Métodos Rápidos para el control Microbiológico de Alimentos Vigo, 8 de septiembre del 2011 1
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Necesidades en el análisis de alimentos • Contaminación microbiana: principales problemas asociados al consumo • Las toxiinfecciones alimentarias conllevan un elevado impacto económico (patógenos) • Las alteraciones de alimentos también preocupan a las industrias alimentaria (indicadores ( de calidad)) • Sistemas APPCC es la herramienta de seguridad alimentaria más reconocida • Requiere de un gran número de análisis y obtención rápida p de resultados
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Necesidades en el análisis de alimentos • • • • • • •
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Métodos Mé d cada d vez más á rápidos á id (industrias, (i d i l b laboratorios) i ) Métodos sencillos Métodos fiables Métodos reconocidos Métodos trazables Métodos sensibles Métodos económicos
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos tradicionales/oficiales:
• Largos Surgen los métodos alternativos (rápidos y/o • Elevada manipulación automatizados) • Tediosos
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos: y uno o varios días frente a los • Disminuyen protocolos tradicionales
Métodos automatizados: • Utilización de un equipo que realiza una o varias tareas que habitualmente realiza un técnico
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos Rápidos: Consideraciones generales CARACTERISTICAS DE UN MÉTODO RÁPIDO/AUTOMATIZADO IDEAL ¾Preciso ¾Rápido p yp productivo ¾Económico ¾Aceptable ¾Realización simple ¾Entrenamiento ¾Reactivos comunes ¾R ¾Reputación t ió d de lla compañía ñí ¾Buen servicio técnico ¾Requerimientos de espacio y utilidad óptimos 6
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos Rápidos
Clasificación en áreas de acuerdo a lo que se busca: ¾Sistemas para facilitar la toma de muestras ¾Métodos para ayudar al procesamiento de las muestras ¾Sistemas de cuantificación microbiológica ¾Métodos para identificación y cuantificación de microorganismos ¾Sistemas especiales para análisis de muestras de aguas, ambientales y superficies ¾Sistemas de identificación mediante métodos moleculares ¾Métodos inmunológicos para detección y/o cuantificación de microorganismos ¾Otros métodos misceláneos
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Métodos rápidos para ayudar a la toma de muestras t MUESTREADORES, APLICADORES Muestreo dinámico Estandarización Concepto de trazabilidad
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Métodos rápidos para ayudar al procesamiento de la muestra DILUIDORES Estandarización Aumentan productividad Trazabilidad
PREPARADORES y DISPENSADORES DE MEDIOS DE CULTIVO
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Indicadores de calidad
Recuentos
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos FILM HIDRATABLE: PETRIFILM: 3M ¾Optimizan el espacio de incubación ¾Manual ¾Algunos protocolos Express
Láminas deshidratadas que se rehidratan al inocular la muestra
¾Posibilidad de lector automático ¾Validaciones internacionales
Recuento total Enterobacterias E.coli/Coliformes Mohos y levaduras Staph. Aureus Listeria ambiental 11
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMA TEMPO: bioMerieux •Fácil preparación de muestra Trazabilidad •Trazabilidad •Mismo protocolo para diferentes parámetros •Validaciones internacionales
•Recuento Total •Enterobacterias E t b t i Sistema totalmente automatizado NMP miniaturizado i i t i d Lectura por fluorescencia
•Coliformes E.coli •E.coli •S. Aureus •Mohos y levaduras •Bacterias Lácticas
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Protocolo de trabajo dilu ent X g (or ml)
9X ml
10-1 suspension
Sample p preparation p p Inoculation
Reading & interpretation 13
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation
Protocolo de trabajo
+
=
dilu ent X g (or ml)
9X ml
10-1 suspension
Sample p preparation p p
WIFI
Reading & interpretation 14
Inoculation
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation
Protocolo de trabajo
+
=
dilu ent X g (or ml)
9X ml
10-1 suspension
Sample p preparation p p
WIFI
Reading & interpretation 15
Inoculation
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation
Protocolo de trabajo
+
=
dilu ent X g (or ml)
9X ml
10-1 suspension
Sample p p preparation p
WIFI
Inoculation
RESULTS READING REPORT Reading & interpretation 16
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation
Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMAS BASADOS EN IMPEDANCIA: BACTRAC •Fácil Fá il preparación ió de d muestra t •Lectura automática Más sencillo cuando es “mono-producto” mono producto •Más •Necesaria calibración para recuento •Esterilidad comercial (pasa/no pasa)
Recuento total E t Enterobacterias b t i E.coli/Coliformes Hongos y levaduras Staph. Aureus Ácido Lácticas
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Mide los cambios que producen los microorganismos de un cultivo que alteran las substratos cambiando su conductividad eléctrica y esto varía la impedancia
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Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMAS BASADOS EN CITOMETRIA DE FLUJO AES: Bactiflow •Fácil preparación de muestra •Lectura automática •Rápido •Utilidad: Utilid d yogures, champús, h ú cremas, refrescos, zumos de frutas
