Bebidas Mexicanas abril 2013 by Alfa Editores Técnicos

Contenido Bebidas Mexicanas | Abril 2013

TECNOLOGÍA

Preparación de una bebida sin alcohol y naturalmente carbonatada, utilizando un aislado de levadura de una bebida de suero de leche Saloni Jairath, Parampal Sahota y Gulab Pandove

12 TECNOLOGÍA

Nuevas bebidas de kéfir a base de pulpa de cacao: Composición química, análisis microbiológico y sensorial Cláudia Puerari, Karina Teixeira Magalhães y Rosane Freitas Schwan

Contenido

Abril 2013 l Volumen 2, No. 4 www.alfaeditores.com | buzon@alfaeditores.com Editor Fundador Ing. Alejandro Garduño Torres Directora General

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Lic. Elsa Ramírez Zamorano Cruz

Bebidas Mexicanas | Abril 2013

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6 8 43 45

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Objetivo y Contenido La función principal de BEBIDAS MEXICANAS es dar difusión a los servicios de apoyo que las empresas proveedoras (de materias primas, maquinaria, laboratorios de control de calidad, etc.) ofrecen a la Industria de Bebidas, a la vez servir de medio para que los técnicos, especialistas e investigadores de las áreas relacionadas con el sector indicado anteriormente, expongan sus conocimientos y experiencias. El contenido de la revista es actualizado debido a la aportación del conocimiento de muchas personas especializadas en el área. Adicionalmente se incluye información tecnológica de aplicación básica y práctica, con la finalidad de que ayude a resolver los problemas que enfrentan los industriales procesadores del ramo. BEBIDAS MEXICANAS se edita mensualmente y es una publicación más de ALFA EDITORES TÉCNICOS, S.A. de C.V. Av. Unidad Modelo No. 34, Col. Unidad Modelo, C.P. 09089, México, D.F. Tels./Fax: (55) 55 82 33 42, 78, 96 con 6 líneas. E-mail: buzon@alfaeditores.com o bien nuestra página: www.alfaeditores.com Todos los derechos reservados. Prohibida la reproducción total o parcial, sin permiso escrito del editor. El contenido de los artículos firmados es responsabilidad del autor. El contenido de los artículos sin firma es responsabilidad de la editorial. La veracidad y legitimidad de los mensajes contenidos en los anuncios publicados en esta revista son responsabilidad de la empresa anunciante. Se aceptan colaboraciones. No se devuelven originales. Se acepta intercambio de publicaciones similares.

Editorial

Nuevos sabores de bebidas, porque la innovación no tiene fronteras Luego de que tanto en Europa como en Estados Unidos el mercado de las bebidas alcohólicas Premium ha experimentado un crecimiento considerable, Heineken, a través de su fusión con Cuauhtémoc Moctezuma, ha introducido a las tiendas mexicanas la Strongbow Gold Cider, una sidra de origen belga que tiene la consigna de conquistar paladares ávidos de experimentar nuevos sabores fermentados, en un país reconocido por ser un clásico consumidor y productor de cerveza. Según datos de la Cámara Nacional de la Industria de la Cerveza y la Malta, el consumo de sidra en México es de 62 litros per cápita al año (lejos del principal consumidor, República Checa, con 189 litros por persona)

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y el segmento Premium tiene en el país un valor aproximado de 5,000 millones de pesos, lo que representa

entre seis y siete por ciento del valor total del mercado. Los datos son conservadores pero atractivos; si los resultados se dan acorde a lo esperado por Heineken, la sidra en presentación individual podría ser un gran éxito en México. Aquí la novedad no es el hecho de que Heineken traiga a la República Mexicana una bebida europea de renombre basada en la fermentación de manzanas, sino que el movimiento representa un importante intento por abrir el panorama de consumo de las personas, similar a lo que está sucediendo en los mercados de jugos, tés y algunos lácteos por ejemplo, donde se crean tendencias sobre las cuales hemos estado reportando en los distintos medios de Alfa Editores Técnicos: la globalización posibilita que los latinos disfruten por unos cuantos pesos los mismos productos que han hecho historia en Grecia, Italia, España, Holanda, Turquía, etcétera; ahora es posible probar los sabores del mundo sin desapegarse de los gustos regionales que caracterizan a la gastronomía de cada país. Por ello, esta edición de Bebidas Mexicanas la dedicamos a los nuevos sabores, que son ideas de productores creativos que se esfuerzan por promover una oferta de bebidas cada vez más amplia. Así, le presentamos un artículo que evaluó el uso de gránulos de kéfir como cultivo iniciador para nuevas bebidas de chocolate, texto que destaca por ser el primer trabajo conocido que registra la producción de una bebida alcohólica de kéfir a partir de cacao; e incluimos el reporte de la preparación de una bebida sin alcohol y naturalmente carbonatada, para la cual se utilizó un aislado de levadura de una bebida de suero de leche. Además, también encontrará en este número de Bebidas Mexicanas nuestras prácticas secciones de Novedades y Calendario de Eventos, cuyo propósito es actualizar sus conocimientos en torno a las noticias y encuentros que están delineando el día a día de esta industria. Bienvenido a Bebidas Mexicanas de abril de 2013, esperamos que los contenidos aquí publicados sean de su interés, agrado y, sobre todo, utilidad.

Lic. Elsa Ramírez-Zamorano Cruz Directora General

Novedades

El tequila Jimador lanza botellas con motivos futbolísticos

elementos gráficos e icónicos de la marca con balones y plantas de agave como fondo.

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"El fútbol es la plataforma más importante del tequila Jimador y un gran vehículo para atraer y crear una relación más profunda con nuestros consumidores", dijo al respecto Jesús Ostos, gerente de marca de Jimador. Las botellas estarán a la venta en tiendas comerciales minoristas de todo el país.

Si la lucha contra el consumo de alcohol, previniendo gran cantidad de afectaciones a la salud, ha sido la constante en las últimas décadas, un reciente estudio de la Universidad de Yale (Estados Unidos) amenaza con tirar por la borda mucho de lo que se ha afirmado en ese sentido, principalmente en lo que respecta al cerebro.

El estudio revela que el cerebro de los bebedores “se acostumbra” a emplear esta forma de energía alternativa, dejando atrás la tradicional creencia de que las neuronas solamente son capaces de obtener energía de los glúcidos. Al igual que algunos automóviles son capaces de utilizar otros combustibles si no hay nafta, el cerebro opera con combustibles alternativos, y ello funciona con mayor intensidad en la medida en que más veces se alternen los insumos que operan como combustible.

Según publica el Journal of Clinical Investigation, el consumo habitual de alcohol es capaz de elevar los niveles de acetato en el cerebro, un subproducto del alcohol muy rico en energía. Las personas que consumen alcohol al menos ocho veces a la semana, obtienen energía

“Esto explicaría por qué es tan duro el síndrome de abstinencia del alcohol, como lo difícil que resulta abandonar la bebida: el cerebro se acostumbra a emplear ese combustible alternativo y lo requiere cada vez más”, afirmó Graham Mason, coautor del estudio de la Universidad de Yale.

El alcohol puede “alimentar” al cerebro: científicos de Yale Por segundo año de manera consecutiva, el tequila Jimador, hecho cien por ciento de agave azul, lanzó una edición limitada de botellas conmemorativas sobre fútbol soccer. Como el tequila patrocinador oficial de la Liga Nacional de Fútbol Soccer de Estados Unidos (MLS, por sus siglas en inglés), así como de sus equipos nacionales de fútbol masculino y femenino, y de la gira anual de la Selección Mexicana de Fútbol por aquél país, la marca distribuirá botellas de 750 mililitros para inaugurar la temporada deportiva durante un periodo limitado de dos meses en mercados de la Unión Americana. Las botellas estarán disponibles en los tres tipos de tequila: Blanco, Reposado y Añejo; cada una resalta los colores y logotipos de la MLS, la Selección Mexicana de Fútbol y el equipo Nacional de Fútbol Soccer de Estados Unidos. Pretendiendo imitar el movimiento de las banderas ondeando y capturar la pasión de los aficionados al soccer durante los partidos, el diseño de las botellas incluye un tema de fútbol estilizado, que mezcla los colores del equipo,

del acetato para el funcionamiento cerebral, en mayor proporción que aquellas que no beben. El estudio mostró también que las mismas personas con afición a la bebida son capaces de “quemar” el acetato, de una forma doblemente más rápida que los organismos de los abstemios, e incluso bastante más aceleradamente que consumidores de alcohol “sociales” (que lo ingieren ocasionalmente).

Novedades Bebidas Mexicanas | Abril 2013

Por si no lo ha notado… Strongbow Gold ya está en el mercado mexicano Heineken introdujo al mercado mexicano, a través de Cuauhtémoc Moctezuma, la sidra Strongbow Gold, producto con un 5 por ciento de alcohol con el cual prevé abrir las puertas a este tipo de tendencias de consumo en América Latina, como parte de la estrategia para mantener su liderazgo entre los fabricantes de bebidas alcohólicas. Dave Moore, gerente Global de Strongbow Gold Cider, explicó que este nuevo producto ya puede ser adquirido en centros comerciales del país y mini-supermercados, y que va dirigido al mercado juvenil de entre 21 y 35 años, como una opción a las bebidas refrescantes fermentadas (principalmente cervezas). El empresario recordó que tradicionalmente esta bebida producida por la fermentación del extracto de manzana, elaborada en Herefordshire, Inglaterra, tiene un sabor diferente al de la sidra que comúnmente se consume en épocas navideñas en el país, y señaló que decidieron introducir este producto en México luego de que la categoría Cider (sidra) vive actualmente un proceso de expansión

global, con un potencial de crecimiento de 21 por ciento en el periodo 2011-2015.

Central Lechera Asturiana (España) presenta Alpro, nueva bebida de avena

Discutirán definición de la absenta La absenta, bebida altamente alcohólica bautizada como "el hada verde" por los literatos parisinos (en referencia a sus poderosas propiedades psicoactivas), podría sufrir alteraciones en su conceptualización, pues la Unión Europea (UE) está examinando la posibilidad de cambiar su definición. La discusión, que en breve llegará a su clímax durante una reunión del parlamento en Estrasburgo (Francia), se enfoca principalmente en la cantidad de tujona de origen natural que debe estar presente en la bebida.

Central Lechera Asturiana, líder en el mercado español de los lácteos, presentó su nueva bebida de Avena Alpro de un litro, una alternativa vegetal que le permite al consumidor incorporar la avena de forma fácil y sencilla a su dieta. La nueva bebida le posibilita al comprador disfrutar de las propiedades beneficiosas de la avena, es baja en grasas y está enriquecida con calcio, lo que ayuda al buen mantenimiento de los huesos y vitamina D, facilitando la absorción del calcio. Además, tiene un delicioso y agradable sabor a avena, según informó la compañía. Con este nuevo lanzamiento, la empresa española Central Lechera Asturiana amplía su gama vegetal Alpro, formada actualmente por diferentes productos de soya, sanos, nutritivos, cien por ciento vegetales y reconocidos por su agradable sabor.

La tujona, es una toxina que se obtiene de las plantas de ajenjo (Artemisia absinthium) y algunos legisladores de la UE creen que es demasiado dañina, especialmente en concentraciones altas. De acuerdo con la actual normativa de la UE, la absenta no debe contener ninguna tujona que justifique el nombre, pero tampoco debe exceder un máximo de 35 milígramos de tujona por kilo. Con el fin de estandarizar el contenido, la Comisión Europea ha propuesto que cualquier bebida catalogada como absenta debe tener un mínimo de 5 y un máximo de 35 miligramos de tujona por kilo.

