IDENTIFICACIÓN DE LOS GENOTIPOS vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2 y cagA DE Helicobacterpylori

Conferencias Magistrales CUENCA

“IDENTIFICACIÓN DE LOS GENOTIPOS vacA s1, vacA s2, vacA m1, vacA m2 y cagA DE Helicobacter pylori EN BIOPSIAS GÁSTRICAS INCLUÍDAS EN PARAFINA DE PACIENTES ATENDIDOS EN EL INSTITUTO DEL CÁNCER SOLCA – CUENCA, AÑO 2008”

SOLCA Cuenca Siempre Luchando por la Vida…

“IDENTIFICACIÓN DE LOS GENOTIPOS vacA s1, vacA s2, vacA m1, vacA m2 y cagA DE Helicobacter pylori EN BIOPSIAS GÁSTRICAS INCLUÍDAS EN PARAFINA DE PACIENTES ATENDIDOS EN EL INSTITUTO DEL CÁNCER SOLCA – CUENCA, AÑO 2008” Autora: Dra. Daniela Martínez Serrano Instituto del Cáncer SOLCA Cuenca .

Departamento de Patología - Laboratorio de Biología Molecular

Características de Helicobacter Características Helicobacterpylori pylori “Pylori”: Latin pylorus o guardabarrera. (píloro) • • • • •

Bacilo Gram negativo - espiral Mide 2-4 u largo y 0,5-1 u diámetro.

Posee de 4–6 flagelos. Bulbo.

Microaerófila Hidrógeno y metanogénesis: fuente de energía

* Marshall BJ (1983). «Unidentified curved bacillus on gastric epithelium inactive chronic gastritis». Lancet 1 (8336): 1273–1275.

HISTORIA • 1875  científicos alemanes descubren bacterias espirales en epitelio del estómago humano.

• 1899  Walery Jaworski, polaco investiga sedimentos de lavados gástricos de humanos y describe bacterias alargadas de forma espiral, las nombro “Vibrio rugula”.

• 1940  Freedburg y Barron: “espiroquetas” en lavados gástricos.

• 1975  Steer – Colins: bacilos gram – 80% biopsias de pctes con úlcera péptica.

• 1982  Robin Warren y Barry Marshall; aislan microorganismo de mucosas gástrica de humanos.

“Pyloric campylobacter.”

Helicobacter pylori descubrimiento 1983 Barry Marshall - Robin Warren

* Eslick, GD, Lim, LL, Byles, JE, et al. Association of Helicobacter pylori infection with gastric carcinoma: A metaanalysis. Am J Gastroenterol 1999; 94:2373

Helicobacter pylori y cáncer gástrico • Se estima que aproximadamente las dos terceras partes de la población mundial está infectada con H. pylori.

• Incidencia: desarrollados: 20-40% sub-desarrollados:70-90% • Mecanismo de contagio  oral-oral u oral-fecal.

• La bacteria es adquirida generalmente en la niñez.

• De las personas infectadas: mayoría desarrolla una gastritis 10 % úlceras gástricas o duodenales 1 % adenocarcinoma gástrico o linfoma Freddie Bray, et al.; Global estimates of cancer prevalence for 27 sites in the adult population in 2008; Section of Cancer Information, International Agency for Research on Cancer; 2012

MECANISMO DE ACCIÓN No existe evidencia de que H. pylori sea oncogénico de por sí…..

• IARC: 1994 • Factores: a) virulencia de H. pylori b) predisposición genética y respuesta inmunológica del huésped c) factores ambientales

FACTORES Factores AMBIENTALES ambientales 1.- Dieta rica en sal

2.- Dieta pobre en frutas y verduras, dieta rica en compuestos nitrosos 3.- Estado socio-econĂłmico bajo, hacinamiento, malas condiciones higiĂŠnicas.

FACTORES Factores BACTERIANOS bacterianos El rol patogénico de H. pylori es ejercido a través de sus factores de virulencia y su interacción con el huésped

• cag A (cytotoxin associated gene A) • vac A (vacuolating cytotoxin A) • bab A (blood group antigen-binding adhesin) favorece la colonización por H. pylori al unirse al antígeno Lewisb

• sab A (sialic acid-binding adhesin) antígeno de Lewisxsialilado, que es un antígeno tumoral y un marcador de displasia gástrica.

