Cours 5 by BEN CHIR

Répétition en tandem des séquences non codantes (ADN simlpe. Microsatellites & Minisatellites.

Ces familles sont définies comme des blocs (ou séries) de séquences d'ADN répétées en tandem. Les blocs individuels peuvent avoir un petit ou grand nombre de localisations chromosomiques. Selon la taille moyenne du bloc de séquences répétées sont définis trois sous-groupes d'ADN répété non codant: ADN satellite, ADN minisatellite et ADN microsatellite.

Quelques répétitions en tandem dispersées observées dans divers génomes eucaryotiques

V. 1. Microsatellites.

Motifs répétés en tandem dans les microsatellites polymorphes

L'analyse du gène de l'ataxie spinocérébelleuse SCA 1

Les allè allèles stables de sujets normaux ont des répétitions interrompues. (CAG)n ; n = 19 - 36 Les allèles contenant des expansions instables trouvés sur les chromosomes malades ont des répétitions ininterrompues. (CAG)n ; n = 43 - 81

Une des méthodes d’analyse des microsatellites.

Amplification par PCR d'un microsatellite de type CA)n

Les amorces de PCR sont des séquences uniques situées de part et d'autre du microsatellite. Dans l'exemple choisi, six allèles allant de 25 à 20 répétitions sont indiqués avec la taille des amplimères. Ceux-ci sont en général résolus par électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant.

Les extensions rapides à grande échelle de triplets répétés peuvent entraîner de nombreuses maladies Certaines maladies humaines sont liées à des extensions à grande échelle de trinucléotides répétés, hautement instables. Les répétitions de trinucléotides en tandem ne sont pas rares dans le génome humain. La plupart constituent des marqueurs microsatellites polymorphes utiles, mais certaines répétitions de CAG / CTG et CCG / GGC ont un comportement anormal.  Au-dessous d'une certaine longueur, les répétitions sont stables au cours de la mitose et de la méiose.

 Au-dessus d'une certaine longueur, les répétitions deviennent extrêmement instables.  Ces répétitions instables ne sont pratiquement jamais transmises sans changement d'un parent à son enfant.  Des extensions ou des contractions peuvent survenir, avec un biais vers les extensions. Ces extensions instables de répétitions trinucléotidiques peuvent être classées en trois groupes.  Plusieurs gènes contiennent des répétitions (CAG)n à l'intérieur de la séquence codante, traduites sous forme d'une série de polyglutamines dans la protéine. Habituellement, les allèles stables et non pathologiques possèdent 10 à 30 répétitions, tandis que les allèles instables pathologiques ont des extensions modérées, souvent 40 à 100 répétitions. La transcription et la traduction du gène ne sont pas affectées par l'extension.  Certaines répétitions (CGG)n dans les séquences non codantes peuvent s'étendre massivement d'un nombre de copies de 10 à 50 jusqu'à 100 ou plusieurs centaines ou milliers de répétitions. Par un mécanisme inconnu, ces extensions de répétitions affectent la méthylation de l'ADN et la structure chromatinienne, entraînant la constitution de sites chromosomiques fragiles inductibles. L'expression des gènes adjacents est inhibée.  Un cas particulier est la répétition (CTG) n dans la région 3' non traduite du gène de la kinase de la dystrophie myotonique (DMK) en 19q13. Elle existe chez le sujet normal sous la forme de 5 à 35 unités répétées, mais jusqu'à 2000 unités chez les sujets présentant une dystrophie myotonique. Il existe une parfaite corrélation entre l'extension de la répétition et la maladie. V. 2. Minisatellites ou marqueur VNTR Séquences répétées dans la taille de l’unité répétée contient plus de dix nucléotides à quelques dizaines. Leur localisations est très spécifique pour chaque minisatellites. La fréquence de répétition pouvant être variable d’un individu à un autre, Variabilité dans le Nombre de Répétition en Tandem (VNTR). Ils sont très utilisés comme marqueurs moléculaires Exemple d’utilisation des minisatellites comme marqueur moléculaire.

