Agrobiotecnología by santiago fernandez

Agrobiotecnología Curso 2011

Cultivo de tejidos vegetales I María Mercedes Rivero

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

Sumario

Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales Micropropagación vegetal Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis Sistemas de micropropagación vegetal. Proliferación de yemas axilares o apicales Sistemas de micropropagación vegetal. Proliferación de yemas axilares o apicales

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Sistemas de micropropagación vegetal Cultivo de meristemas Sistemas de micropropagación vegetal Liberación de patógenos

Sumario Conservación de germoplasma Cultivo in vitro de células haploides y de embriones -Cultivo de anteras -Cultivo de polen -Cultivo de óvulos -Cultivo de embriones

Semillas sintéticas Cultivo de protoplastos Variación somaclonal Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Referencias

Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro

• Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciación / Rediferenciación

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

Fundamentos teóricos y prácticos del cultivo de tejidos vegetales

• La teoría de la totipotencialidad celular, enunciada por Haberlandt a principios del siglo XX, postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro, sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc. • La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la redifereciación de las células previamente desdiferenciadas.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.

Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales

• Micropropagación vegetal • Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis) • Cultivo de meristemas • Cultivo de suspensiones de células vegetales • Cultivo de protoplastos • Cultivo de anteras • Cultivo de óvulos y embriones

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Micropropagaci贸n vegetal

Agrobiotecnolog铆a Cultivo de tejidos vegetales

La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtención y cultivo de plantas a gran escala. • Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperíodo.

Alcances de la micropropagación vegetal

• Propagación vegetativa rápida y a gran escala • Uniformidad seleccionada del material clonado • Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales • Reducción en el tiempo de multiplicación y en el espacio requerido para tal fin • Mayor control sobre la sanidad del material propagado • Introducción rápida de nuevos cultivares

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Conservación de germoplasma • Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal

Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

La micropropagación requiere una infraestructura mínima especializada y condiciones controladas de cultivo

• Laboratorio - Area de preparación de medios - Area de lavado y esterilización - Cuarto estéril - Cámara de cultivo - Area de rusticación

• Material vegetal - Plantas madres seleccionadas (preacondicionamiento) - Explantos (elección, disección, esterilización, etc.)

• Condiciones de cultivo Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Asepsia - Recipientes - Temperatura - Luz y fotoperíodo

Medios de cultivo: composición general

Compuestos inorgánicos Macronutrientes: NO4- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Mo2+, Co2+, ICarbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotínico (C) Biotina Aminoácidos Glicina

Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semisólidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite® pH 5,6 – 5,8 Esterilización 1 atmósfera, 15 a 20 min en autoclave

Formulación básica de un medio de cultivo para tejidos vegetales

• Soluciones concentradas de macroelementos (100x) • Soluciones concentradas de microelementos (100x) • Vitaminas grupo B (500 ó 1000x) • Mio-inositol (100 mg/L) • Azúcares: sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extraído a partir de algas. Se usa entre 5 y 10 g/L

Propiedades físicas de los medios de cultivo

Semisólido Consistencia del medio Líquido • El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). • En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del ágar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.)

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías: - Inducción de embriogénesis - Cultivo de protoplastos - Cultivo de suspensiones celulares

Propiedades físicas de los medios de cultivo

• Intercambio gaseoso: Los recipientes de cultivo se tapan con un film de polietieleno (Resinite ) para posibilitar el intercambio de gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado. - La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno - La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes

• pH: - Constituye un factor crítico - Se ajusta en el rango 5,5-5,8 - Se modifica durante el crecimiento de los cultivos

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Composici贸n de medios de cultivo com煤nmente usados Concentraci贸n en el medio de cultivo (mg/L) Compuesto White

Schenk y Hildebrandt (SH)

Gamborg (B5

Heller

Murashige y Skoog

Ca(NO3)2

142

KNO3

2.500

300

1.900

NaNO3

600

NH4NO3

1.650

NH4H2PO4

300

(NH4)2SO4

134

400

500

250

370

200

150

440

KCl

750

KH2PO4

170

NaH2PO4.H2O

150

125

MnSO4.H2O

MnSO4.4H2O

0,1

22,3

0,75

0,01

0,83

H3BO3

6,2

ZnSO4.7H20

8,6

CuSO4

0,2

0,025

CuSO4.5H2O

0,03

0,025

NaMoO4.2H2O

0,1

0,25

MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O

Composici贸n de medios de cultivo com煤nmente usados Concentraci贸n en el medio de cultivo (mg/L) Compuesto White

