FC Strumenti ed Evidenze - n°1 Marzo 2009 by Sinergie Edizioni Scientifiche

TRIMESTRALE SCIENTIFICO

Anno III - n. 1, Marzo 2009

Farmaci per guarire Guest Editor Luis Galietta Laboratorio di Genetica Molecolare Istituto Giannina Gaslini Genova

IL PROBLEMA Dopo il forte rallentamento subito dai programmi di terapia genica verso la fine degli anni 1990, vi è stata una ripresa di interesse per nuove possibilità di trattamento farmacologico del difetto di base nella fibrosi cistica. Questo è stato facilitato dalla comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nella malattia che possono essere diversi a seconda delle mutazioni e da nuove ipotesi sulle vie metaboliche implicate nella patogenesi del danno. In pochi anni, il panorama è molto cambiato e ora si stanno conducendo studi clinici di fase IIb e III, visti i promettenti risultati sia di ricerche sperimentali che di studi di fase IIa. Potrebbe aprirsi, in poco tempo, una nuova prospettiva di correzione del danno di base e quindi di arresto della progressione della malattia o di recupero funzionale. Le difficoltà non sono poche. Per condurre studi clinici significativi sono necessarie casistiche sufficientemente ampie, dell’ordine di alcune centinaia di pazienti con caratteristiche genetiche e cliniche omogenee. Per raggiungere queste dimensioni di reclutamento bisogna poter contare sull’apporto di numerosi centri e sulla standardizzazione delle metodiche di rilevazione degli effetti biologici e clinici. Obiettivo di questo numero è di prendere in esame le molecole che sono già in fase clinica e alcune molecole già in uso clinico per altre patologie per le quali si prospetta un possibile uso per la cura della fibrosi cistica. Per queste ultime, la via all’uso terapeutico in fibrosi cistica potrebbe essere breve perché vi sono già numerosi dati per quanto ne riguarda la tollerabilità e si tratterebbe “solo” di un allargamento dell’indicazione.

Pubblicazione con l’egida della Sinergie Edizioni Scientifiche S.r.l. Luis Galietta Laboratorio di Genetica Molecolare Istituto Giannina Gaslini Genova

Anno III, N. 1 - Marzo 2009 Periodico trimestrale a carattere scientifico Registrazione Tribunale di Milano n. 341 del 28/05/2007

Sinergie Edizioni Scientifiche S.r.l. Galli Thierry Stampa S.r.l. Via Caviglia, 3 - 20139 Milano

SINERGIE Edizioni Scientifiche S.r.l. Sede legale: Corso Italia, 1 - 20122 Milano Sede operativa: Via la Spezia, 1 - 20143 Milano Tel./Fax 02 58118054 E-mail: sinergie.milano@virgilio.it

Mauro Rissa

3 Sviluppo e storia della molecola PTC124 4 Lo sviluppo di PTC124 6 VX-770 9 Denufosol

FC Strumenti ed evidenze è una rivista monografica, trimestrale, dedicata al mondo della fibrosi cistica. Essa si prefigge di trattare argomenti solitamente “meno battuti” dal mondo medico e di offrire, quindi, un contributo originale a chi si occupa della cura dei pazienti o dell’organizzazione dell’assistenza. FC Strumenti ed evidenze si propone quindi come strumento per la ricerca clinica e per la valutazione dei sistemi assistenziali della fibrosi cistica. La rivista contiene articoli elaborati internamente dalla redazione con il contributo di esperti del settore, a livello nazionale ed internazionale. Ogni numero viene curato da un Guest editor che ne garantisce la validità scientifica e la completezza. L’editore sarà lieto di accogliere proposte ed eventuali contributi per la redazione di numeri monografici che verranno valutati dalla redazione. Sono anche accettati contributi di esperti che vogliano proporsi come Guest editor di una monografia. Le proposte possono essere inviate a sinergie.milano@virgilio.it Finito di stampare nel mese di Febbraio 2009

