Ingeniería genética

Ingeniería Genética Participa en la investigación contra la aterosclerosis

Taller de experimentaciónMacrófago PROTOCOLO

Ingeniería genética Buscando una diana para el tratamiento de la aterosclerosis Introducción La investigación biomédica engloba el estudio de los procesos físicos y químicos que se producen dentro de los seres vivos, así como de aquellos procesos que desencadenan las enfermedades. Uno de los principales objetivos de este campo de investigación es identificar dianas terapéuticas, es decir, puntos del cuerpo donde se pueden dirigir nuevos tratamientos que estimulen respuestas y que ayuden a combatir las enfermedades.

Este protocolo se enmarca en una línea de investigación biomédica que se centra en el estudio de una posible diana terapéutica que podría ser reconocida por un fármaco contra la aterosclerosis.

¿Cómo se produce la aterosclerosis?

La aterosclerosis es un trastorno vascular causado por la acumulación de grasas en las paredes de los vasos sanguíneos, que puede dar lugar a manifestaciones muy diversas y de gravedad variable según sea la localización de los vasos afectados y el grado de evolución del trastorno. En nuestra sociedad, el consumo de alimentos con alto contenido en grasas saturadas ha incrementado considerablemente los riesgos de padecer enfermedades cardiovasculares. Este exceso de grasa en nuestro organismo puede depositarse y acumularse en ciertos puntos de las paredes de las arterias en forma de placas, llamadas placas de ateroma, que obstruyen el flujo sanguíneo.

----- Arteria normal

----- Aterosclerosis media

----- Aterosclerosis severa

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El colesterol y los macrófagos Una de las sustancias lipídicas que conforman las placas de ateroma es el colesterol. Para evitar que el colesterol se deposite en las paredes, nuestro organismo tiene un sistema de "limpieza", los macrófagos, que son células que circulan por la sangre y que tienen la capacidad de recoger las moléculas de colesterol nocivo, conocidas como LDL (low-density-lipoprotein, lipoproteínas de baja densidad).

Los macrófagos las reconocen gracias a un receptor que tienen en su membrana. Este sistema de limpieza es eficiente si el exceso de LDL

colesterol no es muy grande.

LDL oxidado Oxidación de LDL Si las cantidades de colesterol son muy abundantes, los macrófagos continúan recogiendo LDL, pero, una

Proliferación de células endoteliales

vez han engullido grandes cantidades, se transforman en unas células llamadas "espumosas". Éstas producen unas sustancias que inducen la inflamación

Activación sistema inmunitario

y la proliferación de células de la pared arterial (endoteliales), y que acabará con la formación de la placa de ateroma, que bloquea la circulación

Célula espumosa

sanguínea.

LDL Actualmente numerosos grupos de investigación de todo el mundo, entre ellos el Grupo de Investigación de Receptores Nucleares de la Universidad de Barcelona, tienen como objetivo entender mejor cómo los macrófagos participan en la regulación de los niveles de colesterol y en el desarrollo de la Oxidación de LDL

aterosclerosis.

Más específicamente, los científicos están estudiando el papel de una proteína que tienen los macrófagos llamada MYLIP. Es una proteína que tiene como función principal degradar el receptor que los macrófagos tienen en la membrana y que les permite reconocer las LDL. Los científicos han

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visto que si se produce esta proteína en una cantidad demasiado abundante, la ingestión de colesterol por parte de los macrófagos disminuye. Sin embargo, aún se desconoce con exactitud su papel en el contexto de la aterosclerosis.

Macrófago

Dado que se ha visto que la proteína MYLIP está relacionada con la regulación del colesterol nocivo, los científicos estiman que en este proceso de regulación podría haber una nueva diana para el tratamiento de la aterosclerosis.

LDL oxidado

Oxidación de LDL

¿Cómo podemos estudiar la proteína MYLIP involucrada en la regulación del colesterol?

Para poder estudiar esta posible diana terapéutica, los investigadores necesitan producirla en el laboratorio en grandes cantidades. Para ello, utilizan una técnica de ingeniería genética llamada transformación bacteriana, con la que transfieren ADN de un organismo a una bacteria, para que ésta produzca grandes cantidades de ADN que posteriormente introducen en otros tipos de células para que produzcan la diana terapéutica de estudio.

Para ello parten de una forma purificada del gen que produce la proteína MYLIP, la unen a un fragmento de ADN circular llamado plásmido, y la insertan dentro de bacterias para que produzcan réplicas del material genético. ¡En este protocolo os invitamos a hacer de biotecnólogos y a llevar a cabo una transformación bacteriana!

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Organización del taller:

1. Llevaremos a cabo una transformación de bacterias para que incorporen el ADN responsable de producir la proteína MYLIP, y para que actúen como biorreactores y nos fabriquen el material genético en grandes cantidades.

