VetScience Magazine n˚12 by Sê Comunicação

ISSN 2358-1018

uma revista do Grupo TECSA Número 12, 2016

LEISHMANIOSE VISCERAL

O PAPEL DO LABORATÓRIO VETERINÁRIO NO DIAGNÓSTICO www.vetsciencemagazine.com

EDITORIAL O TECSA e sua trajetória no combate a Leishmaniose! Há mais de 15 anos o TECSA se aliou aos Médicos Veterinários e profissionais da saúde, que buscam um pais controlado para Leishmaniose Visceral. Tem sido uma jornada bastante árdua, pois a política pública de combate e controle a esta enfermidade sempre foi centrada no controle da população canina supostamente doente. Diante disto, nossa maior missão foi, e continua sendo, garantir um diagnóstico laboratorial preciso e confiável. Sabemos da responsabilidade que temos na orientação ao veterinário de qual o melhor caminho a seguir diante dos dados da clínica, dados epidemiológicos e laboratoriais . A realização de um teste com dupla metodologia – ELISA + RIFI – desde o início, seguindo os melhores protocolos

estabelecidos pela literatura, sempre foi um compromisso do TECSA e do qual nunca abrimos mão. Aliar um método com alta sensibilidade a outro com alta especificidade e ainda aliar controles rigorosos, incluindo duplo observador em todas as leituras, é uma prática que nos levou a sermos o laboratório de escolha para gigantes da Industria farmacêutica quando do lançamento de vacinas e coleiras. O alto rigor técnico quanto aos diversos exames para diagnóstico da LVC, nos gerou o reconhecimento por parte de Universidades, pesquisadores e por parte do próprio Governo que se tornou um forte parceiro nos protocolos de diagnóstico desta zoonose. Nossa longa trajetória com o apoio laboratorial para o diagnóstico da

LVC, fez com que o TECSA se tornasse o maior laboratório veterinário privado do mundo em número de exames, em número de trabalhos publicados, em amplitude do menu de exames específicos e ainda em corpo técnico direcionado exclusivamente para esta patologia. São mais de 150.000 exames sorológicos por ano, atendendo todos os 27 Estados do Brasil. São 22 anos de experiência em diagnóstico animal e mais de 28 anos trabalhando com a Leishmaniose Visceral. Uma vida inteira dedicada a este conhecimento e a este diagnóstico, pois sabemos da complexidade do mesmo e da responsabilidade que temos.

Afonso Perez

“Um pouco de reflexão para a alma” Ninguém é dono da sua felicidade, por isso não entregue sua alegria, sua paz, sua vida nas mãos de ninguém, absolutamente ninguém. Somos livres, não pertencemos a ninguém e não podemos querer ser donos dos desejos, da vontade ou dos sonhos de quem quer que seja. Se você anda repetindo muito "eu preciso tanto de você" ou "você é a razão da minha vida", cuide-se. Remova essas palavras e principalmente a ação dessas palavras da sua vida, pois fazem muito mal ao seu "eu" interior. A razão da sua vida é você mesmo. Sua paz interior é a sua meta de vida. Quando sentir um vazio na alma, quando acreditar que ainda está faltando algo, mesmo tendo tudo, remeta seu pensamento para os seus desejos mais íntimos e busque a divindade que existe em

você. Pare de colocar sua felicidade cada dia mais distante de você. Não coloque objetivos longe demais de suas mãos, abrace os que estão ao seu alcance hoje. Se você anda desesperado por problemas financeiros, amorosos ou de relacionamentos familiares, busque em seu interior a resposta para o acalmar; você é reflexo do que pensa diariamente. Pare de pensar mal de você mesmo, e seja seu melhor amigo sempre. Sorrir significa aprovar, aceitar, felicitar. Então abra um sorriso para aprovar o mundo que te quer oferecer o melhor. Com um sorriso no rosto, as pessoas terão as melhores impressões de você, e você estará afirmando para você mesmo, que está "pronto" para ser feliz. Trabalhe, trabalhe muito a seu favor. Pare de esperar a felicidade sem esforços.

Pare de exigir das pessoas aquilo que nem você conquistou ainda. Critique menos, trabalhe mais. E, não se esqueça nunca de agradecer. Quando você agradece, Deus recebe seu coração. Agradeça tudo que está em sua vida nesse momento, inclusive a dor. Nossa compreensão do universo ainda é muito pequena para julgar o que quer que seja na nossa vida. Por fim, acredite que não estamos sozinhos um instante sequer. Você pode, através de uma oração simples e de coração, buscar a espiritualidade, que é maior que quaisquer problemas. Unir-se a algo superior a todos nós, nos momentos de alegria, garante facilidade de contato nos momentos menos alegres.

LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA: UMA ESPECIALIDADE TECSA Ao longo destes 22 anos no mercado, sempre tivemos uma forte preocupação com a Leishmaniose Visceral Canina. Hoje, podemos dizer que a LVC é uma de nossas grandes especialidades. Para auxiliar no diagnóstico desta complexa doença e contribuir para a sua prevenção, elaboramos um perfil específico e exclusivo. Este "pacote", além de ser de grande valia para o proprietário e a saúde do animal, garantirá excelente margem lucrativa para sua clínica.

PERFIL COMPLEMENTAR PARA LEISHMANIOSE CÓD. 316 composto por:

- Sorologia para LVC - Elisa + Rifi; - Hemograma Completo; - Ureia + Creatinina (avaliação da função renal); - TGP (avaliação da função hepática); - Proteínas Totais e Frações (Albumina + Globulinas + Relação A/G).

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ÍNDICE

06. LEISHMANIOSE 06. LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA: CONSIDERAÇÕES DO DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO NOS DIAS ATUAIS

29. ENDOCRINOLOGIA

33. MED. LAB. DE FELINOS

29. SÍNDROMES METABÓLICAS EM CÃES E GATOS OBESOS 31. OBESIDADE EM CÃES E GATOS

33. DERMATOFITOSE FELINA: RECOMENDAÇÕES PARA O DIAGNÓSTICO

35. ALERGOLOGIA

37. BIOLOGIA MOLECULAR

35. AS PRINCIPAIS RAÇAS PREDISPOSTAS A DESENVOLVER DERMATITE ATÓPICA E OS PRINCIPAIS ALÉRGENOS ENVOLVIDOS NO PROCESSO DA ALERGIA EM ANIMAIS

37. COMPARAÇÃO DE PCR TEMPO REAL E PCR CONVENCIONAL PARA DETECÇÃO DE LEISHMANIA INFANTUM

13. LEISHMANIOSE VISCERAL: MANIFESTAÇÕES CLÍNICO-PATOLÓGICAS INCOMUNS DA DOENÇA NO CÃO - REVISÃO DE LITERATURA 17. VANTAGENS DO PCR REAL TIME PARA O DIAGNÓSTICO E MONITORAMENTO DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA 21. FISIOPATOLOGIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA 24. EXAMES LABORATORIAIS PARA O DIAGNÓSTICO DA LVC 27. OCORRÊNCIA DE LEISHMANIA SP EM GATOS

Colaboraram neste número: Membros da Equipe de Médicos Veterinários do TECSA Laboratórios: Dr. Flávio Herberg de Alonso Dr. Frederico Miranda Pereira Dr. Guilherme Stancioli Dr. João Paulo Fernandez Ferreira Dr. João Paulo Franco Dr. Luiz Eduardo Ristow Dra. Isabela Azevedo Ribeiro Meirelles Carvalho Dra. Isabela de Oliveira Avelar Dra. Luciana Fachini da Costa Além do Médico Patologista Dr. Afonso Alvarez Perez Jr. Contribuíram também para este número, os renomados Professores: Dr. Aldair Junio Woyames Pinto Dr. Paulo Tabanez Dr. Victor Ribeiro Dr. Wagner Luiz Tafuri

40. ANATOMIA PATOLÓGICA 40. EXAME CITOLÓGICO POR IMPRINT 43. AUMENTO DA PREVALÊNCIA DE TUMORES ESPECÍFICOS NA ROTINA ONCOLÓGICA DE CÃES E GATOS

DEPOIMENTO DE CLIENTES

Eu envio exames de PCR para o TECSA há anos. Sempre fui muito bem atendida e os resultados são confiáveis, saem no prazo previsto. Tem suporte caso a gente precise de ajuda ou dúvida. O rapaz vem pegar a amostra aqui na clinica. Sonia Farias - Diretora Científica da Anclivepa-Ce - Proprietária da empresa Milldogs Veterinária

Av. Humberto Monte 2555 - Fortaleza- CE | Fone 85 3287-3849 | Fax 85 3287-5791

Obs.: os artigos assinados são de inteira responsabilidade dos autores e não representam necessariamente, a visão e opinião do TECSA Laboratórios.

EXPEDIENTE Editores/Publishers:

CIRCULAÇÃO DIRIGIDA

Dr. Luiz Eduardo Ristow . CRMV-SP 5560S . CRMV-MG 3708 . ristow@tecsa.com.br Dr. Afonso Alvarez Perez Jr. . afonsoperez@tecsa.com.br Equipe de Médicos Veterinários TECSA . tecsa@tecsa.com.br

A revista VetScience® Magazine é uma publicação do Grupo TECSA dirigida somente aos médicos veterinários, como parte do Projeto JORNADA DO CONHECIMENTO, criado pelo mesmo. Este projeto visa a universalização do conhecimento em Medicina Laboratorial Veterinária. A periodicidade é Bimestral, com artigos originais de pesquisa clínica e experimental, artigos de revisão sistemática de literatura, metanálise, artigos de opinião, comunicações, imagens e cartas ao editor.

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Grupo TECSA – 22 anos de precisão, tecnologia e agilidade.

LEISHMANIOSE

LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA

CONSIDERAÇÕES DO DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO NOS DIAS ATUAIS Prof. Dr.Vitor Márcio Ribeiro, MS, PhD ( vitor@pucminas.br ) Hospital Veterinário Santo Agostinho, Escola de Veterinária PUC Minas.

Introdução

A leishmaniose visceral canina (LVC), é uma doença sistêmica grave, de curso lento e crônico, difícil diagnóstico e cura. É uma zoonose, que em humanos provoca também doença severa, atingindo principalmente crianças, adultos jovens ou pessoas imunossuprimidas e, quando não tratada, pode apresentar letalidade de 95%. O cão é considerado o principal reservatório doméstico da L. infantum, servindo como fonte principal para a infecção dos flebotomíneos e consequente transmissão para humanos. Além dos cães, entretanto, outros animais também podem albergar a L. infantum como o gato doméstico, canídeos silvestres, gambás e até mesmo o homem. A doença tem como agente etiológico o protozoário Leishmania infantum, que é transmitido entre os animais susceptíveis e humanos, através da picada de flebótomos infectados, fêmeas, da espécie Lutzomyia longipalpis. A LVC é enzoótica em mais de 70 países do mundo. Está presente na Europa, África, Ásia, América do Sul e Central e tem sido também reportada nos EUA. Além disso, é também uma preocupação constante em países não enzoóticos onde a importação de cães doentes ou infectados pode constituir um problema médico veterinário e de saúde pública. A LVC se caracteriza por ser usualmente 6

uma doença crônica e os sinais clínicos são múltiplos e variados. Também tem difícil diagnóstico, pois ainda não existe um método de exame laboratorial que seja definitivo para o animal verdadeiramente positivo e negativo. A abordagem e manejo de cães infectados e doentes tem sido constante desafio aos médicos veterinários.

Formas de transmissão

Do ponto de vista epidemiológico a principal forma de transmissão se dá através da picada da fêmea da L. longipalpis infectada. Outras formas de transmissão já foram confirmadas e são através de transfusão sanguínea, do coito, pela via transplacentaria, através de artrópodes hematófagos e até pela via direta, de cão a cão por mordidas e feridas. Isso ressalta a necessidade de que os bancos de sangue sejam adequadamente controlados e que cães infectados sejam esterilizados. Em casos de cães de grande valor afetivo ou cinófilo recomendamos a fertilização artificial, após exame do sêmen através de técnicas moleculares para minimizar a possibilidade de transmissão. A transmissão por contato direto animal-animal foi apresentada em apenas um relato até o momento e necessita maiores estudos. Apesar disso, estas vias não ocupam importância epidemiológica no ciclo da doença,

mas devem ser valorizadas na clínica médica veterinária. A introdução do parasito em uma localidade necessita da presença do vetor, além do cão ou outro reservatório infectado. Apesar do cão ser reconhecido como o principal reservatório conhecido da L. infantum, não podemos deixar de lembrar da existência de outros reservatórios conhecidos como os canídeos silvestres, marsupiais, coelhos, lebres, gatos e até mesmo o homem. Nos últimos anos o numero de casos humanos de LV na comunidade de Madri apresentou índices de crescimento surpreendentes que foram associados com a presença de lebres e coelhos infectados por L. infantum e com grande capacidade de transmissão para os flebotomíneos. Em relação aos humanos infectados, já foi bem demonstrado que humanos com co-infecção pelo HIV são também altamente infecciosos para os flebotomíneos e alguns autores referem que durante epidemias o homem também pode servir como reservatório do parasito, para a infecção do inseto vetor. Em nosso meio o vetor envolvido com a transmissão, a L. longipalpis, tem hábito alimentar não seletivo, podendo se alimentar em um grande numero de animais. Mas a LVC, do ponto de vista epidemiológico, é considerada mais importante que a doença humana, pois além de ser mais prevalente, apresenta

LEISHMANIOSE grande contigente de animais infectados com parasitismo cutâneo, que servem como fonte permanente de infecção para os insetos vetores. As picadas em humanos, embora menos frequentes, podem ocorrer e assim resultar em casos de LV. Essa expansão da doença canina e seu potencial zoonótico tem levado as autoridades sanitárias, desde a década de 1960, a recomendar o abate de cães que apresentem anticorpos anti- L. infantum em inquéritos sorológicos ou que tenham exames parasitológicos ou moleculares que confirmem a infecção. Essa estratégia carrega o peso histórico do abate de milhares de cães com diagnósticos incorretos da infecção, além de não ter apresentado resultados que a justificasse como medida obrigatória de controle.

Patogenia

A picada do flebotomíneo infectado inocula no espaço dérmico do cão as formas promastigotas metacíclicas, infectantes. A saliva dos flebotomíneos é fundamental para a infecção, pois na sua composição existem substâncias que produzem efeitos anticoagulantes, antiplaquetários, vasodilatadores, imunoreguladores e antiinflamatórios. As formas infectantes são fagocitadas por células do Sistema Mononuclear Fagocitário (SMF) e em seu citoplasma evoluem para formas amastigotas. A multiplicação das amastigotas no sítio de inoculação pode produzir um processo inflamatório composto por neutrófilos, linfócitos e macrófagos que leva a formação de um ou mais nódulos denominados de Leishmanioma ou Cancro de inoculação (Figura 1). A expansão da infecção se dá pelo rompimento dos macrófagos e invasão de novas células que alcançam órgãos linfóides e disseminam-se pela derme, generalizando a infecção. A resposta do sistema imune do animal infectado é decisiva para o desenvolvimento da infecção. Dependendo dessa resposta, a infecção poderá ser contida e o animal evoluir para cura espontânea com eliminação do parasito, prevalecer e não gerar sinais de doença ou evoluir para o adoecimento. As

situações de cura clínica e parasitológica e da ausência de sinais de doença em animais infectados estão relacionadas com uma resposta imune celular, com predominância de linfócitos T da linhagem TH1, ativadora de macrófagos e protetora contra Leishmania. Nos animais em que ocorre uma resposta imune baseada na produção de anticorpos, resposta humoral, observase altos títulos de anticorpos, não protetores contra a infecção. Essa resposta é baseada em subpopulações de linfócitos Th2 e nesse caso haverá progressão da doença e morte do animal caso não seja feito tratamento (Figura 2). As citocinas relacionadas com a resistência a infecção, presentes na resposta Th1, são a interleucina 2 (IL-2), IL-12, fator de necrose tumoral (TNF-α) e interferon gama (INF-δ). As citocinas relacionadas com a resposta Th2, que se associam a suscetibilidade à infecção, são IL-4, IL-10 e o fator de crescimento transformador β (TGF-β) que antagonizam aquelas associadas com a proteção. Nesses casos, entre seis a oito meses após a infecção, se dá de forma mais acentuada a queda das populações de LT CD4+ que coincide com a evolução da doença. Essa resposta parece ser modulada principalmente por fatores genéticos. Estudos têm apontado maior resistência a infecção em cães nascidos em áreas enzoóticas no Brasil e na Europa tem-se destacado a raça Ibiza hound, que demonstrou resposta imune a infecção por L. infantum INOCULAÇÃO DE PROMASTIGOTAS NA PELE

predominantemente celular. O período de incubação pode variar entre três meses e sete anos.

Figura 1: Nódulos na face interna da orelha sugestivos de Cancro de inoculação. Acervo do autor.

