Lezione 7 il test all'antiglobulina diretto positivo e aea

Il test all’antiglogulina diretto (TAD o Coombs diretto) positivo

Prima di iniziare, un’altro alloanticorpo‌

Caso 4

Caso 4

3+ 2+ -

Caso 4

C 3+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+ 2+ 2+ -

Caso 4

C F - - 3+ 3+ 2+ 3+ 2+ 3+ 3+ 3+ 2+ 3+ 2+ 3+ 2+ 3+ 2+ 3+ - -

-

Caso 4: Gruppo e fenotipo del paziente

0 Rh pos, CCDee La probabile specificità anticorpale è…….

Caso 5

2+ 2+ 2+ 2+

Complemento • Il sistema del complemento è costituito da più di 15 componenti la cui attivazione sequenziale e associazione in elementi funzionale porta a 3 importanti effetti:

• Rilascio di peptidi attivi nell’infiammazione • Deposito di C3b sulla superficie di membrana, un sito di attacco per i fagociti (opsonina) • Lisi cellulare

• Insieme giocano un importante ruolo nei confronti delle infezioni

• siero: fase fluida • superficie cellulare: luogo dove avviene l’attivazione e la ‘costruzione’ delle unità funzionali

• l’attivazione del complemento può avvenire come conseguenza del riconoscimento nell’ambito della immunità adattativa oppure innata • VIA CLASSICA (adattativa). Iniziata da una reazione Ag-Ab (IgG1, IgG3 o IgM) sulla superficie cellulare • VIA ALTERNATIVA: attivazione delle componenti del complemento direttamente da polisaccaridi o PRR sulla superficie di alcuni batteri

• Ioni calcio e magnesio sono necessari per alcune fasi dell’attivazione

• funzionamento con il meccanismo a cascata: un singolo evento di attivazione può portare ad una serie di eventi

• l’attivazione avviene solitamente sulla superficie cellulare ed è limitata in quanto i componenti hanno vita breve e sono presenti inattivatori • Via classica: Ag-Ab legano C1+C2+C4 • il complesso agisce come ‘convertasi’ che scinde C3 • C3 è l’elemento centrale di tutte le reazioni del complemento • C3a (piccolo frammento), C3b (grande) • una porzione del C3b si deposita sulla membrana e funge da attacco per fagociti • C2a+C4b+C3b=convertasi per C5 • C5a anafilotossina

• C5b: inizia la costruzione del complesso C6+C7+C8+C9 che porta al Membrane Attack Complex

TAD • Si esegue per determinare se i globuli rossi sono sensibilizzati in vivo da:  immunoglobuline  complemento entrambi

Condizioni in cui il TAD può essere + • autoanticorpi contro i GR • alloanticorpi contro GR trasfusi • anticorpi contro farmaci adesi alla membrana dei GR

• anticorpi presenti in emocomponenti trasfusi che aderiscono ai GR dei riceventi • anticorpi prodotti da passenger lymphocytes presenti in organi o tessuti trapiantati • alloanticorpi materni che attraversano la placenta e aderiscono alle membrane dei GR fetali • globuline che aderiscono aspecificamente alla membrana dei GR • fissazione del complemento sulle emazie che può essere dovuta all’attivazione del complemento (alloAb, autoAb, farmaci, infezioni)

Il TAD + NON indica necessariamente che i GR sensibilizzati hanno una sopravvivenza ridotta

• I globuli rossi di soggetti sani hanno da 5 a 90 molecole IgG adese/GR. Hanno inoltre da 5 a 40 molecole di C3d.

• Con questi numeri, il TAD è negativo poiché il limite di sensibilità del test è 100 a 500 molecole di IgG/GR e 400 a 1.100 di C3d

• Da 1 a 15% dei pazienti ricoverati in ospedale ha un TAD+ • la maggioranza dei pazienti con TAD+ non ha segni di emolisi • alcuni pazienti tuttavia presentano un aumento della distruzione dei GR

TAD+ è associato a: • anemia

falciforme

• beta talassemia • nefropatie

• malattie autoimmuni • mieloma multiplo • AIDS

TAD: note metodologiche • campione di sangue in EDTA, per prevenire la fissazione del complemento in vitro

• iniziare con un siero antiglobuline polispecifico (AHG) in grado di rilevare sia le IgG che il C3d • se si esamina un campione di emazie del cordone ombelicale è opportuno l’uso del siero anti-IgG • se positivo, procedere con reagenti monospecifici per le IgG e C3d

