Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 1
TRIMESTRALE SCIENTIFICO
Anno V - n. 1, Marzo 2011
La risposta infiammatoria nella fibrosi cistica Guest Editor Luigi Maiuri Università degli Studi di Foggia Istituto Europeo per la Ricerca in Fibrosi Cistica (IERFC), c/o Istituto Scientifico San Raffaele, Milano con la collaborazione di: BM Assael, Verona IL PROBLEMA Uno degli aspetti più riconosciuti nella fibrosi cistica è una tendenza costitutiva verso uno stato “proinfiammatorio” che conduce a un’abnorme risposta infiammatoria agli stimoli infettivi. Per quanto riguarda la patogenesi del danno bronchiale, all’infiammazione viene attribuito un ruolo cruciale, tanto che il suo trattamento farmacologico rappresenta un cardine della terapia di mantenimento. Esistono prove dell’utilità di terapie antinfiammatorie. Gli steroidi si sono dimostrati clinicamente utili, anche se il loro uso è limitato dagli eventi avversi, l’ibuprofene è da molti sostenuto come terapia di base cronica, infine, il meccanismo protettivo dell’azitromicina trova probabilmente motivo anche nel controllo di alcune risposte infiammatorie della cellula epiteliale bronchiale (Dinwiddie R, 2005). Capire a fondo il meccanismo della risposta infiammatoria nella fibrosi cistica è una sfida sia per comprendere la biologia cellulare della malattia, sia per approntare nuove strategie terapeutiche. In questo numero discuteremo dati recenti che confermano il ruolo dell’infiammazione, aprono nuove prospettive per capirne il nesso col difetto genetico stesso e, forse, la strada a nuove terapie. Parleremo di meccanismi che riguardano aspetti fondamentali di biologia cellulare la cui comprensione ha portato a più di un premio Nobel per la chimica o la medicina con prospettive di impiego per malattie come il morbo di Alzheimer, il cancro, l’Huntington, ma, ora, anche per la fibrosi cistica.
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 2
Pubblicazione con l’egida della
Guest Editor Luigi Maiuri Università degli Studi di Foggia Istituto Europeo per la Ricerca in Fibrosi Cistica (IERFC), c/o Istituto Scientifico San Raffaele, Milano
Anno V, N. 1 - Marzo 2011 Periodico trimestrale a carattere scientifico Registrazione Tribunale di Milano n. 341 del 28/05/2007 Editore SINERGIE Edizioni Scientifiche S.r.l. Via la Spezia, 1 - 20143 Milano Tel./Fax 02 58118054 E-mail: redazione@edizionisinergie.com www.edizionisinergie.com Direttore responsabile Mauro Rissa Redazione Sinergie Edizioni Scientifiche S.r.l.
Impaginazione Sinergie Edizioni Scientifiche S.r.l. Stampa Galli Thierry Stampa S.r.l. Via Caviglia, 3 - 20139 Milano Tiratura 500 copie Copyright ©2011 SINERGIE Edizioni Scientifiche S.r.l. Tutti i diritti sono riservati. Nessuna parte di questa pubblicazione può essere fotocopiata o riprodotta senza l’autorizzazione dell’Editore.
3 Le prove e i meccanismi dell’aumentata risposta infiammatoria nella fibrosi cistica
6 Nuovi meccanismi legati all’infiammazione e il loro ruolo nella fibrosi cistica 7 Infiammazione e transglutaminasi tissutale nella fibrosi cistica 10 Autofagia e infiammazione nella fibrosi cistica
FC Strumenti ed evidenze è una rivista monografica, trimestrale, dedicata al mondo della fibrosi cistica. Essa si prefigge di trattare argomenti solitamente “meno battuti” dal mondo medico e di offrire, quindi, un contributo originale a chi si occupa della cura dei pazienti o dell’organizzazione dell’assistenza. FC Strumenti ed evidenze si propone quindi come strumento per la ricerca clinica e per la valutazione dei sistemi assistenziali della fibrosi cistica. La rivista contiene articoli elaborati internamente dalla redazione con il contributo di esperti del settore, a livello nazionale ed internazionale. Ogni numero viene curato da un Guest editor che ne garantisce la validità scientifica e la completezza. L’editore sarà lieto di accogliere proposte ed eventuali contributi per la redazione di numeri monografici che verranno valutati dalla redazione. Sono anche accettati contributi di esperti che vogliano proporsi come Guest editor di una monografia. Le proposte possono essere inviate a redazione@edizionisinergie.com Finito di stampare nel mese di Febbraio 2011
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 3
Anno V - n. 1, 2011
Le prove e i meccanismi dell’aumentata risposta infiammatoria nella fibrosi cistica Numerosi sono gli studi in vitro, ex vivo e in vivo che
si proteica) permette di mantenere le proteine in stati
hanno correlato il deficit funzionale di CFTR alla disre-
funzionali o di dirigere verso la distruzione le protei-
golazione della risposta infiammatoria, anche se nella
ne che i sistemi di controllo riconoscono come altera-
maggior parte dei casi essi riguardano in maniera
te. Le proteine sono sottoposte a diversi controlli. Un
specifica la mutazione F508del.
sistema di degradazione delle proteine alterate è
Questa mutazione provoca un difettoso processamento
situato a livello del reticolo endoplasmico (ERAD =
della proteina nel reticolo endoplasmico da cui essa non
Endoplasmic reticulum Associated Degradation) e,
riesce ad uscire per raggiungere la membrana plasmati-
quando ne riconosca una non conforme, la sottopone
ca provocando un ingolfamento del reticolo stesso. Non
a “ubiquitinazione” e la trasloca nel citoplasma per-
superando i controlli di qualità previsti dai meccanismi
ché sia distrutta dal sistema ubiquitina-proteasoma
cellulari, CFTR F508del viene dirottata verso la degrada-
(UPS). Alcune proteine riescono tuttavia a superare
zione attraverso il sistema ubiquitin-proteasoma.
l’ostacolo e, pur alterate, arrivare alla membrana cel-
La mutazione F508del provoca una instabilità della
lulare. Qui è attivo un secondo sistema che le condu-
proteina CFTR che ne altera la struttura terziaria
ce verso una degradazione lisosomiale (Okiyoneda T
(misfolding). Il sistema di proteostasi (o dell’omeosta-
et al., 2010).
Il recettore Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (o PPARγ), anche conosciuto come il recettore del glitazone o NR1C3, è un recettore nucleare di secondo tipo che, nella specie umana, è codificato dal gene PPARγ. Esso regola il deposito degli acidi grassi e il metabolismo del glucosio. Molti farmaci usati nel trattamento del diabete agiscono su PPARγ per ridurre la glicemia senza aumentare la secrezione di insulina. I geni attivati da PPARγ stimolano la lipogenesi nel tessuto adiposo. Topi knock-out per PPARγ non riescono a generare tessuto adiposo nonostante diete ad alto regime lipidico. Fra le sue numerose funzioni PPARγ entra anche nel controllo della risposta infiammatoria in vari tipi di cellule. Per esempio, è dimostrato che livelli bassi di PPARγ provocano l'aumento di rilascio di citochine infiammatorie nell'epitelio respiratorio. Il trattamento con i ligandi di PPARγ inibisce la produzione di molecole pro-infiammatorie quali TNF-α, IL-1β e IL-6 attraverso l'interazione con fattori trascrizionali come NF-kB, AP-1 e STAT-1. Queste proprietà antinfiammatorie possono essere clinicamente rilevanti, come suggerito dalla efficacia terapeutica di farmaci che agiscono su PPARγ in malattie infiammatorie croniche intestinali, artrite reumatoide e psoriasi.
3
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 4
Anno V - n. 1, 2011
L’ingolfamento all’interno del sistema reticolo
(Tirouvanziam R et al., 2000). Queste prove riguar-
endoplasmico è considerato uno dei fattori scate-
dano la cellula CF in condizioni di base, cioè non
nanti di stress del reticolo endoplasmico (detto ER
esposta a stimuli infiammatori.
stress) che contribuisce all'infiammazione provo-
Vi sono poi numerose prove che mutazioni di CFTR
cando un’aumentata traslocazione del fattore tra-
modifichino il signalling di mediatori antiinfiammato-
scrizionale NFkB che viene “liberato” dalla sua sede
ri in risposta a stimoli batterici o infiammatori (Kelley
citoplasmatica e trasloca nel nucleo dove induce la
TJ et al., 2001), e provochino una esagerata risposta a
sintesi di interleuchina 8 (DiMango E etal., 1998). La
stimoli ipertonici (Karp CL et al., 2004). Da tempo si sa
traslocazione di NFkB avviene dopo separazione dal
che l’inoculazione intratracheale di Pseudomonas
fattore inibente IkB (Venkatakrishnan A et al.,
aeruginosa in topi CFTR-/- induce una aumentata
2000). Graft tracheali ottenuti da feti umani affetti
risposta infiammatoria (Heeckeren A et al., 1997)
da fibrosi cistica e abortiti sviluppano spontanea-
Inoltre topi omozigoti per la DF508 presentano un
mente infiammazione in assenza di infezione e
fenotipo infiammatorio polmonare in assenza di sti-
rispondono in maniera eccessiva a stimoli batterici
molazione batterica.
Perez A, Issler AC, Cotton CU, Kelley TJ, Verkman AS, and Davis PB. CFTR inhibition mimics the cystic fibrosis inflammatory profile. Am. J. Physiol. 2007; 292: L383-L395.
Il lavoro di Perez et al. è solo uno dei più recenti che
dopo la stimolazione con Pseudomonas, diminuisce di
confermano, a livello sperimentale, il ruolo di CFTR
quattro volte l’espressione di Smad3, eleva l’espressione
nella genesi di un processo infiammatorio. Il modello
di RhoA e induce la traslocazione di NFkB dopo stimo-
sperimentale adottato permette di esplorare diretta-
lazione con TNFα/IL-1β. Il modello è interessante per-
mente il ruolo di CFTR. Cellule epiteliali respiratorie
ché selettivo. Infatti, CFTRinh-172 non ha effetto sull’at-
ottenute da persone sane vengono fatte crescere in
tività del canale epiteliale del sodio (ENaC) al quale
vitro e sottoposte, per 3-5 giorni, all’azione di un agen-
viene attribuito un ruolo nella patogenesi del danno
te farmacologico che inibisce la funzione di canale di
respiratorio. Pertanto, nonostante non sia da escludere
CFTR (CFTRinh-172). Ciò provoca un aumento della
che CFTRinh-172 possa impattare su altre funzioni cel-
secrezione di interleuchina 8 sia in condizioni basali che
lulari, la inibizione del canale del cloro induce un feno-
L’Ubiquitina è una piccola proteina regolatoria presente in quasi tutti i tessuti (per questo ubiquitaria) degli organismi eucarioti. Fra le sue funzioni vi è quella di dirigere le proteine verso il processo di riciclaggio. L’ubiquitina si lega alle proteine segnalandole per essere distrutte. L’ubiquitina dirige le proteine al proteasoma che degrada e ricicla le proteine inutili o non conformi al controllo di qualità messo in atto dalla cellula. Questa scoperta ha meritato il premio Nobel nel 2004.
