Tecniche di Immunoistochimica e Biologia Molecolare applicate alla diagnostica istopatologica
Immunoistochimica • Metodiche utilizzate per identificare costituenti cellulari e tissutali come antigeni in situ, utilizzando anticorpi • Le tecniche di IIC possono essere applicate su cellule isolate su preparati istologici e citologici
Immunoistochimica Alcuni tumori possono essere diagnosticati con un semplice esame istologico, mentre altri per una corretta definizione richiedono l’ausilio di ulteriori indagini: • Istochimiche • Immunoistochimiche • Biologia molecolare
L’immunoistochimica al microscopio
Immunoistochimica Il principio dell’IIC prevede il riconoscimento di un antigene mediante l’utilizzo di un anticorpo specifico.
Antigene L’antigene è una molecola proteica, glicoproteica o lipoproteica capace di di evocare una risposta immune da parte del sistema immunitario. Ogni antigene è costituito da uno o più siti antigenici. Disponendo dell’ anticorpo specifico qualunque antigene può essere evidenziato mediante reazioni di IIC.
DEFINIZIONE EPITOPO 1
DI ANTIGENE
Ogni singolo Ag è costituito da una o più porzioni chiamate epitopi o determinanti antigenici differenti tra loro
Ag EPITOPO 2 EPITOPO 3
ANTICORPO
DEFINIZIONE DI ANTIGENE
L’antigenicità di una molecola dipende dalla sua composizione e conformazione strutturale ed è modificata da tutti i trattamenti fisici e chimici attuati durante la processazione dei campioni
Anticorpi Gli ac sono molecole proteiche (Ig) prodotte dalle plasmacellule in grado di legarsi ad un determinante antigenico. Possono essere: Monoclonali:costituiti da ac identici fra loro e diretti contro lo stesso determinante antigenico Policlonali: costituiti da anticorpi diversi fra loro e diretti contro differenti determinanti antigenici Ibridi: immunoglobuline modificate in modo tale che ciascun frammento abbia specificitĂ per un differente determinante antigenico
Struttura dell’anticorpo Frammento Fc porzione costante specie-specifica
Frammento Fab porzione dell’ Ig in grado di legare l’Ag, è costituito da domini ipervariabili che consentono grande versatilità nel riconoscimento e nel legame con l’Ag (specificità e affinità)
STRUTTURA DI UN ANTICORPO
REAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO Il complesso tra l’antigene e l’anticorpo che si forma nella reazione immune non è di per sé visibile. E’ necessario quindi servirsi di marcatori che direttamente o indirettamente possano evidenziarne la formazione
Markers della reazione immunoistochimica
Attualmente sono impiegati due differenti tipi di tracciante:
•
Fluorescente
•
Enzimatico
Tecniche Immunoistochimiche Tecniche di Immunofluorescenza utilizzano fluorocromi come marcatori della reazione antigeneanticorpo Tecniche Immunoenzimatiche utilizzano enzimi per evidenziare la reazione antigene-anticorpo
Tecniche di immunofluorescenza • Le sostanze fluorescenti maggiormente utilizzate sono: • Isotiocianato di fluoresceina • Tetrametil rodamina • Ficoeritrina • Cianina • Rosso Texas
Immunofluorescenza
CK Rodamina Carcinoma lobulare della mammella CK Fitc
Immunofluorescenza
Metodi di indagine
Metodi diretti Metodi indiretti
Immunofluorescenza Metodo indiretto
Immunofluorescenza Metodo diretto
Immunofluorescenza Metodo diretto
– Tessuto nervoso
Doppia colorazione
Immunofluorescenza Limiti dell’immunofluorescenza -Scarsa possibilità di diluizione degli Ac -Mancanza di informazioni topografiche -Naturale estinzione della fluorescenza -Necessità di osservazione in microscopia particolare Non conservabilità dei preparati
Campi di applicazione dell’immunofluorescenza • Diagnostica nefropatologica • Diagnostica dermatologica • Indagini citoflussimetriche
Immunofluorescenza Nella diagnosi delle patologie renali l’IF diretta permette di identificare Ag e altri fattori presenti nelle strutture glomerulari. La evidenziazione di depositi di immunocomplessi, di frazioni del complemento, di fibrinogeno e la loro distribuzione a livello glomerulare è un fondamentale supporto nella diagnosi differenziale tra le varie glomerulonefriti.
