In vitro

TÉCNICAS DE MICROPROPAGACIÓN Aplicaciones del cultivo in Vitro

En el número anterior vimos como podíamos iniciarnos en el cultivo in Vitro de plantas, a través de la disminución de las condiciones estériles requeridas gracias al uso de agua oxigenada. Una vez iniciados, veremos las diferentes aplicaciones que se le pueden dar a este tipo de cultivo, haciendo hincapié en las distintas técnicas de micropropagación. Bud Spencer

Conclusiones sobre el uso de agua oxigenada

Los recipientes se pusieron bajo una mezcla de fluorescentes de luz cálida

y luz fría, con un régimen de luz de 20 horas al día. Los explantos no necesitan mucha luz ya que la mayor parte de los

azúcares necesarios para su crecimiento se incluyen en el medio de cultivo en forma de sacarosa, por lo que una mínima actividad fotosintética es suficiente y el hecho de que los tarros tengan una tapa opaca no debería preocuparnos.

No se pusieron medios para la estabilización de la temperatura, pero esta se mantuvo entre 22 y 28 ºC, siendo la optima 25 ºC.

Tras cuatro semanas en estas condiciones no se observó ningún tipo de contaminación, ni siquiera en el tarro que no había sido esterilizado, aunque por otro lado el crecimiento de los explantos fue prácticamente nulo, en principio debido a que la cantidad de citoquininas producidas por los mismos al carecer de raíces y la baja cantidad aportada por la levadura de cerveza era poco más que suficiente. Seguramente hubiéramos obtenido una mayor tasa de crecimiento introduciendo alguna citoquinina sintética o induciendo el enraizamiento. indicios carenciales de magnesio y una ligera contaminación bacteriana en sólo dos de los tarros, por los que estos fueron desechados. Aunque el crecimiento de los

explantos haya sido mínimo, el porcentaje de contaminación fue muy bajo, por lo que utilizando un medio más apropiado

y añadiéndole agua oxigenada podría ser un método viable para la realización de cultivo in Vitro en el ámbito casero.

Tarros en cámara madre.

Los explantos no necesitan mucha luz ya que la mayor parte de los azúcares necesarios para su crecimiento se incluyen en el medio de cultivo en forma de sacarosa

Detalle del crecimiento de la primera hoja.

Aplicaciones del cultivo in Vitro

Inicialmente estas técnicas se utilizaron para la realización de estudios fisiológicos, observando las diferencias producidas al utilizar diferentes medios de cultivo y condiciones climáticas. Gracias a estos experimentos se pudieron determinar los distintos efectos que producían distintas concentraciones de reguladores del crecimiento; así una alta concentración de auxinas en relación con la de citoquininas producía la formación de raíces (rizogénesis), al contrario fomentaba la formación de tallo (caulogénesis) y un equilibrio de las mismas daba lugar a la producción de callo, una masa de células sin diferenciar. Además, al retirar o reducir la concentración de auxina de un medio donde se estuviera cultivando callo, daba origen a embriones somáticos (embriogénesis), formados por una pequeña raíz y cotiledones, genéticamente idénticos a la planta de la que proceden. Posteriormente se utilizaron para la obtención de plantas haploides (con un solo juego de cromosomas) a partir de partículas de polen y de plantas transgénicas, bombardeando masas de callo con fracciones de ADN (microbalística) o a través de la aplicación de bacterias modificadas de Agrobacterium tumefaciens, una bacteria capaz de introducir fracciones de su material genético en las células vegetales que infecta.

A través del cultivo de suspensiones celulares en medios líquidos se pudieron desarrollar los métodos para el cultivo de protoplastos, células que no poseen pared celular, y con los que se pudieron obtener los primeros híbridos somáticos, producidos por la unión de dos células a través del cultivo in Vitro, lo que permitía incluso hibridar entre sí especies diferentes. También se produjeron las primeras células cíbridas, for-

madas por el citoplasma de una célula y el núcleo de otra.