Sinais clínicos

A LVC é usualmente doença crônica e os sinais clínicos são múltiplos e variados. Podemos enumerar que os sinais físicos descritos em cães com LV podem ser cutâneos, onicogrifose, aumento dos linfonodos palpáveis, palidez de mucosas, epistaxe e outros episódios hemorrágicos, emagrecimento, anorexia, prostração, esplenomegalia, lesões oculares, sinais ortopédicos, neurológicos, gastrointestinais, entre outros. Além do Cancro de inoculação, observado em torno de 20 dias após a inoculação das formas promastigotas metacíclicas pela L. longipalpis infectadas apresentado na Figura 1, exemplificamos outros sinais cutâneos, como vasculites de extremidade de orelhas, ulceras cutâneas (Figuras 3, 4), dermatites seborreicas e alopecias (Figura 5), onicogrifose (Figura 6), lesões oculares, conjuntivais e periorbitais (Figuras 7, 8) e atrofia

INFECÇÃO SUBCLÍNICA / RESPOSTA IMUNE EFETIVA

INFECÇÃO LOCAL – RESPOSTA IMUNE

ELIMINAÇÃO COMPLETA DA INFECÇÃO – Cura parasitológica

DOENÇA SISTÊMICA, DISSEMINAÇÃO DO PARASITO

Figura 2: Fluxo de evolução da infecção inicial por Leishmania infantum conforme resposta imune.

LEISHMANIOSE musculatura da cabeça (Figura 9).

Figura 3: Úlceras em patas anteriores com dermatite interdigital. Acervo do autor.

Figura 4: Úlcera e vasculite de extremidade de orelha. Acervo do autor.

Figura 5: Alopecia descamativa e dermatite seborreica. Acervo do autor.

Figura 6: Onicogrifose. Acervo do autor

Figura 7: Glaucoma olho direito, ceratite e blefarite bilaterais associadas a Leishmania infantum. Acervo do autor.

Figura 8: Granuloma inflamatório em conjuntiva ocular associado a Leishmania infantum. Acervo do autor

Figura 9: Atrofia musculatura da cabeça. Acervo do autor

Diagnóstico

Não existem sinais físicos patognomônicos na LVC. Outras doenças podem ser responsáveis por sinais semelhantes, como alterações cutâneas seborreicas, piodermites, dermatofitoses, demodiciose, escabiose, esporotricose, atopias, patologias cutâneas auto-imunes (lúpus eritrematoso sistêmico, pênfigo foliáceo), doenças infectocontagiosas como a erliquiose monocitica, babesiose, hepatozoonose, febre maculosa das montanhas rochosas, doença de Lyme, entre outras. Desta forma, o diagnóstico da LVC necessita do auxilio de exames complementares. Os exames direcionados para o diagnostico da infecção podem ser sorológicos, que buscam a presença de anticorpos anti-L. infantum. Os métodos utilizados atualmente são os imunocromatográficos, reação de imunofluorescência indireta e ELISA. Esses métodos vão permitir ao médico veterinário concluir pela suspeição ou confirmação da infecção e doença. Entretanto, em títulos baixos da RIFI como 1:40 a 1:80, deve-se buscar outros exames definidores da infecção, como os testes parasitológicos. Os clínicos devem solicitar ao seu laboratório de confiança a informação das titulações máximas no caso da RIFI e da leitura das absorbâncias do ELISA, para melhor diagnóstico e manejo clínico dos cães. É recomendável que o diagnóstico sorológico da LVC através da RIFI seja firmado quando houver títulos iguais ou maiores a 1:160. Títulos elevados, iguais ou maiores 1:640, são indicadores de infecciosidade dos animais para flebotomíneos. Cães sororeagentes positivos podem estar inseridos em três categorias: 1 – cães sororeagentes positivos não infectados – significa aqueles que tiveram contato com o parasito em áreas enzoóticas e se livraram da infecção e se mantiveram com anticorpos, reações cruzadas ou falso positivas; 2 – cães sororeagentes positivos infectados e não doentes; 3 – cães sororeagentes positivos infectados e doentes. Os testes parasitológicos buscam a comprovação da presença

de amastigotas na pele, linfonodos e órgãos, como medula óssea (MO), baço, fígado, entre outros. Para tanto podese proceder coleta de material através de biópsias ou aspirados com agulha fina. Amostras de sangue apresentam baixa sensibilidade para pesquisa direta do parasito. Entre os métodos parasitológicos utilizados, destaca-se o exame de esfregaços corados pelo panótico rápido ou pelo Giemsa. Além dele, exame histopatológico, imunohistoquímico (IHC), cultura e xenodiagnóstico em cão e gato (Figura 10). Também relacionamos entre os exames parasitológicos os métodos moleculares, realizados através da reação em cadeia de polimerase (PCR). Três diferentes técnicas de PCR estão disponíveis: PCR convencional, nested-PCR e PCR real time. A técnica de PCR real time é mais avançada e pode detectar e quantificar concentrações extremamente baixas de parasitos quando comparada ao PCR convencional. Materiais obtidos de medula óssea, linfonodos, baço ou pele são sensíveis e específicas para detecção do DNA do parasito. A PCR de amostras de swab conjuntival demonstrou ser também sensível e específica para a detecção de L. infantum em cães e gatos.

Figura 10: Realização de xenodiagnóstico. Acervo do autor.

Tratamento

A proposta do tratamento da LVC deve ser analisada no contexto do grande avanço de qualidade da ciência e da medicina veterinária. Não pode ser adequado que perante toda evolução da medicina veterinária ainda se possa determinar o abate do cão infectado ou doente. No Brasil tem-se discutido intensamente com os órgãos responsáveis sobre a liberação do tratamento canino, uma vez que

LEISHMANIOSE

atualmente esse assunto mostra-se contro verso e tem gerado sanções a médicos veterinários em diferentes regiões do país. O Brasileish – grupo de estudo em leishmaniose animal, apresentou uma proposta recentemente ao Ministério da Saúde (MS) no sentido de colaborar com protocolos de tratamentos a serem seguidos pela comunidade profissional. Fórum sobre o tratamento da LVC promovido pelo MS em 2015 teve como conclusão final a recomendação de que o tratamento da LVC fosse reconhecido pelo MS, ressalvando o uso de produtos usados no tratamento da leishmaniose empregado em humanos no país. No contexto mundial, as opções de protocolos distintos conferem aos pacientes grandes possibilidades de melhora clínica e menores índices de recidivas. Do ponto de vista médico veterinário, é importante salientar que o tratamento da LVC é constante, pode ser oneroso e em alguns casos o paciente

pode evoluir a óbito. A opção pelo tratamento da LVC deve considerar parâmetros ligados a condição clínica do paciente e a participação consciente do proprietário, incluindo o conhecimento dos custos advindos. O animal deve ser avaliado através de detalhado exame clínico e laboratorial, que inclui a confirmação do diagnóstico sorológico, com determinação do limite da diluição positiva e da presença do parasito em amostras de pele, punção de linfonodos ou medula óssea, através de técnicas citológicas ou histológicas. Exames complementares de mensuração da pressão sistêmica sanguínea, o hemograma, avaliação da função renal através da avaliação da urina, relação proteína/creatinina urinarias, níveis séricos de ureia e creatinina, testes de função hepática e perfil eletroforético das proteínas séricas, permitirão ao clínico prognosticar e decidir sobre a indicação do tratamento. Infecções concomitantes como babesiose, erlichiose, demodiciose,

escabiose, hepatozoonose, criptococose, dirofilariose, entre outras, devem ser consideradas a fim de se estabelecer a prioridade de tratamento entre as enfermidades diagnosticadas. Confirmada a infecção e analisado o estádio da doença o tratamento será indicado conforme as diretrizes apresentadas pelo Grupo Leishvet (Solano-Galego et al. 2011), composto por médicos veterinários acadêmicos e pesquisadores do continente europeu. Nesse contexto, o Brasileish apresentou ao MS um protocolo de tratamento sem o uso de medicamentos empregados no Brasil para o tratamento humano que permanece em discussão e ainda não foi definido.

Protocolos de tratamento:

Os protocolos abaixo apresentados estão definidos pelo grupo Leishvet conforme apresentados no quadro abaixo (Quadro I). 9

LEISHMANIOSE Quadro 1 – Estádio clínico da leishmaniose visceral canina baseado no status sorológico, sinais clínicos, achados laboratoriais, terapia e prognóstico para cada estágio. Estágio clínico

Sorologia*

Sinais clínicos

Achados laboratoriais

Tratamento

Prognóstico

Bom

Estádio 1 Doença leve

Negativo ou positivo com baixos níveis de anticorpos

Leves sinais – linfadenopatia periférica ou dermatite papular

S/ anormalidades Perﬁl renal normal: creatinina < 1,4 mg/dL e não proteinúrico/ UPC** < 0,5

Alopurinol ou antimoniato de meglumina ou miltefosina/ alopurinol + antimoniato de meglumina ou alopurinol + miltefosine***

Estádio 2 Doença moderada

Baixos para altos níveis de anticorpos

Além dos sinais do estádio 1, difusas ou simétricas lesões cutâneas, como dermatite esfoliativa, onicogrifose, ulcerações (mucosa nasal, coxins plantares, proeminências ósseas, junções mucocutâneas), anorexia, emagrecimento, febre, epistaxe

Leve anemia não regenerativa, hiperglobulinemia, hipoalbuminemia, síndrome da hiperviscosidade do soro SUBESTÁDIOS a)Perﬁl renal normal: creatinina < 1,4/dL; não proteinúrico UPC < 0,5 b)Creatinina <1,4 mg/dL UPC = 0.5-1

Alopurinol + antimoniato de meglumina ou alopurinol + miltefosine

Estádio 3 Doença grave

Médio para altos títulos de anticorpos

Além dos sinais citados nos estádios 1 e 2, podem apresentar sinais oriundos da formação de imunocomplexos, tais como, vasculite, artrite, uveíte e glomerulonefrite

Alterações do estádio 2, doença crônica renal (DCR) IRIS**** estágio 1 com UPC > 1 ou estádio II (creatinina 1.4 – 2 mg/dL)

Alopurinol + antimoniato de meglumina ou alopurinol + miltefosine Seguir IRIS***** – Manejo para DRC

Reservado para pobre

Estádio 4 Doença muito grave

Médio para altos títulos de anticorpos

Sinais clínicos do estádio 3, tromboembolismo pulmonar ou síndrome nefrótica. Estádio ﬁnal de doença renal.

Alterações do estádio 3, DRC IRIS estádio III (creatinina 2 – 5 mg/dL) e estádio IV (creatinina > 5 mg/dL). Síndrome nefrótica: marcada proteinúria UPC > 5

Alopurinol Seguir IRIS***** – Manejo para DRC

Pobre

Bom para reservado

*Cães com níveis anticorpos de negativo a médios, devem ser confirmados como infectados com outras técnicas diagnósticas como citologia, histologia, IHC ou PCR. Altos níveis de anticorpos, definidos como tres a quatro elevações sob o nível do cut off, são conclusivos para o diagnostico da LVC. Negativo – RIFI ≤ 1:40 Baixo – RIFI 1:40 até 1:160 Médio – RIFI 1:160 até 1:640 Alto – RIFI ≥ 1:640 **UPC – Razão proteína/creatinina urinária *** Cães no estágio 1 (doença leve) requerem tratamento menos prolongado com uma ou duas drogas combinadas ou acompanhamento sem tratamento. **** IRIS (International Renal Interest Society) staging of chronic renal disease. [http://www.iris-kidney.com/guidelines/en/staging_ckd.shtml]. ***** IRIS treatment recommendation. [http://www.iris-kidney.com/guidelines/en/treatment_recommendations.shtml].

(FONTE: Solano-Galego et al. 2011.)

LEISHMANIOSE

Controle:

A estratégia de controle proposta pela saúde pública desde a década de 1950 é baseada em três ações, quais sejam, a detecção e tratamento dos casos humanos, o combate ao vetor, através da aplicação de inseticidas e o inquérito sorológico canino com o abate dos cães soropositivos. Estas medidas não têm sido uniformemente realizadas, em razão de vários fatores, entre eles destaca-se o pouco investimento em saúde no nosso país, quando comparado ao investimento em outros setores. A detecção e tratamento dos casos humanos reduz a morbidade e a mortalidade da doença, que afeta principalmente crianças, sobretudo aquelas mal-nutridas, idosos e imunossuprimidos em geral, hoje com particular importância os portadores de HIV. Na busca do cumprimento desta medida tem-se aplicado na capacitação da rede pública, para diagnóstico precoce do ponto de vista clínico e laboratorial rápido, para estabelecimento de tratamento. Esse objetivo pode reduzir a letalidade da doença, pois a LV humana

não é fatal quando tratada. O combate ao vetor é defendido como a principal medida para o controle da leishmaniose humana e canina. Os esforços para o controle dos vetores são direcionados, principalmente, para as formas adultas dos flebótomos, pois seus criadouros são difíceis de serem localizados. Os serviços públicos utilizam inseticidas residuais (piretróides sintéticos) no interior das casas e abrigos de animais em algumas situações para reduzir a população peridoméstica dos flebótomos e consequentemente, a transmissão parasitária. Nos cães tem sido preconizado pela comunidade veterinária o uso de colares ou produtos tópicos inseticidas, a base de piretróides, eficazes para repelir os flebotomineos nos cães tratados, evitando assim a picada e transmissão. No Brasil as ações públicas de controle do vetor são, na maioria das vezes, descontínuas. A liberação de verbas, a alocação e contratação de mão-de-obra dependem de decisões políticas orçamentárias. Os programas implementados não surtem o efeito esperado e como

Obs.: os artigos assinados são de inteira responsabilidade dos autores e não representam necessariamente, a visão e opinião do TECSA Laboratórios.

consequência ocorre a reinfestação dos ambientes e reaparecimento de casos humanos e caninos. Estudos de modelagem matemática demonstraram que o combate ao vetor deveria ser a primeira estratégia de controle da LV humana e canina, seguido pela busca da redução da susceptibilidade, através da melhoria da condição nutricional de crianças e da busca de vacinas para cães e humanos. Alguns autores questionam o procedimento ético dos defensores e executores do abate em massa de cães soropositivos ou infectados pelo país. Debates recentes, já mencionados, patrocinados pelo MS indicaram um redirecionamento das ações, respeitando a relação afetiva do tutor com seu cão e buscando maior efetividade na orientação da comunidade ao combate ao vetor e a vacinação dos cães contra LV. Esta reflexão nos parece acertada. Consideramos que o controle da LVC pode ser mais eficiente se associarmos ao uso de inseticidas, a vacinação. Existem no mundo duas vacinas contra LVC. No mercado brasileiro existe uma registrada e licenciada pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) e pelo MS. Temos recomendado a comunidade veterinária a vacinação sistemática dos cães. Outras vacinas têm sido propostas e esperamos por novas opções de controle da infecção e doença canina.

Comentários

O Brasileish tem buscado orientar a comunidade veterinária e buscar o diálogo com os órgãos públicos como o MS e o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) no sentido de viabilizar o manejo responsável de cães perante a LV. Também tem buscado o diálogo com os órgãos de classe que ao nosso ver tem se manifestado de forma pouco aberta aos avanços técnicos e as evidencias científicas quando não permite aos médicos veterinários a prática de tratamento canino. Através dos estudos conjuntos com os colegas da área de saúde pública acreditamos que em breve teremos formas mais adequadas do manejo da LVC. 11

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LEISHMANIOSE

LEISHMANIOSE VISCERAL: MANIFESTAÇÕES CLÍNICO-PATOLÓGICAS INCOMUNS DA DOENÇA NO CÃO – REVISÃO DE LITERATURA Aldair Junio Woyames Pinto

Médico Veterinário, doutor em patologia pela Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais – Laboratório de Patologia das Leishmanioses

Wagner Luiz Tafuri

Professor Titular Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais – Laboratório de Patologia das Leishmanioses

Introdução

A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma doença crônica causada pelo protozoário Leishmania infantum, com maior potencial zoonótico do planeta1. A doença é transmitida por flebótomos do gênero Lutzomyia e possui importância epidemiológica devido à presença do parasito na pele de cães, o que contribui para a infecção em seres humanos e perpetuação do ciclo biológico no meio urbano 2,3. Alguns cães desenvolvem a infecção sintomática (doença), muitas vezes fatal, enquanto outros permanecem assintomáticos (infectados), ou desenvolvem um ou poucos sintomas. Cães sintomáticos

podem apresentar diversos sintomas que são bastante variáveis 4. Contudo, alguns sintomas são considerados comuns na doença. Por outro lado, a LVC é uma doença sistêmica e acomete diversos órgãos podendo causar alterações tanto macro quanto microscópicas. Desordens em intestinos, pulmões, sistema nervoso, articulações e sistema cardiovascular em cães com LVC já foram descritas 5-9 mesmo não sendo considerados tecidos típicos de se encontrar lesões associada a doença. O conhecimento a respeito da LVC nestes órgãos pode auxiliar o clínico na melhor conduta do paciente frente ao caso. O objetivo deste trabalho é demonstrar os achados incomuns da

leishmaniose visceral canina.