Immunofluorescenza Patologia renale Glomerulonefrite granulare
Pattern granulare IgG
Immunofluorescenza Patologia cutanea
Depositi lineari antianti-C3 Depositi lineari antianti-IgG
Immunofluorescenza Analisi Citofluorimetria
Sospensione cellulare
Immunofluorescenza Tessuto fresco Campionamento Congelamento rapido in azoto liquido
Sezioni di 44-5 µ al microtomo congelatore Asciugare le sezioni all’aria
Conservazione a -80
Sezioni non utilizzate
Fissare in acetone per 10’ Lavare con PBS
Colorazione
Congelamento Il congelamento permette di conferire al campione di tessuto una rigidità tale da consentire l’allestimento di sezioni sottili (25 µ) permette inoltre di: • Stabilizzare le strutture cellulari • Mantenere inalterate le caratteristiche di antigenicità del tessuto • Non interferire nella reazione Ag-Ac.
Congelamento La biopsia chirurgica viene inglobata in una particolare resina chiamata OCT che ha la proprietĂ : - Solidificare a basse temperature - Preservare il tessuto - Formare un supporto rigido necessario per il taglio delle sezioni.
Congelamento Il metodo maggiormente utilizzato è quello di immergere il tessuto per alcuni secondi in azoto liquido che essendo alla temperatura di –196°C consente un rapido congelamento senza provocare danni alla struttura antigenica e all’architettura morfologica
Tecnica per If diretta Tessuto fresco Campionare
Congelare Tagliare al criostato Sezioni di 4 µ su vetrini con adesivo o polarizzati Asciugare le sezioni all’aria Fissare con acetone a 4°C Lavare con tampone Incubare con Ac primario fluorescinato 1 ora Lavare con tampone Montare con un sistema acquoso e conservare al buio Osservare al microscopio a fluorescenza
Immunoistochimica tecniche e metodi La tecnica Immunoenzimatica prevede l’uso di enzimi legati direttamente o indirettamente all’Ac I° per evidenziare la formazione del complesso immune. L’enzima catalizza la formazione di un precipitato colorato e insolubile visibile al microscopio, nel sito in cui è avvenuta la reazione Ag-Ac
EVIDENZIAZIONE DEL COMPLESSO IMMUNE
A seconda del tracciante enzimatico: • IMMUNOPEROSSIDASI
• IMMUNOFOSFATASI • IMMUNOGLUCOSIDASI • IMMUNOβ β−GALATTOSIDASI
Perossidasi • E’ ottenuta dal rafano ma è presente anche nei tessuti umani • Può formare legami covalenti con le immunoglobuline • Suo substrato è il perossido di idrogeno 2 H2O2
2H2O+O2
elemento ossidante per il cromogeno
Immunoperossidasi
Il cromogeno più utilizzato è la DAB che da un prodotto di ossidazione insolubile e colorato in bruno. L’insolubilità e la stabilita del prodotto di ossidazione della DAB consentono il montaggio e l’archiviazione dei preparati dei preparati secondo le tecniche di routine.
Immunoperossidasi Altri substrati come ad es. l’ AEC fornisce un prodotto di osssidazione rosso, è liposolubile e fotosensibile rendendo necessaria la conservazione al buio nonchÊ la documentazione fotografica
Metodi immunoenzimatici I metodi immunoenzimatici possono essere: Diretti Indiretti Il metodo diretto scarsamente sensibile non viene utilizzato nei laboratori di Anatomia Patologica
Metodi Immunoenzimatici Il metodo indiretto: •E’ estremamente sensibile e ha il vantaggio che un solo anticorpo II° marcato può essere utilizzato per riconoscere diversi anticorpi I° appartenenti alla stessa specie.
