FC Strumenti ed Evidenze - n°4 Dicembre 2010 by Sinergie Edizioni Scientifiche

TRIMESTRALE SCIENTIFICO

Anno IV - n. 4, Dicembre 2010

Fibrosi cistica: un solo gene, ma varie ipotesi patogenetiche Guest Editor Baroukh Maurice Assael Direttore Centro Fibrosi Cistica Regione Veneto - Verona

IL PROBLEMA Poco dopo la scoperta del gene CFTR, Anderson et al. (1991) annunciavano che la proteina sintetizzata aveva le caratteristiche di un trasportatore del cloruro, attivato da AMPc. Ciò sembrava sufficiente a spiegare la fisiopatologia della malattia e la patogenesi del danno nei diversi tessuti. Inoltre, rendeva conto del difetto di base identificato nelle ghiandole sudoripare e dell’aumentata concentrazione di cloro nel sudore, utilizzata da anni nella diagnosi della fibrosi cistica. Il cerchio sembrava chiudersi. Ma, come spesso accade in biologia, si sono aperti nuovi problemi. La CFTR si è rivelata non essere un semplice (per quanto complicato) canale del cloro. Essa serve a trasportare diversi altri composti, fra cui il glutatione ed il bicarbonato, ed è oggi considerata anche una proteina regolatrice, in grado di controllare il funzionamento di altri canali. La CFTR possiede anche funzioni a livello intracellulare, dato che partecipa alla regolazione del pH di sottopopolazioni lisosomiali. Anche se il difetto genetico è uno solo, nelle cellule CF sono state riconosciute diverse alterazioni e il quadro si va veramente complicando. Sappiamo che sono alterati il metabolismo degli sfingolipidi, degli acidi grassi essenziali e vari aspetti della risposta infiammatoria. Non è facile ricondurre tutti i fenomeni patologici della fibrosi cistica a un unico quadro patogenetico.

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Pubblicazione con l’egida della Baroukh Maurice Assael Direttore Centro Fibrosi Cistica Regione Veneto - Verona Anno IV, N. 4 - Dicembre 2010

Sinergie Edizioni Scientifiche S.r.l.

Periodico trimestrale a carattere scientifico Registrazione Tribunale di Milano n. 341 del 28/05/2007 SINERGIE Edizioni Scientifiche S.r.l. Via la Spezia, 1 - 20143 Milano Tel./Fax 02 58118054 E-mail: redazione@edizionisinergie.com www.edizionisinergie.com Mauro Rissa Sinergie Edizioni Scientifiche S.r.l.

Galli Thierry Stampa S.r.l. Via Caviglia, 3 - 20139 Milano

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3 Disidratazione isosmotica del liquido periciliare 7 Una malattia da accumulo? Il ruolo degli sfingolipidi e della ceramide nella fibrosi cistica

10 Bicarbonato. Ritorno alla mucoviscidosi? 11 Conclusioni

FC Strumenti ed evidenze è una rivista monografica, trimestrale, dedicata al mondo della fibrosi cistica. Essa si prefigge di trattare argomenti solitamente “meno battuti” dal mondo medico e di offrire, quindi, un contributo originale a chi si occupa della cura dei pazienti o dell’organizzazione dell’assistenza. FC Strumenti ed evidenze si propone quindi come strumento per la ricerca clinica e per la valutazione dei sistemi assistenziali della fibrosi cistica. La rivista contiene articoli elaborati internamente dalla redazione con il contributo di esperti del settore, a livello nazionale ed internazionale. Ogni numero viene curato da un Guest editor che ne garantisce la validità scientifica e la completezza. L’editore sarà lieto di accogliere proposte ed eventuali contributi per la redazione di numeri monografici che verranno valutati dalla redazione. Sono anche accettati contributi di esperti che vogliano proporsi come Guest editor di una monografia. Le proposte possono essere inviate a redazione@edizionisinergie.com Finito di stampare nel mese di Novembre 2010

Anno IV - n. 4, 2010

Le varie ipotesi dovrebbero essere in grado di rendere conto della peculiare suscettibilità alle infezioni da Pseudomonas, della grande variabilità di espressione clinica in diversi organi, come pure delle diverse alterazioni metaboliche riscontrate. Oltre a costituire una vera sfida per la comprensione della malattia, un’ipotesi patogenetica potrebbe per-

mettere lo sviluppo di strategie terapeutiche. Infatti, già oggi, sono proposti alcuni tentativi che rispondono a specifiche ipotesi. In questo numero, prenderemo in considerazione alcune delle ipotesi patogenetiche che, negli ultimi anni, sono state corroborate da importanti dati sperimentali e che hanno aperto prospettive terapeutiche talora contrastanti.

