ELETTROFORESI
ELETTROFORESI
L’ elettroforesi è senza dubbio una delle tecniche maggiormente utilizzate nei laboratori di biologia molecolare, che permette la separazione la visualizzazione e la purificazione di molecole di interesse biologico quali acidi nucleici e proteine. Tale separazione è resa possibile e dal peso molecolare e dalla carica elettrica di cui sono dotate le particelle, ioni o macromolecole. Tali particelle poste in un campo elettrico generatosi dalla d.d.p. applicata a due elettrodi, si muoveranno in direzione dell'elettrodo di carica opposta, quelle cariche positivamente verso il polo negativo e viceversa. Gli acidi nucleici migrano sempre verso il polo positivo per la presenza nella loro molecola di cariche negative dei gruppi fosfato (PO4 - - ).
La tecnica dell’Elettroforesi può avvenire su vari supporti. Quelli maggiormente utilizzati sono: 1- Carta (elettroforesi delle globuline del sangue) 2- Fase liquida (all’interno di capillari) 3- Su gel
ELETTROFORESI SU GEL Supporto elettivo nei laboratori di biologia molecolare è costituito dal gel, che rispetto agli altri supporti presenta diversi vantaggi. Infatti: 1) Il gel non contiene cariche in quanto non sono presenti gruppi ionizzanti 2) è possibile avere gel con maglie di grandezza variabile (in base alla concentrazione della matrice da usare), per tale motivo si effettua una separazione non solo in base alla carica ma anche in base al peso molecolare. 3) si possono facilmente recuperare i campioni dopo la separazione elettroforetica. I gel maggiormente utilizzati nei laboratori di biologia molecolare sono costituiti da : - poliacrilamide, (PAGE) - agarosio.
L'acrilamide e l'agarosio sono di routine utilizzati per la separazione di acidi nucleici e proteine. Le due sostanze danno origine ad una gelatina che può essere racchiusa tra lastre di vetro, poste in colonne o nel caso dell’agarosio stratificato su un supporto orizzontale. Il gel viene preparato in opportuni tamponi : -TBE (Tris Borato EDTA) -TAE (Tris Acetato), identici a quelli posti nella vaschetta elettroforetica, per consentire il passaggio di corrente. Usualmente per la separazione di molecole : - a più basso peso molecolare si usa come supporto del gel l'acrilamide (<500bp) - a più alto peso molecolare si usa come supporto l'agarosio (da 500 bp a 20 Kb) I gel possono essere neutri o denaturanti a seconda che essi permettano la migrazione di doppie o singole eliche. La denaturazione è di solito permessa grazie all'aggiunta di agenti quali la Formamide, Urea ecc.
GEL D’ACRILAMIDE (PAGE)
Il gel è formato dalla polimerizzazione tra acrilamide e bis-acrilamide in presenza di catalizzatori. (TEMED e APS-Ammonio persolfato). La polimerizzazione del gel procede attraverso una reazione a catena. Il TEMED (Tetrametil-etilen-diammina) è attivato ad opera dell' APS (Ammonio Persolfato) che lascia la molecola del TEMED con un elettrone reattivo spaiato. A questo punto il TEMED può reagire con l'acrilamide che viene così attivata. Ad essa si possono legare altre molecole di acrilamide a formare un polimero la cui estremità risulta altamente reattiva. La N metilen-bisacrilamide può reagire con il polimero formato dando luogo ad una matrice ramificata.
STRUTTURA RAMIFICATA DELLA POLIACRILAMIDE
Variando la concentrazione di acrilamide e di bisacrilamide si creano nel gel maglie di diversa grandezza. (RETE DA PESCA) La concentrazione di acrilamide può variare dal 3% al 20% rispetto al volume totale del gel. I gel possono essere polimerizzati in tubicini di vetroin modo da ottenere cilindretti di acrilamide di piccolissimo spessore (elettroforesi capillare) su cui si può stratificare un singolo campione. Comunemente si usano i cosiddetti gel piatti ottenuti per polimerizzazione del gel tra due lastre di vetro, che consentono il caricamento di piÚ campioni.
GEL D’AGAROSIO
L'agarosio è un polimero lineare naturale di galattosio e 3,6 anidro galattosio. L' agarosio è sciolto in opportuno tampone (TBE o TAE) e fatto gelificare su un supporto di vetro o di plastica. Si crea così una matrice gelatinosa le cui maglie permettono la separazione di macromolecole a diverso PM. Anche per l'agarosio è possibile intervenire sulla concentrazione per favorire la migrazione di materiale più o meno grande. In linea di massima il range di concentrazione varia tra lo 0,3% - 2%.
% DEL GEL
RISOLUZIONE KB
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
In entrambi i supporti Acrilamide o Agarosio, si assembla il sistema su un apparecchio per elettroforesi o CELLA ELETTROFORETICA. Esistono in commercio un gran numero e modelli di celle elettroforetiche, di varia : - forma - grandezza - verticali - orizzontali.