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Preparación de una bebida sin alcohol y naturalmente carbonatada, utilizando un aislado de levadura de una bebida de suero de leche Preparation of Non-Alcoholic Naturally Carbonated Beverage Using Yeast Isolate from Whey Beverage Saloni Jairath, Parampal Sahota y Gulab Pandove 1

Universidad Agrícola de Punjab, Departamento de Microbiología, Ludhiana-141004, India. E-mail: gpandoveg@yahoo.co.im 1

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RESUMEN Se caracterizaron fenotípicamente cuatro aislados de levadura pura a partir de una bebida de suero de queso feta y se secuenciaron los dominios D1/D2 del ARNr 26S y la región de espaciador transcrito interno (ITS, por sus siglas en inglés). Estos aislados fueron identificados como Clavispora lusitaniae (84), Candida sp. TS12A (86), Clavispora lusitaniae (B82) y Candida hyderabadensis (S82). Los potenciales de fermentación de todos los aislados de levaduras se determinaron en ciruela, amalaki (grosella espinosa india), limón, guayaba, mandarina Kinnow y piña, y se reportó Clavispora lusitaniae (84) como la mejor levadura para llevar a cabo la fermentación con niveles de CO2 de 1.5 bar. Utilizando Clavispora lusitaniae, se ha desarrollado una tecnología confiable, controlable, simple y reproducible a partir de frutos astringentes para la producción de una bebida sin alcohol, carbonatada de manera natural, con características mejoradas como un sabor acidulado y picante, apariencia, aroma, mayor vida útil y retención de todos los nutrientes. Esta levadura, en inoculación de 0.5% en jugo astringente de amalaki (13%), sólidos solubles totales (TSS, por sus siglas en inglés) ajustados a 16.0 °B y fermentación a 20 ± 5 °C durante 36 horas, produce una nueva bebida sin alcohol, naturalmente carbonatada. Los parámetros fisicoquímicos de la bebida recién preparada son: 13% de jugo, pH 3.0, TSS 16 °B, acidez 0.38%, relación °Brix/acidez 42.10 y ácido ascórbico 120.0 mg/100 mL. Los parámetros fisicoquímicos no cambiaron significativamente durante el almacenamiento. Los componentes volátiles como el propanol, butanol, acetaldehído, metanol, acetato de etilo e isopropanol, estuvieron ausentes mientras que el porcentaje de etanol fue de 1.16% después de un almacenamiento de 3 meses. La vida de anaquel de la bebida es de tres meses bajo condiciones de refrigeración (4 °C). Palabras clave: ARNr 26S, Clavispora lusitaniae, D1/D2, fermentación, fruta, queso feta.

ABSTRACT Four pure yeast isolates from feta cheese whey beverage were phenotypically characterised and D1/D2 domain of 26S rRNA and Internal Transcribed Spacer (ITS) region were sequenced. These isolates were identified as Clavispora lusitaniae (84), Candida sp. YS12A (86), Clavispora lusitaniae (B82), and Candida

hyderabadensis (S82). The fermentation potentials of all yeast isolates were determined in plum, amla, lemon, guava, Kinnow, and pineapple, and Clavispora lusitaniae (84) was reported as the best yeast for carrying out fermentation with CO2 levels of 1.5 bar. Using Clavispora lusitaniae, a reliable, controllable, simple, and reproducible technology from astringent fruits has been developed for the production of nonalcoholic naturally carbonated beverage with improved tangy taste, appearance, aroma, extended shelf life, and retention of all the nutrients. This yeast on inoculation @ 0.5% in astringent in amla juice (13%), TSS adjusted to 16.0 °B, and fermentation at 20 ± 5 °C for 36 h produces a new non-alcoholic naturally carbonated beverage. The physicochemical parameters of freshly prepared beverage juice 13%, pH 3.0, TSS 16.0 °B, acidity 0.38%, Brix acid ratio 42.10, ascorbic acid 120.0 mg/100 mL. The physicochemical parameters did not change significantly during storage. The volatile components like propanol, butanol, acetaldehyde, methanol, ethyl acetate, and isopropanol were found to be absent while the percentage of ethanol was 1.16% after three months of storage. Shelf life of the beverage is three months under refrigerated conditions (4 °C). Key words: 26S rRNA, Clavispora lusitaniae, D1/D2, fermentation, feta cheese, fruit.

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INTRODUCCIÓN Una gran variedad de frutos y productos lácteos ofrecen un nicho ecológico especial para la actividad y presencia de especies específicas de levaduras. Las levaduras se detectan en gran número en los productos lácteos, reflejando una buena adaptación a un sustrato rico en proteínas, lípidos, azúcares y ácidos orgánicos. Su amplia distribución es consecuencia de las actividades proteolíticas y lipolíticas, así como de la habilidad de fermentar o asimilar la lactosa y de utilizar ácido cítrico, láctico y succínico. Además, las levaduras pueden crecer en sustratos con altas concentraciones de sal, bajas temperaturas, pH bajo y baja actividad de agua (Aw). Debido a sus rasgos inherentes de adaptación a sustratos complejos, las levaduras juegan papeles ya sea benéficos (por ejemplo, en procesos de maduración) o perjudiciales (organismos de descomposición, inhibidores del crecimiento de cultivos iniciadores) en la producción de lácteos (Jakobsen y Narvhus, 1996). Como parte de la comunidad microbiana, junto con las bacterias, las levaduras contribuyen a las características sensoriales del kéfir, kumis y diferentes variedades de queso, influenciando la biosíntesis de compuestos aromáticos (Viljoen, 2001). Frecuentemente, las levaduras se encuentran en la microflora de una gran variedad de quesos, especialmente quesos suaves madurados por moho, bacterias y salmuera, ya que contribuyen al desarrollo del sabor. Las levaduras principales incluyen Debaryomyces hansenii, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae y diferentes subespecies de Candida. Las bacterias incluyen diferentes especies de Lactobacillus, Leuconostoc, Micrococcus y Brevibacterium.

El queso feta es el queso tradicional griego más popular hecho de leche de oveja, de cabra o una mezcla de los dos. Las características de cada tipo de queso están determinadas por la influencia de varios factores, entre los cuales el tipo de cultivo iniciador tiene uno de los papeles más importantes. En los quesos madurados por bacterias, el moho, las levaduras y las bacterias están presentes en grandes cantidades en la superficie del queso y son importantes para determinar las características y atributos finales de los quesos. Las levaduras como Candida spp., Cryptococcus spp., Debaryomyces spp., Geotrichum candidum (Galactomyces geotrichum), Rhodotorula spp., Saccharomyces spp. y Yarrowia lipolytica, se aislan común y variablemente de los quesos madurados por bacterias en la superficie (Corsetti et al., 2001). Algunas frutas como la amalaki, limón y piña, debido a su alta acidez y sabor astringente, no son apetecibles para consumo directo, pero debido a su excelente valor terapéutico y nutritivo ofrecen un gran potencial para el procesamiento de productos con valor agregado. En comparación con jugos de frutas, la formulación de una bebida carbonatada naturalmente ofrece mayor variedad de sabores, nutrientes, mayor vida útil y otros beneficios fisiológicos con un margen de seguridad más grande en una bebida con menor costo inherente. La grosella espinosa de la India (Emblica officinalis L.), también llamada “amalaki” o “Aonla” es una de las frutas tropicales que pertenece a la familia Euphorbiaceae, con altos contenidos de ácido ascórbico (600 mg/100 g), colina inhibidora de radicales libres (256 mg/100 g) y polifenoles que aportan un característico sabor ácido y astringente a la fruta. De acuerdo con la Ingesta Diaria Recomendada

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(IDR), se recomienda un consumo adecuado de ácido ascórbico y colina de 90 mg/ día y 550 mg/día para hombres y 75 mg/día y 425 mg/día para mujeres, respectivamente. La bebida fermentada retiene los nutrientes y el CO2 adicional producido es antimicrobiano y le agrega un sabor agrio, efervescencia y gas a la bebida. El amalaki está disponible durante una temporada corta en el año y tiene un tiempo de vida de 6 a 7 días, lo cual da como resultado un exceso estacional. El desperdicio alarmante asociado al amalaki, junto con su bajo nivel de utilización industrial en los países desarrollados, genera gran preocupación. Para mantenerlo disponible durante el año en forma de bebida, se propone el presente estudio con el objetivo de desarrollar una tecnología confiable, controlable y reproducible para la producción de una bebida con bajo contenido alcohólico y auto-carbonatada, con fecha de caducidad de tres meses, utilizando aislado de levadura de una bebida de suero de leche.

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MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento y caracterización fisiológica y bioquímica de los aislados de levadura Se preparó el queso feta mediante inoculación de un cultivo iniciador mesófilo (Choozit 230, Bulk cultures; Danisco, Niebüll, Alemania) que contenía Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris; y un cultivo termófilo de yogurt (YO-MIX 532, Bulk cultures; Danisco, Niebüll, Alemania) que contenía Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. El suero obtenido de esta manera fue utilizado para la preparación de la bebida. Se seleccionaron un total de cuatro colonias de levadura morfológicamente diferentes, se aislaron de la bebida de suero de leche y, durante la purificación, revelaron tipos de colonias diferentes, designados inicialmente como 84, 86, B82 y S82. La identificación del aislado de levadura en base a actividades bioquímicas incluyó: la fermentación de azúcares, asimilación de compuestos de carbono, crecimiento en un medio libre de vitaminas, crecimiento a 25, 30, 35, 37 y 42 °C, crecimiento en un medio de D-glucosa al 50% y 60%, hidrólisis de urea y cicloheximida al 0.01% y 0.1% (Van der Walt y Yarrow, 1984).

Caracterización molecular de la levadura Posteriormente los aislados de levadura se identificaron por medio de la secuenciación basada en la región parcial ITS2 de la secuencia de ADNr. Se aisló el ADN genómico a partir del cultivo puro (Sambrook et al., 2001). Utilizando primers de consenso, se amplificó el dominio D1/D2 de ARNr 26S, ITS-1 y dos fragmentos de región (0.4 kb), empleando polimerasa Taq de alta fidelidad (Fermentas, Glen Burnie, Estados Unidos). Se llevó a cabo una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) con una mezcla de reacción de 50 µL que contenía lo siguiente (por reacción): 25 ng de ADN genómico; solución amortiguadora Taq 1x (KCl 50 mM, Tris-HCl [pH 8.4] 10 mM, MgCl2 1.5 mM) 0.025 mM (concentración de cada desoxinucleótido trifosfato); una concentración de 2 µM de cada primer; y 2 U de polimerasa Taq (Fermentas, Glen Burnie, Estados Unidos). Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador (Biometra GmbH, Goettingen, Alemania) y el programa PCR se realizó como se describe a continuación: 95 °C durante 2 minutos y 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 1 minuto, alineamiento a 50 °C durante 1 minuto y extensión a 72 °C durante 1 min 30 s, seguido de una extensión final de 10 minutos a 72 °C. Se clonó el

producto de PCR en vector pTZ57R/T (Fermentas, Glen Burnie, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del fabricante y el ADN plásmido se secuenció bidireccionalmente utilizando los primers reverso, hacia adelante e interno. Los datos de la secuencia se alinearon y analizaron para encontrar la homología más cercana para el microorganismo. Para todos los análisis se utilizó el paquete MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007).

