TD 6 - MITOSE-MEIOSE Questions de rappel à préparer avant le TD - Schématisez la structure d’un chromosome lors de la métaphase. - Décrivez les différentes étapes de la mitose et de la méiose pour un organisme à 2n chromosomes. - Quel est le rôle des microtubules lors de la mitose ? - Les microtubules kinétochoriens se positionnant sur les deux chromatides soeurs lors des divisions de méiose I et II viennent-ils du même pôle cellulaire ?
Exercice : Rôle des cohésines dans la ségrégation des chromatides, lors de la mitose et de la méiose Lors de la mitose, la transmission de l’intégrité de l’information génétique de la cellule mère aux cellules filles est un processus finement régulé. Au cours de la métaphase, les chromosomes s’alignent dans le plan de l’équateur de la cellule, et orientent chaque chromatide soeur vers un pôle du fuseau mitotique. Cet alignement est crucial pour assurer la distribution d’une chromatide soeur par cellule fille lors de l’anaphase. L’alignement de chromosomes en métaphase se fait grâce à un équilibre entre les forces de traction exercées sur les chromosomes par les microtubules de chaque pôle du fuseau mitotique. Il est indispensable, pour cette étape, que des forces de cohésion maintiennent les chromatides soeurs ensemble jusqu’à la fin de la métaphase. De même, lors de la méiose, des forces de cohésion entre chromatides soeurs ou entre chromosomes homologues sont indispensables pour assurer une répartition correcte de l’information génétique. L’exercice suivant met en évidence l’importance et le rôle de protéines de cohésion lors de la mitose et de la méiose, chez la levure.
A. Mitose La levure de boulanger, Saccharomyces cerevisiae, présente de nombreux avantages, qui font d’elle un très bon modèle d’étude de la ségrégation des chromosomes, au cours de la division cellulaire. Chez S. cerevisiae, la mitose se fait par bourgeonnement, sans rupture de la membrane nucléaire, mais la mise en place de la plaque équatoriale et la séparation des chromatides soeurs se déroulent de manière similaire à ce qu’on observe chez les eucaryotes supérieurs. la phase G1135 mn après le début de
A
wt
scc1
100 %
60 %
0
40 %
1) Une équipe de chercheurs a isolé une souche de levure mutante pour le gène scc1 (souche scc1), qui perd du matériel génétique à une fréquence élevée. Pour caractériser le phénotype de scc1, ils ont mis en place une technique de marquage fluorescent du centromère du chromosome V. Une centaine de cellules en division, d’une souche haploïde sauvage (wt) ou d’une souche haploïde scc1, ont été analysées. Les résultats sont présentés ci-contre (le point représente la position du centromère V) : Que montrent ces résultats ? 2) Pour mieux comprendre le phénotype de scc1, les chercheurs ont étudié la séparation des chromatides soeurs au cours du temps. Ils ont ainsi synchronisé la division cellulaire chez des levures sauvages ou scc1, puis compté, à différents temps après le début de la phase G1, le pourcentage de cellules en bourgeonnement et le pourcentage de
cellules présentant des chromatides séparées. Les résultats sont présentés sur les graphes “WT” et “scc1”. Quel est l’effet de la mutation scc1 sur la séparation des chromatides ?
3) Les mêmes mesures ont été répétées en présence de nocodazole, un inhibiteur pharmacologique qui bloque la polymérisation des microtubules. Les résultats sont donnés sur les graphes ci-dessous (même légende que les graphes précédents). Que pouvez-vous conclure ? A votre avis, le phénomène de séparation des chromatides dans le mutant scc1 est-il actif ou passif ?
Une analyse en immunofluorescence sur des cellules en début de mitose a montré que la protéine Scc1 est présente au niveau des chromosomes, aussi bien au niveau du centromère que sur la longueur des bras. Formulez une hypothèse sur la fonction de la protéine Scc1.
4) L’expression de la protéine Scc1 a ensuite été étudiée. Des levures ont été synchronisées et la présence et la quantité de Scc1, à différents temps après le début de la phase G1, a été analysée par Western blot (cf. TD réplication). Les résultats sont présentés ci-dessous. Que constatez-vous ? G1
S + G2 + début M A G1 (A = Anaphase) Temps (min) Scc1
témoin
5) Le déclenchement de l’anaphase est un événement finement contrôlé. Il a été mis en évidence que le facteur nommé APC (Anaphase Promoting Complex) est requis pour la levée du blocage en métaphase et le déclenchement de l’anaphase. WT Mutant APC La protéine Scc1 a été surexprimée, entre les temps t= -30 et t=0, dans des souches sauvage ou mutante pour le facteur APC. L’expression de Scc1 a été stoppée à t+0, puis la quantité de Scc1 a
Scc1
témoin
été analysée à différents temps par Western blot (ci-contre).