Anno III - n. 1, 2009

Sviluppo e stori dell olecol PTC124 Le mutazioni nonsenso (classe I) inseriscono codoni di stop prematuri (UAA, UAG o UGA) nella regione codificante dell’RNA che codifica per la proteina CFTR. Di conseguenza tali mutazioni provocano l’interruzione prematura della traduzione proteica e la produzione di una proteina CFTR tronca. In effetti, le mutazioni nonsenso provocano un danno ulteriore che è costituito dalla destabilizzazione dell’RNA messaggero di CFTR attraverso il meccanismo cosiddetto di “nonsense-mediated mRNA decay” (NMD). Questo meccanismo dipende da una serie di fattori che modulano sia la stabilità del trascritto che l’efficienza dell’interruzione della traduzione. La correzione farmacologica delle mutazioni nonsenso deve quindi non solo prevedere la “lettura” del codone di stop ma prendere in considerazione i fattori che provocano il fenomeno del NMD. Infatti l’inattivazione di questi fattori potrebbe stabilizzare l’RNA messaggero “nonsense” permettendo l’azione di un farmaco opportuno che permetterebbe il superamento del codone di stop. Il risultato finale sarebbe la produzione di quantità significative di proteina CFTR funzionante. La prima dimostrazione che le mutazioni nonsenso sono correggibili farmacologicamente è stata la scoperta che elevate concentrazioni di aminoglicosidi, come la gentamicina, permettono di aumentare la lettura di codoni di stop prematuri nelle cellule di mammifero e in modelli animali di malattie provocate da mutazioni nonsenso. Il trattamento con gentamicina di topi mdx, modello di distrofia muscolare di Duchenne (DMD), e di topi appartenenti a un modello murino di fibrosi cistica hanno permesso lo sviluppo di una serie di farmaci con possibili applicazioni in campo umano. Sono, infatti, stati pubblicati dati che mostrano come il trattamento di pazienti con fibrosi cistica e DMD con farmaci che aumentano la lettura di mRNA nonsenso portino alla sintesi di proteina matura. I primi farmaci usati sono stati gli aminoglicosidi, la

cui efficienza è, però, scarsa. Essi presentano, poi, vari inconvenienti: non sono somministrabili per via orale e non raggiungono significative concentrazioni sistemiche. Sono inoltre oto e nefrotossici il che li rende scarsamente utilizzabili per trattamenti prolungati. Ma i primi, parziali, successi hanno costituito una dimostrazione di principio che ha indotto la ricerca a proseguire verso la scoperta di farmaci più potenti, meglio tollerati e con migliori caratteristiche farmacocinetiche.

La storia della gentamicina è ormai lunga: Howard et al. hanno dimostrato, nel 1996, che due mutazioni di stop della CFTR potevano essere soppresse trattando le cellule con basse dosi di aminoglicosidi. Bedwell et al. hanno dimostrato che l’incubazione con aminoglicosidi di cellule epiteliali bronchiali della linea IB3-1, che porta una mutazione di stop W1282X, aumenta l’attività della CFTR a livello della membrana cellulare. Zsembery et al. hanno infine isolato colangiociti di un paziente con mutazione G542X e hanno dimostrato che l’incubazione con gentamicina aumenta il trasporto di cloruro attivato da cAMP. Questi effetti sono stati dimostrati anche in una serie di altre malattie con mutazioni di stop come la DMD (Barton et al.), la sindrome di Hurler (Keeling et al.), la cistinosi (Helip et al.) e la lipofuscinosi (Sleat et al.). Wilschanski et al. hanno, infine, dimostrato che l’applicazione topica di gentamicina a livello della mucosa nasale aumenta il trasporto di cloruro in pazienti CF con almeno un allele W1282X. Inoltre, Clancy et al., in uno studio in aperto, hanno dimostrato che la somministrazione EV di gentamicina a 5 pazienti eterozigoti per mutazioni stop permetteva una maggiore iperpolarizzazione dei potenziali nasali dopo la somministrazione di isoproterenolo.