Análisis químico Los porcentajes de sólidos solubles totales (%TSS) en el jugo y en la bebida, se determinaron utilizando un refractómetro manual Erma de 0-32 °B (Erma, Tokio, Japón). El pH del jugo se determinó utilizando un peachímetro (ECIL, Hyderabad, tipo 101; Electronic Corporation of India Ltd., Hyderbad, India). Se calculó la acidez total expresada como ácido cítrico siguiendo el procedimiento de la AOAC (1999). La relación Brix/acidez se calculó dividiendo el valor de TSS entre la acidez total del jugo y de la bebida carbonatada. Se calcularon los azúcares totales por medio del método fenol-sulfúrico de Dubois et al. (1956) utilizando glucosa como estándar. Se estimaron los azúcares reductores con el método de Miller (1959). Se utilizó el método de titulación con 2,6-diclorofenol indofenol para medir el ácido ascórbico (AOVC 1996). Los volúmenes de dióxido de carbono en las botellas de las bebidas fueron determinados con un dispositivo de perforación de Zahm y Nagel (determinador de CO2, Zahm and Nagel Co., Inc., Holland, Nueva York, Estados Unidos). La levadura total se enumeró en agar GYE con un método de dilución en serie en placa. Los componentes volátiles como propanol, butanol, acetaldehído, metanol, acetato de etilo, isopropanol y etanol, se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con cromatografía de gases (GC) Headspace y columna TR-Wax, utilizando un detector de ionización de llama (FID).

Selección de los aislados de levadura por el potencial de fermentación de jugos de fruta La selección se llevó a cabo inoculando los aislados de levadura 84, 86, B82 y S82 en diferentes jugos de frutas: ciruela, amalaki, limón, mandarina Kinnow (obtenida del Departamento de Horticultura, Universidad Agrícola de Punjab, Ludhiana, Punjab, India) y piña obtenidas del mercado local de Ludhiana, Punjab, India. El estudio sobre el potencial de fermentación de los aislados de levadura en diferentes jugos de fruta se llevó a cabo en botellas de cristal de 1 litro, cada una con 750 mL de jugo (Brix ajustados a 16 °B), inoculado a 0.5% (v/v) e incubado a 30 ± 5 °C.

Análisis estadístico El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando software GSTATO4 y CPCS1.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aislamiento de la levadura A partir del cultivo primario de levadura aislado de la bebida de suero de leche, se seleccionaron treinta colonias con apariencia morfológica idéntica para su purificación en agar extracto de levadura-glucosa (GYE), agar extracto de levadura-glucosa-oxitetraciclina (OGYE) y agar Sabouraud a 37 °C. Se eligieron un total de diez colonias morfológicamente idénticas que en el proceso de purificación revelaron cuatro tipos de colonias diferentes, designadas

Tecnología

Se realizó el análisis fisicoquímico (pH, % de acidez, TSS, relación Brix/acidez y rendimiento de jugo) del jugo de amalaki recién preparado. El jugo natural de amalaki se diluyó con agua (13% jugo) y se agregó solución azucarada para alcanzar los 16.0 °B de TSS requeridos, porcentaje de acidez (0.320.40) y relación Brix/acidez (40:1). El jugo diluido se pasteurizó a 82 °C durante 15 segundos, se enfrió y se ajustó los Brix a 16 °B agregando solución azucarada seguida del cultivo a 0.5% (v/v). Se incubó a 20 ± 5 °C durante 36 horas. La bebida se refrigeró durante 24 horas, se extrajo con sifón, se embotelló y se almacenó en condiciones de refrigeración.

inicialmente como 84, 86, B82 y S82. Tres aislados de levadura (84, B82, S82) se obtuvieron de la bebida de suero de leche, mientras que el cuarto (86) se obtuvo de la superficie del queso feta madurado por bacterias.

Identificación y caracterización de la levadura Los resultados de la asimilación de carbono y las pruebas de fermentación mostraron que el aislado 84 fue capaz de fermentar D-glucosa, D-xilosa, y rafinosa mientras que asimilaba D-galactosa, L-sorbosa, D-glucosamina, D-ribosa, D-xylosa, L-arabinosa, sacarosa, maltosa, alfa, alfa-trehalosa, alfa-D-glucósido, melecitosa, glicerol, ribitol, D-sorbitol, D-manitol, D-glucono-1,5-lactona, 2-cetoD-gluconato, D-gluconato, DL-lactato, succinato, citrato y etanol. El aislado 84 tuvo un perfil fisiológico y bioquímico idéntico a Debaryomyces hansenii, a excepción de que el 84 no fue capaz de metabolizar almidón soluble, etilamina, L-lisina y cadaverina. De manera similar, el aislado 84 creció a temperaturas de hasta 42 °C; en condiciones de presión osmótica alta (50% glucosa); mostró prueba negativa a almidón; resistió la cicloheximida a 1000 ppm y no creció en medios libres de vitaminas. Con base en el análisis fisiológico, bioquímico, de homología de nucleótidos y filogenético (Tabla 1, Figura 1a), se detectó que el aislado 84 era Clavispora lusitaniae y se depositó en el GenBank del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés) bajo el número de registro EF221824. Se descubrió que el género y especie homólogos más cercanos al aislado 84, es Candida flosculorum (número de registro EF137918).

Bebidas Mexicanas | Abril 2013

Preparación de bebida de amalaki sin alcohol y naturalmente carbonatada

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Tabla 1. Porcentaje de homología del aislado de levadura (84) con base en la secuencia de nucleótidos. No. de serie

Aislados

EF221824

EF568047

EF568024

AY174102

AY493434

EU568925

AY321464

EF137918

AY321465

EF060724

Porcentaje de homología 1

100

77 *

Figura 1. Micrografías electrónicas de los aislados de levadura: (a) Clavispora lusitaniae (84), (b) Candida sp. YS12A (86), (c) Clavispora lusitaniae (B82) y (d) Candida hyderabadensis (S82).

El aislado S82 fue capaz de fermentar D-glucosa, Dxilosa y rafinosa mientras que asimilaba D-galactosa, L-sorbosa, D-glucosamina, D-ribosa, D-xilosa, D-arabinosa, sacarosa, maltosa, alfa, alfa-trehalosa, metilalfa-D-glucósido, melecitosa, glicerol, ribitol, D-sorbitol, D-manitol, D-glucono-1,5-lactona, 2-ceto-D-gluconato, D-gluconato, DL-lactato, succinato, citrato y etanol. De manera similar, el aislado S82 fue capaz de crecer a temperaturas de hasta 42 °C; en condiciones de presión osmótica alta (50% glucosa); mostró resultados negativos a la prueba de almidón, resistió la cicloheximida a 1000 ppm y no creció en medios libres de vitaminas. Con base en el análisis filogenético y de homología de nucleótidos (Tabla 4, Figura 1d), se detectó que el aislado S82 era Candida hyderabadensis y se depositó en el GenBank de NCBI bajo el número de registro AM180949. El género y especie homólogos más cercanos al aislado S82 fue Saccharomycetales.

El aislado B82 fue capaz de fermentar D-glucosa, D-xilosa y rafinosa, mientras que asimilaba D-galactosa, L-sorbosa, D-glucosamina, D-ribosa, D-xilosa, D-arabinosa, sacarosa, maltosa, alfa, alfa-trehalosa, alfa-D-glucósido, melecitosa, glicerol, ribitol, D-sorbitol, D-manitol, D-glucono-1,5-lactona, 2-ceto-D-gluconato, D-gluconato, DLlactato, succinato, citrato y etanol. De manera similar, el aislado B82 fue capaz de crecer a temperaturas de hasta 42 °C; en condiciones de presión osmótica alta (50% glu-

Tabla 2. Porcentaje de homología del aislado de levadura (86) con base en la secuencia de nucleótidos.

No. de serie

Aislados

DQ857760

EF060428

EF195357

AB109231

EU564206

EU564205

EU564202

EU552501

AY391843

AY939798

Porcentaje de homología 1

100

100 *

Tecnología

cosa); mostró resultados negativos a la prueba de almidón, fue resistente a la cicloheximida a 1000 ppm y no pudo crecer en medios libres de vitaminas. Con base en el análisis filogenético y de homología de nucleótidos (Tabla 3, Figura 1c) se detectó que el aislado B82 era Clavispora lusitaniae y se depositó en el GenBank del NCBI bajo el número de registro EF568047. Las pruebas morfológicas y de cultivo aplicadas a B82 también mostraron resultados análogos a los reportados para Candida intermedia. El género y especie homólogos más cercanos al aislado B82 es Candida intermedia.

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El aislado 86 fue capaz de fermentar D-glucosa y rafinosa mientras que asimilaba D-galactosa, L-sorbosa, D-glucosamina, D-ribosa, D-xilosa, L-arabinosa, sacarosa, maltosa, alfa, alfa-trehalosa, alfa-D-glucósido, melecitosa, glicerol, ribitol, D-sorbitol, D-manitol, Dglucono-1,5-lactona, 2-ceto-D-gluconato, D-gluconato, DL-lactato, succinato, citrato y etanol. El aislado 86 tenía un perfil fisiológico y bioquímico idéntico a Debaryomyces hansenii, a excepción de que el aislado 86 no metabolizó almidón soluble, etilamina, L-lisina y cadaverina. De manera similar, el aislado 86 creció a temperaturas de hasta 42 °C, en condiciones de presión osmótica alta (50% glucosa); dio negativo a la prueba de almidón, resistió la cicloheximida a 1000 ppm y no creció en medios libres de vitaminas. Con base en los análisis filogenético y de homología de nucleótidos (Tabla 2, Figura 1b) se detectó que el aislado 86 era Candida sp. YS12A. Se encontró que el género y especie homólogos más cercanos al aislado 86 es Saccharomycetales sp. LM46.

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Tabla 3. Porcentaje de homología del aislado de levadura (B82) con base en la secuencia de nucleótidos. No. de serie

Aislados

B82

EF568047

EF568024

EF221824

AF172262

AY493434

AY321469

AY321465

EF192222

AY500373

EF0607768

Porcentaje de homología 1

100

96 *

Tabla 4. Porcentaje de homología del aislado de levadura (S82) con base en la secuencia de nucleótidos. No. de serie

Aislados

S82

AM180949

EF060428

FM172983

AY391846

EU564200

AY700134

EU564193

AY391843

FM172980

EU564206

Porcentaje de homología 1

100

Selección de los aislados de levadura para la fermentación de diferentes jugos para la preparación de una bebida sin alcohol, naturalmente carbonatada Se utilizaron cuatro aislados de levadura, es decir 84, 86, B82 y S82 identificados como Clavispora lusitaniae, Candida sp. YS12A, Clavispora lusitaniae y Candida hyderabadensis, respectivamente, para llevar a cabo la fermentación en diferentes jugos (Tabla 5). El aislado de levadura Candida sp. YS12A (86) mostró una fermentación considerable en jugo de ciruela, amalaki, guayaba y piña mientras que el aislado de Clavispora lusitaniae (B82), tuvo una fermentación favorable en jugos de ci-

ruela, guayaba y piña con una carbonatación de 0.9 bar y una concentración de alcohol de 0.4% (v/v). El aislado de levadura Clavispora lusitaniae (84) fue más activo y llevó a cabo una fermentación vigorosa en jugo de ciruela, amalaki, guayaba, mandarina Kinnow y piña en comparación con Candida sp. YS12A (86), Clavispora lusitaniae (B82) y Candida hyderabadensis (S82) y se eligió como la mejor levadura para llevar a cabo la fermentación con un nivel de CO2 de 1.5 bar y una producción de alcohol de cerca de 0.7% en todos los jugos de fruta. El CO2 producido de esta forma es antimicrobiano y agrega un sabor agrio, efervescente y gaseoso a la bebida. En bebidas naturalmente carbonatadas, el pH, la concentración de

influenciada por el tipo de jugo de fruta que se utiliza en su formulación.