Perossidasi La scelta del cromogeno si pone tra
DAB - Cancerogena - Origina un precipitato marrone insolubile nei solventi organici
AEC - Non cancerogeno - Origina un precipitato rossiccio solubile nei solventi organici
Fosfatasi alcalina • Si ottiene dall’intestino di bue • Substrati sono gli esteri fosforici alfa-naftilfosfato e naftolo AS-TR fosfato • Cromogeno è un sale di tetrazolio • Conferisce una colorazione rossa
Immunoistochimica Tecniche e metodi
Enzima + substrato cromogeno
Prodotto colorato
Metodi Immunoenzimatici Diretto
Ac I째 marcato Semplice e rapido
Indiretto
Ac I째 non marcato Ac II째
Storia dell’immunoistochimica dell’immunoistochimica • 1941 Coons Coons:: – Anticorpi marcati con fluoresceina per localizzare antigeni in sezioni di tessuto • 1966 Nakane Nakane:: – Anticorpi marcati con enzimi • 1970 Sternberger Sternberger:: – Perossidasi erossidasi--Anti Perossidasi (PAP) • 1981 Hsu Hsu:: – Avidin Biotin Complex (ABC) • 1984 Cordell Cordell:: – Alkaline Phosphatase Anti Alkaline Phosphatase (APAAP) • 1989 Bobrow Bobrow:: CSA-TSA) – Catalysed Reporter Deposition (CARD CSA• 1993 Bisgaard – Polimeri del destrano
Perossidasi AntiAnti-Perossidasi Antigene Anticorpo primario Anticorpo secondario Enzima Complesso PAP
Metodi Immunoenzimatici Il sistema Avidina Biotina (ABC) si basa sulla straordinaria affinità fra l’avidina, una glicoproteina con p.m. 68.000 D presente nell’albume d’uovo e la biotina piccola molecola vitaminica. In particolare la biotina si lega ai gruppi aminici -NH2 degli Ac e della Pr di modo che più molecole di biotina corrispondono a ciascuna molecola di Ig
Metodo ABC
LSAB Labelled Streptavidin Biotin (Peroxidase) Press left mousebutton
Metodo ABC • Antigene • Anticorpo primario • Anticorpo secondario biotinilato • Complesso ABCABC-Pr
Sistemi avidina avidina--biotina biotina:: vantaggi • Alta affinità dell’avidina dell’avidina per la biotina • E’ possibile ottenere un elevato rapporto fluorocromo/enzima fluorocromo /enzima--proteina • Elevata amplificazione • L’ L’avidina avidina coniugata è molto stabile • Un singolo coniugato marcato può essere utilizzato in molteplici metodiche • Basso costo
Sistemi avidina avidina--biotina biotina:: svantaggi • Biotina endogena • Reazione con multipli passaggi
Polimeri del destrano
Polymer Detection Polymer Detection Pre ss left mousebutton Press left mouse button
Metodi Immunoenzimatici Polimeri del destrano Antigene Anticorpo primario Anticorpo secondario secondariopolimeropolimero -enzima
Polimeri del destrano: destrano: vantaggi • Ottima sensibilità • Nessuna interferenza legata alla biotina • Tempi di reazione ridotti
Catalyzed Signal Amplification
Catalyzed Signal Amplification •Tiramide biotinilata
•acqua ossigenata
Catalyzed Signal Amplification
Catalyzed Signal Amplification
CARD: vantaggi • • • •
Altissima sensibilità Aumenta la diluizione di anticorpi primari 05 Utilizzo di anticorpi non usualmente reattivi Possibilità di utilizzo in svariate metodiche (ibridazione in situ, FISH, etc) • Numerosi apteni utilizzabili
Metodi Immunoenzimatici Doppie colorazioni Permettono di evidenziare contemporaneamente nella stessa cellula due o pi첫 antigeni diversi utilizzando differenti substrati cromogeni e differenti enzimi
Colorazioni doppie TCRBCL: CD20/CD54R0
Doppia colorazione
Inibizione di enzimi endogeni Applicando metodiche di immunoistochimica enzimatica è necessario ricordare che alcuni enzimi utilizzati come traccianti possono essere presenti nel tessuto da analizzare, è necessario perciò inibire l’enzima endogeno senza danneggiare le proprietà antigeniche.