• ice A (induced by contact with epithelium)

FACTORES DEL HUÉSPED

Bergman et al. Nature Reviews Microbiology 4, 151–159 (February 2006) | doi:10.1038/nrmicro1344

• cagA

50% de las cepas de H. pylori

cag PAI. CagA • vacA

Presente en todas las cepas de H. pylori. VacA La región “s” (signal region of the toxin)

s1 - s2 La región “m” (middle region of the toxin)

m1 - m2 “vacA s1, vacA s2 / vacA m1, vacA m2 ”

Cag PAI (pathogenicity island) NOD1

Los genes de cag PAI inducen la producción de interleukina IL-8 por reconocimiento por el NOD1 (nucleotide-binding oligomerization domain) Desencadena la activación de los factores de transcripción NFκB (nuclear factor κB) y AP-1 (activator protein-1).

•IL-8factor quimiotáctico de polimorfonucleares. (Papel clave en el inicio de la inflamación local)

• cagA

50% de las cepas de H. pylori

cag PAI. CagA • vacA

Presente en todas las cepas de H. pylori. VacA La región “s” (signal region of the toxin)

s1 - s2 La región “m” (middle region of the toxin)

m1 - m2 “vacA s1, vacA s2 / vacA m1, vacA m2 ”

Gen vac A VacA 95 KDa Citotoxina multifuncional

• Vacuolización del epitelio • Disrupción de la barrera epitelial • Apoptosis • Acción inmunosupresora local • Neoangiogénesis a través de la sobreexpresión de VEGF (vascular endothelial growth factor) * Moss S F, Blaser M J. Mechanisms of disease: Inflammation and the origins of cancer. Nat Clin Pract Oncol 2011; 2: 90-97.

JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA • Determinar la relación existente entre alteraciones histopatológicas gástricas y las cepas vacA s1, vacA s2, vacA m1, vacA m2 y cagA de Helicobacter pylori en biopsias gástricas incluidas en parafina de pacientes atendidos en el Instituto del Cáncer SOLCA-Cuenca en el año 2008.

• Conocer cuales son los genotipos más frecuentes medidas de prevención y control

HIPÓTESIS HIPOTESIS « De todos los casos estudiados de los pacientes con diagnóstico de Helicobacter pylori positivo por anatomía patológica durante el año 2008 en el Instituto del Cáncer Solca – Cuenca, el 50% corresponden al genotipo vacAs1.»

OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Identificar los genotipos vacA s1, vacA s2, vacA m1, vacA m2 y cagA de Helicobacter pylori en biopsias gástricas incluidas en parafina de pacientes atendidos en el Instituto del Cáncer SOLCA – Cuenca, año 2008, para determinar el genotipo más frecuente en la población de estudio.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Determinar la frecuencia de los genotipos vacA s1, vacA s2, vacA m1, vacA m2 y cagA de Helicobacter pylori, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en biopsias gástricas incluidas en parafina.

• Establecer la frecuencia de los genotipos vacA s1, vacA s2, vacA m1, vacA m2 y cagA de Helicobacter pylori según la edad y el género de los pacientes.

• Establecer la frecuencia existente entre los genotipos vacA s1, vacA s2, vacA m1, vacA m2 y cagA de Helicobacter pylori y las diferentes alteraciones gástricas (atrofia, metaplasia, displasia y cáncer gástrico).

METODOLOGÍA • Diseño y tipo de investigación Retrospectivo, de observación directa

• Universo y muestra Todas las biopsias gástricas incluidas en parafina con diagnóstico de Helicobacter pylori positivo por anatomía patológica, obtenidas por endoscopía en pacientes atendidos en el servicio de gastroenterología del Instituto del Cáncer durante el año 2008, totalizando 396 muestras.

Se trabajó con todo el universo.

• Criterios de inclusión Todas las biopsias gástricas de los pacientes atendidos en el servicio de gastroenterología del Instituto del Cáncer SOLCA-Cuenca en el año 2008, cuyo diagnóstico por anatomía patológica fue Helicobacter pylori: positivo.

• Criterios de exclusión Todas las biopsias gástricas de los pacientes atendidos en el servicio de gastroenterología del Instituto del Cáncer SOLCA-Cuenca en el año 2008, cuyo diagnóstico por anatomía patológica fue Helicobacter pylori: negativo.

