CROMATOGRAFÍA EN PAPEL: N o t a SEPARACIÓN DE LOS PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS
PRÁCTICA Nº
Es evidente que la mayor parte de lan plantas tienen hojas de color verde, pero no menos evidente es que durante el otoño las hojas cambian su característico color verde por otros como el amarillo, el naranja, el rojo o el marrón. Sabemos que el color verde de una hoja se debe a la presencia en los cloroplastos de un pigmento, la clorofila, pero ¿a qué se deben los otros colores que se manifiestan durante el otoño?
MATERIAL: Hojas (espinaca, acelga, geranio o hiedra) Alcohol etílico de 96º Varilla de vidrio Cuentagotas
Placa de Petri Papel de filtro Tijeras Gradilla con tubos de ensayo Recipiente para baño maría
Mechero Trípode de hierro Rejilla Regla milimetrada
FUNDAMENTO: En realidad, en un hoja, además de la clorofila, existen otros pigmentos que se hallan enmascarados por el intenso color verde manifestado por la clorofila; en una hoja lo que hay es una mezcla de pigmentos con diferentes colores: clorofila-a (verde intenso), clorofila-b (verde), carotenos (amarillo claro) y xantofilas (amarillo anaranjado) en diferentes proporciones. Tanto en Química como en Biología existe una técnica instrumental para separar, aislar, purificar e identificar los componentes de una mezcla compleja, tal técnica recibe el nombre de cromatografía, término que fue introducido en 1903 por el biólogo ruso Mikhail Semyonovich Tswett, pero que ya era empleada en 1850 por F. Frunge. La cromatografía es una técnica de separación de una mezcla de solutos en función de la diferente velocidad con la que se mueve cada uno de ellos a través de un medio poroso, arrastrado por un disolvente en movimiento. Existen diversas técnicas cromatográficas: cromatografía de reparto, cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, etc. La que vamos a utilizar es la primera, la de reparto sobre tiras de papel de filtro. En esta técnica el extracto de pigmentos es arrastrado por un disolvente orgánico que avanza por el papel al ser absorbido por capilaridad, de modo que cada pigmento se separa de los demás según su mayor o menor solubilidad en el disolvente y la diferente atracción por el Nota Tomado del Departamento de Biología y Geología del IES La Estrella (Madrid) http://www.telefonica.net/web2/jmgomsal50/practicas/cromatografia/guion/cromatografia.htm
Cromatografía: separación de pigmentos fotosintéticos
pág 1
sustrato. (las más solubles se desplazarán a mayor velocidad, pues acompañarán fácilmente al disolvente a medida que éste asciende; las menos solubles avanzarán menos en la tira de papel de filtro). Este avance o movimiento del pigmento es un valor fijo y característico de cada uno y se expresa por la constante Rf, que es la relación entre la distancia alcanzada por el pigmento y la distancia alcanzada por el disolvente.
PROCEDIMIENTO: 1.- Preparación previa. Las hojas que se vayan a utilizar habrán estado expuestas a la luz y lavadas o mejor aún, hervidas en agua durante un minuto. 2.- Extracción de pigmentos a. Se corta la hoja en trozos pequeños, despreciando los nervios y se introducen en un tubo de ensayo, al que se añade una cantidad de alcohol (alrededor de 10 cc) suficiente para cubrir los trozos de hoja. b. Poner el tubo al baño maría durante el tiempo suficiente para que el alcohol comience a hervir. ¡¡ATENCIÓN: SER CUIDADOSOS CON ESTA FASE PARA EVITAR QUE EL ALCOHOL SALGA PROYECTADO HACIA EL EXTERIOR DEL TUBO!! c. Se retira el tubo y con ayuda de la varilla de vidrio se maceran los trozos de hoja hasta conseguir que la solución tome un intenso color verde y a la que se llama solución de pigmentos fotosintéticos.
