HOGENT-agro-en biotechnologie- microbiologie by HOGENT

Microbiologie Bachelor in de agro- en biotechnologie

Microbiologie

Verantwoordelijke uitgever Lieve Vermeiren, Melissa Camerlinck

2220140282694

Microbiologie Bachelor in de agro- en biotechnologie

Microbiologie

Verantwoordelijke uitgever Lieve Vermeiren, Melissa Camerlinck

2220140282694

Microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Inhoudstafel INHOUDSTAFEL.............................................................................................................................. 1 1. INLEIDING .................................................................................................................................. 6 1.1. WERKGEBIED VAN DE MICROBIOLOGIE .............................................................................. 6 1.2. GESCHIEDENIS VAN DE MICROBIOLOGIE ......................................................................... 10 1.2.1. DE OUDHEID ........................................................................................................................... 10 1.2.2. DE “GENERATIO SPONTANEA” EN DE ONTDEKKING VAN MICRO-ORGANISMEN .............. 10 1.2.3. DE MICROBIOLOGIE ALS WETENSCHAP ................................................................................ 12 1.2.4. DE MEDISCHE MICROBIOLOGIE ............................................................................................. 14 1.2.5. INDELING VAN DE LEVENDE WERELD VOLGENS (MICRO)BIOLOGEN ................................. 18 2. CELBOUW VAN HET MICRO-ORGANISME................................................................ 21 2.1. PROKARYOTISCHE VERSUS EUKARYOTISCHE MICRO-ORGANISMEN ......................... 21 2.2. KERN........................................................................................................................................... 26 2.2.1 CHEMISCHE STRUCTUUR VAN DNA ....................................................................................... 27 2.2.2. RUIMTELIJKE STRUCTUUR VAN DNA .................................................................................... 27 2.3. CYTOPLASMA ............................................................................................................................ 28 2.4. SUBCELLULAIRE DEELTJES EN STRUCTUREN .................................................................... 28 2.4.1. MITOCHONDRIËN .................................................................................................................... 28 2.4.2. CHLOROPLASTEN, CHROMATOFOREN EN CHROMOPLASTEN ............................................... 28 2.4.3. ENDOPLASMATISCH RETICULUM ............................................................................................ 29 2.4.4. RIBOSOMEN ............................................................................................................................. 29 2.4.5. GOLGI-APPARAAT ................................................................................................................... 31 2.4.6. LYSOSOMEN ............................................................................................................................. 31 2.4.7. VACUOLEN ............................................................................................................................... 32 2.4.8. KORRELS .................................................................................................................................. 32 2.5. CYTOPLASMATISCH MEMBRAAN .......................................................................................... 32 2.6. CELWAND .................................................................................................................................. 33 2.7. SLIJMLAAG EN KAPSEL........................................................................................................... 37 2.7.1. SLIJMLAAG ............................................................................................................................... 38

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.7.2. KAPSEL ..................................................................................................................................... 38 2.8. FLAGELLEN & CILIËN EN PILI & FIMBRIAE ...................................................................... 38 2.9. ENDOSPOREN ........................................................................................................................... 39 3. MORFOLOGIE ........................................................................................................................... 41 3.1. SCHIMMELS EN AANVERWANTE SOORTEN ........................................................................ 41 3.1.1. SCHIMMELS ............................................................................................................................. 41 3.2.2. SLIJMZWAMMEN OF MYXOMYCETEN ...................................................................................... 46 3.2.3. LICHENES OF KORSTMOSSEN ................................................................................................ 47 3.3. GISTEN ....................................................................................................................................... 48 3.4. BACTERIËN................................................................................................................................ 49 3.5. OVERGANGSGROEPEN ............................................................................................................ 52 3.5.1. ARCHAEA.................................................................................................................................. 52 3.5.2. RICKETTSIAE (OBLIGAAT PARASITAIRE BACTERIËN) .......................................................... 53 3.5.3. ACTINOMYCETEN (STRAALSCHIMMELS) ............................................................................... 53 3.5.4. MYCOPLASMA .......................................................................................................................... 53 3.5.5. MYCOBACTERIA ....................................................................................................................... 54 3.5.6. MYXOBACTERIA (GLIJDENDE BACTERIËN) ........................................................................... 54 3.5.7. CYANOBACTERIA ..................................................................................................................... 55 3.6. PROTOZOA ................................................................................................................................ 55 3.7. ALGEN ........................................................................................................................................ 56 3.8. VIRUSSEN, VIROÏDEN, PRIONEN ........................................................................................ 58 3.8.1. VIRUSSEN ................................................................................................................................ 59 3.8.2. VIROÏDEN ................................................................................................................................ 61 3.8.3. PRIONEN .................................................................................................................................. 62 4. MICROBIËLE GROEI ............................................................................................................. 63 4.1. INLEIDING ................................................................................................................................ 63 4.2. MITOSE, MEIOSE EN CONJUGATIE ...................................................................................... 63 4.3. GESLACHTELIJKE EN ONGESLACHTELIJKE VOORTPLANTING ....................................... 64 4.4. GROEI VAN BACTERIËN.......................................................................................................... 65 4.4.1. INDIVIDUELE BACTERIEGROEI ............................................................................................... 65 4.4.2. GROEI VAN DE BACTERIËLE POPULATIE ................................................................................ 67

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

4.4.3. UITWISSELING VAN GENETISCH MATERIAAL TUSSEN BACTERIËN ..................................... 70 4.5. GROEI VAN FUNGI (GISTEN EN SCHIMMELS) .................................................................. 72 4.5.1. ONGESLACHTELIJKE VOORTPLANTING VAN DE FUNGI ........................................................ 73 4.5.2. GESLACHTELIJKE VOORTPLANTING VAN DE FUNGI ............................................................. 75 4.5.3. LEVENSCYCLI VAN DE FUNGI ................................................................................................. 75 4.6. GROEI VAN VIRUSSEN............................................................................................................ 80 4.6.1. AANHECHTINGSFASE (VIRUSINTREDE OF VIRUSADSORPTIE) ............................................ 80 4.6.2. INJECTIE VAN HET FAAG-DNA .............................................................................................. 81 4.6.3. INTRACELLULAIRE VERMENIGVULDIGING EN LYSIS............................................................. 81 4.7. INVLOEDSFACTOREN OP DE GROEI VAN MICRO-ORGANISMEN ................................... 84 4.7.1. VOEDINGSSTOFFEN / SAMENSTELLING VAN HET GROEIMEDIUM ...................................... 84 4.7.2. TEMPERATUUR ......................................................................................................................... 85 4.7.3. ZUURTEGRAAD OF PH ............................................................................................................. 87 4.7.4. ZUURSTOF ............................................................................................................................... 88 4.7.5. DE WATERACTIVITEIT (AW) .................................................................................................... 89 4.7.6. ANTIMICROBIËLE STOFFEN .................................................................................................... 91 4.7.7. WISSELWERKING TUSSEN MICROBIËLE POPULATIES ......................................................... 91 4.8. KWEKEN VAN MICRO-ORGANISMEN ................................................................................... 91 4.8.1. KWEKEN (NIET KENNEN – ZIE LABORATORIUMVAARDIGHEDEN) ...................................... 92 4.8.2. OPHOPEN (NIET KENNEN – ZIE LABORATORIUMVAARDIGHEDEN) .................................... 98 4.8.3. ISOLEREN (NIET KENNEN – ZIE LABORATORIUMVAARDIGHEDEN) .................................... 98 4.8.4. HET BEWAREN VAN EEN ISOLAAT (NIET KENNEN – ZIE LABORATORIUMVAARDIGHEDEN) ............................................................................................................................................................. 100 4.9. HET TELLEN EN METEN VAN DE GROEI VAN MICRO-ORGANISMEN ........................... 100 4.9.1. MICROSCOPISCHE TELLING (NIET KENNEN – ZIE LABORATORIUMVAARDIGHEDEN)..... 101 4.9.2. TELLING VIA UITPLATING OP VOEDINGSBODEMS (NIET KENNEN – ZIE LABORATORIUMVAARDIGHEDEN)

..................................................................................................... 101

4.9.3. TURBIDITEITSBEPALING (NIET KENNEN – ZIE LABORATORIUMVAARDIGHEDEN) .......... 102 5. HET MICROBIEEL METABOLISME .............................................................................. 103 5.1. ENZYMEN ................................................................................................................................. 103 5.1.1. ROL IN HET MICROBIEEL METABOLISME ............................................................................. 103 5.1.2. ENZYMSTRUCTUUR ................................................................................................................ 103 5.1.3. ENZYMWERKING .................................................................................................................... 104

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

5.1.4. ENZYMKINETIEK .................................................................................................................... 105 5.1.5. ENZYMREMMING .................................................................................................................... 106 5.2. DE STOFWISSELING VAN MICRO-ORGANISMEN ............................................................ 109 5.2.1. INDELING VAN MICRO-ORGANISMEN NAAR STOFWISSELING .......................................... 109 5.2.2. WAAR HEBBEN M.O. ENERGIE VOOR NODIG? .................................................................. 110 5.2.3. OXIDATIE- EN REDUCTIEREACTIES ALS BASIS VOOR HET METABOLISME ...................... 111 5.2.4. ENERGIELEVERENDE REACTIES ........................................................................................... 113 5.2.4.1. DE AËROBE RESPIRATIE.............................................................................................. 116 5.2.4.2. DE ANAËROBE RESPIRATIE ........................................................................................ 117 5.2.4.3. FERMENTATIE ................................................................................................................ 118 5.2.4.4. OXIDATIE VAN ANORGANISCHE VERBINDINGEN ................................................. 120 5.2.5. BIOSYNTHETISCHE OF ENERGIECONSUMERENDE REACTIES ............................................ 120 5.2.5.1. CHEMOTROOF................................................................................................................. 121 5.2.5.2. FOTOTROOF .................................................................................................................... 123 6. MICROBIËLE ECOLOGIE .................................................................................................. 124 6.1. MINERALISATIE EN DE C-, N- EN S-CYCLUS................................................................. 124 6.1.1. MINERALISATIE VAN ORGANISCHE VERBINDINGEN .......................................................... 125 6.1.2. KOOLSTOFCYCLUS ................................................................................................................ 127 6.1.3. STIKSTOFCYCLUS .................................................................................................................. 129 6.2. BODEMMICROBIOLOGIE ...................................................................................................... 133 6.2.1. MICROBIËLE DIVERSITEIT IN DE BODEM ............................................................................ 133 6.2.2. BEÏNVLOEDING VAN HET BODEMLEVEN .............................................................................. 134 6.3. SYMBIOSE ............................................................................................................................... 136 6.3.1. SAMENLEVING VAN BACTERIËN MET HOGERE PLANTEN .................................................... 137 6.3.2. ZWAMWORTELSYMBIOSE (MYCORRHIZA’S) ...................................................................... 140 6.3.3. PLANTENETERS EN HUN PENSFLORA ................................................................................... 142 7. TAXONOMIE, NOMENCLATUUR EN IDENTIFICATIE........................................ 144 7.1. TAXONOMIE EN IDENTIFICATIE ........................................................................................ 144 7.2. NOMENCLATUUR .................................................................................................................... 149 7.3. TAXONOMIE VAN DE SCHIMMELS ...................................................................................... 149 7.4. TAXONOMIE VAN DE GISTEN .............................................................................................. 151

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

7.5. TAXONOMIE VAN DE BACTERIËN ....................................................................................... 152 7.6. TAXONOMIE VAN DE VIRUSSEN ......................................................................................... 153 8. INDUSTRIËLE MICROBIOLOGIE ................................................................................. 154 8.1. INLEIDING .............................................................................................................................. 154 8.2. HET FERMENTATIEPROCES .................................................................................................. 155 8.3. MICRO-ORGANISMEN ALS PRODUCT ................................................................................ 158 8.3.1. MICRO-ORGANISMEN ALS VOEDSELBRON .......................................................................... 158 8.3.2. PRODUCTIE VAN VACCINS .................................................................................................... 160 8.3.3. PRODUCTIE VAN BIO-PESTICIDEN ...................................................................................... 162 8.4. METABOLIETEN ALS PRODUCT ........................................................................................... 163 8.4.1. ANTIBIOTICA ......................................................................................................................... 164 8.4.2. VITAMINES............................................................................................................................. 169 8.4.3. AMINOZUREN......................................................................................................................... 169 8.4.4. ENZYMEN ............................................................................................................................... 170 8.5. HET GEFERMENTEERD CULTUURMEDIUM ALS PRODUCT .............................................. 172 8.5.1. HUMANE VOEDING ................................................................................................................ 172 8.5.2. DIERVOEDING ....................................................................................................................... 173 8.6. MICROBIOLOGISCHE PROCESSEN BIJ OMZETTINGEN VAN AFVALPRODUCTEN ..... 175 8.6.1. MICROBIOLOGISCHE PROCESSEN BIJ DE WATERZUIVERING ........................................... 175 8.6.2. COMPOSTEREN ...................................................................................................................... 177 8.6.3. BIOREMEDIATIE .................................................................................................................... 178 LIJST MET AFBEELDINGEN.................................................................................................. 179 LIJST MET TABELLEN .............................................................................................................. 182

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

1. INLEIDING De eerste levende wezens waren kleine, primitieve micro-organismen. Ze vormden de oervorm van alles wat leeft op onze planeet. Het zijn de voorvaderen van de moderne micro-organismen. Sinds Anthonie Van Leeuwenhoek als eerste mens micro-organismen gezien heeft, hebben vele biologen zich verwonderd dat zulke kleine levende wezens zoveel invloed hebben op het leven van alle andere organismen (incl. de mens). Alle leven op onze planeet steunt immers op de activiteit van deze micro-organismen. Een basiskennis van micro-organismen is dan ook belangrijk wanneer je straks als agro- en biotechnoloog aan de slag gaat. De mens gebruikt immers micro-organismen op vele terreinen: in de voedingsmiddelentechnologie, in de landbouw/tuinbouw (werken met resistente rassen), in de farmaceutische industrie (vaccins en antibiotica), … Het ontstaan van het leven ligt al enkele miljarden jaren achter ons maar het bestaan van microorganismen is pas een paar 100 jaar aan de mens bekend. Dit hoofdstuk verduidelijkt het werkgebied van de microbioloog en verduidelijkt hoe we gekomen zijn tot de huidige kennis van de microbiologie.

1.1. Werkgebied van de microbiologie Voor de “leek” betekent microbiologie de studie van ongewenste, onzichtbare “beestjes” die ziektes veroorzaken. Deze gedachte is meestal ontstaan door de verslaggeving in het nieuws en door van kindsaf steeds voor dergelijk “gevaar” te zijn gewaarschuwd. Desondanks leven rondom ons massaal micro-organismen zonder schade of ziektes te veroorzaken.

Microbiologie is de wetenschap die zich bezighoudt met de bestudering van de bouw en de levensverrichtingen van micro-organismen. Onder micro-organismen verstaat men in de praktijk die organismen, die uitsluitend met behulp van een microscoop of een elektronenmicroscoop te zien zijn. Geheel juist is deze definitie niet, omdat bijvoorbeeld schimmels, die tot een voor het blote oog zichtbaar schimmeldek kunnen uitgroeien, ook tot de micro-organismen worden gerekend. Een betere omschrijving van micro-organismen is: organismen, die in hun levenscyclus tenminste één periode doormaken, waarin één enkele cel zich als individu vermenigvuldigt. Een andere definitie van micro-organismen is: microscopische organismen die bestaan uit één enkele cel of celcluster samen met de virussen die microscopisch zijn maar niet cellulair.

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Microbiële cellen verschillen van de cellen van planten en dieren (macro-organismen) in het volgende: 

Cellen van planten en dieren kunnen niet alleen leven in de natuur en bestaan alleen als een deel van meercellige structuren zoals vb. de organen van dieren/mensen of vb. een structureel onderdeel van een plant



Cellen van M.O. zijn onafhankelijk van andere cellen voor wat betreft hun levensprocessen zoals groei, energievoorziening, voortplanting, enz….

In het algemeen worden de volgende groepen als micro-organismen beschouwd: 

protozoën



wieren



schimmels



slijmzwammen



gisten



bacteriën



(virussen, viroïden, prionen)

Hoewel virussen, viroïden en prionen in het algemeen ook onder de noemer micro-organismen gerekend worden, vormen ze toch een geheel aparte groep, omdat ze niet uit cellen zijn opgebouwd.

Microbiologen kunnen zich specialiseren in: 

specifieke groepen: o viroloog o bacterioloog o fycoloog of algoloog o mycoloog o protozoöloog



karakteristieken en activiteiten van micro-organismen: o microbiële morfologie o microbiële cytologie o microbiële ecologie o microbiële genetica en moleculaire biologie o microbiële taxonomie 7

Microbiologie H1: Inleiding ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

specifieke domeinen: o medische microbiologie o levensmiddelenmicrobiologie o industriële microbiologie o agromicrobiologie

Micro-organismen zijn de eerste levende organismen op aarde, leven overal waar leven mogelijk is, zijn talrijker dan gelijk welk andere organisme, en vormen waarschijnlijk het grootste aandeel in de levende biomassa op aarde. Het ganse ecosysteem is afhankelijk van de microbiële activiteiten. De microbiologie heeft een impact op medisch vlak, landbouwkundig en voedingsvlak, ecologie, genetica, biochemie, en andere domeinen.

Het is duidelijk dat m.o. schadelijk kunnen zijn. Pathogene micro-organismen veroorzaken bij zowel de mens, het dier als bij de planten heel wat ziekten. Met de bestrijding van deze pathogene m.o. houden zich de mensen diergeneeskunde bezig, alsook de fytopathologie. Andere m.o. kunnen schadelijk zijn, niet omwille van hun virulentie, maar omdat ze ontbindingsprocessen en bederfprocessen in gang zetten van levensmiddelen en landbouwgrondstoffen en de kwaliteit ervan verslechteren zodat deze geen economische waarde meer hebben. Denken we maar aan de aanwezigheid van kiemen in rauwe melk met hun invloed op de betaling en de kwaliteit van die melk.

De meerderheid van de micro-organismen zijn echter onschadelijk. Deze groep wordt benoemd als de commensalen. Commensalisme is een vorm van symbiose (sterk doorgedreven samenleving) tussen twee organismen waarbij het ene organisme voordeel heeft en het andere niet beïnvloed wordt (dus geen voordeel maar ook geen nadeel). Commensale microorganismen zijn bijvoorbeeld bacteriën die op onze huid leven. De mens heeft er geen last van, maar haalt er geen voordeel uit. De bacterie heeft voldoende afvalstoffen ter beschikking en leeft bij een vrij constante temperatuur. De bacteriën halen er dus wel voordeel uit. Een ander voorbeeld van commensalen zijn sommige darmbacteriën die behoren tot onze darmflora.

Sommige van diezelfde micro-organismen, zelfs de meest virulente worden door andere wetenschappers als nuttig ervaren! Ze hebben zich een voorname plaats veroverd, van in de industrie tot in het huishouden, en zijn daardoor van enorme economische betekenis. 8

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Hun toepassingsgebied strekt zich uit van de veredeling van primaire landbouwproducten tot en met de katalyse van ingewikkelde chemische reacties, van de productie van het gewoonste brood tot en met de genetische manipulatie.

A. Productie en bewaring van voedsel en voeder via fermentatieprocessen Als voorbeeld de bier-, brood- en wijnbereidingen en alle bakprocessen die zonder gisten onmogelijk zijn. De productie van de meest verscheidene kazen, yoghurt en andere melkproducten door de melkzuurbacteriën die tevens een belangrijke rol spelen in de conserveringsmethodes van het basisvoedsel voor mens en dier (silovorming, productie van verzuurde groenten zoals zuurkool en vleeshalfconserven). B. Verwerking van afval Niet te vergeten is de tussenkomst van bacteriën in de verwerking van alle mogelijk afval, zowel huishoudelijk als industrieel afval, en de omzetting van giftige afvalproducten tot meststoffen en vruchtbare grond. Micro-organismen worden ook ingezet om afvalproducten van petroleumraffinage te verteren, en uit de microbiële massa, die daaruit voortvloeit, worden proteïnen, vetten, aminozuren, koolhydraten, vitamines, en andere biochemicaliën getrokken die aan de voeding als verbeteraar kunnen worden toegevoegd. C. Biotechnologische toepassingen M.o. worden ook ingezet om zeer ingewikkelde biochemische syntheseprocessen te volbrengen die resulteren in de productie van enzymen (biokatalysatoren) die op hun beurt gebruikt worden in de leerlooierij, suiker- en vruchtensappenbereiding (klaringsprocessen) en in de zeepindustrie. De vorming van

azijn door

azijnzuurbacteriën; de vorming van aceton, butanol, isopropanol en ander belangrijke grondstoffen voor de chemische industrie door Clostridium en Bacillus soorten. D. Verteringsproces bij mens en dier E. Toepassingen in de geneeskunde Door de ontdekking van penicilline, en andere antibiotische uitscheidingsproducten (antibiotica) van schimmels, Actinomyceten en andere bacteriën is de geneeskunde een hele stap vooruit gekomen in de bestrijding van bacteriële infectieziekten. Niet-virulente bacteriestammen zorgen in dat verband ook voor de nodige entstoffen en immunoglobulines (antistoffen).