4
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 5
Anno V - n. 1, 2011
tipo “CF” in quanto a risposta infiammatoria. La rimo-
di superficie abnorme, alla viscosità delle secrezioni o
zione dell’inibitore ripristina le condizioni normali.
al ruolo di altri canali o all’infezione. Inoltre, l’inibizio-
Questa è la dimostrazione più diretta che abbiamo
ne di CFTR mediante CFTRinh-172 interferisce su altri
oggi per sostenere un legame diretto fra canale del
parametri correlati alla risposta infiammatoria quali i
cloro CFTR e infiammazione per sostenere che l’infiam-
livelli di Transglutaminasi 2 (TG2) (Luiciani A et al.,
mazione non è secondaria alla formazione di un liquido
2009; Luciani et al., 2010), come riportato in seguito.
Perez A, van Heeckeren AM, Nichols D, Gupta S, Eastman JF, Davis PB. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma in cystic fibrosis lung epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2008; 295: L303-L313. Le cellule respiratorie CF rispondono a uno stimolo
stato condotto in linee cellulari CF esposte a
infiammatorio con un aumento di attivazione del fat-
Pseudomonas aeruginosa e in animali sottoposti a
tore trascrizionale NFkB. PPARγ in condizioni normali
trattamenti con farmaci che aumentano le quantità di
inibisce l’attività di NFkB, ma nella fibrosi cistica si
PPARγ. In vitro, gli agonisti di PPARγ si dimostrano in
dimostra che i suoi livelli sono bassi. Ligandi di PPARγ
grado di ridurre la produzione di IL8 e di metallopro-
in grado di potenziarne l’attività potrebbero rivelarsi
teinasi-9 in risposta a stimoli infiammatori. Risultati
farmacologicamente interessanti. Questo studio è
simili sono ottenuti nel modello in vivo.
1.00
Harmon GS, Dumlao DS, Ng DT, Barrett KE,
GoLYTELY H20 + Ro H20
Dennis EA, Dong H, Glass CK. Pharmacological correction of a defect in PPAR-gamma signa-
0.75
*
cient mice. Nat Med. 2010;16:313-8.
Survival
ling ameliorates disease severity in Cftr-defi-
NS
0.50
Questo lavoro individua il ruolo di PPARγ a livello intestinale nell’animale CFTR-/-. Il trattamento con il rosi-
0.25
glitazone, ligante di PPARγ, non dotato di attività sul canale del cloro a livello del colon, riduce lo stato infiammatorio, previene l’occlusione intestinale che caratteristicamente insorge poco dopo la nascita in questi animali (equivalente di ileo da meconio) e aumenta la sopravvivenza dei topi CFTR-/- naturalmente gravati da elevata mortalità nei primi giorni di vita per ostruzione intestinale (Figura 1).
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 Time (d)
Figura 1. Curve di sopravvivenza di topi CFTR-/- trattati con rosiglitazone (Ro) o con la dieta GoLYTELY necessaria per evitare l’occlusione intestinale nel topo CF o con sola acqua. (da Harmon et al 2010). Il lavoro dimostra che l’effetto del farmaco si esplica attraverso l’attivazione di PPARγ.
5
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 6
Anno V - n. 1, 2011
Andersson C, Zaman Munir M, Jones AB, Freedman SD. Alterations in immune response and PPAR/LXR regulation in cystic fibrosis macrophages. J Cyst Fibros. 2007;7:68-78. Questo lavoro è importante perché stabilisce un punto di
to con DHA, infatti, eleva i livelli di PPARγ per un mecca-
contatto fra il metabolismo degli acidi grassi e l’infiam-
nismo non ancora chiarito e riduce la risposta infiamma-
mazione PPARγ mediata nella fibrosi cistica. Il trattamen-
toria dei macrofagi “CF” esposti a lipopolisaccaride.
Nuovi meccanismi legati all’infiammazione e il loro ruolo nella fibrosi cistica Vandivier RW, Richens TR, Horstmann SA, deCathelineau AM, Ghosh M, Reynolds SD, Xiao YQ, Riches DW, Plumb J, Vachon E, Downey GP, Henson PM. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009; 297: L677-86.
L’efferocitosi è il processo attraverso cui le cellule
rimosse prima di andare incontro a necrosi postapop-
apoptotiche sono fagocitate. Si tratta di una
totica e perché il riconoscimento della fosfatidilserina
macropinocitosi intrinsecamente connessa alla
induce il rilascio di mediatori antinfiammatori come il
regolazione della risposta infiammatoria (Henson
TGF-1. Questi segnali sopprimono la sintesi di IL8 e di
PM et al., 2001). Nel fenomeno dell’efferocitosi
altri mediatori dell’infiammazione che hanno un ruolo
sono coinvolte varie molecole alcune, come la
cruciale nella patogenesi del danno nella fibrosi cisti-
fosfatidil-serina, compaiono sulla cellula in apop-
ca. Inoltre, l’efferocitosi provoca il rilascio di fattori di
tosi e la rendono riconoscibile, altre sono presenti
crescita e di antiproteasi che hanno un ruolo nella
sulle cellule effettrici e permettono loro di ricono-
riparazione del tessuto e contrastano lo sbilanciamen-
scere una cellula in apoptosi.
to proteasi-antiproteasi (Vandivier RW et al., 2006;
Già nel 2002, Vandivier et al (Vandivier RW et al.,
Henson PM et al., 2001) Uno dei principali risultati di
2002) avevano dimostrato che la clearance delle cel-
questo lavoro è di avere accertato che la disfunzione
lule apoptotiche era sregolato nella fibrosi cistica.
di CFTR aumenta la concentrazione della proteina
L’efferocitosi deve essere considerato un fenomeno
RhoA, proteina che inibisce il meccanismo dell’effero-
antinfiammatorio, perché le cellule che muoiono sono
citosi.
6
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 7
Anno V - n. 1, 2011
Le vie che regolano apoptosi e efferocitosi sono
via RhoA/Rho chinasi potrebbero portare a un con-
complesse, molte certamente non ancora chiarite.
trollo di questo processo a livello polmonare. Le sta-
Resta interessante la costatazione di una efferocito-
tine possiedono questi effetti e migliorano l’efferoci-
si non adeguata e di un accumulo di cellule apopo-
tosi, sopprimendo l’infiammazione. Inoltre gli agoni-
totiche nella fibrosi cistica, il che potrebbe prelude-
sti di PPARγ, i macrolidi e i glucocorticoidi sono anche
re a nuove terapie specie se si dimostrasse che l’ef-
in grado di stimolare l’efferocitosi, sopprimono l’in-
ferocitosi non fosse solo ridotta anche nelle cellule
fiammazione e hanno un ruolo chiaro nel trattamen-
epiteliali respiratorie. Farmaci in grado di bloccare la
to della fibrosi cistica.
Infiammazione e transglutaminasi tissutale nella fibrosi cistica Maiuri L, Luciani A, Giardino I, Raia V, Villella VR, D’Apolito M, Pettoello-Mantovani M, Guido S, Ciacci C, Cimmino M, Cexus ON, Londei M, Quaratino S. Tissue transglutaminase activation modulates inflammation in cystic fibrosis via PPARgamma down-regulation. J Immunol. 2008; 180: 7697-705.
Uno degli obiettivi di questa ricerca era di capire i mec-
pioni di tessuti di pazienti con fibrosi cistica è notevol-
canismi attraverso cui PPARγ svolge un ruolo antin-
mente ridotta. Inoltre, PPARγ è prevalentemente loca-
fiammatorio. Questa molecola, come abbiamo già
lizzato in zone perinucleari di cellule CF il che è indica-
visto, svolge un ruolo cruciale come regolatore della
tivo della sua presenza in “aggresomi”, formazioni
risposta infiammatoria in varie condizioni patologiche
derivanti dall’accumulo di proteine ubiquitinate o con-
ed è in grado di inibire in maniera specifica la sintesi
seguenti a una ridotta funzione del proteasoma
di proteine proinfiammatorie come TNF-α, IL-6, IL-1β,
(Kopito RR, 2000) e ciò comporta un sequestro della
la via NF-kB e di modulare lo stress (Bailey ST et al.,
proteina con riduzione della sua forma solubile. La for-
2005). Come già noto, l’espressione di PPARγ in cam-
mazione di aggresomi è comune a varie patologie
I proteasomi sono complessi composti da proteasi la cui funzione è di degradare, attraverso un processo di proteolisi, proteine non più utili o danneggiate. Per esempio proteine misfolded, come la F508del, non superando il processo di controllo di qualità, vengono ubiquitinate e degradate nel proteasoma (Sistema ubiquitin-proteasoma). In alcuni casi, il proteasoma libera proteine biologicamente attive. Ciò avviene, per esempio, per il complesso NF-kB, presente in forma di complesso inattivo assieme al fattore IKB, la cui ubiquitinazione e degradazione libera NF-kB che migra nel nucleo in forma attiva attivando geni della risposta infiammatoria.
7
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 8
Anno V - n. 1, 2011
come la malattia di Huntington e il Parkinson. Proprio
La controprova sperimentale è stata ottenuta in cellu-
in queste malattie l’aggregazione delle molecole pato-
le non CF in cui l’inibizione della proteina CFTR con
logiche conseguenti al difetto genetico (nel Parkinson
CFTR inh172 è in grado di riprodurre sia l'aumento di
la α-synucleina) è stata messa in rapporto all’aumen-
ROS che l'aumento di TG2 e di ridurre i livelli di PPARγ.
to della proteina TG2 (transglutaminasi tissutale) pro-
Esiste, quindi, una continuità fra il lavoro di Perez et al.,
teina pleiotropica trovata aumentata in molti tessuti in
più sopra citato, e questo lavoro di Maiuri e coll. Nel
condizioni infiammatorie. La TG2 svolge differenti fun-
modello di Maiuri e coll la proteina TG2 svolge un ruolo
zioni biologiche a seconda dell’ambiente in cui opera
cruciale, aprendo la possibilità che manovre terapeuti-
e della sua localizzazione intracellulare e in presenza
che volte a limitarne l’aumento abbiano un ruolo nel
di elevati livelli di Calcio intracellulari induce cross-lin-
controllo dei meccanismi infiammatori nella fibrosi
king di proteine substrato.
cistica, come peraltro dimostrato in altre malattie dove
Era quindi lecito chiedersi se TG2 avesse un ruolo
sono in gioco gli stessi meccanismi.
anche nella fibrosi cistica, cosa che viene confermata mostrandone l’aumento sia in termini di quantità di TG2 protein
proteina che di attività enzimatica (Figura 2). Gli auto-
TG2 activity
Merge
fra aumento di TG2 e formazione di aggregati di PPARγ con sequestro nell’aggresoma. Infine, hanno potuto
Control
ri hanno poi dimostrato che esiste un rapporto diretto
dimostrare che l’inibizione specifica di TG2 nelle celluce la risposta infiammatoria delle cellule.