Achados incomuns na Leishmaniose visceral canina

Trato Gastrointestinal As desordens do trato gastrointestinal (TGI) em cães e seres humanos já foram descritas5,1⁰-¹⁷. Em cães os achados relacionados ao TGI são diarreias mucóides e/ou sanguinolentas 1⁸, hiperemia e erosões da mucosa ¹⁰, ¹² e infiltrado inflamatório plasmolinfohistiocitário associado à presença do parasitismo 3,5,15. Alguns pesquisadores na Europa demonstraram presença de nódulos vermelhos coalescentes em língua de cão com presença de 13

LEISHMANIOSE amastigotas no exame citológico. Ainda, pesquisadores recentes demonstraram lesões ulcerativas granulomatosas em lábio inferior de cão doente 18. O autor desta revisão encontrou lesões semelhantes em cão no Brasil (Figura 1). Um achado importante na LVC são as inflamações intestinais ocasionadas pela presença do parasito principalmente em intestino grosso. Entretanto, a presença do parasito assim com o processo inflamatório pode passar despercebido por não apresentarem sintomas ou lesões macroscópicas 19. Cães com diarreia crônica apresentando muco e estrias de sangue não responsiva ao tratamento com antibióticoterapia já foram relatados. O autor deste trabalho já encontrou sintomas semelhantes (Figuras 2). Autores descreveram cães que apresentaram repetidos exames de fezes sem presença de parasitos intestinais e no exame bioquímico uma elevação das proteínas plasmáticas totais, quando foram indicados ao exame de colonoscopia. Pela biópsia a mucosa do cólon apresentava hiperemia difusa com pequenas áreas de erosão. Na microscopia observaram corpos basofílicos em vacúolos citoplasmáticos de numerosos macrófagos. Como os animais viviam em área endêmica de LVC foi realizado o exame de imunohistoquímica da amostra de biópsia e a confirmação da doença veio com a visualização de formas amastigotas de Leishmania. Após a confirmação, um dos cães foi eutanasiado e o outro tratado para LVC apresentando melhora significativa do quadro de diarreia após dois meses do início do tratamento. O autor descreveu a diarreia crônica como sendo a primeira manifestação clínica da LVC apresentada pelos cães do estudo. Resultados semelhantes já foram publicados pelo autor deste trabalho 15, 20. Autores na Grécia não observaram manifestações clínicas como diarreias ou vômitos em cães naturalmente infectados com Leishmania infantum. Entretanto os autores observaram através da biópsia de cólon, presença de hiperemia da mucosa, com áreas irregulares e/ou edema e pequenas áreas de erosão da mucosa classificando 14

LEISHMANIOSE coxins palmares e plantares, polimiosite, e osteomielite também podem ser motivo de claudicação, todos associados à LVC. A manifestação da doença no sistema locomotor também pode levar a problemas mais graves como consequência de inflamação granulomatosa 25.

Sistema Nervoso

como uma colite assintomática em cães infectados com Leishmania 10.

Sistema Circulatório e Respiratório

Apesar de alguns trabalhos não identificarem sintomas cardíacos ou arritmias, alterações inflamatórias e parasitárias em miocárdio em cães com LVC, já foram descritos. Necrose de cardiomócito e aumento de fibras colágenas intersticial foram descritas em mais de 70% dos cães estudados e o achado histopatológico mais comum foi à miocardite linfoplasmocítica 21. Com relação aos vasos sanguíneos, a vasculite é um achado comumente encontrado correlacionado a epistaxe e também a necrose e hemorragia em pele principalmente na extremidade do conduto auditivo 22, 23. O acometimento do sistema respiratório tem sido

relatado na leishmaniose visceral canina. Entretanto, os achado clínicos não são visualizados. A pneumonia intersticial com grande deposição de fibras colágenas associado a infiltrado inflamatório mononuclear é comum. Cães com LVC apresentam espessamento dos septos interalveolares e fibrose pulmonar sem manifestarem sintomas respiratórios 24.

Sistema Locomotor

Mono ou poliartrites tem sido relatado na LVC como sendo sintomas incomuns. Ocorrência rara deste sintoma ortopédico na rotina se explica por provável caráter subclínico e/ou predomínio da sua forma de artrite não erosiva 22. Embora a artrite seja a principal causa de claudicação na LVC, a possibilidade de outras causas é relatada. Neuralgia, ulceração de

Tetraplegia, depressão e ausência de reflexos posturais, podem ser considerados sintomas incomuns da LVC 4,26. Microscopicamente, áreas de infarto em parênquima cerebral foram encontrados. Neste mesmo trabalho, formas amastigotas de Leishmania foram visualizadas em plexo coroide, medula espinhal e também em parênquima cerebral 26. Achados histopatológicos no cérebro de cães com LVC incluem leptomeningite, coroidite e gliose. Congestão vascular, micro-hemorragias, neuroniofagia podem ser visualizados. Entretanto, os achados clínicos podem ser discretos ou inexistentes. A presença de formas amastigotas no SNC pode ser encontrada discretamente. Entretanto, o uso da reação de cadeia da polimerase (PCR) pode ser uma ferramenta diagnóstica em caso de resultados histopatológicos que possuam as alterações acima mencionadas 27.

Considerações Finais

A LVC por ser uma doença sistêmica pode acometer diversos órgãos e tecidos. Apesar de ser uma doença que, em regiões endêmicas, possui grande atenção dos clínicos veterinários no que diz respeito ao diagnóstico, pode ser facilmente confundida quando encontrada em tecidos e sistema incomuns como os relatados acima. Por isto, é muito importante que o médico veterinário se atente as demais manifestações da doença nestes sistemas levando em consideração os achados, principalmente, microscópicos que muita das vezes não apresenta o diagnóstico parasitário (exame direto) e imuno-histoquímico confirmatório, mas demonstra as alterações histopatológicas comumente relatadas na literatura. Assim, o uso de 15

LEISHMANIOSE ferramentas diagnósticas moleculares, como o caso da PCR nestes casos pode ser uma opção válida na conclusão do diagnóstico. Por fim, o são necessários maiores estudos frente a estes casos incomuns para melhor compreensão da doença no cão.

Figura 1: Lesão ulcerativa em lábio inferior associada à inflamação plasmolinfocítica em cão com Leishmaniose: observar em (1) lesão ulcerativa e necrosante de odor repulsivo em cão. No detalhe observar a característica macroscópica granulomatosa e destrutiva do tecido. Fotos: Aldair Junio Woyames Pinto

Figura 2: PitBull com Leishmaniose Visceral com clássica manifestação clínica da doença: Observar em (1) e (2) animal apresentando emagrecimento, dermatite esfoliativa não pruriginosa em focinho, orelhas e blefarite. Em (3) observar edema em articulações e membros anteriores. Este animal apresentava claudicações e relutância em locomover. Em (4) observar diarreia muco-sanguinolenta Fotos: Aldair Junio Woyames Pinto

Referências Bibliográficas

EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS

CÓD - EXAME

PRAZO/DIAS

316 - PERFIL COMPLEMENTAR PARA LEISHMANIOSE

44 - HEMOGRAMA COMPLETO

290 - LEISHMANIOSE FELINA (ELISA + RIFI)

456 - IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LEISHMANIOSE

408 - PESQUISA DE LEISHMANIOSE

483 - LEISHMANIA CHAGASI MÉTODO PCR REAL TIME QUALITATIVO

680 - LEISHMANIA CHAGASI METODO PCR REAL TIME QUANTITATIVO

451 - PESQUISA DE SPOROTRIX SCHENKIIE

447 - LEISHMANIOSE CANINA DILUICAO TOTAL

83 - LEISHMANIOSE CANINA ( DPP + ELISA + RIFI )

582 - PERFIL LEISHMANIOSE (DPP+ELISA+RIFI) E PROT. TOT/ FRAC.

573 - PERFIL COMBO DE LEISHMANIA IMUNOHISTOQUMICA + SOROLOGIA

738 - PERFIL LEISHMANIOSE SOROLOGIA + IMUNO-HISTOQUIMICA

810 - PERFIL PCR DOADORES DE SANGUE

1. Gramiccia M, Gradoni L: The current status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control. International Journal Parasitology 2005, 35(11-12):1169-1180. 2. Baneth G, Koutinas AF, Solano-Gallego L, Bourdeau P, Ferrer L: Canine leishmaniosis - new concepts and insights on an expanding zoonosis: part one. Trends Parasitol 2008, 24(7):324-330. 3. Solano-Gallego L. Miró G, Koutinas A, Cardoso L, Pennisi Gm, Ferrer L, Bourdeau B, Oliva G, Baneth G. LeishVet guidelines for the practical management of canine leishmaniasis. Parasites & Vectors. 2011. 4:86. 4. Alvar J, Canavate C, Molina R, Moreno J, Nieto J. Canine leishmaniasis. Advance Parasitology. 2004. 57, p.1-88. 5. Pinto AJW, Figueiredo MM, Silva FL, Martins T, Michalick MS, Tafuri WL, Tafuri WL. Histopathological and parasitological study of the gastrointestinal tract of dogs naturally infected with Leishmania infantum. Acta Veterenary Scandnavica. 2011. 13(53): p.67-75. 6. 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Adamama-Moraitou Kk, Rallis Ts, Koytinas Af, Tontis D, Plevraki K, Kritsepi M. Asymptomatic colitis in naturally infected dogs with Leishmania infantum: a prospective study. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 2007. 76(1):p.53-7. 11. Anderson Dc, Buckner Rg, Glenn Bl, Macvean Dw. Endemic canine leishmaniasis. Veterinary Pathology. 1980. 17(1): p.94-6. 12. Ferrer L, Juanola B, Ramos Ja, Ramis A. Chronic colitis due to Leishmania infection in two dogs. Veterinary Pathology. 1991. 28(4): p.342-3 13. Keenan Cm, Hendricks Ld, Lightner L, Johnson Aj. Visceral leishmaniasis in the German shepherd dog. II. Pathology. Veterinary Pathology. 1984b. 21(1): p.80-6. 14. González JL, Fermin ML, Garcia P, Rollan E, Castaño M. Erosive colitis in experimental canine Leishmaniasis. Zentralbl Veterinarmed B. 1990. 37(5): p.377-82. 15. Pinto, AJW., Figueiredo, MM., Ferreira, RA., Caliari, MV., Tafuri, WL.,. Unsual Small Intestine inflamatory Lesions in dogs with visceral leishmaniasis. 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Pinto AJW, Figueiredo MM, de Amorim IFG, Ponzzebon BG, Ribeiro VM, Tafuri WL. A colonoscopia no diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina – revisão de literatura. Clínica. Veterinária 2013. 102(1): 102-112. 21. Rosa FA, Leite JHAC, Braga ET, Moreira PRR, Baltazar FH, Biondo A, Padua PM, Vasconcelos RO, Camacho AA, FerreiraWL, Machado GF, Marcondes M. Cardiac Lesions in 30 Dogs Naturally nInfected With Leishmania infantum chagasi. Veterinary Pathology 2014, 51(3) 603-606. 22. Koutinas AF, Koutinas CK. Pathologic Mechanisms Underlying the Clinical Findings in Canine Leishmaniosis due to Leishmania infantum/ chagasi. Veterinary Pathology 2014, 51(2) 527-538. 23. Costa MM, Lima WG, Figueiredo MM, Michalick MS, Tafuri WL, Tafuri WL. Cervical, mandibular, and parotid lymph nodes of dogs naturally infected with Leishmania infantum: a histopathologic and immunohistochemistry study and its correlation with facial skin lesions. Veterinary Pathology. 2008. 45(5): p. 613- 6. 24. Gonçalves R, Tafuri WL, Melo MN, Raso P, Tafuri WL. Chronic interstitial pneumonitis in dogs naturally infected with Leishmania (Leishmania) chagasi: a histopathological and morphometric study. Revista Instituto Medicina Tropical São Paulo 2003. 45(3):153-158. 25. Turrel JM, Pool RP. Bone lesions in four dogs with visceral leishmaniosis. Veterinary Radiology. 1982. 23:243–249. 26. Márquez M, Pedregosa JR, López J, Marco-Salazar P, Fondevila D, Pumarola M. Leishmania amastigotes in the central nervous system of a naturally infected dog Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2013. 25(1) 142–146. 27. Melo GD, Silva JESS, Grano FG, Souza MS, Machado GF. Leishmania infection and neuroinflammation: Specific chemokine profile and absence of parasites in the brain of naturally-infected dogs. Journal of Neuroimmunology. 2015. 289, 21–29.

Obs.: os artigos assinados são de inteira responsabilidade dos autores e não representam necessariamente, a visão e opinião do TECSA Laboratórios.

LEISHMANIOSE

VANTAGENS DO PCR REAL TIME PARA O DIAGNÓSTICO E MONITORAMENTO DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA

Introdução

A leishmaniose canina (LC) é uma doença infecciosa sistêmica grave do cão causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania. É uma zoonose, sendo o cão considerado o principal reservatório peridoméstico do parasita. A LC é endêmica no Oriente Médio, América do Sul e na bacia do Mediterrâneo, onde a infecção atinge uma notável prevalência de 67%, apesar da prevalência da doença ser de apenas aproximadamente 10%. As apresentações clínicas variam amplamente em consequência dos numerosos mecanismos patogênicos envolvidos no processo da doença e a diversidade das respostas imunes exibidas frente à Leishmania sp. pelos hospedeiros. Por essa razão, o diagnóstico clínico da LC é extremamente difícil e há uma alta taxa de soroprevalência em cães sub-clínicos e assintomáticos de áreas endêmicas. Na rotina prática da clínica, o veterinário normalmente é confrontado com casos

que são compatíveis ou sugestivos de LC, de acordo com os sinais, e com vários testes diagnósticos, por vezes com resultados contraditórios. Isto levou ao desenvolvimento e aplicação da reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional e “nested”para diagnosticar LC. No entanto, uma vez que uma das características da leishmaniose é ter parasitas residuais ou latentes após o tratamento, as abordagens quantitativas tornam-se necessárias, não apenas para elucidar o status de cães positivos em áreas endêmicas, mas também no acompanhamento da parasitemia póstratamento e no desenvolvimento de novas vacinas ou drogas. A detecção por PCR em tempo real está substituindo os métodos convencionais de PCR e PCR “nested” no diagnóstico e acompanhamento de muitas doenças, fornecendo a capacidade de realizar mensurações muito sensíveis, precisas e reprodutíveis de DNA específico presente em uma amostra, até mesmo para parasitas do gênero Leishmania sp.

Figura 1: Cão com Leishmaniose apresentando sinais clínicos inespecíficos. Fonte: Google imagens

PCR convencional

O PCR convencional é altamente específico e mas não tão sensível quanto os métodos sorológicos clássicos utilizados no diagnóstico da LVC. Expressa o resultado apenas em positivo ou negativo e não é capaz de quantificar a carga parasitária presente na amostra. Além disso, possui sensibilidade menor do que o PCR real time (PCR-RT), por isso resultados falso negativos podem ocorrer quando a quantidade de DNA está abaixo da sensibilidade de detecção do teste, como é descrito no 17

LEISHMANIOSE experimento abaixo: Em um experimento, foram analisadas 25 amostras de aspirado de medula óssea a partir de cães que tenham sido previamente avaliados por PCR convencional, a fim de comparar os resultados. O DNA parasitário foi detectado em 21 das amostras analisadas, numa gama de 0,001-3400 parasitas no PCR, o que corresponde a 0,2 parasitas/ml de amostra até 6.800.000 parasitas/ml de amostra. O PCR convencional, rotineiramente utilizado para o diagnóstico da doença, foi negativo para cães com menos de 30 parasitas/ml de amostra e foi positivo em todos os casos acima deste intervalo.

PCR – Real Time

O PCR Real Time identifica o DNA ou RNA de uma sequência do genoma do patógeno e é extremamente sensível à presença de poucos organismos nas amostras, por isso sua sensibilidade é maior do que o PCR convencional. Isto faz com que teste por DNA através de PCR - RT constitua um método muito mais acurado e avançado para pesquisa e fins diagnósticos em relação a testes sorológicos convencionais que detectam anticorpos, principalmente nos casos de infecções super-agudas em que os níveis de anticorpos ainda não aumentaram a ponto de serem detectados na sorologia.

Evolução da carga parasitária no acompanhamento do tratamento

Uma das principais vantagens do PCR-RT é a possibilidade de quantificar a carga parasitária das amostras de punção de medula óssea, punção de linfonodo ou baço e sangue total. Sendo assim, essa técnica nos permite avaliar cães que estão em tratamento. No mesmo experimento relatado anteriormente, alguns cães que foram tratados tiveram suas amostras comparadas pelo PCR convencional e pelo PCR-RT. Os resultados no PCR em tempo real quantitativo (qPCR-RT), demonstraram que houve uma diminuição gradual da carga parasitária em alguns cães, e as mesmas amostras 18

LEISHMANIOSE

foram negativas por PCR convencional após 3 ou 6 meses de tratamento. Por outro lado, outros cães que foram positivos por PCR convencional em cada ponto de análise qPCR-RT, mostram diferentes cinéticas do parasita. Houve um cão que mostrou uma diminuição gradual da carga parasitária após 3 meses de tratamento e outro cão respondeu inicialmente ao tratamento com uma diminuição drástica da carga de parasita, seguida por um aumento drástico na carga parasitária, que acabou sendo concomitante com uma reincidência da doença.

Detecção de Leishmania no sangue periférico

As amostras de sangue total periférico em EDTA e aspirado de medula óssea de alguns cães foram obtidas ao mesmo tempo e submetidas a PCR convencional para L. infantum. Todas as amostras também eram analisadas pelo ensaio de qPCR-RT, a fim de comparar a carga parasitária de cada animal em ambos tecidos e para validar o sangue periférico como uma amostra adequada para detecção de Leishmania. Todos os cães foram positivos para qPCR-RT de Leishmanias, com a carga parasitária variando de 7 parasitas/ml de amostra para 14.055 parasitas/ml de amostra

em amostras de sangue periférico e a partir de 13 parasitas/ml até 12.287.840 parasitas/ml em aspirados de medula óssea. As diferenças nas cargas parasitárias obtidas entre aspirado de medula óssea e sangue periférico do mesmo animal variaram de 4 vezes até 5000 vezes mais elevadas.