2. Haremos crecer el cultivo de bacterias en un medio adecuado que nos permita seleccionar aquellos que hayan incorporado el gen.

3. Purificaremos el material genético que contiene el gen responsable de producir la proteína MYLIP para que pueda ser introducido en otros tipos de células que producirán la proteína (*).

(*) Dado que el crecimiento de bacterias requiere de un día y medio de tiempo, la purificación se llevará a cabo partiendo de un cultivo de bacterias transformadas que los monitores ya habrán preparado previamente

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Equipo y materiales necesarios para cada grupo/mesa 2 tubos con bacterias

1 tubo en hielo con el

1 tubo con medio de

Micropipeta de 20 µl y

en hielo rotulados con

ADN circular llamado

crecimiento bacteriano

200 µl

los n.º 1 y 2.

Plásmido pCR2.1-

"LB"

(A) Caja de poliestire-

MYLIP.

(C)

no expandido + hielo

(B)

Puntas para las

Puntas para las

2 Placas de petri con

micropipetas de 20 y

micropipetas de 20 y

agar y antibiótico

200 µl

200 µl

(D) Ampicilina

Baño líquido con agua

Flotador para tubos

Recipiente de residuos

Recipiente de residuos

destilada

Cronómetro

sólidos

líquidos

Cinta adhesiva

1 tubo con 1 ml de

1 tubo con "Solución 1"

1 tubo con "Solución 2"

Rotulador permanente

cultivo bacteriano (E)

de miniprep (F)

de miniprep (G)

1 tubo con "Solución 3"

1 tubo con "Cloropán"

1 tubo con "Etanol"

1 tubo con agua

de miniprep (H)

(I)

Asas de plástico

ultrapura (milliQ).

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CONTENIDO DE LOS TUBOS:

(A) Bacterias que permiten la entrada de ADN (llamadas competentes XL1-blue) (B) ADN circular llamado plásmido (pCR2.1) (C) Medio de cultivo LB (Luria-Bertani): extracto de levadura 5 g/l, triptona 10 g/l, NaCl 5 g/l.

Esterilizar en autoclave. Almacenar en frío.

(D) Placas LB/ampicilina: Medio de cultivo LB, Agar 1,6%, ampicilina 100 µg/ml.

(E) Bacterias cultivadas en medio 2XYT, O.N. (16 h) (F) Solución 1: 50 mM glucosa/ 25 mM TrisHCl pH8.0/ 10 mM EDTA / Diluir en H2O destilada.

(G) Solución 2: 20 µl de detergente SDS (sodium dodecyl sulfate, dodecilsulfato de sodio) 10% / 4 µl NaOH 10N/ 176 µl de H2O mQ/ por cada muestra. Preparar por duplicado el día de la práctica.

(H) Solución miniprep 3: 73.60 g de acetato de potasio /28.75 ml de acido acético. Diluir en H2O mQ hasta un volumen final de 250 ml.

(I) Cloropán: 25 ml de fenol equilibrado/24 ml de cloroformo/ 1 ml de alcohol isoamílico. Centrifugar 10 min a 3000 rpm.

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Procedimientos 1- TRANSFORMACIÓN BACTERIANA Una transformación bacteriana es un proceso biotecnológico mediante el cual los científicos introducen el material genético responsable de producir una proteína que están investigando en una célula bacteriana. Ésta actuará como biorreactor y producirá copias de este material genético, que se podrá introducir posteriormente a otro tipo de célula para que produzca la proteína de interés. (*) En este taller partimos del gen purificado de nuestra proteína "MYLIP", que ha sido introducido en un plásmido o fragmento de ADN circular.

Gen MYLIP

A partir de este material genético realizaremos una transformación bacteriana, es decir, introduciremos el gen responsable de producir nuestra proteína dentro de la bacteria mediante un choque térmico, o sea, sometiendo la muestra a diferentes temperaturas.

(*) Si la proteína de interés no es muy compleja, las mismas bacterias transformadas pueden actuar ya como biorreactores para producir la proteína.

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Protocolo para la transformación bacteriana 1. Tenemos dos tubos con las bacterias en hielo. Cada tubo contiene una solución tampón que 2

facilitará la transformación gracias a los cationes Ca + de la sal CaCl2 que contiene el tampón.

2+

¿Qué pasa? Los cationes Ca , en frío, preparan las membranas celulares para que sean permeables al ADN. Los 2+

iones Ca

se unen a los fosfolípidos de la membrana celular,

protegiendo sus cargas negativas y formando pequeños poros en la membrana de la bacteria.

2. Añade el ADN en forma de plásmido a las bacterias: utilizando la micropipeta de 20 µl pipetea 10 µl de plásmido (tubo P) y añádelos al tubo 2 donde tenías las bacterias. Tapa el tubo y mezcla suavemente dándole golpecitos con el dedo. El tubo 1 será el control donde habrá las bacterias sin el plásmido.

