm/kg MO deg) en vacunos suplementados con urea y/o una fuente no proteica de liberación controlada de nitrógeno.

Tratamientos Variables (% BS)

Control

Urea

Urea/NnpLC

NnpLC

48 h

55.6

56.6

45.1

54.8

72h

60.3

59.3

59.8

57.9

48 h

33.8

33.0

27.5

29.7

72h

39.8

37.7

33.5

39.6

T1/2 (h)3

56.5 a

52.2 a

58.4 a

48.1 b

P:E

7.67b

21.2a

22.7a

22.2a

Materia orgánica

FND

Promedios con letras diferentes entre columnas, son estadísticamente diferentes (p<0.05).

DISCUSIÓN Consumo. El consumo de alimento fue similar entre tratamientos (p>0.05), y estuvo localizado en el rango referido en la literatura para recursos fibrosos con elevada participación de fracciones refractarias en su pared celular (19). La ausencia de una mejora del consumo voluntario producto de la suplementación nitrogenada puede deberse a un marcado efecto de distención ruminal asociado al alto contenido de pared celular del recurso fibroso evaluado, o a posibles efectos tóxicos derivados del metabolismo de nitrógeno excedentario.

En este sentido, la ingesta de urea o su equivalente en NnpLC se sitúo en 18.2 ± 0.77 g/kg de materia seca ingerida, mientras que en términos de proteína cruda (N*6.25), la ración suministró 94.0 ± 2.8 g PC/kg ración. Estos valores son similares a lo establecido como límite (20 g/kg MS y 105 g PC/kg ración, respectivamente) para observar efectos inhibitorios en el consumo voluntario de recursos fibrosos como consecuencia de los metabolitos resultantes del catabolismo del NNP dietario (20, 21).

Parámetros de la fermentación ruminal. En general, los valores de pH ruminal son inferiores al rango deseable (6.6 a 7.0) para una mayor eficiencia en el crecimiento de los microorganismos celulolíticos (19) y se consideran resultado del aporte de carbohidratos rápidamente fermentables por la melaza de caña.

La concentración de N-NH3 en el tratamiento control a lo largo del día es inferior al óptimo (100 mg N-NH3/L) reportado para maximizar el consumo y la utilización de la materia orgánica en el rumen (22); mientras que los tratamientos Urea, Urea/NnpLC y NnpLC se mantienen por

encima de dicho valor durante 10.5, 12.3 y 18 h; respectivamente.

En un ambiente ruminal con disponibilidad de carbohidratos fermentables, mantener niveles óptimos de N-NH3 en el medio ruminal durante la mayor parte del día, genera una eficiencia elevada en el uso de la energía para crecimiento microbiano (YATP), y por tanto, un incremento de la proteína metabolizable. Esto ha sido demostrado por Tikofsky y Harrison (8), quienes obtuvieron un incremento de 40.1% (p=0.07) en la síntesis de proteína microbiana por unidad de materia seca verdaderamente digestible al evaluar la inclusión de esta misma fuente de NnpLC en sustitución de urea en la ración (18.2 vs 13.0 g N bacterial/kg MSdeg; respectivamente).

La curva descrita por la concentración ruminal de N-NH3 muestra una mayor estabilidad en el tiempo del contenido de amonio, y se evidencia un “espacio vertical” entre las líneas de los tratamientos Urea/NnpLC y NnpLC, respecto a la urea. Esto repercute en una menor cantidad de nitrógeno liberado al medio ruminal durante las primeras 5 h luego de ingerida la fuente de NnpLC, y una mayor persistencia de la concentración de amonio ruminal entre las 5 y 18 h. Este comportamiento se traduce en menores riesgos de toxicidad y menor pérdida de energía para la excreción del nitrógeno úrico generado en el metabolismo intermediario (5,9); además, de una reducción de la contaminación ambiental por la emisión de compuestos nitrogenados al entorno (8).

Aunque en general el patrón de producción de AGV ruminales fue de carácter acetogénico, una mayor proporción de ácido propiónico en los tratamientos urea/NnpLC y NnpLC tuvo consecuencias positivas en la repuesta de animales a pastoreo, ya que este AGV es el único involucrado en la síntesis neta de glucosa a partir de su carboxilación a metilmalonil-CoA, por lo que contribuye a suplir la demanda de este carbohidrato para los procesos catabólicos (generación de energía) y anabólicos (síntesis de aminoácidos, glucógeno, lactosa, glicerol y ácidos grasos) en el rumiante (23).

Degradabilidad in situ. La ausencia de efecto sobre la degradabilidad de la materia orgánica y la FND coincide con estudios previos (8), y con la respuesta observada en el consumo voluntario.

La reducción en el T1/2 en el tratamiento NnpLC es debido a una mejor distribución en el tiempo del nitrógeno disponible al medio ambiente ruminal (8,9). Independientemente del tratamiento, la inclusión de NnpLC incrementó

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

la relación P:E en rumen, aunque éstas fueron ligeramente inferiores al rango de 25-30 g N ferm/kg MO deg establecido como óptimo para un funcionamiento ruminal eficiente (17).

La incorporación de una fuente de NnpLC a la dieta de vacas de doble propósito alimentadas con heno (Cynodon dactylon), sola o en combinación con urea, no alteró el consumo voluntario, el pH ruminal, la degradabilidad in situ de la materia orgánica y el FND; sin embargo, se observó una mayor estabilidad en el tiempo de

la concentración de N-NH3 se modificó el perfil de AGV hacia un patrón gluconeogénico, se redujo el T1/2 de degradación de la materia seca y se generó un mejor ajuste de la relación P:E. Se requiere desarrollar estudios de respuesta animal en vacunos a pastoreo de recursos fibrosos en el medio tropical.

Agradecimientos A Alltech Venezuela S.C.S., por la financiación parcial de la presente investigación.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3140-3146, 2012.

ORIGINAL

Efecto del nivel proteico de la dieta sobre el desarrollo de juveniles de Macrobrachium tenellum (Smith, 1871) Effect of dietary protein level on the development of juveniles of Macrobrachiun tenellum (Smith, 1871) Luis Espinosa-Chaurand,1 M.Sc, Carlos Flores-Zepeda,2 Lic, Héctor Nolasco-Soria,3 Ph.D, Olimpia Carrillo-Farnes,4 Ph.D, Fernando Vega-Villasante,1* Ph.D. Universidad de Guadalajara. Centro de Investigaciones Costeras. Laboratorio de Acuicultura Experimental. Av. Universidad No. 203, Del. Ixtapa, C.P. 48280, Puerto Vallarta, Jalisco, México.

2 Universidad de Guadalajara. Centro Universitario de la Costa. Licenciatura en Biología. Puerto Vallarta, Jalisco, México. 3Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C. La Paz, Baja California Sur, México. 4Universidad de La Habana. Facultad de Biología. La Habana, Cuba. Correspondencia: fernandovega.villasante@gmail.com 1

Recibido: Diciembre de 2011; Aceptado: Agosto de 2012.

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto de cinco niveles de proteína cruda (PC) en alimentos balanceados sobre el crecimiento, sobrevivencia y tasa de conversión alimenticia (FCA) en juveniles de Macrobrachium tenellum. Materiales y métodos. Se alimentó por 60 días a juveniles de M. tenellum (0.31±0.01 g y 32.62±1.10 mm) con niveles de 20, 25, 30, 35 y 40% de PC en el alimento. Los organismos fueron distribuidos al azar en 15 tinas experimentales de 64 L (15 org./tina) bajo condiciones controladas (5.95±0.41 ppm de oxígeno, 29.89±0.72ºC, y pH 8.44±0.15) y alimentados con el 10% de su peso vivo. Resultados. El porcentaje de sobrevivencia fue del 98.22±3.96% sin diferencias significativas entre los tratamientos (p>0.05). Los organismos alimentados con un 40% de PC tuvieron un peso significativamente mayor (p<0.05) respecto a los demás tratamientos (cambio de peso de 0.54±0.02g; incremento de peso de 173.60±12.99%; y tasa de crecimiento específico de 1.68±0.08). El FCA fue significativamente mejor (p<0.05) en los organismos alimentados con 35 y 40% de PC (2.85±0.18 y 2.40±0.05, respectivamente) que los demás tratamientos. Conclusiones. Los organismos juveniles de M. tenellum alimentados con niveles altos de proteína (40%), se desarrollaron más rápido que organismos que recibieron una menor concentración de proteína bajo las condiciones experimentales establecidas en este estudio.

Palabras clave: Alimentos, crecimiento, Macrobrachium, nutrición, proteína de la dieta (Fuente: CAB).

3140

Espinosa - Efectos del nivel proteico en dieta de Macrobrachium tenellum

3141

ABSTRACT Objective. To evaluate the effect of five levels of crude protein (CP) in balanced feed on the survival, growth and feed conversion ratio (FCA) in juveniles of Macrobrachium tenellum. Materials and methods. Juveniles of M. tenellum (0.31±0.01g and 32.62±1.10mm) were fed for 60 days with 20, 25, 30, 35 and 40% of CP in feed. The organisms were randomly distributed in 15 experimental tanks (15 org /tank) under controlled conditions (5.95±0.41 ppm of oxygen, 29.89 ± 0.72 °C, and pH 8.44±0.15) and fed with 10% of its live weight. Results. The survival percentage was 98.22±3.96% with no statistical difference between treatments (p>0.05). The organisms fed with 40% CP in their diet had a significantly higher weight (p<0.05) compared to the other treatments (weight change of 0.54±0.02g; weight increase 173.60±12.99%, and specific growth rate of 1.68±0.08). The FCA was significantly better (p<0.05) in organisms fed with 35 and 40% CP (2.85±0.18 and 2.40±0.05, respectively) than other treatments. Conclusions. Juveniles of M. tenellum fed with high protein levels (40%) developed faster than organisms which received a lower concentration of the protein under the experimental conditions established for this study.

Key words: Dietary protein, foods, growth, Macrobrachium, nutrition (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN De los camarones de agua dulce nativos en América existen aproximadamente 26 especies en México, América Central y Sudamérica (1), de las cuales se destacan cuatro especies de importancia comercial Macrobrachium carcinus y M. acanthurus en el Atlántico y M. tenellum y M. americanum en el Pacífico (1, 2). A partir de la segunda mitad de la década de los setentas el langostino M. tenellum fue considerado como un buen candidato para ser cultivado, teniendo en cuanta que en condiciones naturales se encuentra en altas densidades, no es agresivo y tolera un amplio y fluctuante intervalo de temperatura, salinidad y concentraciones de oxígeno (1).

En un cultivo exitoso de langostino, el manejo y la alimentación son considerados de gran importancia, puesto que el alimento constituye del 40 al 60% de los costos de producción (3). El tipo de alimento y la estrategia de alimentación representan factores de vital importancia en el aporte de la energía y nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo (4) y crecimiento de organismos acuáticos (4, 5). En alimentos prácticos formulados para la acuicultura, la proteína es el componente energético más caro y su calidad representa un aspecto nutricional muy importante (6), ya que esta es utilizada por el organismo con tres fines fundamentales: mantenimiento, recuperación de los tejidos dañados y crecimiento (7).

Pese a los esfuerzos realizados con relación al estudio de la nutrición de M. tenellum, aún no se conocen los requerimientos para cada una de sus etapas de cultivo (2). Entre estos estudios se ha informado que en la sustitución proteica de harina de pesado por harina de soya en las dietas de M. tenellum, no han sido afectados los

parámetros productivos e índices de crecimiento por dicha sustitución (7), además se ha indicado por algunos investigadores la necesidad de desarrollar una dieta nutricionalmente balanceada con el objetivo de optimizar la producción del M. tenellum (1). Por todo lo anterior, es necesario determinar el nivel de proteína adecuado en la dieta para un óptimo crecimiento de juveniles de M. tenellum.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del nivel de proteína (20, 25, 30, 35 y 40% de PC) en la dieta sobre el crecimiento, sobrevivencia y tasa de conversión en juveniles de esta especie.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. Se realizó un estudio de tipo experimental entre julio y septiembre de 2011.

Sitio de estudio. El presente estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Acuicultura Experimental del Centro Universitario de la Costa de la Universidad de Guadalajara (CUCOSTA), localizado en La Delegación Ixtapa, municipio de Puerto Vallarta, Jalisco, México (20º42´19´´ N y 105º13´16´´ O) a una altitud de 10 metros sobre el nivel medio del mar.

Dietas experimentales empleadas. Se elaboraron cinco dietas experimentales con niveles de proteína cruda (PC) de 20%, 25%, 30%, 35% y 40% (Tabla 1). Para la elaboración de las dietas se utilizó como principal fuente de proteína la harina de pescado. Todos los ingredientes fueron mezclados en un procesador de alimentos (Hobart, Troy, OH) durante 10 – 15 min, hasta producir una masa homogénea.

3142

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

Tabla 1. Ingredientes y composición proximal de las dietas formuladas (g/100 g de peso seco).

Nivel de proteína en los alimentos experimentales

Ingredientes (g/100 g)

20%

25%

30%

35%

40%

Harina integral trigo

38.00

38.00

38.00

38.00

35.09

Almidón de maíz

27.18

19.82

12.47

5.11

0.00

Pasta de soya

10.00

10.00

10.00

10.00

10.00

Harina de pescado

9.11

16.82

24.58

32.31

40.67

Aceite de hígado de bacalao

5.71

5.33

4.96

4.58

4.24

Harina de calamar

5.00

5.00

5.00

5.00

5.00

2.50

2.50

2.50

2.50

2.50

Carbonato de calcio

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

Lecitina de soya

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

0.30

0.30

0.30

0.30

0.30

Vitamina C

0.10

0.10

0.10

0.10

0.10

Cloruro de colina

0.10

0.10

0.10

0.10

0.10

Premezcla mineral crustáceos

a

Premezcla vitamina crustáceos

b

Composición proximal real (g/100 g en peso seco) Proteína cruda (Nx6.25)

20.79±0.27

26.41±0.04

32.01±0.16

37.63±0.19

42.55±0.23

Lípidos totales

7.89±0.12

7.86±0.13

8.15±0.07

7.99±0.04

8.47±0.10

Fibra cruda

0.67±0.06

0.43±0.03

0.47±0.05

0.36±0.06

0.34±0.06

Cenizas

6.55±0.04

7.84±0.05

9.04±0.02

10.52±0.02

11.73±0.01

Extracto libre nitrógeno Energía (Kcal g-1)

c

64.11

57.46

50.32

43.50

36.91

4.36±0.03

4.42±0.01

4.55±0.02

4.42±0.03

4.34±0.03

g/200g premezcla mineral: KCl, 28.57; MgSO4.7H2O, 28.57; ZnSO4.7H2O, 5.14; MnCl2.4H2O, 1.34; CuSO4.5H2O, 0.29; Kl, 0.29; CoCl2.2H2O, 0.14; Na2HPO4, 135.43. b g/900g premezcla de vitaminas: Vitamina A acetato, 100000 UI; Vitamina D3, 850 UI; Acetato di-alfa-tocoferol 2000 UI; menadiona, 2; tiamina-HCl, 0.5; rivoflavina (B2), 3; piridoxina HCl (B6), 1; DL-Ca-pantotenato, 5; ácido nicotínico, 5; biotina, 0.05; inositol, 5; Vitamina B12, 0.002; ácido fólico, 0.18. c Extracto libre de nitrógeno = 100 – (% proteína cruda + % lípidos totales + % fibra cruda + % cenizas). a

La mezcla se pasó por un extrusor de 5 mm de diámetro. Los pellets se secaron por 8 horas a 65 °C en un horno de convección. Estas dietas se conservaron en bolsas de plástico (Ziplock®) a -4°C hasta su uso.

Organismos y unidades experimentales.

Se utilizaron 225 juveniles de M. tenellum (0.31±0.01 g de peso y 32.62±1.10 mm de longitud total) obtenidos del medio natural y distribuidos aleatoriamente en 15 tinas de experimentales de plástico de 64 L (49x46x35 cm; 15 org/tina). Los organismos fueron seleccionados por su peso para homogenizar la población y se sometieron a una aclimatación durante 7 días, proporcionándoles a todos los organismos alimento con 30% PC. No se determinó el sexo de los organismos, ni se colocaron refugios en las tinas experimentales.

Todas las tinas se mantuvieron con aguas claras y bajo condiciones controladas de oxígeno (5.95±0.41 ppm), temperatura (29.89±0.72ºC), pH (8.44±0.15) y fotoperiodo (13:11 luz: oscuridad). Se emplearon filtros de cascada (Elite Hush 35) con capacidad de filtración de 500 L/h.

El diseño experimental se basó en un modelo completamente al azar con cinco tratamientos con tres replicas para cada uno. Para evitar el efecto por el cambio de alimento, se acondicionó a los organismos durante una semana con la substitución parcial del alimento de inicio por cada uno de los alimentos experimentales, hasta llegar al 100% al fin de la semana. Durante los

60 días que duró el experimento los langostinos fueron alimentados una vez al día (14:00 h) con el 10% de su peso vivo para asegurar la saciedad. Se determina este porcentaje a priori por experiencias personales de los autores en estudios previos, donde no se ha observado un consumo de alimento superior al 6 % en esta etapa de desarrollo. Las tinas se sifonearon seis horas después de la alimentación, para eliminar residuos de alimento, heces y mudas.

Parámetros biológicos evaluados. Los parámetros de crecimiento se calcularon a través de dos biometrías, para lo cual se midieron (Vernier; mm) y pesaron (balanza digital Scout pro OHAUS®; g) todos los organismos al inicio y final del bioensayo. Para la determinación de la sobrevivencia se registraron diariamente los organismos muertos. El consumo total del alimento (CT) fue calculado del día 15 al 19 y 45 al 49 del bioensayo. Los parámetros biológicos fueron calculados de acuerdo a lo siguiente: sobrevivencia (%)= 100 - (org. inicio – org. final / org. inicio) * 100; cambio de talla (mm/día)= talla final – talla inicial / días del bioensayos; cambio de peso (g/día)= peso final – peso inicial / días del bioensayos; % incremento en longitud (IT %)= [(talla final

Espinosa - Efectos del nivel proteico en dieta de Macrobrachium tenellum

3143

– talla inicial) / talla inicial] * 100;

RESULTADOS

% incremento en peso (IP %)= [(peso final – peso inicial) / peso inicial] * 100;

Los resultados de los parámetros biológicos se muestran en la tabla 2. La sobrevivencia no tuvo diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (p>0.05), su promedio fue de 98.22±3.96%. Los parámetros de crecimiento: peso final, talla final, cambio de peso y talla, IP, IT y TCE presentaron diferencias estadísticas (p<0.05) entre los tratamientos. Los valores de peso y talla final fueron mayores para los organismos alimentados con 40% de PC en la dieta (0.85±0.01g y 41.61±0.47 mm), presentando un cambio de peso de 0.54±0.02 g y de talla de 9.19±1.37 mm en los 60 días del experimento. Los mayores valores para el IP, IT y TCE fueron en los langostinos alimentados con 40% de PC, con 173.60±12.99%, 28.53±5.62% y 1.67±0.08 respectivamente. El crecimiento más bajo se dio en los organismos alimentados con la dieta que contenía 20% de PC.

tasa de crecimiento específico de peso (TCE)= [(ln peso final – ln peso inicial) / días bioensayo]*100; consumo total de alimento (CT)= (alimento suministrado – alimento no consumido) / langostinos en la tina; Consumo de PC total (g/org)= (PC suministrada – PC consumida) / langostinos en la tina; factor de conversión alimenticia (FCA)= alimento consumido / incremento en peso; tasa de eficiencia de la proteína (TEP)= incremento en peso / proteína consumida.

Análisis estadístico. Los datos generados de sobrevivencia, peso y talla final, IP, IT, TCE, CT, FCA y TEP se les aplicó el análisis de varianza (ANOVA) de una vía para cada caso, previas pruebas de normalidad (KolmogorovSmirnov, α=0.05) y homocedasticidad (Bartlett, α=0.05). Los datos expresados en porcentaje (sobrevivencia, IP y IT) se les aplicó la transformación del arcoseno de su raíz cuadrada (8). Las diferencias significativas entre las medias de los tratamientos se determinaron por medio del método de comparaciones múltiples de Tukey (p<0.05). Todas las pruebas se realizaron mediante el software estadístico SigmaStat V3.1 (9).

No existieron diferencias significativas (p>0.05) en el CT y en la TEP entre los tratamientos. Fueron estadísticamente diferentes los tratamientos en sus valores de consumo de PC total y en el FCA (p<0.05). Aunque no existió una diferencia en el CT y en la TEP, el consumo de PC total fue mayor en el tratamiento de 40% de PC (0.52±0.01 g/org) respecto a lo consumido en el tratamiento de 20% de PC (0.26±0.01 g/org).

Para el FCA el mejor resultado lo obtuvieron los langostinos de los tratamientos del alimento de 35% de PC (2.85±0.17) y de 40% de PC (2.39±0.05). Existió una correlación favorable y positiva entre los resultados experimentales y la concentración porcentual de la PC de los alimentos experimentales (Tabla 3).

Tabla 2. Sobrevivencia, tasa de crecimiento específica, consumo de alimento, factor de conversión alimenticia y tasa de eficiencia proteica de juveniles de M. tenellum después de 60 días de tratamiento.

Parámetros Sobrevivencia (%)

Tratamientos 20% PC

25% PC

30% PC

35% PC

40% PC

100.0 ± 0.00

100.0 ± 0.00

96.00 ± 0.03

99.00 ± 0.02

100.00 ± 0.00a

Peso inicial (g)

0.31 ± 0.00a

0.31 ± 0.01a

0.31 ± 0.00a

0.32 ±0.01a

0.31 ± 0.01a

Peso final (g)

0.56 ± 0.02a

0.62 ± 0.02b

0.70 ± 0.01c

0.75 ± 0.02c

0.85 ±0.01d

Cambio de peso (g/org)

0.26 ± 0.03a

0.31 ± 0.01b

0.39 ± 0.02c

0.43 ± 0.02c

0.54 ± 0.02d

Talla inicial (mm)

32.18 ± 0.74a

32.29 ± 0.77a

32.78 ± 1.16a

32.76 ± 0.60a

32.42 ± 1.70a

Talla final (mm)

36.96 ± 0.97

37.86 ± 0.58

ab

38.16 ± 0.63

39.36 ± 0.30

41.61 ± 0.47c

a

6.60 ± 0.43

Cambio de talla (mm/org)

a

a

a

ab

a

a

b

4.79 ± 1.64

5.57 ± 0.22

5.39 ± 1.29

IP (%)

82.14 ± 8.74a

99.16± 3.00a

127.32 ± 4.76b

134.00 ± 7.69b

173.6 ± 12.99c

IT (%)

28.53 ± 5.62b

a

a

ab

9.19 ± 1.37b

14.96 ± 5.44a

17.28 ± 1.07ab

16.53 ± 4.37ab

20.18 ± 1.66ab

TCE

0.99 ± 0.08a

1.15 ± 0.025a

1.37 ± 0.03b

1.41 ± 0.05b

1.67 ± 0.08c

CT (g/org)

1.24 ± 0.06a

1.31 ± 0.27a

1.41 ± 0.15a

1.21 ± 0.13a

1.30 ± 0.03a

Consumo PC total (g/org)

0.26 ± 0.01a

0.33 ± 0.07ab

0.42 ± 0.04bc

0.42 ± 0.04bc

0.52 ± 0.01c

FCA

5.18 ± 0.71

4.23 ± 0.81

TEP

0.97 ± 0.13a

0.97 ± 0.18a

a

ab

3.57 ± 0.25

c

2.82 ± 0.17

2.39 ± 0.05c

0.93 ± 0.07a

1.01 ± 0.06a

1.04 ± 0.02a

bc

Los valores medios +DE seguidos por superíndices diferentes en las fila indican diferencias significativas (p<0.05).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

Tabla 3. Correlación de resultados experimentales y el porcentaje de proteína cruda en los alimentos experimentales.

Parámetros biológicos Peso final (g)

Ecuación de la línea de regresión linear

Correlación (R2)

y = 0.014x + 0.2782

0.9622

Cambio de peso (g/org)

y = 0.0002x – 0.0005

0.9518

Talla final (mm)

y = 0.2156x + 32.325

0.8199

Cambio de talla (mm/org)

y = 0.0033x + 0.0069

0.5894

Incremento en peso (IP;%)

y = 4.3553x – 7.4153

0.9187

Incremento en talla (IT; %)

y = 0.6005x + 1.4781

0.5229

Tasa de Crecimiento Especifica (TCE)

y = 0.0325x + 0.3467

0.9305

Consumo de PC total (g/org)

y = 0.0002x + 0.0004

0.8293

Factor de Conversión alimenticia (FCA)

y = -0.1396x + 7.8286

0.8408

DISCUSIÓN La sobrevivencia de los juveniles de M. tenellum, del presente estudio, fue de 98.22±3.96% independientemente del nivel de proteína con que fueron alimentados. Resultados similares reportaron García-Ulloa Gómez et al (7), al alimentar por 45 días con base en una dieta de 40% de PC a juveniles de esta especie (91.66% de sobrevivencia); y por Gitte y Indulkar (10) quienes registraron sobrevivencias del 82.20±3.56% en M. rosenbergii alimentados por 30 días con una dieta que contenía el 40% de PC. Mientras que Luna et al (11), reportan las mejores sobrevivencias (70%) de su estudio en organismos alimentados por 30 días con 25 % de PC; contradictoriamente, Abbaspour-Davassi (12) al evaluar cinco dietas con diferentes contenidos en proteína (15, 30, 45, 60, 75 % de PC) en juveniles de M. rosenbergii, obtiene la más baja sobrevivencia en su tratamiento con 75% de PC (13.33%). En sistemas de cultivo experimental de langostinos alimentados con 35-40% de PC, tanto M. tenellum como M. rosenbergii, se han reportado sobrevivencias de 70 a 90% (6, 13, 14), influenciadas en ocasiones por la inclusión de refugios en el sistema (7, 13).

Cuando las sobrevivencias son bajas pueden deberse al canibalismo por falta de refugios para los organismos que se encuentran en fase de muda (11), cuestión que no se reflejó en el presente estudio.

En esta investigación los valores de los parámetros de crecimiento (cambio de peso y talla, IP, IT y TCE) mostraron una tendencia positiva, en la cual el crecimiento de los organismos estuvo relacionado directamente con el porcentaje de proteína cruda suministrado; los organismos que crecieron más fueron los del tratamiento

con alimento con 40% de PC. El cambio de peso después de los 60 días del bioensayo fue de 0.54±0.02 g para el tratamiento de 40% de PC, coincide con lo obtenido por García-Ulloa Gómez et al (7) a los 45 días con el mismo langostino y nivel de PC en la dieta (0.53±0.24 g). En M. rosenbergii existen resultados similares al presente trabajo, en los que se reportan los mejores parámetros de crecimiento (cambio de peso y talla, IP, IT y TCE) con dietas de 35 a 45% de PC (12, 13, 14). Casos contrarios han sido señalados, donde los mejores parámetros de crecimiento para juveniles de este género se han encontrado al alimentar con niveles proteicos iguales o inferiores al 25% de PC, como lo mencionado por Luna et al (11) en postlarvas de M. rosenbergii, al evaluar tres dietas con 25, 28 y 35% de PC, quienes obtuvieron un mayor crecimiento en longitud y cambio de peso con la dieta de 25 % de PC; mientras que Urbano et al (15) reportan, en cultivos experimentales de M. jelskii mayores crecimientos en longitud y peso a los 100 días con dietas con 20% de PC; y De los Santos y Silva (16), en su estudio de M. michoacanus bajo dietas con 25 y 28% de PC, que no encontraron diferencias significativas (p<0.05) en el cambio de peso durante 5 meses entre las dos dietas (1.17 y 1.22 g, respectivamente).

La tendencia de incremento de los valores del crecimiento de los juveniles de M. tenellum conforme al incremento de PC en las dietas de esta investigación, pueden deberse al óptimo aprovechamiento de la proteína de la dieta que se acerca a cubrir el requerimiento proteico en esta etapa de crecimiento exponencial (cercano al 40% de PC), el cuál posiblemente disminuirá al acercarse a la etapa adulta, en la que se menciona para esta especie como requerimiento proteico no más del 29% de PC (5, 17). De los Santos y Silva (16), mencionan que el crecimiento entre langostinos no es uniforme y que dependerá de la especie y del tiempo en el cual se completa su ciclo de vida, esa es la velocidad con la que se va a crecer.

Esta tendencia de crecimiento con respecto a la proteína suministrada posiblemente se pueda explicar por el incrementó en el consumo de PC y la mejora del FC cuando se aumenta el porcentaje de PC en la dieta, aunque el CT y el TEP no muestren diferencias. Indicando con ello, que los organismos que reciben un nivel más alto de PC aprovechan mejor las dietas suministradas.

El mejor resultado en el FCA se obtuvo en los langostinos alimentados con las dietas de 35 y 40% de PC (2.85±0.17 y 2.39±0.05, respectivamente), similar a lo reportado en M. rosenbergii por Kabir et al (13) en alimentos de

Espinosa - Efectos del nivel proteico en dieta de Macrobrachium tenellum 35 y 40% de PC y por Hasanuzzaman et al (18) en alimentos con 25% de PC (2.21 y 2.63; y 2.27, respectivamente). Estudios en M. tenellum reportaron valores del FCA de 1.5 en dietas con 25% de PC (19) y 1.40 en dietas con 40% de PC (7). Según Kabir et al (13), mencionan que altos valores de FCA (en el orden de 2.5-2.6) podría indicar que la proteína se estaría utilizando como energía, contraponiéndose a los resultados del presente estudio, en los cuales los menores crecimientos corresponden a los FCA más altos.

En M. tenellum aún no se establecen los requerimientos óptimos de proteína; sin embargo, se menciona que los juveniles de esta especie han tenido crecimientos favorables con 40% de proteína en sus dietas (5). Ya que se destacó a la proteína como el principal componente de las dietas comerciales, debido a su gran influencia sobre el crecimiento (20), algunos investigadores recomiendan usar raciones con un contenido proteico mayor al 40% para la alimentación de camarones de agua dulce (21). Lo anteriormente reportado y los resultados obtenidos en la presente investigación demuestran que en juveniles de M. tenellum conforme se aumenta

3145

el nivel de la proteína en la dieta se mejora el crecimiento de los organismos, y que para esta etapa 40% de PC en las dietas es el conveniente.

Por lo tanto, se puede concluir que, bajo las condiciones experimentales aquí establecidas, juveniles de M. tenellum alimentados con 40% de PC se desarrollan más rápido que organismos que reciban una menor concentración de este nutriente. Se recomienda realizar investigaciones más específicas que permitan acotar el rango de requerimiento proteico en esta etapa de crecimiento, así como desarrollar alimentos específicos para la especie.

Agradecimientos Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT-Beca 34091) y al Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL - Proyecto 06-2009-661) por apoyar esta investigación. A los integrantes del Laboratorio de Acuicultura Experimental del Centro Universitario de la Costa-UdeG por su apoyo.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3147-3153, 2012.

ORIGINAL

Aspectos preliminares del manejo reproductivo en cautiverio de la doncella (Ageneiosus pardalis Lütken, 1874) Preliminary aspects of the reproductive handling in captivity of doncella (Ageneiosus pardalis Lütken, 1874) Pedro Contreras C,1* Biol Mar, Beatriz Zapata B,2 Esp, Rafael Rosado P,3 M.Sc. INCODER-ISAGEN-Corporación Programa para la paz del Magdalena Centro, Avenida El Dorado – CAN, Bogotá. 2Universidad de los Llanos, Instituto de Acuicultura de los Llanos, km 12 vía Puerto López, Villavicencio, Colombia. 3Truchas de la Sierra, AA 85194, Bogotá. *Correspondencia: rrosadop@ gmail.com 1

Recibido: Abril de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

RESUMEN Objetivo. Evaluar procedimientos de manejo en cautiverio de ejemplares maduros de doncella Ageneiosus pardalis, con fines de reproducción y presentar una descripción preliminar del desarrollo embrionario y larvario para la especie. Materiales y métodos. Sobre ejemplares mantenidos en cautiverio se adelantaron dos ensayos de reproducción, así: a) inducción con extracto de hipófisis de carpa EHC para la espermiación (4 mg/kg; una dosis intraperitoneal) y para la ovulación (0.5 y 5 mg/ kg; intraperitoneales, 0 y 12 horas); b) inducción únicamente sobre hembras mantenidas en piletas, sin machos presentes, recolección y seguimiento de ovas. Resultados. Se comprobó la ovulación y la espermiación, pero no se avanzó en el desarrollo embrionario cuando se mezclaron los gametos y fueron incubados. Los ensayos con hembras inducidas, sin machos presentes, confirman el almacenamiento de esperma en los ovarios y los huevos obtenidos mostraron desarrollo embrionario completo, lográndose eclosión de larvas y el mantenimiento de alevinos. Conclusiones. El protocolo convencional de inducción fue efectivo en hembras y machos, pero la mezcla de los gametos no resultó ser un procedimiento viable para la producción de semilla en la especie. Se comprueba el almacenamiento de esperma en las hembras y la emisión espontánea de huevos fertilizados al medio cuando estas son sometidas a inducción. Tanto la forma y el tiempo de almacenamiento de esperma como los mecanismos fisiológicos que ocurren en la fecundación se desconocen.

Palabras clave: Auchenipteridae, reproducción, siluriformes (Fuente: AIMS).

3147

3148

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

ABSTRACT Objective. To evaluate handling procedures in captivity of mature specimens, with reproduction purposes, of doncella Ageneiosus pardalis, and to present the first advance in the description of embryonic and larval development for the species. Materials and methods. Several reproduction tests were carried out in specimens maintained in captivity, as follows: a) Spermiation and ovulation were induced with Carp pituitary extract CPE (4 mg/kg; an intraperitoneal dose for spermiation) and (0.5 and 5 mg/kg; intraperitoneal for ovulation, 0 and 12 hours); b) only females maintained in tanks, without males present, were induced. Eggs obtained from tanks were recollected and observed. Results. Ovulation and spermiation were verified, but embryonic development was not advanced when gametes were mixed and incubated. Testing with induced females, without males present, confirms sperm storage in ovaries, and eggs show a complete embryonic development, achieving hatching of larvae and maintenance of young fish. Conclusions. The conventional protocol using induction was effective in females and males, but the mixed products did not prove to be a viable procedure for seed production in the species. Sperm storage in females and spontaneous emission of fertilized eggs in their habitat, when they were subjected to induction, was confirmed.

Form and sperm as well as physiological mechanisms occurring in fertilization are unknown.

Key words: Auchenipteridae, reproduction, siluriformes (Source: AIMS).

INTRODUCCIÓN En general, entre las características morfológicas que se utilizan para diferenciar entre varios géneros de la familia Auchenipteridae se contemplan particularidades morfológicas, tanto en hembras como machos, que tienen funciones especializadas asociadas a los eventos reproductivos (1, 2). Por ejemplo, en la descripción que realizan Castillo y Brull (3) de Ageneiosus magoi se confirma que para el género es una constante la fusión de varios radios de la aleta anal, formando un órgano intromitente que en los machos permite la transferencia directa del esperma a través de un pseudopene o gonopodio. Aunque para los pimelodidos en general aparece una vesícula seminal, a la que Loir et al (4) atribuyen una función secretora, esta no se presenta en Ageneiosus; en su lugar, con posibles funciones equivalentes de secreción y almacenamiento, se desarrolla entonces una especialización del conducto deferente posterior, de forma que se incrementa su tamaño como una ampolla que finalmente desemboca en el gonopodio; esta característica, más la forma elongada del núcleo espermático y la fecundación interna, sugiere que se trata del grupo evolutivamente más avanzado en lo que se refiere al desarrollo de tracto reproductivo en machos dentro de los silúridos (4).

Castillo y Brull (3) denominan esta estructura como vesícula intermedia pero no definen su función, tanto en el proceso reproductivo como en la posible acción para la transferencia espermática en Ageneiosus. En las hembras se presenta un ensanchamiento de la porción distal de los oviductos, formándose un útero simple

que aloja al pseudopene durante la cópula y que, según Sanches et al (5), en Parauchenipterus galeatus (Auchenipteridae) permite mantener el esperma viable hasta el momento de la puesta, cuando ocurre la fecundación.

Por esta serie de adaptaciones, el manejo reproductivo controlado con fines de producción se ha asumido como de difícil logro operativo y controlado para el género. En ese mismo sentido, Castillo y Koepke (6) determinan que sus observaciones en acuario sobre Ageniosus sp son las primeras que para la cópula son descritas para cualquier especie del género; consideran que puede ser un patrón de comportamiento equivalente para las diferentes especies de la familia, dada la similitud de las adaptaciones reproductivas que les son comunes.

Con base en las sinonimias (A. caucanus, A. virgo) que para la especie referencian Maldonado et al (10), los ejemplares de doncella utilizados en este trabajo se asumen como Ageneiosus pardalis Lütken, 1874. Ya en lo que se refiere a importancia pesquera, se tiene que en el consolidado del segundo trimestre de 2011, la doncella representó el 4% (unas 129 Ton) del volumen total desembarcado en la zona del medio y bajo Magdalena (7). Si bien se le define como especie en peligro (8), son pocos los trabajos que se enfocan hacia aspectos dirigidos a su conservación y, de hecho, sólo se cuenta con una referencia que aborda particularidades de su biología reproductiva (9); información complementaria sobre bioecología se encuentra reseñada en Olaya et al (9), en Maldonado et al (10) y en Mosquera et al (11).

Contreras - Aspectos preliminares del manejo reproductivo de Ageneiosus pardalis De trabajos experimentales con énfasis en reproducción controlada no se conoce de algún registro nacional y sobre desarrollo embrionario y larval la única referencia encontrada para Auchenipteridae (Parauchenipterus galeatus) es la de Sanches et al (5).

El objetivo del presente estudio fue describir la serie de procedimientos que finalizaron con la obtención de huevos, larvas y alevinos de doncella. Con base en las características morfológicas y la observación de particularidades reproductivas se propusieron también alternativas de manejo con metas dirigidas a disponer de una producción constante de semilla. La información se complementa con los primeros registros de seguimiento embrionario y larval que se reportan en Colombia para A. pardalis.

MATERIALES Y MÉTODOS Descripción del área. El trabajo se realizó en la estación piscícola del Alto Magdalena (INCODER), localizada en el municipio de Gigante (Huila), a 960 msnm. La temperatura media es de 24°C y pluviosidad promedio de 2450 mm al año.

Ejemplares. Se dispuso de un plantel compuesto por 40 individuos, entre hembras (454.9±128.3 g) y machos (155.8±31.5 g), obtenidos en el embalse de Prado (Tolima).

Desde su traslado y hasta el momento del manejo permanecieron por un período superior a 90 días en aclimatación a las condiciones de la estación. Se utilizó un estanque en tierra de 600 m2 que hace parte de la batería que en el centro se destina al mantenimiento de especies nativas, en el que, para efectos de alimentación, fueron mantenidas poblaciones de alevinos de tilapias roja, plateada y criolla.

Manejo reproductivo Ensayo 1. En las primeras pruebas se aplicó un procedimiento convencional de inducción a la ovulación y espermiación utilizando extracto de hipófisis de carpa (EHC), en dosis preparatoria de 0.5 mg Kg-1 y 12 horas después una dosis definitiva de 5 mg Kg-1 para las hembras; en el caso de los machos se aplicó una única dosis de 4 mg Kg-1, simultáneamente a la dosis definitiva en las hembras. Los peces (15 hembras y 10 machos) fueron revisados continuamente y la medición y registro de la temperatura se realizó cada hora, hasta el momento en que se confirmó la ovulación. Mediante extrusión los huevos fueron recolectados en recipientes secos, pesados (con aproximación a 0.1 g) y

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se retiró una muestra para definir el diámetro pre inducción (µ) y el número de ovocitos g-1.

Sobre cada una de las puestas se adicionó el esperma directamente y se procedió con la mezcla de los gametos. Después de 5 minutos se agregó agua y los huevos se mantuvieron en reposo por 30 minutos antes de ubicarlos en incubadoras experimentales de flujo vertical con 2 L de capacidad.

Ensayo 2. En el transcurso del ensayo anterior se detectó la presencia de huevos en el fondo de los tanques; estos fueron recolectados y al comprobar desarrollo, se programó una segunda serie de pruebas. La observación de células espermáticas en extendidos de huevos no fecundados previamente soportó también el diseño de las pruebas.

Así, en piletas y siguiendo los mismos procedimientos de inducción que fueron aplicados en la primera fase, se mantuvó un total de 3 hembras y 6 machos, los que fueron observados permanentemente con el fin de detectar la manifestación de patrones de comportamiento de cortejo y/o cópula. En dos tanques adicionales, en este mismo ensayo, se colocaron 1 y 2 hembras inducidas en piletas separadas, pero sin la presencia de machos. En todos los casos se efectuó una revisión constante sobre el fondo del tanque, con un colador plástico, con el fin de registrar la presencia y, de ser el caso, recolectar ovocitos, los que se dispusieron en recipientes de vidrio de 50 ml y muestras del material fueron retiradas permanentemente para determinar y describir, bajo observación en microscopio y estereoscopio, avances en el desarrollo embrionario.

El conjunto de registros obtenido se presenta en forma descriptiva, con la precisión temporal de los momentos más relevantes durante las etapas de la evolución embrionaria y larval, con su correspondiente soporte fotográfico.

Igualmente se describen algunos parámetros de importancia relacionados con características reproductivas y anotaciones sobre manejo en estadios tempranos.

RESULTADOS En general, las hembras maduras son fácilmente distinguibles por el pronunciado abultamiento abdominal que presentan. La forma aserrada del primer radio de la aleta dorsal, la osificación de barbillas maxilares y la fusión de los primeros radios de la aleta anal permiten la identificación de machos maduros, en los que la emisión de esperma por masaje es también evidente. Aunque el dato debe ser precisado, la

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inducción con las dosis utilizadas se manifestó en ovulación efectiva a partir de los 625 grados h-1, en una temperatura media de 25.5°C. Salvo en dos ejemplares, el esperma extraído se mostró activado en todos los demás casos; con la adición de agua o suero fisiológico, las células perdieron integridad. La figura 1 muestra aglomerados de espermatozoides que parecerían estar confirmando la presencia de paquetes espermáticos en los ovarios, lo que debe ser objeto de evaluación posterior.

Los huevos de A. pardalis tienen una coloración que varía de amarillo a naranja, presentan doble membrana y, con la hidratación finalizada, el espacio perivitelino es relativamente reducido; son demersales, adherentes, y en una distribución normal de diámetro se determinó la mayor frecuencia en el rango de 1000 a 1250 µ. En cantidad, se obtuvieron entre 425 y 535 huevos por gramo.

En los tanques no se observó comportamiento de cortejo y cópula entre los peces inducidos.

En las pruebas que se adelantaron con hembras inducidas y sin la presencia de machos (ensayo 2), la ovulación y la presencia del material fecundado fue comprobada con la recolección de huevos viables en el fondo de las piletas. El desarrollo embrionario fue normal (Figura 2 a - h) y la eclosión ocurrió entre las 48 y 60 horas, con una temperatura aproximada de 22°C. Las larvas aceptan nauplios de Artemia y aparentemente no se presenta canibalismo. El seguimiento del desarrollo embrionario finalizó con la eclosión de larvas, confirmando que las hembras almacenan el esperma en los ovarios y la fecundación ocurre al parecer en el momento de la puesta.

Figura 1. Cortes histológicos de ovario de doncella.

A. Distribución espermática rodeando oocitos en estadio perinucleolar (OP), Ez: espermatozoides; B. Oocito maduro con granulos de vitelo (GV), oocitos inmaduros (OI) y ezpermatozoides (Ez).

Técnica H E 100x.

Figura 2. Desarrollo temprano en doncella (Ageneiosus pardalis). A. Gastrulación, con epibolia > al 50%; B. Blastomeración, 4 blastómeros; C. Organogénesis inicial; D. Organogénesis tardía; E. Larva recién eclosionada; F,G,H. Alevinos.