Considerações Finais

O objetivo do presente estudo foi validar a aplicação do PCR em tempo real quantitativo (qPCR) a fim de abordar, tanto o problema associado ao PCR convencional no diagnóstico de leishmaniose canina, quanto o acompanhamento da parasitemia no pós-tratamento e no desenvolvimento de novas vacinas ou testes para elaboração de drogas. Em áreas endêmicas, a interpretação dos resultados de alguns testes diagnósticos para Leishmania confrontaram-se com a soroprevalência em cães sub-clínicos, e os clínicos na medicina veterinária estão enxergando os métodos de PCR como rotina. Por outro lado, estudos anteriores destacaram que uma grande parte dos cães que vivem em uma área onde a leishmaniose canina é endêmica são infectados por Leishmania e a prevalência de infecção é mais elevada do que a prevalência da doença: 67%

dos animais eram soropositivos e/ ou positiva por PCR convencional enquanto que a prevalência da doença era de 13%. Portanto, um resultado positivo no PCR convencional também pode ser obtido em cães sub-clínicos e assintomáticos, especialmente em áreas endêmicas, já que a leishmaniose canina está associada com cargas teciduais de parasitas residuais. Com essa nova tecnologia de qPCR-RT baseado na Sonda TaqMan e tendo como objetivo o minicírculo de cinetoplasto a fim de maximizar a sensibilidade do ensaio, a sensibilidade de 0,001 parasitas por reação de PCR obtida com o ensaio TaqMan é semelhante à recentemente descrita para infecção por Leishmania em humanos, e é mais elevada do que a relatada em trabalhos anteriores devido aos dois alvos (cinetoplasto) e a sonda TaqMan. Além disso, a amplitude dinâmica linear de 7 “logs” nos permite discernir entre 0,01 e 10.000 parasitas de Leishmania em uma única reação, que corresponde a menos de 1 parasita/ml até mais de107parasitas/mL de amostra. Embora as parasitemias abaixo de 1 parasita/ml sejam inferiores ao limiar teórico correspondente a um parasita presente na amostra clínica submetida à extração, resultados semelhantes foram relatados em amostras 19

LEISHMANIOSE diagnóstico e acompanhamento da leishmaniose canina, especialmente em áreas endêmicas, onde uma grande parte da população canina está exposta ao parasita, mas apenas uma menor parte dos cães desenvolvem doença clínica. Os dados contínuos fornecidos pelo qPCR em tempo real poderiam resolver o dilema para o clínico manejar os casos de leishmaniose canina através da diferenciação entre cães infectados por Leishmania ou cães com doença ativa. humanas. Isto poderia ser devido a um rendimento de extração prejudicado quando a parasitemia é muito baixa ou pela detecção de resíduos de DNA parasitário que persistem durante um tempo dentro dos macrófagos após a destruição do parasita. A quantificação de parasitas por qPCR em tempo real pode ser utilizada para elucidar o estado de cães que sejam positivos para Leishmania por PCR convencional, especialmente em áreas endêmicas. É importante ressaltar que os dados resultantes de PCR convencional são variáveis discretas com apenas dois valores possíveis: positivas ou negativas. Até mesmo as amostras com 5“logs” de diferença na carga parasitária serão positivas por PCR convencional. Levando-se em conta que todas as amostras enviadas a análise de PCR para Leishmania são de cães demonstrando qualquer sinal clínico compatível com a doença, que os sinais clínicos da leishmaniose são diversos, não específicos e compatíveis com outras doenças e que, numa área endêmica pode-se encontrar cães com uma sorologia duvidosa que podem estar infectadas com o parasita, mas sem uma doença ativa, a capacidade de discriminar de 0,001 a 10,000 parasitas de Leishmania numa única reação poderia ajudar na decisão clínica. O qPCR tempo real também se revelou muito útil para o acompanhamento da carga parasitária, a fim de estimar a eficácia de tratamento ou a evoluçãoda doença. Estudos anteriores em leishmaniose humana usando pacientes 20

imunocomprometidos indicam que a recidiva clínica está associada ao nível de parasitemia, e estimou que um aumento acima de 10 parasitas/ml de sangue precedia uma recidiva clínica. De forma semelhante, a aplicação do qPCR de acompanhamento após a terapia vai ajudar no prognóstico de LC e também na previsão de recidivas de infecção no levantamento de cães em situação de risco. Outra vantagem do qPCR frente ao convencional é a de que o qPCR permite a monitorização da progressão da infecção de uma forma mais precisa e melhor avaliação da eficácia do tratamento para cada cão, mesmo em um acompanhamento de curta duração. O sangue pode ser suficiente para o diagnóstico de infecção devido à capacidade de quantificar níveis extremamente baixos de parasitemia por qPCR, e pode evitar a necessidade de realizar aspirações de medula óssea mais invasivas. No entanto, a carga parasitária é diferente entre os tecidos, devido ao fato de que a infecção por Leishmania poderia ser tecido-dependente em cães, seja por tropismo tecidual ou por imunidade orgão-específica. Assim, a seleção do tecido a ser analisado é uma questão a ser considerada pelo médico veterinário. Este ensaio de qPCR em tempo real também foi aplicado para a rotina de diagnóstico em aspirado de linfonodo, biópsias frescas ou incorporadas em parafina originadas de tecidos diferentes, urina e swabs conjuntivais. Os resultados apresentados aqui destacam as vantagens que o ensaio de qPCR em tempo real oferece no

EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS

CÓD - EXAME

PRAZO/DIAS

483 - LEISHMANIA CHAGASI MÉTODO PCR REAL TIME QUALITATIVO

680 - LEISHMANIA CHAGASI METODO PCR REAL TIME QUANTITATIVO

447 - LEISHMANIOSE CANINA DILUICAO TOTAL

83 - LEISHMANIOSE CANINA ( DPP + ELISA + RIFI )

456 - IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LEISHMANIOSE

408 - PESQUISA DE LEISHMANIOSE

39 - HEMOGRAMA COMPLETO

570 - PERFIL CHECK UP GLOBAL DE FUNÇÔES

Referências Bibliográficas

Texto baseado na publicação de: O. Francino; L. Altet; E.Sa´nchez-Robert;

A. Rodriguez; L. Solano-Gallego; J. Alberola; L.Ferrer; A.Sa´nchez; X. Roura.

LEISHMANIOSE

F I S I O P ATOL OG I A D A LEISHMANIOSE VISCERAL CA N IN A DR. PAULO TABANEZ DR. PAULO TABANEZ MEMBRO FUNDADOR BRASILEISH | DIRETOR CLÍNICA VETERINÁRIA TABANEZ - DF

A leishmaniose visceral é uma doença infecciosa de transmissão vetorial causada pelo protozoário Leishmania infantum, parasito intracelular obrigatório, encontrado principalmente em macrófagos (Figura 1). O vetor infectado, Lutzomyia longipalpis, durante o repasto sanguíneo, pode infectar vários mamíferos como o homem, cão, gato, rato, gambá, raposa entre outros (DANTAS-TORRES et al., 2012). A apresentação clínica da doença no cão é bastante variada. Os cães infectados podem ser assintomáticos (cerca de 60%) ou sintomáticos. É necessária avaliação mais profunda e correlação destes sinais com as alterações laboratoriais e patológicas, pois a leishmaniose visceral é uma doença com sinais inespecíficos e multissistêmicos, o que dificulta, confunde e amplia o espectro de diagnósticos diferenciais (SOLANO-GALLEGO et al, 2011).

Figura 1: Formas amastigotas de Leishmania sp em macrófago na medula óssea de cão (coloração panotico, aumento 1000x)

A evolução da doença em cães infectados é consequência da interação parasito hospedeiro, onde se acredita que a programação genética do paciente dirija a resposta imunitária, tornando-o mais susceptível ou resistente à doença. Outros aspectos também influenciam a polarização dos sinais clínicos como fatores nutricionais, doenças concomitantes, imunossupressão, carga e cepa parasitária inoculada e resposta imunitária local. Algumas raças, como

Cocker Spainel, Boxer, Rottweiller, parecem mais susceptíveis a doença, enquanto que outras raças, como o Ibizian Hound, raramente apresentam sinais (SOLANO-GALLEGO et al., 2000; FRANCA-SILVA et al., 2003). A idade parece ser outro fator importante. A apresentação da doença ocorre principalmente em animais com menos de 3 anos e mais de 8 anos (CARDOSO et al., 2004). A influência do sexo ainda não está bem definida (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). A resposta imunitária do indivíduo tem papel central na apresentação clínica. A resposta imunitária protetora é mediada pelos linfócitos auxiliares do tipo 1 (LTA1), enquanto que os animais susceptíveis apresentam resposta predominantemente mediada pelos linfócitos auxiliares do tipo 2 (LTA2). Esta dicotomia não é tão clara e definida quanto a que ocorre no modelo experimental para L. major. A infecção no cão induz resposta mediada tanto por LTA1 quanto por LTA2, e o equilíbrio destas duas respostas define a replicação parasitária, a progressão da doença ou a cura do indivíduo (MAIA e CAMPINO, 2012). Os LTA1 produzem fator de necrose tumoral (TNF), interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-12 e interferon gama (IFN-γ) que aumentam a capacidade fagocítica e microbicida do macrófago, levando a destruição do parasito por mecanismos relacionados a explosão respiratória, principalmente produção de óxido nítrico. Por outro lado, os LTA2 estimulam a produção de citocinas antiinflamatórias, como IL-4, IL-10, IL-13 e fator de crescimento transformante (TGFβ) levando a diferenciação dos linfócitos B em plasmócitos secretores de imunoglobulinas, que não apresentam papel protetor na infecção e contribuem para imunopatologia (KAYE e SCOTT, 2011). Os sinais clínicos são relacionados

aos mecanismos imunopatogênicos como a deposição deimunocomlexos, autoimunidade, hiperrreatividade de linfócitos B e imunossupressão. A deposição de imunocomplexos ocorre principalmente na parede de vasos na microcirculação onde se originam os ultrafiltrados. Esta deposição ativa resposta do sistema complemento e atrai mais células inflamatórias levando o dano tecidual. Portanto, leões como uveíte, glomerulonefrite, artrite e vasculites são comuns na leishmaniose visceral canina (FERRER, 1992). O aparecimento dos sinais clínicos normalmente é seguido de marcada resposta humoral com produção de altos títulos de anticorpos, depressão das respostas imunitária celular e de hipersensibilidade tardia (DTH) intradérmica aos antígenos da Leishmania sp., diminuição dos linfócitos T no sangue periférico (PINELLI et al., 1994) e ausência de IL-2 e INF-γ produzido pelos macrófagos in vitro (MARTÍNEZ-MORENO et al., 1995; BARBIÉRI, 2006). Por outro lado, cães resistentes ou assintomáticos desenvolvem baixos títulos de anticorpos e baixo parasitismo, além de forte resposta linfocitária proliferativa in vitro e recuperação da resposta de hipersensibilidade tardia (CARRILLO e MORENO, 2009). Os sinais clínicos mais comuns são lesões de pele, linfadenomegalia, emagrecimento, atrofia muscular, onicogrifose, oftalmopatias, anemia e glomerulopatias (CIARAMELLA et al., 1997; KOUTINAS et al., 1999; BANETH

et al., 2008; SOLANO-GALLEGO et al., 2009, SOLANO-GALLEGO et al., 2011)

(Figura 2). Os sinais dermatológicos estão presentes em cerca de 81-89% dos casos. Os cães podem apresentar lesões alopécicas, descamativas, não pruriginosas, localizadas ou generalizadas, decorrentes de dermatite esfoliativa, ulcerativa, papular, nodular ou pustular (Figura 3).

LEISHMANIOSE A

A prevalência dos sinais oculares varia entre 16% e 80%, podendo ocorrer em conjunto com outros sinais ou isoladamente em cerca de 16% dos casos

(CIARAMELLA et al., 1997; KOUTINAS et al.,

Figura 2: Sinais comuns de leishmaniose visceral em cães. A) Linfadenopatia; B) Emagrecimento, caquexia e atrofia muscular; C) Onicogrifose

Figura 3: Sinais dermatológicos em cães com leishmaniose visceral. A) Dermatite esfoliativa/ descamativa com alopecia; B) Dermatite e alopecia em face com dermatite ulcerativa em pavilhão; C) Cancro de inoculação em ponta de orelha (dermatite nodular).

1999; PEÑA et al., 2000). As manifestações oculares mais comuns são as blefarites (esfoliativa, nodular e ulcerativa), conjuntivite, ceratoconjuntivite comum ou seca (CCS) e uveíte anterior (Figura 4). As lesões oculares podem ser uni ou bilaterais, no segmento posterior mas predominantemente, na câmara anterior. Os sinais clínicos como alopecia periocular, prurido, secreção ocular, hiperemia de conjuntiva, hiperpigmentação e edema de córnea, ulceração, blefaroespasmo, hifema, diminuição da acuidade visual, cegueira, entre outros, são relatados. Os mecanismos patogênicos associados às lesões oculares, como a infiltração inflamatória e a deposição de imunocomplexos, parecem ser os mesmos descritos para outros órgãos (PEÑA et al., 2000; NORANJO et al., 2005;

PEÑA et al., 2008; BRITO et al., 2010). A uveíte anterior parece ser mais comum com apresentação aguda, presença de fibrina ou formações nodulares no estroma da íris. Na CCS, o infiltrado inflamatório localizado ao redor dos ductos lacrimais causa retenção e diminuição da produção lacrimal. O descolamento de retina pode ocorrer por coroidite ou por hipertensão sistêmica, podendo levar o animal a cegueira súbita. Outras manifestações oculares menos comuns já foram reportadas como ciclite, coriorretinite, catarata, glaucoma e celulite orbital (CIARAMELLA et al., 1997; PEÑA et al., 2000). O exame oftalmológico minucioso deve ser realizado em todo cão com leishmaniose no intuito de diagnosticar precocemente as alterações e prevenir a evolução da doença ocular. A doença renal é a principal causa de morte nos cães com leishmaniose visceral. Seu diagnóstico e manejo representam um desafio constante para os clínicos, pois, muitas vezes, cursa de forma silenciosa e subclínica. A glomerulonefrite membranoproliferativa e mesangial proliferativa foram os tipos histológicos mais comuns (COSTA et al., 2003). A deposição de imunocom-

plexos nos capilares glomerulares e na membrana basal parece ser o mecanismo imunopatogênico para a nefrite (SOARES et al., 2009). Entretanto, suspeita-se que a resposta imune celular também esteja envolvida na patogênese da nefropatia nesta doença (COSTA et al., 2000). Inicialmente, os cães podem apresentar moderada a severa proteinúria na ausência de azotemia. Com a progressão da doença glomerular, observam-se lesões tubulares e intersticiais, azotemia, síndrome nefrótica e insuficiência renal crônica (COSTA et al., 2003; ZATELLI et al., 2003; PLEVRAKI et al., 2006). A leishmaniose visceral no cão está associada a altas prevalências de doença renal crônica e, portanto, é importante diagnosticar, avaliar e estadiar a doença renal de acordo com o International Renal Interest Society (IRIS), usando critérios como creatinina, relação proteína creatinina urinária e pressão arterial, para que o paciente possa ter maior sucesso terapêutico e qualidade de vida (IRIS, 2006). Distúrbios hemorrágicos, como epistaxe, hematúria e diarreia hemorrágica estão associados à alteração da hemostasia primária, trombocitopatia e trombocitopenia, e da hemostasia secundária, como diminuição dos fatores de coagulação e fibrinólise, apesar de ainda não completamente elucidados os mecanismos patogênicos que levam a estes sinais ( JUTTNER et al., 2001; CIARAMELLA et al., 2005; CORTESE et al., 2011) (Figura 5).

Distúrbios na locomoção podem ser causados quando os sistemas ósseo, nervoso ou muscular são afetados. A poliartrite, polimiosite e lesões ósseas, proliferativas ou líticas, são as causas dos sinais clínicos mais comuns que levam à dificuldade de locomoção, como claudicação, atrofia muscular e dor ou crepitação articular (KOUTINAS

et al., 1999; AGUT et al., 2003; SANTOS et al., 2006).

Alterações cardiopulmonares e neurológicas são menos frequentes (BLAVIER et al., 2001). Outras alterações laboratoriais consistem em anemia, leucocitose ou leucopenia, trombocitopenia, aumento da atividade das enzimas hepáticas, proteinúria (relação proteína/creatinina urinária > 0,5), azotemia renal (IRIS estágios II, III ou IV), hipoalbuminemia, hiperproteinemia

LEISHMANIOSE por aumento policlonal das globulinas (frações gama e beta) e diminuição da taxa albumina/globulina (CIARAMELLA et al., 1997; KOUTINAS et al., 1999). A leishmaniose é uma doença inflamatória, sistêmica e crônica, que pode envolver qualquer órgão, tecido ou fluido corporal. Sua apresentação clínica é bem variada, inespecífica e mimetiza qualquer outra doença. Conhecer a resposta imunitária, a fisiopatologia da doença e a apresentação clínica são os primeiros passos para o diagnóstico preciso e a condução do paciente.

