12_levchuk_etal by Serge

Лікарське рослинництво: від досвіду минулого до новітніх технологій: матеріали четвертої Міжнародної науково–практичної інтернет–конференції. – Полтава, 14-15 травня 2015 р.

УДК: 582.741 Левчук Г.М., старший викладач1,2, Войтович О.М. , доцент1, Лях В.О.,професор1 1 Запорізький національний університет, Запоріжжя, Україна 2 Університет Міньо, Брага, Португалія РОЗРОБКА МЕТОДУ ПОВНОЇ ЕКСТРАКЦІЇ ВОДОРОЗЧИННИХ ЛЕКТИНОПОДІБНИХ БІЛКІВ ДЛЯ НАСІННЯ LINUM HUMILE MILL. Ключові слова: Linum humile Mill., лектиноподібні білки, насіння льону олійного, лектинова активність, гемаглютинуюча активність, гемолітична активність, вуглеводна специфічність. Одним з центральних питань сучасної біології є феномен біологічного розпізнання, з яким пов’язано формування і підтримка складної структурнофункціональної організації живих організмів. Важливу роль в цьому процесі виконують вуглеводи клітинних поверхонь та білки, які здатні їх розпізнавати, - лектини [1, 2]. Найбільш дослідженим об‘єктом з точки зору встановлення фізіологічної функції лектинів є озима пшениця [3]. Вивчення біологічної активності лектинів інших культур, зокрема льону, може дати додаткову інформацію для розуміння ролі лектинів у рослині в цілому. Завдяки вуглеводзв’язуючій здатності лектини знайшли широке застосування в різних областях препаративної біології та медицини. Особливо широко використовуються рослинні лектини, які майже не мають побічних ефектів. У зв'язку з цим до недавнього часу вивчався лише прикладний аспект лектинів, наприклад, їх затність до розпізнання певних глікокон'югантов або полісахаридів, і майже зовсім не вивчалася роль лектинів в організмі рослини, з якого вони були виділені. Відомо [1, 4], що найбільша кількість лектинів міститься в насінні. На ранніх етапах онтогенезу (при набубнявінні та проростанні) більшість лектинів насіння вивільняється у зовнішнє середовище, виконуючи при цьому ряд фізіологічних функцій. Так, по-перше, ці лектини сприяють формуванню біотичного оточення майбутньої рослини. По-друге, захищають проростаюче насіння від впливу патогенних бактерій та грибів. Тому актуальним є виділення лектиноподібних білків насіння та встановлення їх можливих функцій. За загальноприйнятими методами [1, 2] лектини з насіння олійних культур екстрагують сольовими або буферними розчинами після знежирення останнього. Однак більшість методик, що використовуються, стосується злакових або бобових рослин. Об’єктом дослідження було насіння льону олійного сортозразків К-7354, К-7276 та сорту Золотистий, які суттєво відрізняються між собою за рівнем олійності. Так, олійність сорту Золотистого складає 49 %, сортозразку К-7276 – 42 %, а сортозразку К7354 - 38,7 %. За «Широким унифицированным классификатором СЭВ вида Linum usitatissimum L.» [5] сорт Золотистий є високоолійним, сортозразок К-7276 – середньоолійним, а К-7354 – низькоолійним. Для виділення лектиноподібних білків зі знежиреного насіння наважку насіння (0,5 г) знежирювали за допомогою гомогенізації з 20 мл ацетону протягом 30 хв. Після фільтрації знежирене лляне борошно висушували під тягою та використовували для подальшого аналізу [1]. Виділення лектиноподібних білків зі знежиреного насіння здійснювали різними методами, а саме: Метод Луцика. До наважки знежиреного льняного борошна додавали 10 мл розчину, який містив 0,9% хлориду натрію та екстрагували при постійному перемішуванні на протязі 1-2 годин. Цю процедуру повторювали 3-4 рази [1]. 226