Contreras - Aspectos preliminares del manejo reproductivo de Ageneiosus pardalis

DISCUSIÓN El rango de diámetro de los huevos que fue determinado (1000 a 1250 µ), coincide con el que reportan Olaya et al (9) para la especie (1014 ± 287 µ); en comparación, esta talla es inferior a la que se registran para otras especies del género, como A. ucayalensis (1.85 mm) y A. valenciennesi, con 1.74 mm (5). En términos de manejo reproductivo, A. pardalis puede desovar espontáneamente mediante inducción con EHC. La puesta parece ser intermitente, en tanto se encuentran huevos de forma constante en las piletas, lo que estaría indicando una estrategia, por comprobar, que permitiría proceder con la emisión parcial en condiciones y sitios favorables. Respecto al primer ensayo se debe anotar que, puesto que existe la posibilidad de que en el momento de realizar extrusión se dispuso de huevos fértiles, las pérdidas que se presentaron en el transcurso de la incubación sugieren que para la especie deben ser valorados otros sistemas de manejo de las ovas en esta etapa.

En los machos, que en el momento de la revisión inicial presentan emisión de esperma, la aplicación de la hormona no es necesariamente un factor decisivo pues la producción seminal es relativamente abundante aún sin inducción; de cualquier forma, es evidente que valoraciones posteriores sobre las características particulares del material espermático deben ser objeto de estudio, considerando también el efecto de los inductores sobre los parámetros de calidad seminal. Con la presencia de un gonopodio se elimina la necesidad de formar paquetes espermáticos, tanto en la forma de un espermatóforo o como espermatozeugmata (12, 4). En los casos de fecundación interna, Burns et al (13) describen que, aún con algunas variaciones entre especies, el almacenamiento del esperma por parte de la hembra se efectúa en agrupaciones celulares diferentes, que pueden ser de alguno de los tipos mencionados. Como en este caso, en los extendidos de los huevos obtenidos por biopsia, los espermatozoides se observaron aparentemente libres, la formación por parte del macho y el almacenamiento por parte de la hembra de un empaquetamiento tipo espermatozeugmata no es aún clara.

Grier et al (12), en una precisión conceptual, diferencian entre procesos de fertilización interna y los que corresponden a una asociación interna de gametos. Establecen que en este último patrón de reproducción se incluyen especies de las que es posible obtener huevos en los que posteriormente se confirma desarrollo embrionario, sin necesidad de proceder con

3151

procedimientos de fecundación; dentro de los ovarios pueden presentar células espermáticas, pero sin embriones en formación, lo que hace la diferencia con aquellas especies en las que hay fecundación interna. Este fue precisamente el caso observado en la doncella, pues hay una evidente introducción de espermatozoides y los huevos viables obtenidos proceden de una fecundación realizada en el momento de la puesta, lo que corrobora los registros que Loir et al (4) establecen para la familia. Se desconoce para las especies de Ageneiosus el tiempo en el cual el esperma puede ser almacenado y mantenerse viable hasta la ovoposición (14), y no están descritos los mecanismos involucrados en la fecundación cuando ocurre la puesta. La recolección permanente de huevos dentro de las piletas sugiere la posibilidad de que una hembra pueda desovar en varios sitios y no de forma total en una sola localidad, lo que tendría relación con la estrategia reproductiva derivada de la asociación interna de gametos que se traduce con el almacenamiento de esperma.

La construcción de nidos o la utilización de otro tipo de estructuras para el desove son cuestiones de comportamiento reproductivo que aún deben ser definidas. También persiste el interrogante sobre la posibilidad de que se presente cópula directamente en los estanques o, que en el momento de la captura los ejemplares ya disponían de material espermático almacenado.

Como se mencionó, el lote disponible se mantuvo en aclimatación por más de 90 días, por lo que la capacidad de sostener la integridad del esperma en un extenso período de tiempo es una cuestión por resolver y que aún requiere seguimiento experimental. Con base en lo anterior, se plantean las siguientes consideraciones de manejo reproductivo en cautiverio para la especie: a) De demostrarse que existe cópula en el interior de los estanques, el control de la reproducción en cautiverio se debe puntualizar en la aplicación del inductor exclusivamente sobre las hembras, en las dosis descritas y con las cuales se confirmó respuesta positiva.

En consecuencia, se puede proceder con la recolección continua de los huevos (cuya viabilidad se comprobó), directamente en los tanques en los que se mantienen las hembras inducidas. b) La extrusión de hembras ya ovuladas es una segunda opción, lo que tendría la ventaja operativa de disponer de un sólo lote para manejo en incubación. c) De no ocurrir cópula en cautiverio, la explicación

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que tiene la presencia de huevos fertilizados observada en estos ensayos solamente estaría dada si se asume que las hembras capturadas ya disponían del material espermático en los ovarios. Siendo esta la situación, los esquemas de obtención de larvas para un programa de producción constante pueden sustentarse en la captura de hembras maduras, proceder con la inducción descrita y disponer de huevos aplicando cualquiera de las opciones determinadas anteriormente; por tanto, se confirmaría que no hay necesidad de trabajo sobre los machos.

En definitiva y con base en lo observado, la obtención de ovocitos viables en A. pardalis es técnicamente factible. Ahora bien, se debe aclarar que por las características de los huevos y el tiempo relativamente largo que tiene el desarrollo embrionario que, como se mencionó, en media puede ser de unos 1250° h-1. Los aspectos relacionados con la adaptación y mejoramiento de los sistemas de incubación y el manejo de procedimientos de mantenimiento de larvas y alevinos se deben contemplar como la base de futuras líneas de investigación.

En conclusión, la respuesta a la inducción en las dosis definidas como convencionales demostró ser efectiva para promover la ovulación y la espermiación; en este caso la obtención directa por extrusión y la posterior mezcla de los gametos no se considera como un procedimiento técnicamente práctico para la producción de semilla viable para la especie.

Las estructuras anatómicas especializadas para la reproducción confirman la adaptación para la intromisión del esperma del macho hacia la

hembra, lo que se corrobora con la presencia de espermatozoides en extendidos de huevos obtenidos sin haber efectuado la mezcla artificial de gametos; se desconoce tanto si se presenta cópula en estanques como el tiempo en el que el material espermático se sostiene viable en los ovarios. También queda por resolver si las células espermáticas se encuentran en forma libre dentro de los ovarios o en la forma de empaquetamiento tipo espermatozeugmata.

La ovulación y la puesta en hembras inducidas se presentan en las piletas de manejo; el material recolectado es viable en términos de desarrollo embrionario, eclosión, larvicultura y alevinaje temprano.

El tiempo de desarrollo embrionario y larval, relativamente extenso para especies de clima cálido, implica proyectar la evaluación de diferentes equipamientos para mejorar la eficiencia durante la incubación.

Agradecimientos Los resultados obtenidos se soportan en el Convenio de Cooperación Técnica 0368 INCODER – ISAGEN - CORPORACION PROGRAMA DE DESARROLLO PARA LA PAZ DEL MAGDALENA CENTRO, entidades a las que correspondió su financiamiento. La participación y colaboración del personal técnico y operativo de la Estación, en lo referente al mantenimiento y manejo de los reproductores, además de Natalia Torres Forero, Tecnóloga en Acuicultura Continental, fueron determinantes durante las actividades de control y seguimiento sobre embriones, larvas y alevinos.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3154-3161, 2012.

ORIGINAL

Evaluación ultrasonográfica de las medidas dorsales y del anca y su relación con metabolitos lipídicos en ganado Brahman Ultrasonographic evaluation of back and hip measurements and their relationship to lipid profile in Brahman cattle Néstor Alonso Villa A.1* M.Sc, Paulo Duque M,1 MVZ Ariel Jiménez R,2 M.Sc, Alejandro Ceballos M,1 Ph.D. Universidad de Caldas, Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Sistemas de Producción, A.A 275 Manizales, Colombia. Grupo de Investigación en Biología de la Producción Pecuaria. 2Asociación Colombiana de Criadores de Ganado Cebú (ASOCEBÚ). *Correspondencia: navilla@ucaldas.edu.co 1

Recibido: Marzo de 2011; Aceptado: Julio de 2012.

RESUMEN Objetivo. Determinar las medidas ultrasonográficas de musculatura y grasa en ganado Brahman estabulado y su asociación con edad, sexo y los valores sanguíneos de colesterol total (CT), lipoproteínas de alta densidad (HDL) y baja densidad (LDL), triacilgliceroles (TG), β-hidroxibutiratos (β-OHB) y tiroxina libre (T4). Material y métodos. Se seleccionaron 180 animales entre machos y hembras con edades entre 9 y 24 meses. De cada animal se tomaron medidas ultrasonográficas del área de ojo del lomo (AOL), profundidad del músculo glúteo medio (PMGM), espesor de grasa dorsal (EGD) y espesor de grasa del anca (EGA), y muestra de sangre para determinar los metabolitos sanguíneos.

Se emplearon correlaciones y regresión lineal para establecer las asociaciones entre las variables.

Resultados. El sexo y el peso del animal fueron predictores útiles de las medidas de la musculatura y cobertura grasa en el dorso y el anca del animal. Igualmente, el sexo y el peso produjeron cambios en la concentración de los metabolitos séricos estudiados. La correlación entre algunos metabolitos séricos y EGD, PMGM, y EGA fue baja. Conclusiones. La relación que existe entre las evaluaciones de la musculatura y la cobertura grasa es baja, lo que indica que los metabolitos séricos evaluados no son predictores adecuados del desempeño productivo de ganado Brahman para exposición mantenido en estabulación.

Palabras clave: Colesterol, grasas, lípidos, músculos (Fuente:CAB).

3154

Villa - Evaluación ultrasonográfica de las medidas dorsales, anca en Brahman

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ABSTRACT Objective. To establish the relationship between ultrasonographic measurements of muscle and fat in back and hip of Brahman cattle fed for cattle shows and their association with serum levels of total cholesterol (CT), high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (LDL), triglyceride (TG), β-hydroxybutirate (β-OHB), and free thyroxin (T4). Materials and methods. One hundred and eighty animals were purposively selected. The age varied between 9 and 24 months. Ultrasonographic measurements from the loin eye area (AOL), depth of gluteus medius (PMGM), backfat thickness (EGD), and hip fat thickness (EGA) from each animal were recorded. Blood serum samples were collected to determine total cholesterol (CT), lipoproteins (HDL and LDL), triglycerides (TG), and thyroxin (T4).

Correlation and linear regression analyses were conducted. Results. Gender and weight were related to muscle and fat coverage measurements in the backs and hips of the animals. Differences in serum metabolites were also related to gender and weight. Although there was a significant correlation between the ultrasonographic measurements and serum metabolites, the associations were weak.

Conclusions. The relationship between ultrasonographic measurements of back and hip with serum lipid metabolites is weak, which indicates that those metabolites are not suitable to predict the productive performance of Brahman cattle fed for cattle shows.

Key words: Cholesterol, fat, lipids, muscles (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN En los sistemas productivos donde se crían animales cebuínos para exposiciones ganaderas, la suplementación alimenticia comienza desde edades tempranas, utilizándose generalmente alimentos balanceados. La composición muscular es un indicador del balance nutricional durante el crecimiento de los bovinos destinados a la producción de carne y es sabido que el exceso en la suplementación alimenticia produce una mayor acumulación de grasa subcutánea e intramuscular y una mayor síntesis de proteína (1).

Las consecuencias de la sobrealimentación en machos son la obesidad y problemas de aplomos, los cuales pueden contribuir en forma indirecta a alteraciones de la conducta sexual (2). El sobrepeso en la hembra, entendido como un evidente incremento de la condición corporal (sobreacondicionamiento), está relacionado con cambios en el perfil lipídico a nivel sanguíneo y ovárico induciendo alteraciones de la fertilidad (3).

La ultrasonografía se ha propuesto como un método in vivo para evaluar el grado de engrasamiento y el desarrollo muscular en bovinos, siendo un método no invasivo y de fácil interpretación (4). En ganado Brahman, si bien se ha utilizado la ultrasonografía para evaluar el grado de engrasamiento, no se conocen antecedentes acerca de la asociación entre las medidas ultrasonográficas AOL, PMGM, EGD y EGA y los indicadores metabólicos del balance de energía.

Se ha propuesto como hipótesis para este estudio que aquellos animales más pesados y con medidas ultrasonográficas mayores para

las variables descritas, tendrían cambios en los metabolitos sanguíneos relacionados con el metabolismo energético. En consideración a lo anterior, el objetivo de este estudio fue conocer las medidas ultrasonográficas de grasa y musculatura en lomo y anca en ganado Brahman estabulado para exposición y su asociación con el sexo, la edad y el peso del animal, y con los valores sanguíneos para metabolitos relacionados con el metabolismo energético como CT, HDL, LDL, TG, β-OHB y T4.

MATERIAL Y MÉTODOS Animales. Se seleccionaron aleatoriamente de un listado de animales Brahman estabulados para exposición y registrados en la asociación de criadores, 180 individuos (i.e. 96 hembras y 84 machos) clínicamente sanos, con edades entre 9 y 24 meses, que fueron pesados al momento de llegar a los eventos y exhibidos en la Feria Nacional Cebú 2007 y en la Feria Internacional Cebú 2008.

Datos ultrasonográficos. Se llevó a cabo la medición del AOL, PMGM, EGD tomada al nivel de las costillas 12 y 13, y EGA para cada uno de los animales (5). Para las mediciones, previa sujeción del animal, se utilizó un ecógrafo ESAOTE PIE MEDICAL® modelo Aquila con una sonda sectorial de 3.5 MHz (Pie Medical, Philipsweg, Holanda) y fueron realizadas por un técnico siguiendo la metodología previamente descrita (5). El AOL se expresó en cm2 y la PMGM en cm; el espesor de las grasas dorsal y del anca en mm.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

Toma de muestras y análisis. De cada animal se tomó una muestra de sangre (10 mL) mediante venopunción coccígea depositándose en tubos al vacío (Vacutainer, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) sin anticoagulante. Las muestras fueron centrifugadas a 1800 g por 5 minutos y se refrigeraron a 4ºC hasta su envío al laboratorio donde se congelaron a -20°C hasta su análisis.

Se determinó la concentración de CT, HDL, LDL, TG, β-OHB y T4 mediante la utilización de reactivos comerciales (BioSystems, Barcelona, España) en el Laboratorio de Patología Clínica del Hospital Veterinario de la Universidad de Caldas.

Análisis estadístico. Se llevaron a cabo análisis separados para evaluar la asociación incondicional entre las variables explicatorias (peso, sexo y edad del animal) y las variables respuesta (AOL, PMGM, EGD y EGA). Igualmente, se evaluó separadamente el efecto del peso, sexo y edad sobre los indicadores del metabolismo lipídico. Pese a lo anterior, algunas de las variables explicatorias fueron consideradas como variables respuesta, como por ejemplo en la evaluación de la asociación entre la edad y el sexo, y entre el peso y el sexo. Estas asociaciones se establecieron mediante correlación simple y regresión lineal simple (6). Las variables que estaban incondicionalmente asociadas (p≤0.10) fueron retenidas para la construcción de un modelo de regresión lineal multivariado, que fue posteriormente reducido mediante la selección de paso atrás (backward selection), dejando en el modelo final las variables que presentaban un valor p≤0.05 (6).

Todos los análisis incluyeron las variables independientes: peso del animal (kg), sexo (hembra o macho) y edad categorizada como 0 (9 a 11 meses), 1 (12 a 14 meses), 2 (15 a 17 meses), 3 (18 a 20 meses) y 4 (21 a 23 meses).

El sexo y el peso de los animales fueron evaluados como potenciales variables de confusión en las diferentes asociaciones analizadas. Los supuestos del modelo fueron evaluados mediante el análisis de los residuos, y las asociaciones significativas (p≤0.05) fueron presentadas como el promedio del cuadrado mínimo basado en el modelo. Los análisis fueron realizados usando los comandos ‘pwcorr’ y ‘reg’ en Stata version 12.1 (StataCorp, College Station, TX, USA).

RESULTADOS La edad promedio de los animales del estudio fue 458±122 días, con un rango entre 277 y 716 días, no observándose diferencias según el sexo (P=0,87). El peso promedio fue 517±117 kg, con un peso mínimo de 311 kg y un máximo de 818 kg. Los machos fueron 78.9±16.4 kg más pesados que las hembras (p<0.001).

El promedio y la desviación estándar para cada una de las variables analizadas según la edad y el sexo se presenta en las tablas 1 y 2. En algunas de las variables estudiadas, como por ejemplo EGD y TG, se observó una alta variación en los datos; mientras que para otras variables la variación fue menor, como en el caso de PMGM y T4.

Tabla 1. Promedio (X) y desviación estándar (DE) para las medidas ultrasonográficas según el sexo y la edad en ganado Brahman estabulado. n

AOL (cm2)

PMGM (cm)

EGD (mm)

H2

M

H

M

H

M

0

37

31

79±10.2

89±14.0

7.9±0.7

1

21

22

90±12.8

98±22.9

8.8±1.0

2

19

17

103±7.8

116±10.5

3

12

8

115±6.8

122±8.9

4

7

6

110±8.1

111±10.0

1

EGA (mm)

H

M

H

M

8.6±0.8

7.5±4.1

5.5±2.1

11.6±3.8

9.3±2.9

9.6±0.8

12.5±5.5

9.0±2.4

16.6±4.7

12.6±4.6

9.2±0.9

10.2±0.9

15.8±3.6

13.2±5.3

19.4±4.2

15.9±5.2

9.7±1.2

10.8±1.2

24.3±7.2

11.9±5.8

27.4±7.5

17.4±5.7

9.3±1.1

11.0±0.5

23.1±5.0

15.2±6.2

28.3±5.5

20.0±5.5

Categorías de edad: 0 (9 a 11 meses), 1 (12 a 14 meses), 2 (15 a 17 meses), 3 (18 a 20 meses) y 4 (21 a 23 meses) 2 H: Hembras. M: Machos 1

Tabla 2. Promedio (X) y desviación estándar (DE) para metabolitos sanguíneos según el sexo y la edad en ganado Brahman estabulado.

CT (mmol/L)

n

HDL (mmol/L)

LDL (mmol/L)

TG (mmol/L)

β-OHB (mmol/L)

H2

M

H

M

H

M

H

M

H

M

H

M

0

37

31

6.9±1.9

5.9±1.5

2.8±0.8

2.4±0.6

4.1±1.6

3.4±1.2

0.6±0.4

0.4±0.3

0.5±0.1

0.7±0.2

17.2±2.4 17.4±2.6

1

21

22

7.8±1.4

7.2±1.2

3.0±0.7

2.8±0.6

4.8±0.9

4.4±0.9

0.6±0.4

0.5±0.5

0.5±0.2

0.6±0.2

18.0±1.5 17.6±2.9

2

19

17

8.1±1.9

6.7±1.2

3.1±0.6

2.6±0.6

5.0±1.7

4.1±1.2

0.6±0.4

0.3±0.3

0.6±0.1

0.5±0.1

17.0±1.6 18.1±2.1

3

12

8

6.8±1.5

7.2±2.1

2.7±0.5

2.9±0.6

4.0±1.2

4.3±2.0

0.7±0.4

0.5±0.3

0.6±0.1

0.5±0.1

17.4±3.3 19.1±1.7

4

7

6

7.6±1.3

7.3±1.8

3.1±0.9

3.0±0.4

4.5±1.9

4.2±1.4

0.7±0.3

0.6±0.4

0.5±0.1

0.6±0.3

19.9±2.7 17.7±1.5

1

Categorías de edad: 0 (9 a 11 meses), 1 (12 a 14 meses), 2 (15 a 17 meses), 3 (18 a 20 meses) y 4 (21 a 23 meses) 2 H: Hembras. M: Machos 1

T4 (pg/mL) H

M

3157

Villa - Evaluación ultrasonográfica de las medidas dorsales, anca en Brahman La variable peso estaba relacionada en forma significativa con las variables sexo y edad; por consiguiente, estas variables fueron excluidas del modelo final en cuanto al análisis de su efecto sobre el AOL para evitar la colinearidad, dejando solamente como variable independiente el peso del animal. En cuanto a las otras variables dependientes, se optó por dejar en el modelo final el efecto del sexo siempre y cuando fuera un predictor significativo.

Medidas Ultrasonográficas. Según se mencionó anteriormente, el análisis de la asociación entre el sexo y la edad con las variables dependientes indicó que entre las variables peso y AOL había una colinearidad significativa. Lo anterior significa que estas variables estaban explicando la misma respuesta, por lo que fueron excluidas del modelo final dado que la utilidad de este modelo es predictiva y no buscando una asociación causal.

El peso del animal estaba asociado significativamente con las variables AOL, PMGM, EGD y EGA. En general se observó que la medida para estas variables aumenta en los machos y según el peso del animal (Tabla 3). Además, se observó una interacción significativa entre el sexo y el peso sobre el EGD y el EGA, lo que indica que el efecto del peso depende del sexo del animal.

Tabla 3. Modelo final para la evaluación de la asociación entre el peso y el sexo del animal con las medidas ultrasonográficas en ganado Brahman estabulado.

Variable

Coeficiente (±EE)

AOL (cm2) Intercepto Peso

Peso

Bioquímica sanguínea. Las relaciones encontradas entre las variables peso y sexo de los animales con los metabolitos sanguíneos se presentan en la tabla 4.

La concentración promedio de colesterol estuvo asociada con el peso y el sexo del animal, observándose que las hembras tuvieron una mayor concentración (Tabla 4). Con respecto a las lipoproteínas de alta y baja densidad se encontró una asociación significativa con el sexo, y al igual que para el colesterol, los valores más altos se encontraron en las hembras y los animales más pesados (Tabla 4). A diferencia de lo anterior, la concentración sérica de TG no estuvo asociada con el peso.

Al analizar la proporción de lipoproteínas con respecto a la concentración total de colesterol, se observó que la fracción HDL varió entre 38 y Tabla 4. Modelo final para la asociación entre el peso y el sexo del animal con los indicadores del perfil lipídico en ganado Brahman estabulado.

Variable

Machos

Peso

34.9±4.2

<0.001

Hembras

<0.001

Machos

0.49 5.5±0.3

<0.001

Intercepto

0.007±0.001

<0.001

Peso Hembras

0.0 0.40±0.14

0.005 0.64

Machos

<0.001

2.40±0.23

<0.001

0.001±0.005

0.05

0.0 -0.35±0.48

Intercepto

<0.001

Peso

Sexo

0.001 0.06

<0.001

3.42±0.23

<0.001

0.002±0.001

0.02

Sexo 0.0

Hembras

10.1±3.0

0.001

-0.03±0.01

<0.001

EGA (mm)

Machos

<0.001

Peso

0.062±0.005

<0.001

0.59±0.38

Hembras Machos

0.0 -0.14±0.05

T4

10.0±3.2

0.002

-0.03±0.01

<0.001

<0.001

Sexo

Sexo 0.00

0.003 0.04

Intercepto

-12.16±2.21

0.0 -0.65±0.21

TG

0.61

Intercepto

Machos

0.0 -1.00±0.25

LDL

-16.59±2.08

Interacción peso*sexo

0.007

Sexo

0.063±0.004

Hembras

<0.001

0.06

Peso

Interacción peso*sexo

5.91± 0.55 0.003±0.001

HDL

Intercepto

Machos

P

Sexo

0.12±0.01

EGD (mm)

Hembras

R2 0.09

Intercepto

P

Sexo Hembras

Coeficiente (±EE)

CT

0.57

PMGM (cm) Intercepto

R2

Con estos resultados, el EGD estimado para una hembra de 500 kg es 14.9±0.08 mm, mientras que para un macho el valor estimado sería 10.0±2.1 mm. Con respecto al EGA, en una hembra del mismo peso el valor estimado es 18.8±2.2 mm, en un macho el valor sería 13.9±1.5 mm.

0.008 0.03

Intercepto Peso

15.83±0.81

<0.001

0.003±0.001

0.02

3158

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

Tabla 5. Matriz de correlaciones entre las medidas de musculatura y grasa dorsal en el lomo y el anca y los metabolito sanguíneos en ganado Brahman para exposición y mantenido en estabulación.

Variables

AOL

EGD

PMGM

EGA

CT

HDL

LDL

TG

AOL

1.000

EGD

0.465

p

0.000

PMGM

0.575

0.311

p

0.000

0.000

EGA

0.410

0.812

0.209

p

0.000

0.000

0.005

CT

0.094

0.251

0.169

0.166

p

0.209

0.001

0.024

0.026

HDL

0.045

0.182

0.090

0.130

0.586

p

0.551

0.015

0.232

0.085

0.000

LDL

0.091

0.214

0.159

0.136

0.918

0.217

p

0.226

0.004

0.035

0.070

0.000

0.003

TG

-0.013

0.138

-0.033

0.166

0.099

0.272

-0.014

p

0.862

0.065

0.665

0.027

0.184

0.000

0.857

β-OHB

-0.076

-0.077

-0.074

-0.022

0.014

0.089

-0.027

-0.098

p

0.311

0.310

0.327

0.771

0.851

0.240

0.722

0.192

β-OHB

1.000 1.000 1.000

41% tanto en las hembras como en los machos.

Mientras que la fracción LDL varió entre 58 y 62% con respecto al colesterol total.

La concentración sérica de β-hidroxibutiratos no estuvo asociada con las variables sexo (p=0.09) y peso del animal (p=0.60).

Con respecto a la T4, ésta presentó una asociación significativa solamente con el peso del animal (p=0.02; Tabla 4).

No todas las variables estudiadas para evaluar la musculatura y la cobertura grasa en el dorso y el anca estaban relacionadas con los metabolitos sanguíneos. Aunque el CT y otros indicadores del metabolismo lipídico estaban relacionados con EGD, PMGM y EGA en forma significativa, los valores de correlación fueron bajos (Tabla 5).

DISCUSIÓN El valor predictivo para la musculatura y la cobertura grasa en el dorso y el anca del animal, presentaron un coeficiente de determinación alto, lo que permite indicar que al menos un 50% de la variación en estas medidas estaba asociada con las variables explicatorias incluidas en el modelo (6). Por el contrario, la edad y el peso del animal explicaron una baja proporción de la variación en las variables bioquímicas estudiadas.

Los coeficientes de correlación observados para la evaluación entre la musculatura y la cobertura grasa en el dorso y el anca, fueron bajos, indicando una débil asociación lineal entre las variables (6).

1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Las medidas ultrasonográficas observadas fueron ligeramente más elevadas a lo descrito en otros estudios involucrando animales Brahman rojo y gris a los 18 meses de edad y mantenidos en pastoreo (1). Así como también fueron mayores a lo observado por otros autores (7), quienes hallaron un promedio para AOL de 45.2, 48.1 y 39.1 cm² en animales con edades entre 9 y 12 meses. En animales cruzados de las razas Blanco Orejinegro x Cebú, Romosinuano x Cebú y Angus x Cebú con edades entre 18 y 24 meses, se ha encontrado un promedio menor para el AOL con respecto a los resultados obtenidos en este estudio (8). Estas diferencias pueden deberse a factores nutricionales, ya que los animales mantenidos en pastoreo podrían estar recibiendo una menor concentración de nutrientes comparado con animales estabulados como es el caso de los individuos observados en el presente estudio. Además, puede haber diferencias genéticas debidas a la raza o los cruzamientos entre ellas (9).

En este estudio se hallaron valores mayores de PMGM a los observados previamente en novillos Hereford de 16 meses de edad, donde encontraron un promedio de 7.8 cm (10). No obstante en otro estudio, reportan un promedio de 11.6 cm en toros jóvenes de varias razas (11). Estos mismos autores indicaron que las mediciones ultrasonográficas de animales vivos, tales como la PMGM y el EGA, permiten predecir más exactamente el porcentaje magro de las canales bovinas en comparación con las mediciones reales de la canal.

Para el EGD los resultados fueron mayores a los observados previamente para animales cruzados,

Villa - Evaluación ultrasonográfica de las medidas dorsales, anca en Brahman observándose diferencias entre machos y hembras y según la edad (7). Ademas, estos mismos autores encontraron que los valores para el EGD aumentaban con la edad del animal y eran mayores en hembras, similar a lo obtenido en este estudio. En machos Brahman en crecimiento y mantenidos en pastoreo, los valores para EGD fueron más bajos que los obtenidos en este estudio (1). En general, los animales mantenidos bajo condiciones de pastoreo tienen un EGD inferior a los animales que son mantenidos bajo condiciones de estabulación, así como también hay diferencias según la raza y la zona geográfica de ubicación de las explotaciones (12).

El EGD en los animales de este estudio fue mayor a lo que se indica en la literatura, lo que está relacionado con una mayor y más rápida deposición de grasa dorsal que grasa intramuscular, lo que no es adecuado para obtener una canal de alta calidad y permitir una mejor comercialización (13). Se sabe que los animales más precoces en su desarrollo empiezan a fijar grasa a una edad más temprana, pues durante el crecimiento estos animales conforman primero la masa muscular y una vez que han alcanzado su crecimiento pico, se inicia el depósito de grasa (4). Este fenómeno unido a una sobrealimentación, característico de los programas de estabulación para ganado de exposición, estaría explicando la acumulación grasa desde una edad más temprana comparada con los animales mantenidos en pastoreo.

El EGA es una medida mejor valorada que el EGD, ya que el EGA puede ser mayor a la grasa del lomo de los animales debido a procesos fisiológicos; además, es la medida usada para determinar con mayor precisión el total de grasa corporal, ya que es altamente repetible y más fácil de evaluar e interpretar (8). Los resultados obtenidos en este trabajo concuerdan con otros estudios, donde la medición del EGA fue superior al EGD, lo que se encuentra relacionado con la distribución de la grasa de cobertura en el animal vivo, observándose además una alta correlación con el EGD (10). Los valores de EGA observados fueron similares a los descritos previamente para machos Hereford (10). No obstante, fueron mayores a los señalados para hembras en crecimiento Bos taurus (5).

Con respecto a los metabolitos sanguíneos, el CT fue superior a valores previamente descritos (14, 15), y a otros valores observados en vacas Brahman suplementadas y no suplementadas con grasas, cuyos valores fluctuaron entre 2.5 y 3.0 mmol/L (16). Se sabe que la concentración de CT está influenciada más por variables no relacionadas con el sexo, la edad o el peso del

3159

animal, que fueron los predictores considerados en este estudio. Entre otros factores, el CT puede estar influenciado por la raza y la pastura que consumen los animales como base de la alimentación (17).

La relación de HDL y LDL se encontró invertida con relación a lo descrito para bovinos (18) y para vacas Brahman durante el pre y postparto (19).

Igualmente, una baja relación HDL:LDL ha sido un hallazgo observado en estudios previos con vacas Brahman subfértiles (3). La relación entre las lipoproteínas LDL y HDL puede verse afectada por desequilibrios de tipo nutricional, cuya evaluación no fue parte de los objetivos de este estudio. Se ha observado que la concentración de LDL es superior en bovinos cebú mestizos suplementados con semilla de algodón entera, aumentando el contenido de grasa en la ración (20).

La concentración de TG promedio en ambos sexos fue superior a la referencia (14). Similar a lo que sucede con el CT, la evaluación de la alimentación no fue un objetivo de este estudio, pero se ha señalado que la alimentación más que variables como el sexo o la edad pueden influir significativamente en los cambios observados en los metabolitos relacionados con el metabolismo lipídico (21).

Se ha descrito que una concentración de β-OHB menor a 0.46 mmol/L es considerada como valor referencia para bovinos (14). Los valores obtenidos en este estudio se encontraban ligeramente aumentados con respecto a este valor, pero no necesariamente compatibles con los observados para los casos de cetosis subclínica (> 1.0 mmol/L). Otros factores, no necesariamente relacionados con la dieta, pudieron haber influido para observar este leve aumento en la concentración de β-OHB (22).

La concentración de T4 en suero fueron similares a las encontradas en vacas no gestantes y no lactantes (23). Aunque en este estudio no se encontraron diferencias en T 4 con respecto a la edad y sexo de los animales, éstos se describen como factores que pueden alterar la concentración de dicha hormona, además de otras situaciones como enfermedades, estrés, factores ambientales y composición racial de los animales (24, 25).

Las variables relacionadas con musculatura y cobertura grasa en el dorso y el anca no estaban relacionadas con los indicadores del metabolismo l i p í d i c o, e xc e p t o a l g u n a s c o r r e l a c i o n e s significativas y bajas que se observaron con la concentración de CT y lipoproteínas. Lo

3160

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

anterior estaría indicando que los metabolitos sanguíneos estudiados no guardan una relación lineal con la musculatura o la cobertura grasa, no siendo entonces indicadores útiles que permitan establecer un eventual desempeño productivo.

Agradecimientos.

A la Vicerrectoria de Investigaciones y Posgrados de la Universidad de Caldas y a la Asociación Colombiana de Criadores de Ganado Cebú – Asocebú por el apoyo para desarrollar este estudio.

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ORIGINAL

Identificación de agentes infecciosos asociados con Diarrea Neonatal Bovina en la Sabana de Bogotá Identification of infectious agents associated with Bovine Neonatal Diarrhea in the Sabana de Bogotá Dolly Pardo M,1 M.Sc, Olimpo Oliver E,1* Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia Departamento de Ciencias para la Salud Animal, Grupo de Investigación en Enfermedades de Grandes Animales, Bogotá, Colombia. *Correspondencia: ojolivere@unal.edu.co 1

Recibido: Mayo de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

RESUMEN Objetivo. Determinar los agentes infecciosos asociados causalmente a la presentación de Diarrea Neonatal Bovina (DNB) en terneros menores de 5 semanas de vida, procedentes de fincas lecheras y de producción mixta de la Sabana de Bogotá. Materiales y métodos. Se seleccionaron por conveniencia 21 fincas, se realizó seguimiento de 620 terneros desde el nacimiento hasta las 5 semanas de edad, se tomaron muestras de materia fecal de los animales que presentaron cuadro clínico de diarrea y de terneros clínicamente sanos como controles pareados. Se realizaron pruebas de ELISA para diagnóstico de E.coli F5, Rotavirus, Coronavirus, Cryptosporidium sp., y Salmonella sp., prueba de Ritchie para diagnóstico de Giardia sp., y tinción de Ziehl Neelsen modificada para Cryptosporidium sp. Se evaluó la asociación epidemiológica entre los agentes y la presentación de diarrea usando prueba de c2, seguido de un modelo de regresión logística (p<0.05). Resultados. Se encontró en la prueba de ELISA que de la totalidad de las muestras, 51 (38.3%), 26 (19.7%), 10 (7.5%) y 1 (0.75%) fueron positivas a Cryptosporidium sp., rotavirus, E coli F5 y coronavirus, respectivamente. Los animales positivos a Rotavirus por la prueba de ELISA y a Cryptosporidium sp., por la técnica de Ziehl Neelsen modificada tuvieron 2.6 y 7.0 veces mayor probabilidad que los demás animales de presentar DNB, respectivamente. Conclusiones. Los resultados presentados son los primeros que muestran el papel y la importancia del Cryptosporidium sp., y del Rotavirus en la DNB en las explotaciones ganaderas de la Sabana de Bogotá y en Colombia.

Palabras clave: Diarrea, rotavirus, Cryptosporidium, prueba de ELISA (Fuente: DeCS).

3162

Pardo - Identificación de agentes infecciosos asociados con DNB

3163

ABSTRACT Objective. To determine the infectious agents causally associated to Bovine Neonatal Diarrhea (BND) in calves younger than five weeks of age from mixed production and dairy herds of Sabana de Bogota. Materials and methods. Twenty one herds were conveniently selected, and 620 calves were followed from birth up to 5 weeks of age, fecal samples were collected from animals with clinical signs of diarrhea and from calves without diarrhea which were taken as matched controls. ELISA tests were performed to diagnose E. coli F5, Rotavirus, Coronavirus, Salmonella sp, and Cryptosporidium sp, Ritchie test to diagnose Giardia sp., and a modified Ziehl Neelsen staining for Cryptosporidium sp. The epidemiological association between agents and the appearance of diarrhea was evaluated using c2 test, followed by a logistic regression model (p<0.05). Results. The ELISA test showed that 51 (38.3%), 26 (19.7%), 10 (7.5%) and 1 (0.75%) samples were positive for Cryptosporidium sp., rotavirus, E coli F5 and coronavirus, respectively. Animals that were positive for Rotavirus through ELISA and Cryptosporidium sp., through a modified Ziehl Neelsen technique had 2.6 and 7.0 times more probability than other animals to present BND, respectively. Conclusions. The results presented are the first to show the importance of Rotavirus and Cryptosporidium sp., in BND in the Sabana de Bogotá herds and in Colombia.

Key words: Diarrhea, rotavirus, Cryptosporidium, ELISA test (Source: DeCS).

INTRODUCCIÓN D i a r r e a N e o n a t a l B ov i n a ( D N B ) e s u n a enfermedad compleja y multifactorial que ocurre como consecuencia de la interacción de factores relacionados con la vaca, el ternero, el estado inmune, las prácticas de manejo, los factores ambientales y la infección con enteropatógenos (1-2).

Se ha investigado acerca de la fisiopatología de la diarrea infecciosa durante muchas décadas, esto ha llevado a un mejor entendimiento de la entidad; sin embargo, a pesar del mejoramiento de las prácticas de manejo, la prevención y las estrategias de tratamiento, esta enfermedad continua siendo muy común y altamente costosa (3).

Se considera que existen cinco agentes enteropatógenos principales y más comunes en la DNB: Echerichia coli enterotoxigenica, rotavirus, coronavirus, Cryptosporidium sp., y Salmonella spp. La prevalencia relativa de estos agentes varía bastante entre los diferentes estudios realizados, posiblemente por diferencias en la ubicación, el clima, las técnicas de diagnóstico y otros factores (2-4). Hay otros enteropatógenos menos comunes como E. coli verotoxigénica (VTEC), E.coli necrotoxigénica (NTEC), Giardia duodenalis, Torovirus, Calicivirus y Norovirus (4).

Para establecer medidas eficientes de prevención y control es indispensable determinar la causa específica de esta enfermedad. En los casos de diarrea el color, la consistencia y otras características físicas pueden verse similares por eso la identificación del agente es necesaria para hacer el diagnóstico (1).

En Colombia los estudios realizados reportan incidencias de DNB del 26.1% y el 37.5% para los departamentos de Cundinamarca y Antioquia respectivamente (5, 6); indicando que la enfermedad es de gran importancia en el país.

El objetivo del estudio fue determinar los agentes infecciosos asociados de manera casual con la Diarrea Neonatal Bovina en terneros menores de 5 semanas de vida y procedentes de fincas lecheras y de producción mixta de la Sabana de Bogotá.

MATERIALES Y MÉTODOS Selección de las fincas. Se seleccionaron por conveniencia 21 fincas ubicadas en 15 municipios de la Sabana de Bogotá (Tabla 1), entre febrero de 2009 y enero de 2010. Quince fincas lecheras, dos de doble propósito y tres de producción mixta (con animales de razas lecheras y razas de carne).

Tabla 1. Ubicación de las 21 fincas ganaderas en la Sabana de Bogota.

No. De fincas

Municipio

No. De fincas

Soacha

Municipio

1

Choconta

2

Sibate

1

Villapinzón

2

Funza

3

Zipaquira

2

Tenjo

1

El Rosal

1

Cota

1

Guasca

1

Chia

2

Nemocón

1

Sopo

1

Suesca

1

Gachancipa

1

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Inicialmente se realizó una encuesta en cada finca con el fin de obtener datos relacionados con el estado de salud, productivo, reproductivo y manejo general a nivel de finca y a nivel de ternero. De manera adicional, de cada parto se tomaron los datos relacionados con la madre, la historia del parto y el estado del ternero recién nacido mediante la realización de una encuesta individual al personal encargado de la atención del parto. Los terneros fueron pesados con cinta bovinométrica y cada uno fue identificado de acuerdo al sistema propio de cada finca.

Se realizaron visitas para el seguimiento a cada ternero durante sus primeros 35 días de vida; cuando algún ternero presentó el cuadro clínico de DNB (caracterizado por la evacuación de heces fluidas, frecuentes, abundantes, anorexia, deshidratación) fue incluido en el estudio y se definió como caso e inmediatamente se escogieron uno o dos controles pareados que correspondían a terneros sanos de la misma finca y que tuvieran una edad similar (diferencia menor a 7 días). De los casos y los controles se tomaron muestras de materia fecal directamente del recto, previo a la aplicación de tratamiento de antibióticos en la finca, estas muestras fueron procesadas para las pruebas parasitológicas y luego se mantuvieron a -70ºC hasta el momento de la realización de las pruebas de diagnóstico.

Pruebas de laboratorio. Para diagnosticar la presencia o ausencia de los enteropatógenos E.coli F5, Rotavirus, Coronavirus, Cryptosporidium parvum en las muestras de materia fecal de los casos y de los controles se utilizó un Kit de EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay (ELISA) (Digestive Bio K 071®, Bio-X Diagnostics, Bélgica), que consiste en el uso de anticuerpos que permiten la captura específica del correspondiente antígeno, la sensibilidad y especificidad de acuerdo al laboratorio se encuentran entre 77%- 97% y entre 90 y 100%, respectivamente. Para el procesamiento se siguieron las recomendaciones del fabricante. La lectura de la densidad óptica se realizó usando un lector de ELISA (BioStackReady® Lector BioTek® Power Wave XS) a 450 nm de longitud de onda.

Los resultados se obtuvieron realizando una resta del valor de la muestra con el respectivo valor del control negativo y las muestras se consideran positivas cuando el valor fue superior a 0.150.

El diagnóstico de Salmonella se realizó mediante coprocultivo y caracterización usando un Kit de ELISA en “sandwich” que utiliza anticuerpos de captura específicos (Tecra® Salmonella Visual Immunoassay, Australia), una prueba utilizada inicialmente para detección de Salmonella en alimentos que mostró también buenos resultados en el diagnóstico del patógeno a partir de muestras

de materia fecal en pequeños rumiantes (7).

Se realizaron exámenes coprológicos usando la técnica de Ritchie o formol-éter que consiste en la sedimentación con una mezcla de solución salina formolada y éter, para el diagnóstico de Giardia sp (8) y la tinción de Ziehl Neelsen se utilizó para la confirmación de Criptosporidium sp. (8).

Análisis estadístico. Se utilizó estadística descriptiva de la zona de trabajo y de las variables relacionadas con los diferentes sistemas de manejo existentes en las explotaciones a nivel de finca, de ganado adulto y de los terneros.

Para llevar a cabo el análisis inferencial se utilizó como medida de asociación la prueba de c2 (con un nivel de significancia de ≤0.05). Posteriormente, se aplicaron modelos de regresión logística entre las variables seleccionadas buscando entre estos un modelo de buen ajuste por medio de la prueba de Hosmer & Lemeshow, de este modelo se interpretaron los coeficientes odds ratio (9). Los datos fueron analizados con el programa de análisis estadístico SAS (SAS Institute Inc. 2003, SAS Guide for personal computers, Version 9.0 SAS Institute Inc., Cary, NC).

RESULTADOS Se realizó el seguimiento de 620 animales, nacidos en 21 fincas ubicadas en 15 municipios, de los cuales el 10.3% (n=64) presentaron signos compatibles con DNB; se tomaron y evaluaron muestras de 68 animales controles pareados conjuntamente con las de los casos.

En las fincas enroladas en el presente estudio la raza predominante fue la Holstein, aunque también había animales de raza: Normando, Jersey, Pardo Suizo, Ayrshire, Angus y cruces entre estas.

La edad de presentación de diarrea fue la siguiente: en la primera semana de vida 19 casos (29.7%), en la segunda 26 (40.6%), en la tercera 10 (15.6%), en la cuarta 3 (4.7%) y en la quinta 6 (9.47%). El porcentaje de distribución se presenta en la figura 1.

Figura 1. Edad de presentación de diarrea

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Pardo - Identificación de agentes infecciosos asociados con DNB Se encontró en la prueba de ELISA de la totalidad de las muestras (casos y controles) que, 51 (38.3%), 26 (19,7%), 10 (7.5%) y 1 (0.75%) fueron positivas a Cryptosporidium sp, rotavirus, E coli F5 y coronavirus, respectivamente. La distribución de los resultados entre casos y controles se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. Distribución de muestras positivas a cada agente infeccioso en la prueba de ELISA. Caso

Rotavirus

Coronavirus

E coli F5

Cryptosporidium

18

1

6

30

Control

8

0

4

21

Total

26

1

10

51

De los agentes estudiados, el único que se encontró en mayor cantidad de controles que en casos (6/3) fue Giardia sp. Con la prueba de Ziehl Neelsen se detectaron 19 casos y 6 controles positivos a Cryptosporidium sp (Figura 2).

Tabla 3. Infecciones combinadas e individuales de casos y controles.

AGENTES INFECCIOSOS

CASO

% (n=132)

CONTROL

% (n=132)

Cryptosporidium sp.