Trattamento del materiale istologico e citologico da sottoporre ad indagini di IIC
Dall’effettuazione del prelievo bioptico o citologico al momento dell’esame microscopico dei preparati colorati con reazioni immunoistochimiche intervengono diversi fattori che possono influenzare i risultati e portare a false interpretazioni dei quadri patologici
Trattamento del materiale I campioni bioptici da sottoporre ad indagini di IIC vengono trattati secondo le normali procedure per l’allestimento delle sezioni per la diagnostica istomorfologica e cioè • Fissazione
• Disidratazione e chiarificazione • Inclusione in paraffina • Taglio al microtomo
Fissazione Gli scopi principali della fissazione sono: • Preservare la morfologia cellulare e l’architettura tissutale • Permettere al campione di tollerare gli stress della processazione • Mantenere un buon grado di reattività per le colorazioni tradizionali • Preservare l’integrità antigenica • Mantenere le molecole antigeniche nella loro posizione originale
Fissazione Tra i fissativi quello maggiormente impiegato è la formalina neutra tamponata (10%), (10%), che permette il miglior compromesso tra stabilità , costo, preservazione di molti antigeni, buona morfologia.
Azione della formalina La fissazione con formalina determina legami crociati tra il liquido fissativo e gruppi attivi delle proteine, con mascheramento di molti siti antigenici.
Trattamento del materiale istologico •Azione della formalina sulle proteine del tessuto Proteina naturale
Proteina denaturata
Reticolazione
Trattamento del materiale istologico Azione della formalina sulle proteine del tessuto
Prima della fissazione
Dopo fissazione
Tempi e modalità di fissazione variabili preanalitiche • Primo obiettivo di standardizzazione • Fissare immediatamente il campione • Un ritardo determina degradazione
proteolitica con diffusione dell’antigene e ridotta o assente immunocolorazione • Evitare una fissazione prolungata • Tempi non superiori alle 24 ore • Condizionano l’immunoreattività tissutale
Tempi e modalitĂ di fissazione variabili preanalitiche Ritardo della fissazione
Er
Procedure di ripristino dell’antigenicità I processi a cui sono sottoposti i tessuti o le cellule dal momento del prelievo all’effettuazione della reazione di IIC possono danneggiare l’antigenicità rendendo:
• Inaccessibile l’Ag all’Ac • Modificando parzialmente l’antigenicità • Modificandola in modo irreversibile
Ripristino dell’antigenicità La reattività immunologica può essere ripristinata rompendo questi legami crociati o con un trattamento Enzimatico Alte temperature
Trattamento enzimatico Gli enzimi proteolitici rompono i legami aldeidici rendendo i siti antigenici disponibili per il relativo Ac. Quelli maggiormente utilizzati sono: • Pepsina • Proteasi XXIV • Tripsina • Proteinasi K
Trattamento enzimatico L’incubazione con uno di questi enzimi può avvenire a temperatura ambiente o a 37°C per un periodo di tempo variabile (5-30’) e dipende: • concentrazione • durata della fissazione • spessore della sezione • tipo di enzima
Ripristino dell’antigenicità A partire dagli anni 90 l’uso del calore ha largamente sostituito i metodi enzimatici. Le alte temperature sono in grado di ristabilire l’originale struttura proteica dopo che questa è stata modificata dalla fissazione in formalina
Metodi di recupero dell’antigenicità • Come effettuare lo smascheramento Recupero a caldo • • • •
Forno a microonde Pentola a pressione Bagno termostatato Autoclave
Efficienza dei metodi di recupero dell’ antigenicità Fattori che condizionano lo smascheramento antigenico in mezzo liquido Tempo di riscaldamento
T (°C) x t (min.) pH
-Ag indifferenti al pH della soluzione -Ag buoni risultati a pH acido -Ag buoni risultati a pH basico