Disidr t zione isos otic del liquido pericili re L’ipotesi della disidratazione isosmotica del liquido periciliare è stata sviluppata dal gruppo di Ric Boucher all’Università della North Carolina a Chapel Hill. In oltre 15 anni di lavoro, questa ipotesi si è progressivamente arricchita di un’impressionante messe di dati sperimentali che hanno aperto la strada a ipotesi terapeutiche e nuovi farmaci sono ora giunti in fase avanzata di sperimentazione clinica. L’ipotesi si basa sulla considerazione che le ciglia presenti sull’epitelio respiratorio sono immerse in un gel il cui volume viene determinato dalla cellula dell’epitelio bronchiale attraverso un trasporto di acqua ed elettroliti. In condizioni normali, il muco prodotto dalle cellule caliciformi non sarebbe mai in contatto diretto con le ciglia, ma verrebbe fatto scorrere sul liquido periciliare dal movimento delle ciglia. Boucher e coll hanno dimostrato che il liquido periciliare nella fibrosi cistica è povero di acqua, quindi è di volume ridotto. La capacità di clearance mucociliare sarebbe scarsa perché verrebbe meno l’azione “lubrificante” del liquido periciliare sottostante al muco. Ciò porterebbe al ristagno delle secrezioni, creando un microambiente favorevole alla colonizzazione batterica. Fondamentale, in questa ipotesi, è la capacità della CFTR di regolare il canale epiteliale del sodio (ENaC) anch’esso presente sulla membrana apicale delle cellule epiteliali bronchiali. In condizioni normali, lo stato

di idratazione delle secrezioni respiratorie viene regolato da un movimento di elettroliti cui consegue uno spostamento osmotico di acqua. In questi movimenti, il sodio gioca il ruolo principale, non diversamente da quanto avviene nel tubulo renale. Esso viene riassorbito dalla cellula epiteliale respiratoria a livello apicale, attraverso ENaC e viene escreto dalla cellula a livello baso-laterale, attraverso la pompa del sodio (Na-K ATPasi). Quando il liquido periciliare richiede maggiore idratazione, in condizioni normali, viene inibito l’ENaC e attivato un meccanismo elettrochimico di secrezione di cloruro (ione negativo) attraverso due canali apicali: CFTR e canale del cloro attivato dal calcio (CaCC=calcium activated choride channel). Per mantenere l’elettroneutralità, la secrezione del cloruro viene bilanciata dal passaggio paracellulare dello ione positivo Na+. L’aumento di NaCl nel liquido periciliare attira acqua per gradiente osmotico. Nel caso della fibrosi cistica, l’assenza funzionale di CFTR comporta una mancata inibizione dell’ENaC, quindi anche in condizioni di relativa disidratazione del liquido periciliare il sodio continua a essere riassorbito, con conseguente riassorbimento paracellulare di cloro e sottrazione osmotica di acqua dal liquido periciliare. I dati che corroborano questa ipotesi sono oramai numerosi. Innanzitutto, il gruppo di Boucher è riu-