(ELISA)

30

22.73

21

15.91

ROTAVIRUS

18

13.64

8

6.06

Cryptosporidium sp.

(ELISA) y ROTAVIRUS

6

4.55

2

1.52

Cryptosporidium sp. y E. Coli F5

3

2.27

1

0.76

ROTAVIRUS + E. Coli F5

1

0.76

0

0.00

E. Coli F5

6

4.55

4

3.03

CORONAVIRUS

1

0.76

0

0.00

Giardia sp.

3

2.27

6

4.55

16

12.12

36

27.27

No detección de agentes

Tabla 4. Resultados prueba c2 para los agentes infecciosos.

Variable

p valor

Cryptosporidium (ZN)

0.00199

Giardia sp

0.48825

ROTAVIRUS

0.03148

CORONAVIRUS

0.46826

E. coli F5

0.52573

Cryptosporidium (ELISA)

0.07096

Los resultados de la regresión logística muestran que los animales positivos para Rotavirus por la prueba de ELISA y para Cryptosporidium sp., por la técnica de Ziel Nielseen tuvieron respectivamente 2.6 y 7.0 veces mayor probabilidad que los demás animales de presentar DNB. En el modelo estadístico la interacción entre los agentes que resultaron factor de riesgo para la presentación de diarrea, no incremento la probabilidad de enfermar de los animales (Tabla 5).

Figura 2. Distribución de muestras positivas a cada agente infeccioso en la prueba de ELISA (E), prueba de Ritchie (Rt) y tinción de Ziehl Neelsen (ZN).

Seis de los casos y dos de los controles presentaron infección combinada con Cryptosporidium sp., y rotavirus; 4 animales, 3 casos y 1 control fueron positivos para Cryptosporidium sp., y E. coli F5; sólo uno de los casos fue positivo para rotavirus y E. coli F5. Giardia sp., fue el agente encontrado con mayor frecuencia en los animales control (n=6) comparado con los enfermos (n=3) y sólo se encontró un caso positivo a coronavirus (Tabla 3). No se encontraron animales positivos a Salmonella sp.

De acuerdo con el análisis del modelo y de las pruebas de c2 individuales, se evidencia que los dos agentes etiológicos que están asociados con la diarrea en los terneros son Cryptosporidium sp., (p=0.001999) y Rotavirus (p=0.031484) (Tabla 4).

Tabla 5. Agentes asociados con la presentación de DNB en fincas de la Sabana de Bogotá.

Parámetro

Error Standard

Pr >

c2

Odds

Cryptosporidium (ZN)

0.755

0.010

7.00

ROTAVIRUS

0.526

0.069

2.60

11.755

0.042

0.09

Cryptosporidium (ZN)*Rotavirus

DISCUSIÓN En el estudio se encontró que los agentes identificados con mayor frecuencia usando la prueba de ELISA, fueron Cryptosporidium sp., (38.3%) y rotavirus (19.7%), estos resultados son similares a los reportados en otros trabajos en los que se detecta la presencia de ooquistes de Cryptosporium sp., entre el 50% y 83% y la presencia de rotavirus en el 14.3%, en terneros de 4 a 10 días de edad (10), otros estudios reportaron prevalencias entre 27.8% - 55% y 17.7 – 58.7% para Cryptosporidium sp., y rotavirus respectivamente (11-13).

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Varios autores han reportado la presencia de ooquistes de Cryptosporidium sp., en las heces de terneros, los mismos encontraron que los animales que excretan el protozoario tienen mayor probabilidad de presentar diarrea (1415); sin embargo, se debe tener en cuenta que el agente es detectado en un alto número de animales sanos y su presencia no siempre es causal de la enfermedad.

De acuerdo al modelo estadístico se encontró mayor asociación para la tinción de Ziehl Neelsen (p<0.01) con el diagnóstico de terneros enfermos infectados con Cryptosporidium sp., comparado con el test de ELISA (p<0.1). Sin embargo, este último detectó un mayor número de animales positivos para el protozoario; este hallazgo puede estar relacionado con la mayor capacidad del test de ELISA para detectar animales infectados con niveles más bajos de ooquistes (16), que no presentan cuadro clínico y mayor capacidad para la tinción de Ziehl Neelsen en la detección de animales enfermos que presentan mayor nivel de infección. Esto posiblemente se debe a la necesidad de que ocurra un grado de infestación parasitaria que pueda causar diarrea clínica y la prueba de la tinción de Ziehl Neelsen sólo los detecta cuando alcanzan este grado de infestación.

Estos resultados concuerdan con un estudio que reportó que terneros infectados con más de 2.2 x10 5 ooquistes de Cryptosporidium parvum/ gramo de materia fecal usando microscopia, tenían un mayor riesgo de presentar diarrea que los animales que excretaban niveles más bajos, confirmando que el número de ooquistes en las heces es un indicador de la intensidad de la infección (17).

L a p r e s e n c i a d e Ro t av i r u s ( p o r t é c n i c a de ELISA) y de Cryptosporidium sp., (por tinción de Ziehl Neelsen), son factores que incrementan el riesgo de desarrollo de la enfermedad; sin embargo la interacción de los agentes no incrementó la probabilidad de que los animales presentaran la enfermedad, posiblemente porque el efecto es ejercido individualmente o por el número escaso de infecciones combinadas presentes en el estudio.

A pesar de encontrar E. coli F5 en más casos que controles (6/4), no se encontró como un agente infeccioso asociado a la enfermedad.

Los resultados se relacionan con otros estudios que reportan baja prevalencia del agente, esto puede deberse a que su presentación se limita a los primeros días de vida del ternero o a que se trata de un patógeno de baja frecuencia (11-

12), por tanto se debería revisar su impacto, teniendo en cuenta que en el presente estudio se diagnosticó en 7 animales mayores a una semana y sólo en 3 menores de 7 días de edad.

El análisis realizado para coronavirus no es concluyente ya que sólo se presentó una muestra positiva, que indica una baja frecuencia del agente en los animales de la zona de estudio. Sin embargo, resultados similares con relación a la prevalencia del coronavirus han sido reportados en estudios que observaron bajas prevalencias del agente (11-12-16).

La ausencia de resultados positivos para Salmonella sp., puede deberse a una muy baja incidencia, a la excreción intermitente de la bacteria en las heces, a baja sensibilidad de la prueba utilizada o a los métodos de conservación y procesamiento de la muestra en el laboratorio (18-19).

Aunque algunos reportes indican que hay evidencia clínica de la infección por Giardia sp., y su asociación con diarrea en terneros (20), los resultados encontrados no muestran dicha asociación; por el contrario se detectó el parásito en mayor cuantía en animales sanos que en los enfermos. La alta prevalencia reportada por otros estudios indica la presencia del agente en animales sanos (21-23) por tanto se debe investigar su importancia como enteropatógeno.

En el 25% (n=16) de los casos no se detectó alguno de los 5 agentes, resultados similares fueron reportados en España, donde tampoco encontraron agentes en el 19.7% de los animales. La explicación propuesta para ello es la presencia de causas no infecciosas de diarrea (causas nutricionales y otros factores de manejo), a fallas en el método detección en algunos animales positivos (en casos de excreción baja o intermitente del agente infeccioso) o a la presencia de agentes etiológicos menos comunes no investigados en el estudio (16). Sin embargo, otros estudios más recientes reportaron ausencia de animales positivos en un rango del 8.8% a 43.9% (1112). Por lo que se sugiere que en los futuros estudios sobre agentes causales de DNB se debe ampliar el espectro de agentes estudiados tanto infecciosos como nutricionales, entre otros.

Se puede concluir que la prevalencia de diarrea neonatal bovina en las fincas evaluadas fue del 10.3% y que se presentó con mayor frecuencia en terneros de dos semanas de edad.

Pardo - Identificación de agentes infecciosos asociados con DNB En el país no se han realizado estudios que determinen los agentes involucrados con la enfermedad, por tanto los resultados presentados son los primeros que muestran la importancia del Cryptosporidium sp., y del rotavirus en la DNB de las explotaciones ganaderas de Colombia.

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Agradecimientos A Intervet Schering-Plough Animal Health por el apoyo financiero para el desarrollo del proyecto. A los Laboratorios: Clínico, de Parasitología, Microbiología y de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional por su colaboración durante la investigación.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3169-3175, 2012.

ORIGINAL

Evaluación de métodos de extracción de ADN para detección de Listeria monocytogenes en productos cárnicos Evaluation of DNA extraction methods for detection of Listeria monocytogenes in meat products Lina López DA,1* Micr, Carlos Mejía G,1 M.Sc. Universidad de Antioquia, Escuela de Microbiología, Grupo de investigación Biotransformación, Medellín, Colombia. *Correspondencia: lina_deavila@yahoo.es 1

Recibido: Mayo de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

RESUMEN Objetivo. Evaluar dos procedimientos para la extracción de ADN de Listeria monocytogenes a partir de muestras de alimentos contaminados artificialmente. Materiales y métodos. Se evaluaron diferentes métodos de extracción en cultivos puros de L. monocytogenes. Los métodos con mejores resultados fueron evaluados en muestras de alimentos cárnicos (jamón, salchicha y chorizo) contaminados artificialmente. Para evaluar la calidad del ADN extraído se determinó la concentración de ADN, la relación A260/A280 y se amplificó el gen hlyA de L. monocytogenes por PCR. Resultados. Los métodos con solventes orgánicos y con PBS + Tween 20 permitieron obtener mayor cantidad de ADN (40 y 50 µg, respectivamente). En muestras de alimentos, se obtuvo ADN de mayor pureza con el método con solventes orgánicos (p <0,005), pero con el método con PBS + Tween 20 se obtuvo una mayor concentración. Con ambos métodos de extracción de ADN se logró la amplificación del gen hlyA en muestras contaminadas desde 1 hasta 105 UFC/ml. La composición del alimento no afectó la reacción de PCR en las muestras de ADN obtenidas con los dos métodos de extracción. Conclusiones.

Independientemente del método de extracción utilizado, se logró la detección del gen hlyA de L. monocytogenes en muestras de alimentos contaminados desde 1 hasta 105 UFC /ml. Sin embargo, para su uso como método rutinario de diagnóstico, el método con PBS + Tween 20 es la mejor opción para la extracción de ADN, por ser un método de fácil aplicación, bajo costo y buen desempeño.

Palabras clave: ADN, Contaminación de alimentos, extracción, Listeria (Fuente:CAB).

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ABSTRACT Objective. To evaluate two methods for extracting DNA from Listeria monocytogenes from artificially contaminated food samples. Materials and methods. The effects of different extraction methods on pure cultures of L. monocytogenes. The best performing methods were evaluated in artificially contaminated samples of meat products (ham, sausage and chorizo). To assess the quality of the extracted DNA, DNA concentration and A260/A280 ratio were determined, and the hlyA gene of L. monocytogenes was amplified by PCR. Results. The methods with organic solvents and with PBS+Tween 20 allowed to obtain more DNA (40 and 50 mg, respectively). In food samples, DNA was obtained with higher purity through the organic solvent method (p<0.005), but the method with PBS+Tween 20 resulted in higher concentration. hlyA gene amplification in samples contaminated with 1 to 105 CFU /ml was obtained through both methods of DNA extraction. The composition of the food did not affect the PCR reaction in DNA samples obtained by the two extraction methods. Conclusions.

Regardless of the extraction method used, the detection of hlyA gene of L. monocytogenes in food contaminated samples with 1 to 105 CFU / ml was achieved. However, for use as a routine diagnostic method, the method with PBS + Tween 20 is a better option for DNA extraction, as a method of easy application, low cost and good performance.

Key words: DNA, extraction, food contamination, Listeria (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN Listeria monocytogenes es un patógeno emergente importante asociado al consumo de alimentos; causando listeriosis en humanos, una infección que puede presentar manifestaciones clínicas graves en ancianos, recién nacidos, mujeres embarazadas y en general personas con compromiso de la inmunidad celular (1). Aunque la incidencia de listeriosis es baja con respecto a otras enfermedades transmitidas por alimentos, esta enfermedad presenta tasas de mortalidad altas (20-30%) (2).

Los alimentos asociados con mayor frecuencia a contaminación con L. monocytogenes son los productos listos para consumo (quesos, productos cárnicos, ensaladas, entre otros) (3); alimentos que no son cocidos antes de su consumo y que son almacenados a temperaturas de refrigeración, las cuales son toleradas por el microorganismo, además de tener la capacidad de adaptarse a pH bajos y altas concentraciones de sales. Los mecanismos involucrados en la aparición de brotes de listeriosis son cada vez más complejos e implican un control microbiológico más estricto en el procesamiento, almacenamiento y consumo de alimentos, es por esto que agencias internacionales como la Food and Drug Administration (FDA) de Estados Unidos de América y la Australia New Zealand Food Authorithy (ANZFA) mantienen políticas de tolerancia cero para este microorganismo (3).

La identificación de L. monocytogenes tradicionalmente se ha realizado por aislamiento en medios selectivos seguido de identificación bioquímica y serológica. Sin embargo, esta metodología ha mostrado algunas desventajas para la detección del microorganismo,

principalmente por: (i) los bajos niveles de contaminación, (ii) la presencia de microbiota competidora que puede enmascarar la presencia de L. monocytogenes (4), (iii) los resultados erróneos debido a cambios en las características fenotípicas de la cepa aislada por su exposición a condiciones extremas (5) y (iv) la metodología es laboriosa y requiere de cinco a quince días para obtener resultados (6).

Con el objetivo de mejorar las estrategias de control microbiológico de L. monocytogenes en los alimentos, la industria exige métodos rápidos, altamente sensibles y específicos; y los métodos moleculares ofrecen excelentes características para su aplicación en este control microbiológico.

Estos métodos ofrecen mayores ventajas puesto que el ADN es afectado en menor medida por los cambios ambientales y permite la detección de este tipo de microorganismos de manera más precisa, además estos métodos detectan cantidades mínimas de ácidos nucleicos de manera rápida y sensible.

Desde su introducción, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ha demostrado ser una poderosa técnica para la detección rápida, específica y sensible de microorganismos patógenos en alimentos (7). Sin embargo, esta técnica presenta algunas limitaciones por la falta de un método estandarizado de extracción y purificación de ADN a partir de diferentes matrices alimenticias. La presencia de ciertos compuestos del alimento (fenoles, glicógeno, grasas y otras sustancias orgánicas) pueden actuar como inhibidores de la PCR dando origen a resultados falsos negativos (8,9).

López - Evaluación de métodos de extracción de ADN para determinar Listeria monocytoenes 3171 El objetivo de este estudio fue evaluar diferentes procedimientos para la extracción de ADN de L. monocytogenes a partir de muestras de productos cárnicos contaminados artificialmente para la amplificación por PCR del gen hlyA, codificante de la enzima listeriolisina O, responsable en gran medida de la capacidad patogénica de L. monocytogenes.

MATERIALES Y MÉTODOS Muestras y medios de cultivo. Las muestras de alimentos empleadas en este estudio fueron productos cárnicos obtenidos en expendios locales. Para el crecimiento bacteriano y el enriquecimiento de las muestras de alimentos se utilizaron los siguientes medios de cultivo: Caldo CASO (Merck, Alemania); Caldo de enriquecimiento para Listeria (Listeria enrichment broth, LEB); Agar PALCAM (Oxoid, UK). Todos los medios de cultivo fueron reconstituidos y suplementados de acuerdo con las recomendaciones de los productores.

Inóculo y preparación de las muestras. La cepa de referencia utilizada fue L. monocytogenes ATCC 7644. Los productos cárnicos empleados para la contaminación artificial fueron jamón, salchicha y chorizo. Este procedimiento se realizó con diferentes concentraciones de L. monocytogenes (1 hasta 105 UFC/ml) de la siguiente manera: Se pesaron 2.5 g del alimento y se homogenizaron en un digestor de cuchilla por 30 s con 22.5 ml de Caldo de LEB. A los alimentos homogenizados se adicionaron 2.5 ml de una suspensión bacteriana de concentración conocida (1 a 105 UFC/ml). Las suspensiones bacterianas fueron obtenidas por diluciones seriadas en agua peptonada de un cultivo de L. monocytogenes en Caldo Tripticasa Soya (TSB), y el recuento fue confirmado por siembra en Agar Plate Count (PCA). Como control negativo se utilizó el alimento homogenizado sin contaminar.

Las muestras contaminadas fueron incubadas a 30°C por 24 horas , se tomaron alícuotas de 1 ml y se centrifugaron a 6500 g por 10 min. El pellet obtenido fue utilizado para la extracción de ADN. Extracción de ADN. Inicialmente se evaluaron cuatro métodos de extracción en muestras de cultivo puro y a partir de los resultados obtenidos se definieron los métodos de extracción aplicados en matrices cárnicas. Los métodos evaluados fueron: Ebullición en presencia de Tritón X-100 (10). El pellet fue resuspendido en 50 μl de una solución de Tritón X-100 al 2% y 50 μl de agua desionizada estéril, se incubó a 100°C por 10 min y se

centrifugó a 16000 g por 10 min. El sobrenadante fue recuperado y almacenado a -20°C. Ebullición en presencia de PBS 1X + Tween 20 0.05% (11). El pellet fue lavado dos veces con 1 ml de PBS 1X (pH 7.4). Posteriormente fue resuspendido en 100 μl de PBS + Tween 20 0.05%, se incubó a 100°C por 10 min y luego se centrifugó a 16.000 g por 10 min. El sobrenadante fue recuperado y almacenado a -20°C. Lisis con tampón KCl (12). El pellet se lavó con 1 ml de NaCl 0.85% y se resuspendió en 200 μl de tampón KCl (Tris-HCl 20 mM, pH 8.0 y KCl 50 mM), se incubó a 100°C por 25 min y se centrifugó a 16000 g por 10 min. El sobrenadante fue recuperado y almacenado a -20°C. Extracción con solventes orgánicos. La extracción orgánica se realizó de acuerdo con el método estándar descrito por Sambrook y Rusell (13). El pellet fue resuspendido en 50 μl de sodio dodecil sulfato (SDS) 10% (p/v) y 50 μl de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8,0, 1% (p/v) SDS, 50 mM NaCl). Después de 30 min a 37°C, el ADN se extrajo con 2 volúmenes de fenol, mezclado por 30 s y centrifugado a 16000 g por 10 min. La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo y se adicionó un volumen igual de cloroformo, se mezcló y se centrifugó nuevamente. La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo y se adicionaron 2.5 volúmenes de etanol absoluto frio, se mezcló por inversión y se centrifugó por 10 min. El etanol fue descartado y se permitió su completa evaporación. El pellet de ADN fue resuspendido en 100 μl de tampón TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0).

Para la extracción de ADN a partir de las muestras de alimentos contaminados artificialmente se evaluaron los métodos de ebullición con PBS + Tween 20 y el método de extracción con solventes orgánicos.

Calidad y cantidad de ADN extraído. Para determinar la calidad y cantidad del ADN extraído, las muestras fueron evaluadas en un espectrofotómetro (Genesys 2.0) a 260 y 280 nm para determinar la concentración de ADN y de proteínas, respectivamente; además, la relación A260/A280 fue calculada. Los análisis espectrofotométricos también permitieron evaluar la cantidad de ADN en cada muestra (13).

Amplificación de ADN y análisis electroforéticos. Para determinar la calidad del ADN extraído para análisis moleculares se estandarizó la PCR para la detección de un fragmento de 234 pb del gen hlyA de L. monocytogenes. Los iniciadores escogidos

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para esta PCR fueron: Directo LMA: 5´-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3´ y reverso LMB 5´-CCTCCAGAGTGATCGATCTT-3´ (14). La mezcla de reacción fue la siguiente: 1 U de Taq polimerasa, tampón de reacción 1X, MgCl2 4 mM (Fermentas), dNTPs 1,25 mM (Bioline), 20 pmol de cada iniciador y 5 μl de la muestra de ADN, en un volumen final de 25 μl. El perfil de temperaturas fue el siguiente: una desnaturalización inicial a 94°C por 5 min, 35 ciclos compuestos por un paso de desnaturalización a 94°C por 30 s, un paso de alineamiento a 55°C por 45 s, un paso de extensión a 72°C por 45 s, y una extensión final a 72°C por 7 min. Los productos de PCR fueron visualizados por electroforesis en gel de agarosa al 1.8% (p/v). Las muestras fueron corridas por 1 h y fueron teñidas con 2 μl de EzVision® (Amresco, Estados Unidos), utilizado como tampón de carga. Los geles fueron visualizados en un fotodocumentador GelDoc XR (BioRad, USA).

Análisis estadístico. Los métodos de extracción de ADN de cultivo puro de L. monocytogenes y de muestras de productos cárnicos contaminados artificialmente fueron realizados por triplicado.

Las determinaciones de la cantidad y calidad del ADN obtenido con los diferentes métodos de extracción fueron evaluadas estadísticamente con un análisis de Varianza (ANOVA) en un diseño multifactorial con dos factores: tipo de alimento y métodos de extracción de ADN .Los análisis estadísticos se realizaron en el software STATGRAPHICS PLUS Versión 5.1

RESULTADOS En el momento de definir un protocolo de extracción de ácidos nucleicos, la pureza y calidad del ADN obtenido constituyen variables importantes a tener en cuenta, principalmente en la detección de microorganismos basada en PCR. La calidad y cantidad de ADN extraído con los protocolos evaluados a partir de cultivo puro no revelaron diferencias estadísticamente significativas (p=0.6911). Con el método de extracción con Tritón X-100 no se logró la amplificación del gen hlyA de L. monocytogenes en muestras de cultivo puro por lo tanto fue excluido de los análisis. De acuerdo con estos resultados, los métodos seleccionados para la extracción de ADN a partir de muestras de alimentos contaminados con L. monocytogenes fueron los métodos con solventes orgánicos y con PBS + Tween 20; porque estos métodos lograron las mayores recuperaciones de ADN en cultivo puro (40 y 50 µg, respectivamente).

Las mediciones espectrofotométrica de las muestras extraídas de alimentos (Tabla 1) indican

que con el método de solventes orgánicos se obtuvo muestras de ADN de mayor pureza que con el método de PBS + Tween 20 (p<0.005); sin embargo, el ADN recuperado por ambos métodos permitió la amplificación del gen hlyA por PCR. Aunque la pureza del ADN obtenido con solventes orgánicos fue mejor, la concentración de ADN fue mayor en el método con PBS + Tween 20.

El límite de detección y la reproducibilidad de ambos métodos fueron evaluados con el Tabla 1. MediciónA260/A280 de ADN obtenido a partir de cultivo puro de L. monocytogenes PROTOCOLO

MEDICIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA

CONC. DE ADN (µg/ μl)

260 nm

RELACIÓN A260 /280

Tritón X-100

2.098

0.949

--

Buffer KCL

0.664

1.550

0.34

PBS + Tween 20

0.673

1.718

0.52

Solventes orgánicos

0.566

1.724

0.44

CONC. = CONCENTRACIÓN

procesamiento de muestras contaminadas con 1 hasta 105 UFC/ml de L. monocytogenes por triplicado. En la figura 1, se puede observar la amplificación de una banda de 234 pb correspondiente al gen hlyA en todas las muestras evaluadas, indicando que esta metodología es capaz de detectar bajos niveles de contaminación en este tipo de alimentos (1 UFC/ml).

Para determinar el método de extracción más adecuado para el procesamiento de muestras

Figura 1. Amplificación un fragmento de 234 pb del gen hlyA de L. monocytogenes. Carril M: marcador de peso molecular (GeneRuler 100 bp DNA ladder, Fermentas); Carriles L1-L6: muestras de 1 hasta 105 UFC/mL de L. monocytogenes; Carril L7: control negativo; Carril L8: cultivo puro de L. monocytogenes.

López - Evaluación de métodos de extracción de ADN para determinar Listeria monocytoenes 3173 de productos cárnicos, se realizaron ensayos de PCR con muestras de ADN obtenidas por ambos métodos de extracción. El producto de 234 pb específico para L. monocytogenes fue visualizado en todas las muestras contaminadas independiente del método de extracción de ADN utilizado. En particular, en las muestras extraidas a partir de salchicha se observaron bandas de amplificación más definidas y de mayor intensidad. No se presentaron amplificaciones inespecificas y se pudo comprobar la ausencia de compuestos inhibidores de la PCR, lo que demuestra que los métodos de extracción fueron eficaces en la eliminación de componentes del alimento y del medio de enriquecimiento que puedan interferir con la reaccion de PCR. En la tabla 2 se describe el desempeño de los dos métodos de extracción evaluados en las matrices cárnicas.

enmascarar la presencia de L. monocytogenes.

Estudios previos demostraron que L. innocua crece a una tasa mayor que L. monocytogenes en medios selectivos de enriquecimiento (16), y altas concentraciones de L. innocua pueden inhibir el crecimiento de L. monocytogenes durante el enriquecimiento inicial (17).

Tabla 2. Comparación de protocolos de extracción de ADN a partir de muestras contaminadas artificialmente

En este estudio, se evaluaron dos métodos no comerciales de extracción de ADN a partir de productos cárnicos. La comparación de estos métodos se basó en la rapidez, rango de aplicación, facilidad de operación y eficiencia. Se incluyeron protocolos basados en calentamiento y extracción con solventes orgánicos. Los protocolos basados en calentamiento son de bajo costo, pero el ADN extraído con estos métodos puede ser inestable por la presencia de enzimas que pueden degradarlo, además de presentar turbidez que afecta las mediciones espectrofotométricas, por lo que deben ser empleados en muestras con baja cantidad de sólidos suspendidos (19). El método clásico de extracción de ADN con solventes orgánicos posee algunas desventajas relacionadas con el uso de compuestos tóxicos, es muy laborioso y pérdida accidental de ADN. Sin embargo, continúa siendo el método de elección en el procesamiento de todo tipo de muestras.

Tiempo requerido (h)

Solventes orgánicos

PBS + Tween 20

3 hr

1 hr

ADN extraído (µg) (media ±DS) Jamón

59±0.6

54±0.4

Chorizo

59±0.3

95±0.8

Salchicha

50±0.5

79±0.3

Pureza ADN (A260/A280) (media ±DS) Jamón

1.47±0.87

1.34±0.64

Chorizo

1.53±0.36

1.34±0.79

Salchicha

1.27±0.42

1.22±0.13

El procedimiento microbiológico estandar para la detección de L. monocytogenes en productos cárnicos descrito por la FDA (15) permitió la deteccion correcta de la presencia de L. monocytogenes en todas las muestras contaminadas, desde 1 a 105 UFC/ml.

DISCUSIÓN La detección de L. monocytogenes en alimentos, especialmente en productos listos para consumo representa un gran reto, dadas las características de adaptación del microorganismo y la importancia de obtener resultados en poco tiempo que permitan la toma acertada de decisiones frente a la liberación de lotes de alimentos en las industrias productoras. Las técnicas convencionales involucran procedimientos prolongados y laboriosos de enriquecimiento, aislamiento e identificación bioquímica y serológica. Además, pueden generar resultados falsos negativos en muestras con una alta carga de microbiota acompañante que puede

Los avances en biología molecular han permitido el desarrollo de técnicas con características mejoradas para la detección de patógenos asociados a alimentos; sin embargo, estas metodologías se han visto limitadas por varios factores que han hecho difícil su estandarización y uso de forma rutinaria. El principal obstáculo en la aplicación de la PCR para la detección de microorganismos presentes en los alimentos es la presencia de compuestos que pueden actuar como inhibidores de la reacción de amplificación y arrojar resultados falsos negativos (18).

Para evaluar el desempeño de los protocolos de extracción de ADN en diferentes matrices cárnicas, se emplearon los siguientes alimentos: chorizo, con un alto contenido graso; jamón, que contiene gran cantidad de proteínas; y salchicha, con valores similares de grasa y proteínas, compuestos reconocidos como inhibidores de la PCR (20). Con los dos protocolos evaluados se obtuvo ADN genómico que permitieron la amplificación del gen hlyA de L. monocytogenes, aunque los valores de la relación A260/A280 fueron relativamente bajos para todas la muestras. Es importante tener en cuenta que los compuestos contaminantes en las muestras de ADN no tuvieron un efecto inhibitorio sobre la PCR. Además, se logró detectar la presencia de L. monocytogenes en todas las muestras,

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aún en aquellas provenientes de la más baja concentración bacteriana (1 UFC/ml antes del enriquecimiento).

Debido a la gran complejidad que representan las matrices alimenticias para la aplicación de técnicas de identificación molecular, se han evaluado diferentes protocolos de extracción de ADN de acuerdo al tipo de microorganismo y alimento. Kits de extracción comerciales han sido evaluados en diferentes matrices; el DNeasy Tissue kit (Qiagen GmhH, Hilden, Alemania) se ha utilizado en una gran variedad de alimentos mostrando un buen desempeño en términos de pureza del ADN aunque la concentración obtenida es mucho menor que con métodos caseros (4).

Otros kit de extracción que han sido evaluados para su aplicación en alimentos son el PrepMan Ultra (Applied Biosystems, Norwalk) y el kit InstaGene Matrix (BioRad, Hercules, California), y aunque los resultados obtenidos son aceptables para la identificación molecular de patógenos en alimentos, su costo elevado hace que sean difíciles de implementar en el diagnóstico de rutina.

Los métodos caseros de extracción de ADN han demostrado mayor factibilidad de aplicación por su bajo costo y buenos resultados obtenidos en diferentes matrices. En un estudio se empleó la extracción de ADN con tampón PBS + Tween 20 en muestras de quesos; obteniendo limites de detección entre 1 y10 UFC/ml (11). Se han evaluado diferentes microorganismos patógenos en alimentos con diferentes metodologías: Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, L. monocytogenes, entre otros. Los resultados obtenidos en la identificación simultánea de estos patógenos han mostrado detecciones de < 50 UFC/g de alimento (21).

Los métodos comparados en este estudio demostraron un buen desempeño en la extracción de ADN, con la detección de 1 UFC/ml de L. monocytogenes en diferentes alimentos cárnicos.

Sin embargo, el método de extracción con PBS + Tween 20 presentó varias ventajas entre las que se destacan la facilidad de operación, rapidez del procedimiento y mayor cantidad de ADN extraído, además de la ventaja de no utilizar compuestos tóxicos.

La cantidad de ADN extraída con PBS + Tween 20 fue significativamente mayor que la cantidad obtenida con solventes orgánicos (p< 0.005), y el tipo de alimento evaluado influyó significativamente (p=0.034) en la concentración de ADN, siendo mayor en muestras de jamón que en las muestras de chorizo, posiblemente por la gran cantidad de grasas que pueden atrapar el ADN y evitar su purificación. Esta ha sido una de las grandes dificultades en la aplicación de metodologías moleculares en el diagnóstico de patógenos en alimentos, los componentes de cada alimento pueden afectar de manera diferente el desempeño del método.

En conclusión, la identificación molecular de L. monocytogenes empleando el protocolo de extracción con PBS + Tween 20 mostró un límite de detección bajo, requiriendo insumos de bajo costo y poca experticia en el desarrollo de técnicas moleculares, por lo tanto puede ser aplicado al diagnóstico de rutina de este microorganismo en productos cárnicos, productos frecuentemente asociados con la ocurrencia de listeriosis.

Es necesario evaluar metodologías rápidas de extracción como ésta en diferentes alimentos para lograr la estandarización posterior de protocolos de identificación molecular de patógenos en alimentos.

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ORIGINAL

Actividad antibacteriana de la cáscara de cacao, Theobroma cacao L Antibacterial activity of the cacao bean husk, Theobroma cacao L Oscar Cuéllar G,1 Tecnol Quím, Gloria Guerrero A,1* Ph.D. Universidad Tecnológica de Pereira. Facultad de Tecnología. Escuela de Tecnología Química. Grupo de Oleoquímica. Pereira, Colombia. *Correspondencia: gguerrero@utp.edu.co 1

Recibido: Agosto de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la actividad antibacteriana de diferentes fracciones de la cáscara de cacao (Theobroma cacao L.). Materiales y métodos. Se evaluó la actividad antibacteriana mediante el método de difusión en agar de diferentes fracciones de la cáscara de cacao, empleando cepas autóctonas y de referencia ATCC. Posteriormente, se hizo un análisis de estas fracciones por cromatografía líquida de alta eficiencia y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.

Resultados. La fracción clorofórmica presentó actividad antibacteriana frente a Bacillus cereus ATCC 11778 y Streptococcus agalactiae (autóctona), con porcentajes de inhibición de 34.90% (100 µg/µl) y 52.40% (100 µg/µl) respectivamente. También se evidenció una concentración mínima inhibitoria de 512 µg/ml frente a Bacillus cereus ATCC 11778 y de 128 µg/ml frente a Streptococcus agalactiae.

Conclusiones. Este trabajo es el primer reporte a saber en Colombia sobre actividad antibacteriana in vitro de la cáscara de cacao, el cual resulta ser un avance importante para esta agroindustria.

Esta investigación abre paso a otros estudios relacionados para establecer el espectro de inhibición frente a otros microorganismos.

Palabras clave: Actividad antibacteriana, Bacillus cereus, Streptococcus agalactiae (Fuente: DeCS).

ABSTRACT Objective. To test the antibacterial activity of different fractions of cacao bean husk (Theobroma cacao L.). Materials and methods. Antibacterial activity of different fractions of cacao bean husk was analyzed using agar diffusion method with native and ATCC strains. These fractions were studied

by HPLC and GC/MS. Results. The Chloroform fraction exhibited antibacterial activity through an inhibition percentage of 34.90% (100 µg/µl) for Bacillus cereus ATCC 11778 and 52.40% (100 µg/µl) for Streptococcus agalactiae (native). It also showed 512 µg/ml as a minimum inhibitory concentration for Bacillus cereus and 128 µg/ml for Streptococcus agalactiae. Conclusions. This research is the first report known in Colombia about cacao bean husk exhibiting in vitro antibacterial activity, which is an important advance for the cacao industry. This work opens the door for further related studies to determine the spectrum of inhibition with other microorganisms.

Key words: Antibacterial activity, Bacillus cereus, Streptococcus agalactiae (Source: DeCS).

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Cuéllar - Actividad antibacteriana de la cascara de cacao

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INTRODUCCIÓN El cacao (Theobroma cacao L.) pertenece a la familia Sterculiaceae, es una planta que crece en una franja geográfica fundamentalmente tropical y se extiende 20° de latitud hacia ambos hemisferios. Se clasifica en dos grandes grupos: Criollo y Forastero y según la Organización Internacional del Cacao (ICCO), esta última es una variedad con gran crecimiento, debido a la mayor facilidad para su siembra y manejo (1). El cacao se utiliza principalmente para la producción de chocolate siendo el continente Africano el mayor productor con el 59% de la oferta mundial, liderado por Costa de Marfil con 1.000.000 de toneladas que representan el 34% de la producción mundial (2).

El grano de cacao y las hojas del árbol han sido estudiados por diversos autores en lo que se refiere a la composición química de fenoles, alcaloides, ácidos grasos y carbohidratos (3,4), también se han reportado estudios de actividad antioxidante (5), de la caracterización química de la manteca de cacao así como de sus aplicaciones (6). Respecto a la cáscara de cacao que es el principal desecho de esta industria, se han desarrollado estudios donde se utiliza para la alimentación de porcinos y gallos (7,8), como fuente comercial de pectinas (9), en la producción de espumas de poliuretano para uso hortícola (10) y algunos hacen referencia a la actividad antibacteriana de extractos de la cáscara de cacao frente a Streptococcus mutans (11,12).

En Colombia, el 25% del cacao producido se clasifica como de sabor y fino aroma, el cual se emplea para darle características especiales a los chocolates. El departamento que tradicionalmente ha concentrado la mayor producción de cacao es Santander con el 30.06% de participación del total de la producción en el año 2010 de 68.987 toneladas. En ese mismo año 69.7% de las exportaciones de Colombia se dirigieron principalmente a países del continente americano como Ecuador, Panamá, Venezuela y Estados Unidos (13).

La manteca de cacao producida en Colombia se utiliza como ingrediente en la elaboración de productos de chocolatería, y la cáscara de cacao que se genera luego del proceso de tostado es el principal desecho en la cadena de producción de chocolate representando el 10% (14). El contenido de teobromina en la cáscara de cacao restringe la proporción en que puede ser suministrada como complemento en la nutrición de rumiantes, debido a la toxicidad de este alcaloide (15).

Investigaciones recientes en Colombia, indican que la cáscara de cacao puede ser utilizada como ingrediente principal en la formulación de galletas para personas con estreñimiento (16), adicionalmente el mucílago de este desecho puede ser una alternativa para la clarificación de jugos en la industria panelera (17).

El objetivo del presente trabajo fue buscar nuevas posibilidades de uso del principal desecho en la producción de chocolate: la cáscara, evaluando la actividad antibacteriana de diferentes fracciones, utilizando cepas ATCC y autóctonas.

MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal. Se empleó cáscara residual molida de cacao, Theobroma cacao L. (mezcla de diferentes tipos de granos tostados) suministrada por la empresa Casa Luker. Esta fue llevada al Laboratorio de Oleoquímica de la Universidad Tecnológica de Pereira, donde se almacenó en bolsas plásticas a 4ºC. Obtención y fraccionamiento del extracto etanol absoluto: agua (1:1) de la cáscara de cacao. La extracción se llevó a cabo con cáscara de cacao molida previamente desengrasada con hexano. Se utilizó como solvente una mezcla de etanol absoluto:agua (1:1). Se emplearon 20 gramos de cáscara y 100 ml de solvente, usando agitación magnética, una temperatura de 25ºC y un tiempo de extracción de 2 horas. El extracto crudo se filtró al vacío a través de papel filtro Whatman No. 4 y el filtrado se conservó protegido de la luz a 4ºC. Se hizo un fraccionamiento líquido–líquido del extracto crudo empleando cloroformo, acetato de etilo y n-butanol. En cada caso se realizaron extracciones sucesivas por triplicado con una relación 1:1 de volumen de extracto vs., volumen de solvente. Las fases orgánicas obtenidas se filtraron al vacío, se concentraron por rota-evaporación y el solvente residual se eliminó por corriente de nitrógeno.

Actividad antibacteriana. Se utilizó como blanco dimetilsulfóxido (DMSO) al 99% y como control de inhibición se empleó ampicilina (25 µg/µl) para Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; amoxicilina (5 µg/µl) para Bacillus cereus ATCC 11778 y Streptococcus agalactiae aislado de un paciente en el Laboratorio Clínico Patológico López Correa (Pereira, Colombia); ciprofloxacina (0.125 µg/µl) para Escherichia coli “resistente a amoxicilina” aislada de pollo

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y micostatina (5 µg/µl) para Candida albicans ATCC 10231. La fracción clorofórmica, en acetato de etilo y butanólica se solubilizaron en DMSO al 99% a las concentraciones de 100, 50 y 25 µg/µl. El bioensayo se realizó por el método de difusión en agar, una modificación del método desarrollado por Kirby-Bauer (18). Cada bacteria fue replicada en dos tubos de ensayo con el medio líquido infusión–cerebro–corazón (BHI) y caldo Sauboraud para Candida albicans ATCC 10231.

Se ajustó la absorbancia a 0.1, que corresponde a 0.5 en la escala Mc Farland con una concentración de 1.5.108 UFC/ml de las bacterias y del hongo a una longitud de onda de 540 y 490 nm respectivamente, empleando un espectrofotómetro Génesis 10 (Marca: Termospectronic, Fabricante: Termospectronic, Ciudad: New York, País: USA), y usando como blanco el medio líquido respectivo. Se adicionaron 100 µl de la bacteria u hongo según el caso a una caja de Petri, luego se añadieron 25 ml de agar Müeller–Hinton a 50ºC. Se homogenizó, se perforaron 5 pozos los cuales se sellaron con 20 µl del mismo agar. En el pozo central se adicionó 10 µl de DMSO al 99% (como blanco), a los cuatro pozos restantes en su orden de izquierda a derecha se adicionó 10 µl del antibiótico respectivo y la fracción clorofórmica, en acetato de etilo y butanólica en cada caso a las concentraciones establecidas anteriormente.

Se incubó por 24 horas a una temperatura de 37ºC, utilizando una incubadora VELP (Marca: Scientifica, Fabricante: Scientifica, Ciudad: Milano, País: Italia). Se hizo la medición del diámetro del halo de inhibición de la fracción que fue objeto de estudio con respecto al del control para permitir un control estadístico del factor inhibitorio.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria. Se utilizó ciprofloxacina como control positivo de inhibición en DMSO al 99% para Bacillus cereus ATCC 11778 y amoxicilina para Streptococcus agalactiae autóctona. La concentración mínima inhibitoria se realizó por dilución en microplaca de 96 pozos (19). Se preparó una solución stock de cada fracción a una concentración de 64000 µg/ml en DMSO al 99%, a partir de esta se hicieron diluciones sucesivas desde 1024 hasta 1 µg/ml. Se transfirieron 20 µl de cada una de las concentraciones a los pozos de una fila enumerados del 1 al 11 y se adicionó el blanco en el pozo número 12 (DMSO al 99%). Cada fracción se repitió en tres filas, se adicionó a cada pozo 220 µl de medio de cultivo líquido (caldo nutritivo) y 10 µl del microorganismo ajustado a 0.1 de absorbancia.

La lectura inicial se hizo a contra luz observando

turbidez o transparencia después de 4 horas de incubación a 37ºC, se tomó como valor de CMI la concentración del primer pozo que presentó transparencia en cada fila. Posteriormente se adicionaron 25 µl de Bromuro de 3-(4,5-dimetil2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazoilo (MTT) (con una concentración de 0.8 mg/ml) utilizando como medio dispersante Triton (con una concentración de 0.1 g/ml) a cada uno de los pozos con el microorganismo y se incubó a 37ºC. La segunda lectura se hizo a través de un método colorimétrico. Como prueba confirmatoria se hizo una siembra por superficie en caja Petri con agar nutritivo, se adicionó 20 µl del contenido del pozo y se incubó por 24 horas a 37ºC, posteriormente se realizó la lectura observando inhibición o crecimiento.

Análisis preliminar por cromatografía de capa delgada. Las fracciones clorofórmicas, en acetato de etilo y butanólicas fueron evaluadas preliminarmente mediante cromatografía de capa delgada. Para evaluar la presencia de alcaloides, se empleó como fase estacionaria sílica gel 60 F 254 , un sistema de elución cloroformo:metanol (9:1), estándares de teobromina (Sigma ≥99%, T4500), cafeína (Sigma Reference Standard, C1778) y teofilina (Sigma Anhydrous ≥ 99%, T1633). Para los compuestos fenólicos se utilizó como sistema de elución cloroformo:metanol:agua en proporción (7:13:8), un estándar de ácido ferúlico (Aldrich 99%, 128708). En ambos casos se reveló con luz ultravioleta a longitud de onda corta (270nm).

Análisis de alcaloides y compuestos fenólicos por cromatografía líquida de alta eficiencia. Para el análisis de las diferentes fracciones se empleó un equipo marca Jasco HPLC 2000 Plus (Fabricante: Jasco Corporation, Ciudad: Tokyo, País: Japón), equipado con una bomba de gradiente cuaternario (PU–2089Plus), automuestreador (AS–2059 Plus), horno para columna (CO–2065 Plus), detector de arreglo de diodos (MD–2015 Plus), controlado por software EZCrhom Elite. Se utilizó una Columna UltraAqueous RP–18 RESTEK. Se empleó como fase móvil ácido fosfórico al 0.05% (A) y acetonitrilo al 5% (B). Se hizo una elución isocrática con 95% de A los primeros 5 minutos, luego con gradiente lineal hasta alcanzar 75% a los 15 minutos y finalmente se mantuvo isocrático por 5 minutos más para un tiempo total de análisis de 20 minutos. Se empleó un tiempo de re-equilibrio de 5 minutos entre cada corrida. La columna se mantuvo a 40ºC, se utilizó un flujo de 0.5 ml/ min, un volumen de inyección de 10 µl y un rango de longitud de onda para la adquisición de datos entre 230 a 450 nm.

Cuéllar - Actividad antibacteriana de la cascara de cacao Detección y cuantificación de alcaloides y compuestos fenólicos. La detección de alcaloides en las fracciones se hizo por comparación con el tiempo de retención de estándares de teobromina (Sigma ≥99% T4500), cafeína (Sigma Reference Standard, C1778) y teofilina (Sigma anhydrous ≥99%, T1633), eluidos en las mismas condiciones. Para los compuestos fenólicos la detección se realizó empleando un estándar de ácido ferúlico (Aldrich 99%, 128708) que fue analizado bajo las mismas condiciones.