Régions hypervariables (minisatellites ou VNTR) dans le domaine de l‘α-globine

Chaque point rouge représente un motif élémentaire de 17 nucléotides dans la région 3'HVR. Séquence avec d'autres VNTR : 3'HVR : GGGGGGAACAGCGACAC IZ-HVR : TGTGGGGCACAGGTTGTG. Le VNTR 3'-HVR, proche du locus de la polykystose rénale dominante (PKD1) est très employé comme marqueur de ce locus. insuline-HVR : TGTGGGGACAGGGG (en 5’ du gène de l’insuline sur le chromosome 11)

Test de paternité basé sur analyse par VNTR Des sondes constituées de séquences minisatellites clonées permettent de mettre en évidence le polymorphisme des profils de fragments de restriction dans l'ADN humain. Les séquences (a, b, c) représentent trois minisatellites apparentés humains. En (d), Hybridation d'une sonde de minisatellite b cloné avec des fragments d'ADN digéré par Hinf l. Quatre ADN proviennent des membres d'une famille : la mère, le père, et deux enfants qui sont des jumeaux identiques. Les deux dernières pistes contiennent de l'ADN d'hommes non apparentés. Les bandes d'origine paternelle présentes chez les jumeaux sont indiquées par des flèches.

V. 3 ADN satellite. L'ADN satellite est constitué de longues séries de répétitions en tandem (bloc de 0,1 à 20 Kb) que l'on peut séparer de l'ADN total par centrifugation en gradient de densité. L'ADN satellite humain comporte de longues séries de répétitions en tandem, dont l'unité répétée peut être une séquence simple ou modérément complexe. L'ADN répété de ce type n'est pas transcrit et correspond aux régions d'hétérochromatine du génome. La composition en bases et donc la densité de cet ADN sont conditionnées par la composition en bases des unités répétées et peuvent considérablement diverger de la composition générale de l'ADN total.

Résolution des bandes d'ADN satellite centromérique par centrifugation à l'équilibre de l'ADN total de Drosophila dans un gradient de densité de CsCl.

Pourcentage d'ADN satellites dans quelques génomes

Localisation chromosomique de l’ADN satellite. L’hybridation in situ sur chromosomes avec des sondes radioactives de l’ADN satellite, montre que l’ADN satellite est principalement situé dans les régions centromériques des différents chromosomes.

Localisation chromosomique de l’ADN satellites Localisation chromosomique de classes majeures d'ADN répétitif chez l’homme.

(A) Noter les sites limités de certains types d'ADN répété en tandem, comme les séquences d'ADN satellite que l'on trouve dans l'hétérochromatine (notamment au niveau des centromères), et d'ADN minisatellite souvent retrouvé au niveau ou à proximité des télomères. (B) Organisation de l'ADN satellite au niveau des centromères. La localisation de différentes classes d'ADN satellite est présentée pour le chromosome 9 et 21 (l'un des quatre exemples de chromosomes autosomiques acrocentriques).

Dans quelques domaines du satellite III, le site Hinf1 est absent de certaines unités répétées. La digestion par Hinf l produit une échelle de fragments d'ADN dont les longueurs sont des multiples de 359 paires de bases.

Un domaine du satellite III qui contient à la fois les sites Hinf l et Hae III dans chaque unité répétée.

Chapitre V : Réarrangements génomiques et fluidité du gènome. Pendant la première moitié du xxème siècle, le génome était considéré comme une entité statique et peu malléable. Cette vision changea avec la découverte de Barbara McClintock dans les années cinquante, concernant les mutations instables chez le maïs. Elle eut l'idée de les attribuer à des éléments génétiques se déplaçant dans le génome qu'elle nomma «éléments de contrôle». Ils sont appelés aujourd'hui éléments transposables (ETs). Cette découverte ne commença à être véritablement admise que lorsque de tels éléments furent trouvés tout d'abord chez les bactéries (1969) puis chez la drosophile (1977) et lorsque l'on s'est aperçu qu'une grande partie de la plupart des génomes était constituée de séquences répétées non codantes. Ainsi, la vision statique du génome fut abandonnée pour une vision dynamique recelant un grand nombre de fluctuations. Dans cette nouvelle optique, les éléments transposables ont tout d'abord été considérés comme de simples parasites. En effet, la transposition leur permet une auto-réplication en utilisant les ressources moléculaires de l'hôte. Ainsi, sous cette hypothèse, seul l'avantage réplicatif des ETs pourrait expliquer leur augmentation et leur maintenance dans les génomes. Néanmoins, lors de leur mobilisation, les éléments transposables peuvent avoir des effets négatifs sur l'hôte en abaissant sa valeur sélective. Puis des études ont suggéré qu'ils pouvaient jouer un rôle fondamental dans l'évolution des génomes et augmenter le pouvoir adaptatif de certains individus. Actuellement, les éléments mobiles apparaissent de plus en plus comme des composés fondamentaux des génomes. V.