Otra aplicación que se desarrolló gracias a este sistema fue la producción industrial de metabolitos secundarios, compuestos orgánicos no necesarios para las funciones primarias de un organismo como son el crecimiento y la reproducción. En el caso de las plantas estos compuestos pueden dividirse en tres grupos: - Terpenoides, como el THC o los terpenos que forman los aceites esenciales. - Alcaloides, como la cocaína, la morfina, la triptamina o la atropina. - Compuestos fenólicos, como la vainillina, el ácido salicílico o los flavonoides.

Debido a la preocupación por la pérdida de biodiversidad a nivel mundial, el cultivo in Vitro también es utilizado para la conservación de recursos fitogenéticos, debido a la capacidad de conservar plantas que no producen semillas o clones selectos en muy poco espacio, y a que se pueden cultivar fácilmente especies que crecen en medios y climas extraños. Además ofrece la posibilidad de conservar material genético prácticamente intacto durante años en condiciones de vida suspendida gracias a la crioconservación, donde el material vegetal es introducido en recipientes herméticos a temperatura ultra baja, alrededor de los -196 ºC, mediante nitrógeno líquido.

El cultivo de meristemos, tejidos responsables de crecimiento vegetal, permite la obtención de plantas libres de virus y viroides, ya que su crecimiento activo impide la infección de todas sus células, pudiéndose aislar aquellas que se mantienen sanas.

Otro uso muy extendido es el de la germinación de orquídeas. Las semillas de éstas son tan pequeñas que necesitan la simbiosis con un hongo que las provea de nutrientes en los primeros estadios de la germinación. Gracias al cultivo in Vitro se puede simular dicha situación intro-

duciendo en el medio de cultivo hongo simbiótico aislado o añadiendo todos los nutrientes necesarios.

Pero la aplicación más importante y más utilizada es la de la micropropagación. Con ella se pueden multiplicar plantas conservando el genotipo de las mismas a una velocidad sin precedentes y en un espacio muchísimo menor que con cualquier otro método de multiplicación vegetativa convencional.

Para el cultivo de vástagos apicales suelen utilizarse tarros.

Etapas de la micropropagación

La primera etapa consiste en la selección y preparación de la planta madre de donde se extraerán las porciones de material vegetal que serán cultivadas posteriormente. Es importante que estas sean vigorosas y estén libres de enfermedades para que los explantos se desarrollen lo mejor posible.

La segunda etapa es el establecimiento del cultivo aséptico, donde se desinfectará el material vegetal y se introducirá en recipientes con medio de cultivo estéril.

La tercera etapa es la multiplicación, donde los explantos cultivados in Vitro se utilizan como material de partida para los nuevos subcultivos. Es necesaria la trasferencia periódica del material vegetal a medio de cultivo fresco porque si no acabaría ocupando todo el espacio del recipiente, los nutrientes se agotarían y el agente gelificante, en caso de usarse, se desecaría. Por lo tanto el subcultivo suele realizarse cada cuatro semanas, separando el material vegetal en varias fracciones que darán lugar a una mayor cantidad de explantos. Este proceso puede llevarse a cabo indefinidamente, aumentando exponencialmente su número antes de dar paso a la siguiente etapa.

La cuarta etapa es la del enraizamiento, donde los explantos se transfieren a un medio distinto al utilizado en la fase anterior para inducir la producción de raíces. Este proceso puede realizarse in Vitro o ex Vitro. En ambos casos es conveniente añadir al medio algún tipo de auxina, como son los ácidos indolacético (IAA), indolbutírico (IBA) o naftalenacético (NAA). En el caso de hacerlo ex Vitro, se haría con sustratos habituales como la turba o el coco, no necesariamente estériles, siendo recomendable la adición al medio de bacterias u hongos beneficiosos o de alguna sustancia fungicida de amplio

espectro, para evitar contaminaciones de última hora. También habrá que tener mucho cuidado con la humedad relativa del aire ya que las pequeñas plantas están acostumbradas a una humedad relativa cercana al 100%, por lo que se utilizarán pequeños invernaderos o sistemas automáticos de nebulización.