Marcaje de las células, detección una una y contaje R Recuento t ttotal t l Enterobacterias Hongos y levaduras Salmonella 18
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Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos Sembradores en espiral y lectores automáticos de colonias Deposición p automática de la muestra líquida en la superficie de un placa rotatoria de agar
•Estandarización •Eliminación de diluciones •Lectura automática Ahorro de tiempo •Ahorro •Trazabilidad
Lectores automáticos de colonias 19
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Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos SISTEMA SimPlate: Biocontrol . Fácil de leer · Consistente y reproducible · Rápido · Fácil Fá il de d preparar · Menos interferencia · Amplio rango de conteo · Tecnología g innovadora
Placa de p plástico circular de 84 pocillos p Lectura por fluorescencia
Recuento total
El número de positivos se convierten en valores l NMP
Coliformes/E.coli Mohos y levaduras Campylobacter
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Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMAS BASADOS EN ATP •Económico •Rápido Utilización en el entorno lácteo: esterilidad comercial •Utilización •Más utilizado en control de limpieza y desinfección
Mide niveles de ATP Lo relaciona con niveles de contaminación
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Pat贸genos
Ausencia/presencia
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M茅todos r谩pidos para el control microbiol贸gico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g PROTOCOLOS CORTOS Salmonella: •Pre-enriquecimiento y placa
•SESAME (BIOSER)
•Manuales
•IBISA ((AES))
•Medios cromogénicos o semisólidos •Validaciones internacionales •Económicos E ó i
•SMS (AES) •SALMONELLA PRECIS (OXOID) •RAPID SALMONELLA (BIORAD) Listeria Monocytogenes:
•Salmonella •Listeria spp •Listeria monocytogenes
•ALOA ONE DAY (AES) •LISTERIA PRECIS (OXOID) •RAPID LMONO (BIORAD) •COMPASS LISTERIA (BIORAD) •CHROMOID LMONO (BIOMEREIUX)
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MĂŠtodos rĂĄpidos para el control microbiolĂłgico de alimentos
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MĂŠtodos rĂĄpidos para el control microbiolĂłgico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA:
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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA Si Sistema VIDAS (bi (bioMerieux) M i ) •Salmonella •Listeria Li t i spp/Listeria /Li t i monocytogenes
•Equipo automatizado
•Campylobacter py spp pp
•Tecnología ELFA (elisa+fluorescecia) e inmunoconcentración
•E.coli O157:H7
•Resultados en 16-24 horas
•Toxina Staph aureus
•Validaciones internacionales •Lectura automática, no calibración, no interpretación •Procesado de muestras: 12-30 simultáneamente cada 45 minutos
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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g
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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN ELISA Sistema TECRA (Biotrace) Salmonella Listeria spp Campylobacter spp
•Manual •Desarrollo Desarrollo de color •Resultados : 1-2 días
-
+
•Validaciones internacionales •Posibilidad de realizarlo automáticamente con el UNIQUE PLUS
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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN ELISA Sistema TRANSIA (Biocontrol) Salmonella Listeria Monocytogenes Listeria spp
•Automático •Manejo de elevados volúmenes •Procesado de muestras: 93 muestras simultáneamente •Resultados rápidos: 1-2 días •Validaciones internacionales 31
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN ELISA L Lateral l fl flow Rapid test (Oxoid) VIP (BioControl) RayAl (Rayal Ltd) REVEAL (Neogen) Rapidcheck (Bioser)
•Manual •La L muestra t difunde dif d por capilaridad hacia la zona de Ac •Lectura habitual p por una línea de color •Validaciones internacionales
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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PCR
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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN Real Time PCR (BAX System: Oxoid)
•Procotolos diferentes según matriz •Validaciones internacionales Salmonella spp Listeria spp Listeria Monocytogenes
•Resultados R lt d en 24-33 24 33 h horas •Sonda Sybr Green
Campylobacter E.coli O157:H7 Enterobacter sakazakii Mohos y levaduras S.aureus
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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Applied Biosystem): •2 tipos de kits: Taqman y Microseq •Validaciones internacionales
Salmonella spp
•Resultados en 20-28 horas
Salmonella entérica Listeria spp Listeria Monocytogenes E.coli O157:H7 Campylobacter jejuni •Cronobacter sakazakii •E. coli O157:H7 •Listeria monocytogenes •Pseudomonas aeruginosa •Staphylococcus aureus
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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PCR (Adia food: AES) Salmonella spp
•Termociclador: Stratagen
Listeria spp
•Resultados en 19-21 horas
Listeria Monocytogenes E.coli O157:H7 E coli O157:H7 y Salmonella E.