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Sermet-Gaudelus et al. condotto su pazienti trattati, per via endovenosa, con gentamicina alla dose di 10 mg/kg una volta al giorno e portatori di mutazioni frequenti nella popolazione francese (Y122X, G542X, R1162X, W1282X). Gli effetti sono stati più marcati nei pazienti con mutazione Y122X, in termini di espressione della proteina e di miglioramento dei potenziali nasali. In due casi vi è stato anche una normalizzazione del test del sudore. La conclusione è che gli aminoglicosidi abbiano una certa efficacia nella correzione degli effetti delle mutazioni nonsenso, ma che l’effetto dipenda dalla specifica mutazione.

Lo studio di riferimento sulla gentamicina nella fibrosi cistica è quello di Wilschanski et al., pubblicato nel 2003. Esso è stato condotto in doppio cieco su pazienti omozigoti per la mutazione F508del o per mutazioni stop. Il farmaco (gentamicina 0.3%) o il placebo sono stati somministrati in cross over in gocce intranasali tre volte al giorno per 14 giorni, ottenendo un significativo effetto sui potenziali nasali nei 19 pazienti con mutazioni stop in omo- o eterozigosi, ma non nei pazienti omozigoti per F508del. Questi risultati sono importanti, ma bisogna tener presente che gli effetti della gentamicina dipendono dal tipo di mutazione di stop. Lo dimostra lo studio di

Lo sviluppo di PTC124 Un programma di screening che ha comportato lo studio di 800.000 composti di basso peso molecolare ha portato all’identificazione di una serie di composti in grado di sopprimere il codone nonsenso UGA. Le caratteristiche molecolari di alcuni di questi composti sono poi state modificate chimicamente per migliorarne le caratteristiche arrivando all’identificazione della molecola PTC124 (acido 3-[5(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-yl]-benzoico; C15H9FN2O3) (Fig 1). Il composto non ha anaTibiale logie strutturali con gli aminoglicosidi verso i anteriore quali si è rivelato molto più potente.

Diaframma

N O N

CO2H

Cuore

Gli effetti di PTC124 sono stati studiati in un modello murino di DMD e sono riportati nella Figura 2. Questa ricerca è stata condotta in un modello murino portatore della mutazione CFTR-G542X e ha dimostra-

C57 controllo

Controllo mdx

Mdx 4 settimane di trattamento

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CFTR-NBD1 Serum PTC124 (15 mg/kg)

PTC124 (30 mg/kg)

PTC124 (60 mg/kg)

Gentamicin (34 mg/kg)

Untreated

PTC124 (0.9 mg/ml)

PTC124 (0.3 mg/ml)

(Da Du et al., 2008)

Pre-Immune Serum

CFTR-NBD1 Serum

to che il trattamento con PTC124 permette di ripristinare una significativa espressione e funzione del canale del cloruro. I risultati principali sono illustrati nelle Figure 3 e 4 e mostrano il confronto fra i risultati ottenuti con tre diverse dosi e vie di somministrazione di PTC124, con gentamicina e in controlli non trattati. Si tratta di uno studio di fase 1 condotto su 62 adulti sani volontari.

(Da Du et al., 2008)

PTC124 Ă¨ stato valutato in dosi da 3 a 200 mg/kg; le caratteristiche farmacocinetiche sono state valutate alla dose di 50 mg/kg dopo dose singola. In una seconda fase PTC124 Ă¨ stato somministrato in dosi multiple da 10 a 50 mg/kg/dose (bid) per 14 giorni. PTC124 Ă¨ stato ben tollerato fino alla dose di 100 mg/kg. A 150 e 200 mg/kg, il farmaco ha provocato lieve cefalea e sintomi gastrointestinali. A dosi ripetute fino a 50 mg/kg/dose bid, sono stati

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Trattamento fase 1

Trattamento fase 2

Differenza di potenziale nasale(mV)