Фільтрували та фільтрат концентрували, очищали та використовували для визначення лектинової активності. Метод Алексидзе. Наважку гомогенізували з 10 мл 0,02 М калій-фосфатного буферу при рН 6,8 з додаванням 0,35 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти та 0,01 М ЕДТА. Суміш кількісно переносили у центрифужну пробірку та екстрагували 1 годину при 40 С та центрифугували 15 хв. при 10 000 g. Надосадову рідину зливали у пробірку, а осад знову промивали 5 мл того ж буферу, екстрагували та центрифугували у тому ж режимі [6]. Надосадову рідину після першої та другої екстракції об‘єднували – цей розчин концентрували, очищали та використовували для визначення лектинової активності. Метод Маліченко. До знежиреного лляного борошна додавали 10 мл підкисленої до рН 4,5 дистильованої води та екстрагували протягом 4 годин при 37 0С, потім екстрагували ще 20 год. при 20 0С [7]. Отриману суспензію центрифугували при 3 000 g 10 хв. Надосадову рідину концентрували, очищали та використовували для визначення лектинової активності. Для екстракції не тільки розчинних лектиноподібних білків, а й тих, що зв’язані з мембраною, до складу екстракційних розчинів додавали детергент Тритон Х-100 у кількості 0,05 %. Лектинову (аглютинуючу и гемолітичну) активність визначали за реакцією гемаглютинації с 2% суспензією трипсинизованих еритроцитів кроля [1, 2].. За критерій лектинової та гемолітичної активностей приймали мінімальну кількість білку, при якій спостерігається гемаглютинація або гемоліз відповідно. Лектинову та гемолітичну активності виражали як обернену величину (мкг/мл)-1. Загальний вміст білку у екстрактах визначали за методом Варбурга-Крістіана [8]. Усі дослідження проводились у п’ятикратному повторенні, результати оброблялися за допомогою стандартних статистичних методів [9]. Дані таблиці 1 дозволяють провести порівняльний аналіз ефективності застосування кожної методики виділення лектиноподібних білків зі знежиреного насіння льону олійного. Таблиця 1. Кількість лектиноподібних білків, виділених зі знежиреного насіння льону олійного різними методами, мг/г № Генотип льону Методика п/п виділення Золотистий К-7276 К-7354 1.

Алексидзе

2. 3.

6,18 ± 0,474

6,21 ± 0,085

6,37 ± 0,403

Луцика

3,49 ± 0,448**

4,07 ± 0,160***

4,32 ± 0,575*

Маліченко

2,26 ± 0,327**

3,05 ± 0,199***

3,66 ± 0,486**

Примітка: * ** *** , , – відмінності кількості при виділенні різними методами від виділення за методикою Алексидзе у різних генотипів суттєві при Р < 0,05, 0,01 та 0,001 відповідно. Застосування певної методики може суттєво змінити уявлення про кількісний вміст екстрагуємого білкового розчину. Найбільшу кількість лектиноподібних білків зі знежиреного насіння льону можна отримати, застосовуючи методику Алексидзе у нашій модифікації: відповідно до об’єкту дослідження – льону олійного нами експериментально був підібраний наступний склад екстракційного розчину: 0,02 М калій-фосфатний буферний розчин (рН 6,8) з додаванням 0,35 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти та 0,01 М ЕДТА. При виділенні за цією методикою кількість білку складає приблизно 6 мг/г, а при виділенні за методикам Луцика та Маліченко 4 та 227

3 мг/г відповідно. Різниця при виділенні зазначеними методами є статистично значимою. Однак, лектини є біологічно активними речовинами і для них суттєвішим показником є не кількість, а біологічна активність. Тому у екстрактах була визначена гемаглютинуюча активність (табл. 2). З отриманих результатів видно, що за рівнем цього показника виділені різними методиками екстракти насіння льону також достовірно відрізняються між собою. Найбільшу гемаглютинуючу здатність показав екстракт, отриманий за методикою Алексидзе, а найменшу – за методикою Маліченко. Різниця між цими двома методиками виділення склала 107-109 в залежності від генотипу.

№ п/п

Таблиця 2. Гемаглютинуюча активність лектиноподібних білків насіння льону олійного, виділених різними методами, (мкг/мл)-1 Генотип льону Методика

виділення

Золотистий

К-7276

К-7354

1. Алексидзе (4,75±0,365)×10 (2,01±0,097) ×10 (1,69±0,152) ×108### 2. Луцика (3,39±0,477)×1010*** (7,67±0,856) ×105***, ### (6,59±0,839) ×103***, ### 3. Маліченко (6,31±0,839) ×103*** (1,39±0,085) ×102***, ### (1,52±0,021) ×101***, ### Примітка: *** – відмінності гемаглютинуючої активності при виділенні різними методами від виділення по методу Алексидзе суттєві при Р < 0,001; ### – відмінності гемаглютинуючої активності різних генотипів від сорту Золотистий суттєві при Р < 0,001. 12