La cuantificación de alcaloides y compuestos de tipo fenólico se hizo por el método del estándar externo. Se realizaron curvas de calibración por triplicado, empleando un rango de concentraciones de 6.25 a 200 μg/ml con los estándares respectivos. Los parámetros estadísticos fueron: teobromina: Y=87684.9x+135855, R2=0.999292, D.S=4875.78, LD=0.16 μg/ml, LC=0.55 μg/ml; teofilina: Y=61342.1x+91287.2, R2=0.999189, D.S=3285.51, LD=0.16 μg/ml, LC=0.54 μg/ml; cafeína: Y=62519.4x+107980, R2=0.999212, D.S=3890.13, LD=0.19 μg/ml, LC=0.64 μg/ml; ácido ferúlico: Y=32520,6x+42144, R 2 =0.999336, D.S=1980.09, LD=0.18 μg/ ml, LC=0.61 μg/ml. (LD= Límite de detección, LC= Límite de cuantificación, D.S= Desviación estándar).

Análisis por cromatografía de gases/ espectrometría de masas de la fracción de alcaloides. Se empleó un cromatógrafo marca Shimadzu QP-2010 (Fabricante: Shimadzu Corporation, Ciudad: Kioto, País: Japón), equipado con un autoinyector (AOC20i)/ automuestreador (AOC-20s, Split 1:20), acoplado a un detector de masas, modo de ionización de impacto electrónico a 70eV, controlado por software GC-MS solution. Se utilizó una Columna capilar Rtx–5 Sil MS. El horno se programó con una temperatura inicial de 100ºC por 2 minutos, luego se incrementó en una tasa de 10ºC por minuto hasta alcanzar una temperatura final de 320ºC que se mantuvo por 10 minutos para un tiempo total de análisis de 34 minutos.

RESULTADOS Actividad antibacteriana de la fracción clorofórmica. El porcentaje de inhibición frente a B. cereus fue de 34.90% con la fracción clorofórmica empleando una concentración de 100 μg/μl y 31.70% a una concentración de 50 μg/μl (Figura 1A).

Como se aprecia en la figura 1B, la fracción clorofórmica frente a S. agalactiae presentó

3179 (A)

(B)

Figura 1. Actividad antibacteriana de la fracción clorofórmica frente a: (A) Bacillus cereus ATCC 11778, (B) Streptococcus agalactiae nativa

porcentajes de inhibición del 33.30% (25 μg/ μl), 47.80% (50 μg/μl) y del 52.40% (100 μg/ μl), destacándose que no hubo gran diferencia entre los dos últimos; lo que podría indicar que a concentraciones mayores de 50 μg/μl no se obtendría un incremento considerable de la actividad inhibitoria; sin embargo, se requiere de un estudio detallado frente a este microorganismo que permita establecer con certeza este comportamiento.

En cuanto a los resultados de concentración mínima inhibitoria, la fracción clorofórmica presentó frente a Bacillus cereus un valor de 512 μg/ml, mientras que frente a Streptococcus agalactiae fue de 128 μg/ml, apreciándose que esta última bacteria es más sensible que B. cereus al momento de ser evaluada su capacidad para reproducirse, en presencia de componentes antimicrobianos en su medio.

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La fracción clorofórmica generó un efecto bacteriostático sobre la cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (Figura 2) en cada una de las concentraciones empleadas, se encontró un halo con algunas colonias bacterianas alrededor de cada una uno de los pozos, disminuyendo el crecimiento de esta bacteria.

Los resultados del análisis cuantitativo (Tabla 1), indicaron que el compuesto mayoritario en la fracción clorofórmica fue la cafeína. La teobromina se identificó pero no fue posible su cuantificación porque la concentración estuvo por debajo del límite de cuantificación del método.

Tabla 1. Cuantificación de alcaloides por CLAE de la fracción clorofórmica de cáscara de cacao (Theobroma cacao L.). tR=Tiempo de retención. Conc.= Concentración. NC= No cuantificada. %RSD= Desviación estándar relativa. tR (min)

Conc. (μg/mL)

%RSD

Teofilina

5.24

6.41

5.13

Teobromina

12.75

NC

5.29

Cafeína

13.86

10.31

5.91

Compuesto

Figura 2. Efecto bacteriostático de la fracción clorofórmica frente a Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Análisis químico de la fracción clorofórmica.

Según el análisis preliminar por cromatografía de capa delgada esta fracción contiene alcaloides.

Se evidenció la presencia de teobromina de Rf de 0.85 y de teofilina con un Rf de 0.36 según los estándares analizados en las mismas condiciones.

Análisis por CG/EM de la fracción clorofórmica. El análisis se hizo de manera complementaria. En el perfil obtenido (Figura 4), se aprecia un pico bien resuelto con un tiempo de retención de 14 minutos que según la comparación con la base de datos Willey 7 versión 2 correspondía a cafeína con un porcentaje de similitud del 96% y el espectro de masas presentó los fragmentos característicos de la cafeína m/z 194 (pico base), m/z 165, m/z 137, m/z 109, m/z 82, m/z 67 y m/z 55.

Análisis por CLAE de la fracción clorofórmica. Como se aprecia en la figura 3, en el perfil cromatográfico por CLAE de la fracción clorofórmica, se encontraron teofilina, teobromina y cafeína con base en los tiempos de retención de los estándares y el espectro ultravioleta característico de alcaloides a 270 nm.

Figura 4. Perfil por CG de la fracción clorofórmica de cáscara de cacao (Theobroma cacao L.)

Análisis químico de las fracciones de acetato de etilo y butanólica. Según el análisis preliminar por cromatografía de capa delgada, se evidenció en ambos casos una mancha de Rf 0.84 revelada con luz ultravioleta y el ácido ferúlico empleado como referencia reveló con Rf 0.87, lo que podría indicar la presencia de compuestos de tipo fenólico.

Figura 3. Perfil cromatográfico por CLAE de la fracción clorofórmica de cáscara de cacao (Theobroma cacao L.)

Análisis por CLAE de las fracciones de acetato de etilo y butanólica. Como se aprecia en la figura 5, las dos fracciones

Cuéllar - Actividad antibacteriana de la cascara de cacao presentaron perfiles cromatográficos similares.

En ambos se encontraron 5 picos comunes, cuatro de ellos con tiempos de retención entre 1.3 a 2.7 minutos que de acuerdo con su espectro ultravioleta (máximos de absorbancia entre 250 y 380 nm), pueden corresponder a compuestos de tipo fenólico y un compuesto de tiempo de retención de 5.1 minutos el cual fue identificado según su espectro (máximo de absorbancia a 270 nm) como un alcaloide y por comparación con el tiempo de retención del estándar como teofilina.

(A)

(B)

Figura 5. Perfil cromatográfico por CLAE de las fracciones: (A) Acetato de etilo y (B) Butanólica de la cáscara de cacao (Theobroma cacao L.)

Según la cuantificación de estos compuestos (Tabla 2), el mayoritario (5.1* min) fue la teofilina y las concentraciones de los compuestos de tipo fenólico se encontraron en un rango de 3.31 μg/ml a 14.32 μg/ml.

Tabla 2. Cuantificación de compuestos de tipo fenólico por CLAE de las fracciones de acetato de etilo y butanólica de cáscara de cacao (Theobroma cacao L.). tR=Tiempo de retención. Conc. A= Concentración en la fracción de Acetato de etilo. Conc. B= Concentración en la fracción butanólica. tR (min)

Conc. A (μg/mL)

1.3

10.76

8.66

1.5

14.32

10.85

1.8

13.78

9.86

2.7

3.31

5.63

188.64

104.32

5.1*

Conc. B (μg/mL)

3181

Actividad antibacteriana de las fracciones de acetato de etilo y butanólica. Estas fracciones no presentaron ningún efecto inhibitorio sobre los microorganismos objeto de estudio.

DISCUSIÓN La fracción clorofórmica resultó promisoria ya que presentó actividad antibacteriana frente a los microorganismos Gram positivos estudiados.

De acuerdo con los valores de concentración mínima inhibitoria encontrados (512 µg/ml frente a Bacillus cereus ATCC 11778 y 128 µg/ ml frente a Streptococcus agalactiae, según la clasificación de otros autores (20), esta fracción se consideraría como un potente inhibidor. La actividad biológica que exhibió esta fracción puede atribuirse en parte al efecto sinérgico de los alcaloides que la constituyen puesto que existen reportes que evidencian esta característica de este grupo de compuestos (21,22); sin embargo, se requieren otros estudios para profundizar sobre esta actividad.

De otra parte, la fracción clorofórmica presentó efecto bacteriostático frente al microorganismo Gram negativo P. aeruginosa ATCC 27853, observándose en cada pozo un halo circundante de color brillante con presencia de algunas colonias bacterianas observándose que se inhibió el crecimiento de esta bacteria; este resultado concuerda con lo reportado por otros autores (23), que indican, que este microorganismo presenta una alta resistencia a los agentes antimicrobianos; luego sería importante en próximos estudios evaluar concentraciones diferentes de esta fracción a las utilizadas en el presente trabajo que permitan establecer su potencial bactericida.

Los resultados del análisis cuantitativo por CLAE de la fracción clorofórmica de la cáscara de cacao, indicaron que el alcaloide mayoritario fue la cafeína, otros autores han reportado a la teobromina como el alcaloide principal en todo el grano de cacao (24), pero no se encontraron estudios de la distribución de estas metilxantinas en la cáscara; Sin embargo, como indican otros autores (25), la baja solubilidad de la teobromina en solventes polares favoreció el enriquecimiento de cafeína y teofilina en el extracto etanol agua 1:1 obtenido. Además, según estudios muy recientes (26) la cafeína y teofilina forman un complejo con características químicas que podría llegar a correlacionarse en estudios posteriores con la actividad antibacteriana exhibida por esta fracción.

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El análisis por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas confirmó la presencia de cafeína como el alcaloide mayoritario en la fracción clorofórmica, según sus fragmentos característicos (27).

Las fracciones en acetato de etilo y butanólica no presentaron actividad antibacteriana. Si bien fue posible evidenciar la presencia de compuestos de tipo fenólico con base en su espectro ultravioleta (28), los cuales según reportes de otros autores han exhibido actividad antibacteriana (29); es probable que la concentración de estos compuestos en las fracciones estudiadas y/o el hecho de que puedan encontrarse formando glicósidos como lo han indicado estudios previos en el cacao (30), afecte de alguna forma su actividad. Luego sería conveniente realizar nuevos análisis llevando a cabo una hidrólisis de la cáscara de cacao, previa a la extracción para evaluar su actividad.

En conclusión, la fracción clorofórmica resultó promisoria inhibiendo el crecimiento de

Bacillus cereus ATCC 11778 y Streptococcus agalactiae, por tanto, este trabajo es el primer reporte conocido en Colombia sobre actividad antibacteriana in vitro de la fracción clorofórmica de la cáscara de cacao; el cual resulta ser un avance importante para esta agroindustria.

Esta investigación abre paso a otros estudios relacionados para establecer el espectro de inhibición frente a otros microorganismos.

Agradecimientos Los autores agradecen a Casa Luker por suministrar la cáscara de cacao, a la Vicerrectoría de Investigación y Extensión de la Universidad Tecnológica de Pereira por financiar la investigación, al Laboratorio de Calidad de Productos Naturales de la Universidad Tecnológica de Pereira por los análisis cromatográficos y al Laboratorio ClínicoPatológico López Correa (Pereira, Colombia) por la donación del microorganismo Streptococcus agalactiae.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3184-3192, 2012.

ORIGINAL

Comparación de métodos para la determinación del valor energético de alimentos para rumiantes Comparison of methods to determine the energy value of feeds for ruminants Sandra Posada O,1* Ph.D, Ricardo Rosero N,1 Ph.D, Norberto Rodríguez,2 Ph.D, Ana Costa C,2 Ph.D. Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias, Grupo de Investigación en Ciencias AnimalesGRICA, AA 1226, Medellín, Colombia. 2Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária, CEP 31270-901, Belo Horizonte, Brasil. *Correspondencia: slposada@agronica.udea.edu.co 1

Recibido: Junio de 2011; Aceptado: Mayo de 2012.

RESUMEN Objetivo. Comparar métodos de estimación del TND a partir de ensayos de digestibilidad y análisis químico de la dieta. Materiales y métodos. La digestibilidad in vivo fue determinada usando cebuínos alimentados con heno (Cynodon dactylon L. Pers. cv. Tifton 85), maíz y soya. La digestibilidad in vitro siguió la metodología de Tilley y Terry (TT). Los métodos de estimación del TND fueron: convencional (MET 1), calorimétrico desde valores de combustión cuantificados en bomba calorimétrica (MET 2), calorimétrico desde calores de combustión predefinidos (MET 3), desde la digestibilidad in vivo e in vitro de la materia orgánica (MET 4), desde el modelo multicompartimental del NRC (2001) (MET 5). Los datos se analizaron en diseño completamente aleatorizado y la comparación del efecto promedio se realizó usando la prueba de Tukey (α=5%). La intercambiabilidad entre los valores de TND obtenidos desde el procedimiento TT (MET 4) y el MET 5 se valoró a partir del método de Bland-Altman. Resultados.

Los valores de TND estimados in vivo por MET 1, MET 3 y MET 4 no presentaron diferencia (p>0.05) pero difirieron del valor obtenido por MET 2 (p<0.05), que fue menor. Los valores de TND del MET 5 no fueron intercambiables con los obtenidos desde el procedimiento TT, que superaron los rangos encontrados en la literatura. Conclusiones. La estimación del TND desde MET 2 es más confiable porque no se hacen presunciones u omisiones en el valor energético de los componentes orgánicos.

El MET 5 se mostró promisorio para el cálculo del TND. Palabras clave: Caloría, calorimetría, digestibilidad in vitro, digestibilidad in vivo (Fuente: Agrovoc).

3184

Posada - Comparación de métodos para detectar valor energético para rumiantes

3185

ABSTRACT Objective. Compare different methods (MET) to calculate TND based on chemical analysis of diets and digestibility trials. Materials and methods. in vivo digestibility trials were determined using zebu animals fed hay (Cynodon dactylon L. Pers. cv. Tifton 85), corn and soybean meal. The in vitro digestibility followed the Tilley and Terry (1963) methodology (TT). Methods for estimating TND were: conventional (MET 1), calorimetric based on the combustion values quantified in a bomb calorimeter (MET 2), calorimetric based on table combustion heat values (MET 3), based on the in vivo e in vitro organic matter digestibility (MET 4), and based on the multi-compartment model by the NRC (2001) (MET 5). Data was analyzed by a completely randomized design and comparison of the average effect was conducted using Tukey test (α=5%). The Bland-Altman method was used to evaluate the exchangeability between TND values obtained from TT assay (MET 4) and MET 5. Results. The TND values estimated in vivo by MET 1, MET 3 y MET 4 showed no statistical difference (p>0.05) but differed from the value obtained by MET 2 (p<0.05), which was lower. TND values estimated by MET 5 were not exchangeable with those obtained by TT assay, which were above the ranges established by literature. Conclusions. TND estimate by MET 2 proved to be more reliable, because it did not include assumptions or omissions for energy values of the organic components. MET 5 proved to be promising for the calculation of TND. Key words: Calorie, calorimetry, in vitro digestibility, in vivo digestibility (Source: Agrovoc).

INTRODUCCIÓN El análisis químico no es suficiente para conocer el valor nutritivo de los alimentos, siendo también importante considerar los procesos asociados con su digestión, absorción y metabolismo.

Las pruebas de digestibilidad permiten estimar la proporción de nutrientes presentes en una ración que puedan ser absorbidos por el aparato digestivo del animal y que, por tanto, no se eliminan con las heces (1).

La información sobre el potencial energético de los alimentos es fundamental para su valoración nutricional y económica. Si bien la energía bruta puede ser medida de forma simple a través del empleo de una bomba calorimétrica, su validez en nutrición animal es cuestionable por la variabilidad que registran los alimentos en digestibilidad y metabolismo. Entendiendo que las pérdidas fecales son las más representativas de la energía consumida, ensayos de digestibilidad que permitan cuantificar su magnitud estarán dando una mejor aproximación de la energía realmente disponible para el animal. Factores dependientes del alimento y del animal afectan la digestibilidad del alimento y, por tanto, su valor energético. Entre los primeros se tiene la composición del alimento consumido (contenido de material celulósico y graso, concentración mineral), el tratamiento al que ha sido sometido (secado, molienda) y el efecto asociativo entre los alimentos que componen la ración (1). Los factores animales incluyen el nivel de consumo, la capacidad de selección del animal en función de la oferta de material, la disponibilidad de agua, la tasa de pasaje del alimento, la eficiencia metabólica de los animales y las condiciones

ambientales (temperatura, humedad relativa) en las que se encuentren (2).

Para la determinación del coeficiente de digestibilidad se han empleado diversos métodos in vivo e in vitro. Entre los procedimientos in vivo, la colección total de heces es el método más confiable por involucrar directamente factores del alimento y del animal que afectan el aprovechamiento nutricional, no obstante, es laborioso, costoso, demanda tiempo e infraestructura e implica algunas restricciones al manejo ordinario de animales en producción (2). Dadas estas restricciones, los métodos de digestibilidad in vitro representan una alternativa de trabajo por su rapidez y confiabilidad, siempre que se simulen adecuadamente los procesos de digestión (3). Métodos de estimación de la energía disponible que integran el análisis químico de los alimentos con modelos matemáticos unicompartimentales y multicompartimentales también han sido reportados por la literatura (4, 5).

El total de nutrientes digestibles (TND), como unidad de expresión del contenido energético de los alimentos, constituye una medida aproximada de la digestibilidad (6) y cuando su valor es conocido otras expresiones de energía pueden ser calculadas mediante el uso de ecuaciones apropiadas (5). El objetivo de este trabajo fue presentar y comparar varios métodos de estimación del TND a partir de ensayos de digestibilidad in vivo, in vitro y a partir modelos matemáticos que incorporan el análisis químico de la ración.

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MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. Los datos de este trabajo se generaron de un experimento con ganado Nellore realizado durante cuatro períodos diferentes, correspondientes a un intervalo promedio de peso de 81.43 Kg. Durante cada período se realizaron pruebas de digestibilidad in vivo. La prueba de digestibilidad in vitro, incluyendo todos los alimentos garantizados durante el trabajo, se realizó al final de la fase experimental para garantizar idénticas condiciones de laboratorio.

Sitio de estudio. El experimento se realizó en la Escuela de Veterinaria de la Universidad Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (Brasil).

La ciudad de Belo Horizonte está situada a 900 msnm, posee una temperatura media de 23°C, humedad relativa del 65% y precipitación promedio anual de 1600 mm, tratándose de un clima tropical de altitud según la clasificación de Köppen (7). Geográficamente se encuentra a 19º 55’ 15” de latitud Sur y 43º 56’ 16” de longitud occidente, con respecto al meridiano de Greenwich.

Animales e instalaciones experimentales. Cinco cebuínos enteros de raza Nellore, con peso vivo medio inicial de 200 Kg, fueron mantenidos en régimen de confinamiento en galpón cubierto, en corrales individuales (2 x 1.5 m), con piso de concreto revestido de tapete, comederos y bebederos individuales.

Alimentación. La dieta estuvo constituida por heno de Tifton 85 (Cynodon dactylon L. Pers. cv. Tifton 85), suplemento concentrado a base de maíz y torta de soya y sal mineralizada comercial. La proporción forraje-concentrado varió en función de la edad de los animales, buscando una composición nutricional que permitiera obtener ganancias medias próximas a 700 g/animal/día, de acuerdo con las recomendaciones de Valadares et al (8) (Tabla 1). La ganancia media de peso obtenida fue 1058.25 g/animal/día.

La ración fue suministrada ad libitum dos veces al día, a las 8 y 17 horas, en la forma de ración total mezclada. La cantidad de alimento fue diariamente ajustada permitiendo sobrantes entre 5 y 10% de lo ofrecido, las cuales fueron pesadas y muestreadas diariamente para análisis de materia seca. El consumo de

Tabla 1. Composición porcentual y descripción química de la ración, expresadas como porcentaje de la materia seca.

Período Ingred.

1

2

3

4

Heno (Cynodon dactylon (L.) Pers. cv. Tifton 85)

60

60

70

80

Maíz

20

25

18

10

Torta de soya

20

15

12

10

MS

89.73

88.87

89.62

90.11

PB

14.49

15.13

11.82

14.45

EE

1.58

2.40

2.17

2.06

MI

5.42

5.80

6.47

6.37

FDNp

55.51

48.40

56.72

65.08

FDA

27.31

22.15

27.68

32.09

3.13

1.90

2.84

2.85

78.52

76.67

79.54

77.12

Composición química2

Lignina CHOt CNE EB (Kcal/Kg MS)

23.01

28.27

22.82

12.03

4539.12

4392.53

4426.36

4504.98

Ingred. = Ingredientes1 1 Balances minerales, de acuerdo con las recomendaciones de Valadares y col. [19], determinaron la cantidad de sal mineralizada garantizada.

Composición por kilogramo: 160 g calcio, 60 g fósforo, 110 g sodio, 10 g magnesio, 50 g azufre, 82 mg cobalto, 800 mg cobre, 120 mg yodo, 3600 mg manganeso, 27 mg selenio, 5200 mg zinc, 4700 mg hierro, 600 mg (máx) de flúor 2 MS=materia seca, PB=proteína bruta, EE=extracto etéreo, MI=material inorgánico, FDNp=fibra en detergente neutro corregida para proteína, FDA=fibra en detergente ácido, CHO t =carbohidratos totales, CNE=carbohidratos no estructurales, EB=energía bruta

materia seca fue obtenido por la diferencia entre la cantidad de alimento ofrecido y el sobrante. La ración fue la misma para todos los animales, variando sólo las cantidades garantizadas de acuerdo con el manejo previamente expuesto.

Ensayos de digestibilidad aparente in vivo. Las pruebas de digestibilidad tuvieron una duración de cinco días y fueron realizadas durante los cuatro períodos evaluados. La producción de materia seca fecal fue determinada por el procedimiento tradicional de colecta total y la composición química de las heces fue valorada desde colecta fecal individual realizada diariamente a mañana y tarde. Porciones de aproximadamente 250 g de heces fueron colectadas directamente del ano, identificadas y congeladas a –10ºC. Al final del período de colecta, las heces fueron sometidas a presecado en estufa de ventilación forzada a 65ºC por 96 horas y después de pasar por un molino estacionario “Thomas-Wiley”, adaptado con tamiz de 1 mm, se realizó una muestra compuesta por animal, en proporción con la excreción de materia seca fecal determinada diariamente.

Este material fue conservado en frascos plásticos herméticamente cerrados para su posterior análisis químico.

Posada - Comparación de métodos para detectar valor energético para rumiantes

Ensayo de digestibilidad in vitro. La digestibilidad in vitro de los alimentos individuales, de la mezcla concentrada y de la ración total mezclada fue determinada en un fermentador ruminal DAISYII (ANKOM®), conservando la proporción en la cual participaron en la dieta ofrecida a los animales. La metodología desarrollada correspondió a la propuesta realizada por Tilley y Terry (9). La preparación del medio de cultivo y del inóculo, así como la determinación de la digestibilidad de la materia seca se basó en el protocolo propuesto por el proveedor del fermentador (10).

Análisis químico. En los alimentos, los sobrantes y las heces se realizó análisis de materia seca (MS), proteína bruta (PB), extracto etéreo (EE), cenizas (MI) (11), energía bruta (EB) (12) y fibra en detergente neutro (FDN) (13) corregida para proteína (FDN p) (14). Los carbohidratos totales fueron obtenidos por la ecuación CHOt= 100-(%PB+%EE+%MI), y los carbohidratos no estructurales (CNE) por la diferencia CHOtFDNp (15). El análisis de fibra en detergente ácido (FDA) (13) y de lignina (16) se efectuó únicamente en los alimentos. En los residuos de incubación in vitro sólo se determinó el contenido de MS y de MI. Determinación del total de nutrientes digestibles (TND). El contenido de TND de los alimentos fue determinado a través de cinco métodos (MET) diferentes: Por el método convencional (MET 1). El TND fue estimado a partir de la ecuación: T N D ( % ) = ( P B D + C N E D + F D N pD + 2.25*EED)/100, donde PBD = proteína bruta digestible, CNED = carbohidratos no estructurales digestibles, FDNpD = fibra en detergente neutro digestible corregida para proteína y EED = extracto etéreo digestible (1).

Por el método calorimétrico a partir de valores de combustión cuantificados directamente en bomba calorimétrica (MET2). (17). Los coeficientes de digestibilidad de la energía fueron multiplicados por un factor de ajuste (F), calculado como F=(MO/100)*(100+(EE*2.25)-EE)/100, donde MO = porcentaje de materia orgánica en la ración y EE = porcentaje de EE en la materia orgánica. Los coeficientes de digestibilidad de la energía correspondieron a la energía digestible (ED), expresada como porcentaje del contenido

3187

de energía bruta (EB), y fueron determinados a partir de la cuantificación del contenido de EB en alimentos, los sobrantes y las heces, mediante el uso de la bomba calorimétrica.

Por el método calorimétrico a partir de calores de combustión predefinidos, sin empleo de la bomba calorimétrica (MET 3). (17). Partiendo del mismo procedimiento indicado en el MET 2, la única variante consistió en la estimación del contenido de EB de los alimentos, los sobrantes y las heces usando calores de combustión predefinidos para los nutrientes orgánicos, sin empleo directo de la bomba calorimétrica. Para PB, EE, FDNp y CNE, los calores de combustión correspondieron a 5.65, 9.40, 4.25 y 4.15 Kcal/g, respectivamente (17).

A partir de la digestibilidad de la materia orgánica (MET 4). (18). El coeficiente de digestibilidad de la materia orgánica (MO) fue multiplicado por el factor de ajuste F previamente descrito en el MET 2.

Por medio del modelo multicompartimental NRC (MET 5). (4). A partir de la descripción química de los alimentos, el TND fue calculado como TND1x (%) = dvCNE + dvPB + (dvAG*2.25) + dvFDN – 7, siendo 7 el valor correspondiente a las pérdidas metabólicas fecales y dv la digestibilidad verdadera de cada una de las fracciones, que fue encontrada desde las siguientes ecuaciones: dvCNE = 0.98*[100 – (FDN- PIDN)-PB-MI-EE] * PAF dvPB para forrajes = PB * exp [-1.2 * (PIDA/PB)] dvPB para concentrados = [1 – (0.4 * (PIDA/ PB))] * PB dvAG = AG, determinados como (EE-1) dvFDN = 0.75 * (FDNN-Lignina) * (1-(lignina/ FDNN)0.667) Donde PIND y PIDA= proteína insoluble en detergente neutro y ácido, respectivamente; FDNN= FDN libre de nitrógeno, PAF = factor de ajuste por procesamiento, correspondiente a 1 para grano molido. Todas las variables contempladas en la ecuación estuvieron expresadas como porcentaje de la materia seca.

A partir de la digestibilidad in vivo de la ración total fue calculado el TND conforme los cuatro primeros métodos (MET 1, MET 2, MET 3 y MET 4).

Desde el análisis in vitro de los alimentos, esto es, ensayo de Tilley y Terry (9) y descripción química incorporada al modelo multicompartimental del NRC (4), la determinación del TND (%) se realizó conforme MET 4 y MET 5, respectivamente.

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Estimación del valor calórico del TND. El valor calórico (VC) del TND estimado por los diferentes métodos, con base en los resultados de digestibilidad in vivo, fue calculado a partir de la relación propuesta por Crampton et al (19): VC (Mcal ED/Kg TND) = [ED del alimento (Mcal/ Kg MS)/TND (%)]*100

para las diferencias (y) y los promedios (x) entre ambas metodologías, con el fin de establecer si existió significancia estadística de la pendiente.

Para el análisis de los datos fueron usados los procedimientos PROC GLM, PROC MEANS y PROC REG del paquete estadístico SAS (21).

RESULTADOS

Análisis estadístico. Bajo un diseño de clasificación experimental completamente aleatorizado, balanceado, efecto fijo, se valoró el efecto del método de estimación sobre los valores de TND (%) obtenidos a partir de las pruebas de digestibilidad in vivo y su correspondiente valor calórico.

La comparación del efecto promedio de los métodos se realizó por medio de la prueba de Tukey al 5% de significancia.

Este procedimiento se complementó con un análisis de estadística descriptiva, incluyendo media y desviación estándar.

La digestibilidad aparente de la materia seca y de las diversas fracciones nutricionales, resultante de los ensayos de digestibilidad in vivo realizados en los diferentes períodos experimentales, se presenta en la tabla 2.

El promedio de TND (%) estimado para la ración total mezclada conforme los diferentes métodos, a partir de los resultados de digestibilidad in vivo, y su respectivo valor calórico se presenta en la tabla 3. Los valores de TND y su equivalente calórico no presentaron diferencia significativa (p>0.05) cuando fueron estimados por MET 1, MET 3 y MET 4; no obstante, los tres métodos anteriores se mostraron estadísticamente diferentes (p<0.05) del MET 2, que registró menor TND y superior valor calórico. Los coeficientes de variación del TND para MET 1, MET 2, MET 3 y MET 4, fueron 4.43, 3.94, 4.36 y 4.50, respectivamente. Para estos mismos métodos, la dispersión porcentual en el valor calórico fue 3.80, 2.20, 3.72 y 3.80, correspondientemente (Tabla 3).

El grado de intercambiabilidad entre los valores de TND (%) obtenidos desde el ensayo de Tilley y Terry (9) (estimación del TND a partir de la MET 4) y el modelo multicompartimental del NRC (4) (estimación del TND a partir de la MET 5) se valoró a partir del método de Bland-Altman (20). Este método incluyó la construcción de un gráfico de la media de medidas pareadas (eje x) contra sus diferencias (eje y). El intervalo de confianza alrededor de la media de las diferencias fue calculado (media de las diferencias ± 1.96 x desviación estándar de las diferencias) y posteriormente se efectúo análisis de regresión

El porcentaje de MOD determinado por el procedimiento de Tilley y Terry (9), así como el contenido de TND predicho desde esa fracción (MET 4) y desde el modelo multicompartimental del NRC (4) (MET 5) se muestran en la tabla

Tabla 2. Porcentajes de digestibilidad aparente in vivo de diversos constituyentes nutricionales en los cuatro períodos experimentales Período

Nutriente

MS MO PB EE FDNp CNE Energía

1

2

3

4

Prom1

DE1

Prom

DE

Prom

DE

Prom

DE

67.22 68.52 75.68 64.92 58.20 87.39 65.78

2.59 2.44 3.65 2.93 3.36 1.03 2.70

71.05 72.17 76.62 75.57 62.20 85.20 67.68

1.53 1.59 0.70 0.95 1.78 2.31 1.70

71.16 72.53 74.11 74.19 68.20 82.02 67.55

2.23 2.22 2.78 2.71 1.97 2.61 2.59

74.48 75.75 78.32 62.72 77.33 66.40 66.16

2.63 2.58 1.18 5.72 2.48 5.59 3.41

Prom = promedio; DE = desviación estándar

1

Tabla 3. Porcentaje de total de nutrientes digestibles (TND) estimado por diferentes métodos a partir de resultados de digestibilidad in vivo y su correspondiente valor calórico (VC).

Método 1 TND1, % VC, Mcal ED/Kg TND

2

3

DE2

Prom

DE

Prom

DE

Prom

DE

69.76a 3.82b

3.09 0.15

64.56b 4.12a

2.54 0.09

69.89a 3.81b

3.05 0.14

69.82a 3.82b

3.14 0.14

Dentro de una fila, promedios sin letra común presentan diferencia estadística (p<0.05) Prom = promedio; DE = desviación estándar

1 2

4

Prom2

3189

Posada - Comparación de métodos para detectar valor energético para rumiantes

Tabla 4. Porcentaje de materia orgánica digestible (MOD) y del total de nutrientes digestibles (TND) determinados desde ensayo de digestibilidad in vitro de Tilley y Terry (1963) y modelo multicompartimental del NRC (2001) Alimento

Período

Procedimiento Tilley y Terry (1963)

Modelo NRC (2001)

% MOD

%TND

% TND

Heno (Cynodon dactylon (L.) Pers. cv. Tifton 85)

1 2 3 4 Prom DE

41.59 55.30 58.98 46.60 50.62 7.95

39.62 53.13 56.48 44.54 48.44 7.74

52.76 59.76 56.91 55.79 56.31 2.89

Maíz

1 2 3 4 Prom DE

92.91 88.83 90.51 89.46 90.43 1.79

94.24 91.49 91.48 92.94 92.54 1.33

85.64 87.71 85.21 89.39 86.99 1.93

Torta de soya

1 2 3 4 Prom DE

95.48 96.26 92.87 92.65 94.32 1.83

91.25 88.52 85.28 86.62 87.92 2.59

79.00 76.95 73.32 77.20 76.62 2.38

Suplemento concentrado (maíz-soya) 1 50-50 62.5-37.5 60-40 50-50

1 2 3 4 Prom DE

91.57 92.29 89.69 88.81 90.59 1.61

90.20 91.24 87.33 87.65 89.11 1.92

82.32 83.63 80.34 83.29 82.39 1.48

Ración total mezclada (heno, maíz, soya)2 6-20-20 60-25-15 70-18-12 80–10–10

1 2 3 4 Prom DE

59.42 65.51 58.04 42.84 56.45 9.64

57.38 63.67 55.86 41.21 54.53 9.50

64.58 69.56 64.19 61.99 65.08 3.20

Alimentos mezclados de acuerdo a su participación porcentual en la elaboración del suplemento concentrado 2 Alimentos mezclados de acuerdo a su participación porcentual en la ración total mezclada ofrecida a los animales 1

A partir de los valores presentados en la tabla 4, fue realizada la prueba de intercambiabilidad de Bland-Altman, basada en el análisis de regresión para las diferencias (y) y los promedios (x) entre los valores de TND estimados desde el ensayo de Tilley y Terry (9) y aquellos obtenidos desde el modelo multicompartimental del NRC (4) (Figura 1). La pendiente de regresión fue estadísticamente significativa (p=0.0001) y el alto grado de dispersión en las diferencias generó un intervalo de confianza (o límite de concordancia) comprendido entre -17.80 y 19.86.

25

Diferencia (TT-MM) (%)

4. Los mayores coeficientes de variación del porcentaje de TND se registraron para el heno y la ración total mezclada, siendo superiores cuando se trató del ensayo de Tilley y Terry (9). A través de este ensayo, el coeficiente de variación del TND fue de 17.42, 15.97, 1.43, 2.95 y 2.15% para la ración total mezclada, el heno, el maíz, la torta de soya y el suplemento concentrado, respectivamente. Para los mismos alimentos, la dispersión del TND cuando se estimó por el modelo multicompartimental (4) fue 4.91, 5.14, 2.22, 3.11 y 1.79%, correspondientemente.

20 15

y = 0,5335x -3 8,443 R2 = 0,7655

10 5 0 -5

40

50

60

70

80

90

100

-10 -15 -20 -25

Promedio ( (TT+MM)*0.5) (%)

Figura 1. Análisis de Bland-Altman para el TND estimado desde el análisis in vitro de los alimentos (TT=ensayo de Tilley y Terry, 1963; MM= modelo multicompartimental del NRC, 2001).

DISCUSIÓN Si bien el TND ha sido ampliamente aceptado en circunstancias prácticas de alimentación, se trata de un sistema empírico de valoración energética, donde los valores asignados a los alimentos pueden carecer de precisión dependiendo del método de estimación. En el presente estudio, el TND obtenido para la ración total mezclada, luego de aplicar los resultados derivados del ensayo de digestibilidad in vivo, no presentó diferencia estadística significativa (p>0.05) entre tres de los cuatro métodos de estimación propuestos, registrando un valor medio de 69.82% (Tabla 3). Los tres métodos en mención, correspondientes a MET 1, MET 3 y MET 4, se basaron en el análisis proximal, característica común que puede estar explicando la similitud en los valores de TND obtenidos y que permite clasificarlos como métodos de estimación indirectos, que llevan implícita la falta de precisión asociada con la valoración química. El MET 2, que presentó diferencia estadística (p<0.05) con los anteriores métodos, superó esta limitante por usar directamente los valores de energía bruta obtenidos de la combustión del alimento, los sobrantes y las heces en la bomba calorimétrica, generando información sobre la energía digestible (luego de aplicar la relación EB absorbida/EB consumida), que luego fue transformada hasta TND. Este método, además, sólo requiere de la determinación de las cenizas y el extracto etéreo en los alimentos evaluados.

El valor medio obtenido con el MET 2 (64.56%) (Tabla 3), aunque inferior en aproximadamente 8% respecto los demás métodos evaluados (media de 69.82%), no es cuestionable y fue considerado el valor referencia para el presente trabajo, toda vez que la bomba calorimétrica concede a los diversos constituyentes orgánicos su verdadero valor energético, tanto para el alimento consumido como para la fracción digestible, a diferencia de lo que ocurre en el cálculo del TND por el método convencional (MET 1), donde solamente el valor

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

calórico extra de las grasas es considerado para la fracción digerida, pero no para la fracción consumida, última fracción donde se considera que la grasa tiene un valor energético equivalente a los carbohidratos y las proteínas. Además, el TND determinado por el método convencional presenta también la limitante de omitir el calor de combustión adicional que tienen las proteínas en relación con los carbohidratos, 5.65 vs. 4.20 Kcal/g, respectivamente, asumiendo que todas las proteínas y carbohidratos consumidos y digestibles tienen igual valor energético y que todas las grasas poseen un valor energético 2.25 veces mayor que los carbohidratos y las proteínas, supuestos que conllevan a inadecuada evaluación de un alimento o ración.

Según Lofgreen (18), aunque la composición de la materia orgánica del alimento y de las heces es incomparable por las diferencias existentes en la digestibilidad de los nutrientes, los calores de combustión de ambos materiales no son tan desiguales, lo que hace posible estimar el contenido de TND desde el coeficiente de digestión de la materia orgánica. Los resultados del presente trabajo no validaron esta premisa, porque de acuerdo con el planteamiento del autor era de esperarse que el coeficiente de digestión de la MO, que registró un promedio de 72.24% para los cuatro períodos experimentales, no fuera tan diferente del coeficiente de digestión promedio de la energía, 66.79% (para el mismo intervalo de tiempo) (Tabla 2), caso en el cual se obtendrían valores de TND similares a partir del MET 2 y del MET 4. Se resalta que la diferencia estadística (p<0.05) entre los métodos 2 y 4 (Tabla 3), que emplearon el contenido de ED y de MOD para estimar el porcentaje de TND aplicando el factor de ajuste F sugerido por Lofgreen (17, 18), no fue determinada por la utilización de este factor, ya que el mismo osciló entre 0.96 y 0.97, afectando en igual medida los valores iniciales de ED y MOD. Independientemente de las ventajas o desventajas asociadas con los métodos de estimación del TND evaluados, se destacan los bajos coeficientes de variación registrados (Tabla 3), indicando la consistencia en los resultados derivados de los ensayos de digestibilidad in vivo (de la ración total mezclada) (Tabla 2). Situación contraria se registró con el ensayo in vitro de Tilley y Terry (9), donde la media de TND para la ración total mezclada presentó un coeficiente de variación superior (Tabla 4).

En concepto de Lofgreen (17), algunas de las incertidumbres de la medición del TND deben superarse por medir la ED, siendo importante el establecimiento de la relación ED/TND por la repercusión práctica que los valores de TND cobran

en los estándares de alimentación. Factores de conversión derivados de comparar valores de TND y ED determinados en una misma prueba de digestión resultarán más significativos que un factor calculado teórico (22).

En el presente trabajo, el valor calórico del TND (de la ración total mezclada durante los ensayos in vivo) fue de 3.82, 4.12, 3.81 y 3.82 Mcal/Kg TND para los métodos de estimación 1, 2, 3 y 4, respectivamente (Tabla 3), mostrándose inferior a 4.409 Mcal ED/Kg TND, reportado por el NRC (23). Debido a que los nutrientes tienen diferentes calores de combustión, el valor calórico del TND no es constante entre alimentos. De acuerdo con el NRC (4), cuando una alta proporción del TND de un alimento se deriva de la proteína, el valor calórico del TND supera las 4.409 Mcal; no obstante, cuando una alta proporción de su TND es provista por carbohidratos o grasa, la equivalencia energética será inferior a 4.409 Mcal/Kg TND. El valor calórico encontrado en este trabajo puede explicarse entonces por la composición de la ración, donde los carbohidratos totales constituyeron en promedio 77.96% de la ración ofrecida (Tabla 1). El extracto etéreo sólo correspondió al 2.05% de lo ofrecido, razón por la cual su participación en el cálculo del TND no fue representativa. El superior valor calórico registrado para el MET 2, se corresponde con el menor porcentaje de TND estimado por este método.

Cuando se compararon los métodos de estimación del TND a partir de procedimientos in vitro (MET 4 y MET 5) se observó que los mismos condujeron a sobre o subvaloración de la digestibilidad en función del sustrato evaluado (Tabla 4). En este sentido, la significancia estadística de la pendiente de regresión en la prueba de intercambiabilidad de Bland-Altman (Figura 1) indicó que la discrepancia entre el valor de TND estimado desde el ensayo de Tilley y Terry (9) (MET 4) y aquel obtenido desde la aplicación del modelo multicompartimental del NRC (4) (MET 5) no se mantuvo constante en todo el rango o intervalo de la distribución, sino que incrementó con el aumento de los valores promedio de TND. Tratándose del heno, cuyo valor promedio de TND para ambos métodos de estimación fluctuó entre 46.19 (en el período 1) y 56.59% (en el período 3), o de la ración total, cuyo media de TND varió entre 51.60 (en el período 4) y 66.62% (en el período 2) (Tabla 4), las diferencias siempre estuvieron a favor del MET 5, con los puntos ubicados por debajo del valor cero en el eje de las abscisas en el análisis de intercambiabilidad (Figura 1). Para los componentes del suplemento, a saber, maíz y torta de soya, el promedio de TND estimado por los dos métodos se mantuvo entre 79.30 (para la torta de soya en el período 3) y 91.16% (para el maíz en el período 4) (Tabla 4), y todas las diferencias estuvieron a

Posada - Comparación de métodos para detectar valor energético para rumiantes favor del MET 4, con los puntos ubicados por encima del valor cero en el eje de las abscisas (Figura 1).

El TND obtenido por el procedimiento de Tilley y Terry (9) (MET 4) para el heno de Tifton (Cynodon dactylon L. Pers. cv. Tifton 85), el maíz y la torta de soya correspondió a 48.44, 92.54 y 87.92%.

Para estos mismos alimentos, la determinación mediante modelo multicompartimental (4) (MET 5) derivó cifras de 56.31, 86.99 y 76.62% TND, respectivamente (Tabla 4). Al comparar estos valores con algunos reportes de la literatura, se concluye que el MET 4 subvaloró el contenido energético del heno y sobrestimó el del maíz, en tanto que las predicciones realizadas por el MET 5 estuvieron más afines. El TND reportado por Valadares et al (24) para el heno de Tifton es 55.62%, valor próximo al indicado por el NRC (4), 55.30%, y al rango propuesto por Júnior et al (25), entre 55.90 y 59.61%. Para el maíz, Valadares et al (24), el NRC (4) y Preston (26) reportan 87.24, 88.70 y 88.00% TND, respectivamente.

En relación con la torta de soya, valores sugeridos por Pereira et al (27), Valadares et al (24), Júnior et al (14) y Preston (26), correspondientes a 81.40, 81.54, 83.24 y 84.00% TND, se muestran inferiores al obtenido con MET 4 pero superiores al estimado por MET 5. No obstante, el NRC (4) y el AEC (28) reportan valores de 88.50 y 77% TND, respectivamente, muy próximos a los obtenidos con los métodos enen consideración.

Factores como la variabilidad del inóculo, el tamaño de partícula, el peso del sustrato, la relación inóculo:buffer y la duración asignada a la primera etapa del procedimiento pueden explicar los resultados de digestibilidad obtenidos con la técnica de Tilley y Terry (9) en este trabajo, respecto los valores descritos por la literatura.

3191

Boila et al (29) trabajando con un mismo material (ensilaje de maíz) encontraron que la digestibilidad de la materia seca varió en función del peso del sustrato, la frecuencia de agitación de los sustratos durante la incubación, el volumen de inóculo y el número de bacterias presentes en el mismo.