10 5

Range tipico per pazienti con fibrosi cistica

0 -5 -10 Range normale -15 -20

Tempo (giorni)

osservati alcuni aumenti transitori delle transaminasi <2 volte il limite superiore della norma. Kerem et al. hanno pubblicato nel 2008 i risultati di uno studio di fase II condotto su adulti con fibrosi cistica portatori di almeno una mutazione nonsenso nel gene CFTR. I pazienti sono stati trattati per via orale per due cicli. Il primo alla dose di 16 mg/kg in tre dosi per 14 giorni, seguiti da 14 giorni senza trattamento. Nel secondo ciclo la dose di PTC124 è stata di 40 mg/kg. Sono stati misurati i potenziali nasali di 23 pazienti nel primo ciclo e di 21 nel secondo osservando un aumento significativo del trasporto di clo-

ruro con entrambe le dosi, ma maggiore con la dose più bassa. Il trasporto del cloruro è rientrato nei valori considerati normali in 13/23 pazienti nel primo ciclo e in 9/21 nel secondo. I risultati più significativi dello studio sono riportati nella Fig. 5.

Gli studi disponibili indicano che il PTC124 sia una farmaco molto promettente per il trattamento di pazienti CF con mutazioni stop. Il farmaco entra ora nella fase di sviluppo clinico avanzato.

VX-770 Alla conferenza nord-americana sulla fibrosi cistica tenutasi nell’ottobre 2008 sono stati presentati risultati clinici da tempo attesi di uno studio clinico di fase 2a effettuato con il farmaco sperimenta-

le chiamato VX-770. La Vertex, con il supporto finanziario della Cystic Fibrosis Foundation americana, partecipa all’identificazione di farmaci cosiddetti “correttori” e “potenziatori”, cioé di moleco-

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Livelli normali di CFTR in superficie

Difetto di gating basso flusso di cloruro

I potenziatori aumentano il gating di CFTR Aumentato flusso di cloruro

(Da Accurso NACFC, 2008)

le in grado di correggere difetti specifici causati da alcune classi di mutazioni del gene CFTR. I correttori sono molecole in grado di ripristinare la maturazione della proteina CFTR, alterata per esempio nel caso della mutazione F508del. I potenziatori sono molecole in grado di agire sulla proteina CFTR presente in membrana, stimolandone l’attività. I potenziatori (Fig. 6) sono particolarmente indicati per mutazioni appartenenti alla classe 3 come G551D in cui la mutazione riduce l’attività della proteina CFTR e quindi la sua capacità di trasportare cloruro. I risultati resi pubblici dalla Vertex riguardano proprio un potenziatore da loro sviluppato, il VX770. Inizialmente, il composto è stato somministrato per via orale a 20 pazienti portatori della mutazione G551D per 14 giorni a vari dosaggi. I risultati preliminari sono stati giudicati positivi dato che il farmaco ha provocato un miglioramento del test del sudore e dei potenziali nasali. L’obiettivo dello studio è stato la valutazione della tollerabilità di VX-770 a varie dosi e della sua efficacia in termini di miglioramento dei potenziali nasali, del sudore, di funzionalità respiratoria e della qualità di vita legata alle condizioni respiratorie. La prima parte dello studio è stata condotta in doppio cieco e confrontata con placebo su 10 pazienti con mutazione G551D. I pazienti sono stati trattati