TAD + : note metodologiche • procedere con reagenti monospecifici per le IgG e C3d

• esaminare i siero-plasma per rilevare e identificare Ab significativi • esaminare un eluato • L’eluizione stacca gli Ab legati alle emazie sensibilizzate che vengono quindi studiati

• quando un eluato reagisce con tutte le emazie del pannello, si tratta probabilmente di un autoanticorpo

TAD + : note metodologiche

• quando non sono presenti nel siero anticorpi inattesi e se il paziente non è stato trasfuso di recente, non è necessaria alcuna altra indagine sull’autoanticorpo

TAD+ Informarsi con il curante in merito a: • diagnosi • farmaci recenti • gravidanze in atto • anamnesi trasfusionale • segni di anemia emolitica • trapianti

Emolisi immuno-mediata • riduzione della sopravvivenza dei GR dovuta a meccanismi effettori della risposta immune

• se il midollo osseo compensa la distruzione delle emazie, non si verifica anemia • non tutte le anemie emolitiche sono di natura immune • la diagnosi di anemia emolitica si basa sulla clinica e su test di laboratorio (Hb-Ht, reticolociti, striscio di sangue, bilirubina, aptoglobina, LDH) e talvolta su test di sopravvivenza eritrocitaria

Tipi di emolisi • INTRAVASCOLARE: rilascia Hb libera nello spazio intravascolare (emoglobinemia e emoglobinuria)

• EXTRAVASCOLARE: più comune. Aumento della bilirubinemia ma non c’è emoglobinemia ne emoglobinuria

Tratto da: Technical manual AABB, 15째 edizione

Anemia emolitica autoimmune (AEA) da anticorpi caldi 1

• E’ l’AEA più comune, associata ad anticorpi che reagiscono a 37°C

• TAD con monospecifici: da IgG, da C3d oppure da entrambi • SIERO: • gli auto-Ab sono di classe IgG e spesso reagiscono contro tutte i GR del pannello nel TAI

• se tutto l’Ab è auto-assorbito, nel siero può essere evidenziato solo un basso titolo anticorpale • L’auto-Ab diventerà evidente solo dopo aver ‘saturato’ tutti gli antigeni eritrocitari.

Anemia emolitica autoimmune da anticorpi caldi 2 • ELUATO: solitamente reagisce con tutti i GR del pannello, con un incremento della reattività quando si utilizzano emazie pretrattate • Specificità anticorpali: complesse, frequentemente difficili da risolvere. Talvolta nell’ambito del sistema Rh. In questo caso l’Ab non reagisce con i GR D- - o Rh null.

• Sono stati riferiti auto-Ab nei confronti di Ag dei sistemi LW, Diego, Duffy, Kidd e Kell • Raramente è necessario determinare la specificità di un auto-Ab ai fini trasfusionali

Anemia emolitica autoimmune da anticorpi caldi 3 • TRASFUSIONE: • i pazienti con sintomi moderati di emolisi tollerano bene le trasfusioni • Se l’auto-Ab è presente nel siero, può mascherare la presenza contemporanea di un ALLO-Ab che è un rischio aggiuntivo • La trasfusione può stimolare la produzione di allo-Ab • Nei pazienti con emolisi attiva, i GR trasfusi possono essere distrutti più rapidamente dei GR del paziente e ciò può portare ad una coagulazione intravascolare disseminata (CID)

Anemia emolitica autoimmune da anticorpi caldi 4

IgM • Esiste una tipologia di AEA caratterizzata da agglutinine calde di classe IgM che reagiscono a 37°C.

• Sono rare ma molto severe. I pazienti affetti hanno una prognosi infausta • difficile eseguire il TAD poiché le emazie tendono ad agglutinare spontaneamente • nel siero, IgM abbastanza deboli. Range termico ottimale tra 20 e 30°C

Tratto da: Technical manual AABB, 15째 edizione

Sindrome da agglutinine fredde (SAF) 1

• 16-32% delle AEA • forma acuta secondaria a malattie linfoproliferative o infezione (Mycoplasma pneumoniae) • forma acuta=pazienti anziani • spesso le agglutinine interferiscono con la tipizzazione AB0 ed Rh. Per evitare questi problemi, è necessario tenere i prelievi in EDTA a 37°C e lavare i GR con soluzione salina a 37°C prima di determinare il gruppo sanguigno

• TAD: in quasi tutti i casi si rileva complemento adeso ai GR

Sindrome da agglutinine fredde (SAF) 2 • L’autoagglutinina fredda è una IgM che agglutina i GR alle temperature del circolo periferico e fa aderire C3 e C4 • quando i GR arrivano in aree dove la temperatura è più alta, le IgM si staccano ma rimane adeso il complemento