CF
le CF induce la traslocazione nucleare di PPARγ e riduRestava da spiegare il meccanismo dell’aumentata attività di TG2. Gli esperimenti condotti dimostrano che Nasal polyp mucosa
ciò dipende sia da un’aumentata concentrazione di calcio intracellulare (evento peraltro già descritto nella fibrosi cistica) che dalla presenza di ossigeno reattivo (ROS=reactive oxygen species), altra caratteristica precipua della biologia cellulare della fibrosi cistica.
Figura 2. La figura mostra la diversa intensità di colorazione per la TG2 in tessuto proveniente da paziente con fibrosi cistica e in tessuto da paziente di controllo. (da Maiuri et al., J Immunol 2008)
Le Small Ubiquitin-like Modifier o SUMO proteins sono una famiglia di piccole proteine che si attaccano in modo covalente ad altre proteine per modificarne la funzione. Per SUMOylation si intende una modificazione di proteine a livello post-traslazionale presente in diversi processi cellulari come il trasporto nucleo-citosolico, l’apoptosi, la stabilità proteica e la progressione del ciclo cellulare. Le SUMO proteins sono simili all’ubiquitina e la SUMOylation viene diretta da una cascata enzimatica analoga a quella dell’ubiquitinazione. Contrariamente all’ubiquitina, le SUMO non segnalano le proteine per la degradazione.
8
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 9
Anno V - n. 1, 2011
In biologia cellulare l’autofagia è un processo che comporta la degradazione di componenti della cellula stessa attraverso i lisosomi. Si tratta di un processo strettamente regolato che ha un ruolo importante nella crescita cellulare, nello sviluppo e nell’omeostasi permettendo di mantenere un equilibrio fra sintesi, degradazione e riciclaggio di prodotti cellulari.
Luciani A, Villella VR, Vasaturo A, Giardino I, Raia V, Pettoello-Mantovani M, D’Apolito M, Guido S, Leal T, Quaratino S, Maiuri L. SUMOylation of tissue transglutaminase as link between oxidative stress and inflammation. J Immunol. 2009; 183: 2775-84.
Questo secondo lavoro dello stesso gruppo prosegue
strano ulteriormente che l’aumento di TG2 è diretta-
nella stessa linea e si propone di individuare i mecca-
mente responsabile della riduzione dei livelli di PPARγ.
nismi che portano a un aumentato livello di TG2.
I meccanismi chiariti da una complessa serie di esperi-
L’ipotesi di partenza è che l’aumentata attività di TG2
menti sono riassunti nella Figura 3.
dipenda da una SUMOilazione della molecola che ne
L’aumento di livelli intracellulari di ROS è responsabile
impedisce l’ubiquitinazione. Questa ipotesi viene con-
della SUMOilazione di TG2, inibendone la ubiquitinazio-
fermata attraverso una serie di esperimenti che dimo-
ne e la degradazione nel proteasoma. TG2 induce cross-
CFTR
ROS
PIASy
SUMO TG2 Ub
PPARγ
TG2
TG2
TG2
SUMO-TG2
Ub-TG2
PPARγ cross-linking
degradation
Proteasome degradation
High TG2 levels
Figura 3. Rappresentazione schematica dei meccanismi che conducono ad elevati livelli di TG2 e sequestro di PPARγ nella Fibrosi Cistica. La presenza di elevate concentrazioni di specie di ossigeno reattivo favorisce la SUMOilazione della transglutaminasi tissutale (TG2) attraverso un processo che coinvolge PIASy. Viene quindi inibita l’ubiquitinazione di TG2 e la sua degradazione nel proteasoma. Quindi aumentano le concentrazioni di TG2 che favorisce l’ubiquitinazione e degradazione di PPARγ. La ridotta concentrazione di PPARγ ne riduce l’effetto antinfiammatorio. (da Luciani et al, J Immunol 2009)
9
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 10
Anno V - n. 1, 2011
linking di PPARγ e ne favorisce la ubiquitinazione e
Maiuri, attribuisce molta importanza al particolare
degradazione. Infine, TG2 induce la degradazione pro-
ambiente ossidativo della cellula FC. Da una parte, esso
teasomica di IkBα fattore di cui abbiamo già descritto
sembra direttamente dipendere dalla ridotta funzione
la funzione di modulazione di NFkB. Ne consegue la
del canale del cloro, dall’altra esso induce un aumento
traslocazione di NFkB nel nucleo con aumento della
posttrascrizionale di TG2 che, a sua volta, riduce la pre-
attivià infiammatoria per attivazione dei geni che NFkB
senza del recettore PPAΡγ, e di conseguenza le sue fun-
controlla.
zioni antinfiammatorie, aumenta l'ubiquitinazione di
In definitiva, l’asse dell’ipotesi formulata dal gruppo di
IkBα e libera NFkB.
Autofagia e infiammazione nella fibrosi cistica Luciani A, Villella VR, Esposito S, Brunetti-Pierri N, Medina D, Settembre C, Gavina M, Pulze L, Giardino I, Pettoello-Mantovani M, D’Apolito M, Guido S, Masliah E, Spencer B, Quaratino S, Raia V, Ballabio A, Maiuri L. Defective CFTR induces aggresome formation and lung inflammation in cystic fibrosis through ROS-mediated autophagy inhibition. Nat Cell Biol. 2010; 12: 863-75. Questo studio descrive un meccanismo del tutto nuovo
mente nocivi. Fra le varie forme di autofagia, la macro-
nel complesso quadro di disregolazione della fisiologia
autofagia è quella di maggiore rilievo durante la quale si
della cellula epiteliale CF e dell'impatto sui meccanismi
formano vescicole a doppia membrana, dette autofago-
di regolazione dell’infiammazione. Il lavoro affronta il
somi, che sequestrano organelli, proteine o frazioni cito-
problema della difettosa autofagia nelle cellule CF.
plasmatiche e, attraverso un meccanismo complesso
L’autofagia è uno dei meccanismi citoprotettivi che le
regolato da oltre 30 geni, trasportano questo materiale
cellule adottano per la degradazione di proteine e di
ai lisosomi per la degradazione. Pertanto l’autofagia
organelli intracellulari per garantire l’omeostasi cellulare.
integra i processi degradativi del proteasoma che non
L’autofagia può essere stimolata da molteplici forme di
può degradare molecole aggregate, organelli o frazioni
stress, quali ad esempio lo stress ossidativo, l’ipossia, o
citoplasmatiche. Il bilanciamento di questi processi
carenza di nutrienti per consentire alla cellula di adatta-
garantisce l’equilibrio cellulare.
re il suo metabolismo e proteggersi da fattori potenzial-
Una alterazione del processo di autofagia è riscontra-
Beclin-1 è una proteina codificata dal gene BECN1 un gene relato all’autofagia (Atg6). Beclin-1 interagisce con la sua partner phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Vps34, e con altre molecole del complesso PI3K III per iniziare la formazione dell’autofagosoma nel processo di autofagia.
10
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 11
Anno V - n. 1, 2011
to in diverse malattie umane, quali alcune malattie
mento dei ROS e della TG2, induce sequestro in aggre-
neurodegenerative, malattie infiammatorie croniche
somi della proteina beclin 1, cruciale per la formazio-
o cancro. Questo studio offre la prima evidenza che la
ne degli autofagosomi. Ciò induce un spiazzamento di
Fibrosi Cistica è una patologia correlata ad autofagia
tutto il complesso PI3K III, il cosidetto “interattoma” di
in quanto una inibizione del processo autofagico è
beclin 1, fuori dal Reticolo Endoplasmico in cui la sua
presente nelle cellule epiteliali respiratorie umane e
attività è richiesta per l’inizio del processo di autofa-
nei modelli murini omozigoti per la mutazione
gia. L’inibizione dell’autofagia, a sua volta, innesca un
F508del-CFTR. Questo processo è direttamente legato
circolo vizioso che aumenta ulteriormente i livelli di
al difetto di funzione della CFTR che attraverso l’incre-
ROS, verosimilmente per la permanenza nella cellula
A
B
Defective CFTR
F508del CFTR PM surface
ROS ROS scavengers
ROS Golgi
inflammation
TG2
TG2 Ambra1
autophagy
Beclin 1 Vps34
cystamine
F508del CFTR
ER Ambra1
Atg14
autophagy
Beclin 1
Vps15
Vps34 Proteasome overload
p62
F508del CFTR
Atg14
Vps15
p62
F508del CFTR HDAC6 aggresomes
aggresomes
p62
Figura 4. Rappresentazione schematica dei meccanismi patogenetici dell'infiammazione respiratoria nella fibrosi cistica secondo le ipotesi elaborare dal gruppo di Maiuri. a) La presenza di elevate concentrazioni di specie di ossigeno reattivo favorisce la SUMOilazione e la persistenza di elevati livelli della transglutaminasi tissutale (TG2). Questo induce cross-linking di beclin 1 e sequestro funzionale del complesso PI3K III in aggresomi. Ne consegue il blocco dell'autofagia che non riesce ad eliminare gli aggresomi (che non possono essere eliminati attraverso il proteasoma) e i mitocondri dannegiati con conseguente ulteriore incremento dei ROS e della TG2. L'aumento di p62, una proteina eliminata per via autofagica, sovraccarica ulteriormente il proteasoma. Questo circolo vizioso induce infiammazione. Inoltre, la stessa proteina DF508 CFTR accumula in aggresomi e non puo' raggiungere l'apparato di Golgi per essere glicosilata. b) Bloccando questo circolo vizioso e ripristinando i livelli e la funzione di beclin 1 si ripristina l'autofagia, si controlla l'infiammazione e si favorisce il trafficking di CFTR verso la membrana cellulare. (tratto da: Luciani et al, Nature Cell Biol 2010; 12:863-75; Luciani et al, Autophagy 2001; 1:104-106)
11
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 12
Anno V - n. 1, 2011
di mitocondri danneggiati, aumenta i livelli di TG2 e
peutici per il controllo della infiammazione: a) la tera-
favorisce l’infiammazione (Figura 4).
pia genica con beclin 1; b) inibitori della TG2, quali la
Lo studio offre notevoli implicazioni terapeutiche in
cistamina; c) gli antiossidanti, quali la cistamina stessa,
quanto dimostra che il recupero dei livelli e della fun-
dotata anche di proprietà anti-ossidanti, o la N-acetil-
zione di beclin 1 è in grado non solo di ripristinare l’au-
cisteina (NAC), fornendo inoltre un razionale del tutto
tofagia, ma anche di controllare lo stress ossidativo e
nuovo per l’uso degli antiossidanti in Fibrosi Cistica.
l’infiammazione, sia in vitro, che in modelli ex vivo di
È inoltre di notevole interesse che questi trattamenti
polipo nasale FC, sia in vivo nei topi omozigoti per la
sono in grado di migliorare il trafficking della proteina
F508delCFTR. Lo studio offre 3 potenziali approcci tera-
CFTR e la sua collocazione in membrana (Figura 4).