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

1.2. Geschiedenis van de microbiologie De microbiologie is ontstaan toen Antonie van LEEUWENHOEK de micro-organismen ontdekte. Bacteriën hebben na hun ontdekking aanvankelijk vooral de belangstelling getrokken van de geleerden die de biologie toepasten. In het bijzonder medici en chemici hebben veel bijgedragen tot de vroege ontwikkeling van de kennis over de bacteriën. Hun belangstelling ging uit naar de effecten van bacteriën, als verwekkers van ziekteverschijnselen en als veroorzakers van specifieke chemische omzettingen. De biologen bemoeiden zich tot de twintigste eeuw nauwelijks met bacteriën; zij hielden zich vooral bezig met planten en dieren. Hun invloed op de microbiologie deed zich pas later gelden. De microbiologie is nog altijd een vakgebied waar wetenschappers uit zeer verschillende disciplines elkaar ontmoeten.

1.2.1. De Oudheid Al in de oudheid was bekend dat er twee soorten ziekten bestaan, nl. de besmettelijke en de niet-besmettelijke ziekten. Deze laatste zijn een gevolg van organische of fysiologische afwijkingen in het menselijk lichaam die niet kunnen worden overgebracht op andere mensen. De besmettelijke ziekten, die zich uitbreiden van mens tot mens, werden in die tijd mede gezien als straffen der goden. Voorbeelden hiervan waren de pest en melaatsheid. HOMERUS dacht dat de pest door de god Apollo werd veroorzaakt. In het Oude Testament wordt beschreven dat de Joden een strikte hygiëne van het lichaam in acht moeten nemen. Zij begrepen toen al dat uitbreiding van ziekten, zoals melaatsheid, mede door afzondering van mensen kon worden voorkomen. Het vlees moest op de dag van de slacht worden gegeten en het eten van vlees van onbekende kadavers was verboden; ook mocht vlees van een gezond dier niet worden gegeten in het huis van een gestorvene. Dat deze besmettelijke ziekten, het schoonhouden van het lichaam en het hygiënisch behandelen van voedsel in nauw verband stonden met de werking van micro-organismen, was toen nog niet bekend. HIPPOCRATES (ca. 400 v. Chr.) trachtte de overbrenging van besmettingen te verklaren door “uitwasemingen”, die van een zieke uitgingen.

1.2.2. De “Generatio Spontanea” en de ontdekking van micro-organismen Robert HOOKE was de eerste persoon die micro-organismen waarneemt aan de hand van een microscoop. In 1665 publiceerde hij een boek met de titel “Micrographia” waarin hij zijn bevindingen beschrijft. In het boek staat de eerst gepubliceerde afbeelding van een microorganisme, de fungus Mucor. 10

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Antonie van LEEUWENHOEK slaagde erin een microscoop te construeren waarmee hij in 1676 bacteriën waarnam, die hij 'diertgens' noemde (Figuur 1). De microscoop die hij gebruikte, bestond uit een enkelvoudige lens. De allereerste microbiologische onderzoekers hielden zich bezig met de vraag naar het ontstaan van de kleine organismen op aarde. De vraag naar het ontstaan van leven op aarde heeft de mensen altijd geïntrigeerd. Een oude theorie veronderstelde dat leven op aarde steeds weer opnieuw spontaan kon ontstaan. Zo meende ARISTOTELES dat de aal ontstond uit het slib van de rivieren en de wormen uit de vochtige bodem. Dat was de leer van de “spontane generatie” (“Generatio spontanea”) of de abiogenesis. Levend materiaal gaat dood, maar de levenskrachten zouden niet verdwijnen, aldus deze theorie. Dood materiaal zou spontaan levend kunnen worden en zich daarna weer voortplanten. Zo meende men vroeger dat uit kadavers van rundvee spontaan vliegen- en bijenzwermen ontstonden en dat in vochtige kelders, in potten gevuld met graan, spontaan muizen gevormd werden.

Figuur 1 Eerste tekeningen van bacteriën van Antonie Van Leeuwenhoek

Aan het einde van de 17e eeuw was men al zover gekomen dat dit voor grotere levensvormen niet meer kon gelden. In de strijd tussen aanhangers en tegenstanders van de leer van de spontane generatie werden de eerste microbiologische experimenten gedaan, om te bewijzen dat men gelijk had en de tegenstander ongelijk. De voorstanders van het idee dat micro-organismen spontaan konden ontstaan, deden experimenten om hun stelling te bewijzen, zoals Needham in 1748. Ze vulden een kolf met een 11

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

vloeistof (vleesnat, urine, hooi-infuus en dergelijke) waarin de condities voor het ontstaan van micro-organismen gunstig zouden zijn. Om de eventuele aanwezige levende organismen te doden, werd de kolf enige tijd opgekookt. Om besmetting, via insecten bijvoorbeeld, te voorkomen werd de kolf afgesloten met een kurk. In de kolf was na enige tijd troebeling waar te nemen. Bij microscopische beschouwing bleken steevast allerlei micro-organismen aanwezig. Daarmee was, naar men dacht, het bewijs geleverd dat zulke organismen uit het dode materiaal waren ontstaan. Mensen die daarvan niet overtuigd waren, voerden de experimenten iets anders uit. Zij beschouwden de duur van de verhitting en afdichting van de kolf als zwakke punten in de proeven. Daarom deed Spallanzani proeven waarin hij uitzocht hoe lang een kolf verhit moest worden om het aanwezige leven te doden. Bovendien sloot hij de kolven hermetisch af door ze dicht te smelten. In langdurig verhitte en hermetisch afgesloten kolven ontstond geen troebeling. Spallanzani bracht in 1799 dan ook naar voren, dat door het binnendringen van lucht wellicht levende kiemen in de kolven van Needham waren gekomen. In 1810 had Appert een proces gepubliceerd om voedsel houdbaar te maken door te verhitten nadat het was ingesloten in glas. Appert kon zelf geen verklaring voor zijn uitvinding geven en zocht daarom contact met Gay Lussac. Deze ontdekte dat in de glazen met aldus houdbaar gemaakt voedsel zeer weinig zuurstof aanwezig was. De leer van de “spontane generatie” wankelde, maar niet iedereen gaf zich gewonnen. Als de kracht die het leven opwekt nu juist gelegen zou zijn in de lucht, dan waren, zo stelden de tegenstanders van Spallanzani, de hermetisch gesloten kolven natuurlijk ondeugdelijk om het leven een kans te bieden. In die tijd kende men alleen maar leven dat afhankelijk was van zuurstof (aërobe levensvormen), zodat die gedachte niet onlogisch genoemd mag worden. Schwann publiceerde in 1837 proeven waarbij hij hermetische afsluiting vermeed. Hij liet lucht toe tot de kolf, maar om de mogelijk daarin aanwezige organismen te doden werd de lucht eerst verhit. Anderen deden soortgelijke proeven waarbij ze lucht toelieten nadat die lucht, door passage via gasflessen gevuld met loog of zuur, was bevrijd van levende kiemen. Meestal bleven de kolven, die op een dergelijke manier een open communicatie met de lucht hadden, helder. De voorstanders van de “spontane generatie” verklaarden dat de proeven, zoals juist beschreven, ondeugdelijk waren, omdat de hitte-, zuur- of loogbehandeling de leven opwekkende kracht van lucht zou vernietigen.

1.2.3. De microbiologie als wetenschap In 1861 leverde PASTEUR overtuigende bewijzen die de theorie van de generatio spontanea omverwierpen. Pasteur was ervan overtuigd dat in de lucht micro-organismen voorkwamen en dat zulke organismen in een geschikte omgeving konden uitgroeien, zoals in de vruchtensappen 12

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

waarvan hij de fermentatie bestudeerde. Tijdens hun groei zouden ze chemische omzettingen in het medium veroorzaken. Als chemicus was hij vooral geïnteresseerd in die chemische omzettingen. Zijn betrokkenheid bij de filosofische kwestie van de “spontane generatie” was daarom slechts indirect, maar wel zeer effectief. Om af te rekenen met het idee dat bacteriën spontaan zouden ontstaan, construeerde Pasteur een kolf die in open verbinding stond met de lucht door middel van een sterk neerwaarts gebogen hals (een zwanenhals) (Figuur 2).

Figuur 2: Experiment van Pasteur ter weerlegging van de theorie van de spontane generatie

Hij vulde de kolf met allerlei vloeistoffen, vaak vruchtensappen, verhitte de inhoud en zette de kolf weg. Als er geen geforceerde luchtcirculatie is, zo was zijn redenering, dan zullen de door de lucht aangedragen micro-organismen, op grond van hun gewicht, in het laagste deel van de hals van de kolf achterblijven en zal het sap niet besmet worden. De kolven van Pasteur bleven inderdaad helder en er vonden geen omzettingen plaats van de sappen. Werd de zwanenhals van de helder gebleven kolf afgebroken, waardoor micro-organismen er direct in konden vallen, dan werd de kolf alsnog troebel en trad er vergisting van de sappen op. Dat gebeurde ook als er een geforceerde luchtstroom optrad, of wanneer men de kolf kantelde en men vanuit de kolf vloeistof door de zwanenhals heen en terug liet vloeien. De invloed van Pasteur op de microbiologie is enorm geweest. Hij rekende definitief af met het idee dat micro-organismen, zoals bacteriën, zouden ontstaan in rottend en gistend materiaal. Volgens Pasteur was het tegendeel waar, rotting en gisting waren juist het gevolg van chemische omzettingen door de groei en ontwikkeling van bacteriën, gisten of schimmels in materiaal dat van buiten met zulke micro-organismen werd besmet (biogenesis of kiemtheorie). Micro-organismen komen overal in de natuur voor. Met de vaststelling dat bacteriën en andere micro-organismen verantwoordelijk zijn voor afbraak, rotting en omzettingen van allerlei materiaal, was de basis gelegd voor gerichte biologische omzettingen door micro-organismen. Dit type biotechnologie, dat al vanaf de oudheid werd toegepast en het karakter had van “ervaringen zonder verklaringen” kreeg nu een wetenschappelijke basis.

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

1.2.4. De medische microbiologie Lang voor de ontdekking van de micro-organismen leefde het besef dat sommige ziekten overdraagbaar zouden zijn door “kiemen” die als smetstof fungeren. Besmetting bij direct contact zoals in het geval van syfilis, maar ook besmetting via “kwade dampen” (“mal aria”) zou geschieden via onzichtbare “kiemen”. Uiteraard was dit een theorie waarvoor de feitelijke basis ontbrak, omdat de aard van de “kiemen” in het geheel niet werd aangeduid. Toch handelde men naar dat idee, getuige bijvoorbeeld de quarantainemaatregelen die in de Zuid-Europese havensteden al in de Middeleeuwen gehanteerd werden. Men dwong de schepen een veertigtal dagen voor de haven te wachten en liet ze pas toe wanneer er geen spoor van ziekten, die door de schepelingen verspreid konden worden, aantoonbaar was. Voorts bestonden er van oudsher allerlei hygiënische maatregelen en voorschriften die er op gericht waren om de verspreiding van ziekteverwekkers te voorkomen. 1.2.4.1. Opsporen van ziekteverwekkers De Italiaan Fracastoro, die leefde omstreeks 1550, nam aan dat kleine deeltjes besmetting met ziekteverwekkers overbrachten. Toen eenmaal was vastgesteld dat bepaalde aandoeningen veroorzaakt werden door bacteriën of andere micro-organismen, kon men gericht maatregelen nemen om zulke ziekteverwekkers te weren en te bestrijden. De vrouwenarts Semmelweis kreeg bekendheid door de bestrijding van de kraamvrouwenkoorts, nadat hij had vastgesteld dat deze aandoening werd veroorzaakt door besmetting met bacteriën als gevolg van slechte hygiëne. Een andere bekende naam is die van Lister, die besmettingen van chirurgische wonden effectief bestreed met gerichte hygiënische maatregelen. Maar vooral Robert KOCH is bekend geworden. Deze onderzoeker heeft grote bekendheid gekregen doordat hij vaststelde dat een bacterie (de antrax-bacil, Bacillus anthracis) verantwoordelijk was voor de aandoening miltvuur bij het vee, en door zijn onderzoek aan tuberculose, waarvoor de tuberkelbacil (Mycobacterium tuberculosis) verantwoordelijk bleek. Koch is ook befaamd omdat hij bijzonder kritische regels (Koch’s postulaten) opstelde voor het onderzoek naar relaties tussen ziekten en micro-organismen (Figuur 3). 1. De eerste opgave bij het onderzoek naar bacteriële ziekteverwekkers is dat de verdachte bacterie geïsoleerd moet kunnen worden uit de zieke mens of het zieke dier. Het probleem daarbij is dat de bacterie die de ziekte veroorzaakt over het algemeen voorkomt temidden van vele andere bacteriën en dus niet altijd zonder meer terug te

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

vinden is. In de feces van een patiënt met een darminfectie, bijvoorbeeld, komen naast de verwekker van de infectie, talloze andere (onschuldige) bacteriesoorten voor. 2. Koch heeft dat probleem opgelost doordat hij een techniek ontwikkelde om uit bacteriemengsels de afzonderlijke cellen van elkaar te scheiden en ze te laten uitgroeien tot reinculturen, dat wil zeggen tot een kweek van één type cellen. Zulke culturen kunnen vervolgens apart bestudeerd worden zonder dat men last heeft van andere soorten. Alvorens een oorzakelijk verband te kunnen vaststellen tussen het vóórkomen van een bepaalde bacteriesoort en het optreden van een ziekte, was het volgens KOCH noodzakelijk dat de verdachte bacteriesoort bij alle zieke individuen werd aangetroffen. 3. Vervolgens stelde Koch dat de geïsoleerde bacterie, alvorens hem definitief als ziekteverwekker aan te wijzen, in staat moest zijn om na besmetting van een gezond individu de ziekteverschijnselen op te roepen, 4. en moest tevens de verdachte bacteriesoort weer teruggevonden worden uit de besmette individuen die ziek werden.

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Figuur 3: Koch’s onderzoek naar relaties tussen ziekten en micro-organismen

De strenge regels van Koch hebben bijgedragen tot een goede wetenschappelijke ontwikkeling van de medische microbiologie (Tabel 1).

Tabel 1: Overzicht van de vroege ontdekkingen van ziekteverwekkende bacteriën Jaar

Ziekte of Infectie

Verwekker

Ontdekker

1876

miltvuur

Bacillus anthracis

Koch

1879

gonorroe

Neisseria gonorrhoeae

Neisser

1880

tyfeuze koorts

Salmonella typhi

Eberth

1880

malaria

Plasmodium spp.

Laveran

1881

wondinfectie

Staphylococcus aureus

Ogston

1882

tuberculose

Mycobacterium tuberculosis

Koch

1882

kwade droes

Pseudomonas mallei

Loeffler & Schütz

1883

cholera

Vibrio cholerae

Koch

Microbiologie H1: Inleiding ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1884

difterie

Corynebacterium diphteriae

Klebs & Loeffler

1885

tetanus

Clostridium tetani

Nicolaier

1886

bacteriële longontsteking

Streptococcus pneumoniae

Fraenkel

1887

meningitis

Neisseria meningitidis

Weichselbaum

1887

maltakoorts

Brucella spp.

Bruce

1888

paardendroes

Streptococcus spp.

Schütz

1892

gasgangreen

Clostridium perfringens

Welch en Nutall

1894

pest

Yersinia pestis

Kitasato en Yersin

1896

botulisme

Clostridium botulinum

Van Ermengem

1898

dysenterie

Shigella dysenteriae

Shiga

1898

longontsteking met pleuritis vee

Mycoplasma mycoides

Nocard en Roux

1.2.4.2. De ontwikkeling van de eerste vaccins De immunologie is de wetenschap die zich bezig houdt met de studie van de immuniteit: de afweermechanismen

die

het

lichaam

voorkomen

tegen

ziekteverwekkers

lichaamsvreemde stoffen. De ontwikkeling van de immunologie is nauw verweven met de geschiedenis van de medische microbiologie. Men raakte uiteraard geïnteresseerd in de reacties van mens en dier op de besmetting met ziekteverwekkende organismen. De ervaring had geleerd dat mensen die bepaalde infectieziekten hadden doorstaan veelal gevrijwaard waren voor infecties als die ziekten weer eens uitbraken. Ze waren kennelijk immuun geworden. Jenner en later opnieuw Pasteur (hondsdolheid) hebben pionierswerk gedaan om gerichte bescherming van mens en dier te bewerkstelligen door zulke immuniteit op te wekken via moedwillige besmetting, maar nu met verzwakte kiemen van de gevreesde ziekteverwekker. Een relatief klein ongemak van opzettelijke besmetting met zulke afgezwakte ziekteverwekkers is nodig, teneinde bij een besmetting door de gevreesde ziekteverwekker een infectie te voorkomen. Jenner (1749-1823) had als plattelandsarts in Engeland geconstateerd dat mensen die in de veehouderij als melkers en melksters werkten, bij pokkenepidemieën (veroorzaakt door het pokkenvirus) veelal buiten schot bleven. Van dezelfde personen wist hij dat ze vaak pokachtige aandoeningen op hun handen hadden. Die werden als beroepsziekte opgelopen bij het melken van koeien. Er was een koepok (het vaccinia-virus) in het spel, die door de koe naar de melk(st)ers werd verspreid en klaarblijkelijk bescherming gaf tegen de gevreesde pokken. Vanuit die vaststelling heeft Jenner, na veel strijd en tegenwerking, pokken bestreden door mensen bewust te besmetten met koepokken.

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

1.2.4.3. De ontdekking van de antibiotica De successen van de medische microbiologie en van vaccinaties bij het uitbannen van infectieziekten kregen een vervolg, toen aan het begin van de 20ste eeuw stoffen werden gevonden die bacteriën konden doden of die bacteriën in hun groei remden. Deze stoffen, die we nu algemeen antibiotica noemen, werden met succes gebruikt als geneesmiddelen bij bacteriële infectieziekten. Ehrlich is de grondlegger van de toepassing van antibacteriële stoffen. Hij heeft talloze chemische verbindingen gesynthetiseerd en die vervolgens getest bij besmette dieren om te zien of ze heilzaam werkten. Met een aantal verbindingen, in het bijzonder arseenverbindingen, had hij succes. Atoxyl was een goed middel tegen de trypanosomen (verwekkers van de slaapziekte). Salvarsan is vooral bekend geworden als bestrijdingsmiddel tegen syfilis veroorzaakt door de bacterie Treponema pallidium. Domagk ontdekte prontosil als een effectief middel met name bij streptococcen-infecties. Prontosil werkte uitsluitend in vivo, in het levende organisme zelf. Later bleek dat in het lichaam van mens en dier het prontosil wordt afgebroken tot sulfanilamide, de feitelijke antibacteriële verbinding die nu nog altijd als zodanig wordt gebruikt. Fleming (1929) werd wereldberoemd door zijn ontdekking dat bepaalde schimmels penicilline uitscheiden, een stof die als effectief bacteriedodend middel een grote faam kreeg.

1.2.5. Indeling van de levende wereld volgens (micro)biologen Aan het eind van de 19de eeuw, maar vooral in de 20ste eeuw, werd belangrijk onderzoek gedaan naar de algemene biologische eigenschappen van, met name, de bacteriën. Hoe groeien ze? Wat doen ze met de aangeboden voedingsstoffen? Hoe bouwen ze hun celmateriaal op? Welke verscheidenheid aan bacteriën biedt de natuur? Is er binnen die verscheidenheid toch nog een biologische samenhang te ontdekken? Waarom vind je sommige bacteriesoorten altijd op bepaalde plaatsen en andere soorten op andere plaatsen? Deze en andere algemene biologische vragen waren de thema’s van wat men de algemene microbiologie noemt. De vraag “Wat hoort eigenlijk tot de microbiologie en hoe verhouden de micro-organismen zich tot de rest van de natuur?” heeft de biologen uiteraard beziggehouden. Tot de micro-organismen rekent men alles wat in essentie microscopisch klein is.

Aanvankelijk probeerde men de micro-organismen in te delen in het plantenrijk of in het dierenrijk, omdat men alles wat leefde beschouwde als plant dan wel als dier. Men is er nooit in geslaagd om op die manier de micro-organismen een passende plaats te geven. HAECKEL

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

stelde daarom in 1866 voor om de micro-organismen een plaats toe te kennen in een apart rijk naast de planten en de dieren - hij noemde dat het rijk van de Protisten (Figuur 4).