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2+

¿Qué pasa? Los iones Ca

también interactúan con los grupos fosfatos con

carga negativa del ADN y esto permite que se pueda acercar a la membrana de las bacterias, sin repulsiones debidas a las cargas eléctricas.

3. Deja reposar los tubos 1 y 2 en hielo durante 15 minutos

* Entretanto, aprovecha este tiempo para ir realizando el primer paso del protocolo de "Crecimiento de las bacterias transformadas" (pág.12).

4. Transcurridos los 15 minutos, pon los tubos 1 y 2 en el baño líquido a 42°C durante exactamente 1 minuto 30 segundos.

¿Qué pasa? El ADN circular o plásmido penetra a través de poros de algunas de las bacterias. ¿Cómo? A 42°C aumenta la elasticidad de la membrana de las bacterias y esto facilita la entrada del plásmido a través de los poros.

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5. Vuelve a poner los tubos 1 y 2 en hielo durante 2 minutos.

¿Qué pasa? Al bajar la temperatura se estabilizan las membranas y el plásmido que ya había atravesado los poros quedará en el interior de las bacterias.

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2- CRECIMIENTO DE LAS BACTERIAS TRANSFORMADAS Una vez que las bacterias han incorporado el plásmido, hay que hacerlas crecer en un medio adecuado y a una temperatura adecuada. Dado que la transformación bacteriana normalmente produce una mezcla de pocas transformaciones y abundantes células no transformadas, necesitamos un método para identificar las células que han incorporado el plásmido.

Para asegurarnos de que sólo hacemos crecer las bacterias transformadas, las haremos crecer en placas de cultivo que contendrán un antibiótico. Al contener el plásmido un gen que hace que las bacterias sean resistentes a este fármaco, sólo las bacterias transformadas crecerán en forma de colonias. A partir de estas colonias, podremos posteriormente continuar el crecimiento únicamente de las bacterias que produzcan el gen de interés.

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Protocolo para el crecimiento de las bacterias transformadas 1. Rotula las placas donde harás crecer las bacterias. Una será la placa control, con bacterias sin plásmido, y la otra será donde harás crecer las bacterias con plásmido.

2. Utilizando la micropipeta de 200 µl añade 500 µl de medio de crecimiento bacteriano "LB", que contiene nutrientes, a los tubos 1 y 2. Tapa los tubos y mézclalos suavemente dándoles golpecitos con el dedo.

3. Incuba la mezcla en el baño líquido a una temperatura de 37°C durante 30 minutos.

¿Qué pasa? Este período da tiempo a que las bacterias se multipliquen, por lo que al duplicar su ADN también generan una copia del ADN plasmídico que contiene el gen de interés.

*Mientras esperas a que crezcan las bacterias, puedes ir haciendo la tercera etapa de este taller que consiste en aislar el material genético de las bacterias (pág.16).

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4. Utilizando la micropipeta de 200 µl (con una punta nueva cada vez), añade las bacterias (100200 µl) de los tubos 1 y 2 a las placas de agar que contienen también el antibiótico ampicilina.

5. Esparce las bacterias por la superficie de cada placa de agar utilizando un asa de plástico estéril para cada una. Ve girando la placa mientras mueves el asa hacia adelante y hacia atrás.

Cierra las placas con un poco de cinta adhesiva y escribe debajo tus iniciales, la fecha y el tipo de bacteria.

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6. Incuba las placas invertidas a 37°C y al día siguiente observa el resultado obtenido. Si no dispones de incubadora, simplemente deja crecer las bacterias a temperatura ambiente durante un par de días.

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3- AISLAMIENTO DEL MATERIAL GENÉTICO RESULTANTE A partir de las bacterias transformadas que han crecido formando colonias, los científicos toman una muestra y la ponen a crecer en otro medio de cultivo con nutrientes para obtener grandes cantidades.

Posteriormente hay que aislar el material genético que nos han producido las bacterias, es decir, hay que separarlo del resto de componentes bacterianos, como ARN, ADN de la bacteria o proteínas.

Para aislar el plásmido los científicos siguen un protocolo conocido como miniprep. Esta técnica permite separar el ADN en forma de plásmido mediante diferentes disolventes y centrifugaciones, que van descartando los diferentes componentes celulares.

El ADN purificado será de gran utilidad para los científicos para llevar a cabo experimentos posteriores para estudiar su función en la regulación del colesterol y en la aterosclerosis y para buscar nuevos fármacos.

Dado que el proceso de crecimiento de grandes cantidades de bacterias requiere un período de más de un día y medio, para el taller se utilizará un cultivo que ha sido preparado previamente por los monitores.