Bibliografia • Bailey ST, and Ghosh S. ‘PPAR’ting ways with inflammation. Nat. Immunol. 2005; 6: 966-967. • DiMango E, Ratner AJ, Bryan R, Tabibi S, Prince A. Activation of NF-_B by adherent Pseudomonas aeruginosa in normal and cystic fibrosis respiratory epithelial cells. J Clin Invest. 1998; 101: 2598-2605. • Dinwiddie R. Anti-inflammatory therapy in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 2005; 4 Suppl 2:45-8:45-48. • Heeckeren A, Walenga R, Konstan MW, Bonfield T, Davis PB, Ferkol T. Excessive inflammatory response of cystic fibrosis mice to bronchopulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. J Clin Invest 1997; 100: 2810-2815. • Henson PM, Bratton DL, Fadok VA. Apoptotic cell removal. Curr Biol. 2001; 11: R795-805. • Karp CL, Flick LM, Park KW, Softic S, Greer TM, Keledjian R, Yang R, Uddin J, Guggino WB, Atabani SF, Belkaid Y, Xu Y, Whitsett JA, Accurso FJ, Wills-Karp M, Petasis NA. Defective lipoxin mediated antiinflammatory activity in the cystic fibrosis airway. Nat Immunol. 2004; 5: 388-392. • Kelley TJ, Elmer HL, Corey DA. Reduced Smad3 protein expression and altered transforming growth factor-_1mediated signaling in cystic fibrosis epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2001; 25: 732-738. • Kopito RR. Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation. Trends Cell Biol. 2000; 10: 524-530.
12
• Luiciani A et al, J. Immunol. 2009;183:2775-84; • Luciani A. et al, Nature Cell Biol. 2010;12:863-75. • Okiyoneda T, Barrière H, Bagdány M, Rabeh WM, Du K, Höhfeld J, Young JC, Lukacs GL. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 2010; 329: 805-10. • Tirouvanziam R, de Bentzmann S, Hubeau C, Hinnrasky J, Jacquot J, Peault B, Puchelle E. Inflammation and infection in naive human cystic fibrosis airway grafts. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000; 23: 121-127. • Vandivier RW, Fadok VA, Hoffmann PR, Bratton DL, Penvari C, Brown KK, Brain JD, Accurso FJ, Henson PM. Elastase-mediated phosphatidylserine receptor cleavage impairs apoptotic cell clearance in cystic fibrosis and bronchiectasis. J Clin Invest. 2002; 109: 661-670. • Vandivier RW, Henson PM, Douglas IS. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest 2006; 129: 1673-1682. • Venkatakrishnan A, Stecenko AA, King G, Blackwell TR, Brigham KL, Christman JW, Blackwell TS. Exaggerated activation of nuclear factor-_B and altered I_B-_ processing in cystic fibrosis bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000; 23: 396-403.
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 13
90(::<5;6 +,33, *(9(;;,90:;0*/, +,3 796+6;;6
+,56405(A065, +,3 4,+0*05(3, )9(40;6) TN TS ZVS\aPVUL KH ULI\SPaaHYL *6476:0A065, 8<(30;(;0=( , 8<(5;0;(;0=( <U JVU[LUP[VYL TVUVKVZL KH TS JVU[PLUL ;VIYHTPJPUH TN 7LY NSP LJJPWPLU[P ]LKLYL WHYHNYHMV -694( -(94(*,<;0*( :VS\aPVUL KH ULI\SPaaHYL :VS\aPVUL SPTWPKH KP JVSVYL KH SPL]LTLU[L NPHSSV H NPHSSV 05-694(A0650 *3050*/, 0UKPJHaPVUP [LYHWL\[PJOL ;LYHWPH WYVS\UNH[H KLSS»PUMLaPVUL WVSTVUHYL JYVUPJH KH 7ZL\KVTVUHZ HLY\NPUVZH PU WHaPLU[P JVU ÄIYVZP JPZ[PJH KP L[n UVU PUMLYPVYL HP HUUP 7VZVSVNPH L TVKV KP ZVTTPUPZ[YHaPVUL )9(40;6) u ZVSV WLY \ZV PUHSH[VYPV L UVU ]H \[PSPaaH[V WLY ]PH WHYLU[LYHSL 3H KVZL JVUZPNSPH[H WLY HK\S[P L IHTIPUP u WHYP HK \U JVU[LUP[VYL TVUVKVZL TN K\L ]VS[L HS NPVYUV TH[[PUV L ZLYH WLY \U WLYPVKV KP NPVYUP 3»PU[LY]HSSV [YH SL K\L KVZP KL]L LZZLYL PS WP ]PJPUV WVZZPIPSL HSSL VYL L JVT\UX\L UVU PUMLYPVYL HSSL VYL +VWV NPVYUP KP [LYHWPH P WHaPLU[P KL]VUV PU[LYYVTWLYL PS [YH[[HTLU[V JVU )9(40;6) WLY P NPVYUP Z\JJLZZP]P :P KL]L YPZWL[[HYL PS YLNPTL H JPJSP HS[LYUP \U JPJSV KP NPVYUP KP [LYHWPH ZLN\P[P KH NPVYUP KP PU[LYY\aPVUL KLS [YH[[HTLU[V 0S KVZHNNPV UVU u Z[HIPSP[V PU IHZL HS WLZV JVYWVYLV Ï WYL]PZ[V JOL [\[[P P WHaPLU[P YPJL]HUV \UH ÄHSH KP )9(40 ;6) TN KP [VIYHTPJPUH K\L ]VS[L HS NPVYUV 0U Z[\KP JSPUPJP JVU[YVSSH[P PS [YH[[HTLU[V JVU )9(40;6) H JPJSP HS[LYUP ZVWYHKLZJYP[[V OH KL[LYTPUH[V TPNSPVYHTLU[V KLSSH M\UaPVUHSP[n WVSTVUHYL JVU YPZ\S[H[P JOL ZP THU[LUNVUV HS KP ZVWYH KLP ]HSVYP PUPaPHSP HUJOL ULS WLYPVKV KP PU[LYY\aPVUL KLSSH [LYHWPH 5LNSP Z[\KP JSPUPJP JVU )9(40;6) UVU JP ZVUV KH[P PU WHaPLU[P KP L[n PUMLYPVYL HP HUUP LK PU WHaPLU[P PUML[[H[P KH JVSVUPL KP ) JLWHJPH 3»LMÄJHJPH L SH ZPJ\YLaaH KP )9(40;6) UVU u Z[H[H Z[\KPH[H PU WHaPLU[P JVU -,= # V % KLS WYL]PZ[V 3H [LYHWPH KL]L LZZLYL PUPaPH[H KH \U TLKPJV JVU LZWLYPLUaH ULS [YH[ [HTLU[V KLSSH ÄIYVZP JPZ[PJH 0S [YH[[HTLU[V JVU )9(40;6) KL]L LZZLYL JVU[P U\H[V Z\ IHZL JPJSPJH ÄUV H JOL PS TLKPJV J\YHU[L YP[LUNH JOL PS WHaPLU[L [YHN NH ILULÄJP KHSS»PUJS\ZPVUL KP )9(40;6) ULS YLNPTL KP [YH[[HTLU[V 5LS JHZV PU J\P ZP WYLZLU[HZZL \U KL[LYPVYHTLU[V JSPUPJV KLSSV Z[H[V WVSTVUHYL ZP KL]L JVUZPKLYHYL S»VWWVY[\UP[n KP PU[LY]LUPYL JVU \UH [LYHWPH HU[P WZL\KVTVUHSL HNNP\U[P]H :[\KP JSPUPJP OHUUV KPTVZ[YH[V JOL YPZ\S[H[P TPJYVIPVSVNPJP PUKPJHU[P YLZPZ[LUaH HS MHYTHJV PU ]P[YV UVU WYLJS\KVUV ULJLZZHYPHTLU[L \U ILULÄJPV JSPUPJV WLY PS WHaPLU[L PU [LYTPUP KP TPNSPVYHTLU[V KLSSH M\UaPVUHSP[n WVSTVUHYL 0Z[Y\aPVUP WLY S»\ZV )9(40;6) u \UH ZVS\aPVUL HJX\VZH Z[LYPSL WYP]H KP JVUZLY]HU[P UVU WPYV NLUH JVU[LULU[L TN TS KP [VIYHTPJPUH 0S JVU[LUP[VYL TVUVKVZL KL]L LZZLYL HWLY[V PTTLKPH[HTLU[L WYPTH KLSS»\ZV" S»L]LU[\HSL ZVS\aPVUL UVU \[P SPaaH[H PTTLKPH[HTLU[L UVU KL]L LZZLYL JVUZLY]H[H WLY \U YP\[PSPaaV TH KL]L LZZLYL