In 1969, onder impuls van Whittaker, werd besloten om toch wat meer nuanceringen aan te brengen, door 5 in plaats van 3 rijken te creëren: de Monera, de Protista, de Fungi, de Plantae en de Animalia. Andere biologen, in het bijzonder celbiologen, maken ook vaak de volgende, simpele tweeledige indeling: ze onderscheiden dan prokaryoten van eukaryoten en laten zich daarbij voornamelijk leiden door het feit of cellen waaruit de organismen zijn opgebouwd een primitieve dan wel een echte kernstructuur (karyos) bezitten. Voor de micro-organismen geldt dat er zowel prokaryote micro-organismen (de Monera) als eukaryote micro-organismen (de Protista en de Fungi) bestaan. De micro-organismen behorend tot de Protista en de Fungi zijn immers micro-organismen met een veel complexere structuur dan de Monera. Tot in de jaren 1970 werden twee groepen prokaryote micro-organismen onderscheiden: bacteriën en blauwwieren. Sinds ca. 1975 worden alle prokaryote mico-organismen als bacteriën beschouwd. De term blauwwieren heeft daardoor plaats gemaakt voor cyanobacteriën.

Figuur 4: Eenvoudige, doch niet algemeen aanvaarde, indeling van de levende natuur, volgens Haeckel (1866)

In 1977 kwam er een verdere uitbreiding van 5 naar 6 rijken. Gebaseerd op studies van het RNA van de levende organismen, heeft de onderzoeker Carl Woese in 1977 de prokaryoten

Microbiologie H1: Inleiding ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

(rijk van de Monera) nog eens onderverdeeld in 2 groepen, de Eubacteria en de Archaeabacteria. In 1990 werd binnen de taxonomische classificatie de naam â&#x20AC;&#x153;domeinâ&#x20AC;? voorgesteld als het hoogste taxonomische niveau. Op dat moment was er sprake van het 3-domeinensysteem en het 6-rijken systeem zoals voorgesteld in Figuur 5.

Figuur 5: Indeling in 3 domeinen en 6 rijken door Woese (1990)

Intussen werd en wordt het onderzoek naar de indeling van de levende natuur nog steeds verder gezet en werden nog nieuwe classificatieschemaâ&#x20AC;&#x2122;s voorgesteld, ondermeer in 2004 door de Britse Professor Thomas Cavalier-Smith. Hij verdiept zich vooral in de indeling van de eukaryoten en ontwikkelde meerdere modellen voor de indeling ervan. Andere onderzoekers kwamen in dezelfde periode echter tot andere vaststellingen. De huidige wetenschappers ervaren de fylogenie van de eukaryoten nog steeds als extreem moeilijk en controversieel waardoor er geen consensus is over wat nu de meest correcte manier van classificeren is. Daarom wordt tot op vandaag de indeling van Woese in 3 domeinen en 6 rijken standaard als indeling teruggevonden in veel basiswerken over microbiologie.

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

2. CELBOUW VAN HET MICRO-ORGANISME Dit hoofdstuk bespreekt enkel de celbouw van de levende micro-organismen. Een organisme moet om levend te zijn per definitie opgebouwd zijn uit één of meerdere cellen. Virussen, viroïden en prionen zijn infectieuze agentia, die onder de micro-organismen gerekend worden, maar het zijn geen levende organismen omdat ze niet opgebouwd zijn uit cellen. In dit hoofdstuk wordt niet verder ingegaan op deze niet-levende micro-organismen. Ze komen wel aan bod in H3: morfologie.

2.1. Prokaryotische versus eukaryotische micro-organismen Planten, dieren en mensen zijn opgebouwd uit cellen (van het Latijnse cellula = kamertje), de universele bouwstenen van het biologisch leven. In de organen of verschillende delen van planten, dieren en mensen komen verschillende soorten cellen voor (celdifferentiatie). Zo zijn bij de plant de wortelcellen anders dan de bladcellen, omdat ze een andere functie vervullen.

De micro-organismen, met uitzondering van de virussen, viroïden en prionen, bestaan ook uit cellen. Ze kunnen zowel ééncellig als meercellig zijn, maar zijn overwegend ééncellig. Als ze meercellig zijn, is er weinig differentiatie van de cellen in één individu.

Wat de bouw en interne structuur van de cel, als bouwsteen van het biologisch leven, betreft zijn er in het algemeen twee types cellen te onderscheiden: de prokaryotische (pro-karyos = voor de kern) en de eukaryotische (eu-karyos = echte kern) cel (Figuur 6). De kennis van de inwendige structuur en de organisatie van de cel is zowel met behulp van elektronenmicroscopisch onderzoek als door middel van (bio)chemische analyses van celfragmenten verkregen. De interne structuren van de kleinere prokaryotische cel, die uitsluitend bij de Bacteria (bacteriën) en de Archaea (oerbacteriën) voorkomt, zijn primitiever dan die van de grotere eukaryotische cel, die bij de overige micro-organismen (Eukarya) voorkomt. Een belangrijke eigenschap van eukaryotische cellen, die afwezig is bij prokaryotische cellen, is de aanwezigheid van membraanomhulde structuren die (cel)organellen (Figuur 7) genoemd worden.

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 6: De prokaryotische versus eukaryotische cel

Cytoplasmatisch membraan

Kern

Cytoplasma

Celwand Intern membraan

MitochondriĂŤn

Figuur 7: De prokaryote (links) en eukaryote cel (rechts)

Tot deze celorganellen horen, eerst en vooral, de kern maar ook de mitochondria.

fotosynthetische plantencellen komen daar ook nog de chloroplasten bij. De functie van deze organellen is over het algemeen goed bekend. MitochondriĂŤn spelen een specifiek rol in de energievoorziening van de cel door ademhalingsprocessen (respiratieprocessen) uit te voeren.

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De kern is de drager van de genetische informatie van de cel en dit onder de vorm van genen opgebouwd uit DNA.

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Een gen is een specifiek DNA-fragment dat de code bevat voor de opbouw van een eiwit en draagt op die manier de informatie voor een specifieke erfelijke eigenschap van een cel. In cellen zijn meerdere genen samen georganiseerd tot één of meerdere chromosomen.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Eukaryotische microbiële cellen bevatten verschillende chromosomen. Het

aantal

chromosomen varieert naargelang het organisme vb. bakkersgist bevat 16 chromosomen terwijl de menselijke cel 46 chromosomen bevat (23 paren). Een heel belangrijk genetisch kenmerk van eukaryoten is ook dat iedere cel twee kopijen bevat van elk gen – ze zijn genetisch diploïd - en kennen bijgevolg zowel mitose (ook kerndeling) als meiose (ook reductiedeling). Daardoor is aseksuele of seksuele voortplanting mogelijk. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Mitosis is het celdelingsproces in eukaryotische cellen waarbij de kern deelt na een voorafgaande verdubbeling van het chromosomenaantal. Dit resulteert in 2 identieke dochtercellen met elk een kern die het volwaardige aantal genen draagt als de moedercel. Meiosis is het proces waarbij het diploïde genoom van eukaryotische cellen halveert om haploïde gameten te vormen voor de seksuele voortplanting. Samensmelting van twee gameten herstelt de cel tot zijn diploïde staat.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Prokaryotische microbiële cellen zijn in vergelijking met eukaryotische cellen kleiner wat afmetingen betreft en hebben een eenvoudigere inwendige structuur waarin organellen omgeven door een membraan ontbreken. Hun kernmateriaal is niet omsloten door een kernmembraan en er zijn geen mitochondriën aanwezig. Ze bezitten slechts één chromosoom, het bacterieel chromosoom dat via microscopie visueel waarneembaar is als de nucleoid. Het chromosoom van prokaryoten bevat slechts één enkele kopij van elk gen en bijgevolg zijn ze genetisch haploïd . Prokaryotische cellen onderscheiden zich verder ook nog door de afwezigheid van een endoplasmatisch reticulum (Tabel 2).

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Tabel 2: Vergelijkende tabel tussen Eukaryote en Prokaryote cellen

Eigenschap Kernstructuur DNA Kernmembraan Cytoplasmatische structuren Endoplasmatisch reticulum Mitochondriën Ribosomen Lysosomen Cytoplasmatisch membraan Celwand

Kapsel

Eukaryoot

Prokaryoot

Meerdere chromosomen geassocieerd met histoneiwitten Aanwezig

Één chromosoom, naakt (= geen histoneiwitten) circulair chromosoom Afwezig

Aanwezig Aanwezig 80 S Aanwezig Aanwezig, bevat sterolen

Afwezig Afwezig 70 S Afwezig Aanwezig, geen sterolen, behalve Mycoplasma Complexe structuur met peptidoglycaanlaag, eiwit en lipiden

Afwezig of gevormd door cellulose Geen peptidoglycaanstructuur of chitine Afwezig

Doorgaans aanwezig

*S = Svedberg (eenheid voor sedimentatiesnelheid van moleculen) Tegenwoordig worden de Prokaryoten ingedeeld in twee domeinen, in het bijzonder de Bacteria (vroeger de Eubacteria genoemd) en de Archaea (betekent “oud”). Microscopisch gelijken de Bacteria en Archaea op elkander: ze zijn beide ééncellige organismen, hebben geen door een kernmembraan afgebakende kern en geen door membranen afgebakende celorganellen. De Archaea hebben een andere celmembraansamenstelling, verschillend rRNA en een celwand zonder peptidoglycaan (zie Tabel 3 en Figuur 8). Tabel 3: Vergelijking van Bacteria, Archaea en Eukaryoten

Gemiddelde grootte Kernmembraan Celwand Cytoplasmatische structuren mitochondria chloroplasten cytoskelet Ecologische vindplaats

Bacteria 0,3-2µm Geen Peptidoglycaan aanwezig

Archaea 0,3-2µm Geen Geen peptidoglycaan

Eukaryoten 5-50µm ja Geen peptidoglycaan

Geen Geen Geen In alle omgevingen

Geen Geen Geen Frequent in extreme omgevingen

Ja In planten- en algencellen Ja In niet extreme Omgeving

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Geen (levende) cellen

Figuur 8: Indeling van de microbiĂŤle wereld

Figuur 9: Electronenmicroscopische opname van de bacterie Escherichia coli

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

2.2. Kern De erfelijke eigenschappen van de cel zijn ondergebracht in het DNA dat zich in de kern of het kernmateriaal bevindt.

Bij eukaryotische microbiële cellen is het lineair DNA gebonden aan eiwitten (histonen) en vormt op die manier verscheidene chromosomen (Figuur 10). De meerdere chromosomen bevinden zich in de kern, die omgeven is door een kernmembraan. In dit membraan, dat uit twee lagen bestaat bevinden zich poriën waardoor de kern in direct contact staat met het cytoplasma. De chromosomen zijn onderverdeeld in genen, die elk een erfelijke eigenschap in zich dragen. Naast de chromosomen bevat de kern in eukaryotische cellen één of meer kernlichaampjes of nucleoli, die o.a. ribosomaal RNA of r-RNA bevatten. In sommige eukaryotische cellen, zoals in die van schimmels, wordt vaak meer dan één kern aangetroffen. Bij de eukaryotische cellen is het DNA ook buiten de kern aangetoond, vb. in mitochondriën en chloroplasten, die op zichzelf synchroon met de celdeling kunnen delen en een zekere genetische autonomie bezitten.

In prokaryotische microbiële cellen echter ligt het DNA vrij in het cytoplasma: het DNA van het chromosoom in prokaryotische cellen is niet gebonden aan eiwitten (= naakt DNA). Het is daar in een cirkelvormige, sterk gewonden toestand aanwezig. Prokaryotische cellen bezitten geen kernmembraan. Men spreekt in dat geval van kernmateriaal of van de nucleoid bestaande uit één cirkelvormige DNA-molecule (Figuur 11). Naast het cirkelvormige DNA in bacteriën zijn soms kleine cirkelvormige DNA-moleculen aanwezig, die plasmiden worden genoemd. Dit extrachromosomaal DNA is niet essentieel voor de bacteriële groei en reproductie (bevat geen ‘housekeeping’ genen), maar draagt genen die de bacterie een specifieke eigenschap oplevert vb. een selectief voordeel kan onder de vorm van geneesmiddelenresistentie, verhoogde metabolische activiteit, enz.. Plasmiden variëren in grootte en komen in variërend aantal voor in een bacteriële cel (geen, één of meerdere). Het totaal aan erfelijke eigenschappen dat is vastgelegd in het DNA, wordt het genotype van het micro-organisme genoemd. Het genotype bepaalt, samen met de invloed van het milieu op de cel, de uiterlijke eigenschappen van het micro-organisme, het fenotype.

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 10: Situering van het genetisch materiaal in cellen

Figuur 11: Elektronenmicroscopische opname van 2 circulaire DNA-moleculen

2.2.1 Chemische structuur van DNA DNA is opgebouwd uit nucleotiden, die op hun beurt zijn samengesteld uit een fosfaatgroep, desoxyribose (ribose bij RNA) en een heterocyclische N-verbinding. Onder de nucleotiden treffen we twee pyrimidine- en twee purinederivaten als heterocyclische N-verbindingen aan, te weten thymine (T), cytosine (C), adenine (A) en guanine (G). In DNA kunnen we dus vier verschillende nucleotiden onderscheiden, die als een keten aan elkaar gebonden zijn.

2.2.2. Ruimtelijke structuur van DNA WATSON en CRICK hebben in 1953 ten aanzien van de ruimtelijke structuur van het DNA in de cel een model voorgesteld van twee om dezelfde as draaiende helixen van polynucleotiden. Dit model kunnen we vergelijken met een wenteltrap, waarbij de twee lengte-assen bestaan uit

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

het desoxyribose en de fosfaatgroep, terwijl de treden bestaan uit twee, loodrecht op elk der lengte-assen staande, heterocyclische N-verbindingen die door waterstofbindingen met elkaar verbonden zijn. Het typische is dat adenine altijd met twee waterstofbruggen aan thymine is gebonden, terwijl cytosine met drie waterstofbruggen is verbonden aan guanine. De twee polynucleotiden zijn slechts op één manier in elkaar te passen: beide ketens zijn complementair.

2.3. Cytoplasma Het cytoplasma (verschilt van het protoplasma = cytoplasma + kern) van prokaryoten en eukaryoten, dat wordt omsloten door een membraan (cytoplasmamembraan), is de colloïdeachtige substantie, die aanwezig is in de cel. Het heeft een colloïdale structuur, bestaat voornamelijk uit water en bevat allerlei stoffen (zoals eiwitten die deels een enzymfunctie hebben) en subcellulaire deeltjes of structuren. Enkele van deze stoffen zijn zouten, suikers, aminozuren, eiwitten (enzymen), RNA en lipoïden. Met de elektronenmicroscoop is geen duidelijke structuur in het cytoplasma waar te nemen, hoewel in oudere cellen soms een granulaire structuur te zien is.

2.4. Subcellulaire deeltjes en structuren 2.4.1. Mitochondriën Mitochondriën zijn lichaampjes die zijn ingebed in het cytoplasma en die zijn omgeven door een membraan van twee lagen, waarvan de binnenste sterk geplooid kan zijn. Ze worden de energieproducenten van de cel genoemd, omdat in de mitochondriën de oxidatie van organische stoffen ter verkrijging van energie plaats vindt (oxidatieve fosforylatie, zie hoofdstuk 5). In de prokaryotische microbiële cel (= bacteriële cel) zijn nooit mitochondriën geconstateerd. De oxidatieprocessen voor de energiewinning in de prokaryotische cel vinden plaats ter hoogte van het cytoplasmatisch membraan.

2.4.2. Chloroplasten, chromatoforen en chromoplasten Chloroplasten die in de cellen van wieren (en ook van planten) voorkomen, bevatten het voor de fotosynthese zo essentiële chlorofyl. De structuur van chloroplasten is gelaagd (te vergelijken met een geldrol) en is vrij ingewikkeld. In fotosynthetische bacteriën en cyanobacteriën (= blauwwieren) zijn de structuren voor fotosynthese eenvoudiger. Bij fotosynthetische bacteriën spreken we van chromatoforen en bij cyanobacteriën van chromoplasten. De groene kleur van het chlorofyl in de wieren en van het bacteriochlorofyl in

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

de fotosynthetische bacteriën wordt overheerst door de meestal aanwezige carotenoïden, geel tot rode, in vet oplosbare kleurstoffen.

2.4.3. Endoplasmatisch reticulum Dit is een ingewikkelde membraanachtige structuur, die is ontstaan door instulpingen van het celmembraan en een soort kanalensysteem in het cytoplasma vormt. Daardoor worden de kern, het cytoplasma en het celmembraan nauwer met elkaar in contact gebracht. Men onderscheidt het glad en ruw ER. Het ruwe is bezet met een groot aantal ribosomen (eiwitsynthese), die bij het gladde ontbreken. De functie van het ER is het transport van eiwitten, vetten,… in de cel, en de productie van vetten en eiwitten via geassocieerde ribosomen-enzymcomplexen. Glad ER neemt deel aan de synthese van lipiden terwijl ruw ER, door de activiteit van zijn ribosomen, een belangrijke producent is van proteïnen en ook van nieuw membraanmateriaal. Prokaryotische cellen bezitten dergelijke structuren niet.

2.4.4. Ribosomen Ribosomen zijn kleine deeltjes (diameter ca. 15 nm) die een belangrijke rol spelen bij de eiwitsynthese. Ze komen in grote aantallen voor in het cytoplasma. Ze zijn gebonden aan het endoplasmatisch reticulum of komen vrij voor in het cytoplasma. Ze bestaan uit twee subeenheden, die beide RNA (rRNA) en veel eiwitten bevatten, vandaar dat deze units ook ribonucleoproteïnecomplexen genoemd worden. De bacteriële ribosomen (70S) zijn iets kleiner dan die van eukaryote cellen (80S). Snel groeiende cellen bevatten veel meer ribosomen dan langzaam groeiende.

De eiwitsynthese in de cel wordt gecontroleerd door het DNA (Figuur 12 en Figuur 13). De eiwitten die worden gebruikt als celbestanddeel of als enzym, bepalen de structuur en het metabolisme van de cel. Alle erfelijke eigenschappen zijn dus in het DNA vastgelegd. Het DNA is opgebouwd uit vier verschillende nucleotiden (afgekort T, C, A en G). Een bepaalde volgorde van drie naast elkaar gelegen nucleotiden, een triplet of codon genoemd, codeert voor een bepaald aminozuur. Het gedeelte in het DNA dat de informatie voor het te vormen eiwit bevat, het zgn. structurele gen, wordt overgeschreven in boodschapper- of “messenger” RNA (mRNA), waarbij het genoemde DNA-gedeelte als matrix dient. Dit het proces van transcriptie.

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RNA is de Engelse afkorting voor “ribonucleic acid” en verschilt van DNA door: 

de vervanging van d-desoxyribose door d-ribose



de vervanging van thymine door uracil (U)



de aanwezigheid van één helix in plaats van twee



een kleinere molecuulmassa.

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Naast mRNA bestaat er ook overdrachts- of “transfer” RNA (tRNA), dat de voor de eiwitsynthese benodigde aminozuren aanvoert, evenals ribosomaal RNA (rRNA), dat een functie heeft bij de opbouw van ribosomen. Na de vorming van mRNA, waarbij de volgorde van de nucleotiden in het RNA direct gekoppeld is aan die van het DNA-gedeelte, verlaat het mRNA de kern of het kernmateriaal.

De eiwitsynthese vindt plaats aan het oppervlak van ribosomen: aan het ribosoom worden het mRNA en de voor de eiwitsynthese benodigde aminozuren - elk gebonden aan een voor het aminozuur specifiek tRNA - samengebracht. Het ribosoom schuift het mRNA steeds verder op en bij elk volgend mRNA-triplet (een triplet correspondeert met een bepaald aminozuur) wordt het corresponderende aminozuur-t-RNA-complex aangevoerd, waardoor de aminozuren in de juiste volgorde naast elkaar komen te liggen. Daarna komen de peptidebindingen tot stand voor de opbouw van de eiwitmolecule. Dit is het proces van translatie.

Figuur 12: Van gen tot eiwit

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 13: De eiwitsynthese: de genetische code levert het recept voor de volgorde van de aminozuren van een eiwit

2.4.5. Golgi-apparaat Terwijl de ribosomen de eiwitsynthese verzorgen, zorgt het Golgi-apparaat of dictyosoom voor de eindsynthese (o.a. glycosylatie van eiwitten), het verpakken, de secretie en de chemische modificatie van producten die door het ruw ER zijn aangevoerd. Het Golgi-apparaat is een groepje van door een membraan omgeven kleine holtes waarin de synthese van stoffen voltooid wordt. Van het Golgi-apparaat kunnen zich kleine transportblaasjes afsnoeren en zich verplaatsen naar het celmembraan, waar zij mee versmelten, onder uitscheiding van de inhoud naar de buitenzijde van de cel (vb. kliercellen produceren enzymen en andere klierproducten, plantencellen produceren de bouwstenen voor de celwand). Het Golgi-apparaat komt niet voor bij de prokaryotische bacteriĂŤle cel.