1 Définition et caractéristiques générales • • • • • • • •

Les éléments transposables sont classiquement définis comme des séquences moyennement répétées qui ont la capacité de se déplacer d’une position à une autre dans les génomes hôtes. Des éléments autonomes possèdent des gènes codant pour des protéines nécessaires à leur déplacement. On trouve aussi un certain nombre d’éléments non autonomes qui dépendent des éléments autonomes pour leur transposition. Lors de leurs déplacements, ils peuvent s’insérer dans les gènes ou dans des régions régulatrices et être responsables de mutations pouvant être délétères ou non. Ils sont aussi responsables d’importants remaniements chromosomiques comme des délétions, des inversions et des translocations. Par exemple chez la drosophile, on estime qu’ils sont responsables de 80 % des mutations. Chez l'homme, les Alus sont responsables de 0,1 à 0,3% des maladies. Ils sont donc une source de variations génétiques importantes. Ils ont un impact important sur leur génome hôte.

Tous ces différents types d'éléments présentent des points communs  Formation de duplication au site d'insertion

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Quel que soit le type d'élément mobile, son insertion en un nouveau locus génétique est généralement accompagnée de la duplication d'une courte séquence d'ADN au site d'insertion ( ou site cible ). La duplication du site cible suggère qu'en dépit de la diversité des mécanismes impliqués, la plupart des insertions sont précédées de coupures décalées La taille de la séquence dupliquée varie d'un élément à un autre. les éléments transposables et les Rétrotransposons de classe I présentent en générale des duplications de longueur bien déterminées (Tn3- 5pb; Ac-8pb; Gypsy-4pb). Par contre les Rétrotransposons de classe II et les rétrogènes engendrent des duplications de taille variable (élément F de la Drosophile engendre entre 8 à 13pb). Les longueurs fixes caractéristiques des éléments transposables et des Rétrotransposons de classe I résultent sans doute de coupures effectuées par des endonucléases spécifiques codées par les éléments eux-mêmes. Les longueurs variables observées les Rétrotransposons de classe II et les rétrogènes suggèrent que leur insertions profite des hasard de coupures présents dans le génome

duplication au site d'insertion

 Les éléments mobiles sont des séquences répétées et dispersées. • Chaque type d'éléments mobile est généralement présent à de multiples exemplaires dans le génome. • Ces éléments constituent donc des familles de séquences répétées dispersées. • Ces derniers sont elles-mêmes cause de réarrangements puisqu'elles permettent à des recombinaisons homologues de se reproduire en des sites non alléliques.  Les éléments mobiles sont à la base de mutations Ces événements provoquent la formation de délétions, de duplications, d'invertions et de translocations. Lorsque ces réarrangements se produisent dans des cellules somatiques individuelles chez des organisme multicellulaires, ils n'ont qu'une faible probabilité d'influencer la fonction d'un tissu complexe. Dans les cellules germinales par contre, si elles sont fixées dans la population par sélection naturelle ou par dérive génétique, peuvent jouer un rôle non négligeable dans la dynamique évolutive. 51

Exemple d’éléments transposables. Elément P de Drosophila melanogaster. Structure et produits de l'élément P autonome de Drosophila melanogaster.

A, Éléments P complets B, exemples d'éléments P ayant subit une délétion interne.

Eléments de contrôle Ac/Ds chez le maïs.

