MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Unidad VIII
Cultivo de microorganismos en el laboratorio Muestra Ambiental Inoculaci贸n Aislamiento Identificaci贸n Bioqu铆micas Tinci贸n Microscopia
Toma de muestras
Materiales estériles Uso de guantes, cubrebocas Toma de muestras Conservación de las muestras
Medios de cultivo Macronutrientes necesarios
Medios de cultivo Micronutrientes necesarios
Medios de cultivo Factores de crecimiento
Medios de cultivo Soluciones nutritivas que se utilizan en el laboratorio para el cultivo de microorganismos.
QUIMICAMENTE DEFINIDOS
COMPLEJOS
Medios de cultivo Medios de Cultivo para microorganismos que requieren nutrimentos simples o complejos
Preparación de los medios de cultivo
• • • • • •
Los medios sólidos se preparan igual que los líquidos Se agrega agar al 1.5 % Esterilización de los medios de cultivo Vertido sobre placas de cristal o plástico Solidificación Prueba de esterilidad (incubación)
T茅cnicas de aislamiento Permiten la obtenci贸n de microorganismos a partir de muestras complejas:
SUELO SUELO
AGUA AGUA
ALIMENTOS ALIMENTOS
Técnicas de aislamiento Existen diferentes métodos para aislar microorganismos:
Enriquecimiento Enriquecimiento Métodos de de dilución dilución Métodos Siembra en en placa placa por por extensión extensión Siembra Medios sólidos sólidos por por estría estría en en placa placa Medios
MĂŠtodos de enriquecimiento y aislamiento TECNICA DE CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO Cultivo y aislamiento de microorganismos en medios altamente selectivos. selectivos Las muestras son inoculadas directamente al medio de cultivo. Los restos de materia orgĂĄnica por la muestra puede favorecer el crecimiento de especies que no precisamente son selectivos del medio preparado.
MĂŠtodos de enriquecimiento y aislamiento Aislamiento de Azotobacter
MĂŠtodos de enriquecimiento y aislamiento Columna de Winogradsky
M茅todo de diluci贸n (Numero Mas Probable)
M茅todo de diluci贸n (Numero Mas Probable) 10 ml
1.0 ml
+++ 0.1
+++ Presuntiva C. Totales
0.01
+++ 0.001
0.0001
NMP
Técnica aséptica Serie de procedimientos que evitan la contaminación durante la manipulación de los cultivos, muestras y medios de cultivos estériles.
Técnica estría en placa
Técnica estría en tubo
Siembra en placa por extensi贸n
Siembra en profundidad
Cultivo ax茅nico o puro Medios de cultivo s贸lidos
Cultivos axénicos de alta tecnología Pinzas láser
Identificaci贸n Bioqu铆micas
Identificaci贸n Bioqu铆micas
Identificación TINCIÓN
Identificaci贸n Microscop铆a
Identificaci贸n Microscopio 贸ptico
9
Campo claro
9
Contraste de fases
9
Campo oscuro
9
Fluorescencia
Identificaci贸n
Identificaci贸n
No cultivables
Nuevos m茅todos para cultivar bacterias (Katie Greene) No todos los microorganismos pueden ser cultivables. El cultivo de microorganismos tiene muchas ventajas (se puede aislar de ellos, enzimas o antibi贸ticos). Recreaci贸n de condiciones naturales.
Aislamiento de microorganismos no cultivables simulando un ambiente natural (T. Kaeberlein, K. Lewis, S.S. Epstein) Metodología:
Muestra: Sedimento marino. Medios: 1) Cámaras con sedimento y agua marina, O2, membranas con nutrientes y químicos ambientales. 2) Placas Petri con caseína y caldo marino.
Resultados: * Crecimiento de diferentes formas en una semana. * El 99 % de éstas no eran visibles. * 300 veces más el número de colonias en las cámaras que en las placas Petri. * Microcolonias obtenidas en diferentes meses: 40 35 30 25 20 15 10 5 0
Febrero
Marzo
Junio
Julio
Agosto
Septiembre
Aislaron 11 cepas puras (MSC1, MSC2 y otras 9). * Fueron diferenciadas y detectadas por formas macroscopicas (colonia) por microscopĂa y por tĂŠcnicas moleculares (PCR y 16s rRNA). * En las placas crecieron las cepas MSC1 y MSC2 juntas.
Métodos Moleculares 16s rRNA Ribosoma 70S
Subunidad 50S
Subunidad 30S
5S (120 nucleotidos) 16S (1500 nucleotidos) 23S (2900 nucleotidos)
• 16s rRNA son de aproximadamente 1,500 nucleotidos. • Contienen varias regiones altamente conservadas. • Regiones que consiguen alinear las secuencias adecuadamente. • Pero, presentan suficiente variabilidad de secuencias en otras regiones. • Son excelentes cronómetros filogenéticos.
Genome-enabled Muestras ambientales Células
DNA
mRNA
Proteínas
Cultivo
Secuenciar
Análisis con microsatélites
Proteomics Ambiental
Secuenciación
Genoma Completo
Función de los genes Modelo conceptual de genes
Inferencia de la función Y regulación de las Condiciones ambientales De los genes que se expresan