Tecnología para la preparación de una bebida sin alcohol, naturalmente carbonatada bajo condiciones optimizadas de fermentación

Estudios de vida útil

Composición fisicoquímica del jugo de amalaki

Se estudió y evaluó quincenalmente el tiempo de vida útil de la bebida de amalaki sin alcohol y naturalmente carbonatada almacenada a temperatura de refrigeración, para medir sus cualidades organolépticas, bioquímicas y microbiológicas.

Tabla 6. Parámetros fisicoquímicos del jugo de amalaki.

Preparación de una bebida sin alcohol y naturalmente carbonatada, a partir de amalaki La aceptabilidad de las bebidas depende en gran medida de sus propiedades fisicoquímicas. No hubo cambios significativos en las características fisicoquímicas que imparten el sabor y el aroma a las bebidas, durante la pasteurización y el almacenamiento. La estabilidad de bebidas a base de fruta también está

Parámetro

Amalaki

2.6

TSS (°B)

9.0

Acidez (%)

3.20

Relación Brix-acidez

2.81

Azúcares totales (%)

2.18

Azúcares reductores (%)

2.0

Ácido ascórbico (mg/100 mL)

204.0

Rendimiento en jugo (%)

44.0

Tabla 5. Selección de los aislados de levadura para fermentación en diferentes jugos de fruta para preparar una bebida sin alcohol y naturalmente carbonatada. Fermentación por aislados de levadura Clavispora lusitaniae EF221824

Candida sp. YS12A DQ857760

Clavispora lusitaniae EF568047

Candida hyderabadensis AM180949

Ciruela

+++

Amalaki

+++

Limón

Guayaba

+++

Kinnow

+++

Piña

+++

Concentración inicial de azúcar: 16 °B; periodo de incubación: 36 h aeróbicamente; temperatura de incubación: 30 °C; +++ Buena fermentación (0.7% alcohol y 1.5 bar CO2); ++ fermentación adecuada (0.4% alcohol y 0.9 bar CO2); – sin fermentación.

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Las características fisicoquímicas del Amalaki cv. Francis fueron TSS 9.0 °B, porcentaje de acidez titulable 3.20, pH 2.6, relación Brix/acidez 2.81, azúcares totales 2.18%, azúcares reductores 2.0%, ácido ascórbico 204 mg/100 mL y rendimiento de jugo de 44.0% (Tabla 6).

Se preparó una bebida sin alcohol y naturalmente carbonatada a partir de jugo de amalaki bajo condiciones optimizadas de concentración de inóculo (0.5%), temperatura de incubación (20 ± 5 °C), tiempo de incubación (36 horas) y TSS (16 °B), utilizando el mejor aislado de levadura, Clavispora lusitaniae (84). La bebida sin alcohol y naturalmente carbonatada obtenida es fresca, segura, estable, más natural, mínimamente procesada, libre de aditivos, contaminantes, adulterantes y de bacterias patógenas dañinas.

Jugo de fruta

Tecnología

azúcar, la temperatura óptima y el CO2, son los factores principales que influyen en el crecimiento de la levadura. Markides (1986) reportó que las levaduras fermentan el azúcar a alcohol y producen CO2 como un co-producto, creando una presión en la botella de aproximadamente 500-600 kPa (5-6 atmósferas) a 10 °C; después de completar la fermentación secundaria y por cada 100 kPa de aumento de presión, se requirieron aproximadamente 4 g/L de azúcar.

Tecnología Bebidas Mexicanas | Abril 2013

Efecto de la fermentación en las propiedades fisicoquímicas de la bebida de amalaki

bla 7). La presión de CO2, comenzó a mostrarse después de 15 días y llegó hasta 1.50 bar después de 90 días. Durante la fermentación, el CO2, alcohol y glicerol producidos, fueron proporcionales a la cantidad de azúcar fermentada. La cepa de levadura produjo una gran cantidad de glicerol a expensas del etanol, lo que presentó una alternativa ventajosa para el desarrollo de bebidas con bajo contenido de etanol versus procesos físicos que alteran las propiedades organolépticas del producto final. Eglinton et al. (2002) informó que el glicerol es el producto principal de fermentación de Saccharomyces cerevisiae que contribuye al carácter sensorial del vino. Se redujo el contenido de ácido ascórbico de la concentración inicial de 120 mg/100 mL a 108 mg/100 mL después de 30 días y disminuyó significativamente a 90.0 mg/100 mL después de 90 días (P ≤ 0.05). El ácido ascórbico (vitamina C) es un antioxidante importante que protege contra cáncer, enfermedades cardíacas y estrés. Es parte de la química celular que provee energía, está relacionada con la síntesis de colágeno, la calcificación de dientes y huesos así como con la formación de cartílagos, articulacio-

Los resultados obtenidos con la bebida de amalaki después de 90 días (Tabla 7) mostraron una disminución significativa en los grados Brix, de 16.0 a 13.0 y en la relación Brix/acidez de 42.10 a 22.80. El pH se mantuvo en 3.0 debido a la acción amortiguadora de los jugos y la acidez aumentó de 0.38 a 0.57 después de la fermentación durante un periodo de almacenamiento de 90 días bajo condiciones de refrigeración (4 °C). El porcentaje de disminución de azúcares totales, con un periodo de almacenamiento de 90 días, fue de 21.84% ya que disminuyó de 14.56% a 13.20% después de 30 días y descendió gradualmente hasta 11.38% al final de los 90 días, mientras que el porcentaje de disminución en los azúcares reductores fue de 42.26%, ya que descendió gradualmente de 9.96% a 5.75% después de 90 días (Tabla 7). La producción de etanol aumentó gradualmente de 0.15% a 1.16% después de 90 días. Los componentes volátiles como el propanol, butanol, acetaldehído, metanol, acetato de etilo e isopropanol, estuvieron ausentes de la bebida hasta los 90 días (Ta-

Tabla 7. Efecto del almacenamiento en los parámetros fisicoquímicos de la bebida de amalaki. Parámetros

Fresco

15 días

30 días

45 días

60 días

75 días

90 días

CD (5%)

3.0

3.1

2.9

3.0

TSS (°B)

16.0

15.50

15.0

14.0

13.50

13.0

0.303

Acidez (%)

0.38

0.44

0.48

0.51

0.54

0.57

0.003

Relación Brix-acidez

42.10

40.78

34.09

31.25

27.45

25.0

22.80

0.046

Azúcares totales (%)

14.56

14.08

13.20

13.12

12.44

11.88

11.38

0.050

Azúcares reductores (%)

9.96

9.53

8.77

8.32

7.06

6.58

5.75

0.047

Ácido ascórbico (mg/100 mL)

120.0

110.0

108.0

105.0

102.5

100.0

90.0

0.396

Etanol (%)

ausente

0.15

0.29

0.57

0.73

1.09

1.16

Propanol (%)

ausente

Butanol (%)

ausente

Acetaldehído (%)

ausente

Metanol (%)

ausente

Acetato de etilo (%)

ausente

Isopropanol

ausente

CO2 (bar)

0.90

1.20

1.50

Recuento total en placa (UFC/mL)

4.5 x 106

5.8 x 107

6.4 x 107

7.8 x 107

2.3 x 108

3.8 x 108

13% de jugo; temperatura de almacenamiento 4 °C; ns – no significativo.

•

CONCLUSIÓN La tecnología presentada en este documento puede corregir los problemas de los horticultores minimizando las pérdidas post-cosecha, evitando el exceso de frutas y verduras en el mercado y asegurando una utilización eficaz de frutas astringentes y altamente nutritivas en forma de una bebida sin alcohol naturalmente carbonatada, que retiene los nutrientes y mantiene las propiedades nutracéuticas de las frutas durante un periodo de tres meses.

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Tecnología

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Bebidas Mexicanas | Abril 2013

nes, piel y vasos sanguíneos (Champe y Harvey, 1994). Ayuda en la absorción de hierro dietético al mantenerlo en su forma reducida (forma ferrosa). El calentamiento o la deshidratación de frutas frescas provocan la destrucción de la mayor parte del ácido ascórbico originalmente presente. El amalaki es una excepción entre las frutas ya que contiene sustancias y una alta acidez que protegen parcialmente el ácido ascórbico de la destrucción por el calor o la deshidratación. La disminución del ácido ascórbico en las bebidas durante el almacenamiento es resultado de la oxidación del ácido ascórbico por la ácido ascórbico oxidasa, debido a un efecto combinado de oxígeno y luz (Tabla 7). Alwazeer et al. (2003) demostraron que los factores que contribuyen a la estabilidad del jugo de naranja pasteurizado son el potencial redox (Eh 240-360 mV) y las condiciones de reducción (Eh -180 mV), los cuales son necesarios para estabilizar el color y el ácido ascórbico durante el almacenamiento.

26 Bebidas Mexicanas | Abril 2013

TecnologĂa

New cocoa pulp-based kefir beverages: Microbiological, chemical composition and sensory analysis

Tecnología Bebidas Mexicanas | Abril 2013

Nuevas bebidas de kéfir a base de pulpa de cacao: Composición química, análisis microbiológico y sensorial

Cláudia Puerari 1, Karina Teixeira Magalhães 2 y Rosane Freitas Schwan 2,*

Departamento de Ciencias Alimentarias, Universidad Federal de Lavras, 32700-000 Lavras, MG, Brasil 2 Departamento de Biología, Universidad de Lavras, 37200-000 Lavras, MG, Brasil * Departamento de Biología, Universidade Federal de Lavras, 37.200-000 Lavras-MG, Brazil. Tel.: +55 35 38291614; fax: +55 35 38291100. E-mail: puerariclaudia@gmail.com (C. Puerari), gt-magalhaes@uol.com.br (K.T. Magalhães), rschwan@dbi.ufla.br (R.F. Schwan). 1

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RESUMEN El objetivo de este trabajo fue evaluar el uso de gránulos de kéfir como cultivo iniciador para nuevas bebidas de cacao (Theobroma cacao L.). Se llevó a cabo la fermentación al inocular los gránulos de kéfir en la pulpa de cacao. Los frascos que contenían los gránulos de kéfir y diferentes sustratos, se incubaron estáticamente a 10 y 25 °C durante 48 y 72 horas. La microbiota de los gránulos de kéfir brasileño y las bebidas de cacao con kéfir fueron caracterizadas utilizando técnicas moleculares. La electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización mostró comunidades que incluían levaduras: Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania unispora; y bacterias: Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum, Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum y una bacteria relacionada al género Acetobacter. Se detectó una estructura microbiana estable en las bebidas de cacao con kéfir y los gránulos de kéfir analizados. Esta solidez es determinante para la implementación futura de bebidas de kéfir a base de cacao. El contenido de ácido láctico, acético, málico, propanoico y cítrico aumentó durante las 72 horas del proceso de fermentación en las bebidas de kéfir, alcanzando un valor máximo de ~5.55 g/L, ~1.0 g/L, ~0.3 g/L, ~1.0 g/L y ~3.0 g/L, respectivamente. Los ácidos oxálico, tartárico, butírico y el glicerol se detectaron en concentraciones similares. Estos compuestos se encontraron durante las 48 y 72 horas del periodo de fermentación a 10 y 25 °C, a una baja concentración de ~1.4 g/L. También, se detectó metanol a una baja concentración de ~0.8 g/L. Las bebidas fermentadas a 10 °C durante 48 y 72 horas produjeron cantidades menores de etanol ~4.5 g/L (0.36% v/v). Estas bebidas tuvieron la mayor aceptación (92% y 100% de los panelistas, respectivamente), con base en el sabor, olor y apariencia de las bebidas. La mejor aceptación puede deberse a una concentración baja de acidez y alcohol. En este estudio fue posible producir bebidas alcohólicas de kéfir (concentración de etanol de ~45.0 g/L (3.6% v/v)) con fermentación de la pulpa de cacao por un periodo de 48 y 72 horas a 25 °C. Estas bebidas tuvieron una aceptación del 80% de los panelistas. Este estudio es el primero en reportar la producción de una bebida alcohólica de kéfir a partir de cacao. Con base en las características químicas y la aceptación en el análisis sensorial, estos resultados abren las perspectivas para la aplicación innovadora de gránulos de kéfir para el desarrollo de bebidas a base de pulpa de cacao.