• le emazie con adeso il complemento vengono fagocitate dai macrofagi (che hanno il recettore per il C3b) del fegato • SIERO: ci sono IgM reattive a freddo che possono provocare emolisi anche a temperature > 32°C, quindi causano AEA • ELUATO: non è utile poiché solitamente non ci sono immunoglobuline adese ai GR

Sindrome da agglutinine fredde (SAF) 3 • Specificità: spesso anti-I, ma non ha un significato diagnostico

• esami pre-trasfusionale: servono per verificare che non ci sia un alloanticorpo oltre all’agglutinina • autoassorbimento a freddo può allontanare gli autoanticorpi e consentire la determinazione dell’eventuale alloanticorpo • esiste un test in commercio che rimuove gli autoanticorpi anti-I mediante l’utilizzo di stromi di coniglio

Tratto da: Technical manual AABB, 15째 edizione

Anemia emolitica autoimmune (AEA) mista

• AEA da anticorpi caldi+autoagglutinine a freddo.

• Due tipi: • pazienti con autoanticorpi freddi IgM ad alto titolo con ampio range termico • Pazienti con titolo normale ed ampio range termico • TAD: IgG e C3d positivo

• Siero: IgG reattive a caldo+IgM • Eluato: dovrebbe evidenziare un IgG reattiva a caldo • Specificità: anti-I per l’Ab freddo. Difficilmente chiara specificità per l’Ab caldo

Tratto da: Technical manual AABB, 15째 edizione

Emoglobinuria parossistica a frigore 1

• Solitamente secondaria ad una infezione virale nell’età pediatrica

• negli anziani forma cronica • E’ causata da un auto-Ab IgG che reagisce a freddo e fissa il complemento. Si comporta come l’IgM fredda, ovvero si fissa ai GR quando questi circolano nelle zone più fredde del corpo e poi si stacca quando i GR circolano in zone più calde, lasciando però fissato il complemento • TAD: positivo per i complemento (ma se si lavora a freddo, si può evidenziare anche l’IgG

• Siero: EMOLISINA BIFASICA

Emoglobinuria parossistica a frigore 2

• ELUATO: quasi sempre negativi • SPECIFICITA’: anti-P

• TRASFUSIONE: più frequente nei bambini. Il sangue P negativo è rarissimo. Non aspettare la ricerca del sangue compatibile

Tratto da: Technical manual AABB, 15째 edizione

Anemia emolitica autoimmune (AEA) TAD negative

• Non si riece ad evidenziare l’auto-An ne sulla superficie dei GR ne nel siero

• IgA o IgM? • Ab a bassa affinità si staccano durante il lavaggio • lavare con soluzione fredda o LISS freddo • poche molecole anticorpali sulla superficie dei GR

Tratto da: Technical manual AABB, 15째 edizione

Anemia emolitica da farmaci 1 • la somministrazione di farmaci talvolta induce la formazione di autoanticorpi verso il farmaco o verso antigeni eritrocitari intrinseci che possono: • determinare un TAD +

• distruggere i GR • Entrambe le situazioni • gli Ab prodotti possono essere DIPENDENTI dal farmaco o INDIPENDENTI

Tratto da Anemie emolitiche autoimmuni: diagnosi e terapia. W. Barcellini, M.A. Villa, N. Revelli, A. Zanella. Inserti Cultura Ortho Diagnostic Systems

Anemia emolitica da farmaci 2 • TAD IgG nel 94% dei casi, IgG+C3 nel 6%

• IgG nell’eluato. Simile alle AEA da Ab caldi.

• Specificità nell’ambito del sistema Rh (spesso) • A volte è necessario eseguire le ricerche di anticorpi in presenza del farmaco

• L’elenco dei farmaci descritti come possibili cause di AE è molto lungo e comprende analgesici, antipiretici, antiinfiammatori, antitubercolari, antibatterici, antimicotici, anibiotici, antistaminici, diuretici, antiipertensivi, inibitori tiroidei, antineoplastici, sedativi, ipnoinduttori, epatoprotettivi, antiaritmici, antidiabetici, immunosprressori ecc.

Tratto da Anemie emolitiche autoimmuni: diagnosi e terapia. W. Barcellini, M.A. Villa, N. Revelli, A. Zanella. Inserti Cultura Ortho Diagnostic Systems

Tratto da: Technical manual AABB, 15째 edizione