Cultivo in vitro: propagación de plantas
Hojas de enraizando
crisantemo
Plántula de crisantemo en envase Magenta
Un cultivo in vitro es aquel realizado sobre un medio nutritivo en condiciones estériles. Puede ser de: plantas, semillas, embriones, órganos, explantos, células y protoplástos.
Características del cultivo in vitro: Es empleado a microescala Hay optimización ambientales
de
las
condiciones
No se produce el patrón normal de desarrollo de una planta Hace factible la manipulación de las célula individuales o tejidos. Fundamental para transformación genética.
Pioneros del Cultivo in vitro
Tipos de Cultivo in vitro. Propagación y regeneración de plantas Plantas regeneradas ORGANOGÉNESIS Callos
EMBRIOGÉNESIS Suspensión de células Protoplastos
Explantos: trozos hojas, tallos, meristemos, etc.
Microesporas/gametos Planta donante
Suspensi贸n de c茅lulas
Callos
Protoplastos
Explantos: trozos hojas, tallos, meristemos, etc.
Microesporas/gametos
Condiciones de los cultivos in vitro
¡¡ESTERILIDAD!!
Esterilizaci贸n del material vegetal Se emplean medios nutritivos muy ricos, por lo que la esterilizaci贸n de todo el material es esencial
TOTIPOTENCIA Capacidad de las células vegetales de regenerar un organismo completo.
REPROGRAMACIÓN DESARROLLO Se altera el patrón de células que estaban completamente diferenciadas.
COMPETENTES No todas las células que responden al cambio de programa de desarrollo.
Diferenciación
Morfogénesis
Cambios de forma y función de orgánulos, células y tejidos
Organización de la estructura de tejidos y órganos. Arquitectura y simetría de la planta
DESARROLLO Crecimiento Incremento biomasa por división y elongación celular
Microescala
Auxinas Se transporta polarmente desde el ápice de parte
aérea o raíz. El transporte de larga distancia se produce por el
floema. Junto con las citoquininas son esenciales para la
viabilidad de las plantas: no hay mutantes deficientes. La estructura química de las auxinas es diversa. Pueden
acumularse en formas inactivas conjugadas a oligosacáridos y aminoácidos.
Auxinas naturales encontradas en plantas
Auxinas sintetizadas quĂmicamente
Proliferaci贸n de ra铆ces secundarias Control [Auxina] > 10-8 M causa el inicio de divisiones celulares en el periciclo. Regeneraci贸n de plantas favoreciendo el enraizamiento
Alta [auxina]
Interacción con citoquinina y ácido abscísico en la dominancia apical de tallo Escisión del ápice causa proliferación de tallos axilares
La auxina está implicada en la redistribución de las citoquininas sintetizadas en la raíz hacia el ápice. Escisión del ápice: mayor nivel de citoquinina en las yemas laterales. El ácido abscísico se acumula en las yemas laterales latentes. La escisión del ápice disminuye su contenido.
Citoquininas: descubiertas en cultivos in vitro Las se descubrieron al buscar factores que indujeran divisiones celulares y promoviesen el crecimiento de material vegetal. Se probaron multitud de substancias: extractos de levadura, jugo de tomate, etc. La leche de coco (rica en zeatina) fue muy efectiva, más en conjunción con auxina Skoog descubrió que DNA desnaturalizado de esperma de arenque era muy efectivo en promover división celular La kinetina fue la primera citoquinina identificada producida de síntesis por la degradación térmica de DNA
Diferentes tipos de citoquininas SintĂŠtica
Natural
SintĂŠtica
Bencilamino purina (BAP)
Producciรณn de callos por acumulaciรณn de citoquininas: Agrobacterium
CALLO tejido desdiferenciado en continua divisiรณn. AGALLA tumor producido por la infecciรณn de Agrobacterium tumefaciens por acumulaciรณn de citoquininas y auxinas
En la infección, se produce la inserción de genes bacterianos en el genoma de la célula vegetal, portados en el T-DNA. Éstos codifican enzimas para la síntesis de dichas fitohormonas.
Proliferaci贸n de parte a茅rea
Control
+ Citoquinina
Distintas moléculas tienen diferente actividad Auxinas y citoquininas tienen diferente nivel de actividad biológica según la molécula empleada: establecer la dosis.
Regeneración por organogénesis Concentración de IAA (mg/L) 0,18
1,18
3,0
RAÍZ
0,03
CALLO
0,005
HOJA
0 0,2 1,0
Concentración de kinetina (mg/L)
0
Regeneración de plantas por organogénesis El callo se somete a una relación auxina/citoquinina baja, para inducir la formación de parte aérea. En condiciones de esterilidad, se secciona la parte aérea formada. Se transplanta a un medio de cultivo con una relación auxina/citoquinina alta, para inducir la formación de raíces. Una vez generadas raíces, se transfieren a un sustrato con alta capacidad de retención de agua (p. ej. turba). Las plántulas se cultivan en condiciones de humedad óptima para evitar su desecación, hasta que la raíz se afianza.
Protoplastos Obtenci贸n enzim谩tica
Diversos materiales se pueden incorporar a un protoplasto: orgĂĄnulos, DNA plasmĂdico, bacterias, etc.
Variaci贸n somaclonal
Beneficiosa
Perjudicial: indeseable en la generaci贸n de plantas transg茅nicas
Transformaci贸n de plantas: Agrobacterium
Inserci贸n del T-DNA con oncogenes y genes de metabolismo de opinas
Pioneros del desarrollo de vectores de transformaci贸n basados en Agrobacterium
Jeff Schell
Mark Van Montagu
Plรกsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens
Estructura general del T-DNA
LB
RB
Genes vir NO se transfieren
SELECCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS
Selecci贸n de trasng茅nicos con kanamicina
S贸lo unas pocas c茅lulas son transg茅nicas: varios pasos de selecci贸n
Vectores binarios desarmados derivados del plรกsmido Ti de A. tumefaciens
LB
Nos T
MnSOD
35S
35S
nptII
35S T
Cebadores especĂficos utilizados Fragmento Cebador positivo Cebador negativo Rubisco tccctgtttcaaggaagc gtcgcataaaattgaaggag (349 pb) Rbcs01F Rbcs02R nptII gaagagcatcaggggctc gaagaactcgtcaagaaggc (317 pb) nptII01F nptII02R 35S tgccatcattgcgataaagg cctctccaaatgaaatgaac (234 pb) 35S01F 35S02R Nos term gaatcctgttgccggtcttgcg gcgggactctaatcataaaaac (127 pb) nos01F nos02R
RB