2.4.6. Lysosomen Dit zijn de verteringsorganellen van de cel die enkel voorkomen bij eukaryoten. Ze bevatten hydrolytische enzymen die voor de degradatie van macromoleculen en micro-organismen instaan (fagocytose).

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

2.4.7. Vacuolen Dit zijn een soort blaasjes (organellen), gevuld met celvocht, die zich in de eukaryotische cel bevinden en die worden omgeven door een dunne wand. Naarmate de cellen ouder worden, worden de vacuolen groter. Ze bevatten o.a. afvalstoffen, reservestoffen.

2.4.8. Korrels Veel micro-organismen kunnen voedingsstoffen, vb. vetten en koolhydraten, in korrels opslaan. Zo kunnen sommige bacteriën boterzuur opslaan in de vorm van poly--hydroxyboterzuur (PHB) en glucose in een polymere vorm, bijvoorbeeld granulose (cf. glycogeen). Voorts worden talrijke andere verbindingen opgeslagen, zoals fosfaten in de vorm van polymetafosfaten (poolkorrels bij Corynebacterium). Bij zwavelbacteriën wordt zwavel, afkomstig van de bioxidatie van zwavelwaterstof, in zgn. zwavelkorrels opgeslagen.

2.5. Cytoplasmatisch membraan Het cytoplasmatisch membraan of celmembraan is een dunne (8 nm dik) structuur die de cel omgeeft en een barrière vormt tussen de binnenkant van de cel (het cytoplasma) en de omgeving. Wanneer dit membraan beschadigd wordt, lekt er cytoplasma naar buiten en sterft de cel af. Het is een permeabel membraan maar met een zeer specifieke en selectieve permeabiliteit (doorlaatbaar voor bepaalde stoffen en niet doorlaatbaar voor andere stoffen), waardoor het de cel toelaat om specifieke componenten binnen in de cel te houden en andere vb. afvalstoffen uit de cel te verwijderen. Het cytoplasmatisch membraan bestaat uit drie lagen: twee hydrofiele lagen en een binnenste hydrofobe laag. Deze 3-lagige structuur is de algemene structuur van biologische membranen en wordt de fosfolipide dubbellaag structuur genoemd. Ze bestaat uit twee tegengesteld georiënteerde lagen van fosfolipiden. Fosfolipiden bevatten van nature een hydrofobe staart (vetzuurketen) en een hydrofiele kop (glycerolfosfaat). Verder zijn met het cytoplasmatisch membraan eiwitten geassocieerd: membraaneiwitten. Het membraan is zeker niet strak en onbeweeglijk maar eerder een sterk georganiseerde, asymmetrische, flexibele en dynamische structuur. Wat de functie van het cytoplasmatisch membraan betreft, is dit membraan meer dan enkel een barrière die de binnenkant van de cel scheidt van de buitenkant van de cel. Het membraan heeft verschillende kritische functies in de cel. Eerst en vooral functioneert het membraan als een selectief permeabele barrière waardoor transport mogelijk is. Verder bevinden zich in het membraan vele eiwitten, alsook enzymen. Sommige van deze enzymen zijn betrokken in de 32

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

energiegeneratie processen en andere in het transport van stoffen in en uit de cel. Er is een passief transport (= diffusie t.g.v. concentratiegradiënt), dat afhankelijk is van de concentraties in en buiten de cel, evenals van het moleculair gewicht en de elektrische lading van de getransporteerde stoffen. Het transport gebeurt niet overal langs de membraan, maar op welbepaalde plaatsen of poriën die gevormd worden door bepaalde proteïnen en enzymen die de lipidenlaag doorboren: het actieve transport (permease pompt materiaal naar binnen ten koste van energie: bestanddelen kunnen in de cel opgestapeld worden tegen de concentratie in) van stoffen die de cel binnenkomen en verlaten. De synthese van de celwand, de synthese van de slijmlaag en de synthese van het kapsel zijn enkele van de functies van het cytoplasmamembraan. Het is tevens de locatie voor tal van metabolische processen zoals, respiratie, fotosynthese en vetsynthese bij prokaryoten. Een ademhalende prokaryote cel bevat geen mitochondriën en een fotosynthetische bacterie geen chloroplasten. De hele bacteriecel lijkt in feite op een mitochondrion respectievelijk chloroplast, maar dan met een wat meer uitgebreide functie. Het membraan kan naar binnen toe plooien en lamellen vormen. Aan deze lamellen kunnen bij enkele bacterietypes stralingsgevoelige pigmenten voorkomen, die verantwoordelijk zijn voor het omzetten van licht in voor het organisme nodige energie. Deze lamellen zijn functioneel te vergelijken met de thylakoïden die in de chloroplasten gevonden worden. Aan de membranen bevinden zich ook de enzymen ten behoeve van de ademhaling.

2.6. Celwand De celwand die het cytoplasmamembraan weer omsluit, bepaalt de vorm en de stevigheid van de cel, is doorlaatbaar voor de meeste stoffen en beschermt de gehele cel tegen uiteenlopende osmotische drukken. Protozoa bezitten geen celwand. De celwand van de meeste wieren bestaat voornamelijk uit cellulose, terwijl die van gisten en schimmels meestal uit een mengsel van chitine en hemicellulose bestaat. Bij sommige soorten, zoals de kiezelwieren, bevat de celwand anorganische verbindingen. Alle bacteriën bezitten een celwand met uitzondering van de mycoplasma’s. In tegenstelling tot de Archaea bacteriën komt bij vrijwel alle eubacteriën in de celwand als belangrijk bestanddeel het peptidoglycaan voor. Dit peptidoglycaan bestaat uit een netwerk van mucopolysacchariden, mucopeptiden, bijvoorbeeld muraminezuur, en D- en L-aminozuren. Hoewel peptidoglycaan het basismateriaal van de bacteriecelwand vormt, is er wel een verschil tussen de celwand van de Gram-positieve en die van de Gram-negatieve bacteriën. De celwand van de Gram-positieve

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

bacteriën bevat veel peptidoglycaanlagen (20-50 nm dik in totaal), terwijl die van Gramnegatieve bacteriën één peptidoglycaanlaag (2 à 3 nm) bevat. Alleen bij de Gram-negatieven bevat de celwand een bijkomend buitenmembraan (het ‘outer membrane’) met lipopolysacchariden. Het buitenmembraan vormt een 2de lipide dubbellaag maar bestaat, in tegenstelling tot het cytoplasmatisch membraan, niet alleen uit fosfolipiden en eiwitten maar ook uit polysacchariden. Deze polysacchariden zijn verbonden met de lipiden tot een lipopolysaccharidecomplex. Daarom wordt het buitenmembraan ook soms de lipopolysaccharidelaag (LPS) genoemd. Deze lipopolysacchariden spelen bij sommige soorten een rol bij het ziekteverwekkend vermogen ten opzichte van mens en dier. De zogenaamde teichoïnezuren worden alleen in de celwand van de Gram-positieve soorten aangetroffen. Deze teichoïnezuren zijn zure bestanddelen die ingebed zijn in de Gram-positieve celwand. Omdat ze negatief geladen zijn, zijn teichoïnezuren gedeeltelijk verantwoordelijk voor de negatieve lading van de celwand. Ze binden ook divalente kationen zoals Ca2+ en Mg2+, waarvan sommige in de cel getransporteerd worden. Bepaalde teichoïnezuren zijn covalent gebonden aan de fosfolipiden van het cytoplasmatisch membraan en worden daarom lipoteichoïnezuren genoemd.

Op grond van de Gramkleuring, een kleuring waarbij bacteriën worden behandeld met kristalviolet (paars), jodium en alcohol en safranine (roze), worden de bacteriën ingedeeld in 2 groepen: 

G(+)bacteriën: deze houden het paarse kristalviolet vast omdat de celwand verscheidene lagen peptidoglycaan bevat (Figuur 14 en Figuur 15).



G(-)bacteriën: deze verliezen het paarse kristalviolet door het spoelen met alcohol omdat de celwand een dunne laag peptidoglycaan bevat; daarbuiten komt een buitenmembraan voor dat bestaat uit eiwitten, fosfolipiden en lipopolysacchariden (Figuur 14 en Figuur 16).

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 14: Opbouw van de celwand van Gram+ en Gram- bacteriĂŤn

Figuur 15: De Grampositieve celwand

Figuur 16: De Gramnegatieve celwand

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De Gramkleuring (Figuur 17), een door Gram (1884) ingevoerde kleuringsmethode, bestaat in het behandelen van de bacteriecel met kristalviolet waardoor deze blauw/paars kleurt. Dan volgt een behandeling met lugol (jodium-jodide-oplossing) die met het kristalviolet een moeilijk oplosbaar kleurstofcomplex vormt. Tijdens een volgende behandeling met alcohol wordt het kleurstofcomplex uitgewassen bij Gram- cellen, en blijft de kleurstof achter bij Gram+ cellen. Gram- cellen krijgen dan bij de tegenkleuring met vb. safranine een rood/roze kleur en worden zo duidelijk onderscheiden van de Gram+. Het kleurverschil dat we na de Gramkleuring bekomen, is het resultaat van een structuurverschil van de celwand. Immers de dikke peptidoglycaanlaag van Gram-positieven zal onder invloed van de behandeling met alcohol dehydrateren waardoor de poriën in de celwand zich sluiten en het onoplosbare kristalvioletiodide complex niet uit de cel kan ontsnappen; de Gram-positieve cel ontkleurt bijgevolg niet. Bij de Gram-negatieve bacteriën kan de alcohol gemakkelijk binnendringen in het buitenmembraan en vervolgens het onoplosbare kristalviolet-iodide complex uit de cel extraheren.

Figuur 17: (a) Gramkleuringsprocedure en (b) Gramkleuring kleurt de Gram-positieve cellen (Staphylococcus aureus) purper-blauw en de Gram-negatieve cellen (Escherichia coli) roodrose

Het is mogelijk dat sommige micro-organismen, zoals bacteriën, zonder celwand kunnen voortbestaan. Deze “naakte” cellen worden protoplasten (krijgen bolvorm) genoemd. Ze kunnen alleen voortleven, als de osmotische druk van het milieu hoog genoeg is (2%-5% NaCl of 3%-20% glucose) om in osmotisch evenwicht te zijn met die van het cytoplasma (het milieu 36

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

is isotonisch ten opzichte van het cytoplasma). Bevinden de protoplasten zich in een milieu met een hogere osmotische druk (het milieu wordt hypertonisch ten opzichte van het cytoplasma), die bijvoorbeeld is verkregen door de concentraties aan zouten of suikers te verhogen, dan treedt watertransport van de cel naar de omgeving op en de cel schrompelt ineen. Wordt echter de osmotische druk van het milieu verlaagd (het milieu wordt hypotonisch ten opzichte van het cytoplasma), dan neemt de cel water op en barst uiteen. De protoplasten zijn daarom osmotisch gevoelig. Protoplasten kunnen ontstaan door o.a. lysozym, een anti-bacterieel enzym (aanwezig in eiwit van eieren en in traanvocht), te laten inwerken op de celwand van grampositieve bacteriën. Het lysozym tast ter plaatse de mucopolysacchariden van het peptidoglycaan aan. Hierdoor komt in een hypotonisch milieu water in de cel waardoor de cel opzwelt en barst; dit fenomeen wordt lysis genoemd. In een isotonisch milieu echter treedt onder invloed van lysozym geen lysis op maar wordt een protoplast gevormd. Penicilline belemmert de vorming van het peptidoglycaan.

2.7. Slijmlaag en kapsel De celwand van de meeste bacteriën wordt van de buitenwereld afgeschermd door slijmachtige stoffen (polysacchariden), die soms een dikte van 10 µm kunnen bereiken. Indien deze laag scherp begrensd is, spreken we van een “kapsel” of “schede” bij een stevige structuur (vb. Leptothrix), bij een vage begrenzing van een “slijmlaag” (Figuur 18). De eukaryotische cellen bezitten geen slijmlaag.

Figuur 18:Kapsel van een bacterie

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De aan- of afwezigheid van een kapsel of slijmlaag kan duidelijk worden aangetoond door de kolonievorm van de bacterie op een vaste voedingsbodem. De slijmachtige stoffen geven een gladde, glinsterende kolonie (S-type met S van smooth), terwijl bij afwezigheid ervan, vb. veroorzaakt door een mutatie, een droge, soms gerimpelde kolonie ontstaat (R-type met R van rough). De vorming van een slijmlaag of kapsel wordt mede bepaald door de samenstelling van het milieu.

2.7.1. Slijmlaag Vele bacteriën, vooral

Bacillus soorten en sommige soorten

behorend tot de

Enterobacteriaceae, zijn omgeven door een losse, amorfe slijmlaag, bestaande uit koolhydraten. De vorming van de slijmlaag wordt beïnvloed door het externe milieu: indien geen koolhydraten aanwezig zijn, kan ook geen slijmlaag gevormd worden. Zo maakt saccharose de slijmvorming mogelijk van Streptococcus mutans, veroorzaker van de plaque-vorming bij tandcariës, of Leuconostoc dextranicum, een bederfverwekkend microorganisme in de suikerindustrie.

2.7.2. Kapsel Bij een aantal bacteriesoorten komt een kapsel voor. Dit is, in tegenstelling tot de slijmlaag, een stevige, vaste laag die de bacteriecel omgeeft. Een kapsel is opgebouwd uit koolhydraten (onder meer bij pneumococcen, streptococcen en een aantal Enterobacteriaceae) of uit eiwitten (bij Bacillus soorten). Sommige pathogene bacteriën zijn alleen ziekteverwekkend wanneer een kapsel aanwezig is: het is een extra bescherming tegen antibacteriële stoffen (vb. antibiotica) en fagocytose (celvraat door leukocyten), waardoor deze voor een gastheer veel virulenter overkomen. Een kapsel beschermt de bacteriën tegen fagocytose. Bij pathogene bacteriën komen zowel S- als R-vormen voor. Meestal is enkel de S-vorm virulent. Het kapsel fungeert als een antigeen, het kapselantigeen, wat aangeduid wordt met de letter K en een cijfer achter de naam van de bacteriesoort, bijvoorbeeld E. coli K12.

2.8. Flagellen & ciliën en pili & fimbriae Flagellen (zweepdraden) en ciliën (trilharen) zijn draadvormige uitsteeksels van de cel, die verantwoordelijk zijn voor de zwemmende voortbeweging (microscopisch waarneembaar of macroscopisch via groeimigratie in voedingsbodems) van cellen. Lange uitsteeksels worden flagellen genoemd, korte uitsteeksels ciliën. Beide ontspringen in het cytoplasma. Bacteriële

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

flagellen zijn lang en zeer dun, ze kunnen vastgehecht zijn aan de cel volgens verschillende patronen (zie H3: morfologie). Ze zijn niet recht maar helicaal (-helixvorm) en het draadvormig filament bestaat uit vele copijen van het eiwit flagelline. Pili (enkelv. = pilus) en fimbriae zijn zeer dunne filamenteuse aanhangsels, bestaande uit eiwit, die alleen zichtbaar zijn met de elektronenmicroscoop en die in grote aantallen op Gramnegatieve bacteriecellen worden aangetroffen. Ze kunnen verschillende functies hebben. Fimbriae zijn relatief kort en laten microbiële cellen toe zich vast te hechten aan oppervlakken (adhesie fimbriae) zoals vb. aan dierlijke weefsels in het geval van pathogenen of samen te klonteren tot ze een dun vlies of een biofilm vormen op een oppervlak. Pili zijn gelijkaardig aan fimbriae maar zijn typisch langere structuren en er zijn slechts één of enkele pili aanwezig op het oppervlak van een cel. Hoewel pili ook aanhechten aan oppervlakken net zoals de fimbriae, hebben ze ook nog andere functies zoals de uitwisseling van genetisch materiaal tussen bacteriën in het proces van conjugatie (sex- of F-pili).

2.9. Endosporen Bij de bacteriesoorten van de geslachten Bacillus, Clostridium en andere verwante soorten kan in de cel een endospore (“endo” betekent “in”) worden gevormd tijdens een proces dat sporulatie genoemd wordt. Dit gebeurt voornamelijk bij ongunstige milieu-omstandigheden vb. voedseltekort, droogte, te hoge temperatuur,... De endospore, die het kernmateriaal omsluit, komt, na afsterven van de oorspronkelijke cel (= vegetatieve cel), tenslotte vrij van deze oorspronkelijke cel te liggen. De endospore wordt gevormd door instulping van het cytoplasmamembraan (sporeseptum), waardoor enerzijds het kernmateriaal en een gedeelte van het cytoplasma van de rest van de cel worden afgescheiden (prespore) en anderzijds de prespore wordt omhuld met een uit twee lagen bestaand membraan. Gedurende dit proces wordt water aan deze pas ontwikkelde prespore onttrokken (Figuur 19). Vervolgens worden tussen de twee lagen van het omhulsel nieuwe lagen gevormd, waarvan de belangrijkste zijn: 

een binnenste laag, de zgn. cortex die bestaat uit mucopeptiden en rijk is aan dipicolinezuur;



een buitenste laag, de zgn. sporecoat die veel teichoïnezuur bevat.

Finaal sterft de omringende vegetatieve cel af en komt de spore vrij.

Microbiologie H2: Celbouw ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 19:De verschillende stadia in de vorming van een endospore

Endosporen zijn extreem resistent en kunnen ongunstige invloeden van het milieu, zoals tekort aan nutriënten, verhitting (overleven 10 min./80°C) en uitdroging, langer overleven dan de oorspronkelijke cellen, waaruit ze afkomstig zijn. In tegenstelling tot sporen bij schimmels zijn deze endosporen dus geen voortplantingsstructuren maar overlevingsstructuren die de bacteriën toelaten in moeilijke tijden te overleven. De endospore voert geen merkbare levensverrichtingen uit, zoals deling en stofwisselingsprocessen (“dormant cells”). Onder bepaalde, voor de spore gunstige omstandigheden groeien de sporen weer uit tot vegetatieve cellen (“ontkieming”), waarna de normale levensprocessen weer op gang komen.

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

3. MORFOLOGIE Morfologie is de kennis en de studie van de uitwendige vormen die micro-organismen kunnen aannemen en die met de microscoop en/of met de elektronenmicroscoop zijn waar te nemen. De morfologie speelt een belangrijke rol bij de indeling van micro-organismen.

3.1. Schimmels en aanverwante soorten 3.1.1. Schimmels Schimmels behoren tot de fungi en komen voor in diverse habitats. Bepaalde schimmels komen voor in een waterig milieu maar de meeste komen voor in de bodem. Schimmels zijn saprofyten en voeden zich aldus met dood organisch materiaal. Ze bewonen de grond of dood plantenmateriaal en spelen een cruciale rol in de mineralisatie van organische koolstof.

Een groot aantal schimmels zijn parasieten van planten (=fytopathogenen) en veroorzaken een groot aantal economisch belangrijke ziekten van gewassen. Een voorbeeld is de schimmel Didymella bryoniae, beter bekend als mycosphaerella, die komkommerplanten aantast. Deze schimmel kan alle bovengrondse delen van de komkommerplant infecteren waarbij vruchtrot de grootste economische schade veroorzaakt. Een ander bekende plantenziekte die wordt veroorzaakt door schimmel is de witziekte of echte meeldauw. Deze plantenziekte kan bijvoorbeeld bij courgettes optreden waarbij de ziekte niet door één, maar door twee schimmelsoorten wordt veroorzaakt, namelijk Erysiphe cichoracearum en Padosphaera xanthii. De eerst genoemd soort komt eerder voor in de koele lente, terwijl de andere soort zich best ontwikkeld tijdens de warme zomermaanden. Slechts enkele schimmels zijn parasitair op mens en dier.

De schimmels vormen samen met de gisten en de paddestoelen de groep van de fungi, een groep van eukaryotische micro-organismen binnen het domein van de Eucarya. De schimmels worden ook soms de filamenteuze fungi genoemd. Schimmels zijn chemo-heterotrofe één- of meercellige micro-organismen (de meeste schimmels zijn meercellig). In tegenstelling tot de bacteriën, bevat het cytoplasmatisch membraan van schimmels sterolen en vertoont hun celwand geen peptidoglycaanstructuur.