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scito a misurare direttamente l’osmolarità del liquido periciliare prodotto da colture cellulari in monostrato, mostrando che esso è isosmolare, cioè che il riassorbimento di acqua e sodio avviene contemporaneamente, lasciando invariata l’osmolarità. Questa dimostrazione è importante perché ha definitivamente accantonato un’ipotesi degli anni 1990 secondo la quale la concentrazione di NaCl nel liquido periciliare era aumentata e responsabile di un ambiente iperosmolare, sfavorevole all’azione di sostanze antibatteriche naturali come le defensine. Gli esperimenti di Boucher hanno poi permesso di misurare direttamente il volume di liquido periciliare prodotto da colture di cellule epiteliali respiratorie (Figura 1) dimostrando che esso è ridotto. Infine, ed è forse l’aspetto più interessante, il gruppo di Boucher è riuscito a produrre un ceppo murino che “iperesprime” la subunità beta dell’ENaC e che riproduce diversi aspetti della patologia polmonare della fibrosi cistica, pur senza avere mutazioni nel gene CFTR. Il modello che deriva dalle esperienze del gruppo del North Carolina attribuisce un ruolo fondamentale, quindi, all’interazione CFTR-ENaC nella patogenesi del danno polmonare. Oltre ad avere una forte coerenza interna e ad essere corroborata da molti dati sperimentali, questa ipotesi comporta immediate conseguenze terapeutiche. Classico è l’esempio dell’amiloride, molecola che inibisce ENaC, donde il suo effetto diuretico a livello del tubulo renale. Nella fibrosi cistica, questo farmaco è stato sperimentato per via aerosolica per inibire il riassorbimento del sodio mediato dall’ENaC nelle vie respiratorie, evitando effetti sistemici. È vero che i risultati clinici sono stati dubbi, ma ciò è spiegabile in base ad un effetto farmacologico presente, ma effimero (Pons G et al., 2000; Bowler IM et al., 1995; Knowles MR et al. 1990). Analoghi chimici dell’amiloride, con attività farmacologica di maggiore persistenza, potrebbero avere più successo. Di recente, è stato dimostrato che l’amiloride potrebbe avere comunque un effetto terapeutico importante se somministrata

prima della comparsa delle lesioni bronchiali, il che sembra molto sensato (Ratjen F et al., 2008; Zhou Z et al., 2008). Ma più di ogni altro, vale l’esempio della soluzione salina ipertonica che si è dimostrata uno strumento importante nel trattamento della malattia polmonare, per via aerosolica, e che si basa proprio sull’ipotesi della disidratazione del liquido periciliare. L’iperosmolarità della soluzione inspirata bilancerebbe l’iper-riassorbimento di sodio da parte della cellula epiteliale, mantenendo elevato il volume del liquido periciliare e facilitando lo scorrimento delle secrezioni mucose. La figura 1 rappresenta l’ipotesi sostenuta dai lavori del gruppo di Boucher, dell’Università della North Carolina, secondo cui, nella fibrosi cistica, la clearance del muco sarebbe alterata a causa della disidratazione isosmotica del liquido periciliare: (a) in condizioni normali il liquido periciliare verrebbe arricchito/impoverito di acqua seguendo il trasporto netto di cloruro di sodio. Il riassorbimento del sodio attraverso il canale epiteliale del sodio (ENaC) costituisce il meccanismo traente, favorito dal riassorbimento paracellulare di cloruro. Di converso, l’apertura del canale CFTR, secerne cloruro e inibisce ENaC. Per osmosi, l’acqua segue i soluti attraverso una via paracellulare; (b) nella fibrosi cistica l’assenza di CFTR impedisce di regolare il funzionamento del canale del sodio che resta in un permanente stato di attivazione. I cloruri seguono passivamente il sodio per via paracellulare. Ne consegue un eccessivo riassorbimento di acqua per gradiente osmotico, responsabile della riduzione di volume del liquido periciliare. Ciò provoca l’aderenza del muco alla superficie epiteliale con perdita di efficienza della clearance mucociliare; (c) immagini confocali del liquido di superficie sull’epiteliale normale e FC; (d) colture tissutali fissate all’osmio dopo 24 ore. Nel caso di mucosa normale le ciglia sono distese mentre, in caso di mucosa CF, esse sono schiacciate e a diretto contatto dello strato di muco per il ridotto volume del liquido periciliare.