FLUJOGRAMA DE TRABAJO Extracción de ADN

Cuantificación del ADN

Corrida electroforética

PCR para genotipificación de Helicobacter pylori

Revelado de resultados

EXTRACCIÓN DE ADN

Biopsias incluídas en parafina Biopsias gástricas frescas

Desparafinación

Invitrogen Pure Link genomic DNA Mini Kit

CUANTIFICACIÓN DE ADN

Se realiza para verificar la pureza y concentración de la muestra extraída El kit utilizado para la extracción permite obtener muestras de elevada pureza (1.8 – 2.0) Se calcula mediante por espectrofotometría a diferentes longitudes de onda.

PCR

PCR

PCR

REVELADO โ ข Identificaciรณn molecular de los genotipos vacA s1, vacA s2, vacA m1, vacA m2 y cagA Gen vacA s1: 259 pb Gen vacA s2: 286 pb Gen vacA m1: 567 pb 567 pb vacA m1 642 pb Gen vacA m2: Gen cagA: 350 pb

259 pb vacA s1

* Santanu Chattopadhyay et al.; Multiplex PCR Assay for Rapid Detection and Genotyping of Helicobacter pylori Journal of Clinical Microbiology; 2004.

RESULTADOS

Universo: 396 muestras

4.1.2 Porcentaje de los diferentes genotipos y combinaciones identificadas por PCR en las biopsias gástricas de pacientes H. pylori positivo del Instituto del Cáncer SOLCACuenca, año 2008.

396 muestras

Análisis de la relación de los diferentes genotipos identificados por PCR en las biopsias gástricas de pacientes H. pylori positivo del Instituto del Cáncer SOLCACuenca, año 2008 y los diferentes grupos etarios.

ANÁLISIS DE LOS GENOTIPOS INDIVIDUALES DE Helicobacter pylori VS. GÉNERO

Análisis de la relación de los diferentes No genotipos identificados porvacAm PCR en lasNo amplific SEXO/GENOTIP vacAm O vacAs1 vacAs2 1 2 H. cagA muestra a biopsias gástricas de pacientes pylori positivo del Instituto del Cáncer SOLCAMASCULINO 45 4masculino 11 12 y 15 Cuenca, año131 2008 0y el género femenino.

FEMENINO

193

0

67

11

7

16

29

Análisis de la relación de los diferentes genotipos identificados por PCR en las biopsias gástricas de pacientes H. pylori positivo del Instituto del Cáncer SOLCACuenca, año 2008 y las diferentes lesiones gástricas.

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

1. La cepa de H. pylori mas frecuente encontrada en el universo de estudio corresponde al genotipo vacAs1, seguido de la combinación vacAs1/m1.

2. En todos los grupos etarios el genotipo más frecuente fue el vacAs1; por lo tanto la edad no es un factor relevante al momento de la infección por las diferentes cepas de H. pylori.

3. En cuanto al género, tanto varones como mujeres mostraron una mayor frecuencia para el genotipo vacAs1; por lo tanto el género no parece ser un factor influyente al momento de la infección por parte de H. pylori.

4. Todas las alteraciones gástricas presentes en los casos de este estudio, se relacionaron en un porcentaje mayor con el genotipo vacAs1, que en la literatura se la describe como la cepa más citotóxica del las variantes del gen vacA por la gran cantidad de proteína vacuolizante VacA que secreta; por lo tanto, se puede concluir que el genotipo vacAs1 está altamente relacionado con la progresión de patología gástrica.

RECOMENDACIONES Y PROPUESTAS

• Continuar con este mismo estudio, empleando muestras en fresco provenientes directamente de la endoscopía y así evitar el proceso de desparafinado.

• Realizar estudios mediante PCR para identificar otros genotipos de H. pylori que estén relacionados con la patología gástrica y verificar su frecuencia.

• Continuar con estudios similares en las diferentes regiones del Ecuador y así determinar el genotipo más frecuente a nivel nacional.

• Realizar estudios moleculares en población no sintomática y ver cual es la prevalencia de los genotipos de H.pylori.

• Realizar un estudio de frecuencia de los genotipos vacA (variantes) y cagA en casos de pacientes con cáncer gástrico.

• En cuanto al protocolo de trabajo, se debería hacer un seguimiento más exhaustivo e incluir el análisis molecular en los pacientes que no responden de la manera esperada al tratamiento antibiótico, ya que se trata de cepas resistentes.

GRACIAS