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Chemo-heterotroof = chemotroof en heterotroof Chemotroof : organisme dat de benodigde energie verkrijgt door oxidatie van chemische (organische of anorganische) verbindingen: Heterotroof: organisch celmateriaal wordt opgebouwd uit organische verbindingen en ze zijn hierbij afhankelijk van andere organismen

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Macroscopisch zijn schimmels heel gemakkelijk te herkennen aan hun vaak harige, donzige structuur waarin al of niet sporen op voorkomen. Een schimmelkolonie bestaat grotendeels uit het vegetatieve deel van de schimmel, thallus genoemd. Daarnaast kan de kolonie bedekt zijn met al of niet gepigmenteerde sporen. Wanneer men een schimmel onder de microscoop legt, ziet men lange, cylindrische draden (filamenten of schimmeldraden) omgeven door een cytoplasmatisch membraan en een celwand. De meeste fungale hyfen hebben een diameter van 2 tot 10 µm. Om die reden worden de schimmels ook soms wel de filamenteuse fungi genoemd. Deze draden, hyfen genaamd, kunnen ééncellig zijn of meercellig zijn. De hyfen kunnen gesepteerd zijn, wat betekent dat ze door dwarswanden, de septa, in een aantal cellen worden verdeeld (Figuur 20). Bij de eenvoudigste schimmels (de ‘lagere’ schimmels zoals de Zygomyceten) zijn er geen septa tussen de verschillende cellen: ze zijn coenocytisch; de hyfen zijn dan als het ware zeer grote cellen (macrocellen) met een gemeenschappelijk cytoplasma maar met verschillende kernen. Andere schimmels (de ‘hogere’ schimmels zoals de Ascomyceten en de Basidiomyceten) hebben wel deze septa (ze zijn apocytisch), maar steeds staan de naburige cytoplasma's met elkaar in verbinding langs een kleine porie in het septum. Per compartiment is er een kern aanwezig. De hyfen zijn meestal vertakt en vormen een netwerk, het mycelium, dat de schimmels na groei een wollig aanzien geeft (Figuur 20).

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

Figuur 20: Microscopische structuur van schimmels (links: meercellige éénkernige schimmel met septa = apocytisch; rechts = ééncellige, meerkernige schimmel zonder septa = coenocytisch)

Aan of in het mycelium worden sporen gevormd, die voor de voortplanting zorgen (verschilt van de bacteriële endosporen die voor overleving instaan). Veel schimmels kunnen zich zowel seksueel (geslachtelijk) als aseksueel (ongeslachtelijk) voortplanten maar de meeste schimmels planten zich in eerste instantie ongeslachtelijk voort. Sporen kunnen dan ook op twee manieren ontstaan, nl. door geslachtelijke (meiosis) of door ongeslachtelijke (mitosis) voortplanting. De geslachtelijke sporen (meiosporen) ontstaan door versmelting van gespecialiseerde hyfen, terwijl de ongeslachtelijke sporen (mitosporen) zonder deze versmelting ontstaan. De spore kan daarna onder gunstige omstandigheden weer uitgroeien tot een hyfe en verder tot een mycelium. 3.2.1.1. Ongeslachtelijke voortplanting Bij de ongeslachtelijke voortplanting worden in het mycelium enorme aantallen ongeslachtelijke schimmelsporen gevormd. Deze verspreiden zich gemakkelijk via de wind of via dieren en bepalen, omdat ze meestal gekleurd zijn, de kleur van de schimmels. Zo zijn vele soorten van Aspergillus (kwastschimmel) en Penicillium (penseelschimmel) groen, Mucor (knopschimmel) en Rhizopus (broodschimmel) zijn zwart van kleur. De ongeslachtelijke sporen kunnen op verschillende manieren worden gevormd aan het uiteinde van speciale, soms vertakte, hyfen vb. aan het uiteinde van een conidiofoor (conidiosporen) bij de Ascomyceten (Figuur 21) of inwendig in een sporangium (sporangiosporen) bij de Zygomyceten (Figuur 22). De gespecialieerde hyfen die drager zijn van de aseksuele sporen worden ook de reproductieve hyfen (aerial hyphae) genoemd en dit tegenover de vegetatieve hyfen (geen drager van sporen). 43

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

Figuur 21: Ongeslachtelijke vermenigvuldiging bij Penicillium

Figuur 22: Ongeslachtelijke vermenigvuldiging bij Rhizopus

De sporen ontstaan dus uit een cel die zich daarvoor differentieert en uitgroeit tot een reproductieve hyfe. Afhankelijk van het feit welke delen van de oorspronkelijke cel en celwand er deelnemen aan de sporenvorming wordt er gesproken van endogene of exogene sporenvorming. Van exogene sporenvorming is sprake als de hele cel en de celwand mee doen aan de opbouw van de spore. Bij endogene sporenvorming doet niet de gehele cel of niet de oorspronkelijke complete wand aan de sporenvorming mee. De spore zelf kan bestaan uit een onbeweeglijke of beweeglijke cel, met of zonder celwand. De spore kan ook meercellig zijn. Een beweeglijke, meestal celwandloze spore heet een planospore of zoรถspore (met 1 of meerdere flagellen). Deze ontstaat meestal endogeen, in een sporangium. De onbewegelijke sporen, de aplanosporen, ontstaan endogeen of exogeen. Als de sporen endogeen in een sporangium ontstaan, spreekt men van een sporangiosporen, ontstaan de sporen exogeen dan worden de sporen conidiosporen genoemd. De term

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

â&#x20AC;&#x153;sporangiumâ&#x20AC;? wordt in het algemeen gebruikt wanneer sporen binnen een ruimte gevormd worden. 3.2.1.2. Geslachtelijke voortplanting Geslachtelijke schimmelsporen ontstaan door geslachtelijke voortplanting, ze zijn macroscopisch zichtbaar en worden gevormd ten gevolge van de samensmelting van gespecialiseerde hyfen en hun genetisch materiaal. De seksuele sporen worden in of op speciale organen (vruchtlichamen) gevormd en zijn belangrijk voor de identificatie en taxonomie van de fungi. Worden ze in een soort zak (ascocarp met asci, Figuur 23) gevormd, dan worden ze ascosporen genoemd (Ascomyceten); worden ze op een speciaal knuppelvormig orgaan (basidiocarp met basidia, Figuur 24) gevormd, dan worden ze basidiosporen genoemd (Basidiomyceten waaronder vele paddestoelen). Het meest typische maar ook meest complexe voorbeeld van zo'n vruchtlichaam is de paddestoel. Zygomyceten, waaronder de broodschimmel Rhizopus, vormen zygosporen. Meer details over de voortplantingscycli van de fungi worden gegeven in het volgende hoofdstuk.

Figuur 23:De ascocarp, het vruchtlichaam van de Ascomyceten

Figuur 24: De basidiocarp, het vruchtlichaam van de Basidiomyceten

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

3.2.2. Slijmzwammen of myxomyceten Slijmzwammen zijn een groep van eukaryotische micro-organismen die gelijkenissen vertonen met de fungi en de protozoa. Slijmzwammen lijken onder de microscoop enigszins op schimmels en amoeben, maar ze vertonen toch enkele essentiële verschillen. Net zoals de fungi ondergaan deze zwammen een levenscyclus met vorming van sporen (Figuur 26) en net zoals de amoeboïde protozoa zijn ze beweeglijk en kunnen ze vrij snel langs een vast oppervlak bewegen. De slijmzwammen worden onderverdeeld in de cellulaire en de acellulaire slijmzwammen. De vegetatieve vorm van de cellulaire slijmzwammen bestaat uit één enkele amoebe (Figuur 25). Het vegetatieve gedeelte (plasmodium) van de acellulaire slijmzwammen bestaat uit een massa van cytoplasma met talrijke kernen die, net zoals bij de schimmels, is omgeven door een starre celwand.

Figuur 25: Voorbeelden van cellulaire slijmzwammen

Figuur 26:Vorming van een sporangium bij de acellulaire Myxomyceten

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

Dit plasmodium glijdt net als bij amoeben over het oppervlak van het substraat en neemt door insluiting kleinere organismen en plantendeeltjes in zich op om zich te voeden (=fagocytose). Indien de vruchtlichamen die voor de geslachtelijke voortplanting zorgen, zich ontwikkelen, worden kleine deeltjes van het plasmodium omgeven door een wand met de vorming van een vruchtlichaam (sporangium). Daarin vormen ze een groot aantal sporen. De bevrijde sporen vormen bij ontkieming amoebe-achtige gameten met een flagel, die paarsgewijs samensmelten tot zygoten. Na verlies van de flagellen wordt weer een nieuw plasmodium gevormd (Figuur 27).

Figuur 27: De levenscyclus van de echte of acellulaire slijmzwammen

Figuur 28: Aantal vormen van vruchtlichamen van de Myxomyceten

3.2.3. Lichenes of korstmossen Lichenes zijn bladvormige of korstvormige microbiĂŤle symbioses van een fungus met een alg (of cyanobacterium), waarbij de beide individuen niet kunnen leven zonder de ander. Ze groeien vaak op naakte rotsen, boomstronken, daken en het oppervlak van naakte bodems. Er bestaan ca. 20.000 soorten korstmossen. De alg is de fototrofe partner van de symbiose en produceert onder invloed van licht organisch materiaal, dat dan gebruikt wordt voor de voeding van de fungus. De fungus, die geen fotosynthese kan uitvoeren, doet dienst als een stevige schuilplaats voor de fototrofe partner ter bescherming tegen wind, regen en erosie.

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

3.3. Gisten Gisten behoren tot de fungi, en onderscheiden zich van de schimmels door hun ééncelligheid. Bij sommige gisten kunnen de cellen zich echter aaneenschakelen tot een pseudomycelium. Gisten zijn gemiddeld ca. 10 µm groot (tien maal groter dan bacteriën) en zijn zelfs ongekleurd zeer duidelijk waar te nemen onder de microscoop (Figuur 29). De vorm van de cel varieert van rond, ovaal tot cylindrisch of zeer langgerekt. Microscopisch kunnen in de ongekleurde gistcel verschillende celstructuren worden waargenomen, zoals de kern en vacuolen, die door kleuringen beter zichtbaar kunnen worden gemaakt. De meeste gisten zijn facultatief aëroben: ze zijn in staat tot een aëroob of oxidatief metabolisme maar ook tot een fermentatief metabolisme. Commercieel belangrijke gisten zijn de bakkers- en brouwersgisten die lid zijn van het geslacht Saccharomyces. Als regel delen gisten zich ongeslachtelijk door een klein gedeelte van het cytoplasma af te snoeren (knopvorming), die daarna tot een jonge cel uitgroeit.

Figuur 29: Gistcellen onder de microscoop

Net als bij schimmels worden bij tal van gisten echter ook soms geslachtelijke sporen gevormd die meestal in aantallen van twee, vier of meer aanwezig zijn in een zogenaamde ascus; deze sporen worden daarom ook wel ascosporen genoemd. Meer details over de voortplantingscycli van de fungi worden gegeven in het volgende hoofdstuk. 48

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

3.4. Bacteriën Bacteriën (van Gr. baktèrion = stok) zijn ca. tienmaal kleiner dan gisten en zijn alleen na fixatie en kleuring goed waar te nemen onder de microscoop. De inwendige structuren daarentegen kunnen vrijwel uitsluitend elektronenmicroscopisch worden waargenomen, met uitzondering van een aantal gevallen waarvoor fasecontrastmicroscopie kan worden gebruikt. Met uitzondering van draadvormige bacteriën (grootte kan meer dan 100 µm bedragen) of cyanobacteria (grootte ca. 5-50 µm), is de bacteriële grootte gewoonlijk tussen 0,3 µm (vb. Bdellovibrio bacteriovorus, Mycoplasma) en 1-2 µm (vb. E. coli, Pseudomonas). In vergelijking met de vormenrijkdom die aangetroffen wordt bij hogere organismen en protisten is de morfologische verscheidenheid (Figuur 30) bij bacteriën tamelijk gering. Bacteriën zijn gewoonlijk ééncellig, soms voorkomend als meercellige organismen echter zonder weefseldifferentiatie. Elke cel behoudt zijn autonomie en alle cellen hebben dezelfde functie. Microscopisch onderscheidt men bolvormige, staafvormige (vb. Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus), kommavormige (vb. Vibrio comma) en spiraalvormige bacteriën (vb. Thiospirillum, Treponema), evenals overgangen tussen deze vormen. Opmerkelijke vormen zijn de spirocheten en de filamenteuze of draadvormige bacteriën.

De bolvormige bacteriën (coccen) kunnen onderling op verschillende manieren gerangschikt zijn: 

in groepjes van twee: diplococcen (voorzien van een kapsel in kaarsvlamvorm: pneumococcen);



in ketens: streptococcen;



in groepjes van vier in een plat vlak (vierkant): tetracoccen;



in groepjes van acht als een kubus: sarcina (delingen in 3 dimensies);



als een druiventros: micrococcen of staphylococcen (delingen in 2 dimensies).

Deze rangschikkingen ontstaan door zgn. binaire delingen die bij alle bacteriën plaatsvinden. Zo'n deling is in feite een splijting van het kernmateriaal, gevolgd door de vorming van een dwarswand, waarna er twee nieuwe dochtercellen ontstaan die elkaar loslaten en weer uitgroeien. De dochtercellen laten elkaar echter niet altijd los en zo ontstaan diplococcen of streptococcen, indien de delingswanden evenwijdig aan elkaar zijn, dan wel tetracoccen, stafylococcen of sarcina, indien ze niet evenwijdig zijn. De diameter van bolvormige bacteriën (coccen) bedraagt meestal ca. 0,5 µm.

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

De staafvormige bacteriën (bacillen) vertonen qua rangschikking minder variatie. Men ziet ze meestal geïsoleerd, maar in sommige gevallen als ketens (streptobacillen) of in palissadeachtige groepjes (Corynebacteriën). De staafvormige bacteriën kunnen wel van elkaar worden onderscheiden door verschil in lengte en diameter en door verschil in de verhouding tussen deze afmetingen. Staafvormige bacteriën kunnen zeer lang en dun, maar ook zeer kort en dik tot ellipsvormig zijn. Bij Escherichia coli vb. bedraagt de lengte 1-3 µm bij een diameter van 0,5 µm; een lang staafje als Bacillus anthracis meet 3-10 µm bij 1-1,5 µm. In het laboratoriumjargon spreekt men in dit verband over “lompe” en “slanke” staafjes. Sommige staafvormige bacteriën kunnen sporen vormen die microscopisch duidelijk zichtbaar zijn. Men spreekt van terminale sporen, indien ze aan het einde van de staafvormige cel zijn gelegen, van centrale sporen, indien ze zich in het midden van de cel bevinden en van subterminale sporen, indien ze tussen het midden en het einde van de cel liggen. Men onderscheidt voorts ronde, ovaalvormige, dunwandige en dikwandige sporen. Deze verschillen spelen ook een rol bij het morfologisch onderzoek. Als gezwollen sporen terminaal zijn gelegen, spreekt men van plectridia (trommelstokken).

Figuur 30: Diverse morfologische vormen van bacteriën

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

De kommavormige bacteriën (vibrionen) zijn staafjes, die in één vlak licht gebogen zijn; de spiraalvormigen (spirillen) zijn in meer vlakken gekromd (cf. kurkentrekker).

De spirocheten, eveneens spiraalvormige microben, bezitten in tegenstelling tot de spirillen een buigzame celwand, waardoor zij zich slangachtig kunnen voortbewegen; de lengte van de cel is zeer groot ten opzichte van de diameter.

Enkele bacteriesoorten, vooral staafvormige, zoals de bacteriën van de coli-aerogenes-groep, vertonen pleomorfie. Hieronder verstaat men het verschijnsel dat, terwijl de meest voorkomende gedaante van deze bacteriën de staafvorm is (met afmetingen van ca. 2,5 µm x 0,5 µm), men als regel in elke cultuur ook betrekkelijk grote aantallen kan waarnemen die rond tot ovaal (coccoïd) van vorm zijn (oude cellen).

Sommige bacteriën zijn beweeglijk. Het kan daarbij om een langzame, glijdende beweging gaan zoals bij diverse cyanobacteriën en ook bij bepaalde andere bacteriën wordt aangetroffen. De “zwemmende” beweging zoals die bij de meeste beweeglijke bacteriën wordt aangetroffen, vloeit voort uit de werking van flagellen. De flagellen die alleen bij staafvormige en kromvormige bacteriën voorkomen, kunnen op grond van hun aanhechtingsplaats aan de cel in de volgende groepen worden verdeeld: 

één flagel gelegen aan één der polen van de cel: monotrich



één flagel aan elk van de beide polen van de cel: amfitrich



een bundel flagellen aan één pool: lofotrich



een aantal flagellen rondom de gehele cel: peritrich



twee bundels flagellen, aan elke pool één: amfi-lofotrich



afwezigheid van flagellen: atrich

Een ander morfologisch kenmerk bij bacteriën is de aan- of afwezigheid van een kapsel of slijmlaag. Het kapsel of de slijmlaag kunnen met speciale kleuringen microscopisch zichtbaar worden gemaakt.

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

3.5. Overgangsgroepen 3.5.1. Archaea De groep van de Archaea vormt één van de drie domeinen van het leven. Net zoals de bacteriën hebben ze een prokaryote cellulaire structuur (Figuur 31) maar evolutionair gezien zijn ze verschillend. De membraanlipiden verschillen qua chemische opbouw van deze van de Bacteria en de Eukarya maar ondanks de chemische verschillen, is de fundamentele constructie van het cytoplasmatisch membraan dezelfde. Peptidoglycaan is afwezig in de celwand van de Archaea en ook een buitenmembraan is afwezig. De meeste Archaea zijn extremofielen met species die in staat zijn te groeien bij zeer hoge temperaturen, zoutconcentraties, pH-waarden. Voorbeelden zijn de methanogene bacteriën, de extreme halofielen en de thermo-acidofielen.

Figuur 31:Electronenmicroscopische opname van een doorsnede van Methanopyrus kandleri, behorende tot de Archaea

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

3.5.2. Rickettsiae (obligaat parasitaire bacteriën) Dit zijn zeer kleine cocoïde staafjes (300-600 nm) die dezelfde bouw hebben als bacteriën maar niet zichtbaar zijn met een lichtmicroscoop.

Zij kunnen zich alleen via levende cellen

vermenigvuldigen (obligate intracellulaire parasitaire bacteriën) en staan, voor zover het hun groeivoorwaarden betreft, zeer dicht bij de virussen. Ze veroorzaken verschillende ziektes bij plant, mens en dier.

3.5.3. Actinomyceten (straalschimmels) Dit zijn filamenteuse bacteriën die sterk vertakte cellen en ahw mycelium vormen. Ze vertonen sterke gelijkenis met de schimmels, maar hebben geen kernen (prokaryotische celbouw). In de natuur zijn de Actinomyceten vooral belangrijk bij de afbraak van organisch materiaal in de bodem. Vruchtbare grond bevat 105-108 Actino’s per gram, dit is 10-50 % van de microbiële biomassa. Enkele voorname geslachten in afnemende volgorde van belangrijkheid voor normale bodems zijn Streptomyces, Nocardia, Micromonospora, Thermoactinomyces, Actinoplanes, Actinomyces. De Actinomyceten domineren de bodem bij hoge pH, hoge temperatuur en bij waterstress. Vele actinomyceten vormen antibiotica als secundaire metabolieten en spelen aldus een belangrijke rol in de bodemhomeostasis. Verschillende soorten zijn belangrijk in de industriële microbiologie als antibioticaproducent (o.a. streptomycine, tetracycline).

3.5.4. Mycoplasma Mycoplasma’s zijn bijzondere bacteriën omdat ze geen celwand hebben. Doordat ze geen celwand hebben is het ook niet mogelijk dat ze verhoudingsgewijs groot worden. De kolonies van de meeste Mycoplasma zien eruit als een spiegelei, enkele soorten zien eruit als een druppeltje water. Dit spiegelei-effect komt doordat deze Mycoplasma's de eigenschap hebben om in de agar te groeien, waardoor een verdikking ontstaat in het midden van de kolonie. Een mycoplasmacel heeft geen vaste vorm omdat het de stevigheid van de celwand mist. Soms gelijken ze op fungi door hun filamentachtige uitgroei. Mycoplasma’s zijn moeilijk te kweken. Ze stellen zeer hoge eisen aan het medium en groeien bovendien erg langzaam. Een aantal soorten zijn pathogeen voor plant en dier, zoals Mycoplasma pneumoniae.

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

3.5.5. Mycobacteria Zijn aërobe staafvormige micro-organismen die op schimmels gelijken. Er zijn diverse pathogene soorten zoals Mycobacterium tuberculosis, M. leprae en M. bovis. Ze hebben een atypische celwand waardoor ze ongevoelig zijn voor penicillines.