Palabras clave: Comunidad microbiana, kéfir con alcohol y sin alcohol, fruta, metabolitos microbianos, PCR-DGGE.

ABSTRACT The aim of the present work was to evaluate the use of the kefir grains as a starter culture for new cocoa (Theobroma cacao L.) beverages. Fermentation was performed by inoculating kefir grains in cocoa pulp. Flasks containing kefir grains and different substrates were statically incubated at 10 and 25 °C for 48 and 72 h. The microbiota of Brazilian kefir grains and kefir cocoa beverages was characterized using molecular techniques. Denaturing gradient gel electrophoresis displayed communities included yeasts: Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania unispora, and bacteria: Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum, Lactobacillus kefiranofaciens

Tecnología these results open up perspectives for this innovative application of kefir grains for developing cocoa pulpbased beverages. Key words: Fruit, microbial community, microbial metabolites, non-alcoholic and alcoholic kefir, PCR-DGGE.

INTRODUCCIÓN Las bebidas de cacao (Theobroma cacao L.) existen desde antes del año 1000 a.C., lo que recapitula el uso confirmado del cacao en Mesoamérica al menos 500 años. El cacao crudo, después de procesado, se vende principalmente como chocolate. La cantidad de pulpa es crucial para afectar la eficacia y calidad de la fermentación. La pulpa sobrante también puede venderse como un producto de alto valor. La pulpa de cacao contiene entre 82-87% de agua, 10-15% de azúcar (60% sacarosa y 39% mezcla de glucosa y fructosa), 2-3% pentosas, 1-3% ácido cítrico y 1-1.5% pectina. También contiene proteínas, aminoácidos, vitaminas (principalmente vitamina C) y minerales, lo que lo convierte en un medio rico para el crecimiento microbiano (Dias, Schwan, Carlos & Lima, 2003; Schwan, 1998; Schwan & Wheals, 2004). Se puede utilizar la pulpa para preparar mermelada, gelatina y jugo; este último puede utilizarse para preparar bebidas fermentadas como licor de cacao y otros productos (Duarte et al., 2010).

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subsp. kefiranofaciens, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, and a bacterium related to the genus Acetobacter. A microbial steady structure was detected in the analyzed kefir cocoa beverages and kefir grains. This robustness is determinant for future implementation of cocoa-based kefir beverages. The lactic, acetic, malic, propionic and citric acid contents increased during the 72 h of fermentation process in kefir beverages, reaching maximum value of ~5.55 g/L, ~1.0 g/L, ~0.3 g/L, ~1.0 g/L and ~3.0 g/L respectively. Oxalic, tartaric, butyric acids and glycerol were detected in similar concentrations. These compounds were found during the 48 and 72 h fermentation period at 10 and 25 °C in low concentration of ~1.4 g/L. Methanol also was detected in low concentration of ~0.8 g/L. The beverages fermented at 10 °C during 48 and 72 h produce lower amounts of ethanol ~4.5 g/L (0.36% v/v). These beverages had the greater acceptance (92% and 100% of the panelist, respectively) based on taste, odor, and appearance of the beverages. The best acceptance may be due to low acidity/alcoholic concentration in the beverages. In this study it was possible to produce alcoholic kefir beverages (ethanol concentration of, ~45.0 g/L (3.6% v/v)) with cocoa pulp fermentation for a period of 48 and 72 h at 25 °C. These beverages had acceptance by 80% of the panelist. This study is the first to report the alcoholic kefir beverage production from cocoa. Based on the chemical characteristics and acceptance in the sensory analysis,

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El kéfir se originó en las montañas del Cáucaso y consistía en gránulos irregulares, blancos o amarillos de proteína y una matriz de polisacáridos, llamada kefiran, producida por bacterias ácido lácticas. La microbiota simbiótica en el kéfir depende de su fuente y región geográfica (Grønnevik, Falstad & Narvhus, 2011; Miguel, Cardoso, Magalhães & Schwan, 2011; Silva, Rodrigues, Filho & Lima, 2009; Zhou, Liu, Jiang & Dong, 2009). Los granos de kéfir contienen bacterias ácido lácticas (LAB), incluyendo Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus y levaduras (Kluyveromyces, Candida y Saccharomyces). Las bacterias y levaduras están rodeadas por la matriz de kefiran, que es un polisacárido de glucosa y galactosa ramificado y soluble en agua (Gulitz, Stadie, Wenning, Ehrmann & Vogel, 2011; Magalhães, Pereira, Dias & Schwan, 2010). La fermentación del sustrato genera una bebida refrescante con sabor ácido, ligeramente carbonatada y con bajo contenido alcohólico y acético (Grønnevik et al., 2011; Miguel et al., 2011). Se ha sugerido que el kéfir tiene propiedades como alimento para mejorar la salud. Varias de las diferentes bacterias y levaduras encontradas en el kéfir son reconocidas como probióticos (Latorre-García, Castillo-Agudo & Polaina, 2006; LeBlanc, Matar, Farnworth & Perdigon, 2006; Zhou et al., 2009). Los gránulos de kéfir pueden utilizarse para fermentar cualquier tipo de leche, suero de queso o jugo de fruta, melazas o soluciones azucaradas, cuando se le nombra kéfir azucarado, kéfir de agua o tíbico (tepache de tíbicos) (Koutinas et al., 2009; Magalhães, Pereira, Dias et al., 2010). A través de los años se han estudiado nuevos y diversos métodos para procesar frutas, en un intento de minimizar las pérdidas de producción, incrementar el ingreso de los agricultores e introducir nuevos productos al mercado (Duarte et al., 2010). Diferentes trabajos han reportado el uso de frutas para la producción de licor de frutas (AyalaZavala et al., 2011; Dias, Schwan, Freire & Serôdio, 2007; Dias et al., 2003; Duarte et al., 2010). El desarrollo de una bebida a base de jugo de fruta fermentada con kéfir, podría ser visto por los consumidores como algo saludable. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar el efecto de la pulpa de cacao en la fermentación del kéfir azucarado y esclarecer la estabilidad, organización e identificación de la microbiota dominante presente en los gránulos de kéfir brasileño y las bebidas correspondientes. Se llevó a cabo la evaluación de los cambios bioquímicos, ácidos orgánicos y la producción de alcohol durante el proceso de fermentación y el análisis sensorial de la nueva bebida de cacao y kéfir (bebida CK).

MATERIALES Y MÉTODOS Preparación del mosto de cacao Las vainas de cacao se obtuvieron del estado de Bahía en la región noreste de Brasil. Se lavaron y se partieron para extraer las semillas y se procesaron en el CEPEC/ CEPLAC (Centro de investigación del Cacao, Itabuna, BA, Brasil). Se extrajo la pulpa utilizando una máquina despulpadora automática (ITAMETAL 0.5 DS, Itabuna, BA, Brasil). Para preparar el mosto en fermentación, se descongeló la pulpa de cacao a temperatura ambiente. La pulpa de ca-

Gránulos de kéfir y preparación del inóculo En los experimentos, se utilizaron granos de kéfir brasileño (cultivo madre del Laboratorio de Microbiología de la Universidad de Lavras, Brasil). Se preparó el inóculo cultivando los granos de kéfir en una solución de azúcar morena a 12 °B, renovada diariamente, por un periodo de 7 días. Después de este tiempo, se lavaron los gránulos con agua destilada esterilizada y subsecuentemente, se inocularon (25.5 g de gránulos) en 225 mL de sustrato de fermentación a 12 °B. Los procesos de fermentación se desarrollaron en condiciones estáticas a 10 y 25 °C durante 48 y 72 horas. Las condiciones estáticas y la temperatura de 25 °C se utilizan normalmente en la fermentación de kéfir (Beshkova, Simova, Frengova, Simov & Dimitrov, 2003; Magalhães, Dias, Pereira, Campos et al., 2011; Magalhães, Dias, Pereira, Oliveira et al., 2011; Magalhães, Dragone et al., 2011; Magalhães, Pereira, Nicolau et al., 2010; Zajšek & Goršek, 2010). La temperatura de 10 °C se eligió al azar. El objetivo era permitir el crecimiento del conjunto microbiano presente en los gránulos de kéfir a bajas temperaturas y analizar las diferencias en la composición química y microbiológica.

Tecnología

Se tomaron muestras de la bebida asépticamente después del comienzo y al final del proceso de fermentación. Se llevaron a cabo análisis químicos y microbiológicos en los tres lotes. Los gránulos de kéfir fueron recuperados (filtrados) al final del proceso de fermentación y las bebidas fueron evaluadas por medio de análisis sensorial.

Extracción de ADN y análisis PCR-DGGE Los gránulos de kéfir y el producto fermentado, recolectados al final de las fermentaciones, se congelaron al momento del muestreo y se almacenaron a -20 °C. También se recolectaron las muestras de los granos utilizadas como inóculo. Se centrifugaron aproximadamente 1.5 mL de cada muestra líquida (es decir, de bebida) a 13,000 g durante 5 minutos, cinco veces (para lograr una concentración de biomasa mayor y mejor). Los pellets resultantes se suspendieron nuevamente en 400 µL de agua desmineralizada estéril. Cada muestra (gránulos y bebida) se transfirió a un tubo de plástico y se sometió a extracción de ADN utilizando un kit NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel, Düren, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se almacenó a -20 °C. El ADN genómico se utilizó como plantilla para la amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) de re-

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cao tenía un promedio de 13.1 °Brix (°B) y pH de 3.8, se diluyó en agua para reducir la turbidez y ajustar los sólidos solubles a 12 °B (1:1.5 v/v). El mosto de cacao y el control se pasteurizaron a 72 °C/15 min en vapor fluido.