Schenk y Hildebrandt (SH)

Gamborg B5

Heller

Murashige y Skoog (MS)

CoCl2.6H2O

0,1

0,025

AlCl3

0,03

NiCl2.6H2O

0,03

FeCl3.6H2O

FeSO4.7H2O

27,86

2,46

Sequestrene 330 Fe

Na2EDTA

37,26

Mio-inositol

1.000

100

Tiamina-HCl

0,4

Acido nicot铆nico

Piridoxina-HCl

0,5

100

20.000

30.000

20.000

30.000

5,9

5,5

Fe(SO4)3

Extracto de Levadura Sacarosa pH

5,8

Reguladores del crecimiento comúnmente usados en medios de cultivos vegetales Clase

Nombre

Abreviatura

Peso Molecular

Rango de concentración (M)

Auxina

Acido clorofenoxiacético

pCPA

186,6

10-7-10-5

Acido 2,4diclorofenoxiacético

2,4-D

221,0

10-7-10-5

Acido indol 3-acético

AIA

175,2

10-7-10-5

IBA

203,2

10-7-10-5

NAA

186,2

10-7-10-5

Acido β-naftoxiacético

NOA

202,2

10-7-10-5

6-bencilaminopurina

BAP

225,2

10-7-10-5

N-isopentenilaminopurina

2iP

203,3

10-7-10-5

6-furfurilaminopurina (kinetina)

215,2

10-7-10-5

Zeatina

Zea

219,2

10-7-10-5

Acido 3-indolbutírico Acido 1-naftalenoacético

Citoquininas

Giberelina

Acido giberelico

GA3

364,4

10-7-5x10-6

Preparación de solución stock

Comentarios

Las auxinas son usualmente tituladas en solución con NaOH

El AIA puede ser oxidado por células vegetales. Es frecuentemente usado como única fuente de auxinas en el medio de cultivo

Las citoquininas son normalmente disueltas en NaOH diluídas o en etanol acuoso

La zeatina es termolábil y no debería ser autoclavada

Soluble en agua

Es termolábil, no debe ser autoclavada. Es comúnmente necesario para la iniciación o el mantenimiento de callos y cultivos en suspensión. Algunas veces necesario para la regeneración de plántulas.

Reguladores del crecimiento

• Grupos básicos de reguladores del crecimiento: - Auxinas - Citoquininas - Giberelinas - Acido abscísico - Etileno • Generalidades: - Actúan a bajas concentraciones - Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta. - Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.

Las auxinas se emplean como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis

Acido indol acético (AIA) (auxina endógena)

• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleoptile de gramíneas. - Alargamiento y división celular - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formación de raíces adventícias - Dominancia apical - Acción herbicida - Estimulación de la producción de etileno • Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Su transporte es polar • Auxinas sintéticas: - Acido indol butírico (IBA) - Acido naftalen acético (ANA) - 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

Las citoquininas determinan diferentes respuestas morfogenéticas en combinación con las auxinas

• Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro. • Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas: - Promoción de la división celular - Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia - Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos • Citoquininas endógenas: - Zeatina (Zea) - Isopenteniladenina (2iP) • Citoquininas sintéticas: - Kinetina (Kin) - Benziladenina (BAP)

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran en todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g/Kg. • Su transporte es no polar.

Las giberelinas favorecen el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes

O Acido giberélico (GA3) C O

HO H

H CH3

H COOH CH3

• Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. • El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberelinas diferentes. • Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales - Crecimiento de yemas latentes - Germinación de semillas en dormición - Floración - Movilización de reservas en la semilla

• Se sintetizan en hojas jóvenes, en yemas y en el embrión. • Su transporte no es polar.

Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores

AgrobiotecnologĂa Cultivo de tejidos vegetales

El proceso de micropropagación de especies vegetales consta de varias etapas

Elección de una planta madre selecta Explantos ETAPA 1

Desinfección superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicación ETAPA 2

Formación de brotes o embrioides

Agrobiotecnología

ETAPA 3

Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes

ETAPA 4

Pasaje a maceta en un invernáculo

Cultivo de tejidos vegetales

Elección del explanto inicial

Escarificación

MS + 2,4-D

Esterilización Tritón X-100 3%, 10 min Hipoclorito de Na 15%, 20 min

Semillas estériles Germinación Esterilidad

Medio de Hoagland

% de germinación? M. apical Hoja M. axilar Tallo Raíz M. radicular

Disección bajo lupa

Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo

• Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal: - Etanol 70%, entre 5 y 10 seg. - Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. - Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.

Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro Ambiente Respuesta • Sin respuesta • Cultivo infectado • Regeneración indirecta

Explanto (asepsia)

• Regeneración directa

Cultivo

Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Existen dos posibles vías morfogenéticas para la diferenciación de novo de brotes o plantas completas

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Posibles vías morfogenéticas: - Organogénesis - Embriogénesis • Diferencias entre las dos posibles vías: - La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas. - La embriogénesis se presupone de origen unicelular. Una célula del explanto se aísla y constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa.

Fotomicrografías de las dos vías morfogenéticas Organogénesis d

Embriogénesis av

pf pf

Propagación vegetativa por embriogénesis somática

Explanto (disco de hoja) Callo

Explanto (células vegetales)

REGENERACIÓN

Suspensión celular

Embriones somáticos GERMINACIÓN ENCAPSULACIÓN

GERMINACIÓN

Semilla artificial

Sistemas de micropropagaci贸n vegetal Proliferaci贸n de yemas axilares o apicales

Agrobiotecnolog铆a Cultivo de tejidos vegetales

Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes

• Proliferación de yemas apicales o axilares - Consiste en la multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemas. - La tasa de multiplicación (tm) se calcula en base al número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Por ejemplo, con una tm de 5/mes podrían obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año a partir de una única yema inicial. - El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta técnica.

Sistemas de micropropagaci贸n vegetal Proliferaci贸n de tejidos desdiferenciados

Agrobiotecnolog铆a Cultivo de tejidos vegetales

Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro

• Consideraciones generales: - Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, células en suspensión, etc.) - Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos. - Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta Explanto (suspensión de células)

Explanto (disco de tejido)

Regeneración directa

Regeneración indirecta

Formación directa de brotes

Callo

Formación indirecta de brotes Planta regenerada

Sistemas de propagaci贸n vegetativa in vitro

Agrobiotecnolog铆a Cultivo de tejidos vegetales

Propagaci贸n vegetativa in vitro Regeneraci贸n directa e indirecta

Sistemas de micropropagaci贸n vegetal Cultivo de meristemas

Agrobiotecnolog铆a Cultivo de tejidos vegetales

El empleo de meristemas como explantos es una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas

Cultivo de meristemas Meristema apical

Meristema axilar

AgrobiotecnologĂa Cultivo de tejidos vegetales

Domo meristemĂĄtico

Los meristemas son grupos de células indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta

Los meristemas determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos

• Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Constituyen el explanto ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos o bacterias. • Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservación y conservación de germoplasma.

Aplicaciones del cultivo de tejidos: Liberaci贸n de pat贸genos

Agrobiotecnolog铆a Cultivo de tejidos vegetales

El cultivo de meristemas facilita la eliminación de patógenos

- El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción).

- El número de partículas virales es menor en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.

El cultivo de tejidos posibilita el saneamiento de las plantas multiplicadas vegetativamente

Mediante esta técnica es posible sanear plantas infectadas sistémicamente por diferentes tipos de patógenos como bacterias, hongos, virus y viroides. Síntomas producidos por el Tomato mosaic virus.

Partículas de Potato virus Y

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

El tratamiento de plantas madres puede efectuarse por distintas técnicas

El material vegetal infectado por virus, bacterias, hongos y/o micoplasmas puede ser tratado con diferentes técnicas:

• Termoterapia • Quimioterapia • Cultivo de meristemas

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Estos tratamientos pueden usarse por separado, pero incrementan su efectividad notablemente cuando se los combina, trabajando in vivo e in vitro.

Consideraciones prácticas para el saneamiento de plantas madres por termoterapia

• Termoterapia El tratamiento por calor es un método eficaz para inactivar algunos virus y viroides. Se debe elegir una temperatura y tiempo de tratamiento tales que la planta sea capaz de sobrevivir, pero que permita la inactivación del virus.

