Percorso di Genetica - Pon C5

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Programma Operativo Regionale 2007IT051PO007 FSE Puglia

Percorso di Genetica

Dirigente Scolastico: Prof.ssa Giovanna Caretto D.S.G.A.: Dott. Valterluigi Carluccio Coordinatore logi. e org. e Responsabile piattaforma Ansas Resp. PubblicitĂ : Prof. Rollo Antonio Facilitatore: Prof. Enrico Peccarisi

Tutor scolastiche:

Prof.ssa Maria Rosaria Arlotta Prof.ssa Alessandra Galizia Prof.ssa Luciana Tesorone Prof.ssa Patrizia Tommasi

Gruppo di lavoro

Valentina Pesce Barbara Irno Consalvo Roberta Iovino Francesca Erroi Katia Monteduro

Percorso di Genetica

Tutor d’azienda: Dott. Simone Raho

La scienza della vita:

La genetica è la scienza che studia i meccanismi dell'ereditarietà attraverso i quali avviene la trasmissione delle caratteristiche biologiche (caratteri) da una generazione a quella successiva nelle varie specie animali e vegetali.

Tutto ciò avviene mediante lo studio:

: è l'unità ereditaria fondamentale degli organismi viven5.

I geni corrispondono a porzioni di codice gene5co localizzate in precise posizioni (LOCUS) all’interno della sequenza nucleo5dica del DNA e contengono tuGe le informazioni necessarie per la produzione di una proteina. Essi sono contenu5 ed organizza5 all’interno dei cromosomi, presen5 in tuGe le cellule di un organismo. Le cellule umane contengono tuGe 23 coppie di cromosomi, con la sola eccezione dei game5 che presentano una singola copia di ciascun cromosoma.

: termine con il quale si definisce la forma alterna5va di un gene

: si riferisce all’insieme di geni che compongono il

DNA di un organismo. In individui diploidi, dotati cioè di due copie di ogni cromosoma (cromosomi omologhi), il genotipo, in riferimento ad un singolo carattere, è la combinazione degli alleli di quel gene portati dall'individuo. Se i due alleli di uno stesso locus genico, posizione occupata da un gene sul cromosoma, sono uguali, l'individuo viene detto omozigote, in caso contrario eterozigote (Aa). L’omozigote può essere distinto in dominante (AA) e recessivo (aa) per un determinato gene, in base agli alleli ad esso riferiti.

: si intende l'insieme di tutte le caratteristiche

Osservabili di un organismo vivente, quindi la sua morfologia, il suo sviluppo, le sue proprietà biochimiche e fisiologiche comprensive del comportamento.

Si distinguono: - Dominante: carattere fenotipicamente espresso negli eterozigoti.

- Recessivo: carattere espresso unicamente negli individui omozigoti per il gene che lo controlla.

- Codominanti: caratteri controllati da due alleli ed entrambi espressi nell’eterozigote.

Diversi individui di una stessa specie presentano colorazione differente.

Nella prima fase del ciclo è come se la cellula facesse la “fotocopia” del proprio materiale gene;co. Tu=o ciò avviene durante la fase S (sintesi) nella quale ogni cromosoma si duplica formando una copia di se stesso. Le due copie rimangono unite tra loro in un tra=o de=o centromero nel quale il DNA non è ancora completamente duplicato. Esse vengono de=e croma5di fratelli.

La fase S è preceduta e seguita da due fasi dette rispettivamente G1 e G2. La fase G1 è il periodo di crescita cellulare durante la quale essa sintetizza nuove molecole e strutture citoplasmatiche. Nella fase G2, che segue la fase S, la cellula prepara a dividersi. I cromosomi che subiscono la duplicazione iniziano un processo di condensazione e spiralizzazione che li porterà ad assumere una forma sempre piÚ compatta. La cellula inizia inoltre a costruire tutte quelle strutture che le consentiranno durante la mitosi di ripartire il suo corredo cromosomico alle cellule figlie.

5 avvolgimenti della doppia elica

2nm

sezione della cromatina

Le cellule umane contengono 46 cromosomi.

I geni, cioè frammenti specifici di DNA, sono i principali costituenti dei cromosomi.

In un singolo cromosoma sono mediamente presenti 2.000 geni.

I cromosomi X e Y, sono quelli che determinano il sesso: Nella donna sono presenti due cromosomi X, e nell’uomo un X e un Y.

11nm

fibra di 30nm con nucleosomi

strettamente

impacchettati

i

30nm

parte di una sezione di cromosoma

sezione condensata di un cromosoma metafasico

cromosoma metafasico

300nm

700nm

1400nm

Con il termine cariotipo si indica, in citogenetica, la costituzione del patrimonio cromosomico di una specie dal punto di vista morfologico.

Il cariotipo di una cellula eucariota è dato dal numero e dalla morfologia dei suoi cromosomi ed è una rappresentazione ordinata del corredo cromosomico di un individuo.