10###

Крім того, рівень гемаглютинуючої активності залежить також від генотипу. Так, у високоолійного зразка (сорт Золотистий) цей показник є найвищим та складає при оптимальних умовах виділення 4,75×1012 (мкг/мл)-1. У середньоолійного (К-7276) та низькоолійного (К-7354) генотипів гемаглютинуюча активність складає 2,01×1010 та 1,69×108 (мкг/мл)-1 відповідно. Отже в межах проведеного експерименту можна спостерігати пряму залежність між рівнем гемаглютинуючої активності та олійності. Таким чином, було встановлено, що оптимальною методикою екстракції лектинів зі знежиреного насіння льону олійного є методика Алексидзе у нашій модифікації, при застосуванні якої у розчин переходить більша кількість лектиноподібних білків та спостерігається їх найвища лектинова (гемаглютинуюча) активність. У процесі встановлення гемаглютинуючої активності, нами було виявлено, що лектини насіння у великих концентраціях викликають не аглютинацію, а гемоліз еритроцитів кроля. Тобто, на відміну від лектинів вегетативних органів льону, лектини насіння, окрім гемаглютинуючої, володіють ще й гемолітичною активністю. Гемолітична активність спостерігається при застосуванні дуже високих концентрацій лектину 0,1-1 (мг/мл)-1. На відміну від гемаглютинуючої активності, яка спостерігається при дуже низьких концентраціях (103-1012 (мкг/мл)-1). Подібні результати були отримані для більшості відомих лектинів з групи рибосомінактивуючих лектинів рослин [10, 11], також для білків родів Laetiporus, Amanita, Mycena [12-14]. На підтримку того, що фітолектини можуть викликати гемоліз еритроцитів свідчать також результати дослідження механізмів гемолітичної активності холерних вібріонів, у ході яких була показана участь лектинового рецептора збудника у лізісі еритроцитів [15]. Крім того, білоруськими вченими [16] було виявлено, що ряд лікарських рослин володіє гемолітичною активністю. 228

Рівень гемолітичної активності залежав від генотипу льону олійного та був аналогічним таковому гемаглютинуючої активності. Так, найвищий показник гемолітичної активності (біля 1 (мг/мл)-1) має сорт Золотистий, а найнижчий (біля 0,3 (мг/мл)-1) – сортозразок К-7354. Таблиця 3 Вуглеводна специфічність лектиноподібних білків насіння льону олійного вуглеводи Генотип льону гал глю ман ксі ара мальт сах лакт фр гл А Золотистий 0 + 0 + + 0 + + 0 + К-7276 + + 0 + 0 0 0 0 0 + К-7354 + + 0 + + 0 0 + 0 + Примітка: «+» – здатність розпізнавати лектином даний вуглевод; «0» - лектин не розпізнає даний вуглевод. Для виконання своєї фізіологічної ролі у рослині для фітолектинів важливішою є якісний показник активності – вуглеводна специфічність, тому, що саме він визначає з якими вуглеводними детермінантами здатен зв’язуватися даний лектин [1, 2]. За допомогою пригнічення реакції гемаглютинації різними вуглеводами, нами було визначено вуглеводну специфічність виділених лектиноподібних білків насіння льону (табл. 3). З результатів видно, що вуглеводна специфічність лектиноподібних білків насіння льону різних генотипів є дуже схожою, але все ж таки дещо різною. Так, усі досліджені лектини (незалежно від генотипу) здатні розпізнавати глюкозу, ксілозу та глюкозамін, тобто за класифікацією Мьокеле є манозоспецифічними [17]. Наявність вуглеводної специфічності у всіх досліджених лектинів до такого вуглеводу, як ксілоза, можна пояснити тим, що цей вуглевод є основним компонентом слизу насіння льону, де його вміст складає біля 70 % [18]. Іншим переважаючим вуглеводом слизу насіння є арабіноза, на яку припадає ще 20 %. У зв’язку з тим, що при набубнявінні насіння льону більша частина слизу виділяється у оточуюче середовище разом з лектиноподібними білками, останні можуть виступати скріпляючим цей слиз агентом, оскільки проявляють високий ступінь спорідненості до обох переважаючих його компонентів. Функція цього комплексу – ефективне зв’язування спор патогенних грибів та клітин бактерій, що дозволяє створити найкращі умови для розвитку майбутньої рослини. Однією з причин гемолітичної активності, на нашу думку, може бути здатність лектинів обох функціональних груп розпізнавати глюкозамін. Аналогічний факт був встановлений для лектинових рецепторів холерних вібріонів [15]. Авторами було доведено, що штами, які мали рецептори зі здатністю зв’язувати аміносахариди, володіли гемолітичною активністю, і навпаки. Отже, у результаті досліджень було встановлено, що найбільш ефективною методикою виділення лектиноподібних білків зі знежиреного насіння льону олійного є методика Алексидзе у нашій модифікації. Кількість лектинів у насінні різних сортів льону олійного складає приблизно 6 мг/г, тобто 0,6 % від сирої маси насіння. Рівень лектинової активності отриманих екстрактів з 3 досліджених зразків різнився, залежав від генотипу та олійності. Усі лектиноподібні білки насіння є манозоспецифічними. Особливістю цих лектиноподібних білків є здатність розпізнавати аміносахарид глюкозамін. Встановлено, що всі лектиноподібні білків насіння льону у високих концентраціях володіють гемолітичною активністю, що можна пояснити їх здатністю розпізнавати глюкозамін.