Figura 4: Alterações oculares em cães com leishmaniose visceral. A) Uveíte; B) Hifema; C) Blefarite

EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS CÓD - EXAME

PRAZO/DIAS

316 - PERFIL COMPLEMENTAR PARA LEISHMANIOSE

44 - HEMOGRAMA COMPLETO

290 - LEISHMANIOSE FELINA (ELISA + RIFI)

456 - IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LEISHMANIOSE

408 - PESQUISA DE LEISHMANIOSE

483 - LEISHMANIA CHAGASI MÉTODO PCR REAL TIME QUALITATIVO

680 - LEISHMANIA CHAGASI METODO PCR REAL TIME QUANTITATIVO

451 - PESQUISA DE SPOROTRIX SCHENKIIE

447 - LEISHMANIOSE CANINA DILUICAO TOTAL

83 - LEISHMANIOSE CANINA ( DPP + ELISA + RIFI )

582 - PERFIL LEISHMANIOSE (DPP+ELISA+RIFI) E PROT. TOT/ FRAC.

573 - PERFIL COMBO DE LEISHMANIA IMUNOHISTOQUMICA + SOROLOGIA

738 - PERFIL LEISHMANIOSE SOROLOGIA + IMUNO-HISTOQUIMICA

810 - PERFIL PCR DOADORES DE SANGUE

Referências Bibliográficas: Solicite as referências bibliográficas para sac@tecsa.com.br

Figura 5: Epistaxe em cão com leishmaniose visceral

Todas as fotos deste artigo foram fornecidas pelo seu autor Dr. Paulo Tabanez.

Obs.: os artigos assinados são de inteira responsabilidade dos autores e não representam necessariamente, a visão e opinião do TECSA Laboratórios.

LEISHMANIOSE

EXAMES LABORATORIAIS PARA O DIAGNÓSTICO DA LVC

A doença, transmissão e sinais clínicos

A Leishmaniose é uma zoonose (acomete seres humanos e animais) causada por protozoário do gênero Leishmania. Trata-se de uma doença com distribuição ampla e em crescente expansão no território brasileiro, além de estar presente em vários outros países da Europa, Ásia e África. A transmissão é feita principalmente pela picada de flebotomíneos infectados que albergam o parasita se desenvolvendo em seu trato digestivo. O ciclo da enfermidade se perpetua quando o vetor, ao picar um animal doente, adquire o protozoário. Este matura-se e completa seu ciclo, tornando-se infectante. Ao se alimentar picando um animal sadio ou homem, transmite-lhes o agente. Outras formas de transmissão são relatadas como, por exemplo, transmissão congenita, coito e transfusão sanguínea. Os sinais clínicos da doença podem variar. Não há sinais patognomônicos. Animais podem se apresentar assintomáticos ou sintomáticos, as manifestações clínicas podem aparecer aleatoriamente, além de variar de indivíduo para indivíduo e estágio da doença.

Sinais: • Alopecia periocular bilateral • Anorexia, Emagrecimento progressivo e Caquexia • Feridas de difícil cicatrização • Alterações comportamentais • Anemia • Crescimento exagerado das unhas (onicogrifose) • Alopecia • Linfadenomegalia

Diagnóstico laboratorial

O diagnóstico da doença leishmaniose é feito pelo Médico Veterinário responsável, por meio da correlação de dados clínicos e epidemiológicos com resultados apresentados em exames laboratoriais de rotina, triagem e confirmatórios, excluindo ainda o diagnóstico diferencial. É de extrema importância que a coleta de sangue para realização dos exames seja realizada de maneira correta (tricotomia e antissepsia local, evitar garroteamento prolongado, utilização de seringa e agulha de calibre adequado) e a amostra seja devidamente identificada e armazenada/conservada. Sempre é recomendável o jejum de 8 horas para qualquer análise sorológica, evitando lipemia que pode acelerar

Figura 1: Ciclo da Leishmaniose. Fonte: www.uni-tuebingen.de/.../leishmania_cycle.jpg

a hemólise e alterar resultados. O material a ser coletado e enviado para exame sorológico é 2,0 mL sangue total ou 1,0 mL de soro. No caso de sangue total, esse deve ser acondicionado em tubo sem anticoagulante (TAMPA VERMELHA) e armazenado sob refrigeração após a retração do coágulo. No caso do envio de soro, esse pode ser enviado congelado ao laboratório.

Os principais exames sorológicos aceitos como padrão no mundo acadêmico para diagnóstico da LVC são, ELISA – Enzime Linked Immunoassay + RIFI – Reação de Imunofluorescência Indireta, nos quais são pesquisadas Imunoglobulinas G. As duas técnicas se complementam em especificidade e sensibilidade, sendo assim nunca deve-se utilizar apenas um método sorológico. A combinação dos dois métodos é obrigatória Por que utilizamos dois métodos sorológicos na Leishmaniose? Pelo mesmo motivo que o Ministério da Saúde padronizou dois métodos no diagnóstico da HIV – para aumentar a certeza do diagnóstico laboratorial uma vez que se trata de doença grave. Um método sorológico (ELISA) complementa o outro (RIFI) em Sensibilidade e em Especificidade, a análise dos dois em conjunto é que vai nos dar um diagnóstico laboratorial com maior segurança. Com o intuito de garantir a segurança e confiabilidade dos resultados, o TECSA Laboratórios SEMPRE realiza as duas técnicas e orienta sua repetição em intervalo de 21 a 30 dias, uma vez que o paciente

LEISHMANIOSE

Figura 2: Imagens do setor de imunologia do TECSA Labs.

pode se apresentar em processo de soroconversão (“janela imunológica”) ou mesmo apresentar reações inespecíficas devido à vários outros fatores que elevem a produção de imunoglobulinas.

O exame de Imunofluorescência Indireta – IFI Este método depende de uma leitura visual e para isto é necessário que o técnico seja extremamente competente e com muita experiência. Além disto, é importante uma leitura em duplicata, por observadores diferentes e sem saberem os resultados um do outro. Todos os casos conflitantes devem ser revistos (Retestados) por um terceiro profissional experiente. No TECSA nossas leituras são realizadas por Profissionais com vários anos de experiência em Leitura de Leishmaniose e todos são supervisionados e liberados na bancada por um Médico Veterinário. Com mais de 20 anos de experiência em Laboratório diagnóstico e com centenas de milhares de exames de Leishmaniose já realizados, muita coisa já vimos e muitos casos raros e inusitados também, o que nos dá uma vivência enorme para compartilharmos com os colegas. Existe Reação cruzada? Pode haver alguns animais reagentes na RIFI e Não reagentes ou Indeterminados (Zona Cinza – perto do Cutoff do teste) no ELISA, pois o excesso de sensibilidade da RIFI pode levar (em títulos baixos sempre) a resultados que espelham uma reação cruzada com outras patologias. O

melhor a fazer nestes casos é solicitar a Sorologia com Diluição Total para ver até que ponto está o título no exame de RIFI, caso esteja acima ou igual a 1/160 descarte reação cruzada – este cão tem Leishmaniose, mesmo se o ELISA tiver indeterminado - isto vai ser possível pois o ELISA está menos sensível do que a RIFI, porém mais específico. No caso de suspeita de reação cruzada a primeira coisa a fazer são os testes diagnósticos de patologias que podem levar a este quadro. Pesquise a presença de hemoparasitas, inclusive a presença de Tripanossoma . Não se esqueça de situações como Prenhez, Dermatopatias crônicas, endocrinopatias , etc, que podem alterar a dinâmica de anticorpos. Deu um resultado Reagente no ELISA e Não reagente na RIFI o que pode ser? Pode ser algum problema sério na conservação desta amostra – por exemplo amostra hemolisada - repita o exame em outra amostra. Discuta com o Patologista do Laboratório. Deu um resultado Reagente no RIFI e Não reagente ou Indeterminado no ELISA o que pode ser? Pode ser reação cruzada com outra patologia, pesquise as patologias que mais frequentemente dão reação cruzada. Pode ser o início de uma soroconversão de animal infectado pois com a RIFI mais sensível do que o ELISA , nós podemos começar a ter Reagentes apenas no RIFI. Repita o exame após

21 a 30 dias – neste intervalo este animal deve ser considerado suspeito, use coleira + repelentes, etc. Caso se mantenha da mesma forma parta para um exame Parasitológico. Caso o resultado da RIFI seja 1/80 solicite diluição Total ao laboratório, caso obtenha resultado maior ou igual a 1/160, descarte reação cruzada e considere este animal como Reagente. Este resultado também pode ocorrer quando existe uma hemólise muito acentuada da amostra. Animal em tratamento que consegue “negativar" o ELISA mas mantém a RIFI com baixos títulos. Lembre-se que existem Proprietários administrando Alopurinol por conta própria e isto causa uma mudança total na interpretação dos resultados dos exames. Sorologia com Diluição total, o que é isto? O exame de Reação de IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA- RIFI, é o exame sorológico que determina com títulos se for Reagente, começando com 1/40 - que é considerado um título baixo e na zona cinza da RIFI e indo até títulos como 1/1280 ou mais. Quanto maior o título da RIFI, pior o prognóstico, segundo a literatura científica. Portanto, saber em qual patamar, com qual título está o animal, é muito importante. No TECSA você pode solicitar a diluição TOTAL. Na rotina diluímos até 1/80, mas se solicitar diluição Total vamos diluir até o máximo título. Títulos maiores ou iguais a 1/160 já afastam a possibilidade de ser uma reação cruzada, pois as reações cruzadas são quase sempre com títulos de 1/40 - 1/80.

Outros exames laboratoriais para diagnóstico com evidenciação direta ou indireta do agente PCR Real Time Teste molecular com alta sensibilidade e especificidade associada à robustez. Alta capacidade de detecção e amplificação do material genético do parasito, sendo ainda passível de quantificação da carga parasitária. 25

LEISHMANIOSE Pesquisa de Leishmania (Parasitológico por citologia) Quando métodos sorológicos não são conclusivos, pode-se ainda pesquisar pelo parasita em material obtido de punção de medula óssea vermelha, linfonodo ou baço.

Imunohistoquímica/ Imunocitoquímica Exames complementares ao diagnóstico sorológico, baseado em pesquisa direta “imunodirecionada” podendo ser realizada em material obtido por punção ou mesmo biopsias (material previamente fixado em formol a 10%), sendo possível realizar em fragmentos de pele (ex.: ponta de orelha e feridas de difícil cura). Exames de apoio Vários trabalhos científicos evidenciam que a relação A/G, embora não seja patognomônica, possui correlação com a infecção por Leishmania (valores menores que 0,60 são forte indício de infecção). •Eletroforese de proteínas séricas •Proteína sérica total e frações

Importância da realização de sorologia no diagnóstico laboratorial da Leishmaniose

Mundialmente e especialmente nas áreas endêmicas, os exames sorológicos devem ser realizados rotineiramente nos cães, uma vez que os mesmos podem se constituir reservatórios da doença e não apresentarem sintomatologia. Além disso atestar que um animal não está infectado constitui-se prérequisito para iniciação de protocolos vacinais contra a doença. Resultados divergentes entre as duas técnicas sorológicas ou que apresentem reações fracas, podem ser atribuídos a diversas causas, como por exemplo: qualidade da amostra (hemólise), possibilidade de reações cruzadas ou inespecíficas, início de soroconversão ou mesmo uso indiscriminados de fármacos (automedicação com corticoides ou aluporinol). Sendo assim nova sorologia é recomendada, além de outros exames complementares como proteinograma (proteína total e frações) ou mesmo 26

screening geral do paciente como Hemograma Completo, Check Up Global de Funções e Urinálise e o Perfil Doenças transmitidas pelo Carrapato.

Perfis Facilitadores para Diagnóstico

Perfil Leishmaniose Sorologia + Proteína Total e Frações (cod 582); Perfil Complementar de Leishmaniose (cod 316);

apresentarem resultados reagentes devem ser testados laboratorialmente nas técnicas de ELISA e RIFI. Este Kit está em fase final de registro no MAPA e em breve estará sendo comercializado pelo TECSA. EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS CÓD - EXAME

PRAZO/DIAS

Perfil Combo de Leishmaniose (cod 573);

316 - PERFIL COMPLEMENTAR PARA LEISHMANIOSE

Perfil Diagnóstico Ampliado de Leishmaniose I (cod 550);

44 - HEMOGRAMA COMPLETO

290 - LEISHMANIOSE FELINA (ELISA + RIFI)

Perfil Leishmaniose + Pesquisa de Hematozoários (cod 532).

456 - IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LEISHMANIOSE

Exames e para Triagem e Diagnóstico Diferencial

408 - PESQUISA DE LEISHMANIOSE

483 - LEISHMANIA CHAGASI MÉTODO PCR REAL TIME QUALITATIVO

680 - LEISHMANIA CHAGASI METODO PCR REAL TIME QUANTITATIVO

451 - PESQUISA DE SPOROTRIX SCHENKIIE

447 - LEISHMANIOSE CANINA DILUICAO TOTAL

83 - LEISHMANIOSE CANINA ( DPP + ELISA + RIFI )

582 - PERFIL LEISHMANIOSE (DPP+ELISA+RIFI) E PROT. TOT/ FRAC.

573 - PERFIL COMBO DE LEISHMANIA IMUNOHISTOQUMICA + SOROLOGIA

738 - PERFIL LEISHMANIOSE SOROLOGIA + IMUNO-HISTOQUIMICA

810 - PERFIL PCR DOADORES DE SANGUE

Perfil Diagnóstico Ampliado de LeishmanioseII (cod 552); Perfil Diagnóstico Completo de Leishmaniose (cod 330);

Perfil Check Up Global de Funções (cod 570);

Pesquisa de Sarna e Fungos (cod 355); Exame Histopatológico de Pele (cod 86); FAN / ANA - Fator antinuclear e Anticorpo antinucelar (cod 272 / 253); Perfil Doença Transmitida pelo Carrapato (Babesia e Ehrlichia IgM e IgG) (cod 668);

VetCheck Triagem Leishmaniose

Uma nova opção como screening ou mesmo sorologia pré-vacinal, de fácil execução, rápida leitura e interpretação dos resultados é o VetCheck Triagem Leishamaniose. Kit imunocromatográfico com sensibilidade de 96,7% e especificidade de 98,8% comparado com a técnica de RIFI, utilizando antígenos recombinantes de Leishmania infantum chagasi, podendo ser executado na presença do proprietário, no momento da consulta na própria, clínica, hospital ou laboratório. Os animais que

LEISHMANIOSE

OCORRÊNCIA DE LEISHMANIA SP EM GATOS

Introdução

Apesar dos relatos da ocorrência de leishmaniose visceral em felinos, a literatura é muito escassa no que diz respeito à pesquisa de Leishmania chagassi em animais de áreas endêmicas, sendo possível que infecções em gatos sejam relativamente comuns em algumas dessas regiões. Acreditase que gatos infectados possuam certo grau de resistência natural à doença, provavelmente relacionada à fatores genéticos. Apesar da ocorrência de infecções esporádicas, os felinos não são considerados, até o momento, um reservatório importante da doença, havendo poucas informações quanto ao potencial desses animais servirem como reservatórios. Também são pouco conhecidas a prevalência, a transmissão e o quadro clínico da

enfermidade nessa espécie. A primeira referência a leishmaniose felina no ano de 1756, quando Russel, no relatório de sua viagem à cidade de Aleppo, na Síria, descreveu que, além do homem e dos cães, os gatos eram acometidos pela doença. Casos esporádicos da enfermidade foram descritos a partir do século XX, notadamente nos países onde a infecção por Leishmania sp. é endêmica. A primeira descrição de leishmaniose felina (LF) no mundo, ocorreu em 1927, aproximadamente 2 séculos depois de Russel. Atualmente, apesar de ser considerada rara, tem apresentado um aumento significativo no número de casos relatados em todo o mundo. Cerca de 30 casos foram reportados, sendo que 11 deles tiveram origem na América do Sul, dos quais 10 foram diagnosticados no Brasil. O

aumento destes relatos possivelmente foi favorecido pelo avanço nas técnicas de diagnóstico bem como a maior preocupação com a saúde dos animais de companhia, principalmente em países desenvolvidos. Praticamente, as mesmas técnicas utilizadas para evidenciar a presença do parasito e/ou anticorpos contra eles utilizadas no diagnóstico da enfermidade em cães são aplicáveis aos felinos. No entanto, a LF é ainda pouco estudada em vários aspectos, incluindo prevalência, manifestações clínicas, transmissão do parasita ao vetor e espécies dos protozoários envolvidos. Além disso, há pouca informação sobre a real susceptibilidade e importância dos gatos na transmissão de Leishmania sp. Todos estes fortes indícios confirmam que a LF não é uma patologia comum, principalmente por não entrar nos 27

LEISHMANIOSE diagnósticos diferenciais durante a realização de um atendimento no dia a dia da clínica de pequenos animais. Alguns trabalhos publicados discorrem sobre a infecção de gatos domésticos por Leishmania sp, incluindo relatos de casos clínicos e inquéritos epidemiológicos, bem como infecção experimental, atratividade e preferência alimentar de alguns flebotomíneos com relação aos gatos. Em um trabalho realizado em Araçatuba/SP (Claudio Nazaretian Rossi e colaboradores), foram colhidas amostras de soro de 200 gatos, encaminhados ao Centro de Controle de Zoonoses, para análise sorológica e também realizadas biópsias aspirativas de linfonodo, medula óssea, baço e fígado, utilizados para a pesquisa direta de formas amastigotas de Leishmania sp através de exame citológico. A prevalência da doença nessa população de gatos foi de 6,5%. Dos 200 animais avaliados, oito (4,0%) apresentaram resultado parasitológico positivo, seis (3,0%) apresentaram títulos sorológicos acima do ponto de corte pela técnica de ELISA e um (0,5%) evidenciou título superior ao ponto de corte (1:40) pela RIFI, totalizando 13 gatos considerados positivos.