VERTICALE ORIZZONTALE
La grandezza e lo spessore delle celle, e quindi dei gel permettono l'analisi di maggior o minore volume dei campioni. I sistemi orizzontali offrono il vantaggio di poter in ogni istante analizzare la corsa elettroforetica in quanto non contemplano l'assemblaggio delle lastre di vetro alla vaschetta. E' quindi possibile anche ad intervalli ravvicinati rimuovere il gel(solitamente di agarosio perchĂŠ piĂš resistente alle varie manipolazioni) ed analizzare la migrazione delle bande. Tutte le celle elettroforetiche sono costituite da 2 vaschette contenenti il tampone (TAE o TBE) ed in comunicazione tra loro alle quali sono collegati il polo negativo e positivo tra cui si genera una d. d. p.
Gli acidi nucleici migrano sempre verso il polo positivo per la presenza nella loro molecola di cariche negative dei gruppi fosfato (PO4 - - ).
Il sistema è collegato ad un alimentatore in grado di creare il campo elettrico. Grazie al campo elettrico generatosi la miscela di frammenti comincerà a migrare verso il polo positivo in base al loro diverso peso molecolare: quelle più pesanti (a maggior PM) migreranno più lentamente rispetto a quelle più leggere (a minor PM), che a loro volta migreranno più velocemente. DNA
Il risultato della corsa elettroforetica consisterà in una serie di bande. Sul gel si depone anche una miscela di frammenti a PM noto (MARKER) che servirà per il calcolo della lunghezza in basi delle bande incognite.
E' possibile visualizzare la corsa elettroforetica grazie a coloranti inerti:
-BPB (Blu di bromofenolo) -XC ( Xilene cianolo ) che si muovono nel campo elettrico come molecole a PM noto, dipendente dalla concentrazione del gel.
BPB XC
5% 30 bp 150 bp
7% 50 bp 180 bp
Terminata la corsa è possibile evidenziare il pattern elettroforetico mediante una colorazione specifica dovuta alla presenza di ETIDIO BROMURO (EtBr),un agente intercalante che si frappone tra le basi azotate ed è evidenziabile alla luce UV, colorando le bande di DNA di arancione. E' possibile quindi calcolare il PM e quindi la grandezza in paia di basi dei frammenti misurando la distanza in cm percorsa da ciascun frammento (mobilità elettroforetica) a partire dal pozzetto fino al termine della corsa. Dopo la corsa si costruisce una retta di taratura su un grafico semilogaritmico utilizzando le bande del MARKER, una miscela di frammenti a PM noto, riportando in ascisse la migrazione in cm ed in ordinata il logaritmo del peso molecolare (espresso come paia di basi). Interpolando sulla retta di taratura la migrazione dei frammenti incogniti si può risalire alla grandezza di ogni frammento. Infatti la mobilità elettroforetica è inversamente proporzionale al log del peso molecolare.
MARKER
21 Kb 9 Kb 4 Kb 2 Kb
2 cm 5 cm 8 cm 9 cm
2 cm
21
9
5 cm
? 8 cm
4
9 cm
2 2
5
8
9
cm
Maggiore è la migrazione dei frammenti più piccolo è il peso molecolare degli stessi
Infatti la mobilità elettroforetica è inversamente proporzionale al log del peso molecolare.
ALIMENTATORE
CELLA ELETTROFORETICA
PETTINE
VASSOIO
POZZETTI
POZZETTI
XC (XILENE CIANOLO) BPB
(BLU DI BROMOFENOLO)
TRANSILLUMINATORE A UV
MARKER
Standard
DNA
Se il DNA di partenza è molto lungo e dà quindi origine a molti frammenti in seguito a restrizione, il gel può mostrare un’unica banda diffusa, nella quale sono presenti frammenti di ogni possibile lunghezza che si fondono insieme . Questo è il tipico risultato che si ottiene digerendo un DNA genomico.
MAPPE DI RESTRIZIONE
MAPPATURA DI RESTRIZIONE La mappatura di restrizione consiste nel determinare l’ordine dei vari frammenti lungo la molecola di DNA
•Digestione parziale: digestione in condizioni sub-ottimali (minori quantità di enzima o tempi di digestione ridotti) •Doppia digestione: si ottiene digerendo una molecola di DNA con due diversi enzimi che riconoscano sequenze differenti contemporaneamente •Marcatura terminale della molecola di DNA prima della digestione.
Doppia digestione
4900 ECO R1 X BAM H1
BAM H1
ECO R1
3.4 2.0
2.0
1.5 1.2
1.2
1.0
1.0
0.7 0.5 B
B
0.2
B E
1000
1200
700
2000
3400 1000
500
200
1500 1200
2000
La mappatura di restrizione è applicabile meglio a molecole piccole che a molecole grandi: il limite superiore dipende dalla frequenza dei siti di restrizione nella molecola da mappare. Se una molecola di DNA è più corta di 50 kb, è possibile normalmente costruire una mappa di restrizione scegliendo un enzima con una sequenza di riconoscimento di sei nt. Questa dimensione è molto al di sotto dei cromosomi batterici o eucariotici e le mappe di restrizione si sono rivelate fondamentali nel dirigere il sequenziamento di questi genomi. Se i genomi batterici ed eucariotici vengono clonati in frammenti di dimensioni inferiori a 50 kb, è possibile costruire delle mappe di restrizione dettagliate come passaggio preliminare al sequenziamento della regione clonata.