Resulta de interés la acertada estimación realizada por el modelo multicompartimental del NRC (4) aun tratándose de alimentos de origen tropical que, como el heno de Tifton (Cynodon dactylon L. Pers. cv. Tifton 85), presentan contenidos de carbohidratos estructurales. Esto posiblemente se explique por la introducción en el modelo de un término que da cuenta de la proporción de FDN indisponible, donde el contenido de lignina, como factor limitante de la digestión, es considerado. De acuerdo con Weiss (5), la fibra se destaca como la variable más común para predecir el contenido energético de los alimentos, reportando además que la FDN potencialmente digestible calculada en el modelo funciona como una fracción uniforme, o lo que es lo mismo, presenta digestibilidad constante a través de todos los alimentos, lo cual es una característica positiva.

En conclusión, la divergencia en las medidas de dispersión entre los métodos de estimación in vivo e in vitro conduce a recomendar los primeros como el método de elección para la evaluación de alimentos, no obstante, se resalta que el modelo multicompartimental sugerido por el NRC (4) y basado en la descripción química se mostró promisorio para el cálculo del TND. Agradecimientos Los autores agradecen al Proyecto de Sostenibilidad 2011-2012 (CODI, Universidad de Antioquia) y a la Fundación Universitaria San Martín el apoyo económico para la ejecución de este trabajo.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3193-3199, 2012.

ORIGINAL

Murciélagos del área urbana en la ciudad de Montería, Córdoba - Colombia Urban Bats from the City of Monteria, Cordoba - Colombia Jesús Ballesteros C,1* Ph.D, Javier Racero-Casarrubia,2 M.Sc. Universidad de Córdoba, Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Biología. Grupo Investigación Biodiversidad Unicórdoba. Montería, Colombia. 2Parque Natural Nacional Paramillo.

Grupo de Investigación Biodiversidad Unicórdoba. *Correspondencia: jballescor@yaahoo.com 1

Recibido: Julio de 2011; Aceptado: Enero de 2012.

RESUMEN Objetivo. Conocer la riqueza de especies de murciélagos del área urbana de la ciudad de Montería.

Materiales y métodos. Durante el período de enero a junio de 2007, se realizaron capturas de murciélagos utilizando cinco redes de nieblas (12x2 m). Se realizaron trece muestreos en varios sitios de la ciudad, abriendo las redes desde las 18:00 a las 24:00 horas, con un esfuerzo de 524 horas-red/ noche. Resultados. De 604 individuos capturados se identificaron 24 especies de murciélagos. La mayor abundancia relativa se presentó en las especies Artibeus planirostris (54%), Artibeus lituratus (11.2%) Sturnira lilium (7.4%) y Glossophaga soricina (4.2%). Conclusiones. El ensamblaje de murciélagos en el área urbana estuvo representado por los gremios insectívoros, frugívoros, nectarívoros, omnívoros y piscívoros. La familia Phyllostomidae presentó la mayor diversidad de especies.

Palabras clave: Clima tropical, ecología, mamíferos, quirópteros (Fuente: MeSH).

ABSTRACT Objective. To identify the abundance of bat species in urban areas of the city of Monteria. Materials and methods. During the period from January to June 2007, collections of bats were made using five (12x2 m) mist nets. Thirteen surveys were conducted at several sites in the city, opening up the networks from 18:00 to 24:00 hours, with an effort of 524 hours-net/night. Results. A total of 604 catches, with 24 species of bats identified. The highest relative abundance of species occurred in Artibeus planirostris (54%), Artibeus lituratus (11.2%), Sturnira lilium (7.4%) and Glossophaga soricina (4.2%). Conclusions. The assembly of bats in urban area was represented by insectivores, frugivores, nectarivores, omnivores and piscivores. The family Phyllostomidae had the highest species diversity.

Key words: Chiroptera, ecology, mammals, tropical climate (Fuente: MeSH).

3193

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INTRODUCCIÓN Los murciélagos, únicos mamíferos capaces de volar, tienen amplia distribución en el planeta son especialmente diversos en el Neotrópico y se desempeñan en una gran variedad de nichos tróficos (1). Con más de 1100 especies a nivel mundial (2) y 220 especies en el Neotrópico (3), los murciélagos constituyen el segundo orden taxonómico más diverso entre los mamíferos.

Colombia con 197 especies de murciélagos (4,5), ocupa el primer lugar en América y segundo en el mundo en cuanto a la diversidad de quirópteros (6). Para el departamento de Córdoba se han identificado ocho familias, 37 géneros y unas 66 especies de murciélagos.

Estos organismos cumplen una importante función en procesos ecológicos de los bosques tropicales, especialmente como polinizadores de plantas (7), dispersores de semillas (8,9) y controladores de poblaciones de insectos plaga (10,11), un aspecto beneficioso para la agricultura al consumir millones de insectos plaga en los cultivos cada noche (12). El desconocimiento de la ecología, ha resultado perjudicial para la conservación de la diversidad de murciélagos; siendo poco valorados por la comunidad en general, que por sus hábitos nocturnos, se estigmatizan como animales dañinos y vectores de enfermedades.

En Colombia, aunque se cuenta con numerosos estudios de murciélagos en áreas rurales, especialmente sobre diversidad de especies, ecología, sistemática, distribución e implicaciones para la salud humana; es poca la literatura disponible que documente aspectos ecológicos de los murciélagos en ecosistemas urbanos.

La generación de información científica sobre murciélagos en áreas urbanas es de gran importancia para futuros planes de conservación y manejo. Un estudio integral de los murciélagos en ambientes urbanos puede ayudar a eliminar algunos prejuicios; especialmente de aquellas especies que generan molestias al cohabitar con el hombre y que algunas veces, puede presentar problemas de salud pública, como es la histoplasmosis, una enfermedad causada por un hongo microscópico del suelo (Histoplasma capsulatum), que puede estar presente en los excrementos de murciélagos, además de su papel como transmisores de enfermedades zoonóticas como la rabia, la leptospirosis, la histoplasmosis y la encefalitis equina (13).

Estudios de murciélagos asociados a áreas urbanas en Colombia son escasos y para Córdoba, sólo un trabajo se refiere al tema (14), quizás debido a que la mayoría de estudios

biológicos se orientan casi exclusivamente al sector rural. Es importante reconocer que los ecosistemas urbanos, al estar inmersos en una matriz del paisaje contienen importante diversidad de especies faunísticas, muchas veces desconocidas, en especial aquellas especies poco carismáticas como los quirópteros. Considerando la escasa literatura disponible que documente aspectos ecológicos de los murciélagos de las áreas urbanas en Colombia, este artículo, tiene como objetivo aportar información para llenar los vacíos de conocimientos sobre la composición del ensamble de murciélagos del área urbana de la ciudad de Montería.

MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio. El trabajo se desarrolló en el área urbana del municipio de Montería, departamento de Córdoba, al noroccidente de Colombia (Figura 1). Esta región presenta un clima cálido, con temperatura media de 28°C y una precipitación media anual de 1200 mm, con dos épocas bien marcadas; una época lluviosa (mayo-noviembre) y una época seca (diciembre-abril). El territorio del área urbana de Montería está dividido en nueve comunas, que se extiende en la parte media del Valle del Río Sinú en un paisaje plano de origen fluvio-lacustre y colinas. El área municipal comprende cerca de 312.200 ha y un perímetro urbano de 4.300 ha. El patrón de uso del suelo es de ganadería extensiva con pastos manejados, con predominio de parches de pastizales naturales y un sector bien definido de parches de cultivos en las áreas más próximas al río Sinú. En los alrededores

Figura 1. Localización del área de estudio y distribución de los sitios de muestreo de murciélagos en la ciudad de Montería, Córdoba.

3195

Ballesteros - Murciélagos del área urbana en la ciudad de Montería de la ciudad de Montería la vegetación original ha sido completamente degradada a pequeños fragmentos de bosque secundario o bosque de galería.

Métodos. Entre los meses de enero a julio del 2007, se realizaron muestreos de murciélagos en 13 sitios del área urbana de Montería. Se utilizaron cinco redes de niebla (12x2.5 m), ubicadas al azar, abiertas desde las 18:00 hasta las 24:00 horas, y monitoreadas cada 30 minutos. Los murciélagos capturados se depositaron en bolsas de tela y luego procesados. Para la identificación de las especies, a todos los especímenes capturados se les tomó las medidas morfométricas estándar (longitud total, longitud de: cola, oreja, trago, hoja nasal, antebrazo, envergadura, pata con uña, pata sin uña, y calcáneo) con calibrador digital precisión 0.01 mm. El peso del cuerpo se tomó con balanza electrónica de precisión 0.1 g, previamente calibrada.

Para la identificación de las especies se utilizaron claves taxonómicas (15,16) y las descripciones de Gardner (7); la taxonomía de géneros y especies sigue a Wilson y Reeder (17). La identificación de gremios alimenticios se realizó con base en las categorías: insectívoros, frugívoros, nectarívoros, carnívoros, piscívoros y hematófagos (18). Se calculó el éxito de captura como el número de

individuos capturados respecto al esfuerzo de muestreo (individuos-noche/horas-red). Se elaboraron curvas de acumulación de especies usando el programa estadístico EstimateS Versión 7.5.1.

Se realizó una colección de referencia mediante especímenes voucher macho y hembra de cada especie; cuyo material biológico está depositado en la colección del Instituto de Ciencias Naturales (ICN) de la Universidad Nacional de Colombia (especímenes aún no catalogados). La colección fue realizada bajo el permiso de colecta biológica expedido por la Corporación Autónoma Regional de los Valles del Sinú y San Jorge (CVS) resolución Nº 1147 de agosto 2 de 2007.

RESULTADOS Se capturaron 604 individuos con un éxito de captura de 1.15 individuos/horas-red. Se identificaron 24 especies de murciélagos comprendidos en 14 géneros y 5 familias. La familia con mayor riqueza de especies fue Phyllostomidae con 554 individuos (12 especies), seguida de Molossidae con 24 individuos (4 especies). Las familias Noctilionidae y Emballonuridae estuvieron representadas por un sólo individuo (Tabla 1). El estimador de riqueza CHAO 1 indica una representatividad del muestreo del 98% (Figura 2).

Tabla 1. Lista de especies de murciélagos y frecuencia de captura en el área urbana de Montería, Departamento de Córdoba – Colombia.

Familia/ Subfamilia

Especie

Gremio*

# capturas/sexo Machos Hembras

Total capturas

Phyllostomidae Stenodermatinae

Phyllostominae Glossophaginae

Carollinae

Artibeus planirostris (Spix, 1823)

F

132

191

323

Artibeus lituratus (Olfers, 1818)

F

25

42

67

Uroderma bilobatum Peters, 1866

F

7

3

10

Sturnira lilium (E. Geoffroy, 1810)

F

15

41

56

Sturnira sp.

F

3

10

13

Phyllostomus discolor Wagner, 1843

O

6

8

14

Phyllostomus hastatus (Pallas, 1767)

O

1

3

4

Anoura sp

N

3

5

8

Glossophaga soricina (Pallas, 1766)

N

10

17

27

Glossophaga longirostris Miller, 1898

N

3

18

21

Carollia castanea H. Allen, 1890

F

3

6

9

Carollia perspicillata (Linnaeus, 1758)

F

2

0

2

Molossops temmincki (Burmeister, 1854)

I

3

2

5

Molossus molossus (Pallas, 1766)

I

2

6

8

Molossus currentium Thomas, 1901

I

4

6

10

Eumops bonariensis (Peters, 1874)

I

0

1

1

Saccopteryx bilineata (Temminck, 1838)

I

0

2

2

Myotis nigricans (Schinz, 1821)

I

1

9

10

Myotis albescens (E. Geoffroy, 1806)

I

10

0

10

Eptesicus brasiliencis (Desmarest, 1819)

I

1

0

1

Noctilio albiventris Desmarest, 1818

P

3

0

3

234

370

604

Molossidae Molossinae

Emballonuridae Emballonurinae Vespertilionidae Myotinae

Noctilionidae TOTAL

*Gremios: (F) Frugívoro, (O) Omnívoro, (I) Insectívoro, (P) Piscívoro, (N)Nectarívoro.

3196

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(a)

(b)

Figura 2. Curva de acumulación de especies de murciélagos capturados en el área urbana de la ciudad de Montería.

El ensamblaje de murciélagos para el área urbana de Montería, según gremios alimentarios, estuvo integrada por cinco categorías, dentro de las cuales los murciélagos insectívoros (38%) presentaron mayor riqueza de especies, seguido por frugívoros, nectarívoros, omnívoros y pescadores (Figura 3). La familia Phyllostomidae presentó la mayor riqueza de especies, siendo Artibeus planirostris (Figura 4a) la más abundante; mientras que Molosus molossus (Figura 4b) fue la especie con mayor abundancia asociada a sitios de construcciones y techos de las viviendas urbanas.

Figura 4. (a) Superior, murciélago frutero (Artibeus planirostris). (b) inferior, murciélago cola de ratón (Molossus molossus) capturados en el área urbana de la ciudad de Montería, Colombia.

DISCUSIÓN

Figura 3. Composición porcentual de la estructura trófica del ensamblaje de murciélagos en el área urbana de la ciudad de Montería, Córdoba.

Las especies reportadas para el área urbana de la ciudad de Montería equivalen al 51% de los murciélagos registrados para la zona costanera del departamento de Córdoba (19), y casi el doble número de especies reportadas por Muñoz-Saba (20) en muestreos realizados en las áreas rurales de Betancí y Martinica en el municipio de Montería; quizás con un mayor esfuerzo de muestreo, la riqueza se vea aumentada. En contraste con otras áreas urbanas de Colombia, se registró un número mayor de especies comparado con 6 especies reportadas por Alberico et al (21) para la ciudad de Santiago de Cali; 12 especies fueron registradas por Sampedro et al (22) para el área urbana de Sincelejo, donde Molossus molossus constituyó la especie más abundante (78% de las capturas). En otro estudio, el mismo autor registra el 42.3% de infestación por M. molossus en viviendas en regular y mal estado en el área urbana de Sincelejo (23). El papel ecológico que desempeña M. molossus como controlador de

Ballesteros - Murciélagos del área urbana en la ciudad de Montería

3197

insectos parece tener importancia, al consumir insectos nocturnos, en su mayoría considerados insectos plaga. Desde el punto de vista de salud pública en Colombia y otras partes del mundo, M. molossus ha sido encontrado positivo para el virus de la rabia (24).

diferentes frutos de almendro (Terminalia catappa), especie muy apetecida por los murciélagos, y el níspero (Manilkara sapota), entre otras especies de Sapotaceae y Lauraceae, cuyos frutos también son consumidos por los murciélagos, dispersando sus semillas (31).

Este estudio muestra que el área rural y el área urbana de Montería comparten especies como: M. molossus, A. planirostris, G. longirostris, G. soricina, S. lilium, U. bilobatum. La mayor riqueza de especies en familia Phyllostomidae, es coherente con lo encontrado en otro estudio para el norte de Colombia (25); los murciélagos de este grupo son consideradas especies indicadores de hábitats intervenidos, en especial los géneros Carollia, Sturnira y Uroderma (26,27).

La abundancia dominante de A. planirostris concuerda con la característica generalista de la especie en cuanto a dieta y uso de hábitat (28).

Es indiscutible la importancia de los murciélagos como dispersores de semillas y controladores de plagas (9,12), por lo que es necesario promover el conocimiento de su diversidad y su papel funcional. Entender su ecología evitaría su exterminio, especialmente de aquellas especies de murciélagos que acostumbran a emplear como sitios de refugio el cielo raso de las casas, arboles en patios, hendiduras entre paredes o techos de palma. Algunos investigadores sugieren establecer hogares artificiales ubicados en parques, fuera de las viviendas para evitar este tipo de conflictos; sin embargo, su éxito es discutible porque los murciélagos irán donde ellos estimen conveniente, con el agravante que múltiples proyectos urbanísticos destruyen cada vez más los pocos espacios naturales en la periferia de la ciudad.

E n t r e l o s m u r c i é l a g o s i n s e c t í vo r o s q u e presentaron una dominancia del 38% de las capturas para el área urbana de Montería, se encuentra la familia Molossidae, segundo grupo más abundante, después de Phillostomidae, a pesar de no haber elevado redes a más de tres metros, condición que disminuye la posibilidad de capturar especies de vuelo alto. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en estudios para áreas urbanas (29), donde aprovechan como sitios de forrajeo la presencia de luces artificiales, que atraen los insectos (30).

En este trabajo se identificaron algunos refugios en cielo raso de viviendas y debajo de puentes, lo que permitió capturar cuatro especies de la familia Molossidae, donde M. molossus fue más abundante. La presencia de M. molossus generalmente se le asocia a sitios con intervención antrópica, se le encuentra formando colonias en construcciones y debajo de los techos; esta especie se ha reportado como muy abundante en zonas urbanizadas al norte y suroccidente de Colombia (21,23).

Los murciélagos frugívoros con el 33% de las capturas, es el segundo gremio más abundante en el área de estudio, donde es común observar que murciélagos del género Artibeus utilicen

Se recomienda involucrar a la comunidad general en aspectos relacionados con la conservación de los murciélagos mediante el desarrollo de procesos de educación ambiental, desde la academia local hacia las comunidades. Tal proceso se puede realizar mediante talleres, programas radiales y afiches que den a conocer la importancia ecológica de los murciélagos en los ecosistemas.

En conclusión, el ensamblaje de murciélagos en el área urbana estuvo representado por los gremios insectívoros, frugívoros, nectarívoros, omnívoros y piscívoros. La familia Phyllostomidae presentó la mayor diversidad de especies.

Agradecimientos Al Dr. Jairo Pérez-Torres, profesor de la Universidad Javeriana por su colaboración en la revisión y comentarios al documento. A Katia Reyes y Cristian González por su participación en trabajo de campo y laboratorio.

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ORIGINAL

Respuesta productiva de gallinas semipesadas inducidas al descanso ovárico en diferentes edades The productive performance of brown egg-laying hens induced to molt at different ages Luis Galeano V,1* M.Sc, Mónica Estrada P,2 M.Sc, Luis Restrepo B,2,3 Esp, Juan Sorza Z,3 Ph.D. Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias, 1Grupo Genética, Mejoramiento y Modelación Animal (GaMMA), 2Grupo de investigación en avicultura (GIA), 3Grupo investigación en Ciencias Agrarias (GRICA), Medellín Colombia. *Correspondencia: gavo76@gmail.com.

Recibido: Octubre de 2010; Aceptado: Marzo de 2012.

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto de la inducción al descanso ovárico (DO) a diferentes edades sobre la respuesta productiva en aves semipesadas productoras de huevo comercial. Materiales y método. Se usaron 840 aves de la línea Hy Line Brown con 64 semanas de edad, distribuidas en 10 tratamientos, consistentes en tres edades (65, 70 y 75 semanas) con la aplicación de tres períodos de ayuno (5, 10 y 15 días) y un control (sin DO). El análisis estadístico utilizó un modelo completamente aleatorizado, anidado, efecto fijo y balanceado. Se evaluó consumo de calcio durante el ayuno (g/ave/día), consumo de alimento (g/ave/día), porcentaje de producción, peso del huevo (g), conversión por masa de huevo y huevos por ave alojada (HAA). Resultados. La edad presentó efecto significativo (p<0.05) sobre las variables consumo de alimento, día del primer huevo postmuda, días sin producción, día postmuda de retorno al 50% de producción, peso del huevo, número de huevos, masa huevos, conversión y porcentaje de producción (p<0.01). Al comparar con el control, el tratamiento 75-5 presentó efecto significativo (p<0.05) para las variables: consumo de alimento, número de huevos promedio, masa huevos y conversión. Conclusiones. Las aves con mayor período de ayuno presentaron mayor período improductivo postmuda, grandes pérdidas de peso y alto consumo de alimento, lo que genera alta conversión e ineficiencia productiva. En comparación con reportes de literatura sobre DO en aves livianas, las aves semipesadas llegan al cese de producción en menos días y su período improductivo es menor.

Palabras clave: Ayuno, consumo de alimentos, edad, producción de huevos (Fuente:AGROVOC).

3200

Galeano - Efecto del descanso ovárico en aves semiponedoras

3201

ABSTRACT Objective. The application of the ovarian rest technique on brown egg layer birds was evaluated in this investigation as well as the effect of age and feed duration withdrawal have over their productive behavior. Materials and method. 840 Hy Line Brown hens at 64 weeks of age, evaluating three ages (65, 70 and 75 weeks) and three feed withdrawal periods (5, 10 and 15 days) in a completely randomized, nested, fixed and balanced effects model was used. The calcium consumption during feed withdrawal (g/bird/day), percentage of production, egg weight (g), conversion per egg mass and eggs per housed hen were evaluated. Results. The age factor presented a significant effect (p<0.05) for food consumption, day of the first egg laid post-molting, days without production, day of return to 50% of the production post-molting, egg weight, number of eggs average, egg mass, conversion and (p<0.01) production percentage. After comparing the control treatments, the 75-5 treatment presented a significant effect (p<0.05) for food consumption, average number of eggs, egg mass and conversion. Conclusions. Birds with a greater feed withdrawal period presented a greater unproductive post-molting period, greater weight loss and greater consumption of food which reflects on high conversion and could be defined as productive inefficiency. The comparison between lines showed that cease of production.

Key words: Age, egg production, feed intake, feed restriction (Source:AGROVOC).

INTRODUCCIÓN En la producción avícola, el ave a mayor edad tiende a disminuir su nivel productivo de huevos, tanto en cantidad como en calidad hasta el punto que económicamente no es viable para el productor (1,2). Esta evolución natural de los rendimientos productivos del ave, puede ser alterada por el productor utilizando el descanso ovárico (DO).

El DO es una técnica adaptada del comportamiento natural de las aves, donde entran en período de ayuno y cambio de plumaje durante las estaciones de invierno, los períodos de incubación o migración (3).

La efectividad del DO depende de la capacidad de generar el nivel de estrés óptimo en el ave, que desencadene alteraciones hormonales y que tenga como resultado el cese de la producción de huevos. Autores como Etches (1984), Williams (1985) citados por Kretzschmar et al (1) y Berry (4), insisten en la importancia del aumento de la corticosterona y la disminución de LH (hormona luteinizante), el cese de postura y la pérdida de peso como indicadores de la eficacia del DO (1). Para obtener este efecto en el ave se usan estímulos externos inductores al DO, tales como: la restricción de la alimentación, la manipulación del fotoperiodo, la inclusión de desbalances nutricionales, el suministro de hormonas y de sustancias químicas entre otros (5,6).

Con respecto al cese de la producción, se ha considerado necesario para la regeneración del aparato genital (4,7) y rejuvenecimiento

de la zona reproductiva (8-10), permitiendo la recuperación en el nivel productivo, no tan alto como el ciclo anterior, pero con un peso de huevo promedio mayor y una calidad de cáscara óptima (3,5, 11). En resumen, la técnica del DO se utiliza para ayudar a manejar y sincronizar los ciclos de la producción de un lote de aves (1,2,); debido a que durante la muda suspenden la producción de huevos, pero luego de ser nuevamente estimuladas, retornan a la producción igualando o superando la respuesta productiva antes del estimulo inductor del cese productivo, este segundo ciclo puede durar entre 25 a 35 semanas (11,12).

La aplicación del DO, parte de la evaluación de criterios tales como: la disminución en el nivel de producción, la alteración en la calidad externa e interna del huevo y el aumento de los costos en la crianza de lotes de reemplazo, entre otros (13).

El objetivo de este trabajo fue caracterizar y documentar la respuesta productiva de la aplicación de la técnica del descanso ovárico con restricción alimenticia, con duración de cinco, diez y quince días, en aves semipesadas de 65, 70, 75 semanas de vida.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. La investigación se llevo a cabo en la granja productora de huevo comercial Aves Emaús, localizada en el municipio de El Retiro (Antioquia), noroccidente de Colombia, a 2400 m.s.n.m. y con temperatura promedio de 18ºC.

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Muestra y tratamiento. Fueron seleccionadas 840 gallinas de la linea Hy Line Brown® con 64 semanas de edad con un peso promedio (1930±95 g), acorde a los pesos propuestos en la guía de manejo de la casa comercial para la edad.La evaluación productiva se realizó hasta la semana 100 de vida de las aves. Las aves se distribuyeron aleatoriamente en jaulas, cada una con dimensión de 35 x 45 cm, garantizando 525 cm2 por ave. A cada jaula se le asignó al azar uno de los 10 tratamientos combinando las tres edades (65, 70 y 75 semanas de vida) y tres períodos de ayuno (5, 10 y 15 días).

El tratamiento control no recibió ningún estímulo inductor del cese productivo (DO). Cada unidad experimental correspondió a dos jaulas contiguas (seis aves por réplica) y catorce réplicas por tratamiento. Las aves recibieron en forma continua agua fresca y tratada en bebederos de copa. Durante los períodos de ayuno evaluados, se suministró calcio a voluntad en presentación de grit. El método de realimentación postayuno consistió en la oferta gradual, iniciando 30 g/ave el primer día, 60 g/ave el segundo día, 90 g/ave el tercero y a partir del cuarto día se entregó el alimento a voluntad. La composición de la dieta postmuda proporcionada a las aves se elaboró con base en lo propuesto por Koelkebeck (14).

Recolección de huevos. Se hizo diariamente, y los datos generados se consignaron en un registro de producción para cada réplica. Esta información se procesó y se utilizó para el cálculo del porcentaje de producción de huevos por réplica, el período improductivo de cada uno de los tratamientos, día postayuno de inicio del cese producción, día postayuno de retorno a la producción y el tiempo que tardaron los tratamientos para llegar al 50% de producción.

Para la determinación de la conversión en masa de huevo, se pesaron los huevos de todos los tratamientos un mes después de terminado el ayuno y se repitió por cuatro veces durante el período restante hasta la semana 100 de evaluación.

Grupo de aves. Las aves utilizadas para la evaluación estaban divididas en tres grupos, aves en evaluación, aves para sacrificio y aves denominadas reemplazo. Los tres grupos se distribuyeron en los distintos tratamientos y recibieron el mismo manejo, lo que permitía que si un ave moría en el grupo de evaluación era inmediatamente reemplazada por otra que hubiese recibido el mismo período de ayuno del grupo reemplazo, garantizando seis aves por réplica durante todo el seguimiento. Esta información se utilizó para la creación de un registro por réplica de las aves que morían y eran

reemplazadas para poder calcular la mortalidad de la aplicación del DO. Análisis estadístico. Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado, anidado, de efecto fijo balanceado con catorce réplicas por tratamiento, anotando que el factor ayuno se anidó en el factor edad, por lo tanto no existe interacción entre dichos factores. De ahí que el tratamiento control se comparaba dentro de cada condición de anidamiento, generando el siguiente modelo: Yijk= µ + αi + βj(i) + εk(ij) Donde: Yijk: Variable de respuesta µ: Efecto promedio general αi: Efecto de la i-ésima edad βj(i): Efecto del j-ésimo período de ayuno anidado en la i-ésima edad εk(ij): Error experimental asociado al modelo.

Se empleó la prueba de contraste de Tukey, a fin de comparar el efecto promedio de los tratamientos dentro de cada condición asociada con el diseño anidado. Se efectuó un análisis descriptivo unidimensional para las variables: Consumo de calcio, consumo de alimento, peso del huevo, porcentaje de producción de huevos utilizando el software SAS v 8.2 (15).

Al efectuar el análisis de la variable porcentaje de producción, no se cumplió con el supuesto de normalidad en los términos del error experimental, por lo que se procedió a transformar los datos mediante el empleo de la familia de transformación Box Cox (16), donde se obtuvo por máxima verosimilitud el lambda, que al aplicar a los datos no logró hacer cumplir el supuesto de normalidad. Por tal motivo, se modificó el alpha a un nivel del 1% para efectuar los ajustes y así mitigar el efecto de inflación que presenta el error tipo I.

RESULTADOS El efecto de la aplicación del DO para la variables consumo de calcio no fue significativo (p>0.05) para las edades evaluadas; pero para el consumo de alimento, esta variable presentó efecto significativo (p<0.05) para la edad y tiempo de ayuno dentro de cada nivel de edad. Siendo la edad a las 75 semanas en la que se obtuvo el más alto consumo, en comparación con los demás niveles del factor y los referentes teóricos de la casa genética de la línea Hy lyne Brown® (17); el menor consumo se presentó en el tratamiento control (Tabla 1).

3203

Galeano - Efecto del descanso ovárico en aves semiponedoras Tabla 1. Efecto de la edad de aplicación del DO en el consumo de calcio y alimento.

FE

Consumo (g/ave/día)

Factor Edad (sem)

Calcio

Alimento

65

12.178ª ± 7.198

111.711b ± 6.86

70

12.307ª ± 6.967

115.509b ± 9.05

75

17.667ª ± 10.629

128.913a ± 3.45

Modelo*

NS

***

E Sign

NS

***

A(E) Sign

NS

***

Letras diferentes en una misma columna indica diferencia significativa *** (p<0.05). E= Edad, NS= No significativo y A(E)=Ayuno anidado en la edad

En la tabla 2, se puede observar como el modelo presentó efecto significativo para todas las variables evaluadas (p<0.05) y altamente significativo (p<0.01) para la variable porcentaje de producción, a excepción de la variable mortalidad.

Tabla 2. Efecto de la edad y duración del ayuno en la aplicación del DO sobre la producción y conversión.

Factor Edad (sem)

Peso huevo (g)

Número de huevos promedio

Masa huevo (g)

Conversión

65

70.25a ±4.33

257.56a ±65.89

18056a ±4506

3.32b ± 0.81

70

71.58a ±3.69

198.72b ±67.23

14225b ±4813

4.55ab ± 1.51

75

71.09 ±4.90

191.94 ±80.14

13712 ±5913

5.77 ±2.84

Modelo*

***

***

***

***

E Sign

NS

***

***

***

A(E) Sign

***

***

***

***

a

b

b

Tabla 3. Variables para valoración de la efectividad productiva del DO

a

Letras diferentes en una misma columna indica diferencia significativa. ***Significativo (p<0.05). E=Edad, NS=No significativo y A(E)=Ayuno anidado en la edad

El factor edad presentó efecto significativo (p<0.05) en las variables: primer huevo postmuda, días sin producción, día postmuda de retorno al 50% de producción y altamente significativo (p<0.01) para la variable porcentaje de producción. El factor de período de ayuno anidado dentro del factor edad, presentó efecto significativo (p<0.05) para todas las variables anotando alta significancia(p<0.01) para la variable porcentaje de producción.

Para el día de inicio del cese de producción, no se encontró efecto significativo de la edad, ni diferencia entre edades (p>0.05; Tabla 3). Lo que sugiere que, sin importar la edad a la que se aplique de inducción del DO o la duración del ayuno, el ave cesa de producir en promedio de 5 a 6 días de iniciado el estímulo.

DCP

PHP

DSP

DP%

%M

%P 50.810b ± 4.33

65

5.777a ± 218

10.111b ± 3.78

13.944b ± 6.74

13.055b ± 2.20

24.07a ± 29.82

70

5.944a ± 1.98

12.277a ± 1.74

16.444a ±4.50

14.833b ± 2.57

20.37a ± 28.32

39.195b ± 3.69

75

6.500a ± 1.46

13.000a ± 4.47

16.611a ±7.95

17.333a ± 5.80

24.07a ± 27.54

37.080b ± 4.90

Mod

***

***

***

***

NS

****

E Sign

NS

***

***

***

NS

****

A(E) Sign

***

***

***

***

NS

****

FE: Factor Edad (sem); DCP: Día de inicio cese producción; PHP: Primer huevo postmuda; DSP: Días sin producción; DP%: Día postmuda de retorno al 50% de producción; %M: % Mortalidad; Letras diferentes en una misma columna indica diferencia significativa. **** Altamente significativo (p<0.01), *** Significativo (p<0.05), E= Edad, A(E)= Ayuno anidado en la edad y NS= No significativo

La mortalidad no presentó efecto significativo (p>0.05) para los factores edad y duración del ayuno anidado dentro del factor edad, lo que indica que las aves muertas en la evaluación no fueron consecuencia directa de la edad en que se aplicó el estímulo o la duración del período de ayuno; de hecho las aves murieron durante todo el período de evaluación, incluyendo el tratamiento control que no recibió ningún estímulo para la inducción al DO. La variable porcentaje promedio de producción de huevos (Tabla 3), presentó efecto altamente significativo (p<0.01) para el modelo, la edad de aplicación del DO y el período de ayuno. Para la edad 65 se encontró el mayor porcentaje promedio de producción, pero sin diferencia significativa (p>0.05) con las edades 70 y 75. En las figuras 1, 2 y 3 se presentaron los picos de producción por tratamiento siendo el tratamiento a la edad de 65 semanas y con un tiempo de ayuno de 10 días el que obtuvo el mayor nivel productivo.

Las variables productivas peso del huevo, número de huevos promedio, masa de huevos y conversión presentaron efecto significativo (p<0.05) para las fuentes de variación tenidas en cuenta en el modelo experimental, para el factor edad se encontró efecto significativo (p<0.05) sobre las variables número de huevos, masa de huevos y conversión, pero no significativo para el peso del huevo (p>0.05) (Tabla 2).

Al evaluar las variables productivas porcentaje promedio de producción (Tabla 3) y el número de huevos (Tabla 2), la primera presenta diferencia altamente significativa (p<0.01) entre las edades, mientras que la segunda, presenta

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

diferencia estadística (p<0.05) entre la edad 65 con respecto a las edades 70 y 75. Por este mismo efecto, tanto la masa de huevo como la conversión presentan el mismo comportamiento de las variables porcentaje de producción y número de huevos.

En el caso de la conversión, entendida como el indicador de la eficiencia del proceso, toma mayor importancia al ser valorada económicamente y debe ser tenida en cuenta como referente para la decisión de la aplicación o no del DO. La tabla 2 muestra una mayor ineficiencia a medida que aumenta la edad, esto como consecuencia del mayor consumo de alimento y a la menor producción reportada por las aves, indicando una posible mayor rentabilidad el proceso en edades tempranas.

Comparación pareada entre los tratamientos y el control. Con el fin de contrastar las variables consumo alimento (g/ave/día), peso del huevo (g), número de huevos promedio, masa huevo (g), conversión y huevos por ave alojada (HAA) dentro de cada condición de anidamiento con el control, fue necesario tomar en cuenta que todos presentaron curvas de producción en el tiempo; por tal motivo se decidió comparar un período de 169 días para cada tratamiento con el mismo período de tiempo para tratamiento control.

La variable consumo de alimento para las condiciones 70-15, 75-5, 75-10 y 75-15, presentó diferencia significativa (p<0.05) con el tratamiento control.

El peso del huevo presentó efecto significativo (p<0.05) para el tratamiento 65-10 con respecto al control.

En lo que respecta a la producción promedio de huevos del segundo ciclo, se presentó diferencia significativa (p<0.05) entre el tratamiento 70-15 y el control, y entre el tratamiento 75-5 y el control.

La variable masa de huevo (g) sólo presentó efecto significativo (p<0.05) para el tratamiento 75-5 y el control. De forma similar, la variable conversión mostró efecto significativo (p<0.05) para el tratamiento 75-5 y el control. Ambas variables están condicionadas por el resultado del número de huevos y su peso, con respecto a esto el tratamiento 75-5 fue el de mayor diferencia de HAA con respecto al control (40-45).

DISCUSIÓN Para la valoración de la efectividad productiva del método de inducción al DO se determinaron variables o indicadores, tales como: día de inicio del cese de producción después de iniciado

el ayuno, día del primer huevo postmuda, duración en días del período sin producción, día postmuda de retorno al 50% de producción y porcentaje de mortalidad (Tabla 2); ya que Bell(18) considera que un buen método es aquel que pueda provocar la situación de estrés precisa para interrumpir la producción de huevos de forma rápida y homogénea en el lote, minimizando así, el período improductivo de las aves y lograr alcanzar rápidamente los niveles productivos rentables (más del 50% del lote), con una mortalidad baja y una alta producción en el siguiente ciclo o como mínimo igualando la producción del primer ciclo.

La edad del ave influyó en la ineficiencia productiva, ya que presentó una caída de la producción a medida que la edad del ave aumentó. Con respecto a la edad de aplicación del DO, no importa la edad a la que se aplique el estímulo de inducción del DO, siempre que se someta el ave a un período de ayuno igual o superior a 5 días el ave cesa de producir en promedio de 5 a 6 días de iniciado el estímulo.

Para la variable: consumo de alimento, ésta mostró una tendencia a un mayor consumo de alimento a medida que aumenta la edad del ave; indicando que el efecto de recuperación del ave, como consecuencia del ayuno, parte del aumento en el consumo de alimento y el consecuente aumento de peso y posterior retorno a la producción de huevos.

Al comparar los tratamientos con el control este último presentó un consumo inferior al tratamiento con el que se comparó; reafirmando lo expresado con el análisis, donde las aves que fueron sometidas al DO a mayor edad tienen mayor consumo de alimento y con ello, mayor ineficiencia productiva (mayor conversión). Este comportamiento se puede considerar como una de las adaptaciones del ave en respuesta a la pérdida de peso corporal ocasionada por el ayuno y la posterior recuperación con respecto a las no sometidas al DO (11).

El desempeño productivo de las aves en el segundo ciclo, se comienza a evaluar con los días improductivos a partir de la aplicación del DO, lo cual indica que el período improductivo aumenta a medida que el ave envejece, que bien podría interpretarse como una menor velocidad de recuperación del tracto reproductivo del ave a medida que aumenta la edad, aspecto expresado por Bar (19), quien recomienda no realizar inducciones al DO en aves con una avanzada edad, ojalá con menos de 100 semanas de vida.

En los tratamientos que no presentaron diferencia significativa en lo que respecta a la producción

Galeano - Efecto del descanso ovárico en aves semiponedoras promedio de huevos del segundo ciclo, al igual que Webster,(20) entre aves con distintos niveles de pérdida de peso, e incluso con aquellas que no recibieron el estímulo inductor al DO. Lo que demuestra que períodos largos de ayuno como inductores al DO tienen efecto en la respuesta productiva del ave, pues aunque generan mayor período improductivo, logran igualar el promedio de huevos de las aves con menor período improductivo; no obstante cabe anotar que ésta ventaja productiva no arrojó diferencia en cantidad de huevos promedio con aplicación o no del DO. La producción de huevos presentó una alteración en la curva, esto pudo ser consecuencia del desgaste productivo del ave a medida que envejece. Conclusión que se asume con base en los resultados obtenidos por Galeano (21), donde el porcentaje de LFY (porcentaje de folículos con un diámetro igual o superior a 10 mm), mostró tendencia a la disminución a medida que aumentaba la edad, lo que demuestra que las aves no generaron la respuesta esperada de persistencia productiva en el segundo ciclo propuesta por otros autores.

Pero esta disminución no se presentó en todos los tratamientos, además no fue una caída gradual en los tratamientos que manifestaron la alteración productiva; por tal motivo, queda como interrogante para nuevas investigaciones que permitan determinar si el nivel óptimo productivo para la línea de aves evaluadas sólo puede llegar hasta la semana 95 de vida o si ésta disminución en la respuesta productiva de las aves sólo fue un caso marcado por el carácter biológico de los animales evaluados.

Con respecto a esto, McDaniel (12) sustenta que la aplicación del DO puede aumentar el período de producción de 25 a 35 semanas en el ciclo postmuda, pero como se puede ver en las figuras de producción, en el caso de la semana 75 de aplicación del DO, contó con 12 ó 13 semanas de producción antes de llegar a menos del 10% de producción, en contraste con 16 a 19 semanas para la edad 70, y 25 a 27 semanas para la edad 65. Por esta variación en la duración del período productivo postayuno entre los tratamientos, fue necesario para el análisis de la producción delimitar un lapso similar para los tratamientos de 169 días a partir de la finalización del ayuno.

La variable peso del huevo indicó que el peso del huevo no depende de la edad, ya que en condiciones normales, el tamaño y el peso del huevo tienden a aumentar después del pico de producción, debido al incremento del peso corporal del ave y la disminución en el nivel de producción (5,8,22). Todos los pesos obtenidos

3205

en el experimento fueron mayores a los datos reportados en la guía de manejo de la línea para las mismas edades (17), lo que confirma lo propuesto por Flemming(22) y Webster(20), quienes afirmaron que una de las ventajas de la utilización del DO es el aumento en el tamaño del huevo postmuda (Tabla 2). Otra posible causa por lo que la edad no tuvo efecto en el que al peso del huevo se refiere, pudo ser por el período tan corto de cinco semanas entre las edades evaluadas y el corto período de evaluación de 169 días.

Estadísticamente la comparación de los efectos promedios de los tratamientos y el control no presentaron diferencia significativa (p>0.05) con respecto a la variable número de huevos producidos promedio. Este resultado fue consecuencia de la comparación de los porcentajes de producción entre el control y los tratamientos que presentaban semanas postayuno con producciones bajas, lo provocó la disminución en el valor promedio. También es de anotar, las desviaciones estándar son amplias entre los tratamientos comparados con el control, hasta de 80 huevos. Por lo cual, ésta variable no sirvió como indicador de la efectividad del DO en la producción.

Por consiguiente, la valoración productiva del DO se hizo a partir de la comparación de la HAA entre los tratamientos y el control.

Se encontró cantidades de huevos diferentes entre las edades y el control, también se observó la tendencia a la disminución de la cantidad de huevos a medida que envejece el ave tanto para la edad evaluada como para el control, además, la diferencia a favor de las edades con respecto al control y el aumento de ésta diferencia en relación al aumento de la edad del ave. Esto se explica a partir de los rendimientos decrecientes, donde normalmente el ave tiende a disminuir su productividad al aumentar la edad, pero al ser sometida al DO, la producción llega a cero retornando al segundo ciclo productivo con el pico de producción que supera los niveles productivos de la curva normal del ave que no es inducida al DO (Figuras 1, 2 y 3).

En la comparación de los tratamientos con el control se apreció que no hay una tendencia clara en lo que respecta a la duración del período de ayuno y el número de huevos por ave para cada edad.

Comparación productiva entre aves livianas y semipesadas. Para el análisis, se tuvo en cuenta que los resultados en las investigaciones de aves livianas provienen de la aplicación del DO, a partir

3206

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

Figura 1. Curvas de producción para los tratamientos de la edad 65.

Figura 2. Curvas de producción para los tratamientos de la edad 70.

Figura 3. Curvas de producción para los tratamientos de la edad 75.

Galeano - Efecto del descanso ovárico en aves semiponedoras de la utilización como estímulo inductor el ayuno y la manipulación del fotoperiodo, mientras que los resultados de esta investigación sólo tuvieron en cuenta la utilización del ayuno como estímulo inductor del DO. Aun así, la comparación de los resultados mostró que el cese de la producción se presenta en menos días en aves livianas que en aves semipesadas y el período improductivo o período de recuperación del tracto reproductivo de las aves de líneas livianas es mayor al presentado por las aves en el ensayo. Lo que comparativamente ofrece al ave semipesada un menor período improductivo y una mayor capacidad de recuperación al ayuno.

Con respecto a la mortalidad, para las aves del experimento es mayor (20 a 25%), comparado con el 2% al 6% reportado para aves livianas, pero en las publicaciones no especifican si el dato reportado corresponde a las aves que murieron en todo el período de evaluación o únicamente durante la aplicación del estímulo inductor al DO; tampoco se hace claridad si la muerte del ave se presentó como consecuencia a la técnica de inducción al DO o por otros motivos. En el caso de la evaluación, el dato de mortalidad reportado corresponde a la totalidad del período de seguimiento y no está relacionado, ni con la edad del ave, el período de ayuno o el método de inducción al DO.

3207

Esta comparación, permite mostrar la gran diferencia existente entre la respuesta de aves de líneas livianas y semipesadas al ser sometidas al DO utilizando el ayuno como efecto inductor; lo que requiere ahondar en la diferenciación de las alternativas de inducción al DO y su aplicación en las distintas líneas de aves, y en especial, en el metabolismo lipídico del ave semipesada, como fuente energética y precursor hormonal (23), como posible gran diferenciador de su comportamiento en comparación con las aves de líneas livianas.

Queda como objetivos de próximos trabajos la identificación el efecto del DO sobre las reservas lipídicas del ave semipesada y el papel metabólico que cumplen en el ave en períodos de ayuno, así también, valorar cual es la edad productiva a la cual puede llegar un ave. Otro aspecto a tener en cuenta para futuras investigaciones, es el desarrollo de una estructura de costos para el análisis microeconómico y la valoración del efecto de la edad y la duración del período de ayuno en la respuesta productiva del DO. En conclusión, con base en el análisis de graficas de producción, una inducción tardía del DO, permitiría tener un margen superior de huevos al compararlos con una curva normal de producción, que normalmente estaría en proceso de finalización. Esta diferencia entre ambas curvas de producción debería ser significativa para hacer de la inducción al DO una alternativa viable.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3209-3216, 2012.