Sinais Clínicos

O quadro clínico na leishmaniose felina é inespecífico e se assemelha ao quadro clínico observado na espécie canina, dificultando o diagnóstico. Sinais como depressão, anorexia, emaciação, estomatite, gengivite, êmese, diarréia, hipertermia, desidratação, hepatomegalia, linfoadenomegalia local ou generalizada, lesões cutâneas, dermatite seborreica úlcero-crostosa, alopecia difusa, uveíte e atrofia da musculatura temporal já foram descritos como formas de apresentação da leishmaniose visceral em gatos, mas na grande maioria dos casos, se apresentam na forma de lesões cutâneas ulceradas e nódulos presentes na face, orelha, focinho (figura 1) e patas. São similares àqueles observados em outras doenças comuns em gatos como criptococose e esporotricose, tornando-se então um diagnóstico diferencial de grande 28

importância. Eventualmente a doença pode assumir uma forma aguda típica e o animal evolui para o óbito em poucas semanas.

clientes as seguintes análises, indicando o material a ser coletado para cada uma delas:

EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS Figura 1: Leishmaniose cutânea em um felino – lesão no focinho (A) e orelha (B). Fonte: Retirado do trabalho de SOUZA e colaboradores.

Diagnóstico

As alterações hematológicas e bioquímicas encontradas em gatos doentes são similares às descritas para a espécie canina. Os principais métodos sorológicos utilizados para diagnóstico têm sido as técnicas de ELISA e RIFI. É possível também a visualização direta das formas amastigotas em exames citológicos confeccionados a partir de amostras provenientes de lesões (figura 2). Da mesma forma que a soroprevalência canina, a felina pode variar sensivelmente de acordo com a metodologia utilizada (amostragem, técnica sorológica e ponto de corte adotado) e com a região geográfica estudada. Além disso, os gatos podem ser mais refratários que os cães à infecção por Leishmania sp. Evidências apontam que a leishmaniose felina pode estar associada a doenças imunossupressoras, em alguns estudos a presença de infecção por Leishmania sp. têm sido correlacionada com soroposititividade para FIV e/ou FeLV.

Figura 2: Formas amastigotas extra e intracelulares em citologia de lesões de um felino infectado. Fonte: Retirado do trabalho de SOUZA e colaboradores.

Para o diagnóstico da Leishmaniose Felina e diagnóstico diferencial, o TECSA laboratórios oferece a seus

CÓD - EXAME

PRAZO/DIAS

579 - PERFIL CHECK UP GLOBAL DE FUNÇÕES

44 - HEMOGRAMA COMPLETO

679 - PERFIL FELINOS - TRIAGEM

290 - LEISHMANIOSE FELINA (ELISA + RIFI)

456 - IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LEISHMANIOSE

408 - PESQUISA DE LEISHMANIOSE

483 - LEISHMANIA CHAGASI - MÉTODO PCR REAL TIME QUALITATIVO

451 - PESQUISA DE SPOROTRIX SCHENKII

255 - CULTURA DE FUNGOS

274 - FIV - IMUNODEFICIENCIA FELINA

371 - FELV - LEUCEMIA FELINA

271 - FIV / FELV - LEUCEMIA E IMUNODEFICIENCIA FELINA

823 - PERFIL FIV E FELV PCR REAL TIME -QUALITATIVO

ENDOCRINOLOGIA

SÍNDROMES METABÓLICAS EM CÃES E GATOS OBESOS

Introdução

O aumento de peso pode levar a um conjunto de alterações fisiológicas no organismo do animal. A obesidade é considerada a forma mais comum de nutrição inadequada, caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura em níveis maiores que os necessários para o bom funcionamento do organismo, desencadeando prejuízos fisiológicos nos animais acometidos. Estima-se que a obesidade faz parte da realidade de 6 a 12% da população de gatos e 25 a 45% da população de cães. Animais são considerados obesos quando o seu peso corporal ultrapassa 20% do ideal de sua raça, além disso, pode-se adotar a mensuração do escore corporal para definir se o animal está ou não com sobrepeso (figura 1). Muitas das causas da obesidade estão relacionadas à baixa qualidade da dieta oferecida pelos proprietários (muitas vezes até com

alimentos caseiros), associados à falta de atividade física, doenças endócrinas e castração. Destaca-se também que a genética de algumas raças predispõe para o sobrepeso de animais, como Cocker Spaniel, Labrador, Golden Retriver, Shetland Sheepdog, Dachshund, Basset Hound, Schnauzer miniatura, Springer Spaniel, Chihuahua e Pug. Existem também raças menos susceptíveis, como o Boxer, Pastor Alemão, Dogue Alemão e Fox Terrier.

Doenças relacionadas

Os distúrbios mais comuns relacionados à obesidade são as doenças

esqueléticas (ruptura de ligamentos e discopatias), doenças cardiovasculares, deficiências imunológicas, diabetes mellitus tipo II, hipertensão, artrites, constipação, lipidose hepática, incontinência urinária em cadelas castradas, problemas respiratórios e dermatopatias. Em gatos, a obesidade é o principal fator na etiologia da resistência à insulina. Em animais obesos, o organismo necessita de uma quantidade maior de insulina para se manter no dia a dia, levando à uma sobrecarga das células pancreáticas produtoras de insulina (células β pancreáticas da porção central das

Figura 1: Escore de condição corporal. Fonte: Veiga, 2007

ENDOCRINOLOGIA O TECSA Laboratórios conta com veterinários experientes para auxiliar os médicos veterinários a fazer um diagnóstico correto de seus pacientes. Para maiores informações entre em contato conosco, teremos um grande prazer em poder ajudar.

EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS

CÓD - EXAME

Ilhotas de Langerhans), gerando a resistência à insulina. Animais que apresentam suspeita dessa doença, começam a demonstrar alguns sinais, como poliúria, polidipsia, polifagia, perda de peso, glicosúria, além de persistente hiperglicemia em jejum (acima de 200 mg/dL).

Diagnóstico

O diagnóstico das doenças relacionadas à obesidade deverá ser realizado com muita cautela e investigação, através da realização de alguns exames laboratoriais, como dosagem de T4 total, T4 livre, cortisol basal, hemograma completo, além de exames relacionados ao sistema renal, pancreático e hepático. Todos os exames laboratoriais deverão ser analisados juntamente com a clínica do animal e o relato dos proprietários.

Conclusão

A reeducação alimentar e física deve ser implementada antes que as doenças 30

relacionadas à obesidade venham a se instalar no animal. Caso contrário, além do sobrepeso, o animal necessitará de tratamento para outras enfermidades, que acabam surgindo devido à elevação do peso corporal. O veterinário responsável pelo atendimento de um animal obeso tem que estar atento a todos os fatores que levam a essa condição, incluindo doenças endócrinas, como o hiperadrenocorticismo e o hipotireoidismo, que deverão ser investigados com ajuda de exames laboratoriais, anamnese e exames físicos.

PRAZO/DIAS

696 - PERFIL HIPOTIREOIDISMO RADIOIMUNOENSAIO

697 - PERFIL HIPERTIREOIDISMO RADIOIMUNOENSAIO

581 - PERFIL GLICEMICO

105 - GLICOSE - GLICEMIA

344 - PERFIL HIPERADRENOCORTICISMO

39 - HEMOGRAMA COMPLETO - CANINO

44 - HEMOGRAMA COMPLETO - FELINO

837 - PERFIL RENAL COMPLETO

340 - PERFIL PANCREATICO

333 - PERFIL HEPATICO

801 - CHECK UP GLOBAL PLUS

339 - PERFIL OBESIDADE

Referências Bibliográficas

SILVA, H. C.; BARION, M. R. L.; ALVARES, A. A. A.; SANTOS, J. M. G. Distúrbios metabólicos em animais obesos. Anais VI mostra interna de trabalhos de iniciação cientifica. 23 a 26 de outubro de 2012.

LAZZAROTTO, J. J. Relação entre aspectos nutricionais e obesidade em pequenos animais. 1999.

Figura 2: Comparação entre um cão com sobrepeso e um cão com o peso ideal da raça Labrador. Fonte: http://tudosobrecachorros.com.br/2010/10/ obesidade.html.

RODRIGUES, L. F.; FIORAVANTI, M. C. S. Métodos de avaliação da condição corporal em cães. Universidade federal de Goiás. 2011.

VEIGA, A. P. M. Suscetibilidade a diabetes mellitus em cães obesos. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, 2007.

ENDOCRINOLOGIA

OBESIDADE EM CÃES E GATOS

Os PETs por serem considerados membros da família atualmente, seguem o estilo de vida de seus donos e normalmente vivem confinados em ambientes pequenos, desta forma, a obesidade humana que já é considerada uma epidemia mundial e uma questão de saúde pública, infelizmente tem se tornado cada vez mais frequente e preocupante também nos animais de estimação. A prevalência de casos de obesidade em cães e gatos tem aumentado significativamente em associação com hábitos alimentares ruins; sedentarismo; castração; fatores genéticos, idade e distúrbios endócrinos. O animal é considerado obeso quando se encontra de 15% a 20% acima

do peso ideal, sendo facilmente identificado através da pesagem, inspeção visual e palpação de tecido adiposo. As costelas não são palpáveis e não é possível visualizar a cintura, além disso os animais obesos tornam-se sonolentos, intolerantes aos exercícios e ao calor e apresentam respiração ofegante. Alguns proprietários não reconhecem ou simplesmente ignoram o excesso de peso e por isso não procuram ajuda médico veterinária para tratar seu companheiro de estimação. Assim como no ser humano, nos animais a admissão e o controle da obesidade é de extrema importância, uma vez que o problema em si não é apenas estético, a obesidade predispõe

doenças musculoesqueléticas, distúrbios cardiovasculares, dermatopatias, Diabetes Mellitus, favorece a lipidose hepática em felinos, compromete a atividade reprodutiva, aumenta os riscos cirúrgicos e anestésicos, promove a queda da competência imunológica e, enfim, a diminuição da expectativa de vida de cães e gatos. Além do exame físico completo, o animal obeso deve passar por uma série de exames complementares laboratoriais, incluindo hemograma, urinálise, bioquímicos e hormonais, para estabelecer diagnósticos diferenciais, avaliar o estado geral do animal e investigar a possibilidade de outra doença concomitante. Por esse motivo, é importante a 31

ENDOCRINOLOGIA CÃES PESO IDEAL

SOBREPESO

15% a 20% acima do peso

OBESIDADE GRAVE 31% a 45% acima do peso

Costelas facilmente palpáveis, sem excesso de gordura (17 a 20%). Silhueta abdominal evidente.

Costelas facilmente palpáveis, sem excesso de gordura (24 a 32%). Silhueta abdominal evidente. Bolsa gordura abdominal mínima.

Costelas palpáveis com diﬁculdade devido a quantidade de gordura (22 a 26%).

Costelas palpáveis com pressão devido a quantidade de gordura (29 a 38%). Gordura abdominal aparente, porém, sem excesso. Gordura corporal elevada (39 a 48%). Grande depósito de gordura sobre as costelas e região lombar. Costelas não palpáveis e cintura ausente. Signiﬁcativa distensão abdominal por depósito de gordura.

Costelas não palpáveis, ou apenas com muita pressão (31 a 37% de gordura) cintura ausente. Deposito evidente de gordura na lombar, base da cauda, pescoço e nos membros. observação de alguns parâmetros para identificação do sobrepeso (Tabela 1), que se detectado, é motivo de alerta. O Médico Veterinário, é o profissional capacitado a identificar as causas envolvidas e estabelecer metas para reverter o quadro o mais rápido possível. Após descartar doenças que levem à essa condição corporal, é importante instituir-se também um plano de emagrecimento, objetivando mudanças de hábitos e comportamentos.

Plano de Emagrecimento

•Alterar a dieta para uma ração balanceada (menos energia e mais fibra) indicada pelo Médico Veterinário. •Aumentar a frequência de fornecimento de ração e diminuir a quantidade oferecida. •Realizar contínuos exercícios físicos, como caminhada, corrida ou arremesso de objetos. •Reduzir o fornecimento de guloseimas (não mais que 10% da caloria diária). •Não fornecer alimentos humanos para os animais. •Realizar acompanhamento durante o período de emagrecimento. 32

GATOS

EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS CÓD - EXAME

PRAZO/DIAS

339 - PERFIL OBESIDADE (HEMOG., TSH, CORTISOL BASAL, COLESTEROL TOTAL, GLICOSE, UREIA, CREATININA, T4 LIVRE)

788 - CHECK UP GLOBAL DE FUNÇÕES COM HEMOGRAMA

581 - PERFIL GLICÊMICO (GLICOSE, GLICOHEMOGLOBINA, FRUTOSAMINA, INSULINA)

107 - LIPIDES TOTAIS

97 - COLESTEROL TOTAL E FRAÇÕES (LDL + VLDL + HDL)

336 - PERFIL HIPOTIREOIDISMO (QUIMIOLUMINESCÊNCIA)

696 - PERFIL HIPOTIREOIDISMO RADIOIMUNOENSAIO

334 - PERFIL HIPERADRENOCORTICISMO

621 - CORTISOL PÓS SUPRESSÃO COM DEXAMETASONA - 3 DOSAGENS (RIE)

630 - CORTISOL PÓS ACTH 2 DOSAGENS (RIE)

234 - URINA ROTINA

MEDICINA LABORATORIAL DE FELINOS

DERMATOFITOSE FELINA: RECOMENDAÇÕES PARA O DIAGNÓSTICO

A dermatofitose é uma infecção fúngica superficial comumente presente na clínica de pequenos animais, possuindo grande importância devido ao seu caráter antropozoonótico. Os agentes etiológicos predominantemente envolvidos são: Microsporum sp. e o Trichophyton sp., sendo que o Microsporum canis é o dermatófito isolado com maior frequência nas infecções dermatofíticas em diversas regiões do Brasil e do mundo. Os microrganismos acometem principalmente animais de pêlo longo, jovens e/ou com o sistema imune debilitado. Devido à sua ocorrência, ao se deparar com um animal doente, é prudente que o médico veterinário considere a dermatofitose em praticamente todos os gatos acometidos por doenças de pele.

Sinais Clínicos

Uma grande variabilidade de lesões pode ocorrer na apresentação clínica da doença, o que pode mimetizar uma série

de outras dermatoses. Os sintomas mais comumente observados são a alopecia (focal ou generalizada) e a presença de crostas e escamas, sendo que as lesões se situam mais frequentemente na região cefálica e tronco. Lesões granulomatosas em forma de anel são de difícil resolução e podem ser vistas em gatos Persas ou Himalayan com dermatofitose generalizada causada por M. canis. Já os sintomas menos comuns, incluem a dermatite miliar, dermatite granulomatosa, prurido, pseudomicetoma e onicomicose.

Diagnóstico

Quando apenas as características clínicas são avaliadas, o diagnóstico pode ser comprometido. Desta forma, é importante a utilização de testes laboratoriais, que são capazes não só de identificar a espécie fúngica, como também de detectar animais portadores e avaliar a eficácia do tratamento. Lâmpada de Wood: Um dos testes

diagnósticos muito comuns utilizados na clínica é a lâmpada de Wood, uma radiação ultravioleta que induz fluorescência esverdeada em moléculas produzidas durante o parasitismo pelo M. canis. Apesar de útil, este teste pode gerar falso-negativos, uma vez que o único dermatófito a ser diagnosticado é o M. canis., e destes, apenas cerca de 50% apresentam fluorescência. A ocorrência de falsos positivos também é possível, pois os resquícios de algumas substâncias (como álcool, éter e xampus contendo derivados de iodo e mercúrio) podem gerar fluorescência. Desta forma, é recomendado que a Lâmpada de Wood seja utilizada apenas como um teste de triagem (figura 1).

Figura 1: Lâmpada de Wood e Fluorescência em felino exposto ao teste. Fonte: www.zoetisus.com

MEDICINA LABORATORIAL DE FELINOS

Exame direto (raspado): Inicialmente é importante que seja realizado o exame direto da amostra, onde se busca a presença ou ausência de formas fúngicas. Esse método utiliza o hidróxido de potássio (KOH) a 10% ou 30% como clarificante da amostra, que por sua vez é depositada entre lâmina e lamínula e observada em microscopia óptica, em objetivas de 10x ou 40x (figura 2). Apesar de ser um método de rápida execução, há a desvantagem de que os resultados negativos são muitas vezes inconclusivos.

Figura 2: Aspecto microscópico do Microsporum canis. Fonte: Dra. Isabela Azevedo R. M. Carvalho - TECSA Laboratórios.

Cultura fúngica: A cultura fúngica é reconhecida como o método mais confiável e padrão-ouro para o diagnóstico das dermatomicoses. O ágar Sabouraud dextrose é o meio básico, o qual é modificado para possibilitar distinções mais precisas entre os dermatófitos e os fungos saprófitos. Atualmente o DTM (Dermatophyte test medium) é a modificação mais comumente utilizada. Quando uma espécie de dermatófito é cultivada em DTM, a mesma utiliza o substrato protéico do meio, promovendo pH alcalino. Neste caso, a mudança de cor ocorre simultaneamente com o início do crescimento fúngico, auxiliando o diagnóstico (figura 3). 34

é longo, requer comprometimento e paciência, sendo indicados medicamentos de uso tópico e oral. Todo o material associado à manutenção e movimentação do animal (camas, caixas de transporte, escovas) são fontes potenciais de infecção e reinfecção dos animais. Desta forma, é importante tosar o animal, separar dos demais e fazer uma desinfecção do ambiente, pois o M. canis pode permanecer ativo por até dois anos em locais que dêem condições à sua sobrevivência. Figura 3: Kit VetCheck e a mudança de cor em meio DTM. Fonte: VetCheck - TECSA Laboratórios e Dr. Tales Luís Bezerra.