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giones ribosomales objetivo de hongos o bacterias y su posterior análisis con electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE, por sus siglas en inglés). Se utilizaron dos sets de primers para el análisis de las comunidades microbianas. La Tabla 1 muestra información sobre los primers y las condiciones de PCR y DGGE. Todas las PCR se llevaron a cabo en una mezcla (50 µL) que contenía: 0.625 U de ADN polimerasa Taq (Invitrogen, Barcelona, España), 2.5 µL de solución amortiguadora 10x, dNTP 0.1 mM, 0.21 µL de cada primer, MgCl2 1.5 mM y 1 µL de ADN extraído. Las alícuotas (2 µL) de los productos de amplificación se analizaron por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1% y tinción por SYBR Green (Invitrogen, Foster City, Estados Unidos). Se calculó el tamaño de los productos utilizando una escalera de ADN de 100 pb (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania). Los productos de las PCR se analizaron por DGGE utilizando un sistema universal de detección de mutaciones DCode de Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA, Estados Unidos). Las muestras se aplicaron en geles de poliacrilamida al 8% (p/v) en TAE 0.5x. La separa-

ción óptima se alcanzó con un gradiente de desnaturalización urea-formamida de 30-55% para las comunidades bacterianas y 12-60% para las comunidades de levaduras (100% correspondiente a 7 M de urea y 40% (v/v) de formamida). Los geles se corrieron de acuerdo con las condiciones mostradas en la Tabla 1. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con SYBR Green (Invitrogen, Foster City, Estados Unidos) durante 30 minutos y se fotografiaron con una cámara Polaroid. Se extrajeron las bandas prominentes del gel, se reamplificaron y se sometieron a DGGE como se describió anteriormente. Los nuevos productos de la PCR se purificaron utilizando el kit de purificación QIAEX® III (Qiagen, Chatsworth, CA, Estados Unidos) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN se reamplificó utilizando las mismas condiciones de PCR mostradas anteriormente (Tabla 1). Los productos de PCR se secuenciaron por MACROGEN (Corea). Posteriormente las secuencias se compararon con la base de datos de GenBank utilizando el algoritmo BLAST (Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés), MA, Estados Unidos).

Químicos La sacarosa, glucosa y fructosa se obtuvieron de SigmaAldrich (St. Louis, MO, Estados Unidos). El ácido acético, ácido láctico, etanol y metanol se adquirieron en Merck (Darmstadt, Alemania). El glicerol y los ácidos oxálico, cítrico, tartárico, málico, succínico, propanoico y butírico, en Fluka Analytical (Seelze, Alemania).

Análisis por HPLC El etanol, glicerol, ácidos orgánicos (láctico, acético, málico, propanoico, butírico, oxálico y cítrico) y carbohidratos (glucosa, sacarosa y fructosa) se cuantificaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los análisis se realizaron utilizando un cromatógrafo Shimadzu, modelo LC-10 Ai (Shimadzu Corp., Japón), equipado con un sistema dual de detección que consiste en un detector Ultra Violeta (UV) y un detector de índice de refracción (RI – 10 A). Se utilizó una columna de intercambio catiónico Shimadzu (Shim-pack SCR-

101H, 7.9 mm x 30 cm) operada a 30 °C para azúcares y etanol y a 50 °C para los ácidos orgánicos, utilizando ácido perclórico 100 mM como eluyente a un flujo de 0.6 mL/min. Los ácidos se detectaron a través de absorción UV (210 nm), mientras que los azúcares y el etanol se detectaron vía índice de refracción. Los azúcares, ácidos y alcoholes individuales se identificaron por comparación de sus tiempos de retención con los tiempos de retención de los estándares certificados. La cuantificación de alcoholes, azúcares y ácidos se llevó a cabo utilizando curvas de calibración obtenidas con los compuestos estándares. Todas las muestras se examinaron por triplicado.

Evaluación sensorial Las bebidas CK finales fueron evaluadas en una prueba sensorial. Se pidió a los degustadores que indicaran qué tanto les gustaba o disgustaba cada producto en una escala hedónica de 9 puntos (9=extremadamente agradable; 1=extremadamente desagradable), con base en el sabor, olor y apariencia de las bebidas, de acuerdo con la escala hedónica (Moraes, 1993) aplicada a veinticinco evaluadores no entrenados, hombres y mujeres de 25-35 años de edad (estudiantes y personal del Departamento de Biología, Universidad Federal de Lavras, Brasil). Se sirvieron, al azar, muestras refrigeradas (10 °C) de 10 mL en copas transparentes con volumen de 50 mL; los vasos se marcaron con números aleatorios de tres dígitos y se cubrieron con cajas Petri.

Tabla 1. Primers de PCR-DGGE utilizados para detectar las comunidades de hongos y bacterias en las bebidas CK. Primer

Secuencia (5’-3’)

Comunidad

Objetivo

ITS1fGC

TCC GTA GGT GAA CCT GCG G Grapa de GC conectada al extremo 5’ de ITS1gc

Fúngica

Región ITS del ADNr

ITS4r

TCCTCCGCTTATTGATATGC

338fGC

GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG Grapa de GC conectada al extremo 5’ de 338fgc

518r

Bacteriana

PCR

Condiciones de DGGE

Referencias

Condición 1

16 h a 70 V a 60 °C

Magalhães, Pereira, Nicolau et al. (2010).

Región V3 del gen de ADNr 16S

ATT ACC GCG GCT GCT GG

Grapa de GC - CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GG. f- primer hacia adelante; r- primer en reversa. Condición 1 - desnaturalizado por 5 min a 95 °C. 30 ciclos: desnaturalizado a 92 °C por 60 s, alineamiento a 55 °C por 60 s y extensión a 72 °C por 60 s. Extensión final por 10 min a 72 °C.

Tecnología

Los análisis de pH y sólidos solubles se realizaron de acuerdo con la metodología propuesta por la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC por sus siglas en inglés, 2000). El pH de las bebidas se midió a temperatura ambiente, utilizando un peachímetro (Micronal, modelo B474, Alemania). Los sólidos solubles se determinaron utilizando un refractómetro digital (ATAGO PR-1000). Los resultados se expresan en °B.

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Mediciones físicas

Tecnología

Análisis estadístico Se llevó a cabo cada fermentación por duplicado y se reportan las medias ± desviaciones estándar. Se realizó la prueba de Tukey utilizando el software Statgraphics Plus para Windows 4.1 de Statistical Graphics Corp. Software (Descarga gratuita), para evaluar la significancia estadística (nivel de P<0.05) de las diferencias entre las bebidas y para comparar las medias entre las muestras.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Para determinar la composición de la microbiota en los gránulos de kéfir y bebidas CK, se amplificó el gen longitudinal 16S ARNr bacteriano y fragmentos ITS de ADNr fúngico. Se secuenciaron los perfiles de DGGE y las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias depositadas en la base de datos GenBank utilizando el programa de búsqueda BLAST del NCBI (Tabla 2). Las bandas bacterianas K1, K2, K3 y K4 estuvieron estrechamente relacionadas con Lactobacillus kefiranofaciens subsp.

de la región V3 de ADNr 16S bacteriano, amplificada a partir de muestras de granos de kéfir y bebidas de kéfir y cacao. (b) Perfiles de DGGE de fragmentos de la región ITS de ADNr fúngico, amplificada a partir de muestras de granos de kéfir y bebidas de kéfir y cacao. Abreviaciones: GI = grano (inóculo); GFC = grano (fermentación de cacao); BFC = bebida (fermentación de cacao); K1 = Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum, K2 = Lactobacillus plantarum, K3 = Lactobacillus fermentum, K4 = Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens, K5 = Acetobacter sp., K6 = Kluyveromyces marxianus, K7 = Saccharomyces cerevisiae, K8 = Kazachstania unispora.

Fermentación 48h

Fermentación 72h

Fermentación 48h

Fermentación 72h

Gradiente de desnaturalización urea-formamida

Los perfiles bacterianos y de levaduras de DGGE de las cuatro fermentaciones (a 10 y 25 °C para 48 y 72 horas) se muestran en la Figura 1a y 1b, respectivamente. No se encontraron diferencias en la estructura de las comunidades microbianas de las bebidas fermentadas y de los granos de kéfir, lo que sugiere la participación del mismo grupo de microorganismos en las diferentes fermentaciones realizadas. Hubo una población estable a través de la fermentación. Las dinámicas de la población están relacionadas con la capacidad de utilizar carbohidratos eficientemente, la regulación eficiente del equilibrio redox, así como con la tolerancia a la acidificación (Magalhães, Pereira, Dias et al., 2010). Ya que las condiciones ecológicas permanecieron sin cambios, no se detectaron cambios en la composición de las especies. Las bebidas de kéfir constituyen un ambiente caracterizado por un pH de aproximadamente 4.5 producido por bacterias ácido lácticas - el grupo más grande de bacterias pertenecientes a la microbiota del kéfir-, inhibiendo el crecimiento de otros grupos de microorganismos debido a la actividad antimicrobiana del kefiran. Por lo tanto, únicamente algunas cepas son altamente competitivas bajo las condiciones ecológicas predominantes y pueden persistir por décadas en procesos fermentativos propagados continuamente (Magalhães, Pereira, Dias et al., 2010).

Figura 1. Perfiles microbianos de DGGE. (a) Perfiles de DGGE

Gradiente de desnaturalización urea-formamida

Análisis microbiológico independiente del cultivo utilizando la estrategia PCR-DGGE

kefirgranum (99%), Lactobacillus plantarum (99%), Lactobacillus fermentum (99%) y L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens (99%), respectivamente, mientras que K5 estaba relacionada al género Acetobacter. La banda relacionada con Acetobacter sp. no pudo ser distinguida a nivel de especie de acuerdo con los datos de NCBI, mostrando identidad del 100% con más de una especie de

Las bandas de levaduras (K6, K7 y K8) estuvieron estrechamente relacionadas con Kluyveromyces marxianus (100%), Saccharomyces cerevisiae (100%) y Kazachstania unispora (99%), respectivamente (Tabla 2). Los perfiles de DGGE con primer específico para Eukarya, como se presenta en la Figura 1b, fueron considerablemente más simples que la ecología bacteriana. S. cerevisiae y K. unispora fueron las especies más dominantes durante todos los procesos de fermentación, como se reveló por medio de la secuenciación de la banda intensa de DGGE en todas las muestras de fermentación. K. marxianus también pudo

A pesar de las diferencias específicas en la microbiota de gránulos de kéfir obtenido de diferentes orígenes, la coexistencia de una asociación simbiótica entre las bacterias ácido lácticas y las levaduras, incluidas en una matriz de polisacáridos y proteínas, permite la fermentación láctica-alcohólica que forma el núcleo que caracteriza el concepto del kéfir (Miguel, Cardoso, Lago y Schwan, 2010; Miguel et al., 2011). Un grupo probiótico importante de bacterias, es Lactobacillus spp., el cual se encuentra constantemente (Latorre-García et al., 2006; LeBlanc et al., 2006; Zhou et al., 2009). Siendo así, las propiedades probióticas de las bebidas de kéfir brasileño a base de cacao encontradas en este estudio podrían extenderse a otras bebidas de kéfir y fruta.

Tabla 2. Identificación de bandas bacterianas y de levaduras por secuenciación de porciones del ARNr 16S e ITS, respectivamente. Bandas

Especies

Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum

Número de registro de GenBank AB372208.1

Lactobacillus plantarum

% de similitud

Valor E

0.0

HQ293084.1

124

Lactobacillus fermentum

HQ293040.2

0.0

Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens

AJ575259.1

0.0

Acetobacter sp.