LSPTPUH[H 3H ZVTTPUPZ[YHaPVUL KP )9(40;6) ]H LMML[[\H[H YPZWL[[HUKV YPNVYVZHTLU[L SL UVYTL PNPLUPJOL NLULYHSP 3»HWWHYLJJOPH[\YH \ZH[H KL]L LZ ZLYL W\SP[H L M\UaPVUHU[L" PS ULI\SPaaH[VYL KP \ZV Z[YL[[HTLU[L WLYZVUHSL ]H [LU\[V HJJ\YH[HTLU[L W\SP[V L KL]L LZZLYL YLNVSHYTLU[L KPZPUML[[H[V 0Z[Y\aPVUP WLY S»HWLY[\YH KLS JVU[LUP[VYL! -SL[[LYL PS JVU[LUP[VYL TVUVKVZL ULSSL K\L KPYLaPVUP :[HJJHYL PS JVU[LUP[VYL TVUVKVZL KHSSH Z[YPZJPH WYPTH ZVWYH L WVP HS JLU[YV (WYPYL PS JVU[LUP[VYL TVUVKVZL Y\V[HUKV S»HSL[[H ULS ZLUZV PUKPJH[V KHSSH MYLJJPH ,ZLYJP[HUKV \UH TVKLYH[H WYLZZPVUL Z\SSL WHYL[P KLS JVU[LUP[VYL TVUVKVZL MHY \ZJPYL PS TLKPJPUHSL L ]LYZHYSV ULSS»HTWVSSH KLS ULI\SPaaH[VYL 3»PU[LYV JVU[LU\[V KLS JVU[LUP[VYL TVUVKVZL TN ]LYZH[V ULS ULI\SPaaH [VYL ]H ZVTTPUPZ[YH[V [YHTP[L \U»PUHSHaPVUL KLSSH K\YH[H KP JPYJH TPU\[P \[PSPaaHUKV \U ULI\SPaaH[VYL YP\[PSPaaHIPSL 7(90 3* 73<: JVU \U JVTWYLZZVYL HKLN\H[V :P JVUZPKLYHUV HKLN\H[P P JVTWYLZZVYP JOL \UH ]VS[H H[[HJJH[P HK \U ULI\SPaaH[VYL 7(90 3* 73<: LTL[[VUV \U Å\ZZV KP S TPU L V \UH JVU[YVWYLZZPVUL KP R7H )9(40;6) ]PLUL PUHSH[V TLU[YL PS WHaPLU[L u ZLK\[V V PU WPLKP L YLZWPYH UVYTHSTLU[L H[[YH]LYZV PS IVJJHNSPV KLS ULI\SPa aH[VYL <UH TVSSL[[H WLY PS UHZV W\~ HP\[HYL PS WHaPLU[L H YLZWPYHYL H[[YH]LYZV
SH IVJJH 0S WHaPLU[L KL]L JVU[PU\HYL PS WYVWYPV YLNPTL Z[HUKHYK KP ÄZPV[LYHWPH YLZWPYH[VYPH 3»\ZV KP IYVUJVKPSH[H[VYP HWWYVWYPH[P ]H JVU[PU\H[V H ZLJVUKH KLS SH ULJLZZP[n JSPUPJH 5LS JHZV PU J\P P WHaPLU[P YPJL]HUV KP]LYZL [LYHWPL YLZWPYH [VYPL ZL UL YHJJVTHUKH S»HZZ\UaPVUL ULS ZLN\LU[L VYKPUL! IYVUJVKPSH[H[VYL ÄZPV[LYHWPH YLZWPYH[VYPH HS[YP MHYTHJP WLY ]PH PUHSH[VYPH LK PUÄUL )9(40;6) )9(40;6) UVU KL]L LZZLYL TPZJLSH[V JVU HS[YP TLKPJPUHSP WLY \ZV PUHSH[VYPV 0Z[Y\aPVUP WLY SH W\SPaPH L SH KPZPUMLaPVUL KLS ULI\SPaaH[VYL ;LYTPUH[H SH ULI\SPaaHaPVUL PS ULI\SPaaH[VYL ]H ZTVU[H[V P ZPUNVSP WLaaP LJ JL[[V PS [\IV ]HUUV W\SP[P HJJ\YH[HTLU[L JVU HJX\H JHSKH L KL[LYZP]V SPX\PKV YPZJPHJX\H[P LK HZJP\NH[P JVU \U [LSV W\SP[V HZJP\[[V L WYP]V KP WLS\JJOP 7LY SH KPZPUMLaPVUL KLS ULI\SPaaH[VYL KH LMML[[\HYZP YLNVSHYTLU[L ZP JVUZPNSPH KP PTTLYNLYL SL ZPUNVSL WHY[P LJJL[[V PS [\IV W\SP[L JVTL KLZJYP[[V ZVWYH PU \UH ZVS\aPVUL KP \UH WHY[L KP HJL[V L [YL WHY[P KP HJX\H TVS[V JHSKH WLY \U»VYH" WVP YPZJPHJX\HYL JVU HJX\H JHSKH LK HZJP\NHYL HJJ\YH[HTLU[L JVU \U [LSV W\SP[V ;LYTPUH[H SH KPZPUMLaPVUL SH ZVS\aPVUL KP HJL[V ]H PTTLKPH[HTLU[L LSPTPUH[H 0U HS[LYUH[P]H SH KPZPUMLaPVUL W\~ LZZLYL LMML[[\H[H TLKPHU[L IVSSP[\YH PU HJX\H WLY TPU\[P *VU[YVPUKPJHaPVUP 3H ZVTTPUPZ[YHaPVUL KP )9(40;6) u JVU[YVPUKPJH[H PU [\[[P P WHaPLU[P JVU PWLY ZLUZPIPSP[n HJJLY[H[H ULP JVUMYVU[P KP X\HSZPHZP HTPUVNSPJVZPKL
(]]LY[LUaL ZWLJPHSP L VWWVY[\UL WYLJH\aPVUP K»PTWPLNV (]]LY[LUaL NLULYHSP 7LY PUMVYTHaPVUP YLSH[P]L HSSH ZVTTPUPZ[YHaPVUL ULS JVYZV KLSSH NYH]PKHUaH L KLSS»HSSH[[HTLU[V ]LKP PS WHYHNYHMV ¸.YH]PKHUaH L HSSH[[HTLU[V¹ )9(40 ;6) KL]L LZZLYL \ZH[V JVU JH\[LSH ULP WHaPLU[P JVU KPZM\UaPVUL YLUHSL HJ JLY[H[H V ZVZWL[[H \KP[P]H ]LZ[PIVSHYL V UL\YVT\ZJVSHYL V JVU LTV[[PZP NYH]L PU H[[V )YVUJVZWHZTV 0S IYVUJVZWHZTV W\~ PUZVYNLYL PU ZLN\P[V H ZVTTPUPZ[YHaPVUL KP TLKPJPUHSP WLY ]PH PUHSH[VYPH LK u Z[H[V ZLNUHSH[V HUJOL JVU [VIYHTPJPUH ULI\SPaaH[H 3H WYPTH KVZL KP )9(40;6) KL]L LZZLYL ZVTTPUPZ[YH[H ZV[[V JVU[YVSSV TLKPJV \ZHUKV \U IYVUJV KPSH[H[VYL WYL ULI\SPaaHaPVUL ZL X\LZ[V MH NPn WHY[L KLS [YH[[HTLU[V PU H[[V WLY PS WHaPLU[L 0S -,= ]VS\TL LZWPYH[VYPV MVYaH[V KL]L LZZLYL TPZ\YH[V WYPTH L KVWV SH ULI\SPaaHaPVUL :L ]P u L]PKLUaH KP IYVU JVZWHZTV PUKV[[V KHSSH [LYHWPH PU \U WHaPLU[L JOL UVU YPJL]L \U IYVUJVKP SH[H[VYL PS [YH[[HTLU[V KL]L LZZLYL YPWL[\[V PU \U»HS[YH VJJHZPVUL \ZHUKV \U IYVUJVKPSH[H[VYL 3»PUZVYNLUaH KP IYVUJVZWHZTV PU WYLZLUaH KP \UH [LYHWPH JVU IYVUJVKPSH[H[VYL W\~ PUKPJHYL \UH YLHaPVUL HSSLYNPJH :L ZP ZVZWL[[H \UH YLHaPVUL HSSLYNPJH )9(40;6) KL]L LZZLYL ZVZWLZV 0S IYVUJVZWHZTV ]H [YH[ [H[V ULS TVKV JSPUPJHTLU[L HWWYVWYPH[V +PZ[\YIP UL\YVT\ZJVSHYP )9(40;6) KL]L LZZLYL \ZH[V JVU NYHUKL JH\[LSH ULP WHaPLU[P HMML[[P KH KP Z[\YIP UL\YVT\ZJVSHYP X\HSP 7HYRPUZVUPZTV V HS[YL JVUKPaPVUP JHYH[[LYPaaH[L KH TPHZ[LUPH PUJS\ZH SH TPHZ[LUPH NYH]L WVPJOu NSP HTPUVNSPJVZPKP WVZZVUV HN NYH]HYL SH KLIVSLaaH T\ZJVSHYL H JH\ZH KP \U WV[LUaPHSL LMML[[V J\YHYVZPTPSL Z\SSH M\UaPVUL UL\YVT\ZJVSHYL 5LMYV[VZZPJP[n 5VUVZ[HU[L SH ULMYV[VZZPJP[n ZPH Z[H[H HZZVJPH[H HSSH [LYHWPH JVU HTPUVNSPJVZPKP WLY ]PH WHYLU[LYHSL UVU J»u Z[H[H L]PKLUaH KP ULMYV[VZZPJP[n ULNSP Z[\KP JSPUPJP JVU )9(40;6) JVUZPKLYH[H SH YPKV[[H LZWVZPaPVUL ZPZ[LTPJH 0S TLKPJPUHSL ]H JVT\UX\L \ZH[V JVU JH\[LSH ULP WHaPLU[P JVU HJJLY[H[H V ZVZWL[[H KPZM\UaPV UL YLUHSL L KL]VUV LZZLYL JVU[YVSSH[L SL JVUJLU[YHaPVUP ZPLYPJOL KP [VIYHTPJP UH 0 WHaPLU[P JVU NYH]L PUZ\MÄJPLUaH YLUHSL UVU ZVUV Z[H[P PUJS\ZP ULNSP Z[\KP JSPUPJP 3»H[[\HSL WYHZZP JSPUPJH WYL]LKL JOL ZPH ]HS\[H[H SH M\UaPVUHSP[n YLUHSL KP IHZL 3H M\UaPVUHSP[n YLUHSL KL]L PUVS[YL LZZLYL YP]HS\[H[H WLYPVKPJHTLU[L JVU[YVSSHUKV P SP]LSSP KP \YLH L JYLH[PUPUH HSTLUV VNUP JPJSP JVTWSL[P KP [LYHWPH JVU )9(40;6) NPVYUP KP [YH[[HTLU[V JVU [VIYHTPJPUH WLY ULI\SPaaH aPVUL 0U JHZV KP L]PKLUaH KP ULMYV[VZZPJP[n SH [LYHWPH JVU [VIYHTPJPUH KL]L LZZLYL PU[LYYV[[H ÄUV H X\HUKV SL JVUJLU[YHaPVUP ZPLYPJOL TPUPTL KP MHYTHJV ZJLUKHUV HS KP ZV[[V KP N TS 3H [LYHWPH JVU )9(40;6) W\~ LZZLYL WVP YP WYLZH H KPZJYLaPVUL KLS TLKPJV 0 WHaPLU[P JOL YPJL]VUV JVU[LTWVYHULHTLU[L \UH [LYHWPH JVU \U HTPUVNSPJVZPKL WLY ]PH WHYLU[LYHSL KL]VUV LZZLYL [LU\[P ZV[[V Z[YL[[V JVU[YVSSV [LULUKV JVU[V KLS YPZJOPV KP [VZZPJP[n J\T\SH[P]H