ORIGINAL

Implantación de hidroxiapatita-lignina en canal medular de conejos: evaluación macroscópica y difractográfica Implantation of hydroxyapatite-lignin in the medullary canal of rabbits: macroscopic and difractografic evaluation Mastoby Martínez M,1* M.Sc, Andrea Pacheco B,2 Ph.D, Mauricio Fontes F,2 Ph.D. Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Ciencias Pecuarias, Montería, Colombia. 2Universidad Federal de Viçosa, Departamentos de Veterinaria y Suelo, Viçosa-MG, Brasil. *Correspondencia: mastobymvz@hotmail.com 1

Recibido: Mayo de 2011; Aceptado: Marzo de 2012.

RESUMEN Objetivo. Evaluar macroscópica y difractograficamente la respuesta ósea al compuesto hidroxiapatita– lignina implantado en canal medular tibial de conejos. Materiales y métodos. Se utilizaron 20 conejos de raza Nueva Zelanda, en cada uno, la tibia izquierda fue tratada con compuesto y la tibia derecha no fue, sirviendo como control. Se realizó una falla ósea de 4 mm de diámetro en la superficie lateral proximal tibial, hasta alcanzar el canal medular. Del compuesto, 1000 mg fueron ablandados con 10 gotas de solución salina utilizando parte de la masa para revestir la rosca del clavo intramedular de Schanz en acero F 138, de diámetro 2.5 mm para hueso cortical y la otra parte introducida en el canal medular con el auxilio de catéter calibre 16 y jeringa. El clavo revestido se introdujo al canal medular por la falla ósea. Los planos anatómicos fueron suturados. Lo mismo fue realizado en el control, sin utilización del compuesto. La evaluación macroscópica y difractográfica del contenido medular y del material que creció en las rocas de los clavos se hizo a los ocho, 30, 60, 90 y 120 días pos-cirugía. Resultados. Con cada fecha de evaluación la tendencia de la medula ósea en los tratados fue a regenerarse y la del compuesto a perder visibilidad, lo que se demostró con la difracción de rayos X, encontrándose tejido con cristalinidad compatible con el componente mineral del hueso. Conclusiones. El compuesto puede guiar la formación de hueso hasta el clavo intramedular sin afectar la regeneración de médula ósea.

Palabras clave: Clavos, evaluación, hidroxiapatita, médula ósea (Fuente:CAB).

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ABSTRACT Objective. Macroscopically and diffractografically evaluate bone response to hydroxyapatite - lignin compound implanted in rabbit tibial medullary canal. Materials and methods. 20 New Zealand rabbits were used. Each of their left tibias was treated with the compound; the right tibias were not treated, serving as control. Bone fracture of approximately 4 mm in diameter in the lateral proximal tibia was performed, reaching the medullary canal. From the compound, 1000 mg were dissolved in 10 drops of saline solution using part of the mass to cover the twisted end of the intra-medullary pin, (Schanz steel F 138, size 2.5 mm for cortical bone) and the rest was introduced in the medullary canal of the group treated with the help of a catheter size 16 and disposable syringe. After introduction of 7 cm in length of the pin in the medullary canal, the anatomical blueprint was closed. The same was done in the control tibias, without use of the compound. Macroscopic and difractographic evauation of the medullary content which grew at the base of the pins was assessed at eight, 30, 60, 90 and 120 days post-surgery. Results. Each macroscopic evaluation date showed that the tendency of bone marrow in the treated rabbits was to regenerate and lose compound visibility, which was shown through X-ray diffraction, where crystalline tissue was found to be compatible with the mineral component of the bone. Conclusion. The compound can lead bone formation of intra-medullary nail without affecting the regeneration of bone marrow.

Key Words: Bone marrow, evaluation, hydroxyapatite, pins (Source:CAB).

INTRODUCCIÓN Los substitutos óseos deben ser inertes, degradables o absorbidos, además de favorecer el crecimiento óseo por conducción y si es posible por inducción. Estas características dependen de las propiedades físicas y químicas del biomaterial, que debe ser compatible con las reacciones fisiológicas del hueso (1-3). En la actualidad, uno de los biomateriales más investigados es la hidroxiapatita que puede ser obtenida de diferentes formas: a partir de corales marinos, del propio hueso o sintetizada en laboratorio (4-6).

La hidroxiapatita ha sido utilizada en la corrección de defectos óseos en el hombre y en varias especies animales, con resultados satisfactorios lo suficiente para ser indicada como alternativa para la injerta ósea en la rutina clínica (7-9).

La estructura porosa de la hidroxiapatita funciona como soporte pasivo para la neoformación vascular que llevan factores inductores de la aposición ósea (1). La superficie porosa de la hidroxiapatita parece proveer un substrato adicional a la proliferación del tejido óseo.

Además; permite la unión, proliferación, migración y expresión fenotípica de células óseas, resultando en formación de nuevo hueso (8, 10-12).

La lignina es un componente de la pared celular de las plantas leñosas que les provee rigidez y actúa como agente permanente de unión entre las células. Es un polímero complejo de elevado peso molecular constituido por unidades de fenilpropano (13-15). Un compuesto de hidroxiapatita asociado a la lignina, podría unir

la excelente bio-actividad de la primera que no posee cohesión y resistencia suficiente, con las propiedades mecánicas y de adhesión celular de la última (13).

Con el desarrollo de la difracción de rayos X, se confirmó en 1926 que la fase inorgánica del hueso era una apatita (10,16,18). La difracción de rayos X es la principal técnica analítica utilizada para identificar fases mineralógicas y para estudiar estructuras cristalinas. La técnica hace uso de la periodicidad con que los átomos se distribuyen al formar la estructura cristalina de los minerales y las distancias entre los planos atómicos. Las difracciones son fácilmente obtenidas con el uso de los actuales difractómetros de rayos X. La hidroxiapatita es un fosfato de calcio que se cristaliza en el sistema hexagonal con parámetros de red a=b=9.417Å ec=6.875Å, lo que genera picos característicos en los diversos planos atómicos dentro de su estructura, conforme muestra la figura 2 (fuente: Laboratorio de mineralogía – Departamento de Suelos – UFV-Brasil).

Teniendo en cuenta la propiedad óseo-conductora de la hidroxiapatita y frente a los efectos adversos que tiene la resina acrílica sobre el tejido óseo a la hora de la fijación de prótesis articulares en la ortopedia veterinaria y humana, un grupo de investigadores de la UFV-Brasil en trabajo conjunto con investigadores del sector privado, se dispusieron en la tarea de conseguir un biomaterial que pudiera guiar el proceso de regeneración ósea hasta el canal medular y que favoreciera la unión biológica del clavo intramedular en este local.

Martínez - Implantación de hidroxiapatita-lignina en canal medular de conejos Por tal razón, el objetivo del presente trabajo fue evaluar a la hidroxiapatita asociada a lignina (HAP-91 - L) en el proceso de bioconducción ósea hasta un implante metálico en canal medular tibial de conejos adultos de la raza Nueva Zelanda. El estudio se basó en la observación de los canales medulares y del material que se adhirió a las roscas de los clavos implantados como también, en la caracterización de la cristalinidad del tejido que se formó en ambos locales utilizando la técnica de difracción de rayos X.

MATERIALES Y MÉTODOS Animales. Fueron utilizados 20 conejos machos de la raza Nueva Zelanda Albina, esqueléticamente maduros a la confirmación radiográfica, con edad entre 10 y 12 meses y pesando entre 4-5 kg, oriundos del bioterio del Departamento de Veterinaria de la UFV. Tuvieron 2 meses para aclimatación al nuevo ambiente, en jaulas individuales donde recibieron una dosis única de ivermectina 0.2 mL a 1% por la vía subcutánea, alimento 2 veces al día y agua a voluntad.

Compuesto. La hidroxiapatita sintética HAP 91® (JHS, Belo Horizonte-Br.) fue producida por precipitación, después de adicionar gota a gota H3PO4 sobre el Ca(OH)2 obtenido a partir de la calcinación de la calcita y su posterior hidratación por agitación constante. El precipitado fue calcinado a 900°C. El Ca de la HAP-91 fue determinado por volumetría y espectroscopia de UV-V (1). Después de este proceso, de acuerdo con el fabricante fue adicionado a la HAP-91, 1% de lignina derivada del eucalipto para formar el compuesto de HAP-91 – L. Con este material se obtuvieron bloques circulares de 4.5 mm de diámetro con peso de 200 mg con proporción de 99% de HAP-91 y 1% de lignina, que después fueron esterilizados en oxido de etileno a 10% y embalados en material plástico.

Procedimiento quirúrgico. En el preoperatorio los conejos recibieron 40.000 UI/kg de penicilina sódica y procainica por vía intramuscular, 30 minutos antes de la inducción anestésica.

Después fueron sedados con levomepromazina en dosis de 2 mg/kg y anestesiados con tiletamina/zolazepam en dosis de 20 mg/kg, ambos por vía intramuscular. El tercio proximal del fémur hasta el tercio distal de la tibia fueron depilados y la grasa cutánea removida con éter.

La anestesia disociativa se complementó con la técnica epidural lumbo-sacra utilizándose lidocaína a 2% en asocio con epinefrina a dosis de 1 mL/4kg. En seguida los animales fueron

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posicionados en decúbito lateral izquierdo. Se realizó la antisepsia del campo operatorio, se aisló la parte distal del miembro con venda estéril y la zona quirúrgica se aisló con paños de campo estériles. El abordaje quirúrgico fue basado en la técnica descrita por Piermattei et al (17) para perros y gatos y adaptada para conejos de la siguiente forma: se realizó una incisión cutánea parapatelar lateral desde el tercio distal del fémur hasta la diáfisis proximal de la tibia.

Seguidamente y en el mismo sentido se cortó con bisturí el tejido subcutáneo y la fascia lata, quedando visibles y siendo separadas de la tibia la musculatura cráneo-lateral. Inmediatamente se desbridó el periostio de la zona para realizar un defecto circular en la parte central de la faceta lateral proximal de la tibia, a 2 cm de la meseta, de aproximadamente 4 mm de diámetro y profundad suficiente para alcanzar el canal medular con el auxilio de un taladro manual y broca de igual diámetro.

En un mismo animal se consideró la tibia izquierda como tratada y la tibia derecha como control.

En el grupo tratado se introdujo por el defecto cortical un clavo intramedular de Schanz en acero de calibre 1 mm con el que se practicaron movimientos de fricción repetitivos con el propósito de irritar el endostio, desprender la médula ósea y facilitar su salida, para lo que se inyectaron unos 10 cm de aire dentro del canal medular con el auxilio de jeringa desechable y catéter venular calibre 16, retirando la mayor cantidad posible.

En un recipiente, cinco comprimidos del compuesto de HAP-91 – L (1000 mg) fueron ablandados con solución fisiológica 0.9% en una relación de dos gotas por comprimido, resultando una masa que se utilizó para revestir la rosca del clavo intramedular de Schanz en acero de diámetro 2.5 mm, donde la cantidad se determinó como aquella que se necesitó para que la rosca no fuera visible, dejándola secar por 10 min al ambiente. Al resto de la masa se le adicionó solución salina 0.9% en volumen suficiente para completar los 2 mL, para ser introducida en el canal medular por medio de jeringa desechable y catéter calibre 16. La longitud del clavo fue medida por medio de radiografía previa de la tibia, desde el local determinado para el defecto hasta la epífisis distal tibial, determinándose un largo de 7 cm para todos los animales. Después de cortado el clavo se introducido por el defecto cortical y su calibre fue suficiente para ocupar aproximadamente 90% de la cavidad medular.

Los tejidos separados e incisionados se suturaron con naylon.

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El grupo control pasó por los mismos procedimientos que el tratado con la excepción de que no se utilizó HAP-91 – L. De esta forma el espacio entre el clavo y el endostio fue ocupado por el coágulo que se formó normalmente.

En el pos-operatorio los animales recibieron morfina 3 mg/kg/12h/2días/sc y 40.000 UI/kg/24h/2días/im de penicilina sódica y procainica como analgésico y antibiótico-terapia respectivamente y las heridas cutáneas se curaron con solución salina a 0.9% diariamente por 10 días.

Estudio macroscópico y difractográfico. Para los estudios macroscópicos y difractográficos de los canales medulares a los ocho, 30, 60, 90 y 120 dias posteriores a las cirugías fue necesaria la eutanasia de cuatro conejos por fecha de evaluación con sobredosis de tiopental sódico por vía intravenosa, previa tranquilización con levopromacina por vía intramuscular.

Para la evaluación macroscópica del canal medular fue necesario un corte longitudinal de todas las tibias con cierra manual, donde un observador determinó el color y distribución de la medula ósea, además; en el grupo tratado se observó la distribución del compuesto, siendo los resultados presentados descriptivamente.

Las características observadas en el material adherido a la rosca del clavo de todas las tibias de ambos grupos, fueron el color (metálico, rojo, blanquecino y oscuro) y la visibilidad del fondo de las roscas y su superficie; siendo los resultados presentados descriptivamente.

La medición del material adherido a la rosca del clavo intramedular fue realizada con el auxilio de un pie de Rey digital y los resultados fueron interpretados comparando cada fecha de observación entre los grupos tratado y control, con análisis estadístico realizado por la prueba de Friedman, significancia fijada en p<0.05. La comparación de las evaluaciones dentro de cada grupo fue analizada por la prueba de Dunn´s, también con significancia estadística fijada en p<0.05. El comportamiento de las medias para ambos grupos se representó por medio de una línea de tendencias.

Con el objetivo de determinar la naturaleza (orgánica e inorgánica) del tejido presente en la superficie rosqueada de los clavos intramedulares y en los canales medulares de las tibias de los conejos a los ocho, 30, 60, 90 y 120 días, se utilizó la prueba de difracción de rayos X (DRX). Para tal, fue necesario el secado de las tibias en estufa eléctrica a 70°C por 72

horas, para posterior retirada por raspado del material contenido en el canal medular y en la superficie rosqueada del clavo. Este material fue molido para ser reducido a partículas menores y colocado en lámina de vidrio escavada. Con el propósito de evitar pérdidas de material, se adicionó pegante comercial que permaneció por 12 horas a temperatura ambiente para su secado.

Después de este periodo, fue realizada la prueba de DRX en un difractómetro de marca Rigaku D-Max modelo Geiger Flex equipado con tubo de cobalto (radiación Co-Kα, λ = 1.79026 Å), con un monocromador de cristal curvo de grafito en el eje difractado, operado con una diferencia de potencia de 40 kV y una corriente eléctrica de 30 mA. Los barridos fueron realizados en el modo paso a paso en intervalos de 15 a 50º 2q con 0.05º y 2 seg de conteo de tiempo en cada paso. Este procedimiento fue realizado en la muestras de los grupos control y tratado. Los resultados obtenidos de los difractogramas fueron presentados por medio de gráficos y análisis descriptivo.

RESULTADOS Al corte longitudinal de las tibias del grupo tratado a los ocho y 30 días posteriores a las cirugías, se observó en la evaluación macroscópica del canal medular una distribución desigual del compuesto, con mayor localización en la mitad proximal, que se corresponde con la diáfisis proximal de la tibia, siendo el espacio restante ocupado por médula ósea (Figura 1). El compuesto dio al canal medular una coloración blanca hidroxiapatita por estar en mayor proporción que la medula ósea.

A los 60, 90 y 120 días posteriores a las cirugías se observó en las tibias tratadas una distribución mayor de médula ósea y menor presencia del compuesto, dando al canal una coloración rojisa propia de médula.

Es importante destacar que en uno de los canales medulares a los 120 días de evaluación, no fue visible el compuesto (Figura 1E). Esta observación permite presumir que con el pasar del tiempo, el compuesto puede ser absorbido en el local de implantación y la medula ósea tiende a regenerarse y retomar su normal distribución dentro del canal medular.

La presencia del compuesto en mayor cantidad en la mitad proximal del canal medular, posiblemente se debió a diferentes razones: a la técnica de introducción de aire a través de la jeringa que no permitió retirar la suficiente medula ósea de la mitad distal del canal medular, dejando poco espacio para el compuesto; a la presión

Martínez - Implantación de hidroxiapatita-lignina en canal medular de conejos

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Figura 1. Fotografías del canal medular de las tibias de conejos del grupo tratado con hidroxiapatita-lignina ilustrando la distribución y coloración dentro del canal medular – A- a los ocho días, B- a los 30 días, C- a los 60 días, D- a los 90 días y E- a los 120 días posteriores a las cirugías. Flecha roja: indica la presencia de hidroxiapatitalignina en el canal medular. Flecha azul: indica la médula ósea. Flecha amarilla: indica presencia de tejido blanquecino semejante al tejido óseo revistiendo la rosca del clavo intramedular.

interna del canal que actúo como fuerza negativa repeliendo al compuesto durante su introducción, hecho favorecido por el ablandamiento previo del compuesto con solución salina 0.9%; a la desituación física del compuesto como consecuencia de la introducción del clavo intramedular que provocó su salida parcial; a la hemorragia intra-operatoria del canal que produjo desituación del compuesto blando o a la combinación de razones anteriores que imposibilitaron la distribución homogénea y en cantidad suficiente en toda la extensión del canal medular.

En las tibias del grupo control se observó normalidad en la distribución y coloración de la médula ósea en todos los días del estudio, demostrando una recuperación rápida de la misma.

En la evaluación macroscópica de las roscas de los clavos intramedulares de las tibias tratadas y control, a los ocho días de la evaluación, no hubo adherencia de tejido sobre su superficie, permitiendo la visibilidad de las mismas, teniendo el clavo su color característico. Se observó solo diferencia en el fondo de las roscas, donde el grupo tratado tuvo presencia del compuesto.

Como la media de la circunferencia de los clavos intramedulares tratados fue igual a la de los no tratados, se sugiere que no hubo adherencia de ningún tipo de tejido en ellas (Tabla 1).

A los 30, 60, 90 y 120 días de evaluación posteriores a las cirugías en 75% de las roscas de los clavos del grupo tratado y control se observó

Tabla 1. Medias de la circunferencia del punto correspondiente a la rosca de los clavos intramedulares (mm) después de su extracción del canal medular de tibias de conejos en los días de la evaluación, donde; G.T. representa al grupo tratado con hidroxiapatita sintética–lignina y G.C. representa al grupo control.

Grupos

Días después de las cirugías 0

8

30

60

90

120

G.T.

1.18

1.18

1.39

1.35

1.40

1.59

G.C.

1.18

1.18

1.24

1.50

1.51

1.48

presencia de tejido con características de tejido medular de coloración rojisa amarillenta, que impedía ver el fondo de la misma y parcialmente su superficie, sugiriendo una posible adherencia de tejido. Solamente en dos roscas del grupo tratado a los 90 días y dos a los 120 días (25%,) se observaron presencia de tejido duro de coloración blanquecina y dureza al tacto compatible con hueso.

Al comparar estadísticamente las mediciones de las circunferencias de las roscas de los clavos intramedulares después de retirados del canal medular, se encontró que en los días del estudio entre los dos grupos, no hubo diferencia de acuerdo con la prueba de Friedman. El análisis estadístico entre días de un mismo grupo tanto para o grupo tratado como para el control, tampoco mostró diferencias de acuerdo con la prueba de Dunn´s.

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Al análisis difractográfico del compuesto de hidroxiapatita-lignina se observó que la cristalinidad de la apatita produce picos delgados con una línea de base casi recta (Figura 2).

Figura 2. Difractograma del compuesto de hidroxiapatita - lignina. *Picos de hidroxiapatita. (Fuente: Laboratorio de Mineralogía - Departamento de Suelos – UFV - Brasil).

En la Figura 3 se observa el grupo control en los diferentes días de la evaluación, en los que se puede notar la ausencia de material cristalino y sí apenas una hombrera típica de materiales orgánicos de baja cristalinidad.

Figura 3. Difractogramas del material obtenido del canal medular y de las roscas de los clavos intramedulares tibiales de los conejos del grupo control en los días después de las cirugías. *hombrera.

La Figura 4 muestra que a los ocho y 30 días de la evaluación pos quirúrgica, la hidroxiapatita sintética – lignina mantiene su integridad cristalina por la presencia de todos sus picos característicos. A los 60 días después de su implantación, existe una pérdida gradual de algunos picos y el desaparecimiento de otros. A los 90 y 120 días se observa pérdida total de su cristalinidad.

Figura 4. De abajo-arriba: difractograma del compuesto de hidroxiapatita - lignina, difractograma del material obtenido del canal medular de las tibias y de las roscas de los clavos intramedulares de los conejos del grupo tratado con HAP-91®- L en los días después de las cirugías y difractograma de la cortical tibial de conejo. *picos de hidroxiapatita, **picos de hueso tibial, ***hombrera.

Martínez - Implantación de hidroxiapatita-lignina en canal medular de conejos

DISCUSIÓN La no presencia del compuesto de hidroxiapatita – lignina en algunos canales medulares tratados a los 120 días puede ser indicativo que este se absorbe semejante a lo reportado por Borges et al. (2) en análisis cuantitativos en perros donde observaron que la hidroxiapatita se degrada, a pesar de ser considerada clínicamente no degradable (2). Según Overgaard et al. (21), en un estudio experimental en humanos demostró que los revestimientos con hidroxiapatita son absorbidos a un ritmo de aproximadamente 20% anual, especialmente en locales en que el revestimiento está en contacto directo con médula ósea más no cuando se implanta en hueso trabecular.

A los 30, 60, 90 y 120 días de evaluación posteriores a las cirugías en 75% de las roscas de los clavos del grupo tratado y control se observó presencia de tejido con características de médula ósea de coloración rojisa amarillenta, que impedía ver el fondo de las mismas y parcialmente su superficie, sugiriendo una posible adherencia de tejido medular. Solamente en dos roscas del grupo tratado a los 90 días y dos a los 120 días (25%,) se observaron presencia de tejido semejante al hueso por su color blanquecino y dureza al tacto. Este hecho sugiere una posible óseo-conducción del compuesto de hidroxiapatita-lignina hasta la rosca del clavo intramedular, semejante a la conseguida por Vidigal y Goisman (22) que utilizando implantes de titanio puro e implantes de titanio revestidos con hidroxiapatita por la técnica de aspersión térmica a plasma, observaron que hubo mayor formación de tejido óseo en torno de los implantes revestidos con la hidroxiapatita.

3215

En cuanto a la pérdida de la cristalinidad del material analizado por difracción de rayos X en los últimos días de evaluación (90 y 120 días) (figura 4) y el hecho que los picos registrados semejen a los registros difractográficos de hueso compacto, permiten presumir que el compuesto posiblemente fue absorbido y que posiblemente posibilitó el crecimiento de hueso hasta la superficie rosqueada de los clavos, estando de acuerdo con Borges et al. (2) quien dice que la hidroxiapatita funciona como soporte pasivo para la formación de tejido óseo. La superficie porosa de la hidroxiapatita parece proporcionar una matriz para el desarrollo del tejido óseo, permitiendo la migración y proliferación de células óseo-progenitoras (8, 13, 18, 19).

El compuesto del estudio presenta picos muy semejantes a los obtenidos con la hidroxiapatita sintetizada a 950ºC por Londoño et al. (10), que formó cristales pequeños que la hacen absorbible cuando es implantada en tejido óseo, reforzando la posibilidad de absorción ósea de la HAP-91-L. La evaluación macroscópica y difractográfica del compuesto de hidroxiapatita-lignina permitió concluir que el compuesto no interrumpe la regeneración de médula ósea y además; posibilita el crecimiento de hueso hasta el implante metálico.

Agradecimientos Los autores agradecen al laboratorio JHS por proporcionar el compuesto experimentado, a la Universidad de Córdoba – Colombia y a la Universidad Federal de Viçosa – Brasil. Esta investigación de tipo descriptiva fue aprobada por la comisión de Ética del Departamento de Veterinaria de la UFV (proceso Nº 58/2007).

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3217-3223, 2012.

ORIGINAL

Ecología trófica del Liso (Rhamdia quelen Quoy & Gaimard, 1824) en el río Sinú, Colombia Trophic ecology of Liso (Rhamdia quelen Quoy & Gaimard, 1824) in the Sinu river, Colombia Charles W. Olaya-Nieto,1* M.Sc, Liliana Pacheco-Orozco,1 Prof en Acuicultura, Julieth Ochoa-Arteaga,1 Prof en Acuicultura.

Universidad de Córdoba, Departamento de Ciencias Acuícolas, Laboratorio de Investigación Biológico Pesquera-LIBP. Lorica, Colombia. *Correspondencia: charles_olaya@hotmail.com 1

Recibido: Diciembre de 2011; Aceptado: Agosto de 2012.

RESUMEN Objetivo. Estudiar la ecología trófica del Liso en el río Sinú como contribución al conocimiento de su biología y ecología, a su preservación en el medio natural y al ordenamiento de su pesquería en la cuenca. Materiales y métodos. El contenido estomacal se evaluó con el Coeficiente de vacuidad, Grado de digestión, Frecuencia de ocurrencia, Frecuencia numérica, Gravimetría, Índice de importancia relativa (IIR) y la relación longitud intestinal (LI)-longitud total (LT). Resultados. El 38.2% de los estómagos estaban vacíos y el 92.5% de las presas estaban medio digeridas, identificándose 5 grupos alimentarios: Peces, Crustáceos, Insectos, Material vegetal y Otros. Peces, conformado por Cachana, Cocobolo, Mayupa, Sardina y Restos de peces, fue la presa más frecuente (69.9%), abundante (45.5%) y con mayor composición por peso (76.8%). El Índice de importancia relativa (IIR) indica que Peces fue el alimento principal (IIR =53.7%), y que las demás presas eran de baja importancia relativa, circunstanciales o incidentales. Conclusiones. Los resultados alcanzados en este estudio indican que el Liso es un pez con hábitos alimentarios nocturnos y carnívoros, con tendencia a consumir Peces.

Palabras clave: Rhamdia quelen, Alimentación, Colombia (Fuente:AIMS).

ABSTRACT Objective. To study the trophic ecology of Liso in the Sinu river as a contribution to the knowledge of its biology and ecology, preservation in wild environment and the management of fishery in the basin. Materials and methods. The stomach content was analyzed by using the Proportion of empty stomachs, digestion rate, Frequency of occurrence, numerical Frequency, Gravimetry, relative importance Index (RII) and gut length (GL)-total length (TL) relationship. Results. 38.2% of stomachs were empty, 92.5% of preys were half digested and five food items were identified, they are conformed

by Fish, Crustaceans, Insects, Vegetable Rests and Others. Fish, conformed by Cachama, Cocobolo, Mayupa, Sardine and Rest of other fish, was the most common prey (69.9%), the most abundant prey (45.5%) and the greatest prey composition in weight (76.8%). Relative importance Index indicated that fish was the main prey (RII =81.6%), and the other prey reached low relative importance, or circumstantial or incidental prey. Conclusions. The results reached in this study indicate that the Liso is a fish with nocturnal and carnivorous feeding habits, with a tendency to consume other fish.

Key words: Rhamdia quelen, Feeding, Colombia (Source:AIMS).

3217

3218

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

INTRODUCCIÓN El Liso (Rhamdia quelen Quoy & Gaimard, 1824) es una especie común en las corrientes pequeñas en el río Sinú, de carne muy fina y generalmente apetecida, pero su relativamente baja abundancia ha impedido que tenga una mayor importancia comercial (1). Sin embargo, se le ha reconocido algún valor dentro de la pesca doméstica o de subsistencia (2); además de que puede ser utilizada en la piscicultura de ornamentación.

Pertenece a la familia Heptapteridae (3), alcanza 35.0 cm de longitud estándar (1), presenta una cabeza aplanada dorso-ventralmente, vientre de color claro, sin banda lateral diferenciada, aleta caudal bifurcada y lóbulos terminados en punta.

Los barbicelos maxilares alcanzan o sobrepasan la aleta caudal y el quinto radio del lóbulo superior de la aleta caudal es el más largo (4).

Se distribuye en las cuencas del Atrato, Cauca, Magdalena, San Jorge, Sinú y Catatumbo, Orinoco y Amazonas (1,2,4-7), con marcada preferencia por los ambientes de corrientes rápidas y someras de piedemonte, o de baja corriente de pequeñas y medianas quebradas o grandes ríos (8).

La mayoría de las especies del género Rhamdia son de ciclo reproductivo corto, con la primera maduración gonadal al final del primer año de vida, coincidiendo con la estación lluviosa (9). El Liso es un pez con tipo de desarrollo ovocitario asincrónico en más de dos grupos, con desoves parciales durante todo el año, con talla media de madurez sexual de 24.0 cm de longitud total, ovocitos maduros con 963 µ y fecundidad promedio estimada en 26.305 ovocitos (10).

El objetivo de este trabajo fue estudiar la ecología trófica del Liso en el Bajo río Sinú, como contribución al conocimiento de su biología y ecología, a su preservación en el medio natural, al ordenamiento de su pesquería y a su aprovechamiento pesquero y acuícola en la cuenca.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización y descripción del área de estudio. El estudio se desarrolló en el Bajo río Sinú, entre enero y diciembre 2005. El río Sinú tiene una longitud de 380 Km, extendiéndose desde el nudo de Paramillo en el departamento de Antioquia hasta el delta de Tinajones en el mar Caribe, en el departamento de Córdoba, cuya cuenca tiene una superficie de 13700 km². En su parte media y baja se encuentran la ciénaga

Grande de Betancí, la ciénaga Grande de Lorica, las ciénagas de la margen izquierda y otras de menor tamaño. Presenta una temperatura promedio anual de 28ºC, que en épocas de lluvias cuando las aguas inundan los planos cenagosos, disminuye a 27ºC (11). La pluviosidad media anual en las zonas en las zonas bajas es de 1200 mm/año, con un régimen bimodal de precipitaciones, períodos lluviosos en abril-junio y agosto-octubre. El principal período seco se prolonga desde noviembre a marzo, con uno de menor proporción en julio-agosto (12).

O b t e n c i ó n d e l a s m u e s t r a s . Pa ra l a identificación taxonómica de la especie se siguió la clasificación de Bockmann & Guazzelli (3), colectándose 338 individuos entre enero y diciembre 2005, a quienes se les tomó longitud total (LT), longitud horquilla (LH) y longitud estándar (LS) al milímetro más cercano con un ictiómetro graduado en mm (Tridente, España), y el peso total (WT) al gramo más cercano con una balanza eléctrica (Ohaus, USA) con capacidad de 1500 g (± 1 g).

Extracción de los estómagos. Aplicando las técnicas de Laevastu (13), una vez efectuada la disección de los peces, se ubicaron las diferentes partes del tubo digestivo. Luego se procedió a retirar el estómago y el intestino para conservarlos en frascos plásticos de 250 ml que contenían formol al 10% bufferado. Todos los frascos fueron rotulados, indicando la especie, número de la muestra y fecha. En un formato se anotó la información citada arriba más el sitio de captura, arte de pesca utilizado, talla, peso total y peso eviscerado.

Análisis del contenido estomacal. El contenido estomacal se colocó en una caja Petri y se examinó al estereoscopio (Leica, USA) y microscopio (Leica, USA), separando, identificando y enumerando el alimento o presas presentes. La identificación se efectuó hasta el nivel taxonómico permitido por el grado de digestión del alimento, ordenándose en grupos, ítems o presas, pesándose en una balanza eléctrica (Ohaus, USA) de 1500 (±0.01 g) de capacidad. El material animal que estaba totalmente digerido se identificó por los fragmentos, en lo posible (14).

El Coeficiente de vacuidad (CV) se obtuvo con la técnica de Windell (15): CV = 100* No. estómagos vacíos / No. total de estómagos analizados El Grado de digestión (GD) se evaluó con la escala de Laevastu (13), la cual clasifica el estado de las presas así: Fresco, Medio digerido y Digerido.

Olaya-Nieto - Ecología trófica del Liso (Rhamdia quelen Quoy & Gaimard, 1824)

FO =100* Ocurrencia de presas del ítem A/ Número total de estómagos con alimento

180

Número de peces

Se utilizaron tres métodos para cuantificar el contenido estomacal, expresado en valores promedios mensuales y anuales: Frecuencia de ocurrencia (FO), Frecuencia numérica (FN) y Gravimetría (G) (15):

3219

135 90 45 0

FN =100* Número de presas del ítem A/Número total de presas

15

20

25

30

35

Longitud total (cm)

G =100* Peso de las presas del ítem A/Peso de todas las presas

Figura 1. Distribución de frecuencia de tallas del Liso en el río Sinú. Año 2005.

Para establecer la importancia de cada presa en la composición de la dieta se estimó el Índice de importancia relativa (IIR) (16) modificado (17): IIR = F*G/1OO, en donde, IIR representa el Índice de importancia relativa, F es el porcentaje de la Frecuencia de ocurrencia y G es el porcentaje de la Gravimetría. Esta expresión presenta un rango de 0 a 100, en donde el rango de 0 a 10% representa grupos tróficos de importancia relativa baja, de 10 a 40% grupos de importancia relativa secundaria y 40 a 100% grupos de importancia relativa alta.

Fueron identificados cinco grupos alimentarios: Peces, Crustáceos, Material vegetal, Insectos y Otros, siendo Peces el más frecuente (69.9%) (Figura 2) con individuos pertenecientes a cuatro géneros: Cachana (Cynopotamus atratoensis), Cocobolo (Andinoacara pulcher), Mayupa (Sternopygus macrurus), Sardina (Astyanax sp) y Restos de peces; seguido por Material vegetal (36.4%), conformado por Semillas y Restos vegetales; Crustáceos (18.2%), constituido por Camarón y Cangrejo; Insectos (16.7%) conformado por Diptera, Coleoptera, Hemiptera, Odonata y Restos de insectos y Otros (12.0%), constituido por Detritos, Gusanos, Moluscos, Piel de serpiente, Restos de huesos, Restos de vísceras y Sedimento. Peces y Material vegetal estuvieron presentes durante todos los meses del año de estudio, mientras que Crustáceos estuvo ausente en marzo y abril, Insectos en marzo y agosto, y Otros en enero y abril.

RESULTADOS Se analizaron 338 estómagos de individuos capturados en el período comprendido entre enero y diciembre 2005. La talla mínima registrada fue de 15.5 cm LT (abril), la máxima de 37.0 cm LT (abril); mientras que el menor peso fue de 28.0 g (abril) y el mayor de 486.0 g (junio).

La distribución de frecuencias de tallas mostró rangos entre 15.0 y 35.0 cm LT, con talla media de captura de 23.7 cm LT (Figura 1); mientras que la distribución de frecuencias de pesos presenta rangos entre 50.0 y 500.0 g y peso promedio de 139.2 g.

Del total de estómagos estudiados, el 38.2% se encontró vacío, destacándose abril (54.2%), marzo (53.8%) y junio (53.3%). El 92.5% del alimento consumido se encontró medio digerido, alcanzando su valor máximo mensual en diciembre (100%), el 5.9% fresco, y solo el 1.6% digerido.

80

Frecuencia de ocurrencia (%)

Se estableció la relación longitud intestinallongitud total de acuerdo con la escala de Brusle (18) y se analizaron las preferencias alimentarias de acuerdo con las tallas que presenta la especie en estudio y con el ciclo hidrológico del río Sinú.

Se utilizó estadística descriptiva, expresando las variables como media ± desviación estándar y se estimó el coeficiente de correlación (r) a la relación longitud intestinal-longitud total.

60

40

20

0 Peces

Crustáceos

Insectos

M. vegetal

Otros

Figura 2. Frecuencia de ocurrencia de presas en el estómago del Liso en el río Sinú.

Peces (45.5%) fue el grupo más abundante seguido por Material vegetal (24.0%), Crustáceos (11.8%), Insectos (10.9%) y Otros (7.8%) (Figura 3). En la composición mensual se observó que Material vegetal y Crustáceos fueron las presas más abundantes en aguas ascendentes y aguas altas. Peces fue también el grupo con mayor composición en peso (76.8%), seguido

3220

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

Frecuencia numérica (%)

50

40

30

20

10

0 Peces

Crustáceos

Insectos

M. vegetal

Otros

Figura 3. Frecuencia numérica de presas en el estómago del Liso en el río Sinú.

por Crustáceos (9.8%), Otros (6.7%), Material vegetal (3.7%) e Insectos (3.1%), mostrando los mayores valores en todos los meses (Figura 4).

100

Gravimetría (%)

80

60

40

20

0 Ene

Feb

Mar Peces

Abr

May

Crustáceos

Jun Insectos

Jul

Ago

M. vegetal

Sept

Oct

Nov

Dic

Otros

Figura 4. Gravimetría de presas en el estómago del Liso en el río Sinú.

El Índice de importancia relativa (IIR) indicó que Peces fue el alimento principal del Liso (IIR =53.7%). Crustáceos (IIR =1.8%), Material vegetal (IIR =1.3%), Otros (IIR =0.8%) e Insectos (IIR =0.5%) fueron presas de baja importancia relativa, circunstanciales o incidentales. La relación longitud intestinallongitud total (LI-LT) fue estimada en 1.0, lo que clasifica a la especie en estudio como carnívora de acuerdo con la escala de Brusle (18).

Para analizar las preferencias alimentarias con respecto a la talla, los ejemplares de la especie en estudio se agruparon en cinco intervalos de tallas, los cuales oscilaron entre 12.5 y 37.5 cm LT, en donde solo se observó el consumo de Peces (100%) para el intervalo 12.5-17.5 cm, mientras que en los siguientes (17.5-22.5, 22.5-27.5 y 27.5-32.5 cm) consumieron los cinco grupos alimentarios (Peces, Crustáceos, Insectos, Material vegetal y Otros), y en el intervalo mayor (32.5-37.5 cm) consumieron Peces (50.0%), Material vegetal (30.0%), Crustáceos y Otros (10.0%).

En la tabla 1 se muestra la composición y tamaño de los peces consumidos por el Liso. Entre 12.517.5 y 27.5-32.5 cm no se registraron peces enteros, sino restos de ellos; entre 17.5-22.5 cm se encontró Mayupa (6.0%), Sardina (1.5%) y Restos de peces (92.5%); entre (22.5-27.5 cm) se encontró Cachana (1.6%), Cocobolo (3.1%), Mayupa (4.7%), Sardina (1.6%) y Restos de peces (89.1%); y entre (32.5-37.5 cm) se observó únicamente Cocobolo (20.0%) y Restos de peces (80.0%).

La talla del Liso osciló entre 15.5 y 37.0 cm LT, mientras que la talla de los diferentes peces consumidos se encontró entre 2.5 y 12.0 cm LT, observándose que a medida que aumentó la talla del predador disminuyó la talla de la presa consumida; lo que se confirmó con la relación talla media de la presa/talla media del predador, la cual muestra correlación inversa.

De acuerdo con los niveles durante el ciclo hidrológico del río: aguas bajas (diciembre, enero, febrero), aguas ascendentes (marzo, abril, mayo), aguas altas (junio, julio, agosto) y aguas descendentes (septiembre, octubre, noviembre), se observó que Peces y Crustáceos fueron los grupos más consumidos en aguas altas; mientras que Material vegetal lo fue en aguas ascendentes y aguas altas; Insectos, en aguas bajas; Otros, en aguas descendentes (Figura 5).

Tabla 1. Composición y tamaño de los peces consumidos por el Liso en el río Sinú.

Liso LT (cm)

Presas consumidas n

Tamaño presa (LT)

Cachana

Cocobolo

Mayupa

Sardina

R. peces

Mín.

Máx.

Prom.

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

(cm)

(cm)

(cm)

12.5-17.5

3

-

-

-

-

100.0

-

-

-

17.5-22.5

67

-

-

6.0

1.5

92.5

2.5

12.0

7.3

22.5-27.5

64

1.6

3.1

4.7

1.6

889.1

3.0

10.5

6.8

27.5-32.5

7

-

-

-

-

100.0

-

-

-

32.5-37.5

5

-

20.0

-

-

80.0

6.5

6.5

6.5

5.5

80

5.0

60

4.5

40

4.0

20

3.5

0

3.0 Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Peces

Crustáceos

Insectos

Ago Sept Oct Nov Dic M. Vegetal

Otros

Nivel del río

Figura 5. Preferencias alimentarias del Liso y el ciclo hidrológico del río Sinú.

DISCUSIÓN El Coeficiente de vacuidad encontrado en este trabajo es mayor que los reportados para la especie en los ríos San Martín y Guarayos (16.7%) en Bolivia (19), en el río Sauce Grande (0%) en Argentina (20). La presencia de altos porcentajes de estómagos vacíos puede relacionarse con la reducción de la actividad alimentaria como consecuencia de la actividad reproductiva, lo que sugiere que los coeficientes de vacuidad pueden estar asociados con los procesos reproductivos de la especie (21). De igual manera, altos porcentajes de vacuidad se podrían presentar debido a que los peces carnívoros tienen un estómago evolucionado que segrega ácidos para digerir rápidamente hueso, carne y escamas de las presas ingeridas, y posee un intestino mucho más corto que las especies herbívoras, por lo que la digestión es más rápida (22).

El alto porcentaje de presas digeridas y medio digeridas, al igual que el alto Coeficiente de vacuidad, pueden estar relacionados con el intestino corto que presentan los peces depredadores, mientras que su estómago es más voluminoso o evolucionado con pH ácido y presencia de jugos gástricos, favoreciendo una digestión muy rápida (22). También, la boca, la cavidad bucal y la faringe están asociadas con la secreción, captura, orientación y preparación predigestiva del alimento (23).

Diferentes trabajos realizados en América del Sur coinciden con los resultados obtenidos en este estudio puesto que los grupos alimentarios son muy similares. Varios autores han reportado que Rhamdia quelen se alimenta de Insectos acuáticos, Peces y Material vegetal como frutos, semillas y flores en el río Cauca, Colombia, mostrando una dieta muy flexible (24) y de Algas, Detritos orgánicos, Restos inorgánicos y Restos vegetales en Bolivia (19).

3221

En investigaciones realizadas en Brasil se ha observado que los adultos son omnívoros, con una tendencia al carnivorismo, con clara preferencia por Peces, Crustáceos, Moluscos, Insectos terrestres y acuáticos, Restos vegetales y Detritus orgánicos (25-26). Otros autores reportaron que Rhamdia quelen es una especie piscívora en el Alto río Paraná (27); que presenta una dieta diversificada compuesta, tanto por grupos de origen animal (Camarón e Insectos), como vegetal (Macrofitas), ubicándolo como un pez carnívoro generalista (28); que los organismos encontrados en su contenido gastrointestinal no están restringidos a hábitats bentónicos, lo que indica que esta especie es generalista en lo que respecta a la elección de sus alimentos (25), observándosele hábitos alimentarios nocturnos en este estudio, lo cual coincide con lo reportado (19,24).

El Índice de importancia relativa estimado en este estudio (IIR Peces =53.7%) es muy diferente al reportado por López et al. (20), quienes afirman que el alimento dominante o principal de la especie en el río Sauce Grande (Argentina) es Moluscos (Chilina parchappii) (56.4%) mientras que Ephemeroptera (Baetis inops), Odonata (Aeshna bonariensis) y Trichoptera (Neotrichia sp) fueron alimentos ocasionales.

La relación longitud intestinal-longitud total estimada (LI-LT =1.0), que clasifica al Liso como un pez carnívoro, es mayor que la relación encontrada para la especie en los ríos Paraibuna (LI-LT =0.83) y Grande (LI-LT =0.75) (26), correspondientes a especies omnívoras con tendencia de ingestión de presas de origen animal (Figura 6).

50

Longitud intestino (cm)

100

Nivel del río (m)

Frecuencia numérica (%)

Olaya-Nieto - Ecología trófica del Liso (Rhamdia quelen Quoy & Gaimard, 1824)

LI = - 0.15 + 1.02 LT r = 0.56 n = 332

40 30 20 10 0 0

10

20

30

40

Longitud total (cm)

Figura 6. Relación longitud intestino-longitud total del Liso en el río Sinú.

3222

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Los peces carnívoros presentan un intestino corto debido a que la cantidad de alimento es menor y la calidad superior, lo que hace que el tránsito sea más lento, aspecto importante para favorecer la difusión de los nutrientes (29); de igual forma, la longitud del intestino parece estar más relacionada con la cantidad de material indigerible del alimento, que con su origen animal y/o vegetal. Para el Liso se encontró correlación positiva (r =0.56) entre el tamaño del intestino y su talla.