3.5.6. Myxobacteria (glijdende bacteriën) De myxobacteria gelijken op de myxomyceten (slijmzwammen), maar hebben een prokaryotisch celtype. Het worden ook glijdende bacteriën genoemd omdat ze een soort glijdende beweeglijkheid vertonen. Ze zijn typisch ofwel lang en staafvormig ofwel filamentvormig. Eén groep van glijdende bacteriën, de “fruiting myxobacteria” vormen multicellulaire structuren die vruchtlichamen genoemd worden en vertonen een complexe levenscyclus. Deze bacteriën aggregeren met vorming van een vruchtlichaam dat sporen (myxosporen) produceert (Figuur 32).

Figuur 32:Levenscyclus van de myxobacteria

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

3.5.7. Cyanobacteria De cyanobacteriën zijn fotosynthetische bacteriën (fototroof: organisme dat in staat is om met behulp van licht als energiebron en de opname van anorganische stoffen te leven). Een oudere naam voor deze groep is de blauwwieren maar deze is verwarrend omdat de cyanobacteria geen wieren zijn maar een prokaryotisch celtype hebben. Morfologisch vertonen de verschillende cyanobacteriën grote verschillen: van ééncellig tot filamenteus.

3.6. Protozoa Net zoals de ééncellige wieren vroeger als de eenvoudigste vorm van plantaardig leven beschouwd werden, zo werden de protozoën lange tijd beschouwd als de laagste vorm van dierlijk leven maar Protozoa zijn eigenlijk ééncellige eukaryote micro-organismen zonder celwand. Ze zijn over het algemeen kleurloos en beweeglijk. Hun afmetingen variëren van ca. 1 µm tot ca. 500 µm (soms zelfs uitzonderingen tot 1 à 2 mm): hun grotere afmetingen alsook hun eukaryotische aard onderscheidt hen van de bacteriën. Ze komen voor in zoetwater- en zoutwaterhabitats. Ze kunnen zich veelal zowel langs geslachtelijke als langs ongeslachtelijke weg vermeerderen. De vormen, waarin de protozoën zich manifesteren, variëren onderling zeer sterk (Figuur 33).

Figuur 33: Protozoa groepen uit water en afvalwater

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

De amoeben, hebben het vermogen om een klein gedeelte van het cytoplasma als zgn. schijnvoetjes of pseudopodiën te laten uitstulpen en zich daarvan te bedienen bij de voortbeweging of bij het opnemen van voedsel. Sommige amoeben vormen een exoskelet tijdens hun groei. Zo zijn de ciliaten, waaronder het pantoffeldiertje (Paramecium), gekenmerkt door een groot aantal trilharen (ciliën) op de cel. Deze structuren spelen een rol in de beweeglijkheid. De ciliaten zijn uniek onder de protozoa door de aanwezigheid van 2 kernen: een macro- en een microkern. Naast de cilia hebben vele ciliaten ook trichocysten, structuren die hen toelaten zich vast te hechten aan een oppervlak. De flagellaten bezitten één of enkele flagellen aan een uiteinde: deze flagellen spelen opnieuw een rol bij de beweeglijkheid. De Apicomplexa (vroeger Sporozoa) worden gekenmerkt door de afwezigheid van een beweeglijk volwassen stadium. Hoewel hun naam doet vermoeden dat ze sporen vormen, vormen ze geen echte sporen zoals bacteriën of fungi dit doen maar ze produceren wel analoge structuren, sporozoïten, die een rol spelen in hun parasitair karakter. Tot de protozoa behoren diverse pathogene soorten, zoals Giardia, Entamoeba (verzwering van het darmstelsel), Trypanosoma (vb. Afrikaanse slaapziekte), Cryptosporidium (diarree). De Apicomplexa vormen een grote groep van obligaat parasitaire protozoa die ernstige ziekten veroorzaken zoals Toxoplasma (toxoplasmose), Plasmodium (malaria).

3.7. Algen Wieren of algen zijn eukaryotische micro-organismen (met een celwand) die zich voornamelijk onderscheiden van protozoa, gisten en schimmels door de aanwezigheid van fotosynthetische kleurstoffen in de cel (fototrofen). Alle algen bezitten in hun chloroplasten chlorofyl, dat een rol speelt bij de fotosynthese. Binnen de groep van de algen is er veel kleurverschil (rode en groene algen), dat veroorzaakt wordt door verschillen in concentratie en samenstelling van de pigmentstoffen in de plastiden. De vormen die wiersoorten kunnen aannemen zijn zeer gevarieerd (Figuur 34 en Figuur 35).

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

Figuur 34:Voorbeelden van algen in water en afvalwater (1) Chlamydomonas; (2) Scenedesmus; (3) Spyrogira; (4) Navicula; (5) Tabellaria; (6) Synedra; (7) Euglena; (8) Ceratium; (9) Gymnodynium

Veel soorten zijn ééncellig, maar ze kunnen ook meercellig zijn. Verscheidene wieren zijn beweeglijk en bezitten één of meer polaire zweepdraden. Aan de basis van zo'n zweepdraad bevindt zich een orgaan met caroteenachtige kleurstoffen, dat als lichtacceptor de bewegingen regelt of beïnvloedt.

Algen kunnen zich zowel geslachtelijk als ongeslachtelijk voortplanten. Een bijzonderheid van sommige ééncellige, onbeweeglijke wieren is de aanwezigheid van een verkiezelde celwand. Deze kiezelwieren of diatomeeën lijken dan op een doos met een daarop passend deksel. De blauwwieren (nu correcter benoemd als cyanobacteria) bestaan, in tegenstelling tot de overige wieren, uit prokaryotische cellen die evenals de bacteriën een binaire deling uitvoeren. Wieren kunnen oorzaak zijn van eutrofiëringsverschijnselen van oppervlaktewateren (algenbloei) bij N- en P-lozingen. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Eutrofiëring is letterlijk het vergroten van de voedselrijkdom; het verschijnsel waarbij door toevoer van een overmaat aan voedingsstoffen vb. N- en P-rijke meststoffen in (zoet)water een sterke algenbloei optreedt. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

Figuur 35:Verschillende vormen van wieren uit zuiver water

Een specifiek groep van wieren, de dinoflagellaten, die het algenbloeifenomeen “de red tides” veroorzaken, zijn zeer toxisch. Ze kunnen via de filtervoeding van 2-kleppige schelpdieren of vissen in onze voedselketen terechtkomen en na consumptie fatale gevolgen hebben.

3.8. Virussen, viroïden, prionen De organismen tot nu toe besproken zijn levende organismen van de microbiële wereld. Virussen, viroïden en prionen zijn geen “levende organismen” omdat ze niet opgebouwd zijn uit cellen. Toch kunnen ze infecties veroorzaken niettegenstaande ze zijn opgebouwd uit een beperkt aantal moleculen. 58

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

3.8.1. Virussen De grens tussen de bacteriën en de virussen wordt gekenmerkt door het feit dat de bacteriën in staat zijn hun eigen eiwitten (door het bezit van ribosomen), hun RNA en hun DNA zelf te synthetiseren, iets waartoe virussen niet in staat zijn. Ze bezitten geen eigen stofwisseling en kunnen zich uitsluitend vermenigvuldigen via een gastheercel (obligaat intracellulaire parasieten). Het is dan ook begrijpelijk dat veel virussen schade kunnen berokkenen aan de cellen van mensen, dieren, planten en micro-organismen. Het woord 'virus' betekent letterlijk "vergif". Virussen kunnen gastheerspecifiek zijn, wat betekent dat een bepaald virustype uitsluitend één of enkele soorten als gastheer kan gebruiken. Zo zal het virus dat katteziekte veroorzaakt, niet gevaarlijk zijn voor de mens, terwijl het virus dat bij de mens mazelen veroorzaakt, deze ziekte nooit bij de kat zal teweegbrengen. Er zijn echter uitzonderingen. Zo kan het virus dat hondsdolheid veroorzaakt van dier op mens worden overgedragen. Indien een bacteriecel als gastheer fungeert, spreekt men van bacteriofagen. Ze kunnen in hun gastheerkeuze zó selectief te werk gaan, dat alleen bepaalde stammen binnen een soort worden aangetast. Daardoor kunnen bacteriofagen (Figuur 36) veelal worden gebruikt om stammen te onderscheiden.

Figuur 36: Bacteriofagen onder de microscoop (50 000 maal vergroot)

Virussen zijn volgens sommigen, voor wat betreft hun evolutiegraad, veel primitiever dan bacteriën. Ze zijn echter volgens anderen dan weer regressievormen die door hun ver doorgedreven vorm van parasitisme heel wat van hun levensnoodzakelijke metabolismen hebben verloren. Virussen zijn, in tegenstelling tot de overige micro-organismen, geen cellen maar elementaire of zeer eenvoudige structuren die bestaan uit nucleïnezuur (een DNA- of een RNA-molecule)

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

omgeven door een mantel van eiwitten (=capside). Bij dierlijke of humane virussen kan de eiwitmantel omgeven zijn door een envelope (membraan van lipoproteïnen): 

enveloped virussen;



non-enveloped of naakte virussen (Figuur 37).

Figuur 37: Structuur van een virus

Door deze opbouw zijn ze veel kleiner dan de andere micro-organismen (Fig. 3.16). De kleinste virussen zijn ca. 10 nm (bevat ca. 10 genen), de grootste ca. 800 nm (mimi-virus). Ze kunnen alleen met de elektronenmicroscoop zichtbaar worden gemaakt. De vorm die virussen aannemen, is zeer verschillend, maar we onderscheiden ten aanzien van de opbouw van hun eiwitmantel (capside) o.a. deze drie groepen: 

een symmetrisch veelvlakkig lichaam (isometrische kapsels);



een schroefvormig lichaam (heliocoïdale kapsels);



een complexe structuur (vb. T4 bacteriofaag) (Figuur 38).

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

Figuur 38: Verschil in opbouw van verschillende types virussen

3.8.2. ViroĂŻden ViroĂŻden zijn eenvoudiger dan virussen en zijn samengesteld uit een enkelvoudige klein stuk erfelijk materiaal, in het bijzonder RNA zonder een protectief kapsel. Ze zijn kleiner dan virussen en zoals virussen obligaat intracellulair parasitair. Ze veroorzaken diverse plantenziektes, en volgens sommige zouden deze mogelijks ook bij de mens ziektes veroorzaken.

Microbiologie H3: Morfologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------

3.8.3. Prionen Prionen zijn verantwoordelijk voor minstens 6 neurodegeneratieve ziektes bij mens en dier. Ze blijken enkel te bestaan uit eiwit zonder de aanwezigheid van nucleïnezuren. Een zeer gekend voorbeeld is BSE (= bovine spongiforme encefalopathie), ook wel gekend als de “gekkekoeienziekte”.

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

4. MICROBIËLE GROEI 4.1. Inleiding Het groeien/kweken/in cultuur brengen van micro-organismen kan gebeuren om diverse redenen: 

om het micro-organisme in levende toestand te bewaren (onderhoud en bewaring van culturen vb. starterculturen voor productie van gefermenteerde levensmiddelen);



ter identificatie van het species (taxonomie);



ter studie van de rol van het micro-organisme in de natuur (ecologie);



om de structuur en/of de functie van het micro-organisme te bestuderen vb. onder welke omstandigheden vormt een pathogeen micro-organisme toxines?



om microbiële cellen of metabolieten te produceren (industriële fermentaties).



…

In de microbiologie kan groei gedefinieerd worden als een toename van het aantal cellen. Normaal leidt groei van ééncellige micro-organismen tot celvermenigvuldiging en niet tot een toename in de omvang van het individu. Het resultaat van groei is dus een toename van het aantal individuele cellen = er ontstaat een celpopulatie. Kennis van hoe microbiële populaties zich (snel) kunnen ontwikkelen kan nuttig zijn bij het vinden van methoden om microbiële groei te controleren.

4.2. Mitose, meiose en conjugatie Prokaryotische cellen (bacteriën) bevatten per cel één chromosoom. Eukaryotische cellen (schimmels en gisten) kunnen met betrekking tot het aantal chromosomen in één der volgende stadia verkeren: 

het stadium, waarbij de chromosomen paarsgewijze aanwezig zijn (diploïde cellen). Elke erfelijke eigenschap is aanwezig in de genen van twee aan elkaar identieke chromosomen.



het stadium, waarbij de chromosomen enkelvoudig aanwezig zijn (haploïde cellen). Elke erfelijke eigenschap is aanwezig in slechts één gen van een chromosoom.

Het proces waarbij uit één diploïde (of haploïde) cel na deling twee diploïde (of haploïde) dochtercellen ontstaan, wordt mitose genoemd. Ontstaan na deling van een diploïde cel vier

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

haploïde cellen (waarbij elk chromosomenpaar van elkaar wordt gescheiden), dan spreekt men van meiose of reductiedeling. De cytoplasma’s en de kernen van twee haploïde cellen kunnen samensmelten tot één diploïde cel (zygote), die zich op haar beurt weer kan delen. Zo'n samensmelting noemt men conjugatie, terwijl de twee haploïde cellen gameten worden genoemd.

4.3. Geslachtelijke en ongeslachtelijke voortplanting Bij de vermeerdering van micro-organismen onderscheidt men geslachtelijke en ongeslachtelijke voortplanting.

Bij ongeslachtelijke voortplanting, ook wel vegetatieve voortplanting genoemd, ontstaan nieuwe cellen via mitose, zonder dat er meiose en conjugatie optreedt. Bij bacteriën gebeurt dit door binaire deling, bij gisten gebeurt dit door middel van knopvorming en bij schimmels door aseksuele sporenvorming. Wanneer na een mitose een nieuwe cel ontstaat die als zelfstandige eenheid het begin van een organisme is, spreekt men van ongeslachtelijke vermenigvuldiging.

Geslachtelijke voortplanting, ook wel generatieve voortplanting genoemd, wordt gekenmerkt door twee verschijnselen: meiose en conjugatie. Bij de geslachtelijke voortplanting (Figuur 39) versmelten twee geslachtscellen, de gameten (G). Deze maken contact via het plasmamembraan dat op deze plaats wordt doorbroken. Er ontstaan een gemeenschappelijke cel en het cytoplasma van beide cellen komt bijeen, de plasmogamie (P!). Vervolgens versmelten de kernen, de karyogamie (K!). Op dit moment ontstaat de (diploïde) zygote (Z). Uit de zygote ontstaan na een meiose of reductiedeling (R!) weer 4 haploïde cellen die kunnen versmelten, de gameten.

Figuur 39: Geslachtelijke voortplanting

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Zowel ongeslachtelijke als geslachtelijke voortplanting treden op tijdens de levenscyclus van de diploïde gist of schimmel. Bacteriën kunnen zich enkel ongeslachtelijk vermenigvuldigen omwillen van hun haploïde karakter.

4.4. Groei van bacteriën De bacteriële cel is in staat zichzelf te dupliceren. Zeker 2000 verschillende chemische reacties zijn betrokken bij het proces van de bacteriële celgroei. Sommige reacties omvatten de omzetting van energie, andere de biosynthese van kleine moleculen,… maar de belangrijkste reacties bij de celsynthese zijn de polymerisatiereacties: proces waarbij macromoleculen gevormd worden uitgaande van monomeren. Naarmate deze macromoleculen accumuleren in het cytoplasma van de cel, worden ze geassembleerd tot nieuwe structuren zoals de celwand, het cytoplasmatisch membraan, enz… finaal zal dan de celdeling volgen.

4.4.1.

Individuele bacteriegroei

De meeste bacteriën vermeerderen zich door deling in twee identieke dochtercellen (binaire deling of binaire fissie of celsplijting) (Figuur 40). Een klein aantal bacteriën vermenigvuldigt zich via een asymmetrische deling (knopvorming) zoals bij de gisten (zie verder).

Figuur 40: Schematisch overzicht van het proces van splijting bij bacteriën (A: staafvormige, B: bolvormige)

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Het groeiproces van een individuele bacteriecel is dus een complex proces van 

opname door de cel van voedingsstoffen uit de omgeving;



omzetting in de cel van deze voedingsstoffen tot energie en celbestanddelen;



replicatie van het chromosoom (= er wordt nog een zelfde DNA-molecule gemaakt);



toename in grootte en massa van de cel;



delen van de cel (in twee identieke bestanddelen, of "dochtercellen" voor wat bacteriën betreft).

Bij de binaire deling van bacteriën kunnen we vijf stadia onderscheiden: 1. het verdubbelen en splitsen van het kernmateriaal (= replicatie van het DNA); 2. celelongatie: de cel wordt langer; 3. het

vormen

van

een

dwarswand

(septum)

door

instulping

van

het

cytoplasmamembraan; 4. het splitsen in twee gescheiden liggende identieke dochtercellen door het aanleggen van de celwand en splitsing langs het septum; 5. het uitgroeien van de twee dochtercellen tot volwassen cellen. Indien stadium 1 niet synchroon loopt met de stadia 3, 4 en 5, dan ontstaan meer kernmassa's per cel; als bij bolvormige bacteriën stadium 4 langzamer verloopt dan stadium 3, dan ontstaan diplococcen, streptococcen, tetracoccen, sarcinae.

Na deling van de cel bevatten de nieuw gevormde dochtercellen DNA, dat volkomen identiek is aan het DNA in de moedercel. Het totaal aan erfelijke eigenschappen wordt dus volledig overgedragen aan de dochtercellen. Bij celdeling dient het DNA dus ook als het ware te “delen”; dit proces wordt DNA-replicatie (Figuur 41) genoemd.

Figuur 41: DNA-replicatie

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De twee helicale complementaire DNA-strengen wijken uit elkaar en maken zich los van elkaar (denaturatie van het DNA). Op elk van de DNA-strengen wordt een nieuwe complementaire DNA-streng gesynthetiseerd: elk afzonderlijk ketenstuk verbindt nieuw aangevoerde complementaire nucleotidemoleculen aan elkaar, totdat twee afzonderlijke dochter-DNAdubbelstrengen zijn ontstaan. Elke afzonderlijke DNA-helix van een DNA-molecule is dus voldoende om de genetische code over te brengen in de nieuwe dochtercel en fungeert als matrijs voor de vorming van een nieuwe complementaire DNA-helix. Dit proces komt tot stand onder invloed van het enzym DNA-polymerase. Het plaatselijk uit elkaar gaan van de 2 DNAstrengen wordt onmiddellijk gevolgd door synthese van de nieuwe strengen (= replicatievork).

4.4.2.

Groei van de bacteriële populatie

Er is een duidelijk onderscheid tussen groei van de individuele cel en groei van een celpopulatie: groei van één cel leidt tot een toename van de omvang en het gewicht, waarna celdeling optreedt, terwijl populatiegroei resulteert in een toename van het aantal cellen als gevolg van celgroei en opeenvolgende celdelingen. Omwille van hun kleine afmetingen is de studie van de celgroei van micro-organismen zeer complex en wordt meestal de populatiegroei bestudeerd. Wanneer gesproken wordt over groei bij bacteriën, wordt meestal de groei van de populatie bedoeld, d.i. de toename van het aantal cellen (vermenigvuldiging). Daarnaast kan men spreken van de groei van de individuele cel, d.i. de synthese van celmateriaal zonder dat celdeling optreedt. De groei van één enkele cel wordt gewoonlijk niet gevolgd, maar wel de groei van een populatie van cellen of een bacteriële cultuur. Voor de bepaling van het bacterie-aantal of bacteriegetal en de bacteriemassa of biomassa gaat men uit van een homogene suspensie van bacteriën in een vloeistof: het bacterie-aantal is het aantal cellen per ml of g, de bacteriemassa is het drooggewicht per ml of g. Uit deze getallen kan men voor een groeiende bacteriecultuur de groeisnelheid (k: het aantal verdubbelingen van het bacteriegetal per uur) en de generatietijd (g: tijdsinterval tussen 2 verdubbelingen) afleiden.

Wanneer een klein aantal bacteriën van een bepaalde soort geënt wordt in een vloeibaar medium, dan kan tijdens de populatiegroei in deze batchcultuur (dwz. een gesloten systeem waarin geen medium ververst wordt) een aantal fasen in het groeiproces onderscheiden (Figuur 42):

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

1. Lagfase: aanpassingsperiode aan omgeving (groeimedium) vooraleer groei voorkomt (intense stofwisseling); 2. Exponentiële fase of logfase: constante delingssnelheid (de logaritme van het aantal cellen per ml verloopt lineair met de tijd); 3. Evenwichtsfase of stationaire fase: aantal levende cellen constant; 4. Afstervingsfase: cellen sterven af met of zonder lysis.