SOLUCIÓN 2

SOLUCIÓN 3

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Protocolo para purificar el ADN plasmídico del cultivo bacteriano (miniprep) 1. Centrifuga el tubo de cultivo bacteriano a máxima velocidad durante 30 segundos. A continuación elimina el líquido sobrenadante.

¿Qué pasa? Se separan las células del medio de cultivo en el que han crecido, que normalmente contiene restos de células y otras moléculas que queremos descartar.

2. A continuación elimina el líquido sobrenadante y pon el precipitado en suspensión de nuevo con 100 µl de la solución 1, utilizando la micropipeta de 200 µl, y mezcla con la misma pipeta. ¿Qué pasa? Se resuspenden las bacterias de nuevo para continuar la purificación, pero a más concentración, ya que los tendremos en un volumen menor. La solución 1 es una solución tampón que evitará la desnaturalización del ADN circular en forma de plásmido, que tiene lugar si el pH sube por encima de 12,6.

3. Añade 200 µl de la solución 2 y mezcla suavemente por inversión ¿Qué pasa? La solución 2, que contiene un detergente, destruye las membranas de SOLUCIÓN 2

fosfolípidos de las bacterias, liberando al medio todo el contenido del interior de las células mediante un proceso llamado lisis bacteriana. Esta solución también contiene una base fuerte (hidróxido de sodio, NaOH) que desnaturaliza las proteínas involucradas en mantener la estructura de la membrana celular y el ADN propio de la bacteria. En cambio, el ADN plasmídico no se ve afectado, ya que el pH es inferior a 12,6.

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4. Añade 150 µl de la solución 3 y mezcla suavemente por inversión. ¿Qué pasa? La solución 3 es una solución ácida de acetato de sodio, que permite neutralizar el pH de la solución y detener el proceso de lisis. En este paso la mayoría del contenido celular, como las proteínas y los fosfolípidos de las membranas y el ADN propio de la bacteria, precipitan formando una mucosa blanca. El ADN propio de la bacteria, ya +

desnaturalizado, forma un complejo insoluble que precipita, gracias a que los iones K se unen a los grupos fosfato del ADN y neutralizan así su carga negativa.

5. Añade 350 µl de cloropán, mezcla bien por inversión y centrifuga durante 3 minutos a máxima velocidad para separar el plásmido que contiene el gen de la MYLIP ¿Qué pasa? En este paso se separa el ADN plasmídico de los contenidos celulares restantes, como proteínas, lípidos y otros ácidos nucleicos. El cloropán es una mezcla de solventes orgánicos que contiene fenol y cloroformo. Estos solventes disuelven las moléculas hidrofóbicas como los lípidos de la membrana y desnaturalizan las proteínas haciéndolas insolubles en agua. Con la centrifugación separamos la mezcla en dos fases: los fosfolípidos y las proteínas celulares se quedan en solución en la fase inferior de cloropán, o atrapadas en la interfase entre las dos fases en forma de precipitado blanco, mientras que el DNA plasmídico quedará en la fase acuosa superior, ya que sus cargas eléctricas no están neutralizadas y, por lo tanto, es soluble en agua.

6. Pasa la fase acuosa superior transparente a un nuevo tubo con la pipeta de 200 µl.

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7. Añade 900 µl de Etanol 100% con la pipeta de 200 µl y mezcla bien. El etanol hace que precipite el ADN plasmídico de la solución acuosa.

8. Centrifuga 5 minutos a máxima velocidad. Observarás el precipitado que es el ADN en forma de plásmido.

9. Saca TODO el etanol con la pipeta de 200 µl.

10. Vuelve a resuspender el precipitado de ADN plasmídico en 20 µl de H2O purificada.

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Resultados y discusión

1. Haz un esquema del proceso de transformación bacteriana y explica para qué sirve en la línea de investigación de búsqueda de nuevos fármacos contra la aterosclerosis.

2. Explica, con la ayuda de un esquema, qué es un choque térmico.

3. Para hacer crecer las bacterias has utilizado una placa de cultivo que tenía un antibiótico. ¿Por qué?

4. ¿Qué es una colonia de bacterias?

5. ¿En cuál de las dos placas que has sembrado, la de control o la de las bacterias transformadas, obtendrás colonias? ¿Por qué?

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6. A partir de las colonias que se han formado, ¿cómo se obtienen múltiples copias del gen de interés?

7. ¿Cómo se hacen precipitar el ADN bacteriano y el ADN de interés? Complementa la explicación con un esquema.

8. Con la técnica de separación llamada miniprep, has conseguido aislar múltiples copias del ADN de interés. ¿Qué hacen los científicos una vez obtienen este ADN?

Investigadores que han contribuido con contenidos: Theresa León, Jonathan Matalonga, Universidad de Barcelona

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