Eléments de controles (Ac/Ds) chez le maïs

Les Rétrotransposons. Ont reçu le nom de rétrotransposon, les éléments mobiles eucaryotiques dont la transposition dépend de la transcription normale et de la transcription inverse. Ils comportent un segment central codant pour une transcriptase inverse et d'autres protéines. * Rétrotransposons de classe I Chez certains Rétrotransposons, ceux que nous considérerons comme faisant partie de la classe I , ce segment central est flanqué de longues séquences répétées dans la même orientation, constituant les deux extrémités du transposon. Ce sont les longues répétitions terminales (LTR "long terminal repeats"). Les Rétrotransposons de classe I ont également de courtes séquences répétées en ordre inverse à chaque extrémité. Ils ressemblent aux provirus des rétrovirus par la structure, le mode de transcription et de transposition, d'où leur nom. On connaît des familles de tels Rétrotransposons chez divers invertébrés, la levure, les plantes et plusieurs mammifères. * Les rétrotransposons de classe II ne possèdent pas de LTR et l'une de leurs extrémités est souvent pourvue d'une séquence riche en A-T Ils ne sont donc pas semblables aux provirus rétroviraux. Ils sont très répandus chez les eucaryotes. Modèle de rétrotransposon de classe I.

Elément Ty de la levure.

Structure de l’élément Ty de la levure

Eléments de type Copia chez la drosophile. Certaines des familles du groupe de rétrotransposons du type copia chez Drosophila.

Retrotransposon de Classe II.

Structure des rétrotransposons de la classe II.

Les Rétrogènes. La formation d'un pseudogèoe maturé correspondant à un polypeptide. Un ARN messager fonctionnel est produit par transcription suivie de maturation, y compris d'excision des introns. La transcription inverse produit alors un brin d'ADNc qui s’intègre dans des coupures décalées dans l'ADN génomique. Comparaison structurale entre gènes codant pour des polypeptides et leur pseudogènes maturés.

Modèle général pour la transposition des rétrogènes via un intermédiaire d'ARN.

SINES & LINES des vertébrés. • • • • • • • • •

On compte environ 106 copies de la séquence Alu, qui fait 300 pb (soit en moyenne une copie tous les 4 kb), et 105 copies, le plus souvent partielles, de l'élément LI, long de 7 000 pb. Ces deux familles représentent respectivement environ 10 et 5 % du génome humain. L'énorme famille des séquences Alu n'existe que chez les primates. Tous les mammifères ont leur génome truffé d'une ou deux familles majeures de SINE, mais ces familles sont le plus souvent sans rapport d'une espèce à l'autre. Par contre, chez tous les vertébrés, la famille majeure de LINE est apparentée à l'élément LI des primates. Quant aux petits éléments dispersés (SINE), comme l'élément Alu, ils ne codent aucune protéine. Il semble que beaucoup sont issus à l'origine de la rétrotransposition de petits ARN stables essentiels dans la cellule, transcrits par l'ARN polymérase III. L'élément Alu descend ainsi d'une copie réarrangée et dédoublée de l'ARN 7SL, qui fait partie de la machinerie de transport des protéines. L'élément BI de la souris descend du même ARN 75, mais sans dédoublement, tandis que nombre d'autres SINE descendent d'ARN de transfert.

Les similitudes entre l'ARN 7SL et les séquences consensus des SINES de type 1 des rongeurs et des Alu des primates

Les gènes d'ARN 7SL humain ont la même structure que l'ARN. La partie centrale de la séquence de l'ARN 7SL n'est apparentée ni aux Alu ni aux SINES de type l.

La séquence d'un membre non-tronqué de la famille LINE-1 humaine représentée en haut de la figure est semblable à celles rencontrées chez tous les mammifères.

Des séquences répétées dispersées dans la région b-globine humaine

Exemple de recombinaison intrachromosomique entre deux des éléments Alu présents dans le gène du récepteur aux LDL.

Rectangles noirs, parties codantes du gène; A, une recombinaison est survenue chez un individu entre les deux séquences Alu indiquées sur le chromosome normal. Cet événement a excisé la partie comprise entre les deux éléments, qui contient des régions codantes essentielles pour la fonction du récepteur. B, ARN messagers correspondant au gène normal et au gène ayant subi une délétion, responsable d'un hypercholestérolémie familiale.