Smascheramento IntensitĂ di colorazione aumenta aumentando i tempi Recettore per estrogeni
10’
Smascheramento Recettore estrogeni
20’
’
Smascheramento Recettore per estrogeni
30’
Efficienza dei metodi di recupero dell’antigenicità • Tempo/Temperatura • A parità di trattamento il tempo e la temperatura alla quale le sezioni vengono sottoposte giocano un ruolo fondamentale per il raggiungimento di un risultato ottimale • Casi con reattività debole o incerta possono diventare chiaramente positivi se esposti al calore per un periodo più lungo • Viceversa casi sicuramente negativi restano tali anche dopo esposizione prolungata al calore
Metodi di recupero dell’antigenicità • • • • •
Soluzioni utilizzate Tampone citrato 0.01 M pH6 Tampone EDTA pH 8-9 Tampone glicina Acqua distillata
FASI DELLA COLORAZIONE IIC SPARAFFINARE REIDRATARE
PRETRATTAMENTO
INIBIZIONE
Ac I째 Ac II째
ABC-ENZIMA
CROMOGENO
CONTRASTO
MONTAGGIO
OSSERVAZIONE
Interpretazione dei risultati Una delle maggiori difficoltà dell’immunoistochimica sta nell’interpretazione dei risultati. La presenza di deposizione di substrato cromogeno in corrispondenza di una cellula o di un tessuto, spesso, dovrebbe significare che in quella sede è avvenuta una reazione tra l’anticorpo e l’antigene tissutale. Questo è vero nella maggior parte dei casi, tuttavia altri eventi definiti artefatti, possono essere responsabili della colorazione
Interpretazione dei risultati
Le cause più comuni di colorazioni dovute ad artefatti sono: •Presenza di perossidasi o fosfatasi (già presenti nel tessuto ) non adeguatamente inibite. •Cross Cross--reattività dell’anticorpo I° I° con un antigene diverso da quello in studio. •Legame aspecifico dell’anticorpo alla cellula o tessuto (attraverso il frammento Fc o per carica elettrica) •Inadeguata fissazione del tessuto. Scarsa fissazione provoca un eccesso di “fondo “; eccesso di fissazione provoca una ridotta sensibilità
Pattern di colorazione Esistono alcune strategie che possono aiutare a distinguere una colorazione immunoistochimica specifica da una non specicifica o legata ad artefatti L’interpretazione dei risultati in IIC deve tenere conto del tipo di positività attesa per un determinato Ab che può essere di quattro tipi:
• Nucleare • Citoplasmatica • Di membrana
• Extracellulare
Pattern di colorazione
• NUCLEARE • CITOPLASMATICO • DI MEMBRANA
Campi di applicazione
L’approccio diagnostico immunoistochimico deve essere condotto con razionalità scegliendo, sia il tipo di materiale piÚ idoneo, sia gli anticorpi da utilizzare, secondo un algoritmo appropriato
Campi di applicazione Si definisce algoritmo immunoistochimico la successione logica nella selezione degli anticorpi da utilizzare al fine di giungere alla diagnosi. Esiste un algoritmo primario che consiste nell’utilizzo di un pannello di anticorpi che consente di identificare la neoplasia
Campi di applicazione Le positività riscontrate con l’algoritmo primario consentono di applicare un algoritmo secondario al fine di classificare adeguatamente la neoplasia. Raramente si rende necessario l’utilizzo di un ulteriore algoritmo
Campi di applicazione “IHC” • Marcatori di differenziazione • “Colorazione speciale” • Marcatori di neoplasia • Marcatori di agenti infettivi • Fattori prognostici
Marcatori di differenziazione • Natura della popolazione cellulare • Linfomi B/T • Epiteliale vs. mesenchimale • DD melanoma amelanotico • Mesotelioma vs adenocarcinoma
Marcatori di differenziazione • Sottoclassificazione linfomi • Sottoclassificazione neoplasie mesenchimali • Differenziazione endocrina
Colorazione speciale • Individuazione tipi cellulari specifici: cellule sustentacolari, cellule follicolari dendritiche ecc.