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 14
6[V[VZZPJP[n 0U ZLN\P[V HSS»\ZV KP HTPUVNSPJVZPKP WLY ]PH WHYLU[LYHSL u Z[H[H YPWVY[H[H V[V [VZZPJP[n JOL ZP u THUPMLZ[H[H ZPH JVTL [VZZPJP[n \KP[P]H PWVHJ\ZPH JOL JVTL [VZZPJP[n ]LZ[PIVSHYL ]LY[PNPUP H[HZZPH V JHWVNPYP 5LS JVYZV KLSSH [LYHWPH JVU )9(40;6) ULSS»HTIP[V KP Z[\KP JSPUPJP JVU[YVSSH[P ZVUV Z[H[P VZZLY]H[P PWVHJ\ ZPH KLP JHZP L ]LY[PNPUP KLP JHZP KP LU[P[n TVKLZ[H L YL]LYZPIPSP 0S TLKPJV KL]L JVUZPKLYHYL SH WVZZPIPSP[n JOL NSP HTPUVNSPJVZPKP JH\ZPUV [VZZPJP[n ]LZ[PIVSHYL L JVJSLHYL LK LZLN\PYL JVU[YVSSP HWWYVWYPH[P KLSSH M\UaPVUL \KP[P]H ULS JVYZV KLSSH [LYHWPH JVU )9(40;6) 5LP WHaPLU[P JVU \U YPZJOPV WYLKPZWV ULU[L KV]\[V HK \UH WYLJLKLU[L [LYHWPH JVU HTPUVNSPJVZPKP WLY ]PH ZPZ[LTPJH WYVS\UNH[H W\~ LZZLYL ULJLZZHYPV JVUZPKLYHYL S»VWWVY[\UP[n KP HJJLY[HTLU [P H\KPVSVNPJP WYPTH KLSS»PUPaPV KLSSH [LYHWPH JVU )9(40;6) 3H JVTWHYZH KP [PUUP[V PTWVUL JH\[LSH WVPJOu ZP [YH[[H KP \U ZPU[VTV KP V[V[VZZPJP[n :L PS WHaPLU[L YPMLYPZJL [PUUP[V V WLYKP[H KLSS»\KP[V ULS JVYZV KLSSH [LYHWPH JVU HTPUV NSPJVZPKP PS TLKPJV KL]L JVUZPKLYHYL S»VWWVY[\UP[n KP WYLKPZWVYYL HJJLY[HTLU[P H\KPVSVNPJP 0 WHaPLU[P JOL YPJL]VUV JVU[LTWVYHULHTLU[L \UH [LYHWPH JVU HTPUVNSPJVZPKP WLY ]PH WHYLU[LYHSL KL]VUV LZZLYL ZV[[VWVZ[P H JVU[YVSSP JSPUPJP [LULUKV JVU[V KLS YPZJOPV KP [VZZPJP[n J\T\SH[P]H
,MML[[P Z\SSH JHWHJP[n KP N\PKHYL ]LPJVSP L Z\SS»\ZV KP THJJOPUHYP :\SSH IHZL KLSSL YLHaPVUP H]]LYZL UV[L u KH JVUZPKLYHYZP PTWYVIHIPSL SH WVZZP IPSP[n JOL )9(40;6) PUÅ\LUaP SH JHWHJP[n KP N\PKHYL L \ZHYL THJJOPUL *PV UVUVZ[HU[L ZPH W\YL PU JHZP TVS[V YHYP u WVZZPIPSL S»PUZVYNLUaH KP JHWVNPYP L V ]LY[PNPUL +P JP~ KV]Yn [LULYL JVU[V JOP ZP HJJPUNL HSSH N\PKH
,TV[[PZP 3»PUHSHaPVUL KP ZVS\aPVUP ULI\SPaaH[L W\~ PUK\YYL PS YPÅLZZV KLSSH [VZZL 3»\ZV KP [VIYHTPJPUH PUHSH[VYPH ULP WHaPLU[P HMML[[P KH LTV[[PZP NYH]L PU H[[V u JVUZLU[P[V ZVSHTLU[L ZL P ILULÄJP JVUULZZP HS [YH[[HTLU[V ZVUV JVUZPKLYH[P Z\WLYPVYP HP YPZJOP KP PUK\YYL \S[LYPVYL LTVYYHNPH
*VU )9(40;6)! 0UMLaPVUP L PUMLZ[HaPVUP 5VU JVT\UL! JHUKPKVZP VYHSL (S[LYHaPVUP KLSS»HWWHYH[V \KP[P]V L ]LZ[PIVSHYL 5VU JVT\UL! ]LY[PNPUP PWVHJ\ZPH (S[LYHaPVUP KLSS»HWWHYH [V YLZWPYH[VYPV KLS [VYHJL L KLS TLKPHZ[PUV *VT\UL! KPZWULH [VZZL YHU[VSP H\TLU[H[H LZWL[[VYHaPVUL YH\JLKPUL HS[LYHaPVUP KLSSH ]VJL 5VU JVT\UL! YPK\aPVUL KLS -,= (S[LYHaPVUP KLSS»HWWHYH[V NHZ[YVPU[LZ[PUHSL *VT\UL! UH\ ZLH 5VU JVT\UL! PWLYZLJYLaPVUL ZHSP]HYL NSVZZP[L (S[LYHaPVUP KLSSH J\[L L KLS [LZZ\[V ZV[[VJ\[HULV 5VU JVT\UL! YHZO 0UKHNPUP KPHNUVZ[PJOL 5VU JVT\UL! H\TLU[V KLSSL [YHUZHTPUHZP
9LZPZ[LUaH TPJYVIPJH 5LNSP Z[\KP JSPUPJP PU HSJ\UP WHaPLU[P [YH[[H[P WLY ]PH PUHSH[VYPH JVU )9(40;6) u Z[H[V VZZLY]H[V \U H\TLU[V KLSSL *VUJLU[YHaPVUP 4PUPTL 0UPIP[VYPL 40*Z KP HTPUVNSPJVZPKP WLY PZVSH[P KP 7 HLY\NPUVZH [LZ[H[P ,ZPZ[L \U YPZJOPV [LVYPJV JOL P WHaPLU[P PU [YH[[HTLU[V JVU [VIYHTPJPUH ULI\SPaaH[H WVZZHUV Z]PS\WWHYL PZVSH[P KP 7 HLY\NPUVZH YLZPZ[LU[P HSSH [VIYHTPJPUH WLY ]PH LUKV]LUVZH 0U[LYHaPVUP JVU HS[YP TLKPJPUHSP LK HS[YL MVYTL KP PU[LYHaPVUL 5LSS»HTIP[V KLNSP Z[\KP JSPUPJP P WHaPLU[P JOL OHUUV HZZ\U[V [VIYHTPJPUH WLY ]PH PUHSH[VYPH JVU[LTWVYHULHTLU[L H T\JVSP[PJP HNVUPZ[P JVY[PJVZ[LYVPKP WLY ]PH PUHSH[VYPH LK HS[YP HU[PIPV[PJP HU[PWZL\KVTVUHZ VYHSP V WHYLU[LYHSP OHUUV TVZ[YH[V L]LU[P H]]LYZP ZPTPSP H X\LSSP KLS NY\WWV KP JVU[YVSSV UVU [YH[[H[V JVU [VIYHTPJPUH 3»\ZV JVUJVTP[HU[L L V ZLX\LUaPHSL KP [VIYHTPJPUH WLY ]PH PUHSH[VYPH JVU HS[YP TLKPJPUHSP WV[LUaPHSTLU[L ULMYV[VZZPJP V V[V[VZZPJP KL]L LZZLYL L]P[H[V (SJ\UP KP\YL[PJP WVZZVUV H\TLU[HYL SH [VZZPJP[n KLNSP HTPUVNSPJVZPKP HS[LYHUKV SL JVU JLU[YHaPVUP KLSS»HU[PIPV[PJV ULS ZPLYV L ULP [LZZ\[P ;VIYHTPJPUH WLY ]PH PUHSH[VYPH UVU KL]L LZZLYL ZVTTPUPZ[YH[H JVU[LTWVYHULHTLU[L HK HJPKV L[HJYPUPJV M\YV ZLTPKL \YLH V THUUP[VSV (S[YP TLKPJPUHSP JOL OHUUV KPTVZ[YH[V KP H\TLU[HYL SH WV[LUaPHSL [VZZPJP[n KLNSP HTPUVNSPJVZPKP ZVTTPUPZ[YH[P WLY ]PH WHYLU[LYHSL ZVUV! HTMV[LYPJPUH ) JLMHSV[PUH JPJSVZWVYPUH [HJYVSPT\Z WVSPTP_PUH YPZJOPV KP H\TLU [H[H ULMYV[VZZPJP[n " JVTWVZ[P KLS WSH[PUV YPZJOPV KP H\TLU[H[H ULMYV[VZZPJP[n L V[V[VZZPJP[n " HU[PJVSPULZ[LYHZPJP [VZZPUH IV[\SPUPJH LMML[[P UL\YVT\ZJVSHYP .YH]PKHUaH LK HSSH[[HTLU[V )9(40;6) UVU KL]L LZZLYL \[PSPaaH[V PU JVYZV KP NYH]PKHUaH L HSSH[[HTLU[V H TLUV JOL P ILULÄJP WLY SH THKYL UVU ZPHUV Z\WLYPVYP HP YPZJOP WLY PS ML[V V PS ULVUH[V .YH]PKHUaH 5VU LZPZ[VUV HKLN\H[P KH[P Z\SS»\ZV KP [VIYHTPJPUH ZVTTPUPZ[YH[H [YHTP[L PUH SHaPVUL H KVUUL NYH]PKL :[\KP Z\ HUPTHSP UVU PUKPJHUV \U LMML[[V [LYH[VNLUV KLSSH [VIYHTPJPUH ]LKP WHYHNYHMV ¸+H[P WYLJSPUPJP KP ZPJ\YLaaH¹ ;\[[H]PH NSP HTPUVNSPJVZPKP WVZZVUV JH\ZHYL KHUUP HS ML[V WLY LZLTWPV ZVYKP[n JVUNLUP[H X\HUKV HS[L JVUJLU[YHaPVUP ZPZ[LTPJOL ]LUNVUV YHNNP\U[L PU \UH KVUUH NYH ]PKH :L )9(40;6) ]PLUL \ZH[V ULS JVYZV KLSSH NYH]PKHUaH V ZL SH WHaPLU[L YPTHUL PUJPU[H ULS JVYZV KLSSH [LYHWPH JVU )9(40;6) u ULJLZZHYPV PUMVYTHYSH KLS YPZJOPV WV[LUaPHSL WLY PS ML[V (SSH[[HTLU[V 3H [VIYHTPJPUH ZVTTPUPZ[YH[H WLY ]PH ZPZ[LTPJH ]PLUL LZJYL[H ULS SH[[L TH[LY UV 5VU ZP u H JVUVZJLUaH ZL SH ZVTTPUPZ[YHaPVUL KP [VIYHTPJPUH WLY ]PH PUHSH [VYPH KL[LYTPUP JVUJLU[YHaPVUP ULS ZPLYV Z\MÄJPLU[LTLU[L LSL]H[L KH JVUZLU[PYL SH YPSL]HaPVUL KLSSH [VIYHTPJPUH ULS SH[[L TH[LYUV ( JH\ZH KLS WLYPJVSV WV[LU aPHSL KP V[V[VZZPJP[n L ULMYV[VZZPJP[n JVUULZZV HSS»HZZ\UaPVUL KLSSH [VIYHTPJPUH KH WHY[L KLP IHTIPUP u ULJLZZHYPV KLJPKLYL ZL PU[LYYVTWLYL S»HSSH[[HTLU[V V SH [LYHWPH JVU )9(40;6)