con dosi di 25-150 mg ogni 12 ore o placebo. Nella seconda parte dello studio i pazienti sono stati suddivisi in tre gruppi e trattati con 150 o 250 mg di farmaco o placebo. Lo schema sperimentale è presentato nella figura 7. Lo studio coinvolgeva pazienti adulti con test del sudore positivo (Cl >60mEq/l) almeno una mutazione G551D e FEV1 ≥40%. La tollerabilità è stata buona e tutti i pazienti hanno completato lo studio. La figura riporta i risultati della misurazione dei potenziali nasali (fase 0 cloruro/isoproterenolo) e mostrano la risposta a tre diverse dosi nella prima parte dello studio e alle due diverse dosi nella seconda parte. Sono stati rilevati effetti significativi con le due dosi più elevate nella prima parte e con entrambe le dosi nella seconda (Fig. 8). La Figura 9 riporta gli effetti misurati sul test del sudore. Si può osservare come tutti i trattamenti hanno comportato un miglioramento del test e, in numerosi casi, la sua normalizzazione. Sebbene siano stati riportati effetti significativi sulla funzione respiratoria e sul miglioramento dei sintomi respiratori, lo studio sembra ancora troppo prematuro per parlare di un beneficio clinico confermato. Tuttavia, si può affermare che i dati siano di grande interesse e meritevoli di essere confermati in studi clinici più ampi. Come nel caso di PTC124, siamo di fronte a risultati che aprono una nuova strada nel trattamento della fibrosi cistica.

Anno III - n. 1, 2009

14 giorni Parte I, randomizzato, doppio cieco, controllato con placebo

Gruppo A 10 soggetti (Mutazione G551D)

7-22 giorni

14 giorni

N=4

25 mg

75 mg

N=4

75 mg

25 mg

N=2

PBO

PBO 7-22 giorni

Gruppo B 10 pazienti (Mutazione G551D)

10 soggetti (Mutazione G551D)*

75 mg

150 mg

N=4

150 mg

75 mg

N=2

PBO

N=8

150 mg

N=7

250 mg

N=4

PBO

Cambiamento medio dal basale

5 0

-1.6, -1.7 -4.7 * -5.4 †

-5 -10 -15 -20 -25

Basale Placebo

25mg VX-770

75mg VX-770

†

p < 0.010 (150mg) within subject comparison

150mg VX-770

28 giorni

Cambiamento medio dal basale

5 0 -5 -10 -15 -20 -25

Giorno 14

* p < 0.005 (75mg) within subject comparison

14 giorni

N=4

Mean Change [SD] (mV)

Mean Change [95% Cl] (mV)

* Soggetti differenti dalla Parte 1

14 giorni

Basale Placebo

Giorno 14 150mg VX-770

‡ p < 0.05 within subject comparison

Giorno 28 250mg VX-770

Anno III - n. 1, 2009

120

Gi 75mg VX-770

150mg VX-770

0.0001 within subject comparison

Placebo

150mg VX-770

†

14 or no

or no Gi

25mg VX-770

-52.8

or no

0 le

0 7

‡

or no

Placebo

-52.6

-32.4

‡

-42.3 *

-27.6

or no

-40.4 *

-32.9*

or no

4.8

-2.3

100

Sweat Chloride [SD] (mmol/L)

100

4.4

sa le

Sweat Chloride [95% Cl] (mmol/L)

120

Cambiamento medio dal basale

250mg VX-770

† p < 0.01 within subject comparison ‡ p < 0.05 within subject comparison

Denufosol I recettori purinergici P2Y2 sono presenti sulla superficie luminale delle cellule epiteliali polarizzate che ricoprono le superfici bronchiali. Esistono agonisti endogeni di questi recettori (UTP, ATP) che ne regolano varie funzioni fra cui la stimolazione della secrezione di cloruro, l’inibizione dell’assorbimento di sodio, la stimolazione della secrezione di mucina, la stimolazione del battito ciliare e la promozione del rilascio di surfattante da parte di cellule alveolari di tipo II. Il Denufosol (tetrasodio [P1-(uridin 5-P4-(2-deoxicitidine)tetrafosfato, tetrasodio è un agonista farmacologico dei recettori P2Y2 che possiede un profilo di attività simile a quello dell’UTP e quindi in grado di attivare la secrezione di cloruro e di migliorare la clearance mucociliare in soggetti normali e in fumatori. Il Denufosol è particolarmente stabile dal punto di vista metabolico il che ne prolunga la durata d'azione. Sono stati condotti studi