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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (iQ-CHECK: Biorad) •Sondas: Molecular Beacons Varios termocicladores:iCycler iQ, chrom 4, •Varios iQ 5 y miniOpticon. •En algunos software de interpretación de resultados lt d •Validación 16140
Salmonella spp y g Listeria Monocytogenes Listeria spp Campylobacter E.coli 0157:H7 38
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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Assurance GDS: Biocontrol) •Salmonella •Listeria spp •Listeria monocytogenes •E.coli O157:h7 •Shiga Shiga Toxin To in
•Combina concentración de muestra y detección d t ió de d DNA •Termociclador:Assurance GDS Rotor-Gene™.
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MĂŠtodos rĂĄpidos para el control microbiolĂłgico de alimentos
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MĂŠtodos rĂĄpidos para el control microbiolĂłgico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS DE DETECCIÓN CON FAGOS Salmonella E.coli 0157:H7
+
•Detección rápida y automática de patógenos mediante FAGOS ligada g a fluorescencia. Salmonella
+ 42
•Detección D t ió rápida á id y manual de patógenos mediante FAGOS (lateral flo ) flow) Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Food & envt. 225 ml of BPW + supplement (green)
41.5 +/- 1 °C 18-24 h
Heat & Go 5 min* min *Except for poultry & egg products
VIDAS UP Salmonella 48 min 43
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Identificaci贸n
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M茅todos r谩pidos para el control microbiol贸gico de alimentos
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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos g IDENTIFICACIÓN CON SISTEMAS MINIATURIZADOS •Manual •Miniaturización de pruebas bioquímicas •Diferentes formatos: galerías, tubos de plástico,
•API: bioMerieux •BBL BBL Enterotube: BD •BBL Crystal: BD •RapID™ RapID System: REMEL
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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos g SISTEMAS AUTOMÁTICOS DE IDENTIFICACIÓN Fenotípica: VITEK: bioMerieux •BIOLOG: AES •PHOENIX: BD •Resultados a partir de 4 horas •Combinan reacciones enzimáticas y bioquímicas
Genotípica: •MICROSEQ: C OS Q ABI 46
•Secuenciación del ARN 16 S Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos CLASIFICACIÓN FILOGENÉTICA Family
VITEK, API, BIOLOG, PHOENIX Genus
Species
Subspecies Strain
DNA sequencing MicroSeq
16S rDNA sequencing ARDRA
Riboprinter
Riboprinting tRNA PCR tRNA-PCR ITS-PCR
BioRad
PFGE, LFRFA, RLFP Multilocus Isozyme Whole cell protein profiling
ABI
AFLP RAPD APPCR
Diversilab G Genetic ti Differences: Diff Technique Discrimination:
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rep-PCR M More
F Fewer
Low
High
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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos •Genera huellas genéticas únicas y reproducibles para cada una de las muestras •13 muestras en 4 horas
1. Extracción de ADN: Extracción de ADN a partir de cultivos aislados. 2. Amplificación mediante rep-PCR: Amplificación de muestras con la técnica rep-PCR y los correspondientes kits de identificación genética DiversiLab (DiversiLab DNA Fingerprinting kits). 3. Detección: Separación de fragmentos mediante electroforesis de microfluidos en chip (DNA LabChip Kits). 4. Análisis de datos: Análisis de los datos en tiempo real, con informes a los que se puede acceder a través de un sitio web individual y seguro.
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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos ESPECTROMETRÍA DE MASAS
•
Técnica analítica para determinar la composición elemental de una muestra
•
El principio de MS consiste en la ionización de compuestos químicos p q para g generar moléculas cargadas g y medir su relación masa/carga (m/r)
•
MALDI-TOF MALDI TOF (Matrix (M t i Assisted A i t d Laser L Desorption D ti / Ionisation I i ti Time of Flight), es un tipo de espectrometría de masas que permite el screening de proteínas directamente a partir de bacterias intactas Ionization Mass Ion InletDetector Analyzer System System
Sample Under Vacuum 49
Data Analysis S System
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• Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight. Flight MALDI is the Ionization System-TOF is the Mass Analyzer system.
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2
3
1
Una muestra en una solución matriz absorbe energía de un haz láser. El resultados es una ionización de la muestra.
2
Todos los iones son acelerados a la misma energía cinética, entran en el tubo y son separados de acuerdo con su masa
3
Detección al final del tubo
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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos ESPECTROMETRÍA DE MASAS
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<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3
5000
7000
10939 11000
11572
11 1906
10226 1
10347 9000
10 0608
9330
10 0 3000
9994
7980
20
8450 8
30
7863
40
6837 7092 7367 7
50
5931
5015
60
3581
% Intensity
70
9654
80
8744
8074
90
9453
1648.1
7075
100
13000
Mass (m/z)
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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos ESPECTROMETRÍA DE MASAS Fungi, yeast and mycobacteria: On-target extraction addition of 1.0 µL matrix solution di t direct
solvent evaporation at room temperature Target slide
No selección previa de la colonia
Identificación en solo 2 minutos automated MS analysis
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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos •VITEK MS RUO: bioMerieux •Maldi Biotyper: Bruker
Pow e r
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Ionis ing
V a cuum
N eg ative
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MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN
Ana María Fuertes Barrio ana-maria.fuertes@biomerieux.com
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