Técnicas cromatográficas para el control de calidad

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LA SALUD CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA CONTROL DE MEDICAMENTOS

TEMA DE INVESTIGACIÓN: TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTEGRANTES: TANIA CAROLINA BARBA TORO STEFANNY XIMENA OCHOA VERZOSA. DOCENTE: BQF. CARLOS GARCIA MGS CURSO: QUINTO “A” AÑO LECTIVO: 2016

INTRODUCCIÓN En 1906 el botánico ruso M.Tswett puntualizó por primera vez esta técnica, que fue aplicada a la separación de pigmentos vegetales. Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de él (fase móvil). La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). En el experimento de Tswett, la separación de los pigmentos vegetales se logró gracias a que cada uno de ellos tenía una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes más afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso de un detector, su caracterización química.

(1)

Los principios fundamentales son los mismos pero se acostumbra especificar los métodos cromatográficosde acuerdo al estado físico de la fase móvil: Cromatografía líquida. - La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido), o bien un líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquidolíquido). Esta forma de cromatografía puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor uniforme; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografía líquido.

Cromatografía de gases. - En este caso la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase estacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte (cromatografía gas-líquido).

Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo (hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor capacidad de separación. De acuerdo con el mecanismo de retención, la cromatografía se puede clasificar en los siguientes tipos:  adsorción (normal, de fase reversa)  partición líquido-líquido  intercambio iónico  permeación sobre gel  de afinidad

Las áreas de aplicación son muy diversas y abarcan prácticamente todas las actividades en las que interviene la química, por ejemplo: se emplea en: El análisis de drogas y fármacos en fluidos biológicos como la saliva, la sangre, la orina; Seguir la transformación de las sustancias responsables de la transmisión neurológica; Determinar la presencia de contaminantes en el medio ambiente; Descifrar la composición de los combustibles fósiles; Realizar el control de calidad de los productos químicos y farmacéuticos manufacturados; en fin, la lista de ejemplos es interminable. (1)

DESARROLLO TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS PARA EL CONTROL DE MEDICAMENTOS LA CROMATOGRAFÍA

¿QUIÉN

USO

POR

PRIMERA

VEZ

LA

CROMATOGRAFIA? La cromatografía fue inventada por el botánico ruso Mikhail Tswett a principios del siglo xx. Empleó la técnica para separar algunos pigmentos de las plantas, como clorofilas y xantofilas al hacer pasar soluciones de dichas especies a través de columna de vidrio empacadas con carbonato d calcio de gránulos muy finos. (2)

SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS La cromatografía es un método analítico usado desde el siglo pasado los autores se refieren a la cromatografía como un método de validación cualitativa y cuantitativa ya que logra separar los principios activos, componentes que forman parte de una mezcla por ejemplo citamos un medicamentos que es una mezcla compleja unidos por sustancias químicas ya sea de origen natural o sintético elaborado en un laboratorio de alto confort.

En si la técnicas de cromatografías se basa en su fundamento teórico práctico generalizado donde se analiza una muestra y se determina a través de una columna de cromatografía sus sustancias en proceso de estudio e indentificación ya sea por electroforesis capilar como cita el autor.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA CROMATOGRAFÍA Se puede conceptualizar a la cromatografía como un método ya sea analítica en el ámbito de la estudio, su significado “cromatografía” se deriva de los griegos

“chroma” que

significa color y “graphein” que significa escritura. Ahora bien podemos definir a la cromatografía como un resultado final que tiende a visualizar por su color y a expresarse como una escritura para señalar rangos. (2)

La cromatografía es una técnica que emplea por fases ya sea estacionaria o móvil lacceder a una información por separación de moléculas diferentes presentes en una muestra. El

método está basado en la circulación de una fase móvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar) a través de una fase estacionaria. Todo esto se logra obedeciendo a las reglas de la afinidad de sus principios activos o se haga referencia por las fases que tengan

los distintos compuestos presentes en la mezcla desencadenara su separación. (3).