Que pouvez-vous conclure ? A partir de l’ensemble de ces données, formulez une hypothèse sur l’alignement des chromosomes en métaphase, et le déclenchement de l’anaphase. 6) Lorsque la synthèse de la protéine Scc1 est bloquée avant le début de la phase S, pour n’être activée qu’au début de la phase G2, la protéine Scc1 est toujours détectée en immunofluorescence au niveau de l’ADN, mais les levures présentent des défauts de ségrégation des chromosomes du même type que le mutant scc1. Imaginez un modèle permettant d’expliquer ces résultats, sachant que des études récentes ont montré que scc1 appartient à une famille de protéines, appelées cohésines, qui forment un anneau protéique autour de la fibre de chromatine. B. Méiose La même équipe de chercheurs s’est ensuite intéressée à la ségrégation des chromatides lors de la méiose, toujours chez S. cerevisiae. 1) Ils ont tout d’abord cherché à savoir si les protéines Scc1 et Rec8 (une protéine de séquence très proche de Scc1) sont impliquées dans ce processus. En utilisant la même technique de marquage fluorescent du centromère V, ils ont analysé les divisions de méiose d’une centaine de cellules, d’une souche sauvage et des souches mutantes scc1 et rec8. Le tableau B donne les résultats de ces observations. Notez que les levures sont bien sûr diploïdes, et que pour cette expérience, les centromères de 2 chromosomes homologues V ont été marqués. Que pouvez-vous conclure sur l’importance des protéines Scc1 et Rec8 dans la ségrégation des chromosomes ? Que suggère l’existence de la forme *? scc1
rec8
100 %
97
68
0
0
21
0
3
11
50
100
100
6
50
0
0
51
0
0
0
23
0
0
14
0
0
0
6
0
wt
scc1
rec8
D
66
34
Spo11 50
méiose I
C méiose I
*
wt
méiose II
méiose II
méiose I
B
0
50
Pour préciser ce point, le même type d’observations a été réalisé après la première division de méiose, sur des levures dont un seul des chromosomes homologues V présente un centromère détectable par fluorescence (tableau C). Quels sont les résultats attendus pour les souches sauvages et scc1 ? Que montrent les résultats obtenus pour la souche rec8 ? D’après ce qu vous savez maintenant du rôle de Scc1 au cours de la mitose, formulez une hypothèse sur le rôle de Rec8 lors de la méiose.
2) La localisation de la protéine Rec8, au cours de la méiose, a été analysée par immunofluorescence, en utilisant un fluorochrome bleu capable de se lier à l’ADN, un anticorps dirigé contre une protéine centromérique couplé à un fluorochrome rouge, un anticorps dirigé contre Rec8 couplé à un fluorochrome vert. Les images suivantes ont été observées: ADN + Protéine centromérique
Rec8 + Protéine centromérique (La version en couleur de ces images sera montrée en TD. A l’Anaphase II, seule la protéine centromérique, en rouge, est détectée)
En réalisant ces observations à différents temps, sur une culture de levures synchronisées, le graphe ci-dessous a été construit. Il représente, en fonction du temps, le pourcentage de cellules ayant accompli la 1ère division de méiose, ayant accompli la 2ème division de méiose, présentant Rec8 sur toute la longueur des chromatides, ou ne présentant Rec8 qu’au niveau des centromères :
Que montrent ces images et ce graphe ? Quelle différence majeure voyez-vous entre le comportement de Scc1 lors de la mitose, et le comportement de Rec8 lors de la méiose ? Pouvez-vous relier cette observation au mode de répartition des chromatides soeurs dans les deux types de divisions ?
3) Le même groupe de chercheurs s’est également intéressé au mutant Spo11, qui présente lui aussi des défauts de ségrégation de l’ADN. Leurs observations sont consignées dans le tableau D (ci-dessus). A quel niveau la protéine Spo11 peut-elle intervenir ? Des études ont montré que les mutants Spo11 ne présentent pas de recombinaison, et que la protéine Spo11 est une enzyme qui initie la formation des chiasmas. Quel rôle les chiasmas peuvent-ils jouer dans la ségrégation des chromosomes ?