di fase 1 in fumatori e si è osservato che a dosi di 100 mg o maggiori il farmaco provoca una tosse produttiva. Studi di fase I/II hanno dimostrato una buona tollerabilità del farmaco a 10, 20, 40, e 60 mg in pazienti FC. A questo riguardo sono stati pubblicati dati riguardanti uno studio randomizzato condotto su 89 pazienti che hanno confermato la buona tollerabilità del Denufosol, il cui maggior effetto collaterale è la tosse. Il trattamento ha permesso un miglioramento significativo della FEV1 (P < 0.006), di FEF25%-75% (P < 0.008), e FVC (P < 0.022), e del rapporto FEV1/FVC (P < 0.047), rispetto al placebo. Questo lavoro è stato poi seguito da uno sviluppo ulteriore i cui dati sono stati presentati da F. Accurso e dalla casa farmaceutica Inspire alla NACFC (North American Cystic Fibrosis Conference) del 2008.

Anno III - n. 1, 2009

Le caratteristiche dello studio sono riportate nella Figura 10. Sono stati reclutati 352 pazienti con età superiore a 5 anni e con FEV superiore a 75% del predetto. Un

primo periodo ha previsto una randomizzazione fra Denufosol e placebo per 24 settimane seguito da un trattamento in aperto per altre 24 settimane con il farmaco. I risultati complessivi sull’efficacia sono pre-

Pazienti CF ≥ 5 anni con FEV1 ≥ 75%del predetto Continuazione delle cure standard 352 pazienti CF randomizzati in 62 centri Denufosol 60mg x 3 (n=178)

Denufosol 60mg x 3 (n=314)

Placebo x 3 (n=174) Periodo di screening

Periodo di estensione per lo studio di sicurezza 24 settimane

Periodo di trattamento vs placebo 24 settimane

Follow-up post-trattamento 1 settimana

(da Accurso, NACFC, 2008)

Media (ES) variazione di FEV1 (mL)

Denufosol da solo-fase in aperto 140 120

Denufosol Placebo Placebo cambiato a Denufosol

100 80 60 40 20 0 -20 -40 0

Settimana di trattamento CFB=Change from Baseline ITT Population

Dati presentati da Accurso, NACFC, 2008

Anno III - n. 1, 2009

Cambiamento medio di FEF 25-75 (mL/sec)

Denufosol da solo-fase in aperto 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 -100

Denufosol Placebo Placebo cambiato a Denufosol

Settimana di trattamento CFB=Change from Baseline ITT Population

Dati presentati da Accurso, NACFC, 2008

sentati nella Figura 11 che mostra un aumento della FEV1 (espressa in ml) significativo e costante. Il miglioramento funzionale è visibile anche nel gruppo di pazienti passati, nella seconda fase dello studio, da placebo a farmaco. Importante anche l’effetto rilevato a livello di FEF25-75 (Figura 12). Non sono stati ottenuti effetti per quanto riguarda

la frequenza di esacerbazioni o il miglioramento di sintomi respiratori. Questo studio va valutato tenendo conto del fatto che la popolazione di pazienti trattati presenta scarsi sintomi e una funzionalità respiratoria buona per la malattia (FEV>75%), i miglioramenti ottenuti sono quindi particolarmente significativi e rendono il Denufosol meritevole di studi su altre categorie di pazienti e per tempi più prolungati.

Almeno tre farmaci sono oggi in stato di avanzata sperimentazione clinica e sono mirati alla correzione del difetto di base o del meccanismo patogenetico della fibrosi cistica a livello respiratorio. I primi dati sono promettenti. Sono programmati studi di fase tre che, nel tempo di uno o due anni dovranno confermare o meno la reale collocazione di questi farmaci da un punto di vista terapeutico. Questi studi richiederanno la collaborazione di ricercatori di base e di ricercatori clinici, la partecipazione di numerosi pazienti e il rispetto di regole rigorose di reclutamento, conduzione e interpretazione dei dati. Si tratterà di un grande sforzo da compiere con collaborazioni internazionali che potrebbe cambiare radicalmente le prospettive di cura della malattia.

Anno III - n. 1, 2009

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