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS El fundamento se logra basándose primeramente dando a conocer las diferentes y únicos tipos fases que tiene el método. Dada la circunstancia el principio de la cromatografía no solo se busca separar compuestos o moléculas ya que tiene la capacidad de desplazar a lo amplio de una matriz o centro de recaudación principal que puede estar en un estado ya sea sólido para el control y circunstancias necesarias. El principio de separación se basa en la función de permitir a qué punto máximo puede llegar si lo compuesto en estudio. Al existir diversas clasificaciones de la cromatografía todas tiene el mismo fundamento teórico en el cual se cada una de ellas permite la separación según su límites. (4)

ELUCIÓN EN LA COLUMNA CROMATOGRÁFICA La “elución” es un proceso especificado que permite lavar los solutos en su fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil que se encuentra en la columna cromatografica y a este proceso se lo conoce como “eluyente”. (2) En los diferentes cromatogramas se evidencia la especificidad del método empleado en esta gráfica podemos observar el principio activo, un diluyente para la muestra, la fase móvil, una solución amortiguadora dependiendo las condiciones del compuesto activo. Todos estos ingredientes se puede decir se unen para dar a conocer resultados y como su técnica es especifica se basa en una escala tanto para el principio activo como para el diluyente y mantenga la muestra en uso activo en la versatilidad del tiempo. (5)

Podemos definir a la cromatografía como una técnica que aísla una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser extendidos por una fase móvil (líquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser líquida o sólida. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre sí y a diferencia en la migración de los mismos. ¿En qué consiste?

La cromatografía alcanzauna variedad de técnicas que tienen como finalidad la disociación de mezclas basándose en la diferente capacidad de interacción de cada componente en otra sustancia. Y consiste en pasar una fase móvil (una muestra constituida por una mezcla que en ella está el compuesto deseado en el disolvente) a través de una fase estacionaria fija sólida. Dicha fase estacionaria aplaza el paso de los componentes de la muestra, de forma que los componentes la atraviesan a diferentes velocidades y se separan en el tiempo. Y asi cada uno de los elementos de la mezcla presenta un tiempo característico de paso por el sistema, denominado tiempo de retención. Cuando el tiempo de retención del compuesto deseado eterniza del de los otros elementos de la mezcla, éste se puede separar por la separación cromatográfica.

Fundamento teórico La separación de los diversos componentes de una mezcla que se encuentran en un líquido o gas es el resultado de las diferentes interacciones de los solutos a medida que se desplazan alrededor o sobre una sustancia líquida o sólida (la fase estacionaria). Las numerosas técnicas para la disociación de mezclas complejas se estipulan en la complejidad de las substancias por un medio móvil gas o líquido y un medio absorbente estacionario (papel, gelatina, alúmina o sílice) a través del cual circulan.

(6)

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA. De acuerdo a

este método se pueden estudiar mezclas de

aminoácidos. La muestra para análisis se emplea por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie

por la acción de fuerzas electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc).

Los adsorbentes más manejados son gel de silica, alumina, tierra silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia.Dichaplaca seca se pone en el tanque cromatográfico o cámara, en el cual debe encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil líquida).

El eluente ascenderá o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrará los elementos a lo largo de ésta produciendo “manchas” que figuran a los componentes, la separación se da por migración diferencial, es decir que la fase móvil arrastra a las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separación.

Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de métodos químicos en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adición de Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de métodos físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible.

El examen es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el inicial se realiza comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa diámetro y comparación visual e intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentración conocida. De manera cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisión a través de la sustancia y medidas de emisión o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometría por fluorescencia.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.

Este proceso es básicamente el mismo, aquí

se emplean tiras de papel

cromatográfico en el tanque cromatográfico.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.

Se emplean columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de Magnesio.

La fase estacionaria esta compuesta por un sólido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna elaborada en plástico o vidrio.

La fase móvil se encuentra constituida por la solución que lentamente va pasando la fase estacionaria. La solución que sale al ultimo de la columna se reemplaza por nueva solución que se facilita desde un contenedor por la parte superior de la columna.

El traslado de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se distancian gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la separación, y por tanto la resolución, aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido

a

procesos

difusiónales,

disminuyendo

por

tanto

la

resolución.

