Optimierte AAV-Produktion durch Zwei-Plasmid-System fektion. Im Rahmen mehrerer Forschungskooperationen zur AAV-Herstellung haben unsere Partner erfolgreich Plasmide durch Minicircles für das Transfergen sowie auch für das Helper-und-Packaging-Plasmid ersetzt. Dabei zeigte sich eine deutlich erhöhte Ausbeute an Adeno-assoziierte Vektoren intakten, also mit der korrekten (AAV) gewinnen derzeit rasant Gensequenz versehenen Virus an Bedeutung als Genfähren partikeln. Insbesondere das in verschiedenen therapeusogenannte Retro-Packaging, tischen Anwendungen, die Dr. Martin Schleef das heißt das Verpacken falaktuell in diversen klinischen Geschäftsführer scher Gensequenzen aus den Studien erprobt werden. Mit PlasmidFactory GmbH & Co. KG zur Herstellung verwendeten dem Zwei-Plasmid-System Plasmiden, tritt bei der Mini müssen die Protokolle für die circle-basierten Herstellung nicht mehr auf, da Transfektion der Produktionszelllinie mit nur die Minicircles diese zusätzlichen Sequenzmotive zwei statt drei Plasmiden optimiert werden. schlicht nicht mehr enthalten. Auch die Produktionskosten für hochskalierte Produktion viraler Vektoren sinken, wenn man als Ausgangsmaterial ein Plasmid weniger Wie sichert Plasmid Factory benötigt. die Qualität und Integrität der Was ist das Besondere am Zwei-Plasmid-System für die Transfektion von Prokuktionszelllinien für das Wachstumsfeld Adeno-assoziierte virale Vektoren?
produzierten AAV-Vektoren?
Abb.: PlasmidFactory/Bielefeld – Advertorial
Warum und mit welcher Technologie erzielen Sie signifikant höhere Ausbeuten an AAV-Vektoren?
Neben der Verwendung des Zwei-Plasmid-Systems können auch die Plasmide selbst signifikant verbessert werden: Minicircles sind kleinere und vereinfachte Derivate aus Plasmiden, letztlich nur noch das zirkuläre Gen, das man für die eigent liche Anwendung benötigt. Sie zeichnen sich durch eine geringere Größe und eine im Vergleich zu herkömmlichen Plasmiden höhere Transfektionseffizienz aus und tragen nahezu keine problematischen prokaryotischen Gensequenzen mehr in sich. Das verringert das Risiko einer Immunantwort oder einfach eine Stummschaltung der Transgene nach einer erfolgreichen Trans-
BioTechnologie Jahrbuch 2021
Im Transferplasmid ist das eukaryotische Gene of Interest von ITR-Sequenzen flankiert. Die Integrität dieser Repeatsequenzen ist von großer Bedeutung für die korrekte Replika tion und Verpackung der AAV-Vektoren in der Produktionszelllinie. Neben „traditionellen“ Methoden wie Verdau mittels Restriktionsenzymen (und anschließender Analyse des Bandenmusters) und Sanger-Sequenzierung, bietet PlasmidFactory nun auch das Next-Generation-Sequencing als Plasmid-QC an. Dabei ist es erstmals möglich, den Anteil an korrekten ITR-sequenzhaltigen Plasmiden in einer Charge zu quantifizieren. Dies ermöglicht die Standar disierung und vor allem Optimierung der AAVVektorproduktion.
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