Pela sua complexidade, a cultura fúngica requer um período de tempo superior ao exame direto, uma vez que o crescimento de isolados de dermatófitos leva cerca de 14 dias à temperatura de 25 - 28ºC. Após o crescimento das colônias, a análise micromorfológica é feita a partir do exame de uma alíquota retirada do ágar e montada entre lâmina e lamínula. A cultura fúngica pode apresentar resultados falso-negativos em algumas situações, principalmente se o animal examinado tiver recebido alguma medicação antifúngica ou forem colhidas amostras que não contêm artrósporos fúngicos viáveis. Por outro lado, a cultura fúngica pode resultar falso-positivas quando os animais forem carreadores mecânicos de esporos fúngicos na cobertura pilosa, sem apresentar a infecção ativa. O diagnóstico laboratorial depende diretamente de uma coleta adequada. Os pêlos devem ser coletados preferencialmente nas bordas da lesão, onde se encontra a infecção ativa por dermatófitos. O material obtido deve ser conservado em temperatura ambiente, identificado e acondicionado adequadamente. Além disso, devido ao risco de apresentarem resultados falso-positivos ou falsonegativos, é recomendado que os exames não sejam realizados isoladamente, e sim combinados para a obtenção de resultados mais acurados

Tratamento O

tratamento

dermatofitose

Conclusão

A dermatofitose tem se tornado comum na clínica de pequenos animais, constituindo-se em um grande desafio diagnóstico, terapêutico e de manejo para a resolução da doença. Desta forma, é fundamental a conscientização dos proprietários frente aos riscos da patologia e a adequada assistência do médico veterinário. EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS CÓD - EXAME

PRAZO/DIAS

736 - TRICOGRAMA

576 - CULTURA (ANAEROBIOS + AEROBIOS) + ANTIBIOGRAMA 759 - CULTURA DE FUNGOS COM ANTIFUNGIGRAMA

87 - CITOLOGIAS PET

86 - HISTOPATOLOGIA COM COLORAÇÃO DE ROTINA 272 - FAN (FATOR ANTI NUCLEAR VETERINARIO)

253 - ANA (ANTICORPO ANTI NUCLEAR)

686 - TESTE ALERGICO PAINEL 24 ALERGENOS 271 - FIV / FELV LEUCEMIA E IMUNODEFICIENCIA FELINA

Referências Bibliográficas BALDA, A.C.; LARSSON, C.E.; OTSUKA, M.; et al. Estudo retrospectivo de casuística das dermatofitoses em cães e gatos atendidos no Serviço de Dermatologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Acta Scientiae Veterinariae, v.32, n.2, p.133-140, 2004. BIN, L.; GOMES, J.; BRÁZ, S.; GIUFFRIDA, R. Comparação de métodos diagnósticos para dermatofitose em animais de companhia. Colloquium Agrariae, v.6, n.2, p.46-51, 2010. FOIL, C.S. Feline dermatophytosis – recente advances and recommendations for treatment. In: II CONGRESSO INTERNACIONAL DE MEDICINA FELINA, 2001, Rio de Janeiro. Anais... Rio de Janeiro, 2001. p.7-9. GOMES, A.R.; MADRID, I.M.; MATOS, C.B.; et al. Dermatopatias fúngicas: aspectos clínicos, diagnósticos e terapêuticos. Acta Veterinaria Brasilica, v.6, n.4, p.272-284, 2012.

ALERGOLOGIA

AS PRINCIPAIS RAÇAS PREDISPOSTAS A DESENVOLVER DERMATITE ATÓPICA E OS PRINCIPAIS ALÉRGENOS ENVOLVIDOS NO PROCESSO DA ALERGIA EM ANIMAIS

A dermatite atópica é uma dermatose inflamatória e pruriginosa de origem genética e de alta incidência, que atinge em torno de 20% dos animais, e está associada a uma reação a alérgenos ambientais, como: ácaros, fungos, gramíneas, pólens, ervas, produtos químicos, alimentos, entre outros. A predisposição genética é um dos fatores principais para a dermatite atópica, sendo considerada uma doença de adultos jovens, onde os primeiros sinais clínicos se apresentam entre seis meses a três anos de idade. Não há predisposição sexual, onde machos e fêmeas são acometidos igualmente. Algumas raças possuem alto potencial genético para desenvolver a doença, sabendo disto, o TECSA Laboratórios realizou um levantamento estatístico das principais raças, com maiores índices de diagnóstico positivo para dermatite atópica em cães (gráfico 1). A Dermatite atópica é uma resposta exagerada do sistema imunológica a alguma substância estranha ao organismo, ou seja, é uma hipersensibilidade imunomediada a um estímulo externo especifico. A substância que desencadeia a alergia no animal é chamado de alérgeno. Quanto mais o animal tiver contato com o alérgeno, maior poderá ser a resposta do sistema imune, e consequentimente maiores os sinais clinicos apresentados. A avaliação da exposição alergênica realizada em

estudos no Brasil mostra que ocorre uma variação de acordo com cada região. Isso se deve, provavelmente, às condições ambientais e climáticas. Contudo, os ácaros são os mais prevalentes. As espécies Dermatophagoides pteronyssinus e Blomia tropicalis são as mais comuns no Brasil. Os ácaros preferem locais com umidade relativa acima de 50% e temperaturas de 18 a 26°C. Os ácaros da poeira raramente são encontrados em climas secos e em grandes altitudes. Os ácaros da poeira doméstica alimentamse principalmente de descamação de animais e humanos, fungos e outros

restos encontrados em ambientes humanos. Altas concentrações de ácaros da poeira são encontradas em colchões, travesseiros, tapetes e móveis estofados. Em um grama de poeira domiciliar pode conter mais de 1.000 ácaros. Sabendo da importância na identificação dos principais alérgenos causadores da dermatite atópica em animais, o TECSA laboratórios realizou um levantamento inedito, onde foram realizados a prevalência de cada alérgeno em relação as cinco principais raças suscpitiveis a dermatie atopica. (Tabela 1).

Gráfico 1. Neste levantamento para identificação das raças mais predispostas a dermatite atópica, foram escolhidos aleatoriamente 400 Testes alérgicos realizados no TECSA laboratórios, que apresentou hipersensibilidade ao teste entre 01/01/2016 e 01/05/2016. Onde pode-se observar que se trata de uma doença que atinge tanto animais de raças puras como animais mestiços. Fonte: TECSA Laboratórios.

ALERGOLOGIA Tabela 1: Neste levantamento podemos observar a prevalência dos ácaros como o principal causador da dermatite atópica em cães. Fonte: TECSA Laboratórios.

EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS CÓD - EXAME

686 - TESTES ALÉRGICOS PAINEL C/ 24 ALÉRGENOS 684 - TESTE ALÉRGICO ALERGIA À PICADA (SALIVA) DE PULGA 688 - TESTE ALÉRGICO ALERGIA A MALASSEZIA

PRAZO/DIAS

7 7 7

VACINA IMUNOTERAPICA SUBLINGUAL

VACINA IMUNOTERAPICA SUBCUTÂNEA

BIOLOGIA MOLECULAR

COMPARAÇÃO DE PCR TEMPO REAL E PCR CONVENCIONAL PARA DETECÇÃO DE LEISHMANIA INFANTUM

Introdução

A leishmaniose visceral canina (LVC) compreende um importante problema de saúde pública, uma vez que é frequentemente fatal se não for tratada. Consequentemente, novos métodos de diagnóstico que promovam a identificação precoce da doença são necessários. O diagnóstico da LVC pode ser realizado por exames parasitológicos diretos que podem produzir resultados falso-negativos, quer devido ao baixo número de Leishmania spp. em amostras clínicas (medula óssea e gânglios linfáticos), ou porque a identificação morfológica é complexa. Além disso, tais métodos são invasivos. Técnicas sorológicas convencionais são passíveis de reactividade cruzada com outras doenças parasitárias, especialmente grave quando se utiliza apenas um método sorológico isolado – por

exemplo apenas ELISA . No entanto, métodos sorológicos são ainda a primeira ferramenta diagnóstica a ser empregada nos levantamentos epidemiológicos ou em casos de animais saudáveis apenas para fins pré-vacinais. O diagnóstico precoce é importante para a prevenção de danos graves ou mesmo morte dos animais doentes. Desde a produção do primeiro instrumento termociclador em 1987, técnicas de biologia molecular têm prometido uma revolução na detecção de agentes patogénicos em amostras clínicas. Neste contexto, os métodos moleculares, essencialmente baseados em PCR, tornaram-se ferramentas o diagnóstico de indispensáveis para doenças infecciosas. Alta especificidade, a rápida identificação e quantificação do parasita, a possibilidade de aplicação direta em espécimes clínicos, produzem resultados confiáveis em poucas horas e são inegáveis vantagens

de PCR Real Time (qPCR), quando comparado aos métodos de diagnóstico por PCR convencional. Nos últimos anos, a técnica de reação em cadeia da polimerase técnica (PCR) tem avançado significativamente no sentido de expandir a sua utilização e versatilidade, trabalhando agora com a quantificação do agente em tempo real (qPCR). Dados da literatura mostram que ambos os métodos apresentam características interessantes para o diagnóstico da leishmaniose visceral. Os benefícios de qPCR REAL TIME em relação ao PCR convencional incluem velocidade, reprodutibilidade e capacidade quantitativa. Em adição às vantagens operacionais, qPCR é mais sensível e reprodutível e pode substituir PCR convencional nas rotinas de diagnóstico. Além disso, a utilização de uma técnica que possui elevada sensibilidade de diagnóstico, e pode monitorizar a 37

BIOLOGIA MOLECULAR

terapia e prevenção de recaídas promove perspectivas mais amplas para o controle da doença.

Métodos de Amplificação do DNA

PCR Convencional - cPCR Nas últimas duas décadas, a técnica PCR convencional (cPCR) foi modificada para expandir seu uso e versatilidade . A possibilidade de utilizar na mesma reação, um par de iniciadores com a amplificação simultânea de múltiplas sequências de DNA alvo, é chamado multiplex-PCR. Assim, mais do que uma sequência de DNA pode ser amplificado (multiplicada) pelo mesmo processo. Nested-PCR utiliza dois pares de iniciadores para a amplificação de uma sequência de DNA interna no alvo seleccionado. O primeiro par é usado para uma reação inicial, e os produtos são então, submetido a uma segunda amplificação com um outro par de iniciadores. Esta técnica apresenta maior sensibilidade e especificidade. No entanto, também revela um aumento do risco de contaminação do produto amplificado a partir da primeira reação. Embora cnPCR e suas variações são sensíveis e altamente específicos, eles 38

têm algumas limitações, incluindo a exigência de gel de agarose ou de poliacrilamida para electroforese, risco de contaminação, a falta de capacidade quantitativa, e a utilização de reagentes tais como brometo de etídio, que é prejudicial para o saúde do operador. O surgimento de uma nova tecnologia, qPCR (PCR REAL TIME), enfatizou essas limitações. PCR em Tempo Real -qPCR PCR em tempo real foi desenvolvido em 1992, como um aperfeiçoamento da PCR original criada por Kary Mullis, e representa um avanço significativo na biotecnológica para o diagnóstico de doenças infecciosas e parasitárias. O sistema baseia-se na utilização de corantes fluorescentes ou sondas que permitem o controle do produto amplificado. Um corante é amplamente empregue e se liga não especificamente as cadeias duplas de DNA geradas durante a amplificação. Outra forma de gerar a fluorescência é a utilização de uma sonda especificamente dirigida para uma sequência de região interna que tem de ser amplificado, um exemplo desse sistema é a sonda TaqMan. Durante a amplificação o TaqMan é degradado

e então ocorre a libertação da luz. A análise da emissão de luz é feita por um detector de sinal de luz que cria um gráfico com a absorção obtida após cada sonda de PCR, o sinal gerado reflecte a quantidade de produto formado. Os resultados qPCR são registrados através de sistemas interligados de computação gráfica gerados no termociclador. Basicamente, quatro tipos de análises são realizadas: curva de amplificação, curva de dissociação, espectro e do componente. Os quatro parâmetros devem ser consideradas em conjunto. Padõres positivos e controles negativos devem ser incluídos em todas as reacções. A qPCR permite, basicamente, a realização de quatro tipos de testes: quantificação absoluta, quantificação relativa, análise de resolução de fusão elevado e discriminação alélica, que apresentam aplicações diferentes e variadas. Como uma ferramenta de diagnóstico, a quantificação absoluta pode ser usada para a detecção de infecção e quantificação do seu agente etiológico. O teste para a quantificação absoluta baseia-se na análise da curva padrão. Estas características de qPCR permitem a eliminação de uma fase (preparação de electroforese

BIOLOGIA MOLECULAR em gel) onde geralmente ocorrem as contaminações no método convencional de PCR . cPCR e qPCR para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina Em 2002, um trabalho que avaliava dois métodos de cPCR encontraram uma sensibilidade de 100% para o sistema de RV1 / RV2 no sangue periférico de cães doentes. Os resultados animaram os pesquisadores a realizar um estudo sobre a capacidade de cPCR (RV1 / RV2) para detectar LVC em amostras diferentes (biópsias do fígado, baço e gânglios linfáticos) de cães. Os autores observaram que a maioria dos animais que foram positivos pela microscopia também foram positivos pela PCR. Tal descoberta pode, possivelmente, ser associado com o tipo da amostra em estudo ou com uma alta carga parasitária em animais com sintomas clássicos da doença. A sensibilidade relatada para o estudo realizado em 2002, também foi determinada por amostras de sangue de cães com sintomas múltiplos de LVC. Em um estudo mais atual, com o objetivo de avaliar cPCR na identificação do agente etiológico da LVC em cães, foram empregadas amostras de baço, fígado, rins e gânglios linfáticos de 25 animais sintomáticos (grupo caso) e 15 animais assintomáticos. Os cães eram de diferentes raças, sexos e idades, e foram de Teresina, Piauí, Brasil. Todos os animais do grupo caso e dois controles teste deram positivos em amostras de fígado , baço ou linfonodos por cPCR. A conclusão foi que , os resultados foram mais positivos por cPCR em cães soropositivos sintomáticos e cPCR é mais preciso do que a histopatologia convencional na detecção do parasita Leishmania. Este estudo e varios outros apos este, provam que o método de PCR convencional nao é adequado para o diagnóstico inicial em populações, ou seja animais assintomáticos especialmente. Os estudos mencionados mostraram ainda uma baixa reprodutibilidade de cPCR para o diagnóstico de LVC em amostras de sangue do cão. Outra possibilidade é que a eficiência da técnica está associada com a carga

de parasitas, ou seja, os animais com uma elevada carga de parasita iriam apresentar resultados positivos usando a técnica cPCR. Segundo alguns autores, o uso de PCR em tempo real com iniciadores derivados do sistema de RV1 / RV2 no sangue e medula óssea revelou uma correlação adequada entre a carga parasitária e o estado clínico do paciente, que permitem concluir que a quantificação do parasita é necessária para uma leitura precisa dos resultados. Consequentemente, para verificar o andamento do PCR em tempo real para o diagnóstico de LVC, os pesquisadores compararam o sistema cPCR com qPCR na medula óssea de cães. Eles encontraram 54 e 84% de resultados positivos, respectivamente, para cPCR e qPCR (29).O que mostra claramente como o PCR por TEMPO REAL é superior em sensibilidade. As amostras que deram negativo para cPCR mostraram uma carga parasitária de menos de 30 parasitas/mL de medula óssea, ou seja, no PCR convencional o paciente com menos de 30 parasitas por mL dá resultado negativo, mas no PCR REAL TIME da positivo. Utilizando amostras de sangue periférico a partir de 15 cães que eram positivos para a leishmaniose visceral, a sensibilidade qPCR foi de 100%. O sistema desenvolvido por estes investigadores elucidou tambem que o uso de sangue como amostra para o diagnóstico em animais sintomáticos é o método menos invasivo e de alta sensibilidade.

Considerações Finais

O qPCR já está disponível em vários laboratórios, especialmente no sector privado; no entanto, a interpretação de seus resultados requer novos níveis de conhecimento. Por isso, requer uma equipe treinada para garantir a precisão do método. Em adição às vantagens operacionais, qPCR é uma técnica sensível e reprodutível, que pode substituir cPCR nas rotinas de diagnóstico. O uso da técnica de alta sensibilidade que pode monitorar a terapia e pode prevenir recaídas promove perspectivas mais amplas para o controle da doença.

EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS CÓD - EXAME

PRAZO/DIAS

316 - PERFIL COMPLEMENTAR PARA LEISHMANIOSE

44 - HEMOGRAMA COMPLETO

290 - LEISHMANIOSE FELINA (ELISA + RIFI)

456 - IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LEISHMANIOSE

408 - PESQUISA DE LEISHMANIOSE

483 - LEISHMANIA CHAGASI MÉTODO PCR REAL TIME QUALITATIVO

680 - LEISHMANIA CHAGASI METODO PCR REAL TIME QUANTITATIVO

451 - PESQUISA DE SPOROTRIX SCHENKIIE

447 - LEISHMANIOSE CANINA DILUICAO TOTAL

83 - LEISHMANIOSE CANINA ( DPP + ELISA + RIFI )

582 - PERFIL LEISHMANIOSE (DPP+ELISA+RIFI) E PROT. TOT/ FRAC.