,MML[[P PUKLZPKLYH[P 5LNSP Z[\KP JSPUPJP JVU[YVSSH[P ZVUV Z[H[P ZLNUHSH[P L]LU[P H]]LYZP UVU ULJLZ ZHYPHTLU[L JVYYLSH[P HS [YH[[HTLU[V PU \UH WLYJLU[\HSL KP JHZP [YH[[H[P JVU )9(40;6) UVU Z\WLYPVYL H X\LSSH VZZLY]H[H ULP JHZP [YH[[H[P JVU WSHJLIV .SP L]LU[P WP MYLX\LU[P ZVUV Z[H[P X\LSSP YLSH[P]P HS ZPZ[LTH YLZWPYH[VYPV [VZZL YHU[VSP KPZWULH H\TLU[H[H LZWL[[VYHaPVUL YPK\aPVUL KLS -,= :\SSH [V[HSP[n KLNSP L]LU[P u Z[H[V KH[V \U NP\KPaPV KP JVYYLSHaPVUL WVZP[P]H JVU PS [YH[[HTLU[V YLHaPVUP H]]LYZL ULS KLP JHZP JVU )9(40;6) L ULS KLP JHZP JVU WSHJLIV 3L YLHaPVUP H]]LYZL ZLNUHSH[L JVU )9(40;6) L JVU WSHJLIV ULSSH ZWLYPTLU[HaPVUL JSPUPJH ZVUV YPWVY[H[L KP ZLN\P[V 3L YLHaPVUP H]]LYZL ZVUV JSHZZPÄJH[L PU! JVT\UP % # " UVU JVT\UP % # " YHYL % # " TVS[V YHYL #
*VU 7SHJLIV! 0UMLaPVUP L PUMLZ[HaPVUP *VT\UL! JHUKPKVZP VYHSL 5VU JVT\UL! IYVUJOP[L (S[LYHaPVUP KLS ZPZ[LTH ULY]VZV *VT\UL! JLMHSLH (S[LYHaPVUP JHYKPHJOL 5VU JVT\UL! [HJOPJHYKPH (S[LYHaPVUP KLSS»HWWHYH[V YLZWPYH[VYPV KLS [VYHJL L KLS TLKPHZ[PUV *VT\UL! KPZWULH [VZZL YHU[VSP H\TLU[H[H LZWL[[VYHaPVUL 5VU JVT\UL! YPK\aPVUL KLS -,= YH\JLKPUL (S[LYHaPVUP KLSS»HWWHYH[V NHZ[YVPU [LZ[PUHSL *VT\UL! UH\ZLH PWLYZLJYLaPVUL ZHSP]HYL ]VTP[V 5VU JVT\UL! KPHYYLH +PZVYKPUP NLULYHSP L HS[LYHaPVUP KLS ZP[V KP ZVTTPUPZ[YHaPVUL 5VU JV T\UL! KVSVYL HS [VYHJL 0UKHNPUP KPHNUVZ[PJOL 5VU JVT\UL! H\TLU[V KLSSL [YHUZHTPUHZP .SP LZHTP KP SHIVYH[VYPV LK P [LZ[ H\KPVTL[YPJP LMML[[\H[P HS ÄUL KP ]HS\[HYL WVZZPIPSP ZLNUP L ZPU[VTP KP ULMYV[VZZPJP[n V V[V[VZZPJP[n UVU OHUUV L]PKLUaPH[V KPMMLYLUaL JSPUPJHTLU[L ZPNUPÄJH[P]L [YH )9(40;6) L WSHJLIV Ï UV[V JOL S»\[PSPaaV PU [LYHWPH KP [VIYHTPJPUH WLY ]PH PUHSH[VYPH W\~ KL[LYTPUHYL SH JVTWHYZH KLSSL ZLN\LU[P YLHaPVUP H]]LYZL! 0UMLaPVUP L PUMLZ[HaPVUP 4VS[V YHYH! PUMLaPVUL TPJV[PJH JHUKPKVZP VYHSL (S[LYHaPVUP KLS ZHUN\L L ZPZ[LTH SPUMH[P JV 4VS[V YHYH! SPUMVHKLUVWH[PH (S[LYHaPVUP KLS TL[HIVSPZTV L KLSSH U\[YPaPVUL 9HYH! HUVYLZZPH (S[LYHaPVUP KLS ZPZ[LTH ULY]VZV 9HYH! JHWVNPYP LTPJYHUPH 4VS[V YHYH! ZVUUVSLUaH (S[LYHaPVUP KLSS»HWWHYH[V \KP[P]V L ]LZ[PIVSHYL 9HYH! [PUUP[V WLYKP[H KLSS»\KP[V 4VS[V YHYH! KPZ[\YIP KLSS»VYLJJOPV KVSVYL HSS»VYLJ JOPV (S[LYHaPVUP KLSS»HWWHYH[V YLZWPYH[VYPV KLS [VYHJL L KLS TLKPHZ[PUV 5VU JVT\UL! HS[LYHaPVUL KLSSH ]VJL KPZWULH H\TLU[V KLSSH [VZZL MHYPUNP[L 9HYH! IYVUJVZWHZTV KPZ[\YIP WVSTVUHYP H\TLU[V KLSS»LZJYLH[V LTV[[PZP YPKV[[H M\UaPVUHSP[n WVSTVUHYL SHYPUNP[L LWPZ[HZZP YPUP[L HZTH 4VS[V YHYH! PWLY]LU[P SHaPVUL PWVZZPH ZPU\ZP[L (S[LYHaPVUP KLSS»HWWHYH[V NHZ[YVPU[LZ[PUHSL 9HYH! UH\ ZLH \SJLYHaPVUP HSSH IVJJH ]VTP[V WLY]LYZPVUL KLS N\Z[V 4VS[V YHYH! KPHYYLH (S[LYHaPVUP KLSSH J\[L L KLS [LZZ\[V ZV[[VJ\[HULV 9HYH! LY\aPVUP J\[HULL (S [LYHaPVUP KLSS»HWWHYH[V T\ZJVSVZJOLSL[YPJV L [LZZ\[V JVUUL[[P]V 4VS[V YHYH! KVSVYL HSSH ZJOPLUH +PZVYKPUP NLULYHSP L HS[LYHaPVUP KLS ZP[V KP ZVTTPUPZ[YHaPVUL 9HYH! KVSVYL [VYHJPJV HZ[LUPH MLIIYL KVSVYL 4VS[V YHYH! KVSVYL HKKVTPUHSL THSLZZLYL .SP HTPUVNSPJVZPKP WLY ]PH WHYLU[LYHSL ZVUV Z[H[P HZZVJPH[P HK PWLY ZLUZPIPSP[n V[V[VZZPJP[n L ULMYV[VZZPJP[n ]LKP WHYHNYHÄ ¸*VU[YVPUKPJHaPVUP¹L :WLJPHSP H]]LY[LUaL L VWWVY[\UL WYLJH\aPVUP K»PTWPLNV¹
:V]YHKVZHNNPV 7LY ZVTTPUPZ[YHaPVUL PUHSH[VYPH SH [VIYHTPJPUH OH \UH YPKV[[H IPVKPZWVUPIPSP [n ZPZ[LTPJH 0 ZPU[VTP KH ZV]YHKVZHNNPV KP HLYVZVS WVZZVUV JVTWYLUKLYL NYH]L YH\JLKPUL 0U JHZV KP PUNLZ[PVUL HJJPKLU[HSL KP )9(40;6) SH [VZZPJP[n u PTWYVIHIPSL WVPJOu SH [VIYHTPJPUH ]PLUL ZJHYZHTLU[L HZZVYIP[H KHS [YH[ [V NHZ[YVPU[LZ[PUHSL PU[LNYV 0U JHZV KP ZVTTPUPZ[YHaPVUL WLY LYYVYL KP )9( 40;6) WLY ]PH LUKV]LUVZH u WVZZPIPSL JOL ZP WYLZLU[PUV ZLNUP L ZPU[VTP KP \U ZV]YHKVZHNNPV KP [VIYHTPJPUH WHYLU[LYHSL JOL JVTWYLUKVUV JHWVNPYP
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 15
7YVWYPL[n NLULYHSP 3H [VIYHTPJPUH u \U HU[PIPV[PJV HTPUVNSPJVZPKPJV WYVKV[[V KHSSV :[YLW[VT` JLZ [LULIYHYP\Z 3H ZVZ[HUaH HNPZJL WYPUJPWHSTLU[L PU[LYMLYLUKV JVU SH ZPU[LZP KLSSL WYV[LPUL JH\ZHUKV JVZy S»HS[LYHaPVUL KLSSH WLYTLHIPSP[n KLSSH TLTIYHUH JLSS\SHYL SH WYVNYLZZP]H KPZNYLNHaPVUL KLSS»PU]VS\JYV JLSS\SHYL LK PUÄUL SH TVY[L KLSSH JLSS\SH 3H [VIYHTPJPUH Z]VSNL \U»HaPVUL IH[[LYPJPKH H JVUJLU[YHaPVUP WHYP V SLNNLYTLU[L Z\WLYPVYP YPZWL[[V H X\LSSL JOL Z]VSNVUV \U»HaPVUL PUPIP[VYPH 3H [VIYHTPJPUH u H[[P]H WYPUJPWHSTLU[L ULP JVUMYVU[P KLP IHJPSSP HLYVIP NYHT ULNH[P]P TLU[YL OH ZJHYZH H[[P]P[n Z\P TPJYVYNHUPZTP HUHLYVIP L Z\SSH THNNPVY WHY[L KLP IH[[LYP NYHT WVZP[P]P 3H [VIYHTPJPUH u WP H[[P]H KLSSH NLU[HTPJPUH Z\SSV 7ZL\KVTVUHZ HLY\NPUVZH L Z\ HSJ\UP JLWWP KP 7YV[L\Z" JPYJH PS KLP JLWWP KP 7ZL\KVTVUHZ HLY\NPUVZH JOL ZVUV YLZPZ[LU[P HSSH NLU[HTPJPUH YP THUNVUV ZLUZPIPSP HSSH [VIYHTPJPUH 3H [VIYHTPJPUH u YPZ\S[H[H LMÄJHJL ULSS»LYH KPJHYL SV 7ZL\KVTVUHZ HLY\NPUVZH HUJOL WLY ZVTTPUPZ[YHaPVUL SVJHSL WLY HLYVZVS L WLY PUZ[PSSHaPVUL PU[YH[YHJOLHSL PU TVKLSSP ZWLYPTLU[HSP KP WVSTVUP[L ULSSH JH]PH L KP PUMLaPVUL WVSTVUHYL JYVUPJH ULS YH[[V 7LY ZVTTPUPZ[YHaPV UL HLYVZVSPJH HSS»\VTV P ]HSVYP KP 40* KLSSH [VIYHTPJPUH ZVUV UV[L]VSTLU[L Z\WLYPVYP H X\LSSP UV[P WLY ZVTTPUPZ[YHaPVUL WHYLU[LYHSL H JH\ZH KLSS»LMML[[V PUPIP[VYPV SVJHSL LZLYJP[H[V KHSS»LZJYLH[V KP WHaPLU[P HMML[[P KH ÄIYVZP JPZ[PJH ULP