La talla del Liso osciló entre 15.5 y 37.0 cm LT, mientras que la talla de los diferentes peces consumidos se encontró entre 2.5 y 12.0 cm LT, observándose que a medida que aumenta la talla del predador disminuye la talla de la presa consumida; lo que se confirmó con la relación talla media de la presa/talla media del predador, la cual muestra correlación inversa.

La morfología del pez juega un papel importante en el tipo de presa consumida, en tanto que las variaciones morfológicas pueden conducir a cambios en su capacidad de alimentación y a la subsecuente explotación diferencial de los recursos alimentarios (30). El comportamiento alimentario es característico de cada especie.

A medida que se hacen más estables sus

condiciones de alimentación, se reduce la diversidad de alimentos consumidos, por lo que a mayor variabilidad de alimento disponible es mayor la diversidad de elementos alimentarios ingeridos (23).

Los resultados obtenidos indican que Peces es la presa más consumida, lo que sumado -a la información arrojada por el Índice de importancia relativa y la relación longitud intestino-longitud total, permite inferir que el Liso es un pez con hábitos alimentarios nocturnos y carnívoros con tendencia a consumir Peces.

Agradecimientos Los autores expresan sus agradecimientos a los pescadores y comercializadores de pescado de la cuenca baja del río Sinú y a los tesistasinvestigadores involucrados en el proyecto de investigación “Estimación de los parámetros biológicos básicos de peces comerciales del Río Sinú–Fase II”, Código FMV-01-04, Numeral 1120107, del cual hace parte este trabajo. A la Universidad de Córdoba, por la financiación recibida.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3224-3230, 2012.

ORIGINAL

Títulos de anticuerpos contra Leptospira sp., en primates del zoológico Matecaña, Pereira, Colombia Antibody titers against Leptospira sp., in primates from Matecaña zoo, Pereira, Colombia Marlyn Romero P,1* M.Sc, Miryam Astudillo H,2 M.Sc, Jorge Sánchez V,1 M.Sc, Lina González G,1 MVZ, Néstor Varela A,3 Esp. Universidad de Caldas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Salud Animal, Grupo de Investigación CIENVET. Manizales, Colombia. 2Universidad del Valle, Departamento de Microbiología, Cali, Colombia. 3Zoológico Matecaña, Pereira, Colombia. *Correspondencia: marlyn. romero@ucaldas.edu.co 1

Recibido: Febrero de 2011; Aceptado: Diciembre de 2011.

RESUMEN Objetivo. Identificar los serovares más frecuentes de Leptospira sp., por la técnica de Microaglutinación (MAT) en una población de primates neotropicales, mantenida en condiciones de cautiverio, y evaluar por microscopía de campo oscuro la presencia de espiroquetas en aguas para el consumo de los animales. Materiales y métodos. Se realizó un estudio de prevalencia de punto en 65 monos neotropicales, mediante la técnica de Microaglutinación Macroscópica (MAT) usando un cepario de referencia conformado por 21 serovares de Leptospira sp., y la observación de espiroquetas en el agua mediante microscopía de campo oscuro. Resultados. La seroprevalencia de Leptospira sp., en los monos neotropicales fue del 41.5% (27/65). Los serovares de Leptospira Autumnalis (25%), Ranarum (22.9%), Icterohaemorrhagiae (12.5%), Pomona (12.5%) y Australis (10.4%) fueron los más aglutinados por los sueros. Los monos ardilla (Saimiri sciureus), lanudo (Lagothrix lagotricha) y tití pielroja (Saguinus oedipus) fueron seronegativos. Se observaron espiroquetas en el agua evaluada.

Conclusiones. Se evidencia la circulación de Leptospira sp., en el zoológico, siendo necesario la implementación de estrategias de vigilancia epidemiológica activa y programas de promoción.

Palabras clave: Monos, seroprevalencia, zoológico (Fuente: CAB).

3224

Romero - Titulos de anticuerpos contra Leptospira sp. en primates

3225

ABSTRACT Objectives. To identify the most frequent serovars of Leptospira sp., in a captive neotropical primate population using the Microagglutination test (MAT), and to evaluate the presence of spirochetes in the drinking water of enclosures using dark-field microscopy. Materials and methods. A point prevalence study was performed in 65 neotropical monkeys using the microagglutination test (MAT) and 21 Leptospira sp., reference strains; observation of spirochetes in water was performed using the dark-field microscopy. Results. The Leptospira sp., seroprevalence was 41.5% (27/65) in neotropical monkeys. Leptospira serovars showing important agglutination were Autumnalis (25%), Ranarum (22.9%), Icterohaemorrhagiae (12.5%), Pomona (12.5%) and Australis (10.4%). Squirrel monkey (Saimiri sciureus), woolly monkey (Lagothrix lagotricha) and cotton-top tamarin (Saguinus oedipus) had non-reactive sera. Spirochetes in drinking water of enclosures were observed. Conclusions. This study shows evidence of the circulation of Leptospira sp., inside the zoo setting, revealing the need of implementing active epidemiological surveillance strategies and educational programs.

Key words: Monkeys, seroprevalence, zoo (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN La Leptospirosis es una enfermedad zoonótica bacteriana de importancia y distribución global (1). Presenta un comportamiento endémico, pero se reportan brotes epidémicos en varios continentes; siendo considerada una enfermedad reemergente en la actualidad (1,2).

Las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes tienen dos implicaciones biológicas de importancia; en primer lugar, muchas especies de vida silvestre son reservorios de patógenos que amenazan la salud de las personas y de los animales domésticos; y segundo, constituyen una amenaza sustancial para la conservación de la biodiversidad global (3). Por lo tanto, su investigación puede beneficiar los esfuerzos en la conservación de la vida silvestre y proveer una conexión entre los estudios serológicos y la necesidad de la detección, identificación y vigilancia epidemiológica oportuna de estas enfermedades (4,5).

En la cadena epidemiológica de la leptospirosis participan hospederos de mantenimiento y hospederos definitivos (5). Los primeros se definen como las especies animales en las cuales la infección es endémica, usualmente transmitida de individuo a individuo por contacto directo. A diferencia, los hospederos accidentales (como el hombre) se infectan por contacto indirecto por contaminación ambiental con orina de animales infectados (1). Esta última vía se presenta a través de la ingestión de agua o alimento contaminado, y por contacto con mucosas o la piel (2).

Es poco frecuente el reporte de leptospirosis en primates no humanos y por lo tanto, la presentación de la enfermedad ha sido poco estudiada (6), a pesar de que se ha

comprobado que actúan como portadores renales del patógeno, lo cual los convierte en un riesgo para los animales de zoológicos y de laboratorio, al igual que para los trabajadores, los veterinarios y los demás primates (7,8).

Los síntomas de leptospirosis observados en infecciones naturales de primates generalmente son leves, pasan desapercibidos; limitándose a respuestas febriles, conjuntivitis e inquietud (9). Por otra parte, la respuesta humoral es detectada sólo en períodos cortos de tiempo (7). Sin embargo, en condiciones de cautiverio, el frágil equilibrio entre los agentes infecciosos y los hospederos se rompe, debido a problemas como la desnutrición y el estrés crónico (fruto de ambientes inadecuados, totalmente distintos a los ambientes naturales), el desconocimiento de las necesidades básicas de las diferentes especies, la limitación espacial que los puede predisponer a una reinfección, así como, las alteraciones orgánicas y del comportamiento, que favorecen el establecimiento de enfermedades y el desarrollo de cuadros clínicos más severos (4,6,9).

A pesar de estas limitaciones, los zoológicos ofrecen oportunidades para el estudio de la leptospirosis en situaciones controladas y son fuente importante de información para la investigación epidemiológica de enfermedades transmisibles (8). Teniendo en cuenta la escasa información sobre la epidemiología de la leptospirosis en poblaciones silvestres en zoológicos colombianos, el presente trabajo tuvo como objetivo realizar una evaluación serológica para establecer los serovares más frecuentes de Leptospira sp., por la técnica de microaglutinación (MAT), en una población de primates neotropicales mantenida en condiciones

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

de cautiverio y evaluar por microscopía de campo oscuro la presencia de espiroquetas en aguas de bebida de los animales.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización. El zoológico de Matecaña se encuentra localizado en la ciudad de Pereira, departamento de Risaralda, Colombia. El municipio se encuentra a 4˚49 minutos de latitud norte y 75˚45 minutos de latitud oeste de Greenwich, con una temperatura promedio de 21˚C. Primates no-humanos. La población de primates neotropicales evaluados está conformada por 65 individuos, pertenecientes a nueve especies taxonómicas: Ateles fusciceps, Cebus albifrons, Cebus apella, Cebus capucinus, Saimiri sciureus, Ateles hybridus, Lagothrix lagotricha, Saguinus oedipus y Saguinus leucopus.

Normas de ética. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Caldas y contó con el consentimiento informado para la toma de las muestras.

Muestras sanguíneas de los primates. Los monos neotropicales fueron sometidos a un procedimiento de contención química, utilizando como protocolo anestésico una mezcla de Ketamina (10 mg/kg) y Xilacina (1mg/kg) vía intramuscular.

Se siguió el pulso, la frecuencia respiratoria y cardíaca, la relajación muscular, analgesia, reflejos (palpebral, corneal, interdigital y genital) cada 10 minutos. La vena de elección para la colecta, cantidad de sangre y el tamaño de la aguja, se seleccionó de acuerdo con la edad y la masa corporal de cada animal. Las muestras de sangre fueron tomadas con tubo Vacutainer sin anticoagulante, luego de un reposo de 10 minutos se centrifugaron a 3000 rpm durante cinco minutos y el suero obtenido se almacenó a -20°C hasta su procesamiento en el laboratorio.

Muestreo y análisis del agua. Se tomaron 10 ml de agua de los bebederos de cinco locaciones de monos neotropicales y una muestra del tanque distribuidor del zoológico Matecaña, las cuales fueron analizadas mediante microscopía de campo oscuro.

Técnica de Microaglutinación MAT. El procesamiento de las muestras se efectuó en el laboratorio de Diagnóstico de Leptospirosis de la Universidad del Valle (Cali); laboratorio que participa en el control externo de la MAT realizado por la Sociedad Internacional de Leptospirosis. El mantenimiento de las cepas y el manejo de la técnica se realizó bajo los parámetros convencionales (10), utilizando un cepario de referencia suministrado por el Laboratorio Internacional de Referencia para el Diagnóstico de la Leptospirosis del Royal Tropical Institute, Amsterdam (Holanda).

Los 21 serovares de Leptospira evaluados fueron: Bataviae, Mini, Autumnalis, Sutumnalis, Canicola, Shermani, Icterohaemorrhagiae, Cynopteri, Australis, Celledoni, Gryppotyphosa, Hebdomanis, Javanica, Manhao, Pomona, Pyrogenes, Sejroe, Tarassovi, Bataviae, Patoc, Hurstbridge y Djasiman.

Se consideraron como positivos los sueros con títulos ≥1:50. Se determinó el título de anticuerpos utilizando microscopio de campo oscuro, objetivo 25X, cuando al comparar con un control de antígeno, el 50% o una proporción mayor de las leptospiras estaban aglutinadas en una dilución del suero entre 1:50 y 1:3200.

Análisis estadístico. Se utilizó el paquete estadístico Epidemiology Program Office Epi Info™ versión 6.

RESULTADOS La seroprevalencia de Lectospira sp., en la población de primates neotropicales evaluados fue del 41.5% (27/65). Los monos neotropicales mono ardilla (Saimiri sciureus), mono lanudo (Lagothrix lagotricha) y tití pielroja (Saguinus oedipus) fueron seronegativos (Tabla 1).

Tabla 1. Especies de primates neotropicales evaluados y serovares seroreactivos en el Zoológico Matecaña, Pereira, Colombia.

Primates

Sueros

Serovares reactivos

Pos

Exa

Ateles fusciceps (Mono araña negro)

6

19

Ateles hybridus (Mono cornudo)

2

6

Cebus apella (Mono capuchino)

7

14

Cebus capucinus (Mono cariblanco)

1

3

Australis, Autumnalis, Ranarum

Cebus albifrons (Mono ardilla)

6

6

Australis, Autumnalis, Cynopteri, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Ranarum

Saimiri sciureus (Mono araña mulato)

0

4

Lagothrix lagotricha (Mono lanudo)

0

2

Saguinus oedipus (Tití piel roja)

0

6

Saguinus leucopus (Tití gris)

5

5

27

65

Total Pos = Positivos; Exa = Examinados

Autumnalis, Canicola, Celledoni, Icterohaemorrhagiae, Lau, Patoc Pomona.

Autumnalis, Icterohaemorrhagiae Australis, Autumnalis, Ranarum, Sarmin

Cynopteri, Ranarum

3227

Romero - Titulos de anticuerpos contra Leptospira sp. en primates

Tabla 2. Frecuencia de aglutinación anti-Leptospira sp. en sueros de primates en cautiverio del Zoológico Matecaña, Colombia, 2010.

Serovar

TÍTULO

%

50

100

200

400

800

>1600

Total

Australis

04

00

01

00

00

00

05

10.4

Autumnalis

07

04

00

01

00

00

12

25

Bataviae

00

00

00

00

00

00

00

0

Canicola

00

00

01

00

00

00

01

2.1

Celledoni

00

00

00

00

00

00

00

0

Cynopteri

02

00

02

00

00

00

04

8.3

Djasiman

00

00

00

00

00

00

00

0

Gryppotyphosa

00

00

00

00

00

00

00

0

Hebdomanis

00

00

00

00

00

00

00

0

Hursbridge

00

00

00

00

00

00

00

0

Icterohaemorrhagiae

01

00

02

01

01

01

06

12.5

Lau

00

00

01

00

00

00

01

2.1

Mini

00

00

00

00

00

00

00

0

Manhao

00

00

00

00

00

00

00

0

Panama

00

00

00

00

00

00

00

0

Pomona

01

02

00

01

01

01

06

12.5

Ranarum

05

06

00

00

00

00

11

22.9

Sarmin

01

00

00

00

00

00

01

2.1

Serjoe

00

00

00

00

00

00

00

0

Shermani

00

00

00

00

00

00

00

0

Patoc

01

00

00

00

00

00

01

2.1

Total

22

12

07

03

02

02

48

100

%

45.8

25

14.6

6.2

4.2

4.2

Los serovares de Leptospira Autumnalis (25%), Ranarum (22.9%), Icterohaemorrhagiae (12.5%), Pomona (12.5%) y Australis (10.4%) fueron los más aglutinados por los sueros de los primates neotropicales (Tabla 2).

DISCUSIÓN No fue posible determinar las vías de transmisión y las fuentes de infección relacionadas con la presencia de animales positivos para Leptospira sp., en el zoológico Matecaña. Sin embargo, de las seis muestras de agua evaluadas por microscopía de campo oscuro, en tres de éstas se visualizaron formas microscópicas compatibles con Leptospira sp., pero por la baja especificidad de la técnica, no fue posible establecer con certeza su naturaleza patógena o saprófita (2). Este hallazgo sugiere que es necesario realizar evaluaciones complementarias para dilucidar su clasificación, teniendo en cuenta que las leptospiras patógenas pueden sobrevivir en agua por muchos meses, dependiendo de la temperatura, el pH, la salinidad o el grado de contaminación (11). Asimismo, trabajos realizados en aguas de lagos del zoológico de la Plata (Argentina) demostraron la presencia de leptospiras, haciendo evidente el papel del agua en la epidemiología de la enfermedad (12).

Es importante resaltar que en el año 2007 en el zoológico Matecaña se presentó un brote de

leptospirosis en animales y en el personal; por lo tanto, la alta seroprevalencia de punto de leptospirosis encontrada (41.5%) en este estudio indica que los primates evaluados estuvieron expuestos a la infección por Leptospira sp., y que existe un riesgo de transmisión a las especies susceptibles, incluidos los operarios responsables de su cuidado; teniendo en cuenta que se ha sugerido su papel como portadores renales del patógeno (13).

La seroprevalencia fue superior a la reportada en los zoológicos de Rio de Janeiro y de Aracaju (6, 8), así como a la encontrada en 286 muestras de Cebus apella (16.1%) capturados en un ambiente natural del estado de Tocantins, Brasil (14); e inferior a la detectada en el zoológico de Sao Paulo del 65% (13/21) (15). Estas diferencias se pueden deber a factores relacionados con el agente, los hospederos, el ambiente, el manejo y a características propias de la técnica MAT. Los títulos de los sueros evaluados para los distintos serovares de Leptospira interrogans, variaron entre 1:50 y 1:1600 (Tabla 2). Predominaron los títulos bajos de 1:50 (45.8%), lo que sugiere, que sólo hubo o hay infección y el título de inmunoglobulinas en el momento del examen corresponde a un punto de la curva de anticuerpos. Asimismo, los animales portadores de un serovar presentaron títulos bajos.

La MAT detecta especialmente inmunoglobulina IgM, lo cual indica infección inicial y por consiguiente no siempre están correlacionados con los signos

3228

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

clínicos, los cuales muchas veces se presentan cuando los niveles de IgM han descendido.

Los títulos serológicos ≥100 (54.2 %) evidencian que los animales padecieron la enfermedad o que la infección está en curso. Los títulos ≥1600 (4.2%), pueden indicar una infección activa, sin presentar manifestaciones clínicas, siendo viable también la eliminación del agente por la orina (9). En este caso es necesario realizar estudios complementarios con el fin de confirmar el diagnóstico mediante técnicas como el aislamiento, tipificación y análisis molecular e implementar el tratamiento respectivo.

Las investigaciones serológicas sobre la leptospirosis en primates neotropicales en cautiverio han presentado resultados variables. Los serovares de Leptospira sp., más frecuentemente encontrados en primates de Brasil fueron Castellonis, Copenhageni, Grippotyphosa (15), resultados diferentes a los hallados en el presente estudio, en donde predominaron Autumnalis, Ranarum, Icterohaemorrhagiae, Pomona y Australis, que evidencian la presencia de leptospiras patógenas en zoológicos.

Se ha descrito un amplio rango de reservorios de los serovares Autumnalis y Australis como roedores silvestres, prociónidos (mapache), mustélidos (comadreja y zorrillo), roedores sinantrópicos (Rattus norvegicus, Rattus rattus, Mus musculus), porcinos y bovinos (16). En este caso, las condiciones de cautiverio que favorecen el contacto estrecho entre animales con orígenes ecológicos y antecedentes epidemiológicos disímiles, pueden contribuir a la exposición de los animales con diferentes serovares (17).

El serovar Icterohaemorrhagiae ha sido frecuentemente identificado en estudios serológicos en casos confirmados y probables de leptospirosis en seres humanos en Colombia (18,20). Asimismo, la infección por éste serovar ha sido comprobada por serología y genotipificación en un brote de leptospirosis severa en monos capuchinos confiscados y mantenidos en un centro de rehabilitación de fauna silvestre colombiano (21).

El serovar Icterohaemorrhagiae fue aislado de 3 casos fatales de leptospirosis presente en macacos de Gibraltar en cautiverio (Macaca sylvanus) en el parque zoológico Nacional de Washington, D.C. (13), siendo descrito además en varias especies de mamíferos en el zoológico de Rio de Janeiro (17).

Estos hallazgos permiten sugerir que a pesar de que los primates evaluados en el presente trabajo tienen hábitos arborícolas en su medio natural, se ven forzados a tener mayor contacto con el piso de las instalaciones, debido a las

condiciones de cautiverio; aumentando el riesgo de contacto con roedores, o con ambientes y alimentos contaminados con su orina (21), convirtiéndose en una fuente de infección de este serovar, teniendo en cuenta que los roedores, especialmente los sinantrópicos como la rata parda (Rattus norvergicus), son reservorios importantes (8).

Como medidas de control se pueden implementar: la utilización de barreras físicas que eviten el ingreso de los roedores, mejorar el manejo de los restos de alimentos en los recintos, suministrar el agua en recipientes localizados en estructuras elevadas, proporcionar suficientes plataformas para que los animales descansen, limpiar frecuentemente el piso de las instalaciones, recubrimiento del piso con cemento para evitar acumulaciones de agua, y mantenimiento preventivo de instalaciones, entre otras medidas (21).

La alta seroprevalencia de Leptospira sp., en el presente estudio sugiere que se deben incluir los primates no humanos en los programas de vigilancia epidemiológica activa de la infección en poblaciones silvestres mantenidas en condiciones naturales y en cautiverio; debido a que los médicos veterinarios por lo general asumen que los monos no son susceptibles a la infección por Leptospira; apreciación que puede conducir a diagnósticos y tratamientos errados .

Adicionalmente, la infraestructura de los zoológicos puede ser propicia para la sobrevivencia de Leptospira sp., en el ambiente, como consecuencia de la presencia de áreas adyacentes muy arborizadas, que en ocasiones entorpecen la entrada de la radiación solar a los recintos de los animales, o mantienen una humedad elevada; especialmente en los períodos de verano y de alta pluviosidad, siendo común la formación de charcos de agua en las instalaciones, aspecto que es importante controlar (22).

Finalmente se evidenció la circulación de Leptospira sp., en los primates neotropicales del zoológico Matecaña; siendo necesario fortalecer los programas de promoción y prevención de la leptospirosis para evitar la transmisión de la infección a otras especies animales y a los funcionarios.

Agradecimientos A la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas, al Zoológico Matecaña de Pereira y al Laboratorio de Diagnóstico de Leptospirosis de la Universidad del Valle, por la financiación de esta investigación.

Romero - Titulos de anticuerpos contra Leptospira sp. en primates

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3231-3235, 2012.

COMUNICACIÓN BREVE

Efectos de la sobredosificación con láser de arseniuro de galio sobre el cuádriceps de ratas Effects of gallium arsenide laser irradiation overdose on the quadriceps of rats Mónica Mercado L,1* Ph.D, Cristina Pallares V,1 Vet, Sebastián González A,1 Vet, Marcelo Toledo S,1 MV. Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Veterinarias, Cátedra de Enfermedades Quirúrgicas Chorroarin 280 (1417) Capital. República Argentina. *Correspondencia: mercado@fvet.uba.ar 1

Recibido: Agosto de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

RESUMEN Objetivo. Obtener información de los efectos de la irradiación con laser con el objeto de determinar dosis en la que se observen efectos deletéreos sobre el tejido muscular. Materiales y métodos. Se estudiaron 20 ratas macho Sprague Dawley y fueron divididas aleatoriamente en cuatro grupos de 5 individuos. En todos los grupos se realizó la irradiación con laser, empleando un equipo de diodo de Arseniuro de Galio. Se aplicó en forma puntual 1 vez al día durante 10 días consecutivos. El tiempo de exposición y las dosis diarias siguieron el siguiente arreglo: grupo A, 15 minutos y 24.3 julios, grupo B, 30 minutos y 48.6 Julios, grupo C, 45 minutos y 72.9 Julios, grupo D, 60 minutos y 97.2 Julios.

Se tomaron muestras del cuadriceps para microscopía óptica y microscopía electrónica. Resultados.

La microscopia óptica no mostró alteraciones en ninguno de los grupos estudiados. Al microscopio electrónico se observaron alteraciones ultraestructurales solamente en el grupo D. Conclusiones. El rango entre la dosis terapeútica y la que produce alteraciones ultraestructurales en el tejido muscular es tan amplio que hace del laser un eficiente elemento seguro para la terapia física.

Palabras clave: Laser, músculo, ratas, sobredosis (Fuente: CAB).

ABSTRACT Objective. To obtain information on the effects of laser irradiation in order to determine maximum free of deleterious effects dose on muscle tissue. Materials and methods. Twenty male Sprague Dawley rats were studied randomly divided into four groups A, B, C and D. All groups were irradiated with a Laser, using a Gallium Arsenide diode machine. Irradiation was applied in the same point once a day for 10 consecutive days. Groups: A: 15 minutes a day, with a total dose of 24.3 Joules, B: 30 minutes, 48.6 Joules, 45 minutes, 72.9 Joules C: D: 60 minutes, 97.2 joules. Samples from quadriceps were taken for optical and electron microscopy. Results. No alterations were exposed under optical microscopy in any of the groups studied. The electron micrographies showed ultrastructural alterations only in D Group. Conclusions. The difference between the therapeutic dose and the doses that produce ultrastructural alterations in muscle tissue is so great that it make of laser an efficient and safe element to be used in physical therapy.

Key word: Lasers, overdose, rats, muscle (Source: CAB).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

La fisioterapia veterinaria emplea con frecuencia la técnica de laser, para el tratamiento de diversas enfermedades musculoesqueléticas. La palabra laser es la sigla de la denominación inglesa: “Light enlargement by stimulated emission of radiation”. Posee características físicas como monocromía (una única longitud de onda), coherencia (ondas electromagnéticas emitidas en fases que oscilan en la misma cadencia), emisión direccional (divergencia muy débil) e intensidad (1). Existen distintos tipos de laser.

Uno de los más utilizados en terapia física es del tipo de diodo semiconductor de Arseniuro de Galio (AsGa), que emite en la banda infrarroja con longitud de onda comprendida entre los 780 y 905 nm (2). Se genera a través de la aplicación de una corriente eléctrica que excita partículas del material semiconductor, portadoras de cargas positivas y negativas, que luego se neutralizarán. Este proceso genera fotones (3,4) de alta energía, capaces de penetrar los tejidos.

Clínicamente actúan como antiinflamatorios y analgésicos, siendo de elección en afecciones musculares, tendinosas y articulares (5,6). A pesar de que esta forma terapéutica se utiliza desde hace más de 20 años, no existen aún suficientes evidencias científicas de su acción sobre los distintos tipos de células y tejidos in vivo. Existen discrepancias entre distintos autores respecto a las dosis terapéuticas recomendadas.

Sitio de estudio. El experimento se realizó en el laboratorio de la Cátedra de Enfermedades Quirúrgicas de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires.

La laserterapia se aplica en forma puntual o de barrido. En el humano frecuentemente se utiliza una dosis de 8 a 15 Julios por punto. Algunos autores detectaron que a una dosis acumulativa (4 aplicaciones de una dosis cada 48 h) de 12 y 24 Julios se observa un efecto deletéreo de la radiación sobre el cartílago de crecimiento en ratas (7). Rodríguez-Martín (2) recomienda dosis que oscilan entre 2 y 30 Julios por cada cm2 de tejido vivo. La técnica puntual es de elección, ya que la técnica de barrido hace difícil la dosificación.

Del Águila (4) indica que una potencia de 0.84 Julios aplicada en forma puntual contínua por un lapso de 2 minutos, provoca necrosis dermoepidérmica tórpida.

El objetivo del presente trabajo fue determinar la posible producción de lesiones sobre el tejido muscular con dosis superiores a las terapéuticas indicadas en medicina humana.

Muestra. Se estudiaron 20 ratas, macho, Sprague Dawley de 70 días de edad y de 450 g de peso corporal.

Se dividieron en forma aleatoria en cuatro grupos A, B, C, y D cada uno con 5 individuos.

Todos los sujetos presentaban el cuádriceps sin lesiones.

Equipo. Se utilizó un equipo emisor laser de Arseniuro de Galio (AsGa) marca Vip modelo Junior, fabricado en Buenos Aires, Argentina.

El mismo emite en una longitud de onda de 904 nanómetros (nm), con una potencia media de 0.027 Watts (W) a una frecuencia de 5000 Hertz (Hz) y con una duración de cada pulso de 200 nanosegundos (nseg).

Aplicación de laser. En todos los grupos se aplicó el laser en forma puntual apoyando el diodo sobre 1 cm2 de piel a la altura del tercio medio del fémur sobre el cuadriceps del miembro posterior derecho, utilizándose como control, el miembro posterior izquierdo.

La irradiación se realizó durante 10 días consecutivos, en una sesión diaria. En todos los grupos se aplicó la misma potencia media (0.027 Watts) variando el tiempo de aplicación.

Grupo A: 15 minutos; Grupo B: 30 minutos; Grupo C: 45 minutos y Grupo D: 60 minutos, logrando dosis para: G. A: 24.3 Julios, G. B: 48.6 Julios, G. C: 72.9 Julios y G. D: 97.2 Julios, respectivamente.

Finalización del período experimental.

Se tomaron muestras del músculo irradiado y del control. Para ello los animales fueron anestesiados con xilazina (15 mg/kg) y ketamina (70 mg/kg). La biopsia muscular tomada fue escisional.

Las muestras para microscopio óptico fueron fijadas en formaldehido al 10% y teñidas con Hematoxilina-Eosina y Tricrómico de Gomori.

Las muestras para microscopio electrónico, siguiendo las técnicas standard, fueron colocadas en glutaraldehído a 4°C inmediatamente, la inclusión se realizó en resina epóxica; los cortes se hicieron con ultramicrótomo y se empleó la coloración doble de Reynolds-uranilo. Las observaciones se efectuaron con un microscopio

Mercado- Efecto de la sobredosificación con láser de arseniuro de galio

3233

de transmisión marca IEÖL 1200 EX, a 85 Kv en aumentos crecientes de 4000 a 150.000X

RESULTADOS La microscopia óptica mostró estructura histológica normal en todas las muestras procesadas, sin ninguna evidencia de desorganización fibrilar ni alteraciones nucleares (Figuras 1 y 2).

El

estudio

con

microscopia

electrónica

se

Figura 3. Corte del cuádriceps coloreado con Tricrómico de Gomori. Grupo tratado. Las fibras musculares se ven de color azul y los núcleos rojos. No se observan lesiones.

Figura 1. Corte del cuádriceps coloreado con Hematoxilina-Eosina.

Grupo control (microscopio óptico- 40X). Técnica de biopsia escisional. Todas las fibras se presentan cortadas transversalmente.

Figura 2. Corte del cuádriceps coloreado con Hematoxilina-Eosina. Grupo tratado. No se observan lesiones. (microscopio óptico40X)

realizó incrementando progresivamente la magnificación hasta 100.000X. No se detectaron alteraciones ultraestructurales en los grupos A, B y C (Figuras 3, 4 y 5).

Figura 4. Cuádriceps miembro posterior izquierdo de rata. X30K. Corte transversal. Control.

(Microscopio Electrónico)

En el grupo D, con un aumento de 12.000X se observaron alteraciones de los organelos en el corte transversal. Se detectó incremento de la distancia interfibrilar y microfragmentación a nivel de las fibras de miosina. En magnificación de 100.000X se evidenciaron alteraciones

del retículo sarcoplásmico, consistentes en desintegración de las membranas tubulares y obstrucción tubular. Además, se observó desintegración de las crestas en la mayoría de las mitocondrias (Figura 5, Tabla 1).

3234

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

DISCUSIÓN El laser de Arseniuro de Galio posee características físicas que permiten su utilización en fisioterapia. Los efectos beneficiosos observados clínicamente son principalmente analgésicos y antiinflamatorios, lo cual lo convierte en un tratamiento de elección en afecciones articulares, tendinosas y musculares.

En el presente estudio la utilización de laser de diodo de Arseniuro de Galio a dosis terapéuticas no produjo alteraciones. Sin embargo, una dosis superior a la recomendada permitió detectar lesiones ultraestructurales a nivel mitocondrial.

Figura 5. Cuádriceps de rata miembro posterior derecho de rata. X25K. Corte transversal.

(Microscopio Electrónico). Obsérvese el edema interfibrilar.

Tabla 1.

Efectos de los distintos tratamientos evaluados mediante microscopio óptico y electrónico.

Tratamiento con laser (AsGa) 904 nm. Dosis: Julios y tiempo aplicación en minutos

Microscopio óptico. Tejido muscular

Microscopio Electrónico. Tejido muscular

Grupo A 24.3 Julios. 15 minutos.

No se observan lesiones

No se observan lesiones

Grupo B 48.6 Julios. 30 minutos.

No se observan lesiones

No se observan lesiones

Grupo C 72.9 Julios. 45 minutos.

No se observan lesiones

No se observan lesiones

Grupo D 97.2 Julios. 60 minutos.

No se observan lesiones

Alteraciones ultraestructurales: microfragmentación fibras miosina-actina, alteraciones sistema retículo sarcoplásmico.

Por más de dos décadas, una serie de estudios efectuados en ratas reveló que los fotones generados por el laser son absorbidos por enzimas de la cadena respiratoria mitocondrial y por la membrana celular (5,8,9). Se determinó que hay activación de enzimas y se inicia la producción de ATP y ADN. También se detectaron modificaciones en la permeabilidad de la membrana. La susceptibilidad del músculo esquelético al tratamiento estaría relacionada con su alto contenido mitocondrial y la presencia de células satélites (6,10).

Rodríguez (2) recomienda dosis entre 2 y 30 Julios en cada cm2 de tejido vivo. Del Águila (4) estima que, aunque no hay valores establecidos con respecto de la máxima potencia permitida para el haz, no parece posible superar los 1.2 Julios. Recomienda para una aplicación puntual continua, que la máxima exposición para 0.84 Julios no debe ser mayor a 60 segundos.

De los resultados obtenidos puede concluirse que la irradiación con laser de Arseniuro de Galio en dosis iguales o inferiores a 72.9 J/ cm2 por día durante 10 días consecutivos no produce alteraciones ultraestructurales en el tejido muscular de ratas (Figura 1 y 2).

Sin embargo, la aplicación de dosis iguales o mayores a 97.2 J/cm2 producen alteraciones ultraestructurales caracterizadas por la separación y microfragmentación de los filamentos de miosina y actina; así como alteraciones del sistema retículo sarcoplásmico (Figuras 4 y 5).

Mercado- Efecto de la sobredosificación con láser de arseniuro de galio

3235

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COMUNICACIÓN BREVE

Evaluación de tres dietas con harina de hoja de bore (Alocasia macrorrhiza) en pollos de engorde Evaluation of three bore leaf meal (Alocasia macrorrhiza) diets in broilers Fredy López M,1* M.Sc, Alex Caicedo G,1 IA, Gustavo Alegría F,1 IA. Universidad del Cauca. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Popayan – Colombia.

Agropecuarios, Universidad del Cauca. *Correspondencia: fjlopez@unicauca.edu.co 1

Ingenieros

2

Recibido: Marzo de 2010; Aceptado: Enero de 2012.

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto nutricional de incluir la harina de hoja de bore, en proporciones de 0 (T1), 5 (T2), 10 (T3) y 15% (T4), en la alimentación de 100 pollos machos de la línea Ross 308. Materiales y Métodos. Se empleo un diseño experimental completamente al azar con cuatro tratamientos, cinco repeticiones por tratamiento y cinco unidades experimentales por repetición.

Para su respectivo análisis se registró consumo diario, ganancia de peso, conversión alimenticia, mortalidad y eficiencia económica, durante un periodo de 6 semanas. Resultados. Se observó que no existieron diferencias estadísticas significativas en conversión alimenticia, pero si en consumo, ganancia de peso y eficiencia económica (p< 0.05), siendo el mejor tratamiento el T2, con un consumo de 4003.4 g, una ganancia de peso de 1794.4g una conversión de 2.4 y un beneficio neto de campo de 107.88%. Conclusiones. La harina de hoja de bore es una alternativa de alimentación para pollos de engorde, al emplearla al 5% de nivel de inclusión, como materia prima no convencional, la cual permite generar un buen comportamiento productivo y económico.

Palabras Clave: Alimentos no convencionales, dieta, forraje (Fuente: CAB).

ABSTRACT Objective. Assessing the nutritional impact of including bore leaf meal in proportions of 0 (T1), 5 (T2), 10 (T3) and 15% (T4) in the supply of 100 male chickens of the Ross 308 line. Materials and Methods. A completely randomized design with four treatments, five rounds per treatment and five experimental units per round was used. For the corresponding analysis, daily consumption, weight gain, feed conversion, mortality and economic efficiency, for a period of 6 weeks were recorded.

Results. No statistically significant differences in feed conversion were observed, but differenced in consumption, weight gain and economic efficiency (p<0.05); with T2 being the best treatment, with a consumption of 4003.4 g, a weight gain of 1794.4g, a conversion of 2.4, and a field net profit of 107.88% were established. Conclusions. The bore leaf meal is an alternative feed for broilers, when employed at 5% of inclusion level, as non-conventional raw material, which can generate a good productive and economic behavior.

Key words: Diets, forage, unconventional foods (Source: CAB).

3236

López - Evaluación de tres dietas con harina de hoja de bore (Alocasia macrorrhiza)

INTRODUCCIÓN Los países desarrollados se caracterizan por su alto nivel de investigación dirigido a cultivos adaptados a su medio y a la búsqueda de nuevos renglones productivos para estos; es así como se manifiesta un alto nivel económico y productivo de estos países, los cuales presentan ventajas tecnológicas comparados con países como el nuestro. En Colombia, y en especial en el Municipio de El Tambo, muchas de las especies vegetales útiles como alternativas alimentarías en pollos de engorde, están subvalorados y no son explotados adecuadamente, siendo estos quizás la solución a la problemática de los altos costos de alimentación que se presenta en las explotaciones avícolas (70% de la producción) (1), en los cuales existe una alta dependencia de recursos alimenticios convencionales importados, que genera que el precio de las dietas, este sujeto a las fluctuaciones externas del mercado.

Por lo tanto, la Alocasia macrorrhiza comúnmente conocida con el nombre de bore, se constituye en un recurso alimenticio potencial, como complemento a las propuestas de utilización de recursos convencionales, en la alimentación de pollos de engorde; es una especie herbácea perenne que puede llegar a los 5 m de altura, presenta un alto grado de adaptabilidad para las condiciones medioambientales del trópico bajo y medio, con suelos de baja fertilidad y con un excelente valor nutritivo (2).

El presente estudio evaluó la inclusión de harina de hoja de bore (Alocasia macrorrhiza) en la alimentación de pollos de engorde, como fuente parcial de proteína, en niveles de 5, 10 y 15%, de materia seca (MS) de la dieta, teniendo como variables de respuesta la ganancia de peso, consumo de alimento, conversión alimenticia y otros aspectos como mortalidad, factor de eficiencia europeo (F.E.E.) y rentabilidad en la etapa de iniciación y finalización.

MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio. El proyecto se realizó en La Corporación Maestra Vida, ubicada en el Municipio de El Tambo – Cauca, a 25 kilómetros al suroccidente de la ciudad de Popayán, con coordenadas geográficas: 2º27´15” latitud norte, 76º49´1” longitud este, a una altura 1750 msnm, temperatura de 18 ºC y precipitación promedio anual de 2800 mm (3).

Instalaciones. Se trabajó en un galpón de 27m2, sobre piso en tierra, techo en zinc,

3237

paredes en esterilla y malla, dentro del cual se diseñaron 20 divisiones de 1 m de largo por 0.5 m de ancho con el fin de alojar 5 pollos por división en relación de 10 pollos/m2.

Muestra. Se utilizaron 100 pollos machos de la línea Ross 308 de un día de nacidos, estos se sometieron a una valoración de calidad, en la cual se incluyó un pesaje inicial y aspectos fenotípicos como color del plumón, picos, ombligo seco, tamaño y fortaleza de patas. La fase experimental duró 42 días representados en 6 semanas, (3 semanas para cada etapa, iniciación y finalización respectivamente).

Suministro de alimento. Las diferentes dietas, acordes a los requerimientos nutricionales del ave, fueron repartidas en dos suministros al día, el primero en la mañana (7:00 a.m.) y el segundo en la tarde (4:00 p.m.) la cantidad suministrada fue de acuerdo con la tabla de consumo comercial usada en la zona de estudio.

El alimento rechazado se recogía y se pesaba diariamente, para determinar el consumo real por parte de los animales evaluados, al igual que se efectuaron pesajes semanales antes de suministrar la primera ración.

Las variables evaluadas fueron ganancia de peso, consumo, conversión alimenticia y mortalidad, en cada etapa productiva.

Análisis estadístico. Se utilizó un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos, cinco repeticiones y cinco unidades pollos por repetición; la diferencia entre tratamientos se basó en los niveles de inclusión de harina de hoja de bore (Alocasia macrorrhiza ), siendo el T1: el testigo (concentrado no convencional), T2, T3 y T4 concentrados con 5, 10 y 15% de harina de hoja de bore, respectivamente, mas la utilización de materias primas como torta de soya, maíz, harina de pescado, aceite de girasol, harina de huesos, carbonato de calcio, coccidiostato, sal común y premezcla; dichos niveles de inclusión partieron de la base del preensayo efectuado en el Centro Latinoamericano de Especies Menores (Clem - Tuluá), en el año 2007.

Cada división representa una repetición que se distribuyó al azar, en estas se adecuó un comedero y un bebedero, buscando el suministro adecuado de cada dieta. Los resultados obtenidos se evaluaron por medio de análisis de varianza y pruebas de comparación múltiple de Duncan.

Análisis económico. Para contrastar al tratamiento control con los demás tratamientos y determinar su viabilidad en términos

3238

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

económicos, se empleó la metodología de presupuestos parciales, que permite organizar la información experimental de tal manera que ayude a tomar una decisión, sobre el tratamiento más conveniente (4). Mientras que el desempeño productivo de cada tratamiento se midió por medio del factor de eficiencia europeo (F.E.E.).

RESULTADOS Consumo de alimento etapa de iniciación y finalización. El análisis de varianza permite evidenciar, que existieron diferencias significativas entre los tratamientos (p<0.05), para ambas etapas productivas. Con respecto a la etapa de iniciación, la prueba de Duncan, mostró que se formaron tres grupos, uno por el tratamiento de mayor ganancia de peso (T1), un segundo grupo con T2, y un tercer grupo con T3 y T4 , siendo estos últimos, los que reportan menor consumo con 867.2 y 839.5 g, respectivamente (Figura 1).

Figura 2. Consumo de alimento etapa de finalización.

donde se formaron tres grupos, los grupos 1 y 2 conformados por los tratamientos T2 y T1, respectivamente y el grupo tres con los tratamientos T3 y T4, quienes presentaron las menores ganancias de peso con 1620.6 y 1527.4 g, respectivamente (Figura 3).

Figura 3. Ganancia de peso etapa de finalización.

Figura 1. Consumo de alimento etapa de iniciación.

Con respecto a la etapa de finalización, la prueba de Duncan determinó que todos los tratamientos fueron diferentes entre sí, siendo el tratamiento testigo (T1) el que más alimento consumió (3136g), mientras que los tratamientos T2, T3 y T4 los de menor consumo con 3121.3, 3091.5 y 3038.6 g, respectivamente (Figura 2).

Ganancia de peso etapa de iniciación y finalización. Para esta variable en etapa de iniciación, no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos (p> 0.05), siendo el T2 el de mayor ganancia con 488g, contra 397.6 g para el T4 que presentó el menor valor; caso contrario a la etapa de finalización, donde si se encontraron diferencias estadísticas (p< 0.05) entre los tratamientos,

Conversión alimenticia etapa de iniciación y finalización. Para ambas etapas no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (p> 0.05), siendo el T2 el que obtuvo la mejor conversión tanto en iniciación como finalización con 1.81 y 2.40, respectivamente (Figura 4).

Figura 4. Conversión finalización.

alimenticia

etapa

de

López - Evaluación de tres dietas con harina de hoja de bore (Alocasia macrorrhiza) Mortalidad. El índice de mortalidad fue de 0% en todos los tratamientos evaluados durante el ensayo.

Análisis económico. La relación costo del alimento y consumo de cada tratamiento (Tabla 1), permite evidenciar que una mayor inclusión de harina de hoja de bore, permite obtener reducciones en los costos variables, siendo el T4 el que mayor reducción presenta con un porcentaje de 14.15% frente al tratamiento testigo.

Tabla 1. Beneficio Bruto y Neto de campo por tratamiento.

Tto

B.B.C. ($)

C.V. ($)

B.N.C. ($)

(%)

Reducción Costos (%)

T1

236.4

98.7

137.6

100.0

0.0

T2

242.2

93.7

148.5

107.8

5.1

T3

218.7

89.2

129.4

94.0

9.1

T4

206.1

84.7

121.4

88.1

14.1

Beneficio bruto de campo; CV= Costos variables; BNC = Beneficio Neto de Campo.

Las dietas experimentales T3 y T4 no reunieron las características necesarias para sustituir al concentrado testigo ya que a pesar de ser más económicas, no son rentables, pues estos tratamientos generan menor ganancia de peso y no compensa la reducción en el costo de alimentación. Mientras que el tratamiento 2 genera 7.8% más rentabilidad que el concentrado testigo (Tabla 1), permitiendo afirmar que niveles de 5% de hoja de bore en raciones para alimentación de pollos de engorde, aporta los nutrientes necesarios en la producción de esta especie a un bajo costo.