E’ costituito da 22 coppie appaiate, nelle quali uno dei cromosomi è di origine paterna ed uno di origine materna.

I cromosomi sono distinti a seconda della lunghezza (dal più lungo al più corto) ed in base alle caratteristiche morfologiche (visibili con la tecnica del “bandeggio”).

I cromosomi del sesso (XX o XY) vengono evidenziati come coppia separata.

Viene qui illustrato un ;pico protocollo per I’o=enimento di cromosomi metafasici di linfoci; a par;re da sangue periferico. I passaggi principali sono: Prelievo di sangue e sua aggiunta ad un terreno di coltura contenente PHA per s;molare la mitosi.

Incubazione in termostato per 3 giorni a 37°C. Aggiunta della colchicina per bloccare le cellule in metafase.

Centrifugazione per raccogliere le cellule.

Aggiunta di una soluzione ipotonica (a bassa concentrazione salina).

Centrifugazione e aggiunta di una soluzione fissa;va cos;tuita da metanolo e acido ace;co.

I linfoci; vengono preleva; e sparsi su un vetrino.

I cromosomi vengono ora colora; col metodo del "banding" nella quale assumono una colorazione appunto per bande, o fasce colorate, ;piche.

La piastra metafasica viene fotografata I vari cromosomi vengono ordina; (i cromosomi omologhi vengono appaia;; i cromosomi appartenen; alla stessa coppia hanno gli stessi bandeggi e il loro centromero è nella stessa posizione).

La tecnica più conosciuta in diagnosi prenatale è l’amniocentesi. Vi sono due momenti distinti della gravidanza in cui è possibile eseguire l'amniocentesi, con scopi diagnostici assai diversi. Il primo momento (amniocentesi precoce) è tra la 16ª e la 18ª settimana, quando l'amnios ha raggiunto dimensioni sufficienti perché la pratica non costituisca un rischio per il feto; il secondo momento (amniocentesi tardiva) cade dopo la 25ª settimana, quando possono verificarsi condizioni nelle quali sia richiesto il prelievo di liquido amniotico per fini diversi da quelli citogenetici.

La sempre maggiore richiesta di ottenere risposte precoci ha indotto, negli ultimi anni, ad eseguire il prelievo del liquido amniotico anche in epoca inferiore alla 15ª settimana di gestazione, come valida alternativa al prelievo dei villi coriali (amniocentesi precocissima).

GLI SCOPI : - valutazione del cariotipo, cioè dell'assetto cromosomico fetale, al fine di valutarne la normalità o al contrario per evidenziare la presenza di anomalie, o per determinazione del sesso fetale, importante nel sospetto di trasmissione ereditaria di una malattia legata al cromosoma X; - dosaggio di alfafetoproteina o di acetilcolinesterasi, sostanze presenti in quantità superiori alla norma nel liquido quando il feto presenta un'anomalia di sviluppo del tubo neurale (anencefalia, spina bifida, encefalocele, mielomeningocele).

GRUPPO

CROMOSOMI

CARATTERISTICHE

A B C

1, 2, 3 4, 5 6, 7, 8, 9, 10,11,12

Cromosomi grandi con centromeri in posizione mediana.

Cromosomi grandi con centromeri sub-­‐mediani.

Cromosomi di media grandezza con centromeri sub-­‐mediani

D E F G

13, 14, 15 16, 17, 18 19, 20 21, 22

Cromosomi di media grandezza con centromeri terminali.

Cromosomi piccoli con centromeri mediani e sub-­‐mediani.

Cromosomi piccoli con centromeri mediani.

Cromosomi molto piccoli e acrocentrici.

Lo sviluppo del bandeggiamento ha costituito un progresso decisivo per le analisi citogenetiche e ha permesso di individuare in maniera univoca i singoli cromosomi.

Vari trattamenti denaturanti consentono di colorare i cromosomi in modo riproducibile, secondo una sequenza di bande chiare e scure.

Il numero del cromosoma è seguito da p (braccio corto) o q (braccio lungo) e dal numero della banda, esempio 11q23 significa, l’estremità del braccio lungo q del cromosoma 11, banda 2 soGobanda 3.

Bandeggio GTG (G-Trypsin-Giemsa):

-­‐E’ uno dei bandeggi più largamente u5lizza5. Consiste nel traGare i cromosomi con un enzima proteoli5co, la tripsina, che digerisce le proteine istoniche.

-­‐ In seguito si immergono i vetrini in una soluzione di Giemsa, una miscela di azur II ed azur II eosina, e questo consente la visualizzazione delle bande cosiddeGe G.

Il bandeggio Q-­‐Fluorescence-­‐Quinacrine è cos5tuito da una colorazione fluorescente.

-­‐ E’analogo a quello G. -­‐ Il contrasto inoltre è inferiore a quello oGenibile con il bandeggio G.