Ejemplo: El tratamiento de plantas madres de Solanum tuberosum a 8ºC durante 4 meses permiten obtener un 30% de platas libres de Potato spindle tuber viroid (PSTV).

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Sintomas inducidos por PSTV en tubérculos de papa

Aspectos prácticos del saneamiento de material vegetal por quimioterapia

• Quimioterapia Esta técnica implica el tratamiento de las plantas madres o explantos (in vivo o in vitro) con las siguientes sustancias: - Fungicidas en el caso de hongos - Insecticidas frente al ataque de insectos - Antibióticos en el caso de bacterias - Inhibidores metabólicos (actinomicina D)

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Análogos de aminoácidos (fluorofeniladenina)

La metodología de saneamiento empleada debe ser evaluada

• Las plantas regeneradas in vitro deben ser evaluadas para comprobar si ha sido eliminado el patógeno considerado. • Estas pruebas se denominan ensayos de indización (indexing) y difieren según el sistema huesped-patógeno de que se trate. • Se incluyen entre estas pruebas: - Selección visual u observación de síntomas - Empleo de hospedantes indicadores

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Métodos serológicos - Microscopía electrónica

Observación visual

• Consiste en la observación de síntomas. • Se trata de un método impreciso. • Resulta confiable en el caso de enfermedades que inducen síntomas muy característicos o conspícuos. Potato Virus X

Coliflower Black Rot Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Enfermedades bacterianas y/o virales con síntomas distintivos

Mosaico clorótico producido por Tomato mosaic virus en tomate

Síntomas de pie negro y podredumbre blanda causados por Erwinia carotovora en papa.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Pie negro

Tubérculo inoculado con E. carotovora

Tuberculo no inoculado

Síntomas de enfermedades causadas por hongos

Antracnosis en Fragaria spp. causada por Colletotrichum

Síntomas en estolones

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Síntomas en frutos

Powdery Mildew en Solanum tuberosum causado por Erysiphe spp.

Síntomas de enfermedades causados por nematodes

Disminución de tamaño causada por nematodes en maíz

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Micrografías de un nematode del género Trichodorus (tamaño aproximado: 0,5 µM de diámetro, 1 mm de largo).

Empleo de hospedantes indicadores

• Es una técnica frecuentemente utilizada para detectar virus que pueden transmitirse mediante el jugo infeccioso extraído de plantas enfermas.

• Se usan como indicadoras variedades muy susceptibles de la especie estudiada u otras especies que desarrollan síntomas característicos en un corto tiempo.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Los síntomas inducidos en la planta indicadora revelan la presencia del patógeno y permiten identificarlo.

Métodos serológicos

• Se basan en la alta especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo, por la cual un anticuerpo reconoce y se combina sólo con la porción de antígeno que le dio origen. - Pruebas inmunoenzimáticas

(DAS-ELISA) - Floculación de látex sensibilizado (partículas de látex recubiertas por anticuerpos específicos, se observa agregación de partículas con formación de precipitado) - Microprecipitación (gotas de antisuero y antígeno, se observa formación de precipitado) Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Microscopía electrónica

• Observación de partículas virales en extractos vegetales (dip method) • Inmunoelectromicroscopía • Cortes ultrafinos de tejidos vegetales (observación directa del patógeno o de anomalías citológicas o efectos histopatológicos como secuela de la presencia del patógeno) Inclusiones virales detectadas con el microscopio óptico

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Inclusión cristalina del virus del mosaico de tabaco (I) en células epidérmicas de Nicotiana tabacum

Célula de tricoma de Vicia faba con inclusión amorfa (I)

La metodología de saneamiento empleada debe ser evaluada

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Métodos serológicos - Microscopía electrónica

Conservaci贸n de germoplasma

Agrobiotecnolog铆a Cultivo de tejidos vegetales

Conservación de germoplasma

Las técnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales costituyen parte esencial de una estrategia general para la conservación e intercambio de recursos fitogenéticos.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Gentillieza W. Roca

Existen diferentes métodos para la conservación de germoplasma

• Colecciones in vitro • Bancos de semillas • Crioconservación

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales www.cgiar.org

Bancos de germoplasma in vitro

• La conservación de germoplasma mediante el cultivo de tejidos se basa en la limitación del crecimiento del material vegetal.