Figuur 42: Bacteriële groeicurve met verschillende fasen

De lagfase, ook wel latente fase genoemd, is de periode waarin de bacterie - na in een vloeibare cultuur te zijn gebracht - zich aanpast aan zijn nieuwe omgeving, alvorens zich te gaan vermeerderen. De cellen passen hun enzympatroon aan aan de voedingsstoffen die in het groeimedium aanwezig zijn. De synthese van nieuwe enzymen zal wat tijd in beslag nemen. Na enten is er slechts na 2 tot 3 uren incubatie een zichtbare troebeling waar te nemen. Deze periode wordt de lagfase genoemd. De duur van deze periode is afhankelijk van de fysiologische toestand (ouderdom en voorgeschiedenis van de geënte bacteriën), van het organisme en van de mate waarin het milieu verschilt (in temperatuur, in samenstelling, enz…) voor en na overenten. Komen de cellen uit een identiek milieu dan is de lagfase praktisch afwezig of zeer kort omdat de cellen al optimaal aangepast zijn. Na enige tijd (= de lagfase) gaan de cellen groeien.

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De logaritmische fase (logfase) of exponentiële fase is de actieve fysiologische fase bij uitstek: in deze fase vermenigvuldigen de bacteriën zich het snelst. De snelheid van de vermeerdering van de bacteriën in de logfase wordt volledig bepaald door de delingstijd (d.i. de generatietijd g of de tijd tussen twee delingen van het organisme). In deze fase delen de cellen met constante snelheid (constante groeisnelheid k) en zal het aantal cellen exponentieel toenemen in de tijd. De groeisnelheid is sterk afhankelijk van de aard van het organisme en van alle kenmerken van het milieu: pH, aard en concentratie van de beschikbare nutriënten, temperatuur. In de veronderstelling dat één cel aanleiding geeft tot twee nakomelingen in een welbepaalde tijdsspanne (of generatietijd) kan een celpopulatie exponentieel toenemen. De omvang van een populatie (Nt = aantal cellen op tijdstip t), gegroeid vanuit een initieel celaantal No, kan na n generaties voorgesteld worden (Tabel 4) door Nt = 2n x No.

Deze formule kan ook geschreven worden als log Nt = log No + n log 2 Hieruit volgt het aantal delingen n: log Nt – log No n = -------------------

= 3,3 (log Nt - log No)

log 2 De generatietijd g = 1/k met k = n/t met n = aantal delingen Tabel 4: Vermeerdering van bacteriën in 12 uur, met een delingstijd van 20 minuten Tijdstip 0uur, n=0 1 uur, n=3 2 uur, n= 6 3 uur, n =9 4 uur, n= 12 5 uur, n= 15 6 uur, n = 18 7 uur, n = 21 8 uur, n = 24 9 uur, n = 27 10 uur, n=30 11 uur, n= 33 12 uur, n=36

2 23 26 29 212 215 218 221 224 227 230 233 236

aantal (2n) 1 8 64 512 4.096 32.768 262.144 2.097.152 16.777.216 134.217.728 1.023.741.824 8.589.934.592 68.719.476.736

E. coli heeft bij 30°C-37°C in een geschikt milieu tijdens de logaritmische fase een delingstijd van ongeveer 20 minuten. Vertrekkende van één cel, ontstaan er na 20 minuten twee cellen, na 40 minuten vier cellen en na 24 uur 23x24 = 1022 cellen. Als we de inhoud van de E. coli-cel op 1 µm3 (=10-12 cm3) en de soortelijke massa op 1 g/cm3 stellen, dan zou er in 24 uur een massa van 1022 x 10-12 x 1 g = 1010 g = 104 ton ontstaan. 69

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Dit is een situatie, die in de praktijk niet kan ontstaan door een combinatie van de volgende factoren: 

gebrek aan voedingsstoffen;



ophoping van min of meer toxische stofwisselingsproducten



gebrek aan levensruimte: bij een groot aantal cellen per ml cultuurvloeistof (109- 1012 per ml) gaan de cellen elkaar in ongunstige zin beïnvloeden (indien 1012 bacteriecellen van 1 µm diameter per ml aanwezig zijn, is alle ruimte opgevuld).

Dit cijfervoorbeeld illustreert echter wel de enorme snelheid van de groei. Door een combinatie van deze factoren gaat de logaritmische fase tijdig over in de stationaire fase, waarin de afsterving van bacteriën even snel verloopt als de aanmaak van nieuwe cellen. Tenslotte komt het moment dat de groeiomstandigheden zo slecht worden dat er meer cellen afsterven dan er bijgevormd worden (= afstervingsfase).

Oef.1: het aantal pathogene bacteriën op een gerecht bedraagt ca. 10 per gram. Bereken het aantal bacteriën dat wordt bereikt indien dit gerecht in de zon op een ideale groeitemperatuur voor de bacteriën (delingstijd 20 min.) wordt bewaard gedurende 4 uur. Oef. 2: Als in 8 u. tijd een exponentieel groeiende celpopulatie toeneemt van 5x106 cellen/ml naar 5x108 cellen/ml, bereken dan de generatietijd, het aantal delingen en de groeisnelheid.

4.4.3.

Uitwisseling van genetisch materiaal tussen bacteriën

Normaal gebeurt er bij de vermenigvuldiging van bacteriën geen uitwisseling van genetisch materiaal en zullen alle afstammelingen van één bacterie hetzelfde genotype bezitten – tenzij er mutaties zijn opgetreden. Recombinatie van genetisch materiaal tussen bacteriën met verschillend genotype kan nochtans voorkomen door de uitwisseling van DNA-fragmenten van de ene naar de andere bacteriesoort, waardoor de acceptorcel een genetische verandering ondergaat. Bij de genetische recombinatie onderscheidt men transformatie, conjugatie en transductie. Bij transformatie worden stukjes DNA, die zijn vrijgekomen uit een afgestorven donorcel, in het milieu in de acceptorcel opgenomen (Figuur 43). Recombinatie via transformatie verloopt alleen als het opgenomen DNA-fragment verwantschap heeft met het bestaande chromosoom. Op basis van DNA-homologie kan het fragment paren met het chromosoom, waarna het met behulp van recombinatie-enzymen wordt ingebouwd in dat chromosoom. Via electroporatie, waarbij een sterke elektrische ontlading 70

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

door een mengsel van DNA en bacteriën gaat, kan dit transformatieproces ook kunstmatig opgewekt worden en kan DNA geforceerd binnengebracht worden.

Figuur 43: Transformatie

Bij conjugatie, soms als vorm van seksueel bacteriegedrag beschreven, worden stukjes DNA overgebracht op het moment dat de donorcel en de acceptorcel aan elkaar gekoppeld zijn (Figuur 44). Zo zijn er voorbeelden van bacteriën, die resistent zijn tegen een bepaald antibioticum en deze eigenschap via conjugatie kunnen overbrengen op verwante pathogene micro-organismen. Laatstgenoemde zijn dan in de gastheer met dat antibioticum moeilijk te bestrijden. Conjugatie doet zich vrij algemeen voor, zo is conjugatie mogelijk tussen niet verwante soorten, zoals tussen G(-) en G(+)bacteriën. Er is eveneens een bacterie, Agrobacterium tumefaciens, die over een plasmide beschikt dat zichzelf via een sterk op conjugatie gelijkend proces overdraagt naar plantencellen. Anderzijds zijn er ook transposons (jumping genes), in het bijzonder stukken DNA die van plaats wisselen, zoals van het chromosoom naar de plasmide: via het proces van conjugatie kan via deze weg dan ook diverse genen worden overgedragen.

Figuur 44: Conjugatie

Het overdragen van een stukje DNA van een donorcel naar een acceptorcel via een bacteriofaag noemen we transductie (Figuur 45). Een belangrijke stap in het ontwikkelingsproces van de bacteriofagen is de assemblage van faag-DNA en gevormde manteleiwitten tot complete 71

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

faagdeeltjes (zie 4.6). Dat proces verloopt normaal met een grote precisie, en soms zijn afwijkingen mogelijk waarbij bacterieel DNA wordt ingebouwd in plaats van het faag DNA.

Figuur 45: Transductie

Een belangrijke ontwikkeling op het gebied van recombinatie begon met de ontdekking van de zgn. restrictie-enzymen, bacteriële enzymen die DNA op zeer specifieke plaatsen fragmenteren, waarna deze stukjes DNA gekoppeld kunnen worden aan plasmide-DNA van andere bacteriën waarin zij tot expressie worden gebracht (recombinant DNA-technologie). Tot expressie brengen wil zeggen dat de in het DNA gecodeerde genproducten (vb. enzymen) door het organisme inderdaad worden gevormd. Men kan op deze wijze voorbijgaan aan barrières die in de natuur tussen niet-verwante bacteriën bestaan, en tussen micro-organismen en planten- en dierencellen. Deze genetische manipulaties (“genetic engineering”) kunnen worden aangewend bij de productie van bepaalde metabolieten van bacteriën, schimmels of virussen, zoals vaccins, antibiotica en enzymen, farmaceutische producten zoals menselijk insuline, groeihormoon en EPO (erythropoietine).

4.5. Groei van fungi (gisten en schimmels) Gisten zijn ééncellige fungi die zich zowel aseksueel (meest frequent) als seksueel kunnen voortplanten. Aseksuele voortplanting gebeurt meestal door knopvorming (Figuur 46) en uitzonderlijk door dwarsdeling (Schizosaccharomyces).

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 46: Knopvorming bij gisten

De groei van schimmels komt tot uiting in het langer worden van de hyfen en het vergroten van het mycelium = hyfale extensie. De mate van groei bij schimmels zal dus worden uitgedrukt op basis van het gevormde mycelium vb. de toename van het gewicht van droog mycelium of de toename van de diameter van het mycelium.

Bij micro-organismen die door knopvorming of door hyfale extensie groeien, blijven de originele componenten in de moedercel en bestaat de dochtercel uit nieuw gevormd celmateriaal. Een cel die deelt door knopvorming “veroudert” dus, een cel die binair deelt (bacteriecel) “veroudert” niet. Bij micro-organismen die binaire deling ondergaan worden de constituenten van de oudercel gelijkmatig verdeeld over de twee dochtercellen.

4.5.1. Ongeslachtelijke voortplanting van de fungi Wanneer een fungus na mitose sporen vormt, dan is er sprake van ongeslachtelijke voortplanting. Deze ongeslachtelijke sporen (ook mitosporen genoemd) groeien na kieming weer uit tot een zelfde fungus. Bij de meeste schimmels worden deze sporen conidiosporen of sporangiosporen genoemd (Figuur 47).

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 47: Ongeslachtelijke voortplanting bij schimmels

Bij gisten (Figuur 48) verloopt de ongeslachtelijke voortplanting niet door sporenvorming maar door knopvorming.

Figuur 48: Ongeslachtelijke voortplanting bij gisten (Ascomyceten) kan zowel in het haploïde als in het diploïde stadium van de levenscyclus

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

4.5.2. Geslachtelijke voortplanting van de fungi Zoals in alle eukaryoten wordt onder seksuele reproductie de versmelting van 2 cellen tot één cel met versmelting van de kernen verstaan. Seksuele reproductie verloopt in drie fasen. In sommige fungi volgen deze fasen elkaar snel op, doch in andere fungi vinden ze plaats tijdens verschillende ontwikkelingsstadia: 

Plasmogamie: de fusie van het cytoplasma van twee haploïde (n chromosomen) geslachtelijke cellen van verschillend geslacht (gameten). De resulterende cel heeft 2 nuclei (dikaryon).



Karyogamie: fusie van de twee haploïde nuclei tot een diploïde (2n) nucleus (zygote).



Meiose: reductiedeling die het ontstaan geeft aan sporen met een haploïd (n) karakter.

Deze geslachtelijke sporen (ook meiosporen genoemd) groeien na kieming weer uit tot nieuw mycelium (vegetatieve hyfen). Er bestaan verschillende types van seksuele sporen naargelang het fylum waartoe de fungi behoren: 

Zoösporen: sporen van het fylum Chytridiomyceten



Zygosporen: sporen van het fylum Zygomyceten



Basidiosporen: ééncellige sporen van het fylum Basidiomyceten die meestal per vier voorkomen in vier uitstulpingen van een basidium, de sterigmata



Ascosporen: ééncellige sporen van het fylum Ascomyceten in een zak (ascus). De vier haploïde nuclei ontstaan na de meiose en ondergaan meestal nog een meiose, zodat finaal acht haploïde ascosporen in de ascus voorkomen.

Bovenstaande 4 fyla vormen samen de “perfecte fungi”: ze kunnen zich zowel seksueel als aseksueel voortplanten. Het 5de fylum van de fungi zijn de “Fungi Imperfecti” of de Deuteromyceten: dit fylum vormt geen geslachtelijke sporen en kan zich niet seksueel voortplanten.

4.5.3. Levenscycli van de fungi Tijdens hun levenscyclus (Figuur 49) vertonen fungi zowel seksuele als aseksuele reproductie.

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 49: De levenscyclus van een fungus

De termen teleomorf, anamorf en holomorf zijn van toepassing op onderdelen van de levenscyclus van de fungi van de fyla Ascomycota en Basidiomycota. 

Teleomorf: het seksuele stadium gekenmerkt door de aanwezigheid van een vruchtlichaam.



Anamorf: het aseksuele stadium, gekenmerkt door het typsich schimmelachtig uitzicht.



Holomorf: de volledige fungus, inclusief zijn anamorfe en teleomorfe vorm.

Figuur 50 tem Figuur 53 tonen verschillende levenscycli van verschillende types gisten en schimmels.

Microbiologie H4: MicrobiĂŤle groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 50: Levenscyclus van een ascomycete schimmel

Figuur 51: Levenscyclus van een ascomycete gist

Microbiologie H4: MicrobiĂŤle groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 52: Levenscyclus van een Basidiomyceet

Microbiologie H4: MicrobiĂŤle groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 53: Levenscyclus van Rhizopus (boven: eenvoudige voorstelling, onder: complexere voorstelling)

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

4.6. Groei van virussen Virussen zijn verplichte intracellulaire parasieten van mens, dier, plant en micro-organismen want ze beschikken niet over een eigen metabolisme. Ze hebben dus ook geen enzymen. Zowel voor metabolisme als voor vermenigvuldiging zijn ze aangewezen op een gastheer. De meeste gegevens over de interactie tussen virus en gastheer zijn afkomstig van het model bacteriofaag. Een bacteriofaag is een virus dat bacteriën parasiteert. Bacteriofagen bezitten een proteïnemantel of kapside waaraan men een staart, een hals en een kop onderscheidt. In de kop bevindt zich het DNA van de faag; er zijn enkele fagen die alleen maar RNA bevatten. Tegenwoordig beschikt men dankzij gespecialiseerde technieken over steeds meer gegevens betreffende de interactie van virussen met dieren plantencel. Bacteriofagen werden, en worden meestal nog, als model voor virussen genomen. De groei van bacteriofagen met kop- en staartstructuur gebeurt in vier stappen: 1. aanhechting van de faag aan de bacteriecel; 2. het spuiten/injecteren van het faag-DNA in de cel; 3. intracellulaire vermenigvuldiging; 4. het openbarsten en oplossen (lysis) van de bacteriecel, waarbij talrijke nieuwe faagdeeltjes vrijkomen die nieuwe bacteriën infecteren, totdat de gehele bacteriepopulatie is aangetast.

4.6.1. Aanhechtingsfase (virusintrede of virusadsorptie) Bacteriofagen dienen te botsen met een gevoelige gastcel waarbij een viruscomponent (staart van het capside) bindt op een specifieke herkenningsplaats (receptor) op het celoppervlak van de gastcel (Figuur 54).

Figuur 54: Bacteriofagen die zich vasthechten aan de wand van een bacterie (26.000X)

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Bij bv. de colifaag met kop- en staartstructuur geschiedt de aanhechting door middel van de staartuitsteeksels. Bacteriofagen zijn uiterst specifiek wat de keuze van hun gastheer betreft: de meeste fagen parasiteren slechts één species, vele zelfs maar één type binnen één bepaalde species (vb. fagen die specifiek zijn voor één type van E. coli of van S. aureus), omdat de andere types niet de juiste receptor voor die faag dragen.

4.6.2. Injectie van het faag-DNA Op de aanhechtingsplaats doorboort de faag de wand van de bacterie, door middel van een enzym, en spuit zijn DNA in het cytoplasma. De proteïnemantel dringt de bacterie niet binnen.

4.6.3. Intracellulaire vermenigvuldiging en lysis Het ingespoten DNA van de faag (= vegetatieve faag) kan vervolgens twee cycli doorlopen: ofwel de lytische cyclus ofwel de lysogene cyclus (Figuur 55). Er bestaan dan ook twee klassen bacteriofagen: de “virulente” fagen en de “temperate” fagen.

Figuur 55: Lytische en lysogene faagcyclus

De virulente fagen kiezen altijd de lytische cyclus: het DNA van de faag onderdrukt de aanmaak van bacterieel DNA, maar stimuleert de aanmaak van enzymen voor de opbouw van nieuw faag-DNA. Daarna stimuleert de faag de aanmaak van proteïnen bestemd voor de fagenmantel, en enzymen die de bacterie zullen in lysis brengen. In een laatste fase zal het nieuwe faag-DNA

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

geïncorporeerd worden in de nieuwe mantels en zullen volledige fagen, na lysis van de microbe, naar buiten treden. Deze intracellulaire vermenigvuldiging duurt meestal 20-25 minuten. Na het openbarsten van de bacteriecel komen ongeveer 50-200 faagdeeltjes vrij. De temperate fagen kunnen zich ofwel als virulente fagen gedragen en een lytische cyclus volgen, ofwel slechts een latente infectie van de microbe verwekken en de lysogene cyclus volgen. In het laatste geval gaat het ingespoten faag-DNA zich samenvoegen met het DNA van de bacterie: er ontstaat dan een profaag. Deze microben produceren niet onmiddellijk nieuwe fagen omdat het genoom van de profaag onder invloed van een repressor komt te staan. De faag brengt een specifiek gen tot expressie waardoor in de geïnfecteerde cel een repressoreiwit wordt gevormd. Dat eiwit schakelt de faagontwikkeling uit, doordat het de interactie van het RNApolymerase met essentiële faaggenen verhindert. De lysogene bacteriën zijn ook immuun geworden tegen nieuwe virulente fagen van hetzelfde type, die nog wel kunnen penetreren maar zich omwille van de aanwezige repressor niet meer kunnen vermenigvuldigen. De profaag wordt echter wel synchroon met het DNA van de bacterie verdubbeld bij elke celdeling. De bacterie en haar afstammelingen dragen allen de profaag en bezitten bijgevolg de mogelijkheid om onder bepaalde omstandigheden faag te produceren. Na vele generaties kan om een of andere reden de repressor geïnactiveerd worden of de concentratie van de repressor wordt te laag met als gevolg dat het DNA van de faag weer actief wordt (= lysogene conversie) (vb. na een UV-bestraling of contact met bepaalde chemicaliën) en de lytische cyclus begint (met vorming van volledige fagen en lysis van de gastheer).

Figuur 56: Bacteriofagen die zich vasthechten aan de wand van een bacterie (26.000X)

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------DIERLIJKE VIRUSSEN Dierlijke virussen infecteren en vermenigvuldigen in dierlijke cellen en verschillen van bacteriofagen via de wijze van penetratie in een gastheercel. Bijvoorbeeld DNA-virussen penetreren een gastheercel op deze wijze: 

aanhechting: dierlijke virussen hechten zich vast aan plasmamembraan proteïnen en glycoproteïnen (gastheercel receptors).



Penetratie: dierlijke virussen injecteren geen nucleïnezuren in de eukaryotische cel, maar penetratie van het volledige virion grijpt plaats via endocytosis waarbij het virus zich vasthecht

aan

microvilli

van

plasmamembraan

van

gastheercel.

gastheercelmembraan omsluit vervolgens het virus met de vorming van een vesicle in het cytoplasma. 

Transcriptie in de kern door gastheercel RNA-polymerase.



Translatie door gastheercel ribosomen tot nieuwe viruseiwitten.



DNA-replicatie door viraal DNA-polymerase in de kern tot nieuw virusDNA.



Assemblage van de viruspartikels;



Vrijstelling uit de cel door lysis of exocytosis.