CD21 - cellule FD
Marcatori prognostici • Ag regolatori del ciclo cellulare (Mib (Mib--1, cicline) • Recettori ormonali (Er, Pr) • Prodotti di oncogeni e geni oncosoppressori (Erb (Erb--B2, Myc) • Ag legati all’invasività (E (E--caderina)
Marcatori immunoistochimici di riconosciuta validità clinica • ER, PR • Proliferazione – Ki67 • HER HER--2 • KIT • EGFR
CARCINOMA DELLA MAMMELLA Fattori prognostici/predittivi Il carcinoma della mammella, viene caratterizzato con lo studio di: Parametri morfologici Grandezza del tumore,istotipo,infiltrazione, grado di differenziazione, presenza o meno di linfonodi metastatici Parametri biologici (non puramente morfologici) • Attività proliferativa (MIB1) • Assetto ormonale (ER,PR) • Prodotti di oncogeni (HER2)
Carcinoma della mammella Fattori pronostici Per caratterizzare i parametri biologici si impiegano metodiche: Immunoistochimica che permettono di evidenziare sostanze di natura proteica presenti nei tessuti
Ibridazione in situ (FISH e CISH) identificazione di una sequenza di acido nucleico in tessuti o cellule
Marcatori prognostici/predittivi
• Validità clinica Estrogeni-Progesterone Mib1 Cerb-2 Queste indagini sono svolte su tutte le neoplasie perché complementari non solo all’interpretazione istopatologica ma anche per le relative implicazioni terapeutiche
Scelta degli anticorpi Estrogeni
Scelta degli anticorpi Progesterone
Scelta degli anticorpi KI67 (Mib1) Valutazione dell’attività proliferativa delle cellule neoplastiche e normali. Si utilizza un Ac monoclonale ki67 (clone MIB1) che riconosce un antigene nucleare presente in tutte le fasi attive del ciclo cellulare
Scelta degli anticorpi Mib1
Scelta degli anticorpi C-erb-B2 L’anticorpo reagisce con l’oncoproteina C-erb-B2 su tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. La colorazione è localizzata nelle membrane cellulari delle cellule neoplastiche
Her-2
Kit standardizzati
Devono essere eseguiti accuratamente
Valutazione dello stato di HER2/neu Attualmente sono disponibili numerosi sistemi per valutare lo stato di HER2/neu (Southern Blot, Dot Blot, PCR quantitativa). I più frequentemente utilizzati sono la dimostrazione dell’iperespressione di HER2 mediante indagine immunoistochimica (IHC) e dell’amplificazione mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH).
Carcinoma della mammella: valutazione dello stato di HER-2/Neu Her 2/neu/c-erbB-2 appartiene alla famiglia dei recettori per i fattori di crescita. E’ un componente della via di trasduzione del segnale coinvolto nella crescita cellulare. La sua localizzazione extra-cellulare lo rende un possibile bersaglio farmacologico.
Valutazione dello stato di HER2/neu I campioni con intensa positivitĂ per Her-2 (IHC 3+) sono elegibili per la terapia con Herceptin. I campioni IHC 2+ devono essere ritestati con altro metodo, preferibilmente con indagine FISH. I campioni sono inizialmente testati mediante IHC.
HER2/NEU EXPRESSION IHC - HercepTest
2+
3+
Vysis (PathVysion) - Dakocytomation HER-2/DNA probes Permettono di valutare l’ amplificazione del gene HER-2 mediante FISH. Entrambe le metodiche prevedono l’utilizzo di due sonde a DNA marcate con sostanze fluorescenti:
HER-2 che identifica l’ intero gene HER-2 marcato con Spectrum Orange® CEP 17 è marcato con Spectrum Green® e si ibridizza con il DNA alfa-satellite localizzato in corrispondenza del centromero del cromosoma 17 (17p11.1-q11.1)
HER-2/NEU - FISH
HER2/NEU AMPLIFICATION Low Level
High Level
Problemi metodologici • Tecniche di smascheramento antigenico • Cloni utilizzati • Sensibilità dei sistemi di rivelazione • Scoring methods • Controlli di qualità
Marcatori di neoplasia • bcl bcl--2 - linfomi follicolari vs iperplasia follicolare • Ciclina D1 - linfoma mantellare • p53 • p80 - ALCL
Marcatori di neoplasia
Bcl2
Marcatori di differenziazione • Determinazione della sede primitiva di una neoplasia metastatica – Profilo cheratine – Marcatori melanocitari – TTF1 ecc...