ANOMALIE COSTITUZIONALI: presen5 in cellule di tuGo il corpo. Spermatozoo e ovulo normali, fecondazione anomala o evento anomalo nelle prime fasi di sviluppo embrionale ANOMALIE SOMATICHE: presen5 in un piccolo soGogruppo di cellule o tessu5. Diverse cos5tuzioni cromosomiche pur derivando tuGe le cellule dallo stesso zigote. MOSAICO GENETICO.

Quali sono le anomalie cromosomiche Di numero: - trisomie

- monosomie - triploidie - tetraploidie

Di struttura - traslocazioni -  inversioni - delezioni - duplicazioni

MONOSOMIE E TRISOMIE

CELLULE NEOPLASTICHE ( aneuploidia estrema) NON-­‐DISGIUNZIONE: incapacità di cromosomi appaia; di separarsi durante la prima divisione meio;ca, o dei croma;di fratelli appaia; di separarsi nella seconda divisione meio;ca. I due cromosomi o croma;di congiun; migrano ad un polo e vengono inclusi in una sola cellula figlia, mentre l’altra avrà materiale gene;co in meno

RITARDO ANAFASICO: ritardata migrazione del cromosoma durante l’anafase, conseguente perdita del cromosoma.

Mancata incorporazione di un cromosoma nel nucleo di una delle cellule figlie

La sindrome di Down è una condizione genetica caratterizzata dalla presenza di un cromosoma in più nelle cellule di chi ne è portatore: invece di 46 cromosomi nel nucleo di ogni cellula ne sono presenti 47, vi è cioè un cromosoma in più nella coppia identificata con il numero 21.

La trisomia 13 è una grave anomalia cromosomica causata dalla presenza di un cromosoma 13 in sovrannumero. Nei feti affetti la morte endouterina si verifica in oltre il 95% dei casi.

La sindrome di Edwards è una malattia genetica rara. Il cariotipo dei soggetti affetti da questa sindrome presenta tre cromosomi 18 invece di due. Questa patologia si manifesta con delle malattie congenite di tutti gli organi interni che precludono il corretto sviluppo dell’individuo già durante la gravidanza; nel caso in cui la gravidanza viene portata a termine il 90% dei bambini affetti muore nei primi sei mesi di vita per problemi cardiaci.

Bilanciate:

nella maggioranza dei casi non sono correlate ad un fenotipo anomalo

Sbilanciate: Â sono correlate ad un

fenotipo anomalo (malformazioni e/o ritardo mentale)

PORTATORE DI TRASLOCAZIONE BILANCIATA: PUO’ PRODURRE GAMETI NON BILANCIATI CHE ORIGINERANNO ZIGOTI CON TRISOMIA PARZIALE O MONOSOMIA PARZIALE PER DEFINITE REGIONI CROMOSOMICHE

La citogene5ca classica.

La citogene5ca molecolare.

• Permette di identificare riarrangiamenti cromosomici coinvolgenti non meno di 3-5 Mb.

• Abbina la possibilità di associare l’analisi del DNA, propria delle tecniche di biologia molecolare, con l’analisi della struttura cromosomica, il cui studio è oggetto della citogenetica classica.

PermeGe un’analisi mirata di una regione cromosomica consentendo di meGere in evidenza riarrangiamen5 di alcune cen5naia di chilobasi.

Una delle principali tecniche di citogene5ca molecolare è la:

• FISH (Fluorescence In Situ Hybridiza5on)

E’ una tecnica di ibridazione che permeGe, dopo fissazione di metafasi o nuclei in interfase su vetrino, di iden5ficare sequenze specifiche negli acidi nucleici. La FISH consente la localizzazione di specifiche sequenze di DNA su un determinato cromosoma, regione di cromosoma, o “5po” cellulare; generalmente la morfologia del cromosoma, della cellula o del tessuto d’interesse viene conservata per permeGere una precisa ed inequivocabile interpretazione del “target”.

marcatura della sonda

denaturazione della sonda

nucleo;di bio;nila; sonda bio;nilata

ibridazione

sonda ibridata al DNA cromosomico

cromosomi denatura;

visualizzazione al microscopio

avidina fluorescinata

cromosomi con sonda fluorescinata

cromosomi con segnali fluorescen; in corrispondenza del segmento di DNA riconosciuto dalla sonda

CCD

Metafase

CHROMOSOME PAINTING

applicazioni • Iden5ficazione di cromosomi marker e ring; • CaraGerizzazione di traslocazioni complesse; • Iden5ficazione di inserzioni cromosomiche; • Individuazione di riarrangiamen5 ‘crip5ci’.

finalità

• analisi simultanea di tuGo il corredo cromosomico con un approccio rapido: un singolo esperimento per lo studio dell’intero cario5po; • sistema affidabile di caraGerizzazione contemporanea di tuk i riarrangiamen5 cromosomici nella cario5pizzazione di cellule neoplas5che

M-­‐FISH

VANTAGGI

SVANTAGGI

• rapidità • identificazione di microdelezioni e riarrangiamenti complessi • diagnosi su nucleo

• costi elevati • diagnosi non completa