Lección 2: electroforese en xel de agarosa e visualización dos fragmentos de ADN Preparación previa Obxectivos: ● Preparar o patrón HindIII (marcador de ADN) e alicuotas (opcional) ● Preparar alicuotas de tampón de carga de ADN (opcional) ● Preparar a cámara de electroforese ● Diluir Fast Blast a 1x (para tinguidura nocturna) ou a 100x (para tinguidura rápida). ● Configurarlas estacións de traballo de estudantes e do profesor. Tempo requerido: uns 45 minutos. Requerimentos: ● Marcador de ADN HindIII ● tinguidura de carga ● Cubetas de electroforese coas súas bandexas de xel e peines. ● Tampón de electroforese (TAE 1x) ● tinguidura para ADN Fast Blast a 500x Procedemento
1. Preparar o patrón HindIII (marcador de ADN) e alicuotas (opcional). Engadir 20μL de tinguidura de carga ó vial que contén o marcador de ADN HindIII. Se és posible, quentar o marcador a 65ºC durante 5 minutos, colocalo de seguido en xeo (este tratamento resulta nunha mellor separación das bandas). Etiquetar 8 viais como “M”. Distribuir 15μL do marcador de ADN con tinguidura de carga neses 8 viais. 2. Distribuir as alicuotas da tinguidura de carga. Etiquetar 8 tubos como “LD” para a tinguidura de carga e distribuir 30μL de tinguidura de carga que se usará coas mostras en cada tubo. 3. Preparar a cámara de electroforese. Unha vez que o xel de agarosa se ten solidificado, pódese iniciar a carga das mostras para, de seguido, comezar a electroforese. a. Ó colocar a bandexa do xel na cámara de electroforese, poñer atención en que os pocillos sitúanse no extremo do cátodo (negro). As mostras de ADN migrarán cara ó ánodo (vermello) durante a electroforese.
b. Preparar o volume preciso de tampón TAE 1x, no caso denontelo preparadooxa. xel baixo uns 2 mm de tampón TAE 1x. c. Mergullar d. Preparar as mostras para a carga. Ver protocolo de laboratorio máis adiante. Nota: Os requisitos de enerxía varían dependendo do espesor do xel, a lonxitude e concentración, e co tipo de tampón de electroforese utilizado. Para este exercicio recoméndase o uso dunha voltaxe constante de 100 V durante 30 minutos1 4. Preparar a tinguidura de ADN Fast Blast ● Para preparar tinguidura 100x (para tinguidura rápida), diluir 100ml de Fast Blast 500x en 400ml de auga destilada ou deionizada nun frasco de capacidade axeitada e homoxenizar. Tapar o frasco e almacenar a temperatura ambiente ata o seu uso. ● Para preparar tinguidura 1x (para tinció nocturna), diluir 1ml de Fast Blast 500x en 499ml de auga destilada ou desionizada nun frasco de capacidade axeitada e homoxenizar. Tapar o frasco e almacenar a temperatura ambiente ata o seu uso. Visualización de fragmentos de ADN A tinguidura de ADN ‘Fast Blast’ é unha alternativa ó bromuro de etidio axeitada, segura e non tóxica para a detección de ADN por electroforese en xeles de agarosa. ‘Fast Blast’ contén un composto catiónico da familia dos colorantes de tiazina. As moléculas con carga positiva da tinguidura síntense atraídos e se xuntan ós grupos fosfato, con carga negativa, das moléculas de ADN. A fórmula proporciona unha tinguidura azul marino ó ADN ofrecendo moi bos resultados. A tinguidura para ADN ‘Fast Blast’ suminístrase como un concentrado 500x que se ten que diluir antes do seu uso. A tinguidura pódese facer de xeito rápido, diluíndo a 100x o que permite a visulización do ADN dentro dos 12-15 minutos, ou ben durante toda a noite diluíndo a razón de 1x. Cando o xel de agarosa mergúllase no ‘ADNFast Blast’, as moléculas de colorante xúntanse ás moléculas de ADN retido no xel de agarosa. Cando as bandas de ADN son visibles, pódese comparar o ADN patrón coas distintas mostras de ADN. No manual do alumno pódense atopar instrucción polo miúdo sobre o uso do ‘ADN Fast Blast’. ATENCIÓN 1Bio-Rad
ha investigado un nuevo protocolo para reducir el tiempo a 20 minutos usando un voltage superior (200V). Requiere la preparación del buffer de electroforesis según nuevas indicaciones: http://www.bio-rad.com/webroot/ web/pdf/lse/literature/Bulletin_5396.pdf
Aínda que o ADN Fast Blast non é tóxico nin carcinoxénico, cómpre usar roupa de laboratorio e luvas de vinilo ou látex para a manipulación dos xeles e evitar a aparición de manchas azúis nas mans ou na roupa. Para a eliminación dos resíduos cómpre seguir os protocolos normalizados. Para unha eliminación rápida das superficies pódese usar unha disolución de lixivia ó 10% ou de alcol ó 70%. Comprobar que esas disolucións non danan as superficies a tratar antres do uso. Apuntamento:: ● Recoméndase usar 120 ml de Fast Blast diluido para tinguir dous xeles de agarosa de 7x7 cm ou de 7x10 cm nas bandexas porporcionadas (pódense facer muescas nas esquinas dos xeles para identificalos. En todo caso, cómpre engadir solución de tinguidura en cantidade suficiente para mergullar completamente os xeles. ● Logo da electroforese, os xeles de agarosa teñen que se retirar das bandexas antes de se mergullar na solución de tinguidura. Esto é doado de facer collendo a bandexa do gel nunha man e empuxando fora o gel co pulgar da outra man. ● Cómpre prestar especial atención na manipulación dos xeles dada a súa fraxilidade. Recoméndase o uso dunha espátula grande ou doutra superficie de apoio para transferir o xel da bandexa á outra durante o protocolo de tinguidura. ● O lavado (obrigado cando se usa o protocolo rápido de tinguidura) precisa do uso dunha cubeta cunha capacidade mínima de 500 ml. Se usan cubetas distintas para cada paso de decoloración ou ben unha única cubeta que se baleira logo dun paso e se enche para o seguinte. ● O Fast Blast 100x pódese reusar ata sete veces. ● Cando se usa o protocolo de tinguidura nocturna non se precisa facer lavado ou detinguidura. Para rexistrar de forma permanente do xel antes de que se seca, pódese trazar o contorno (Incluíndo os pocillos e as bandas de ADN) nun torozo de papel ou de acetato, tomar unha fotografía usando calquera cámara normal ou fotocopiar o xel tinguido.