Factor de eficiencia europeo. En términos generales, el factor de eficiencia europeo para cada tratamiento reporta valores bajos, indicando que el lote en general no fue eficiente; sin embargo al comparar los tratamientos evaluados (T2, T3 y T4) con valores de 178.3, 150.5 y 130.9 respectivamente, contra el testigo 171.5 (T1), se puede determinar que el tratamiento que mejor desempeño obtuvo durante los 42 días del ensayo fue el T2, mientras que el T4, fue el de menor desempeño productivo.

DISCUSIÓN El consumo de alimento se puede ver influenciado sustancialmente por muchos factores incluyendo el manejo de la parvada, la calidad del alimento, el estado de salud y las condiciones climáticas (5). Es importante aclarar, que las condiciones de manejo, sanidad y ambiente fueron similares para cada tratamiento.

3239

De igual forma es importante mencionar, que el balance dispuesto para cada tratamiento (Tabla 2), buscaba suplir los requerimientos nutricionales necesarios para un optimo desarrollo fisiológico de los pollos en cada una de las fases; sin embargo al adicionar los tres niveles de inclusión de harina de hoja de bore, se generó un aumento de la fibra; siendo el tratamiento testigo (T1) el de menor concentración de esta (3.15%) y los tratamientos T2, T3 y T4 los de mayor nivel con 3.6, 4.04, 4.48% respectivamente, para la etapa de iniciación. Esta diferencia en el balance de las dietas, genera disminución en el consumo presentado por los tratamientos con mayor proporción de bore, ya que excesos de fibra en la ración (>4%) causan efectos negativos sobre la productividad en monogástricos jóvenes, relacionado con la palatabilidad, reducción de digestibilidad de los nutrientes y sensación de saciedad, haciendo que el pollo sea incapaz de consumir la cantidad de alimento necesaria, para cubrir sus necesidades energéticas (6).

Tabla 2. Balance nutricional por tratamiento y etapa productiva.

Etapa

Iniciación

T%

M

T1 0 T2 5

Finalización

L

F (%)

M

L

F (%)

0.4

1.0

3.15

0.4

0.99

3.6

0.34

0.8

2.89

0.35

0.79

T3 10

0.4

0.98

3.34

4.04

0.35

0.78

T4 15

0.4

3.37

0.97

4.48

0.6

0.77

Req

0.5

4.21

1.1

4

0.35

0.85

4

Metionina; L=Lisina; F= Fibra

Este comportamiento fisiológico, es acorde a lo reportado por González et al (7), quienes al trabajar con niveles de 0 hasta 10% de inclusión de harina de hojas de bore, encontraron disminución en el consumo, en la medida que el nivel de inclusión aumentaba. De igual forma , otros autores (8), reportan disminución en el consumo de alimento en dietas donde se utilizo 15 y 30% de nivel de inclusión de Canavalia brasilensis, en dietas para pollos de engorde, argumentando de igual forma, los efectos generados por el incremento de la fibra acorde al nivel de inclusión de este forraje.

En el mismo contexto, otros autores (9), manifiestan que el hambre esta relacionada con una necesidad fisiológica, y el apetito relacionado con diferentes tipos de motivación, como un deseo de repetir una experiencia placentera; sin embargo, estas se ven afectados por factores como la palatabilidad, capacidad física del tracto digestivo y la voluminosidad de la dieta. Debido a su volumen, un ingrediente puede restringir el consumo de alimento, si

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

la cantidad de alimento que el animal debiera comer para llenar sus requerimientos, es mayor que su capacidad física que lo permita; igualmente, la distensión del buche de los pollos con alimento húmedo o con alto contenido de fibra, deprimen el consumo durante las siguientes 3 horas, ya que hay señales físicas que trasmiten receptores dentro del buche.

Estos receptores son sensibles a la presión a la que son sujetos. Una vez que se perciben, los mensajes que se envían al cerebro se integran a la señal de saciedad, reduciendo así el consumo de alimento. Particularmente en aves, factores como el apetito específico por aminoácidos y minerales hace que un déficit oexceso moderado de estos nutrientes, provoque un aumento o una disminución de la ingestión del alimento.

No obstante, cualquier deficiencia grave en nutrientes esenciales causa una drástica reducción del consumo, por ejemplo, un bajo contenido proteico o un desequilibrio importante de aminoácidos (9) y por lo tanto, bajo condiciones comerciales donde solo hay una opción de alimento balanceado disponible, el consumo de alimento está marcadamente influenciado tanto por el perfil energético de la dieta, como por el de aminoácidos.

Por otra parte, pese a que no existió diferencia de ganancia de peso entre los tratamientos; estos valores son bajos comparados con los reportados por la tabla de ganancia de peso de la línea Ross 308, la que sugiere que un pollo de 21 días debe de estar pesando en promedio 755g, peso que no fue alcanzado por ninguno de los tratamientos evaluados.

Este efecto se podría atribuir a la deficiencia en lisina (T1:1%, T2:0.99%, T3:0.98% y T4:0.97%), aminoácido que tienen un papel muy importante en las dos primeras semanas y puede influir en el desempeño final del ave y en el rendimiento de la canal.

En comparación con otros aminoácidos, el contenido de lisina es relativamente alto en la carne de pechuga y considerando que este músculo representa el 21% de la canal en pollos de 7 días y 27% en pollos entre los 7 y 14 días de edad; por lo que, proporcionar una cantidad adecuada de lisina (1.11 y 1.21%), durante las dos primeras semanas del crecimiento puede incrementar el rendimiento de la pechuga y en el peso al mercado (8).

Es importante destacar, que esta experimentación buscó determinar el desempeño productivo y económico del lote, bajo un sistema de alimentación no convencional, sin la necesidad

de incurrir en insumos externos y altamente costosos, como lo son los aminoácidos sintéticos (Lisina y Metionina), los cuales son aportados por los ingredientes de la dieta y son cercanos al requerimiento del ave. Por otra parte, la genética avícola moderna, permiten que los pollos de engorde incrementan su peso 50 veces desde el nacimiento hasta llegar al mercado en un periodo de 6 semanas (10-12), permitiendo inferir que la nutrición adecuada contribuyen a este alto nivel de desarrollo actual. Sin embargo, el manejo deficiente o una nutrición subóptima cuando la parvada es joven, pueden tener un importante efecto en el peso al mercado. Las aves no pueden recobrar completamente la pérdida de peso en una etapa temprana y por lo tanto se reflejara en el peso al sacrificio (10), esto se presentó durante esta evaluación; los pollos en general no terminaron con un buen peso en la etapa de iniciación y por lo tanto, iniciaron con bajos pesos en la etapa de finalización, propiciando bajos rendimientos al sacrificio, efecto más marcado en los tratamientos 3 y 4 (10 y 15% de bore), lo cual es consonante a un mayor nivel de fibra, lo que afecta el consumo y por ende su ganancia de peso, tal como lo reportan diversos autores (13), al evaluar diferentes niveles de inclusión de morera morus alba, con niveles de inclusión de 5, 10 y 15%, y otros reportes (14), al evaluar niveles de inclusión de 15 y 30% de Vigna unguiculata, encontrando que a medida que se aumenta la inclusión de estos follajes, se disminuye la ganancia de peso.

Parvadas que exhiben los promedios más altos de ganancia de peso casi siempre tienen los consumos más altos de alimento y frecuentemente tienen las mejores conversiones alimenticias y tasas de viabilidad (10). Basado en esto, se puede determinar que posiblemente la diferencia de peso que se presentó en esta fase, se debe al bajo consumo de alimento observado por los tratamientos T3 y T4 comparado con los otros dos tratamientos, que generó un atraso significativo en el desarrollo de los animales.

De igual forma, las pruebas de ganancia de peso, se mencionan como la metodología por excelencia para medir la biodisponibilidad de nutrientes, ya que para obtener una respuesta en la ganancia de peso, es necesario que los componentes de la dieta sean digeridos, absorbidos y utilizados para las funciones de mantenimiento, crecimiento y/o producción (15) y por lo tanto al comparar el tratamiento 1 y 2 se considera que la diferencia entre las dos raciones se debió posiblemente, a una mayor digestibilidad del concentrado a evaluar

López - Evaluación de tres dietas con harina de hoja de bore (Alocasia macrorrhiza) con relación al testigo. Esto se debe a que los niveles de 5% de inclusión de harina de hoja de bore, mantuvieron niveles más bajos de fibra en comparación a los otros tratamientos experimentales y por lo tanto, permitió reflejar el potencial de este material en el desarrollo de la parvada bajo esta dieta.

Por otra parte, el índice de conversión se define como la relación entre la cantidad de alimento consumido y la producción (ganancia de peso), para este ensayo, se pudo determinar que no se presentaron diferencias estadísticas entre tratamientos. Sin embargo el T2 ostentó un índice de conversión 0.18 menos que el T1; 0.38 menos que el T3 y 0.42 menos que T4.

Estos datos reflejan la importancia de la implementación de niveles bajos de bore en la dieta; los animales del tratamiento 2 fueron más eficientes y requirieron menos alimento para obtener una producción similar al tratamiento testigo (T1).

Sin embargo, la conversión obtenida para cada tratamiento es relativamente alta comparada con la reportada por la tabla de conversión alimenticia de la línea Ross 308, la cual indica que para la etapa de finalización, se debe manejar una conversión alimenticia de 1.89 aproximadamente, mientras que el tratamiento con conversión más cercano a este valor, es el tratamiento 2 (2.4), seguido por el 1, 3 y 4 con 2.43, 2.56 y 2.78 respectivamente. Estos valores se asemejan a los obtenidos en otros ensayos (13), quienes al evaluar diferentes niveles de inclusión de morera 5, 10 y 15%, obtuvieron valores de 2.34, 2.67 y 3.21 respectivamente.

3241

Finalmente, la presentación del alimento para este ensayo (harina), posiblemente fue un factor adicional que pudo incidir en la alta conversión que presentó la parvada en general.

Algunos autores (16,17), reportan que en general, la forma física del alimento, harina o pellets, interviene en el desarrollo del tracto gastrointestinal (TGI); los alimentos en forma de pellets, tienen la ventaja de disminuir el tiempo de consumo y el ahorro de energía metabolizable; así, alimentos en diferentes tipos de pellets, como los crumbles, son ideales para los alimentos iníciales.

En conclusión, la harina de hoja de bore es una alternativa de alimentación para pollos de engorde, al emplearla al 5% de nivel de inclusión, como materia prima no convencional, la cual permite generar un buen comportamiento productivo en términos de ganancia de peso, consumo y conversión , al igual que su reflejo en términos de una mayor rentabilidad al productor, debido a la disminución de la dependencia de algunos insumos externos de uso convencional, lo cual se traduce en la reducción en los costos de producción en un 5.13%.

Agradecimientos A las directivas de la Corporación Maestra Vida, por permitir el uso de sus espacios y el aporte del material forrajero para esta evaluación, al igual que a la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad del Cauca.

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Rev.MVZ Córdoba 17(3):3243-3247, 2012.

CASO CLÍNICO

Plasmocitoma extramedular nasal en un perro Nasal extramedular plasmacytoma in a dog Carlos Giraldo M,1 M.Sc, Catalina López V,1,2 MVZ, Jorge U Carmona,1* Ph.D. Universidad de Caldas, Departamento de Salud Animal, Grupo de Investigación Terapia Regenerativa.

Manizales, Colombia. 2Universidad de Caldas, Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Becaria COLCIENCIAS “Generación Bicentenario”, Manizales, Colombia. *Correspondencia: carmona@ ucaldas.edu.co 1

Recibido: Noviembre de 2010; Aceptado: Octubre de 2011.

RESUMEN Se describe un caso de plasmocitoma nasal en un canino, macho entero, de raza Akita de 30 Kg de peso y veintiún meses de edad, con historia de epistaxis unilateral crónica. Se practicó examen clínico y biopsia de la neoplasia visible en la cavidad nasal izquierda. La ubicación y extensión del tumor fue determinada mediante tomografía computarizada de cabeza y cuello. Se realizaron análisis histopatológico e inmunohistoquímico (IHQ) del tejido tumoral. La tomografía computarizada evidenció una masa con densidad de tejido blando de 10 cm de longitud x 3.5 cm de diámetro y escasa captación de medio de contraste, que comprometía en su totalidad la cavidad nasal derecha y parte de la porción posterior de la coana izquierda. El análisis histopatológico reveló numerosas células redondas pleomórficas con poco citoplasma, rodeadas por trama escasa de tejido conectivo y bajo índice mitótico. En el examen IHQ la muestra fue negativa a los antígenos CD3 y CD20 para linfocitos T y B, respectivamente. Los hallazgos clínicos y de la tomografía computarizada, así como los resultados del análisis histopatológico del tejido tumoral, fueron compatibles con un plasmocitoma extramedular nasal de bajo grado de malignidad.

Palabras clave: Cavidad nasal, perro, plasmocitoma, tomografía (Fuente: MeSH MEDLINE).

ABSTRACT A case of nasal plasmacytoma with history of chronic unilateral epistaxis in a twenty-one month old, male, Akita dog, weighing 30 kg is described. Clinical examination and biopsy of the visible tumor in the left nasal cavity were performed. The location and extent of the tumor were determined by head and neck computer tomography. Histopathological and immune-histochemical (IHC) analyses of tumoral tissue were performed. Computer tomography showed a mass with soft tissue density of 10 cm long x 3.5 cm in diameter and low uptake of the contrast medium that entirely compromised the right nasal cavity and part of the rear portion of the left choana. The histopathological analysis revealed the presence of numerous pleomorphic round cells with little cytoplasm, surrounded by a scarce network of connective tissue, and a low mitotic index. The IHC analysis was negative for CD3 and CD20 antigens or T and B lymphocytes, respectively. Clinical and computer tomography findings, such as the results of the histopathology of the tumoral tissue were consistent with a low-grade malignancy extramedular plasmacytoma.

Key words: Dog, nasal cavity, plasmacytoma, tomography (Source: MeSH MEDLINE).

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INTRODUCCIÓN

CASO CLÍNICO

Los tumores de la cavidad nasal y de los senos paranasales son de escasa presentación en caninos. Su prevalencia varía del 1-4% de todos los tumores en esa especie (1) y el 15% de las enfermedades nasales pueden estar asociadas con neoplasias (2). Las neoplasias nasales afectan principalmente a pacientes mayores de 9 años (1, 2). Los tumores nasales se localizan preferentemente en los cornetes etmoidales anteriores, son invasivos localmente y de metástasis infrecuente. Sin embargo, algunos carcinomas en estados tardíos pueden hacer metástasis hacia ganglios linfáticos regionales, pulmones y cerebro (1).

En el servicio de consulta externa del Hospital Veterinario de los autores, fue presentado un canino, macho entero, de raza Akita de 30 Kg de peso y veintiún meses de edad.

Los perros de razas medianas y gigantes de cráneo dolicocefálico y mesocefálico son los más afectados (1). Se piensa que este tipo de conformación anatómica representa una mayor superficie de contacto para los carcinógenos ambientales (1). Existe una alta proporción de casos en el Airedale Terrier, Basset Hound, antiguo Pastor Inglés, Terrier Escocés, Pastor Alemán, Keeshound y Pointer Alemán de pelo corto (1, 2). Se ha establecido una asociación entre humo de tabaco y cáncer canino nasal.

Por otra parte, los productos de la combustión de fuentes fósiles parecen estar implicados (1).

Más del 80% de los tumores nasales en perros son malignos y de estos el 60-70% son adenocarcinomas y tumores de células escamosas (1). Los tumores nasales de células redondas, tales como linfomas (1, 3-5) y mastocitomas han sido escasamente documentados (1). A este grupo, también pertenecen los plasmocitomas. Sin embargo, de acuerdo con la literatura revisada por los autores, hasta el momento no se ha reportado este tipo de tumor en la cavidad nasal canina.

Los plasmocitomas son neoplasias de células plasmáticas monoclonales de forma redondeada.

Estos tumores se clasifican en medulares (si se originan en la médula ósea) y extramedulares (6). Los plasmocitomas extramedulares (PEM) son masas nodulares solitarias de escasa presentación en perros (6, 7). Estas neoplasias se localizan con más frecuencia en la piel y membranas mucosas (7).

En este artículo se describe un caso de plasmocitoma extramedular nasal, en un perro de veintiún meses de edad. El paciente fue evaluado con tomografía computarizada (TC), histopatología convencional y análisis inmunohistoquímico (IHQ) del tejido tumoral con anticuerpos para CD3 y CD20.

Historia clínica. El paciente presentaba epistaxis unilateral izquierda intermitente y disnea que se agravaba con el ejercicio, con evolución progresiva aproximada de cinco meses. Inicialmente, le fue diagnosticada rinitis alérgica, que fue tratada con antihistamínicos, sin ninguna respuesta. La hemorragia nasal se mantuvo y aumentó gradualmente, por lo que se inició un tratamiento inhalado con beclometasona y clorhidrato de oximetazolina al 0.05%. Después de una semana sin evidencia de mejoría, bajo anestesia general, se practicó examen de las cavidades oral y nasal y se observó una masa vascularizada en la coana izquierda.

Un mes más tarde, se intentó practicar criocirugía de la masa nasal, pero sin éxito. Esto por la localización inaccesible del tumor. Se instauró terapia con prednisolona (1mg/Kg/PO/q24h/ durante 7 días), la que podría haber favorecido la aparición de infección nasal purulenta izquierda. Se descontinuó el corticosteroide y se administró amoxacilina (25mg/Kg/PO/q8h/ durante 7 días). El tratamiento produjo mejoría transitoria en el cuadro clínico del paciente y disminuyeron los episodios de disnea.

Una semana después, la fosa nasal derecha evidenció obstrucción completa y el estado del paciente empeoró, se presentó exacerbación de la epistaxis, respiración estertorosa, incluso mientras dormía. Debido a esa situación se realizó TC y biopsia de la masa nasal.

RESULTADOS Hallazgos al examen clínico. El paciente presentó condición corporal normal y sus variables fisiológicas estaban dentro de los rangos normales para la especie. La palpación y auscultación del tórax no reveló presencia de dolor o ruidos respiratorios anormales. Sin embargo, presentó secreción nasal mucupurulenta izquierda, obstrucción completa de la ventana nasal derecha y respiración estertorosa. Aparentemente, los demás sistemas orgánicos estaban normales Por otra parte, los resultados del hemograma y urianálisis fueron normales.

El perro fue anestesiado para practicar una tomografía computarizada (TC) de cabeza y

Giraldo - Plasmocitoma extramedular nasal en perro

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cuello y tomar biopsia del tejido tumoral. El medio de contraste empleado fue iopamidol (150 mg dosis total/IV).

Tomografía computarizada. La TC en corte transversal, evidenció una masa con densidad de tejido blando de 10 cm de longitud x 3.5 cm de diámetro y escasa captación de medio de contraste. El tumor ocupaba en su totalidad la cavidad nasal derecha y parte posterior de la coana izquierda, sin infiltración de tejidos adyacentes (Figura 1).

Figura 2. Tejido de biopsia teñido con H&E, microscópicamente se observa proliferación de células redondas pleomórficas con poco citoplasma, rodeadas de una trama escasa de tejido conectivo y con índice mitótico bajo.

Figura 1. TC de cabeza en corte transversal, tumoración que ocupa la cavidad nasal derecha (R) y parte posterior de la coana izquierda (L), sin infiltración de tejidos adyacentes.

Análisis histopatológico convencional de tejido de la biopsia. Se observaron numerosas células redondas pleomórficas con poco citoplasma, rodeadas por una trama escasa de tejido conectivo y con índice mitótico bajo. Las células tenían apariencia de plasmocitos con escasa cohesión. Estas observaciones fueron compatibles con un tumor de células redondas (Figura 2). Sin embargo, no se pudo diferenciar el tumor entre plasmocitoma y linfoma.

Los resultados de la TC y el análisis histopatológico fueron discutidos con el propietario, quien decidió no continuar con el tratamiento y autorizó la eutanasia del paciente.

Hallazgos de necropsia. El tumor únicamente comprometía la cavidad nasal. Se apreció una masa blanco-amarillenta de consistencia firme y superficie nodular que invadía gran parte de la cavidad nasal e infiltraba ambos cornetes nasoetmoidales. El pasaje nasal derecho estaba obstruido totalmente (Figura 3). No se encontró ningún indicio macroscópico de metástasis.

Figura 3. Cráneo con corte longitudinal, macroscópicamente se observa masa blanco-amarillenta de consistencia firme y superficie nodular que invadía gran parte de la cavidad nasal e infiltraba ambos cornetes naso-etmoidales. El pasaje nasal derecho, comparado con el izquierdo, estaba más comprometido y obstruido totalmente.

Inmunohistoquímica (IHQ). Las secciones de parafina del tejido tumoral fueron teñidas con anticuerpos (antihumano) contra los marcadores CD3 (5, 8) y CD20 (9), para identificar linfocitos T y B, respectivamente.

Sin embargo, la masa tumoral fue negativa a esos dos antígenos. Por tal razón, el tumor fue clasificado como un plasmocitoma extramedular (PEM) nasal de bajo grado de malignidad.

DISCUSIÓN Los signos clínicos tempranos asociados con neoplasia nasal pueden incluir estornudo, respiración estertorosa, epifora, descarga

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ocular o nasal unilateral o bilateral crónica (mucopurulenta o sanguinolenta que no responde a antibióticos) y epistaxis (1, 2). En estados tardíos o demasiado insidiosos, se ha descrito edema facial o deformidad de huesos nasales y exoftalmia (1). Además, se han reportado signos neurológicos asociados con cambios de comportamiento y convulsiones (1).

Las alteraciones paraneoplásicas son frecuentes y pueden incluir anemia e hipercalcemia, entre otras (1). Los signos evidenciados por el paciente de este reporte, coincidieron con la sintomatología asociada con neoplasia nasal temprana (1, 2).

Según el conocimiento de los autores, este es el primer caso de PEM diagnosticado en la cavidad nasal de un canino, aunque se han reportado casos que afectan la piel, hígado, intestino, laringe, tráquea y cerebro en esta especie (7). Un hecho llamativo de este reporte, fue la aparición temprana de la neoplasia (21 meses de edad) en comparación con los casos de tumores nasales documentados previamente en perros (1, 2).

No se pudieron establecer los factores que potencialmente desencadenaron el desarrollo de la neoplasia nasal en el paciente de este reporte, ya que este habitaba en un lugar libre de humo de tabaco o de combustibles fósiles (1).

En seres humanos no se han podido establecer las causas que pueden predisponer el desarrollo de PEM, aunque se ha pensado que el estimulo antigénico inflamatorio crónico asociado con colagenopatías autoinmunes o infecciones bacterianas (e.j.: osteomielitis y colecistitis, entre otras) puede propiciar la aparición del tumor (10). El hecho de no encontrar ninguna causa aparente asociada con el desarrollo del PEM nasal en el canino de este reporte, hace pensar que en esta especie este tipo de neoplasia tiene un comportamiento epidemiológico diferente y aún desconocido al de los seres humanos.

Se han empleado diferentes pruebas diagnosticas para detectar cambios neoplásicos en la cavidad nasal de los caninos, tales como radiografía, rinoscopia anterograda y biopsia, citología con brocha o por impresión , resonancia magnética nuclear (RMN) y tomografía computarizada (TC). Todos estos métodos difieren en su sensibilidad y especificidad para detectar neoplasia nasal (1). En este caso se utilizó TC y el diagnóstico fue complementado con estudio histológico e IHQ de la biopsia tumoral.

Se realizó TC en el paciente de este reporte, ya que este es un método superior a la radiografía para detectar cambios tumorales en cualquier estructura o área de la cavidad nasal, fácilmente se pueden diferenciar de procesos infecciosos y constituye la mejor técnica no invasiva para planear el tratamiento (radioterapia y cirugía) (1). La TC del paciente de este estudio permitió valorar el tamaño y la extensión de la neoplasia y lo observado coincidió con los hallazgos de necropsia (Figuras 1 y 3).

El diagnostico preliminar de tumor de células redondas de la neoplasia nasal evaluada, se logró mediante la coloración clásica del tejido de la biopsia con hematoxilina-eosina (H&E) (Figura 2). La clasificación final del tumor se efectuó por descarte, ya que el examen IHQ de la muestra fue negativo para los anticuerpos (antihumano) contra los marcadores CD3 y CD20 (8, 11).

Los linfomas caninos presentan inmunoexpresión aberrante de antígenos CD, como CD3 y CD79a, que son los marcadores más utilizados para la determinación del linaje celular T y B, respectivamente (8). En el caso de este reporte, se realizó inmunotinción con anticuerpos para CD20, como alternativa a la utilización de anticuerpos CD79a para la identificación de linfoma de células B (9).

Un estudio reciente (9) demostró que el gen CD20 canino tiene una alta homología con el mismo gen humano.

La principal limitante de este reporte radica en el hecho de que no se realizó una inmunotinción contra proteínas de cadena ligera lambda (6). Esta prueba IHQ es fundamental para confirmar el diagnostico de PEM en caninos (12). Sin embargo, la evaluación morfológica del tejido de la biopsia con H&E y la ausencia de marcadores IHQ (CD3 y CD20) específicos para linfoma, hacen pensar que este paciente presentaba un PEM nasal.

El tratamiento de las neoplasias nasales incluye la utilización única o la combinación de radioterapia y cirugía (1). También se utiliza la quimioterapia sola o combinada con radioterapia (1) y la braquiterapia. Se ha demostrado que la radioterapia sola o combinada con cirugía representa el tratamiento más efectivo para los tumores nasales. Sin embargo, la recurrencia local es alta y la metástasis frecuente. Los pacientes sometidos a este procedimiento tienen por lo general un periodo de sobrevida de once

Giraldo - Plasmocitoma extramedular nasal en perro meses a un año. La cirugía o la criocirugía utilizadas como procedimiento único, no son efectivas para el tratamiento de las neoplasias nasales (1).

En el paciente de este reporte no se realizó ningún tratamiento, porque el propietario eligió su eutanasia por razones de bienestar animal. Los autores coincidieron con este argumento, puesto que la literatura revisada permite concluir que las neoplasias nasales y específicamente el PEM (7), a pesar de ser tratadas agresivamente tienen una supervivencia promedio de 138 días (7).

3247

Agradecimiento Los autores agradecen la interpretación de los resultados histopatológicos e inmunohistoquímicos presentados en este trabajo a los profesores Carlos Arturo Sánchez Buitrago, MVZ, MSc y Francisco Javier Pedraza Ordoñez, MV, MSc, de la Universidad de Caldas, Manizales, Colombia, y María del Pilar Pérez Figueroa, MD, Esp, de la Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.

REFERENCIAS 1.

Malinowski C. Canine and Feline Nasal Neoplasia. Clin Tech Small Anim Pract 2006;21(2):89-94.

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Meler E, Dunn M, Lecuyer M. A retrospective study of canine persistent nasal disease: 80 cases (1998-2003). Can Vet J 2008;49(1):71-6.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

Revista MVZ Córdoba INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES La revista MVZ Córdoba es el órgano oficial de difusión de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba con periodicidad de publicación semestral y circula en el ámbito internacional. La revista publica (secciones) artículos originales de investigación, artículos técnicos, revisiones de literatura, revisiones de tema, comunicaciones breves, informes de casos y, otros que a juicio del Comité Editorial sean de interés general.

Los temas que publica MVZ Córdoba están relacionados con la medicina veterinaria y zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias.

generales descritas abajo. La revista MVZ Córdoba se acoge a los requisitos generales de uniformidad para revistas biomédicas (normas de Vancouver).

“La revista MVZ Córdoba apoya las políticas para registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de esas iniciativas para el registro y divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente se eceptarán para publicación, a partir de 2007, los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por OMS e ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio del ICMJE. El número de identificación se deberá regiostrar al final del resumen”.

1.2. Nombre, apellido del autor o autores: Para el segundo apellido solo se colocará la inicial en mayúscula seguida de coma y el grado académico más alto o el título profesional. Se deberá incluir la filiación institucional de los autores (institución, dirección, ciudad, país). Se deberá indicar además, el responsable de la correspondencia del manuscrito suministrando su correo electrónico.

Los interesados en publicar deberán enviar al Editor una carta remisoria firmada por todos los autores declarando expresamente que el artículo remitido no ha sido publicado previamente y se indicará que los autores no tienen conflicto de intereses. El artículo se deberá enviar por correo electrónico, escrito en procesador de palabras, a doble espacio, con letra verdana a 12 puntos. Las márgenes no deben ser inferiores a 3 cm. y las páginas se numerarán consecutivamente incluyendo todo el material. Se aceptan artículos en español e inglés. Se recomienda observar las guías

1. Presentación: Debe contener la siguiente información: 1.1. Título del artículo: deberá ir en español e inglés. Este último deberá ir debajo del primero dejando doble espacio y en tamaño de letra menor que el principal. El título deberá ser preciso pero informativo y en lo posible no debe superar las 15 palabras.

1.3. Resumen: Deber ser estructurado y será máximo de 250 palabras. Deberá ofrecer una idea clara del contenido del artículo incluyendo: Objetivo, materiales y métodos, resultados y conclusiones.

Estas secciones deberán ir con negrilla y luego punto seguido en donde se inicia el texto de cada sección.

1.4 Palabras clave: Son términos cortos que ayudan a la clasificación del artículo. Se sugiere emplear 6 como máximo. Utilice los términos de la lista “Medical subject headings” (MeSH) u otro descriptor acorde con el tema de su investigación.

(DeCS, BIREME, NLM, etc.).

1.5 Abstract (resumen traducido al inglés) debe poseer una estructura y contenido igual al de español.

3249 1.6 Key Words: Palabras clave, deben ser iguales a las de español, pero en idioma ingles.

2. Introducción: Debe indicar claramente e l p r o p ó s i t o d e l a i nv e s t i g a c i ó n , relacionando igualmente en forma selectiva la literatura pertinente. No incluya datos ni conclusiones del trabajo que está dando a conocer. Al finalizar esta sección deberá hacerse con el objetivo general.

3. Materiales y métodos: Se debe describir claramente los procedimientos empleados en la investigación, incluyendo diseño estadístico y análisis de datos.

Esta sección deberá ser estructurada indicando tipo de estudio, sitio, condiciones geo-climáticas, coordenadas del sitio de estudio, pacientes o animales de estudio, métodos de laboratorio, aspectos éticos, análisis de resultados, etc. Estas secciones deberán ir con negrilla y luego punto seguido en donde se inicia el texto de cada sección.

4. Resultados: Corresponde a la información de los hallazgos pero sin incluir comentarios ni referencias a otros trabajos. Se sugiere utilizar tablas y figuras, las cuales no deberán ser más de seis en lo posible.

5. Discusión: Es la interpretación de los resultados obtenidos y la contrastación de los mismos con otros estudios. Se debe destacar las limitaciones del estudio e igualmente evitar especulaciones.

Resaltar las conclusiones del estudio, así como las recomendaciones para futuras investigaciones.

6. Agradecimientos: Mencionar las personas o instituciones que han colaborado con la investigación (financiera, logística, intelectual, entre otras.).

7. Correspondencia: Nombre completo del autor responsable, dirección laboral y residencial, correo electrónico, teléfono celular y teléfono fijo. Esta información puede ser suministrada en la carta remisoria o en una hoja al final del artículo remitido.

8. R e f e r e n c i a s : D e b e n n u m e r a r s e consecutivamente según el orden en que se mencionen por primera vez en el texto por medio de números arábigos colocados entre paréntesis. La lista de referencias se iniciará en hoja aparte, en estricto orden de aparición en el texto, no será en orden alfabético. Para los artículos originales no se aceptarán más de 30 referencias. Para revisiones de literatura hasta 50 referencias. Para la presentación de casos y comunicaciones breves hasta 12 referencias. Como guía general a continuación se presentan ejemplos de referencias bibliográficas.

8.1. Revistas

• Nombre del autor o autores • Título completo del artículo referenciado • Abreviatura internacional del nombre de l a r e vi sta • Año • Vol umen • Páginas incluidas. Las abreviaturas internacionales pueden consultarse en Journals database de PubMed, C a t a l o g o C 1 7 , DREV, Revistas de biomedicina del IHCD de Valencia.

8.2. Libros y monografías

• Autor o editor • Título del libro, lugar de publicación, editorial, año de publicación y páginas consultadas.

8.3. Ejemplos para las referencias bibliográficas según las normas de Vancouver.

Artículos de Revistas

• Artículos

Autor/es. Título del artículo. Abreviatura internacional de la revista, año; volumen (número): página inicial-final del artículo.

Ejemplos: Díez Jarilla JL, Cienfuegos Vázquez M, Suárez Salvador E. Ruidos adventicios respiratorios: factores de confusión. Rev MVZ Córdoba 1999; 109: 632-634.

• Más de seis autores

Martín Cantera C, Córdoba García R, Jane Julio C, Nebot Adell M, Galán Herrera S, Aliaga M et al. Virus and public health J Vet Sci 1997; 109: 744-748.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

• Autor Corporativo Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos amenazantes. Rev MVZ Córdoba 1997; 33: 31-40.

• No se indica nombre del autor

Cáncer in South África (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16.

Los artículos deben escribirse en su idioma original si la grafía es latina.

• Suplemento de un volumen

Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117.

• Suplemento de un número

Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma.

Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531.

• Número sin volumen

Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14.

• Sin número ni volumen

Browell DA, Lennard TW. Inmunologic status of the cancer fish patient and the effects ofblood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33.

• Paginación en número romanos

Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology.

Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII.

• Indicación del tipo de artículo según corresponda

Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337.

Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN)(abstract). Kidney Int 1992; 42: 1285.

• Documentos legales

Leyes: Título de la ley. (Nombre del Boletín Oficial, fecha, año de publicación).

Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos Laborales. (Boletín Oficial del Estado, número 269, de 10-11-95).

• Mapa

Nombre del mapa (tipo de mapa).

Lugar de publicación: Editorial; año.

Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico).

Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003.

Material no publicado

• En prensa

Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007.

• Artículo de revista en formato electrónico

Autor. Título. Nombre de la revista abreviado (tipo de soporte) año (fecha de acceso); volumen (número): páginas o indicador de extensión. Disponible en: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia. MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/ mmwrhtml/00048303.htm

• Monografía en formato electrónico

Título. (Tipo de soporte). Editores o productores. Edición. Versión. Lugar de publicación: Editorial; año. Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CD-ROM). Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0. Hagenstown: Lippincolt-Raven; 1997.

• Archivo informático

Autor. Título. (Tipo de soporte). Versión.

Lugar: Editorial; año.

• Tesis de Maestría, doctorado y trabajos de grado

Autor(es) título, Facultad, Departamento, año. Arrieta G. Producción de Verotoximas en Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

3251 9. F o t o g r a f í a s : S e p o d r á n u t i l i z a r fotografías, de excelente calidad, digital.

La identificación, secuencia y títulos deben establecerse claramente para localizar el lugar que le corresponda en el contenido del artículo. Las fotografías deberán llevar el título de figura.

10. Evaluación de artículos: Los artículos recibidos para publicación, después de constatar que cumplen con las normas expresas de la Revista MVZ Córdoba, serán enviados a pares que conforman el Comité Científico para su respectiva evaluación. En caso de recibir algún manuscrito que por su especialidad de contenido no pueda ser evaluado por los miembros del comité, este será remitido a sendos evaluadores pertenecientes a la comunidad científica nacional o internacional.

En la redacción del contenido deberán respetarse las normas internacionales para manuscritos científicos que regulan las abreviaturas, literatura citada, símbolos, n o m e n c l a t u ra s a t ó m i c a s , z o o l ó g i c a s , botánicas, químicas, entre otros. Los valores

deben informarse en unidades del sistema métrico decimal y de acuerdo con el Sistema Internacional de Unidades. La revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba no se responsabilizan por opiniones y resultados expresados por los autores, los cuales serán responsabilidad exclusiva de ellos.

Conflicto de intereses. Los autores deben expresar los intereses posibles que posean en el trabajo que realizaron.

Correspondencia: Los artículos, consultas, aclaraciones y correspondencia general se deben dirigir a la dirección abajo señalada, sin embargo, también los trabajos pueden ser remitidos en forma electrónica al editor o al coeditor. http:// www.unicordoba.edu.co Comité Editorial REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Teléfonos (094) 756 11 67, 756 07 10 http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/ revistamvz/index.htm Apartado Aéreo 354 Montería - Colombia Editor Marco González Tous. M.Sc. editormvzcordoba@gmail.com

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Journal MVZ Córdoba Instructions to the Authors The Journal MVZ Cordoba is the official organ of diffusion of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of the Universidad de Cordoba, is a biannual publication and circulates in the international environment.

The magazine publishes (sections) original articles of investigation, technical articles, literature reviews, topic revisions, brief communications, inform of cases and, others that to opinion of the Editorial Committee are from general interest. The topics that the Journal MVZ Cordoba publishes are related with the veterinary medicine and zootechny, aquaculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences and other topics of interest in the agricultural sciences.

Spanish or English. Authors should consult general guides described below. The Journal MVZ Cordoba is welcomed to the general requirements of uniformity for biomedical journals (Norms of Vancouver).

“The Journal MVZ Córdoba follows the policies of the World Health Organization (WHO) and of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) for clinical trial registration, recognizing the importance of those initiatives for international dissemination of information on clinical research, in open access. Accordingly, only articles of trials previously registered in one of the clinical Trial Registries that meet WHO and ICMJE requirements will be accepted for publication, starting in 2007. The list of registries accepted

by WHO and ICMJE is available in ICMJE site. The trail registration number should be published at the end of teh abstract”.

1.2. Name: Last name of author(s). For the second name only be placed the first letter in capital followed by coma and each author´s highest academic degree or professional title. It should include the institution affiliation of authors, (Institution Name, address, city, country). It should also indicate the responsible person for the manuscript correspondence (e-mail included).

Interested in publishing will send to the Editor an introductory letter signed by all the authors declaring expressly that the remitted article has not been published previously and that the authors don’t have conflict of interests. Two printed copies will be sent of the article written on any of the programs for word processing, double space, paper size letter, in ink quarter note for a single face of the leaf, with arial letter, font size 12 and C.D. (these originals will not be returned) or by e-mail. Margin should not be inferior to 3 cm and pages will be numbered consecutively including the whole material. Journal accepts papers in either

1. Presentation: It should contain the following information: 1.1. Title of the article: It should be presented in Spanish and English language. The last one should appear below the first one double spaced and with a minor font size that the main one. The Title should be concisely but informative and be of up to 15 words.

1.3 Abstract: Should be structured and of approximately 250 words, indicating the paper’s objective clearly and including: objective, material and methods, results and conclusions. This section should be in boldface and then point followed by the text of the subsequent section.

1.4 Key words: Are short terms. These will be useful to classify the article. List 6 as maximum. Use the terms of the “Medical subject headings” (MeSH) list or another describer in agreement with the topic of their investigation. (DeCS, BIREME, NLM, etc.).

1.5 Abstract (summarize translated to English) it should possess a structure and content similar to the one of Spanish.

3253 1.6 Key Words: Key words, it should be similar to those of Spanish, but in English language.

2. Introduction: should indicate the paper’s objective clearly, relating equally in selective form the pertinent literature.

Do not include data neither conclusions of the work that is giving to know. When concluding this section it will be made with the general objective.

3. Material and Methods: should be described clearly the procedures used in the investigation including statistical design and data analysis. This section should be structured indicating type of study, place, geo-climatic conditions, coordinate of the study place, patients or animals, laboratory methods, ethical aspects, result analysis, etc. These sections should be in boldface then point followed by the text of the subsequent section.

4. Results: Correspond to findings without comments no references to other works.

The use of tables and figures is suggested which should be no more of six.

5. Discussion: is the interpretation of the obtained results followed by a comparison with other studies. It should stand out the limitations of the study and equally to avoid speculations. Point out conclusions and suggestions for further research.

6. Acknowledgements: Contributions from people or institutions who have collaborated with the investigation (financial, logistics, intellectual, among others) should appear under “Acknowledgements”.

7. Correspondence: Full names of the responsible author, affiliation address, postal address, cellular and telephone number, email addresses. This information should be include in the remission letter or in a single sheet at the end of the article.

8. References: Will be cited with a number correlative to the order in which they

appear in the text and should be numbered consecutively by means of Arabic numbers placed within parenthesis. The list of references will begin in separate sheets, in strict appearance order in the text; they were not in alphabetical order.

Original articles should have no more than 30 references. For literature revisions up to 50 references. Presentation of cases and short communications will have only 12 references. As general guide examples of bibliographical references are given below.

8.1. Journals

• Author’s names • Full title of the referenced article • International abbreviation of the journal name • Year • Volume • Included pages. International abbreviation must be search in Journals database of PubMed, Catalogue C17, DREV, Biomedical journals of Valencia IHCD. 8.2. Books and monographs

• Author or editor • Title of book, publication place, editorial, year of publication and consulted pages.

8.3.

Examples for the bibliographical references according to the Vancouver norms Journal articles • Articles Author(s). Title of the article. International Abbreviation of the journal, year; volume (number): initial-final page of the article.

Examples: Díez Jarilla J, Cienfuegos Vázquez M, Suárez Salvador E. Ruidos adventicios respiratorios: factores de confusión. Rev MVZ Córdoba 1999; 109: 632-634.

• More than six authors Martín Cantera C, Córdoba García R, Jane Julio C, Nebot Adell M, Galán Herrera S, Aliaga M et al. Virus and public health J Vet Sci 1997; 109: 744-748.

• Corporate author Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 17(3) Septiembre - Diciembre 2012

amenazantes. Rev MVZ Cordoba 1997; 33: 31-40.

• The author’s name is not indicated Cancer in South Africa (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16.

The articles should be written in their original language if the graph is Latin.

• Supplement of a volume Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117.

• Supplement of a number Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma.

Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531.

• Number without volume

Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14.

• Without number neither volume Browell DA, Lennard TW. Inmunologic status of the cancer fish patient and the effects of blood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33.

• Paging in Roman numbers

Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology.

Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII.

Laborales. (Boletín Oficial del Estado, número 269, de 10-11-95).

Unpublished Material • In press Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007.

• Journal article in electronic format Author. Title. Name of the journal in abbreviate form (support type) year (access date); volume (number): pages or extension indicator. Available in: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia.

MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26).

URL disponible en: http://www.cdc.gov/ mmwr/preview/mmwrhtml/00048303. htm

• Indication of the article type as it corresponds

Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337.

Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN) (abstract). Kidney Int 1992; 42: 1285.

• Legal documents Laws: LawTitle. (Name of the Official Bulletin, date, year of publication).

Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos

• Map Name of the map (map type). Publication Place: Editorial; year.

Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico).

Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003.

• Monograph in electronic format Title. (Support type). Editors or producers.

Edition. Version. Publication place: Editorial; year.

Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CD-ROM).

Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0.

Hagenstown: Lippincolt-Raven; 1997.

• Informatics file Author.Title. (support Type). Version.

Place: Editorial; year.

• Thesis of Master, Doctorate and under Graduate works Author(s) title, faculty, department, year.

Arrieta G. Producción de Verotoximas en Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

9. Photographs: Pictures can be use, of excellent digital quality. The identification,

3255 sequence and titles should settle down clearly to locate the place that corresponds in the content of the article.

The photographs will take the title of figure.

10. Evaluation of articles: Those manuscripts submitted to the Journal, after verifying that they fulfill the expressed norms of the Journal MVZ Cordoba will be subject to peer reviews of the Scientific Committee for its evaluation. In the event of receiving some manuscript that by its special content cannot be evaluated by the members of the committee it will be remitted to appraisers belonging to the national or international scientific community.

In the writing of the content the international norms will be respected for scientific manuscripts that regulate the abbreviations, mentioned literature, symbols, atomic, zoological, botanical, chemical nomenclatures, among others. The values should be informed in units of the metric decimal system and in accordance with the International System of Units.

The Journal MVZ Cordoba and the Universidad de Córdoba don’t take the responsibility for opinions and results expressed by the authors, which will be exclusive responsibility of them.

Conflict of interests. The authors should express the possible interests that possess in the work made by them.

Correspondence: Articles, consultations, explanations and general correspondence should be sent to the address below, however, the works can also be remitted in electronic form to the editor or the coeditor. http://www.unicordoba.edu.co Editorial Committee REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Telephones: (094) 7561167, 756 07 10 http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/ revistamvz/index.htm Apartado Aéreo 354 Editor Marco González Tous. M.Sc. editormvzcordoba@gmail.com