CROMATOGRAFÍA DE GASES.

Se emplea para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía GasSólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). El cromatógrafo de gases está constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyección, una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatógrama.

La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la disociación. La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o teflón contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice. La fase móvil o gas portador transporta los

elementos de la muestra a través de la columna, por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al último de dicha columna existe el detector que accede la detección y cuantificación de las sustancias, midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. Se da una señal tipo eléctrico, que se extiende por un registrador grafico o un integrador que indica el momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se decretan medidas como la altura y el área del pico.

“CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA O RENDIMIENTO (HPLC).

Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas.

La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por tanto la resolución.

El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra. A

la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna.

En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente.

(6) APLICACIONES Campos de Aplicación de HPLC 

Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos



Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos



Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos



Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes



Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB



Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos



Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos. (7)

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO. La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de

intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración.

1.1.3.5.3.7. Cromatografía por Permeabilidad en Gel. Es

útil

para

Cromatografía

la

separación

de

exclusión

de

proteínas.

molecular,

La

también

llamada de filtración en gel, separa en función de su tamaño. La matriz de la columna esta formada por un polímero

entrecruzado

con

poros

de

tamaños

determinados. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta.” (6)

(8)

Método analítico por cromatografía líquida de alta resolución para el ensayo de disolución de las tabletas de clonazepam 2 mg sin lactosa

Se desarrolló y validó un método para evaluar la disolución de las tabletas de clonazepam 2 mg sin lactosa por cromatografía líquida de alta resolución, con detección ultravioleta a 254 nm. Se comprobó la condición de insaturación del clonazepam en el medio de disolución empleado y se evaluaron los parámetros de especificidad, linealidad y precisión, así como la influencia de la filtración y la estabilidad del principio activo. La curva de linealidad se realizó en el rango de 1,2 a 2,6 µg/mL con un coeficiente de correlación igual a 0,99418; la prueba estadística para el intercepto y la pendiente se consideró no significativa. En el estudio de estabilidad del principio activo en el medio de disolución se demostró que era estable en el medio por más del doble del tiempo de duración del ensayo de disolución.

(9) Estabilidad por cromatografía en capa delgada de mezclas de tinturas de Quassia amara y Maytenusilicifolia

Una línea de investigación que ha tomado auge en los últimos tiempos, es aquella que se refiere a los productos fitoterapéuticos, por lo que se hizo necesaria una evaluación integral para su posterior utilización. Este trabajo describe un método por cromatografía en capa delgada, para evaluar la estabilidad de tinturas obtenidas a partir de un proceso de percolación de 2 plantas de origen brasileño: Quassia amara y Maytenusilicifolia. El estudio se realizó teniendo en cuenta 3 temperaturas de almacenamiento: refrigeración, ambiente y 40 ºC, durante un tiempo de 90 días. Se seleccionaron las condiciones cromatográficas, se determinó el límite de detección y se demostró la selectividad del método, para lo cual se sometió el extracto a 4 condiciones de estrés. Se usó como fase móvil n-butanol-acido acético-agua (4:1:5) y como revelador la luz ultravioleta a unal de 366 nm. Los mejores resultados se observan cuando el extracto analizado se conserva en refrigeración durante el tiempo de estudio. Bajo condiciones de estrés, solo existen resultados favorables cuando es expuesto a la luz ultravioleta. Se establece como límite de detección el correspondiente a 7 µL.