• Implementación: - Medios de cultivo de composición subóptima - Baja intensidad lumínica (<500 lux) - Temperaturas inferiores a las adecuadas para el activo metabolismo de las células y tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 ºC) Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Alta concentración de compuestos osmóticamente activos (sacarosa, manitol)

Los bancos de semilla permiten la conservación de especies vegetales que se propagan sexualmente

• Resultan de utilidad en el caso plantas cuyas semillas se mantienen viables durante un largo período de almacenamiento. • El material debe mantenerse bajo condiciones controladas en una cámara de mantenimiento: - Bajas temperaturas - Bajo contenido de humedad

• Este método no puede aplicarse a la conservación de plantas cuyas semillas presentan longevidad reducida, especies autoincompatibles o especies de propagación vegetativa obligada

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Crioconservación de germoplasma

• Consiste en el mantenimiento de material vegetal a temperaturas ultrabajas (-196 ºC), por inmersión en nitrógeno líquido • Diferentes explantos (ápices de yemas, meristemas, anteras, embriones inmaduros) así como callos y suspensiones celulares pueden ser crioconservados a -196 ºC.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

www.science.siu.edu

Etapas del proceso de crioconservación de material vegetal

• Crioprotección • Congelamiento • Almacenamiento • Descongelamiento • Pruebas de viabilidad

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Recultivo

Crioconservaci贸n y cultivo de meristemas de soja

Cultivo in vitro de cĂŠlulas haploides y embriones

AgrobiotecnologĂa Cultivo de tejidos vegetales

Aplicaciones del cultivo in vitro de células haploides

• Mejoramiento vegetal.

• Estudios de genética cuantitativa.

• Estudios de diferenciación celular y alternancia de generaciones.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Tétradas de microsporas Sacos polínicos (con granos de polen)

Cultivo in vitro de anteras

Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en medios sintéticos que promueven la división celular y la formación de embriones o callos. Los embriones, transferidos a un medio de regeneración, darán lugar a plantas haploides.

anteras

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Condiciones que afectan el cultivo de anteras

- Genotipo de las plantas donantes - Fisiología de las plantas donantes - Caracterización citológica y bioquímica de etapas muy tempranas del desarrollo de los granos de polen - Pretratamiento de las anteras con altas o bajas temperaturas o con choque osmótico

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Medios de cultivo con alto contenido en osmóticos para la inducción de callos y menores concentraciones de sacarosa para la regeneración de plantas

El cultivo de anteras ofrece numerosas ventajas para el mejoramiento de plantas de interés comercial

- Permite la expresión e identificación de alelos recesivos - Constituye una fuente útil para el mejoramiento intravarietal - Permite la rápida introducción de caracteres citoplasmáticos en un fondo genético homocigótico - Crea y acrecienta las reservas citogenéticas y citoplasmáticas de los cultivos

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- La obtención de haploides duplicados resulta útil para el desarrollo de nuevas variedades con el fin de distribuirlas en ambientes ecológicos muy diversos y para ensayarlas en ellos. - Las microsporas o células haploides pueden usarse para la inducción de mutantes y para la selección de caracteres esporofíticos.

El cultivo de embriones inmaduros permite realizar diferentes aplicaciones

• Estudio de requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo. • Rescate de embriones híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos. • Produción de monoploides. • Superación de la latencia de las semillas.

Embrión cigótico

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Corte longitudinal de una semilla de Brassica

Aplicaciones del cultivo de óvulos

• Rescate de embriones (mediante polinización y fertilización in vitro) • Inducción de la embriogénesis somática a partir de nucelos de diferentes especies vegetales.

es Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Embriones somáticos (es) obtenidos a partir del cultivo de óvulos de Arabidopsis.

Semillas sintĂŠticas

AgrobiotecnologĂa Cultivo de tejidos vegetales

Semillas sintéticas Embriones somáticos de Pinus sp

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Las semillas artificiales reproducen la estructura de una semilla de origen sexual

Agrobiotecnolog铆a Cultivo de tejidos vegetales

Las semillas artificiales poseen una cubierta de protecci贸n, contienen sustancias de reserva y portan un embri贸n en su interior.