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60 µm/s Mucus layer

H2O

Cl-

0 µm/s H2O

ENaC

(-)

Cl-

H2O

pO2

PCL CFTR

Cl-

Na+ Na+

Normal

CF 7 µm

t=0h

7 µm

t = 24 h

Normal

t = 24 h 7 µm

Boucher ha poi ulteriormente affinato la propria ipotesi considerando che esistono diverse vie di stimolazione della secrezione di cloro e del controllo dell’ENaC (Figura 2). Una di esse, molto importante, vede protagonista l’ATP. La molecola, prodotta dalla stessa cellula epiteliale respiratoria serve da regolatore autocrino, viene secreta e metabolizzata in ADP ----> AMP ----> ade-

nosina (ADO). Sulla membrana cellulare esistono recettori purinergici di tipo PY2 e Ab2 che rispondono ad ATP e ADO e regolano sia ENaC che il canale del cloro calcio dipendente (CaCC). In assenza funzionale di CFTR, l’adenosina stimola ENaC, mentre i recettori PY2 inibiscono ENaC e CaCC. Il complesso equilibrio compensa solo parzialmente il difetto di CFTR. Boucher ha anche sostenuto che il ruolo dell’ATP su i recettori P2Y2 e sull’attività dell’ENaC sarebbe molto

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ATP

ENaC

CFTT

P2Y2

ADO A2b

Na+

Cl-

CaCC

H2O Cl-

Shear stress ATP

ADP

AMP

ADO

ATP ATP ATP

ATP P2Y2

ENaC

ADO

Na+

Cl-

H2O

CaCC

A2b

CF CFTR CFTR

Da Lazarowski et al., 2009

più importante alla base polmonare che agli apici e ciò spiegherebbe perché, nella fibrosi cistica, la malattia polmonare inizi tipicamente agli apici. Ma passare dal molecolare al clinico non è sempre facile. La figura 2 illustra la complessa organizzazione dei meccanismi di membrana che regolano il trasporto di sodio. In particolare, in questa seconda ipotesi del gruppo di Boucher, giocherebbero un ruolo il recettore purinergico P2Y2 che risponde all’ATP e il recettore A2b che risponde all’adenosina (ADO). In condizioni normali, il recettore P2Y2 inibisce l’ENaC e stimola il canale del cloruro calcio-dipendente (CaCC) mentre il recettore adenosinico stimola CFTR. In assenza di CFTR il recettore adenosinico stimola direttamente l’ENaC. Questa ipotesi ha portato allo sviluppo di farmaci (come il denufosol) in grado di stimolare i recettori P2Y2.

TRENDS in Molecular Medicine

Innanzitutto, essa non è applicabile ad altri organi. In effetti, nel pancreas e nelle cellule duttali epatiche CFTR agisce come un canale del bicarbonato, il cui ruolo non viene considerato dall’ipotesi di Boucher. In secondo luogo, non è chiarita la peculiarità delle infezioni da Pseudomonas. Altri dati sostengono che il microambiente che si determina nell’interfaccia liquido periciliare/muco tenderebbe ad essere povero di ossigeno e a favorire la formazione di colonie di Pseudomonas produttrici di arginato, difficilmente penetrabili dagli antibiotici (Worlitzsch D et al., 2002). Questa ipotesi, collaterale a quella di Boucher, non spiega però perché nella fibrosi cistica non predominino infezioni da altri microaerobi.

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Un l tti d ccu ulo? Il ruolo de li sfin olipidi e dell cer ide nell fi rosi cistic to come il difetto di attività della CFTR comporti una ridotta acidificazione di vescicole intracellulari. Nel 2006 si è anche dimostrato che la CFTR contribuisce all’acidificazione dei fagolisosomi macrofagici (Di A et al., 2006). CFTR sembra in grado di controllare l’influsso di cloruro nei lisosomi che

400

12.5

300

10.0

Ceramide-concentration (pmol/microgram protein)

Asm activity (pmol/min/mg protein)

Una affascinante ipotesi patogenetica, di tutt’altro tenore, è basata sul ruolo degli sfingolipidi e della ceramide, e ha recentemente ricevuto un grande impulso e forse aperto la strada a nuove prospettive terapeutiche. Essa si può far risalire agli studi di Barasch et al. che, nel 1991, avevano dimostra-