JVUMYVU[P KLSS»H[[P]P[n IPVSVNPJH KLSS»HU[PIPV[PJV HTPUVNSPJVZPKPJV ZVTTPUPZ[YH[V WLY ULI\SPaaHaPVUL ;\[[H]PH ULNSP Z[\KP JVU[YVSSH[P LMML[[\H[P JVU )9(40;6) SL JVUJLU[YHaPVUP KP [VIYHTPJPUH YHNNP\U[L ULSS»LZJYLH[V ZVUV YPZ\S[H[L HKL N\H[L WLY KL[LYTPUHYL S»LYHKPJHaPVUL KLSSV 7ZL\KVTVUHZ HLY\NPUVZH ULS L VS[YL KLP WHaPLU[P [YH[[H[P 7YVWYPL[n MHYTHJVJPUL[PJOL 7LY ]PH WHYLU[LYHSL u ULJLZZHYPV ZVTTPUPZ[YHYL KVZP LSL]H[L KP [VIYHTPJPUH HMÄUJOu ZP YHNNP\UNHUV ULSS»LZJYLH[V JVUJLU[YHaPVUP PUPIP[VYPL Z\SSV 7ZL\KV TVUHZ HLY\NPUVZH JVU PS YPZJOPV KP YLHaPVUP H]]LYZL ZPZ[LTPJOL 7LY ]PH PUHSH [VYPH u WVZZPIPSL PU]LJL ZVTTPUPZ[YHYL JVUJLU[YHaPVUP HKLN\H[L KP [VIYHTPJPUH KPYL[[HTLU[L H SP]LSSV LUKVIYVUJOPHSL YPK\JLUKV S»LZWVZPaPVUL ZPZ[LTPJH L KP JVUZLN\LUaH PS YPZJOPV KP V[V[VZZPJP[n L ULMYV[VZZPJP[n 7LY ZVTTPUPZ[YHaPVUL PUHSH[VYPH KP TN KP )9(40;6) H WHaPLU[P JVU ÄIYVZP JPZ[PJH ZP YHNNP\U NL ULSS»LZJYLH[V \UH JVUJLU[YHaPVUL THZZPTH KP TJN N KVWV JPYJH TPU\[P TLU[YL ULS WSHZTH ZP YHNNP\UNL \UH JVUJLU[YHaPVUL THZZPTH WHYP H UN TS KVWV JPYJH VYL" P SP]LSSP WSHZTH[PJP ZP YPK\JVUV JVU HUKHTLU[V TVUVLZWVULUaPHSL JVU \UH LTP]P[H KP LSPTPUHaPVUL [LYTPUHSL KP VYL 3»LSP TPUHaPVUL KLSSH X\V[H HZZVYIP[H PU JPYJVSV H]]PLUL WLY ÄS[YHaPVUL NSVTLY\SHYL +H[P WYLJSPUPJP KP ZPJ\YLaaH .SP Z[\KP WYLJSPUPJP OHUUV KPTVZ[YH[V JOL SH ZVTTPUPZ[YHaPVUL KP [VIYHTPJPUH WLY ]PH ZPZ[LTPJH u JVYYLSH[H H ZLNUP L ZPU[VTP KP ULMYV[VZZPJP[n LK V[V[VZZPJP[n 5LNSP Z[\KP KP [VZZPJP[n WLY KVZL YPWL[\[H NSP VYNHUP ILYZHNSPV ZVUV P YLUP L SL M\UaPVUP ]LZ[PIVSHYP JVJSLHYP 0U NLULYHSL SH [VZZPJP[n ZP ]LKL H SP]LSSP ZPZ[LTPJP KP [VIYHTPJPUH WP LSL]H[P YPZWL[[V H X\LSSP YHNNP\UNPIPSP HSSL KVZP \[PSPaaH[L PU [LYHWPH WLY ]PH PUHSH[VYPH 0U Z[\KP WYLJSPUPJP SH ZVTTPUPZ[YHaPVUL WYVS\UNH[H KP [VIYHTPJPUH WLY ]PH PUHSH[VYPH OH KL[LYTPUH[V TVKLZ[P ZLNUP KP PYYP[HaPVUL H SP]LSSV KLS [YH[[V YLZWPYH[VYPV UVU ZWLJPÄJP L JVTWSL[HTLU[L YL]LYZPIPSP L ZLNUP KP [VZZPJP[n YLUHSL YL]LYZPIPSP HSSH ZVZWLUZPVUL KLS [YH[[HTLU[V L]PKLU[P HSSL KVZP WP HS[L 5VU ZVUV Z[H[P LMML[[\H[P Z[\KP KP [VZZPJVSVNPH YPWYVK\[[P]H JVU [VIYHTPJPUH ZVTTPUPZ[YH[H WLY ]PH PUHSH[VYPH TH SH ZVTTPUPZ[YHaPVUL ZV[[VJ\ [L K\YHU[L S»VYNHUVNLULZP L ULSSH WYPTH MHZL KLSSV Z]PS\WWV ML[HSL KP KVZP ÄUV H TN 2N KPL ULS YH[[V UVU ZP u YP]LSH[H [LYH[VNLUH 5LS JVUPNSPV KVZP KP TN 2N Z J OHUUV WYV]VJH[V [VZZPJP[n TH[LYUH L HIVY[P TH ZLUaH L]P KLUaH KP LMML[[P [LYH[VNLUP ;LULUKV JVU[V KLP KH[P KPZWVUPIPSP Z\NSP HUPTHSP UVU ZP W\~ LZJS\KLYL \U YPZJOPV KP [VZZPJP[n V[V[VZZPJP[n H SP]LSSP KP LZWVZPaPVUL WYL UH[HSL 0U KP]LYZP [LZ[ PU ]P[YV L PU ]P]V SH [VIYHTPJPUH UVU u YPZ\S[H[H T\[HNLUH
0UJVTWH[PIPSP[n )9(40;6) UVU KL]L LZZLYL KPS\P[V V TPZJLSH[V ULS ULI\SPaaH[VYL JVU ULZ Z\U HS[YV TLKPJPUHSL 7LYPVKV KP ]HSPKP[n HUUP 0S JVU[LU\[V KLSS»PU[LYV JVU[LUP[VYL TVUVKVZL ]H \[PSPaaH[V PTTL KPH[HTLU[L KVWV SH Z\H HWLY[\YH ]LKP WHYHNYHMV ¸0Z[Y\aPVUP WLY S»\ZV¹ 0S WLYPVKV KP ]HSPKP[n PUKPJH[V ZP YPMLYPZJL HS WYVKV[[V PU JVUMLaPVUHTLU[V PU[L NYV JVYYL[[HTLU[L JVUZLY]H[V :WLJPHSP WYLJH\aPVUP WLY SH JVUZLY]HaPVUL *VUZLY]HYL [YH L * PU MYPNVYPMLYV *VUZLY]HYL ULS JVU[LUP[VYL VYPNP UHSL <UH ]VS[H [VS[L KHS MYPNVYPMLYV SL I\Z[L JVU[LULU[P )9(40;6) WVZZVUV LZZLYL JVUZLY]H[L PU[H[[L V HWLY[L ÄUV H * WLY \U WLYPVKV THZZPTV KP TLZP 3H ZVS\aPVUL KLS JVU[LUP[VYL TVUVKVZL KP )9(40;6) u UVYTHSTLU[L KP JVSVYL KH SPL]LTLU[L NPHSSV H NPHSSV" ZP WV[YLIILYV VZZLY]HYL HSJ\UL ]HYPH aPVUP KP JVSVYL JOL UVU PUKPJHUV \UH WLYKP[H KP H[[P]P[n KLS TLKPJPUHSL ZL SV Z[LZZV u JVUZLY]H[V PU TVKV JVYYL[[V 5H[\YH L JVU[LU\[V KLS JVU[LUP[VYL )9(40;6) ]PLUL MVYUP[V PU JVU[LUP[VYP TVUVKVZL KH TS KP WVSPL[PSLUL PU I\Z[L ZPNPSSH[L JVU[LULU[P JPHZJ\UH JVU[LUP[VYP TVUVKVZL (Z[\JJP KH L JVU[LUP[VYP TVUVKVZL Ï WVZZPIPSL JOL UVU [\[[L SL JVUMLaPVUP ZPHUV JVTTLYJPHSPaaH[L 0Z[Y\aPVUP WLY S»\ZV =LKP WHY ¸7VZVSVNPH L TVKV KP ZVTTPUPZ[YHaPVUL¹
;0;63(9, +,33»(<;690AA(A065, (33»0440::065, 05 *644,9*06 */0,:0 -(94(*,<;0*0 : W ( =PH 7HSLYTV ( 7(94( 5<4,96 +,33, (<;690AA(A0650 (33»0440::065, 05 *644,9*06 JVU[LUP[VYP TVUVKVZL! JVU[LUP[VYP TVUVKVZL! JVU[LUP[VYP TVUVKVZL! +(;( +,33( 7904( (<;690AA(A065, 4HYaV +(;( +0 9,=0:065, +,3 ;,:;6 4HYaV ;(),33( +0 (77(9;,5,5A( +79 5VU ZVNNL[[V 9,.04, +0 +0:7,5:(A065, (3 7<))30*6 4,+0*05(3, :6..,;;6 ( 79,:*90A065, 4,+0*( 3040;(;0=( +( 90556=(9, =63;( 7,9 =63;( =,5+0)03, (3 7<))30*6 :< 79,:*90 A065, +0 *,5;90 6:7,+(30,90 6 +0 :7,*0(30:;0 05;,950:;0 :7,*0( 30:;0 4(3(;;0, 05-,;;0=, 75,<4636.0 7,+0(;90
Cod. 903893
7YVWYPL[n MHYTHJVKPUHTPJOL *VKPJL (;*! 1 .)
,SLUJV KLNSP LJJPWPLU[P *SVY\YV KP ZVKPV HJX\H WLY WYLWHYHaPVUP PUPL[[HIPSP HJPKV ZVSMVYPJV L PKYVZZP KV KP ZVKPV WLY HNNP\Z[HYL PS W/
Materiale ad esclusivo uso della Classe Medica
796790,;± -(94(*636.0*/,
05-694(A0650 -(94(*,<;0*/,
Dep. AIFA in data 15/06/2010
[PUUP[V ]LY[PNPUP WLYKP[H KP JHWHJP[n \KP[P]H KPMÄJVS[n YLZWPYH[VYPH L V ISVJJV UL\YVT\ZJVSHYL L KHUUV YLUHSL 3H [VZZPJP[n HJ\[H ]H [YH[[H[H PU[LYYVTWLUKV PTTLKPH[HTLU[L SH ZVTTPUPZ[YHaPVUL KP )9(40;6) LK LZLN\LUKV LZHTP KP M\UaPVUHSP[n YLUHSL 3L JVUJLU[YHaPVUP KP [VIYHTPJPUH ULS ZPLYV WVZZVUV LZZLYL \[PSP WLY JVU[YVSSHYL PS ZV]YHKVZHNNPV 0U X\HSZPHZP JHZV KP ZV]YHKVZHNNPV ]H JVUZPKLYH[H SH WVZZPIPSP[n KP PU[LYHaPVUP [YH MHYTHJP JVU HS[LYHaPVUP KLSSH LSPTP UHaPVUL KP )9(40;6) V KP HS[YP TLKPJPUHSP
Dep. AIFA in data 22/02/2011
cod. 904037
Progetto1_Layout 1 23/02/11 11.14 Pagina 16