La última etapa es la de endurecimiento, que consiste en transplantar y aclimatar paulatinamente las plantas a la humedad relativa ambiental.

Cultivo horizontal de nudo.

Técnicas de micropropagación

El objetivo final de la micropropagación es obtener plantas enteras y sanas, clones idénticos genéticamente a la planta madre. Para ello se utilizan las siguientes técnicas:

- Cultivo de vástagos o yemas. Los vástagos están formados básicamente por un tallo y por lo menos una yema. En este caso se emplean como explantos primarios, vástagos con una yema apical y una o dos yemas laterales. También pueden emplearse las propias yemas. Es con esta técnica con la que se pueden conseguir plantas libres de virus si se cultiva inicialmente el fragmento de la yema correspondiente a los primeros dos mm, donde reside el meristemo primario que da lugar al crecimiento de nuevos brotes. Se suele adicionar al medio alguna auxina y alguna citoquinina como la zeatina en la etapa de establecimiento del cultivo, para luego en la siguiente etapa, eliminar completamente la auxina y aumentar la concentración de citoquinina para contrarrestar la dominancia apical y conseguir la ramificación por el crecimiento de brotes laterales. Con ello se consigue un mayor número de brotes y yemas que poder subcultivar. - Cultivo de nudos. En este otro caso se emplean vástagos con una o varias yemas laterales y se cultivan sin ramificar durante la etapa de establecimiento hasta que tienen entre 5 y 10 cm de longitud. En la siguiente etapa se pueden cultivar los vástagos horizontalmente para que sus yemas crezcan de forma vertical o se pueden dividir en secciones nodales que serán subcultivadas individualmente, retirando normalmente la formación de vástagos sobre segmentos de varios órganos: hojas, tallos o raíces. A este proceso se le denomina organogénesis y es muy dependiente del genotipo de la planta madre. En estos cultivos se utiliza habitualmente una mezcla de giberelina con citoquinina y puede aparecer algo de callo junto al órgano, que deberá desecharse al hacer los siguientes subcultivos, en los que se utilizará cualquier porción del explanto en el que se puedan inducir vástagos nuevamente. - Inducción indirecta de vástagos adventicios. En este caso se induce la formación de callo en el explanto primario y se reproduce el mismo para posteriormente formar nuevos vástagos sobre él en un proceso denominado morfogénesis. Para ello se selecciona y reproduce la parte de callo que sea morfogénica, que suele tener una consistencia granular. Esta capacidad morfogénica suele perderse con el tiempo. Con este método existe un mayor riesgo de cambios genéticos, hecho que se conoce como variación somaclonal. - Inducción indirecta de embriones somáticos. Consiste en la formación de embrioides a partir de callo embriogénico, que tiene una consistencia nodular y se puede inducir a partir de tejidos meristemáticos jóvenes cultivados en un medio con alta concentración de auxina. Posteriormente para inducir el desarrollo embrionario se va reduciendo paulatinamente la concentración de auxina del medio de los siguientes subcultivos y se le añade una fuente de nitrógeno reducido como amonio o aminoácidos, para luego inducir la maduración de los embrioides en un medio con ácido abscísico y alta concentración de azucares, que inhiben la germinación precoz y favorecen la acu-

Para el cultivo vertical de nudos suelen utilizarse tubos de ensayo.

las hojas. En este tipo de cultivo si se requieren reguladores de crecimiento, se utilizará una mezcla de auxina y citoquinina en ambas etapas. Como en este caso lo que interesa es la elongación de los tallos, se puede añadir una giberelina como el ácido giberélico para fomentar la separación internodal. - Inducción directa de vástagos adventicios. Con esta técnica se puede inducir mulación de reservas. Estos embrioides pueden ser encapsulados con una cubierta de pectato cálcico para formar semillas artificiales. - Inducción directa de embriones somáticos. Consiste en la formación de embrioides a partir de tejido de plántulas como el hipocótilo o los cotiledones y es una técnica muy poco utilizada porque funciona en muy pocas especies.