200 100

5.0 2.5 CFMHH + Chlorprothixene

CFMHH + Fluoxetine

CFMHH + Sertraline

CFMHH + Amlodipine

untreated

CFMHH + Desipramine

CFMHH

CFMHH + Trimipramine

CFMHH + Amitriptyline

CFMHH + Chlorprothixene

CFMHH + Fluoxetine

CFMHH + Sertraline

CFMHH + Amlodipine

CFMHH + Desipramine

untreated

CFMHH + Trimipramine

CFMHH

CFMHH + Amitriptyline

7.5

IL-1 (µg/g lung protein)

5 4 3 2 1 CFMHH + Chlorprothixene

CFMHH + Fluoxetine

CFMHH + Sertraline

CFMHH + Amlodipine

CFMHH + Desipramine

untreated

CFMHH + Trimipramine

CFMHH

CFMHH + Amitriptyline

Le figure illustrano (a, b, c) l’effetto di trattamenti farmacologici con antidepressivi triciclici, sostanze in grado di ridurre l’attività della sfingomielinasi acida. I farmaci sono stati somministrati per via aerosolica a topi che presentano il difetto genetico della fibrosi cistica e sono in grado di ridurre l’attività dell’enzima nelle vie respiratorie, ridurre la concentrazione di ceramide e ridurre la produzione del mediatore dell’infiammazione interleuchina 8 (IL-8).

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Infiammazione, suscettibilità alle infezioni

Sfingomielinasi Ceramidasi acida acida Accumulo Sfingomielina Sfingosina di ceramide -35%

-95%

CF pH delle vescicole: 5.9 L’alcalinizzazione delle vescicole intracellulari, per lo più di lisosomi secretori nelle cellule CF provoca uno sbilanciamento delle attività delle sfingomielinasi e delle ceramidasi acide. L’aumento del pH a circa 6 riduce l’attività delle sfingomielinasi, che rilascia ceramide da sfingomielina, sono del 30-40% mentre l’attività delle ceramidasi, che consumano ceramide, viene ridotta di oltre 90%. Ne consegue un accumulo di ceramide, sostanza in grado di indurre morte cellulare con conseguente deposizione di DNA nelle vie aeree, infiammazione cronica dimostrata dall’accumulo di neutrofili, macrofagi e citochine proinfiammatorie come IL1 e IL8 e di aumentare la suscettibilità alle infezioni da P aeruginosa. L’inibizione genetica o farmacologica della sfingomielinasi acida normalizza i livelli di ceramide e riduce la morte cellulare, l’infiammazione e la componente infettiva (da Becker et al, 2010)

Acute infection

Prior to infection

servono da contro-ione per bilanciare l’effetto della pompa protonica. Un deficit di CFTR limita l’accumulo di protoni e quindi la possibilità di raggiungere pH inferiori a 5-6, con la conseguenza di ridurre la capacità battericida dei macrofagi alveolari. È stato soprattutto il gruppo di Gulbins a riprendere e sviluppare l’ipotesi, con importanti contributi sperimentali. L’idea di questi ricercatori si basa sul fatto che cellule della mucosa respiratoria CF, sia ottenute da pazienti che da modelli sperimentali, mostrano un accumulo di ceramide che dipende dallo sbilanciamento degli enzimi endolisosomiali responsabili della sua sintesi e del suo metabolismo: la sfingomielinasi acida e la ceramidasi. Infatti, a pH acidi viene garantito l’equilibrio fra i due sistemi enzimatici e mantenuta una concentrazione fisiologica di ceramide. Invece, a pH meno acidi, condizione che si verifica nel caso della fibrosi cistica, l’equilibrio fra sintesi e metabolismo si sposta determinando un accumulo di ceramide, fino a provocare necrosi cellulare e reazione infiammatoria. I frammenti di DNA liberati costituiscono il fattore favorente l’adesione di Pseudomonas. Questa ipotesi è corroborata da vari dati sperimentali. La concentrazione di ceramide è stata misurata direttamente nell’epitelio respiratorio umano e in modelli sperimentali. Vi sono dati sul pH lisosomiale in cellule CF. È stata misurata l’attività della sfingomielinasi acida e della ceramidasi. La riduzione dell’attività della sfingomielinasi acida, provocata con manipolazione genetica di ceppi murini privi di CFTR,