3.- Separación de pigmentos por cromatografía a. Tomar una hoja de papel de filtro de unos 12 x 10 cm. Doblarlo por la mitad, de forma que los bordes mayores coincidan. b. Poner, en una de las dos partes de una placa de Petri, suficiente cantidad de solución de pigmentos fotosintéticos, para que ésta alcance una altura de 2 a 4 mm en la placa. c. Introducir el papel de filtro doblado, formando un diedro, apoyado sobre su lado menor procurando que no toque las paredes de la placa. Dejarlo así durante unos 20 a 25 minutos.
RESULTADOS: 7. Al cabo de este tiempo, observar como han aparecido en el papel de filtro varias bandas de distintos colores, que se corresponden con los pigmentos presentes en las hojas: beta-carotenos, clorofilas a y b, y xantofilas.
Cromatografía: separación de pigmentos fotosintéticos
pág 2
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL: SEPARACIÓN DE LOS PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS
PRÁCTICA Nº
Nota
(segundo protocolo)
MATERIAL: Mortero Tijeras Embudo con papel de filtro Tubo de ensayo en gradilla. Cápsula de Petri o vaso de precipitados Espinacas u hojas verdes.
Capilar o micropipeta (cuentagotas en su defecto) Éter etílico Alcohol metílico puro (CUIDADO, SUS VAPORES SON MUY TÓXICOS)
Tira de papel cromatográfico Wathman (con un buen papel de filtro se obtienen, incluso, mejores resultados).
PROCEDIMIENTO: 1.- Colocar en un mortero trozos de hojas de espinacas lavadas, quitando las nerviaciones más gruesas, junto con 10 o 15 cc de éter etílico. 2.- Triturar sin golpear hasta que el líquido adquiera una coloración verde intensa (utilizar campana de gases a lo largo de toda la práctica). 3.- Filtrar en un embudo con papel de filtro y recoger en un tubo de ensayo (es suficiente con 2 o 3 cc. de solución de pigmentos). 4.- Colocar en la tapadera de una caja de Petri metanol absoluto hasta una altura de 0,5 a 1 cm. 5.- Cortar una tira de papel de filtro de unos 8 cms. de anchura y unos 10 a 15 cms. de altura. 6.- Poner con el capilar en el papel de cromatografía entre 5 y 10 gotas de solución de pigmentos, espaciadas en el tiempo con el fin de que vaya secándose el éter etílico y aumente la cantidad de pigmentos. Las gotas se pondrán siempre en el mismo punto (se puede marcar con un lápiz), situado a nos 2 cm por encima del borde inferior del papel. 7.- Doblar el papel cromatográfico a lo largo y colocarlo en la placa de petri con la mancha de pigmento a 1 cm. de la superficie del eluyente. Podemos sustituir la placa de petri por un vaso de precipitados y fijar el papel cromatográfico con una pinza a un soporte horizontal colocado en el borde del vaso (por ejemplo, una varilla de vidrio). 8.- Esperar unos 30 minutos y observar.
Nota: Tomado del Departamento de Biología y Geología del IES Cerro Milano (Almería) http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~04700259/spip.php?article3 Cromatografía: separación de pigmentos fotosintéticos
pág 3
CUESTIONES Y RESULTADOS 1.- La solubilidad en alcohol de los pigmentos es, de mayor a menor: carotenos, clorofila a, clorofila b y xantofila. Indicar qué pigmento corresponde a cada banda de color.
2. - ¿Por qué empleamos éter etílico para extraer la clorofila?
3. - ¿Qué pigmentos son los más abundantes?
4. - Por encima de las clorofilas aparece más de una banda, ¿qué significado tiene?
5.- Direcciones web http://www.ucm.es/info/diciex/programas/quimica/pelis/barramezclas.html animación de una cromatografía de los pigmentos de una tinta http://es.youtube.com/watch?v=Oy_yTOwyRLM http://es.youtube.com/watch?v=NTDEYX4TtZg
Cromatografía: separación de pigmentos fotosintéticos
pág 4