229

Бібліографія. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

8. 9. 10. 11.

12. 13.

14.

15.

16.

17. 18.

Луцик М.Д. Лектины / Луцик М.Д., Панасюк В.М., Луцик А.Д. – Львов: Вища школа, 1981. – 156 с. Антонюк В.О. Лектини та їх сировинні джерела / В.О. Антонюк. – Л.: Основа, 2005. – 554 с. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и её регуляция / Ф.М. Шакирова. – Уфа: Гилем. – 2001. – 160 с. Линевич Л.И. Лектины и углевод-белковое узнавание на разных уровнях организации живого / Л.И Линевич // Успехи биологической химии. – 1979. – Т.20. – С. 71 - 89. Международный классификатор СЭВ вида Linum usitatissimum L. – Л.: ВИР, 1989. – 28 с. Алексидзе Г.Я. Выделение лектинов и их возможных рецепторов из корнеплода сахарной свеклы / Г.Я. Алексидзе, Н.П. Королёв, И.Л. Семёнов, Э.И. Выскребенцева // Физиология растений. – 1983. – Т. 30, № 6. С. – 1069 – 1076. Маличенко С.М. Выделение лектина из корней и семян люпина (Lupinus luteus L.) и изучение их свойств / С.М. Маличенко, Н.И. Назаренко, Е.В. Кириченко, В.Н. Заец //Физиология и биохимия культурных растений. – 1994. – Т.26, № 3. – С. 252 – 256. Dawson R. Data for Biochemical Research / R. Dawson, D. Elliott, U .Elliott, K. Jones. – 2nd edn. Oxford: Clarendon Press, 1986. – 464 р. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. – М.: Высшая школа, 1990. – 351 с. Patocka J., Streda L. Plant toxic proteins and their significance for warfare and medicine / J. Patocka, L. Streda // J. of Applied Biomedicine. – 2003. – Vol. 1. – P. 141-147. Sehgal P. Purification, characterization and toxicity profile of ricin isoforms from castor beans / P. Sehgal, M. Khan, O. Kumar, R. Vijayaraghavan // Food Chem. Toxicol. – 2010. – Vol. 48, № 11. – P. 3171-3176. Khan F. Fungal lectins: current molecular and biochemical perspectives / F. Khan, M.I. Khan // International J. of Biological Chemistry. – 2011. - Vol. 5, № 1. – Р. 1-20. Антонюк В.О. Вуглеводна специфічність лектину, одержаного з плодових тіл міцени чистої (Micena pura Kumm.), та його використання у гістохімічних дослідженнях / В.О. Антонюк, А.М. Ященко, Р.В. Антонюк, Н.О. Амбарова // Biopolymers and Cells. – 2009. – V. 25(6). – P. 466-475. Антонюк В.О. Вивчення вуглеводної специфічності гемолітичного лектину блідої поганки (Amanita phalloides Secr.) / В.О. Антонюк // Біополімери і клітина. – 2005. – Т.21, № 4. – С. 319 – 325. Колякина А.В. Лектиновые рецепторы холерных вибрионов : автореф. дис. на соискание ученой степени канд. мед. наук. : спец. 03.00.07 “Микробиология” / А.В. Колякина. – Ставрополь, 2009. – 18 с. Канделинская О.Л. Лектины лекарственных растений дикорастущей флоры Беларуси: перспективы использования / О.Л. Канделинская, Е.Р. Грищенко, Л.В. Обуховсткая и др. // Вестник Фонда фундаментальных исследований. – 2011. – №2. – С. 169-184. Mokеlе O. Studied in hemagglutinings of leguminose seeds / O. Mоkelе // Ann. Med. Exp. Biol. Fenniae. – 1957. – Suppl. 35. – P. 11 – 53. Оленников Д.Н. Исследование процесса экстракции полисахаридов семян льна (Linum usitatissimum L.) /Д.Н. Оленников, Л.М. Танхаева //Химия растительного сырья. – 2007, № 4. – С. 79 – 83.

230