Procedimiento para encapsular embriones somĂĄticos

AgrobiotecnologĂa Cultivo de tejidos vegetales

Cultivo de protoplastos

AgrobiotecnologĂa Cultivo de tejidos vegetales

Los protoplastos son células vegetales desprovistas de pared celular

Suspensión de protoplastos de mesófilo de tabaco

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Protoplastos de la línea celular By2

Protoplasto de mesófilo de tabaco

Los protoplastos constituyen un explanto ideal para diferentes fines biotecnológicos

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Esquema general de la manipulación genética de protoplastos in vitro para la realización de técnicas de mutagénesis, fusión o transformación.

Métodos para el aislamiento de protoplastos

• Método mecánico - Bajo rendimiento - Procedimiento tedioso - Aplicabilidad limitada Choque osmótico para producir plasmólisis celular y ruptura de la pared. Los protoplastos se liberan de las células rotas mediante el restablecimiento de su nivel osmótico.

• Método enzimático Consiste en la incubación de las células en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular: celulasas, hemicelulasas y pectinasas. Las preparaciones comerciales de dichas enzimas contienen además proteasas, nucleasas y lipasas.

Pasos implicados en el aislamiento de protoplastos de mesófilo de tabaco

• Protocolo para la obtención de protoplastos . de mesófilo de hoja de tabaco: - Esterilizar superficialmente el explanto (hojas jóvenes de tabaco). - Remover la epidermis abaxial. Cortar secciones de hoja. Disponer los explantos en un regulador osmótico. - Disponer las secciones de hoja en una placa de Petri conteniendo la solución mezcla de enzimas y medio nutritivo para el cultivo de protoplastos en una proporción 1:1. - Incubar con la mezcla de enzimas durante 4 a 12 h en oscuridad, a 22-25ºC, a 50 rpm. Observar la liberación de los protoplastos en un microscopio invertido.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

- Lavar los protoplastos cuidadosamente tamizándolos y centrifugándolos a 100 g. Usar las soluciones formuladas para tal fin. - Remover el sobrenadante y resuspender los protoplastos en medio de cultivo.

Variaci贸n somaclonal

Agrobiotecnolog铆a Cultivo de tejidos vegetales

La variación somaclonal puede explicar la variación fenotípica de las plantas regeneradas in vitro

Entre otras causas: • Modificaciones genéticas heredables por las progenies de las plantas obtenidas mediante cultivo in vitro • Prevalencia del cariotipo específico de plantas y tejidos quiméricos y de mosaicos • Cambios en el cariotipo, debidos a una respuesta diferencial a los procedimientos de cultivo (composición del medio, etc.)

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Aneuploides no separables en el cultivo

Otra posibles causas de la variabilidad de las plántulas regeneradas

• Cese mitótico que lleva a líneas poliploides • Mutaciones del cariotipo • Amplificación o disminución de genes • Reordenamiento de mutaciones en genomas de organelas • Transposones

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

• Inversiones, traslocaciones y otros accidentes cromosómicos

Características de la variación somaclonal • Indeseable en la micropropagación de plantas de interés comercial (diversidad genotípica)

• Potencial para el mejoramiento vegetal cuando se trata de verdaderas modificaciones del material genético (variabilidad) Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

Referencias

Agrobiotecnología

Altman, A. and Loberant, B. Micropropagation: clonal plant propagation in vitro. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 2: 19 – 40 Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.

Cassells, A. S. In vitro production of pathogen-free plants. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 4: 57 – 82. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.

Doods, J. H. and Roberts, L. W. Experiments in Plant Tissue Culture. Cambridge University Press. Cambridge, U.S.A. 1992.

Herrera Estrella, A. and Chet, I. Biocontrol of bacteria and phytopathogenic fungi. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 11: 263 – 282. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.

Litz, R. E. Cultivo de embriones y óvulos. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 12: 295 – 312, 1991.

Roca, W. M., Núñez, V. M. & Mornan, K. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 11: 271 – 294, 1991.

Sasson, A. Biotechnology and Natural Products. Prospects for Commercial Productio, ACTS, African Centre for Technology Studies. Nairobi, Kenya. 1992.

Scragg, A. H. Large scale plant tissue culture. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 9: 225 – 249. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.

Cultivo de tejidos vegetales