(10) Validación de la metodología analítica de los medicamentos Doxium® cápsulas, Labosalic® loción y B-Laboterol® crema mediante el uso espectrofotometría UV y cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) La validación realizada es según el enfoque experimental una validación Concurrente, que es la que se realiza durante la producción normal de un lote. En esta práctica en el Instituto Laboratorio Farmacéutico Labomed para optar al titulo de Químico Farmacéutico se realizaron la validación Concurrente de la metodología analítica de cuatro productos farmacéuticos: Doxium® cápsulas por Espectrofotometría, B- Laboterol® crema y Labosalic® loción por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC). Para realizar validación se comienza con la recopilación de la información sobre cada producto, se revisa el registro sanitario, validación, revisión de los POS de validación y corrección de ellos, características y funcionamiento del equipo a utilizar. Luego del desarrollo experimental de los parámetros analíticos se evalúan los resultados obtenidos y se plantean discusiones acerca de este trabajo realizado. La conclusión final es que las técnicas analíticas de los productos farmacéuticos aquí validados son: lineales, exactas, precisas, sensibles, selectivas y robustas. El trabajo de práctica prolongada en el laboratorio farmacéutico tuvo una duración de seis meses, en los cuales además de realizar el trabajo de validación de la metodología analítica de los productos mencionados anteriormente, se realizó el análisis diario del agua desmineralizada que se extraía de un pozo de propiedad del laboratorio para luego tratarla y utilizarla tanto en los ensayos analíticos como en la producción de sus productos. De este análisis se emitía el Boletín de Análisis del Agua Desmineralizada en el cual se informaba el parámetro, el método, la especificación y los resultados obtenidos. Los parámetros evaluados diariamente eran los estipulados por la USP 24, dentro de los cuales están pH, cloruros, sulfatos, límites de amonio, calcio, dióxido de carbono, sustancias oxidables y sólidos totales. También se realizaron pruebas pilotos para comprimidos de nifedipino de 10 y 20 mg Las pruebas pilotos consistieron en realizar el pesaje de las materias primas de la nueva formulación, continuando con el mezclado de ellas y llevar la mezcla hasta la comprimidora rotatoria y así obtener los comprimidos de nifedipino, los cuales posteriormente se pesaron para ver si estaban dentro de su rango de peso y se almacenaron para su posterior análisis.

Además se realizó la prueba de limpieza a la comprimidora después de su limpieza habitual, analizando el agua de limpieza por espectrofometría UV la cual debe ser menor en 10 ppm en partículas.

BIBLIOGRAFIA:

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4. MSC.

SADIELY

CONFORMACIÓN

SANCHEZ DE

MNS&DOA.

INGREDIENTES

MEJORAS

EN

FARMACÉUTICO

LA

ETAPA

ACTIVO

DE

DE LA

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5. GOMEZ

S&MJ.

VALIDACIÓN

DE

UN

MÉTODO

ANALÍTICO

EMPLEANDO

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA. SCIELO. 2010.

6. VALCARCEL. 2011. [ONLINE]. [CITED 2015 ENERO 13. AVAILABLE FROM: HTTP://WWW.JAVERIANA.EDU.CO/FACULTADES/CIENCIAS/NEUROBIOQUIMICA/L IBROS/CELULAR/CROMATOGRAFIA.HTM. 7. LABORATORIO DE TÉCNICA INSTRUMENTOS UVA. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS HPLC. [ONLINE]. [CITED 2016 ENERO 12. AVAILABLE FROM: HTTP://LABORATORIOTECNICASINSTRUMENTALES.ES/ANALISISQUMICOS/CROMATOGRAFA-DE-LQUIDOS-HPLC. 8. CARIDAD M. GARCÍA PEÑA RDLMCDFCVME. MÉTODO ANALÍTICO POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN PARA EL ENSAYO DE DISOLUCIÓN DE LAS TABLETAS DE CLONAZEPAM 2 MG SIN LACTOSA. SCIELO REVISTA CUBANA DE FARMACIA. 2007;: P. 1-2.

9. PEDRAJAI ES, ACOSTA OMN. ESTABILIDAD POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA DE MEZCLAS DE TINTURAS DE QUASSIA AMARA Y MAYTENUS ILICIFOLIA. SCIELO REVISTA CUBANA DE FARMACIA. 2009;: P. 1-2.

1 GALGANI M, ANDREA M. VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA ANALÍTICA DE LOS 0. MEDICAMENTOS DOXIUM® CÁPSULAS, LABOSALIC® LOCIÓN Y B-LABOTEROL® CREMA MEDIANTE EL USO ESPECTROFOTOMETRÍA UV Y CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC). [ONLINE].; 2006 [CITED 2016 ENERO 12.

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