573 - PERFIL COMBO DE LEISHMANIA IMUNOHISTOQUMICA + SOROLOGIA

738 - PERFIL LEISHMANIOSE SOROLOGIA + IMUNO-HISTOQUIMICA

810 - PERFIL PCR DOADORES DE SANGUE

Referências Bibliográficas Comparação de PCR em tempo real e de PCR convencional para a detecção de Leishmania (Leishmania) infantum infecção: uma mini-revisão Paiva-Cavalcanti M (1), Regis-da-Silva CG (1), Gomes YM (1) (1) Departamento de Imunologia, Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Recife, Estado de Pernambuco, Brasil.

ANATOMIA PATOLÓGICA

EXAME CITOLÓGICO POR IMPRINT

A técnica de esfregaço por aposição, mais conhecida por imprint é um método de coleta para amostras citológicas apropriado em casos de lesões cutâneas ulceradas ou exsudativas, geralmente planas - situações onde a punção é difícil - também é indicado para avaliar a celularidade de fragmentos de tecidos incisados que serão encaminhados à histopatologia. Com esta técnica podemos obter células representativas da lesão ou conseguir somente esfoliar células superficiais e inflamação da superfície de impressão. O preparo citológico a partir de fragmentos de biópsia permite a avaliação mais rápida dos tipos celulares presentes no tecido podendo auxiliar a interpretação diagnóstica. Os imprints de lesões cutâneas normalmente vão revelar células superficiais e inflamatórias, além de serem úteis na identificação de microrganismos. As células neoplásicas, com exceção de tumores de células redondas, frequentemente não 40

esfoliam nestas formações ulceradas e exsudativas, podendo não se apresentar nestas amostras. A punção por agulha fina, aspirativa ou não, é considerada o método de coleta mais adequado para confeccionar amostras citológicas suspeitas de neoplasias, no entanto, em alguns casos neoplásicos, por exemplo, o Tumor Venéreo Transmissível (TVT), recomenda-se coleta citológica por imprint. Desta forma, os casos devem ser analisados isoladamente para o emprego do método de coleta mais adequado para a análise citológica. Este procedimento é indolor e utiliza apenas material para limpeza do tecido a ser coletado e lâminas para microscopia. Devemos seguir algumas regras básicas para obtenção de bons resultados através da citologia: Histórico detalhado: Estas informações são muito importantes, pois indicam o tempo de instalação do processo, como foi o

início da lesão, suspeitas clínicas. Estes dados são muitas vezes fundamentais para a determinação de diagnósticos diferenciais ou para comentários relativos aos possíveis diagnósticos. Informar: Antepassado mórbido, suspeita clínica, tratamentos anteriores, etc. Descrição macroscópica da lesão: - Localização anatômica (Ex: “Região cervical dorsal”, “região dorso-proximal do membro pélvico direito”); - Tamanho da lesão (Ex: “1,0 cm de diâmetro”, “2,5 x 4,0cm”); - Formato da lesão (Ex: “plana”, “arredondada”, “formato de pólipo”, “irregular”); - Consistência da lesão (Ex: “flutuante”, “firme”, “macia”); - Coloração (avermelhada, enegrecida, pálida); - Características gerais (aderido ou não, ulcerado ou não, alopécico ou não, dolorido ou não);

ANATOMIA PATOLÓGICA

- Tempo de evolução (Ex: “2 dias”. “4 meses”, “7 anos”). - Qualquer informação pode ser relevante. Na maioria dos casos, a ausência de uma ou mais informações macroscópicas da lesão impossibilita o diagnóstico citológico. Técnica de colheita: Este é um dos passos mais importantes para realização da citologia diagnóstica e frequentemente desconhecida. Uma técnica de colheita inadequada pode impedir a conclusão do caso, pois a amostra colhida deve necessariamente possuir células características da lesão descrita. O método de coleta para cada caso deve ser avaliado cuidadosamente e informado junto à descrição da lesão (Ex: Imprint de lesão ulcerada em focinho com aproximadamente 2,0 cm de extensão e com evolução média de 5 meses - suspeita clínica: carcinoma de células escamosas).

Amostras (lâminas) adequadas: O esfregaço por impressão ou imprint pode ser feito em lesões ulceradas, exsudativas ou fragmentos de tecido. O objetivo é esfoliar células de uma determinada superfície pressionando uma lâmina de vidro contra diversas regiões deste tecido. Para obter impressões adequadas é importante se atentar para alguns cuidados: As úlceras e áreas apresentando exsudação devem ser impressas em lâmina antes e depois de serem limpas. Para produzir imprints de fragmentos teciduais, o tecido deve ser cortado e envolvido em um material absorvente que remova o excesso de sangue e fluido residual com o propósito de que uma superfície íntegra e limpa seja utilizada na impressão; Para confecção da lâmina, a superfície lesionada deve ser firmemente pressionada, por diversas vezes, sobre uma lâmina de vidro limpa;

Ao final da confecção da lâmina, seque rapidamente o material por movimentação ao ar (abane). Não guarde as lâminas úmidas, pois isto causa degeneração celular inviabilizando o resultado; Não fixe ou core as lâminas; Sempre confeccione e envie para o TECSA um mínimo de 3 lâminas da mesma lesão (Ideal de 3 a 5 lâminas).

Técnica de Obtenção de Material Citológico por Imprint:

Material necessário: - Solução Salina para limpeza do local; - Material absorvente limpo (gaze); - Lâminas para microscopia limpas (de preferência com extremidade fosca para identificação com lápis); - Porta lâminas para transporte e acondicionamento; - Ficha de solicitação de exames. 41

ANATOMIA PATOLÓGICA Instrução Técnica Demonstrada para Imprint de Lesão em Pele

Obtenção do material Úlceras e lesões exsudativas Realize a contenção física do paciente de maneira adequada, o procedimento é indolor não necessitando de preparo especial; Tocar a lesão com uma lâmina de vidro para que as células do tecido ulcerado esfoliem na superfície da lâmina (figura 1); Promova a limpeza local com uma gaze embebida em solução salina; Cuidado: O uso de antissépticos deve ser ponderado, pois se deseja avaliar também o predomínio de agentes infecciosos e estes poderão ser removidos durante a limpeza do local. Pressione novamente a lâmina contra o tecido (figura 1). Dica: O ideal é que se façam várias coletas de várias regiões do tecido, antes e depois de ser limpo, com a intenção de se obter uma amostragem representativa da lesão, aumentando a chance de um potencial diagnóstico. Fragmentos de tecidos Faça uma incisão no fragmento do tecido coletado a fim de que uma superfície fresca seja utilizada para o imprint; 42

Com o auxílio de um material absorvente limpo retire todo o excesso de sangue e fluido residual no tecido; Atenção: O excesso de sangue ou fluido no tecido inibe a aderência das células de verdadeiro interesse na superfície vítrea da lâmina, resultando em material de baixa celularidade, muitas vezes tornando o exame inconclusivo. Pressione a superfície de corte firmemente contra a lâmina para microscopia por várias vezes. Preparo das Lâminas Dica: As lâminas bem preparadas vão apresentar áreas impressas discretamente opacas e não devem apresentar áreas de sangue excessivamente espessas. Após a impressão, abanar a lâmina para que ocorra a “secagem ao ar livre” da mesma; Identifique as lâminas com nome do animal, data de coleta e região anatômica (caso esteja enviando amostras provenientes de mais de um sítio anatômico) (figura 2); Repita em 3 a 5 lâminas da mesma lesão; Acondicione em porta-lâminas adequados para proteção das lâminas durante o transporte (figura 3).

Figura 1: As úlceras e áreas apresentando exsudação devem ser impressas em lâmina antes e depois de serem limpas. Figura 2: Identificar as lâminas, normalmente com nome do animal, data de coleta e região coletada (Esta informação pode ser abreviada, ou substituída por siglas, Ex: membro pélvico direito – MPD). Figura 3: Acondicionar as lâminas em portalâminas (fornecido pelo TECSA). O número ideal de lâminas a serem enviadas para análise é de 3 a 5 por lesão. ATENÇÃO: Com o intuito de evitar a quebra das lâminas, não usar papel, papel toalha ou qualquer outro tipo de recipiente alternativo para acondicionar as lâminas.

EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS CÓD - EXAME

PRAZO/DIAS

664 - GRAM - CITOLÓGICO

87 - CITOLOGIAS PET

451 - PESQUISA DE SPOROTHRIX SCHENKII

Referências Bibliográficas

COWELL, R.L.; TYLER, R.D.; MEINKOTH, J.H.; DENICOLA, D.B. Diagnóstico citológico e hematologia de cães e gatos. 3.ed. São Paulo: MedVet, 2009. 476p. RASKIN, R.E.; MEYER, D.J. Citologia Clínica de Cães e Gatos. 2.ed. Rio de Janeiro: Elsevier Editora Ltda, 2012, 450p.

ANATOMIA PATOLÓGICA

AUMENTO DA PREVALÊNCIA DE TUMORES ESPECÍFICOS NA ROTINA ONCOLÓGICA DE CÃES E GATOS

Introdução

Relatos provenientes da rotina veterinária clínica associados a levantamento de dados laboratoriais revelam que alguns tipos de neoplasia vêm apresentando aumento em seu percentual de incidência diagnóstica. Dentre eles, destacam-se as neoplasias de bexiga, as neoplasias de fígado e as neoplasias de adrenal.

Neoplasias de Bexiga

Dentre as neoplasias de bexiga podemos citar o carcinoma de células de transição, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma indiferenciado, rabdomiossarcoma, fibroma e outros tumores mesenquimais. O carcinoma de células de transição invasivo (Figura 1) é

a forma mais comum de câncer de bexiga e apresenta elevado potencial de causar disseminação adjacente à sua localização anatômica primária, em decorrência de punção aspirativa ou instituição de procedimento de coleta similar para determinação diagnóstica. É muito comum que esta neoplasia se espalhe para a cavidade abdominal do animal quando há tentativa de cistocentese para avaliação citológica da lesão. Recomenda-se precaução redobrada na abordagem de coleta de material biológico neste tipo de quadro clínico envolvendo lesões em bexiga com suspeita neoplásica. Este tipo de neoplasia se inicia com sinais clínicos inespecíficos e é frequentemente confundida com processos inflamatórios ou infecciosos das vias urinárias

inferiores na prática clínica.

Figura 1: Carcinoma de células de transição papilar invasivo observado na bexiga de um cão durante exame pós-mortem. Fonte: Withrow e MacEwen (2007)

Neoplasias de Fígado

As neoplasias hepáticas primárias apresentam maior incidência, segundo a literatura, em gatos e as neoplasias metastáticas provenientes do baço, pâncreas e trato gastrointestinal 43

ANATOMIA PATOLÓGICA

Carcinoma hepatocelular Carcinoma biliar Carcinóide Sarcoma

Massivo (%)

Nodular (%)

Difuso (%)

53 – 84

16 – 25

0 – 19

37 – 46

0 – 21

17 – 54

0 36

33 64

67 0

Tabela1: Frequência relativa dos tipos morfológicos de tumores hepáticos caninos. Fonte: Withrow e MacEwen (2007)

acometem os cães com maior frequência. Existem quatro tipos básicos de tumores hepáticos primários em cães e gatos: hepatocelular, de ducto biliar, neuroendócrino (ou carcinoide) e mesenquimal (sarcoma). Estes tumores podem ser morfologicamente classificados, quanto a extensão da lesão, em massivos, nodulares ou difusos (tabela 1) e, quanto a sua diferenciação celular, em benignos ou malignos, sendo os primeiros mais comuns em gatos e os últimos mais comuns em cães. Os tumores malignos, metastáticos ou primários, nodulares ou difusos, representam pior prognóstico tanto em cães quanto em gatos, enquanto os tumores massivos benignos apresentam avaliação prognóstica favorecida por acometer apenas um lobo hepático. Para o estabelecimento de diagnóstico e prognóstico confiáveis recomenda-se a avaliação histopatológica do fragmento de tecido hepático coletado por biópsia.

Neoplasias de Glândula Adrenal

Os tumores de adrenais apresentam o potencial de desencadear o hiperadrenocorticismo de origem adrenal. Nesse caso, os níveis plasmáticos de ACTH mensurados serão os menores possíveis, visto que a liberação frequente e contínua de quantidade alta de hormônio cortisol pela adrenal submetida a processo neoplásico atuará na glândula hipófise promovendo feedback negativo na produção e liberação do ACTH. Caso o hiperadrenocorticismo seja de origem hipofisária, a concentração de ACTH dosada no plasma do animal apresentará valores bem acimado intervalo de referência para a espécie. Os testes de supressão com baixa dose de dexametasona, estímulo com ACTH e dosagem da relação cortisol:creatinina 44

urinária são as alternativas disponíveis para se realizar a triagem diagnóstica do hiperadrenocorticismo. O primeiro teste apresentará resultados de cortisol basal (pré-administração da dexametasona), cortisol dosado no momento 4 horas e 8 horas após a aplicação do medicamento tipicamente aumentados. Ou seja, não haverá supressão da secreção de cortisol sanguíneo com a administração da dexametasona, indicando que o mecanismo de feedback negativo no eixo hipófise-adrenal não está funcionando adequadamente em decorrência de neoplasia de adrenal ou hipófise. O segundo teste, baseia-se no princípio de que uma ou mais glândulas adrenais acometidas por processo neoplásico irão responder de maneira exacerbada ao estímulo provocado pela ação da administração exógena do ACTH. A mensuração da relação cortisol:creatinina urinária deve ser realizada a partir de amostra de urina preferencialmente coletada no período da manhã, em casa, de modo a evitar situações estressantes para o animal com consequente liberação de cortisol prévia à coleta trazendo interferências na especificidade do exame. Este último teste apresenta elevada sensibilidade para o diagnóstico de hiperadrenocorticismo e é considerado positivo para este diagnóstico quando apresenta valores superiores ao intervalo de referência.

Figura 2: Representação da localização anatômica das glândulas adrenais. Fonte: www. utendocrinology.com

EXAMES REALIZADOS PELO TECSA LABORATÓRIOS CÓD - EXAME

PRAZO/DIAS

86 - HISTOPATOLÓGICO COM COLORAÇÃO DE ROTINA – HE

87 - CITOLOGIAS PET

218 - ACTH - HORMÔNIO ADRENOCORTICOTRÓFICO

621 - CORTISOL PÓS SUPRESSÃO DEXAMETASONA - 3 DOSAGENS (RADIOIMUNOENSAIO)

630 - DOSAGEM DE CORTISOL PÓS ACTH - DUAS DOSAGENS (RADIOIMUNOENSAIO)

634 - RELAÇÃO CORTISOL: CREATININA URINÁRIA

Referências Bibliográficas

Cullen JM, Popp JA: Tumorsoftheliverandgallbladder. In Meuten DJ, editor: Tumors in domesticanimals, ed 4, Ames, 2002, Iowa State Press. Hammer AS, Sikkema DA: Hepatic neoplasia in thedogandcat, Vet Clin North AmSmallAnimPract 25:419, 1995. Knapp DW, Glickman NW, DeNicola DB et al: Naturallyoccurringcaninetransitionalcell carcinoma oftheurinarybladder: a relevantmodelofhumaninvasivebladdercancer, UrolOncol 5:47-59, 2000. Labelle P, De Cock HEV: Metastatictumorstothe adrenal glands in domesticanimals, Vet Pathol42:52, 2005. Mutsaers AJ, Widmer WR, Knapp DW: Caninetransitionalcell carcinoma, J Vet InternMed17:136-144, 2003. Myers NC: Adrenal incidentalomas, Vet Clin North AmSmallAnimPract 27:381, 1997. Norris AM, Laing EJ, Valli VEO et al: Caninebladderandurethraltumors: a retrospectivestudyof 115 cases (1980-1985), J Vet InternMed 6:145-153, 1992. Norton JA, Le HN: Canceroftheendocrine system: adrenal tumors. In DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA, editors: Cancer: principlesandpracticeofoncology, ed 6, Philadelphia, 2001, Lippincott Williams & Wilkins. Patnaik AK, Hurvitz AI, Lieberman PH: Caninehepaticneoplasms: a clinicopathologicalstudy, Vet Pathol17:553, 1980. Strombeck DR: Clinicopathologicfeaturesofprimaryandmetastaticneoplasticdiseaseoftheliver in dogs, J Am Vet MedAssoc 173:267, 1978. Thamm DH: Hepatobiliarytumors. In Withrow SJ, MacEwen EG, editors: Small animal clinicaloncology, ed 3, Philadelphia, 2001, WB Saunders. Tidwell AS, Penninck DG, Besso JG: Imagingof adrenal glanddisorders, Vet Clin North AmSmallAnimPract 27:237, 1997. Pathology of canine bladder and urethral cancer and correlation with tumour progression and survival, J CompPathol 113:113-130, 1995.

PCR Maior especificidade Maior sensibilidade Menor manuseio das amostras Melhor prognóstico Descontos progressivos Vasta linha de exames Controle de qualidade em seis níveis Quantificação de parasitos/vírus Banco de DNA (armazenagem por 2 meses)

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