Applicazioni microbiologiche • Identificazione di virus • Identificazione di batteri HPV
Helicobacter Pylori
HPV e carcinoma della cervice .
Tra gli agenti virali
un posto di rilievo è assegnato allo Human Papilloma Virus (HPV)
Numerosi studi
epidemiologici hanno dimostrato un innegabile legame tra infezione da HPV e sviluppo del carcinoma della cervice uterina
HPV e oncogenesi cervicale •Sono stati identificati 100 genotipi di cui 40 presentano tropismo per il tratto anogenitale •Vengono suddivisi in tre categorie che ne identificano il diverso potenziale oncogeno
Alto rischio (16, 18 ) Rischio intermedio (31,33,35,51,58) Basso rischio (6, 11, 34,42,61,68)
Colorazione IIC per HPV
Ibridazione in situ • Ibridazione in situ
ISH
HPV 16-18
PCR 1) Estrazione del DNA • Le sezioni raccolte in un tubo sterile sono state sparaffinate, reidratate e incubate per tutta la notte con proteinasi K a 37°C • Inattivazione della proteinasi K a 95°C per 30’ 2) Reazione di PCR Preparare una miscela di amplificazione contenente: H2O, dNTP, MgCl2, Taq-polimerase templato
PCR La PCR avviene attraverso una serie di cicli composti da tre fasi: Denaturazione Annealing Allungamento Termociclatore computerizzato opportunamente programmato
PCR P.M.
Contr- Contr+
-
+
+
Elettroforesi su gel di agarosio
+
Ibridazione inversa
Tipizzazione genotipica di HPV
Campi di applicazione
PossibilitĂ di individuare i ceppi coinvolti PossibilitĂ di individuare lesioni latenti o preneoplastiche
UtilitĂ nello screening preventivo
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie neoplastiche CITOCHERATINE • Famiglia di proteine che costituiscono la maggior parte dei filamenti intermedi del citoscheletro delle cellule epiteliali. • In base al peso molecolare che varia da 40 a 67 kD sono numerate da 1 a 20 • La loro evidenziazione in una cellula normale o neoplastica depone quindi per una origine epiteliale
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie neoplastiche CITOCHERATINE • Sono espresse in modo caratteristico nei diversi tipi di epiteli normali e/o neoplastici Es:
CK7
+ ADK polmone -ADK colon
CK20
- ADK polmone + ADK colon
• In IIC vengono utilizzati Ac diretti contro le singole CK o cocktail di Ac variamente allestiti per identificare CK a basso/medio/alto peso molecolare
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie neoplastiche CITOCHERATINE
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie S-100 • L’anticorpo reagisce con una proteina presente in numerose linee cellulari (cellule muscolari striate e cardiache, melanociti, elementi gliali)
• E’ positiva nei mioepiteli ma non è un marcatore specifico
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie S-100
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie Actina del muscolo liscio • E’ un componente del sistema contrattile cellulare; è espressa dalle cellule mioepiteliali ma anche dai miofibroblasti stromali • L’Ac diretto contro l’actina identifica quindi tutti gli elementi normali o neoplastici che presentano una struttura contrattile di tipo muscolare
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie •Actina del muscolo liscio Sono stati identificati sei tipi di actina a seconda del tessuto muscolare di origine riconosciuti da Ac differenti -alfa actina muscolo liscio -alfa actina muscolo scheletrico e cardiaco -alfa actina muscolo liscio, mioepiteli, miofibroblasti
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie •Actina del muscolo liscio
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie Calponina • E’ una proteina che regola la contrazione delle cellule muscolari lisce • E’ un marcatore molto sensibile delle cellule mioepiteliali. Mostra moderata crossreattività con i miofibroblasti • Positività citoplasmatica
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie Calponina
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie • E-Caderina • Le caderine sono una famiglia di proteine di adesione cellulare. Formano complessi con le proteine citoplasmatiche chiamate catenine.Questi complessi insieme con altri componenti del citoscheletro,tra cui l’actina, sono parte essenziale del sistema di adesione intercellulare e quindi coinvolti nella invasività delle cellule tumorali
Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie • E-Caderina