Kluyveromyces marxianus

AF543841.1

100

0.0

Saccharomyces cerevisiae

AM262824.1

100

0.0

Kazachstania unispora

EU789404.1

1e12

Tecnología

ser detectado en todas las muestras, pero la densidad de su banda era comúnmente débil en el proceso de fermentación de 48 h a 10 °C. Magalhães, Pereira, Nicolau et al. (2010) reportaron que la presencia de levaduras del género Kazachstania en el kéfir podría estar conectada con la asimilación de algunos ácidos producidos por LABs. K. marxianus muestra gran actividad en condiciones de alta acidez, consume parte del ácido láctico y produce etanol y dióxido de carbono (Zhou et al., 2009). La presencia de S. cerevisiae contribuye al mejoramiento de la calidad organoléptica de la bebida de kéfir, promoviendo un fuerte y típico aroma a levadura, así como un sabor refrescante y amargo. Esta levadura también reduce la concentración de ácido láctico, elimina el peróxido de hidrógeno y produce compuestos que estimulan el crecimiento de otras bacterias, incrementando así la producción de exopolisacáridos (Magalhães, Pereira, Nicolau et al., 2010).

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Acetobacter (por ejemplo, A. pasteurianus, A. lovaniensis y A. syzygii). Los perfiles bacterianos de DGGE exhibieron a las especies dominantes y la intensidad de cada banda indicó su abundancia relativa. L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens y Acetobacter sp. se encontraron en todos los procesos de fermentación y mostraron bandas de alta intensidad, indicando que son las especies bacterianas dominantes durante los procesos de fermentación. L. kefiranofaciens aislado del kéfir es una bacteria heterofermentativa que produce etanol, ácido acético, dióxido de carbono, diacetil, acetoína, 2-3-butanodiol y formiato, además de ácido láctico y también se ha reportado como productor de kefiran (exopolisacárido) en el kéfir (Chen, Hsiao, Hong, Dai & Chen, 2012). L. plantarum es una de las bacterias ácido lácticas más utilizadas, muestra metabolismo homofermentativo, tolerancia moderada al ácido y es considerada como un microorganismo Generally Recognized As Safe (Generalmente Reconocido como Seguro; GRAS, por sus siglas en inglés) (Brinques & Ayub, 2011).

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Parámetros físicos y químicos Se monitorearon las bebidas CK durante el periodo de fermentación de 48 y 72 horas a 10 y 25 °C por medio de la determinación de la acidez. La Tabla 3 enlista los cambios en los valores de pH durante la fermentación. El valor de pH disminuyó principalmente en las primeras 48 horas y se registró un valor de pH de 3.8 ± 0.04 al final de la fermentación. Hubo diferencia significativa entre los pHs finales a 10 °C (4.00 ± 0.50 (48 h) 3.94 ± 0.10 (72 h)) y 25 °C (3.84 ± 0.01 (48 h) 3.80 ± 0.04 (72 h)) en las bebidas de cacao y kéfir. Estos resultados mostraron que el periodo de fermentación y la temperatura influenciaron la acidez final de las bebidas CK. Los valores de pH del caldo de fermentación influenciaron significativamente el tiempo de fermentación de los azúcares y los niveles de los compuestos volátiles, reflejando posibles variaciones en las características sensoriales del producto final. Se utilizó cromatografía líquida de alta resolución para analizar ácidos orgánicos, etanol y azúcares producidos en las bebidas CK. Las Figuras 2 y 3 muestran las concentraciones de azúcares, ácidos orgánicos y etanol obtenidas por la fermentación de la pulpa de cacao a 10 y 25 °C por 48 y 72 horas. Los procesos de producción de ácidos orgánicos y alcoholes fueron monitoreados mediante el consumo de sacarosa, glucosa y fructosa en las bebidas CK. El consumo total de sacarosa, glucosa y fructosa se observó únicamente después de las 72 horas de fermentación a 25 °C (Figura 3a). El periodo anterior a 72 horas de fermentación refleja probablemente un periodo de adaptación de las comunidades microbianas del kéfir a la pulpa de cacao, ya que los granos de kéfir se fermentan comúnmente en leche y azúcar morena. Las bebidas fermentadas a 10 °C no mostraron un consumo total de azúcares (sacarosa, glucosa y fructo-

sa). Este resultado muestra que el periodo de fermentación de la bebida CK y la temperatura, interfirieron con el metabolismo de la microbiota y consecuentemente en el consumo de azúcar. En el presente trabajo, el contenido de ácido láctico aumentó durante las 72 horas de fermentación en las bebidas CK, alcanzando un valor máximo de ~1.0 g/L en bebidas fermentadas a 10 °C y ~5.55 g/L en bebidas fermentadas a 25 °C (Figura 2b, 3b). La producción de ácido láctico indicó la heterogeneidad metabólica de la población de LABs, en las que las vías homofermentativa y heterofermentativa están activas simultáneamente. La gran mayoría de las LAB durante la fermentación utilizan glucosa a través de la vía Embden-Meyerhof para la producción de ácido láctico. Sin embargo, algunas especies utilizan glucosa a través de la vía hexosa monofosfato produciendo ácido láctico, etanol, ácido acético, glicerol, manitol y CO2 (Magalhães, Dias, Pereira, Campos et al., 2011; Magalhães, Dias, Pereira, Oliveira et al., 2011; Zajšek & Goršek, 2010). El ácido acético también se formó durante el proceso de fermentación de las bebidas CK, alcanzando un valor máximo de ~2.0 g/L en 72 horas de fermentación a 10 °C (Figura 3b) y ~10.5 g/L en 72 horas de fermentación a 25 °C (Figura 2b). El ácido acético se formó probablemente por bacterias heterolácticas y Acetobacter, identificadas previamente en las bebidas CK; y la temperatura de 25 °C pudo contribuir al aumento de la población de microorganismos productores de ácido acético. Estos resultados son de gran importancia ya que el ácido láctico y el ácido acético aportan un sabor agradable e inhiben el desarrollo de microorganismos indeseables o patógenos, debido a que incrementan la acidez.

Tabla 3. Compuestos químicos y valores de pH en las bebidas CK. Temperatura/ Tiempo de fermentación

Ácido oxálico g/L

Ácido tartárico g/L

Ácido butírico g/L

Glicerol g/L

Metanol g/L

-0 h

0.03 ± 0.01a

0.04 ± 0.01a

0.03 ± 0.01a

n.d.

5.30 ± 0.02d

10 °C/48 h

1.38 ± 0.01b

1.39 ± 0.01b

1.38 ± 0.01b

0.79 ± 0.01c

4.00 ± 0.50e

10 °C/72 h

1.38 ± 0.01b

1.39 ± 0.01b

1.38 ± 0.01b

0.79 ± 0.01c

3.94 ± 0.10e

25 °C/48h

1.39 ± 0.01b

1.38 ± 0.01b

1.41 ± 0.01b

1.39 ± 0.01b

0.81 ± 0.01c

3.84 ± 0.01f

25 °C/72h

1.39 ± 0.01b

1.38 ± 0.01b

1.41 ± 0.01a

1.39 ± 0.01b

0.81 ± 0.01c

3.80 ± 0.04f

Los datos son valores medios del duplicado ± desviación estándar. a,b,c,d,e,f Las letras diferentes indican diferencias significativas (P<0.05). n.d = no detectado.

Figura 2. Parámetros químicos del proceso de fermentación de

Figura 3. Parámetros químicos del proceso de fermentación de

las bebidas de cacao y kéfir a 10 °C. (a) Azúcares y alcoholes; (b) ácidos orgánicos; *Significativamente diferente (P<0.05) entre compuestos iguales.

las bebidas de cacao y kéfir a 25 °C. (a) Azúcares y alcoholes; (b) ácidos orgánicos; *Significativamente diferente (P<0.05) entre compuestos iguales.

Los ácidos oxálico, tartárico y butírico y el glicerol, se detectaron en las bebidas CK en concentraciones similares. Estos compuestos se encontraron durante las 48 y 72 horas de fermentación a 10 y 25 °C a una baja concentración de ~1.4 g/L (Tabla 3). Los ácidos orgáni-

Tecnología

nico, aumentó el valor de pH favoreciendo el crecimiento de bacterias menos tolerantes al ácido (Lopandic, Zelger, Bánszky, Eliskases-Lechner & Prillinger, 2006; Schwan & Wheals, 2004). El ácido propanoico es un compuesto con actividad aromática importante en la pulpa de cacao y comúnmente se encuentran ácidos cítrico y málico en las bebidas fermentadas de fruta, actuando como conservadores de bebidas por sus propiedades antimicrobianas (Nualkaekul & Charalampopoulos, 2011).

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Los ácidos málico, propanoico y cítrico también se detectaron en las bebidas CK (Figuras 2b y 3b). El ácido málico y el ácido propanoico se detectaron en concentraciones de ~0.3 g/L y ~1.0 g/L respectivamente, en las bebidas CK fermentadas por 48 y 72 horas (10 y 25 °C). Se detectó ácido cítrico en concentraciones de ~3.0 g/L y ~2.5 g/L a 48 horas de fermentación (10 y 25 °C). En el proceso de fermentación a 10 °C durante 72 horas, la concentración de ácido cítrico fue casi la misma que para 48 horas. Sin embargo, en el proceso de fermentación a 25 °C durante 72 horas, el ácido cítrico se consumió a una concentración de 1.5 g/L. Parte del ácido cítrico fue metabolizado por microorganismos como fuente de carbono y energía; como resultado del metabolismo de S. cerevisiae, que tuvo la capacidad de fermentar/asimilar este ácido orgá-

g/L

sacarosa glucosa fructosa metanol

metanol

etanol

g/L

sacarosa glucosa

fructosa

ácido acético

ácido cítrico

ácido málico

ácido láctico

ácido propanoico

ácido acético

ácido cítrico

ácido málico

ácido láctico

ácido propanoico

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cos (oxálico, tartárico, butírico), producidos por la levadura y especies bacterianas, contribuyen al sabor refrescante, aroma y textura únicos, además de controlar el crecimiento de microorganismos de descomposición en los alimentos (Duarte et al., 2010). La concentración de glicerol detectada en las bebidas CK fue baja. Este valor fue consistente con los valores menores a 10.0 g/L, sugeridos por Dias et al. (2007) como característica para dar cuerpo y textura a la bebida. El glicerol es el principal producto secundario en las fermentaciones alcohólicas de S. cerevisiae, la cual fue detectada por el análisis de secuenciación de las bandas de DGGE en este trabajo. Se detectó metanol en las bebidas CK (durante el periodo de fermentación de 48 y 72 horas a 10 y 25 °C) a una baja concentración de ~0.8 g/L (Tabla 3). El metanol es un

alcohol tóxico indeseable en el procesamiento de jugos, que puede producirse a partir de la hidrólisis de grupos metil éster de la pectina. Esto sucede de forma natural a un bajo nivel en jugos de fruta fresca y en la mayoría de las bebidas alcohólicas, en niveles menores a 3.0 g/L (Duarte et al., 2010). La concentración de etanol aumentó durante el proceso de fermentación de kéfir en todas las bebidas CK, alcanzando una concentración máxima de ~4.5 g/L (0.36% v/v) en 48 y 72 horas de fermentación a 10 °C y ~45.0 g/L (3.6% v/v) en 48 y 72 horas de fermentación a 25 °C (Figuras 2 y 3). Las bebidas fermentadas a 10 °C podrían clasificarse como no alcohólicas de acuerdo con la legislación brasileña (Brasil, 2009), ya que el contenido de etanol fue menor a 0.5% (v/v). Se ha reportado que, durante la fermentación, la temperatura

Tabla 4. Distribución de las respuestas en la escala hedónica, con los índices estadísticos resultantes para las bebidas CK.

Frecuencia de las respuestas Descripción de la escala de puntos

Valor asignado

Extremadamente agradable

Bebida CK 10 °C/48h

Bebida CK 10 °C/72h

Bebida CK 25 °C/48h

Bebida CK 25 °C/72h

Muy agradable

Moderadamente agradable

Ligeramente agradable

Ni agradable ni desagradable

Ligeramente desagradable

Moderadamente desagradable

Muy desagradable

Extremadamente desagradable

Respuestas totales

Media

7.08

7.28

4.68

4.56

Desviación estándar

1.35

0.98

2.25

2.43

Porcentaje de respuestas sobre “desagradable”

20%

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39 es el factor que tiene una influencia importante en la producción de etanol puesto que las bajas temperaturas disminuyen la tasa metabólica de las levaduras y como consecuencia la producción de etanol. Las levaduras crecen y proliferan rápidamente dentro del rango de temperatura de 19 y 25 °C (Zajšek & Goršek, 2010). S. cerevisiae, anteriormente identificada en las bebidas CK y que exhibe un gran metabolismo fermentativo y tolerancia al etanol, es la principal responsable de la producción de alcohol (Pereira, Ramos, Galvão, Dias & Schwan, 2010). Sin embargo, algunas bacterias del género Lactobacillus también tienen la habilidad de producir etanol, ya que tienen actividad de alcohol deshidrogenasa, una enzima capaz de convertir el acetaldehído en etanol. Los Lactobacillus presentes en los granos de kéfir crecen y proliferan rápidamente en un rango más alto de temperatura, por ejemplo arriba de 25 °C (Magalhães, Dias, Pereira, Campos et al., 2011; Magalhães, Dias, Pereira, Oliveira et al., 2011).

De acuerdo con Beshkova et al ., (2003), el contenido de alcohol debería ser suficiente para dar al kéfir el sabor de una bebida ligeramente alcohólica que es típica del kéfir tradicional (antiguo) del Cáucaso. Diferentes estudios mostraron bajos niveles de etanol en bebidas de kéfir utilizando diferentes sustratos, como leche de vaca (10.0 g/L) (Zajšek & Goršek, 2010) (y 0.05 g/L) (Magalhães, Dias, Pereira, Campos et al ., 2011; Magalhães, Dias, Pereira, Oliveira et al., 2011), solución de azúcar morena (0.12 g/L) (Magalhães, Pereira, Dias et al ., 2010) y suero de queso (~11.0 g/L) (Magalhães, Dias, Pereira, Campos et al ., 2011; Magalhães, Dias, Pereira, Oliveira et al ., 2011; Magalhães, Dragone et al., 2011; Magalhães, Pereira, Nicolau et al., 2010). Sin embargo, en este estudio fue posible producir bebidas alcohólicas de kéfir (etanol ~45.0 g/L) con fermentación de pulpa de cacao durante un periodo de 48/72 horas a 25 °C. Este resultado puede ser debido al incremento de la temperatura en el proceso de

Tecnología

fermentación, contribuyendo a aumentar la población microbiana productora de etanol del kéfir.

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Análisis sensorial

Utilizando la escala hedónica, las bebidas CK se sometieron a un análisis sensorial para evaluar su aceptación y preferencia. Las bebidas fermentadas a 10 °C durante 48 y 72 horas tuvieron la mayor aceptación (puntuaciones de 7.08 ± 1.35 y 7.28 ± 0.98, respectivamente) (Tabla 4). Estas bebidas fueron las más preferidas por un 92% y 100% de los panelistas, respectivamente. Las bebidas fermentadas a 25 °C con 48 y 72 horas de fermentación, tuvieron menor aceptación (4.68 ± 2.25 y 4.56 ± 2.43, respectivamente), pero no se rechazaron en extremo; el 20% menos de los panelistas aceptaron estas bebidas. La mejor aceptación de las bebidas fermentadas a 10 °C puede explicarse por la diferencia en la composición de metabolitos y la baja concentración de alcohol y acidez.

CONCLUSIÓN Las combinaciones experimentales resultantes de las bebidas permiten el desarrollo y el despliegue de bebidas de pulpa de cacao basadas en tecnología efectiva, inoculadas con granos de kéfir, con el objetivo de racionalizar los procesos de producción y expandir el rango de nuevos productos con posible valor nutricional en el mercado. Los gránulos de kéfir fueron capaces de reducir la concentración de sacarosa en la bebida CK, produciendo metabolitos para la buena calidad de las bebidas. Este resultado demostró la influencia del periodo de fermentación y de la temperatura en el producto final de la bebida CK. Las bebidas fermentadas a 10 °C durante 48 y 72 horas tuvieron la mayor aceptación (92% y 100% de los panelistas, respectivamente). La mejor aceptación podría deberse a la baja concentración de alcohol y acidez en las bebidas. Sin embargo, en este estudio fue posible producir bebidas alcohólicas de kéfir con fermentación de pulpa de cacao por un periodo de 48 y 72 horas a 25 °C. Estas bebidas fueron aceptadas por el 80% de los panelistas. Este estudio es el primero en reportar la producción de bebidas alcohólicas de kéfir a partir de cacao. Los resultados de este estudio indican que se pueden producir bebidas novedosas de carácter organoléptico aceptable a partir de la fermentación de pulpa de cacao

con gránulos de kéfir. La tecnología propuesta en este estudio es significativa debido a que se pueden utilizar nuevos y diversos métodos en el procesamiento de frutas para minimizar las pérdidas de producción, generar mayores ganancias e introducir nuevos productos de valor nutricional al mercado, incluyendo el uso de gránulos probióticos de kéfir como alternativa. El punto clave para la aplicación industrial de la tecnología propuesta es la promoción de la fermentación mediante la biomasa granular de kéfir, lo cual aporta la posibilidad de eliminar el uso de separadores por centrifugación que tienen una alta demanda energética y requieren grandes inversiones industriales.

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El evento congrega a las dos ferias más importantes de alimentación y hostelería del país, además es una oportunidad para que empresas participantes y visitantes de los sectores de hostelería, distribución e industria alimentaria obtengan el mayor beneficio. La feria vincula a los visitantes con el mercado de influencia portuguesa, con más de 200 millones de consumidores potenciales.

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el número excepcionalmente elevado de expositores y visitantes internacionales, IFFA ofrece cada tres años una demostración convincente de su posición destacada en el sector.

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IFT va a adquirir conocimientos prácticos, ideas innovadoras y conexiones profesionales que directamente afectarán a su trabajo y contribuirán al éxito de su organización, todo en apenas cuatro días.

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Punto de reunión para los profesionales de la industria alimentaria, en donde una vez al año los principales proveedores del sector y productores de alimentos se encuentran para hacer negocios y favorecer los resultados de sus respectivas empresas.

SEMINARIO DE TECNOLOGÍA DE BEBIDAS 6 al 8 de Agosto, 2013 Sede: WTC, D.F., México Organiza: Alfa Promoeventos Teléfono: +52 (55) 5582 3342 E-mail: seminarios@alfapromoeventos.com, ventas@alfapromoeventos.com Web: www.expotecnoalimentos.com La diversificación de nichos de mercado ha llevado a los fabricantes de bebidas a diseñar soluciones específicas para cada tipo de consumidor, con el objetivo de garantizar ventas y ofrecerles un producto acorde con sus intereses, “hecho a su medida”. Para ello es necesaria la implementación de tecnologías, entendidas desde distintos enfoques para garantizar el éxito comercial. En el “Seminario de Tecnología de Bebidas” encontrará conocimientos prácticos en torno a innovación, tendencias, desarrollo y marketing de bebidas, aplicables a todos los productos de esta dinámica industria, como es el caso de bebidas estéticas y reductivas, bebidas funcionales y para el proceso cognitivo, bebidas carbonatadas, y bebidas deportivas, entre otras.

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Los ingredientes funcionales, que dan vida a los alimentos funcionales, se han convertido en la pieza clave de los productos fabricados con el propósito de otorgar valores agregados a la salud y bienestar del consumidor. Debido al actual repunte en ventas de este tipo de alimentos, cuya tendencia mundial es que se mantengan a la alza, en el “Seminario de Ingredientes Funcionales. Innovación, Tecnología y Tendencias” le presentamos un amplio programa de herramientas técnicas pensadas en beneficiar el éxito de sus productos con propiedades funcionales; con ponencias sobre el futuro de los nutracéuticos, control de peso, demanda de sabores, envejecimiento saludable, salud ósea y cerebral, ácidos grasos esenciales, niveles de sal, probióticos y prebióticos, productos para celíacos, y fitosteroles, entre otros temas.

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WORLDFOOD ISTANBUL (ANTES GIDA) 2013 Feria Internacional de Alimentos, Bebidas y Tecnologías para su Procesamiento 5 al 8 de Septiembre Sede: CNR, Estambul, Turquía Organiza: ITE Group Teléfono: +90 (212) 291 8310 Fax: +90 (212) 240 4381 E-mail: info@ite-turkey.com Web: www.ite-gida.com Worldfood Istanbul es un proyecto que apunta a apoyar la mejora del sector alimenticio de Turquia mediante sistemas productivos. La exposición y la conferencia serán el punto esencial de reunión para desarrollar contactos de negocio y discutir estrategias para las cuestiones claves que hacen frente a la industria en Turquía. El evento, antes llamado GIDA, se realiza en el centro de exposiciones más grande y prestigioso de Turquía, atrayendo a nuevas marcas y las últimas innovaciones.

DRINKTEC 2013 Feria líder mundial para la industria de bebidas y alimentos líquidos 16 al 20 de Septiembre, 2013 Sede: New Munich Trade Fair Centre, Munich, Alemania

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drinktec es la Feria Mundial de Tecnologías de Bebidas y Alimentos Líquidos, y el certamen más importante de este sector. Aquí se reúnen los fabricantes y proveedores del mundo entero, entre ellos grandes compañías internacionales y medianas empresas, quienes se citan con pequeños y grandes fabricantes o comerciantes de bebidas y alimentos líquidos. drinktec es considerada en el sector como la plataforma de presentación de novedades mundiales. Los fabricantes exhiben las más recientes tecnologías de la fabricación, el llenado y el envasado de todo tipo de bebidas y alimentos líquidos, al igual que materias primas y soluciones logísticas incluidas. Los temas de marketing de bebidas y diseño de embalajes completan el abanico de prestaciones. En la edición de 2013 se espera la participación de aproximadamente 1,500 expositores de más de 70 países y de alrededor de 60,000 visitantes provenientes de más de 170 países.

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Anuga es no sólo la mayor feria de alimentos y bebidas en el mundo, también es el encuentro más importante del sector de nuevos mercados y grupos específicos. Es el lugar perfecto para conocer las últimas tendencias y temas, y un gran lugar para hacer contactos de primer nivel y negocios. 10 eventos bajo el mismo techo: Anuga Fine Food, Anuga Drinks, Anuga Meat, Anuga Frozen Food, Anuga Chilled & Fresh Food, Anuga Dairy, Anuga Bread & Bakery, Hot Beverages; Anuga Organic, Anuga RetailTec y Anuga FoodService.

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