Figuur 57: Vermenigvuldiging van dierlijke DNA-virus

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------83

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

4.7. Invloedsfactoren op de groei van micro-organismen 4.7.1. Voedingsstoffen / Samenstelling van het groeimedium Voor de groei en vermeerdering van micro-organismen zijn voedingsstoffen (nutriënten) nodig. Naast water hebben micro-organismen een energiebron, een stikstofbron, mineralen en vitaminen nodig voor hun groei. De soort en graad van beschikbaarheid van deze nutriënten zal bijgevolg bepalend zijn voor de groei van micro-organismen. 4.7.1.1. Water Voor al het biologische leven en dus ook voor de micro-organismen is water onmisbaar. 4.7.1.2. Energiebron en C-bron Bij de autotrofe micro-organismen wordt CO2 omgezet in C-houdende bestanddelen waarbij de energie uit zonlicht wordt betrokken (foto-autotroof) of uit een exotherme chemische omzetting, zoals de oxidatie van H2S tot S of van NH3 tot nitriet en nitraat (chemo-autotroof). De heterotrofe micro-organismen hebben als C-bron een organische C-verbinding nodig. De organische verbindingen die als C-bron kunnen worden gebruikt, zijn o.a. glucose of andere suikers, polysacchariden, organische zuren, alcoholen, vetten en aminozuren. 4.7.1.3. Stikstofbron Alle cellen hebben het element stikstof nodig om eiwitten en nucleïnezuren te synthetiseren. Hoewel stikstof in overvloed aanwezig is in de atmosfeer, is de anorganische vorm (N2) waarin het voorkomt, onbruikbaar voor de meeste organismen. Uitsluitend bepaalde bacteriën en cyanobacteriën hebben het vermogen om N2 om te zetten in vormen van stikstof (N-autotroof) die bruikbaar zijn voor organismen die dit vermogen niet bezitten (N-heterotroof). Het overgrote deel van alle organismen is dus afhankelijk van deze kleine groep 'stikstofbindende' prokaryoten. Ten aanzien van de stikstofbehoefte worden de micro-organismen ingedeeld in autotrofen en heterotrofen. De autotrofen kunnen stikstof (cf. Rhizobium: wortelknolletjes vlinderbloemigen) uit de lucht of anorganisch gebonden stikstof, zoals ammoniumzouten, nitrieten en nitraten als enige Nbron, omzetten in celeiwitten, nucleïnezuren en andere N-houdende celbestanddelen (autotroof ten opzichte van stikstof).

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De heterotrofen echter hebben aminozuren nodig hetzij als zodanig, hetzij in de vorm van peptiden, die voorkomen in enzymatische afbraakproducten van vlees, caseïne, melk, soja en gelatine, de zgn. peptonen (heterotroof ten opzichte van stikstof). 4.7.1.4. Mineralen Mineralen zijn voor diverse celfuncties noodzakelijk. Men onderscheidt de macronutriënten (vb. P, S, K) en de micronutriënten of sporenelementen (vb. Mo, Cu, Mn, Zn). Mineralen komen voor onder de vorm van zouten maar kunnen ook uit andere bronnen worden betrokken. Zo kan S ook uit zwavelhoudende aminozuren en P uit nucleïnezuren worden gehaald. 4.7.1.5 Vitaminen Bepaalde micro-organismen zijn niet in staat bepaalde noodzakelijke vitamines te produceren. Dit betekent dat hun groei afhankelijk is van de aanwezigheid van één of meerdere vitaminen in het groeimedium. Zo zijn bijvoorbeeld de bekende vitamines van de B-groep, de wateroplosbare complexe Nverbindingen, voor sommige organismen onmisbaar. De organismen die ten aanzien van deze B-vitamines weinig eisen stellen, zijn de schimmels. Iets minder onafhankelijk zijn tal van gisten en sporenvormende bacteriën. Daarentegen zijn de protozoa en sommige melkzuurbacteriën, die vrijwel alle componenten van het B-complex nodig hebben, veeleisend. De verbindingen die tot het vitamine-B-complex behoren, zijn: thiamine, biotine, nicotinezuur, riboflavine, pyridoxine, panthoteenzuur, p-aminobenzoëzuur, lipoïnezuur, choline en cobalamine (B12). De meeste van deze vitamines functioneren als co-enzymen of worden ingebouwd in coenzymen en worden door veel organismen zelf gesynthetiseerd.

4.7.2. Temperatuur Biochemische reacties en dus ook het metabolisme van de microbiële cel verlopen aanvankelijk sneller bij stijgende temperatuur. In eerste instantie zal dus ook de vermeerdering van microorganismen bij stijgende temperatuur sneller verlopen. Gemiddeld is bij een stijging van 10°C de groeisnelheid 2 tot 3 maal zo groot als de beginsnelheid. Vanaf een bepaalde temperatuur zal deze vermeerdering echter worden tegengewerkt, doordat de denaturatie van de celeiwitten toeneemt. Dit leidt o.a. tot een activiteitsvermindering van de enzymen. De groeitemperatuurfunctie zal daarom door een maximum gaan; de bij dit maximum behorende temperatuur heet de optimumtemperatuur van het micro-organisme. Verder onderscheidt men een minimum- en

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

een maximumtemperatuur voor groei. Daaronder verstaat men de temperatuurgrenzen, waarbij nog juist groei optreedt. Bij temperaturen boven 60°C à 80°C sterven de meeste microorganismen af, uitgezonderd de sporenvormende bacteriën en hyperthermofielen. Men kan micro-organismen indelen in functie van het temperatuursinterval waarbinnen ze groeien (Tabel 5). Psychrofielen kunnen groeien bij lage temperatuur omdat hun celmembraan een hoog gehalte onverzadigde vetzuren bevat (dit voor het behouden van het membraanvloeibaarheid), terwijl een hoog gehalte aan verzadigde vetzuren wordt aangetroffen bij thermofiele microorganismen. Thermofiele micro-organismen zijn in staat om te (over)leven bij hogere temperaturen (37°C - 75°C). Micro-organismen die in staat zijn te groeien bij lage temperatuur doch niet noodzakelijk deze lage temperatuur nodig hebben voor hun groei, worden psychrotrofen genoemd. Op analoge wijze bezitten de thermotrofen een combinatie van mesofiele en thermofiele eigenschappen. Hyperthermofielen zijn micro-organismen die groeien bij temperaturen van 70-110°C; dit zijn gewoonlijk vertegenwoordigers van de Archaea. Deze micro-organismen bevatten hoogthermoresistente eiwitten (zo worden in de praktijk voor detergenten thermostabiele enzymes gebruikt voor de verwijdering van vetten en eiwitten). Mesofiele micro-organismen komen zeer frequent voor bij warmbloedigen en hebben een optimale groeitemperatuur tussen 30°C en 37°C (= lichaamstemperatuur).

Tabel 5: Indeling van de micro-organismen in functie van temperatuursinterval voor groei GROEP

TEMPERATUUR (°C) Min.

Opt.

Max.

psychrofielen

-18

mesofielen

30-37

thermofielen

Temperatuur en voedselconservering Bewaring van voedingswaren bij koelkasttemperatuur (4°C) vertraagt het optreden van voedselbederf omdat het de groei limiteert van snel groeiende mesofielen. Psychrofielen en psychrotrofen kunnen bij deze temperatuur nog groeien en bijgevolg kan bederf nog steeds voorkomen maar wordt het uitgesteld. Bedenk wat er zal gebeuren bij vriezen van voedingswaren? Temperatuur en ziekte 86

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De meeste pathogenen groeien gewoonlijk het best onder mesofiele omstandigheden. Er is een wezenlijk temperatuursverschil tussen verschillende delen van het menselijk lichaam: een lichaamstemperatuur van ca. 37°C is te verwachten ter hoogte van het hart, hersenen en ingewanden, de temperatuur van de extremiteiten kan veel lager zijn. Vandaar dat sommige micro-organismen ziektes in bepaalde delen van het lichaam kunnen veroorzaken en niet in andere. Mycobacterium leprae, de veroorzaker van melaatsheid, zal het best ontwikkelen in de koudste gedeeltes van het lichaam (oren, handen, voeten) omdat het beter groeit bij dergelijke temperaturen.

4.7.3. Zuurtegraad of pH De zuurtegraad of de pH van het milieu oefent een belangrijke invloed uit op de groei van micro-organismen. Bij elk micro-organisme behoort een pH-gebied, waarbinnen groei mogelijk is. Hun groei is gekenmerkt door een minimale, optimale en maximale pH-waarde. Deze waarden zijn verschillend voor bacteriën, gisten en schimmels (Tabel 6).

Tabel 6: Groei van micro-organismen in functie van de pH pH-waarde

micro-organismen min.

opt.

max.

Bacteriën

4,4

7,0

9,8

Gisten

1,5

4,0-6,0

9,0

Schimmels

1,5

7,0

11,0

Bij een pH, ongeveer gelegen tussen 6 en 8, is de ontwikkeling van vrijwel alle microorganismen mogelijk, omdat de daarvoor verantwoordelijke enzymen in dit pH-gebied het meest werkzaam zijn. Micro-organismen waarvan de optimale pH gelegen is tussen 6 en 8 worden benoemd als neutrofielen. De meeste bacteriën, behalve de melkzuur-, de azijnzuuren de zwavelbacteriën, worden bij een pH lager dan 4 à 5 in hun groei geremd, terwijl gisten en schimmels bij lage pH-waarden goed kunnen groeien. Micro-organismen die kunnen groeien bij een pH lager dan 4 à 5, worden zuurlievend genoemd (acidofiele micro-organismen) vb. Helicobacter pylori groeit in de maag en is de veroorzaker van maagzweren (produceert het urease enzym waardoor ammoniak uit ureum wordt vrijgesteld en als dusdanig neutraliserend werkt in de omgeving van de bacterie). Een vertegenwoordiger van de Archaea, in het bijzonder Picrophilus oshimae, groeit in vulkanisch gebied en heeft een pH-optimum rond pH 1. 87

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Sommige micro-organismen kunnen groeien bij een pH hoger dan 10 (basofiele of alkalofiele micro-organismen). Voorbeelden hiervan zijn Vibrio en sommige Enterococcus-soorten.

4.7.4. Zuurstof Hoewel bijna alle planten en dieren zuurstof nodig hebben, is dit niet het geval bij alle microorganismen. Zo zijn er zeer veel soorten gisten en bacteriën bekend die zonder luchtzuurstof kunnen groeien, terwijl enkele soorten zich zelfs uitsluitend bij afwezigheid van zuurstof kunnen ontwikkelen. Wat de invloed van zuurstof op de groei betreft kunnen we micro-organismen onderbrengen in één van de volgende groepen (Figuur 58): a. Strikt of obligaat aërobe micro-organismen, die zich uitsluitend in aanwezigheid van zuurstof kunnen ontwikkelen en zonder zuurstof zelfs afsterven. Voorbeelden hiervan zijn: 

tal van schimmels



alle wieren



alle protozoa



sommige gistsoorten



sommige bacteriesoorten zoals Micrococcus, Acetobacter en Pseudomonas.

b. Facultatief aërobe of anaërobe micro-organismen, die zich zowel in aanwezigheid als bij afwezigheid van zuurstof ontwikkelen. Voorbeelden hiervan zijn vele gistsoorten en de meeste bacteriesoorten. Sommige bacteriën kunnen bij afwezigheid van O2 vb. NO3- of SO42reduceren. c. Strikt of obligaat anaërobe micro-organismen, die zich uitsluitend zonder zuurstof kunnen ontwikkelen. Voorbeelden hiervan zijn de bacteriesoorten Clostridium, Bifidobacterium en Bacteroides (darmbacteriën). Bifidobacterium en Bacteroides sterven in aanwezigheid van zuurstof snel af. d. Aërotolerante anaerobe micro-organismen kunnen O2 verdragen maar hun metabolisme is louter gesteund op fermentatie. Ze zijn dus niet in staat om aërobe respiratie uit te voeren. e. Micro-aërofiele micro-organismen, die zich het beste bij verminderde zuurstofspanning ontwikkelen. Voorbeelden hiervan zijn verschillende melkzuurbacteriën.

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 58: Diverse microbiële groepen in functie van hun zuurstoftolerantie

4.7.5. De wateractiviteit (aw) Een micro-organisme ontwikkelt zich het meest gunstig in een omgeving die in evenwicht is met zijn eigen osmotische waarde. Zoals we hebben gezien oefent de celwand echter een zekere beschermende invloed uit tegen ongunstige veranderingen van de osmotische waarde van de omgeving. Omdat het bepalen van en het rekenen met osmotische waarden in de praktijk nogal gecompliceerd is, baseert men zich liever op de grootheid relatieve evenwichtsvochtigheid of de wateractiviteit (aw). De wateractiviteit van een milieu is de verhouding van de waterdampspanning boven dit milieu en de waterdampspanning boven zuiver water onder dezelfde fysische omstandigheden. De wateractiviteit is een maat voor de hoeveelheid water die voor de micro-organismen ter beschikking staat (afhankelijk van de mate waarin de watermoleculen gebonden zijn en niet beschikbaar voor groei). Dit wordt door de volgende formule uitgedrukt:

P aw =

P = dampspanning van de oplossing Po = dampspanning van water

Po De wateractiviteit is afhankelijk van: 

het vochtgehalte



de aard van opgeloste stoffen met een sterk waterbindend vermogen (vb. NaCl)



de temperatuur van het milieu.

De diverse groepen micro-organismen zijn beperkt in hun groei door een minimale aw-waarde voor groei (Tabel 7 en Tabel 8).

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Tabel 7: Min. aw-waarden voor de groei van micro-organismen MICRO-ORGANISMEN

MIN. aw-WAARDEN

bacteriën gram (-)

0,95

gram (+)

0,91

gisten

0,88

schimmels

0,80

In het algemeen kan worden gezegd dat de meeste micro-organismen in hun groei worden geremd en zelfs afsterven, naarmate de wateractiviteit lager is. Tabel 8: Minimale aw-waarde voor microbiële groei en mogelijk voedselbederf bij levensmiddelen met een bepaalde zout of suiker% in de waterige fase aW-WAARDE

MICRO-ORGANISME GEREMD

VOORBEELD LEVENSMIDDEL

DOOR LAAGSTE aW 1,00-0,95

Gramnegatieve staafjes bacteriële sporen sommige gisten

L.M. met 40 % sucrose L.M. met 7 % NaCl Vleesproducten

0,95-0,91

meeste coccen Lactobacillus Bacillaceae (vegetatieve cellen)

L.M. met 55 % sucrose L.M. met 12 % NaCl Droge ham, halfbelegen kaas

0,91-0,87

meeste gisten

L.M. met 65 % sucrose L.M. met 15 % NaCl Droge worst, belegen kaas

0,87-0,80

meeste schimmels Staphylococcus aureus

meel, rijst, peulvruchten met 15-17 % water

0,80-0,75

halofiele bacteriën

L.M. met 26 % NaCl Marsepein, jam

0,75-0,65

xerofiele schimmels

Havermout

0,65-0,60

osmofiele gisten

Gedroogde vruchten

< 0,60

geen groei

Er zijn echter uitzonderingen nl. micro-organismen die groeien bij zeer lage wateractiviteiten: 1.

osmofiele micro-organismen, die in een suikerrijk milieu kunnen groeien;

xerofiele micro-organismen, die in een vochtarm milieu kunnen groeien;

halofiele micro-organismen, die in een zoutrijk milieu kunnen groeien.

De aw-waarde van rauwe levensmiddelen is hoger dan 0,98 met uitzondering voor granen, waarvan de aw tussen 0,60 en 0,70 is naargelang de graad van uitdroging. Microbieel bederf van levensmiddelen kan voorkomen worden door verlaging van de aw door vb. drogen, concentreren, toevoegen van suiker en zout. 90

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

4.7.6. Antimicrobiële stoffen De ontwikkeling van micro-organismen kan onder overigens gunstige omstandigheden toch worden verhinderd, door aan het medium geringe concentraties toe te voegen van stoffen die groeiremmend werken (microbiostatische werking) of die zelfs micro-organismen elimineren (microbiocide werking). Deze stoffen vormen in chemisch opzicht een zeer heterogene groep en kunnen op verschillende specifieke delen van de cel inwerken. Ze kunnen bijvoorbeeld de functie van DNA, het RNA, het cytoplasmamembraan of bepaalde enzymen verstoren. Ze kunnen ook als antagonisten werkzaam zijn bij het metabolisme van de cel door bijvoorbeeld in enzymen te worden ingebouwd en daardoor bepaalde stofwisselingsreacties te verstoren. Op grond van hun toepassing onderscheidt men volgende antimicrobiële bestanddelen: chemotherapeutica (chemisch gesynthetiseerde verbindingen die worden toegepast bij de bestrijding van infectieziekten), antibiotica (stofwisselingsproducten van micro-organismen die worden toegepast bij de bestrijding van bacteriële infectieziekten), conserveermiddelen (chemische verbindingen die worden toegepast bij de remming van groei van ongewenste micro-organismen

voedingsmiddelen

cosmetica),

desinfectantia

(chemische

verbindingen die een microbiocide werking bezitten en die worden toegepast bij het ontsmetten van o.a. oppervlakken en materialen) en antiseptica (chemische verbindingen met een microbiocide werking die worden toegepast om levende weefsels te ontsmetten).

4.7.7. Wisselwerking tussen microbiële populaties Als gevolg van het samenleven van verschillende micro-organismen kunnen onderling interacties optreden. Er kan groeiremming (antagonistische actie) en groeibevordering (synergistische actie) optreden.

4.8. Kweken van micro-organismen Daar de afmetingen van ééncellige micro-organismen zeer klein zijn, is het zeer moeilijk de eigenschappen van één enkel individu te bestuderen. Wel is het mogelijk microbiële celpopulaties in de grootte-orde van l06 à 109 cellen/ml of /g te bestuderen. Deze populaties worden verkregen door micro-organismen onder min of meer gedefinieerde omstandigheden op te hopen en te isoleren. Zulke populaties noemt men culturen. Bestaat een cultuur uit micro-organismen van één soort, dan spreekt men van een zuivere of reincultuur, terwijl een gemengde cultuur is samengesteld uit meer dan één soort.

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Om de eigenschappen van micro-organismen in het laboratorium te bestuderen, worden ze meestal geïsoleerd uit een gemengde natuurlijke populatie. Uit deze studies kan dan blijken of er een verband bestaat tussen de isolaten en vb. bepaalde ziektebeelden of bederf- en mineralisatieprocessen.

4.8.1. Kweken (niet kennen – zie laboratoriumvaardigheden) Voor het opkweken, het isoleren, het tellen, het identificeren, het differentiëren, en het bewaren van micro-organismen in laboratoria worden voedingsbodems, voedingsmedia of cultuurmedia gebruikt. Deze cultuurmedia bevatten alle nodige voedingsstoffen voor de groei van microorganismen. Een cultuurmedium kan vast of vloeibaar zijn. Een vloeibaar cultuurmedium wordt 'bouillon' of 'broth' genoemd. Voor een vast cultuurmedium wordt een stijfmiddel of een gelerend middel (meestal agar) toegevoegd.

Bij het kweken van micro-organismen moet de samenstelling van de voedingsbodem (ook cultuurmedium genoemd) en de uitwendige omstandigheden zodanig gekozen worden, dat ze optimaal zijn voor het op te kweken isolaat. Net als alle levende organismen hebben microorganismen nutriënten en bepaalde fysische omstandigheden nodig om te groeien. Deze groeistoffen kunnen echter voor de verschillende soorten variëren. In een voedingsbodem moeten alle elementen, nodig voor de celopbouw en de groei van een micro-organisme in een bruikbare vorm aanwezig zijn. Elke voedingsbodem bevat volgende componenten: 1. water 2. koolstofbron (C-bron): koolhydraten, eiwitten, organische zouten 3. stikstofbron (N-bron): eiwitten, aminozuren, N-bevattende anorganische zouten 4. bijkomende groeifactoren: vitamines, gistextract,… 5. mineralen en zouten 6. selectieve stoffen of inhibitoren (facultatief) 7. differentiërende stoffen of indicatoren (facultatief) 8. een stijfmiddel: agar of gelatine (in het geval van een vast medium)

WATER Het groeivermogen van micro-organismen is immers waterafhankelijk.

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

KOOLSTOFBRON (C-BRON) Koolstof is het belangrijkste atoom in het functioneren van de levende cel. De aard van de koolstofbronnen die micro-organismen nodig hebben of kunnen gebruiken bij hun vermeerdering, loopt sterk uiteen. Een koolstofbron kan bestaan uit een organische of uit een anorganische koolstofverbinding. Heterotrofe micro-organismen hebben als koolstofbron organische verbindingen nodig vb. suikers (glucose, lactose, fructose, saccharose,…), meervoudige alcoholen (glycerol, sorbitol,…), organische zuren (azijnzuur, citroenzuur,…) en aminozuren (lysine, arginine, …). Autotrofe micro-organismen zijn in staat om al hun celstructuren op te bouwen vanuit CO2 . Zij worden gekweekt in een medium dat alleen bestaat uit anorganische koolstofverbindingen, voornamelijk CO2 en carbonaten.

STIKSTOFBRON (N-BRON) Stikstof is een belangrijk atoom in vele macromoleculen van de cel, zoals proteïnen en nucleïnezuren. Ook ten aanzien van stikstofbehoefte kunnen micro-organismen ingedeeld worden in autotrofen en heterotrofen. De autotrofen kunnen stikstof uit de lucht (N2) of anorganisch gebonden stikstof (ammoniak, nitraten en ammoniumzouten) benutten. De heterotrofen hebben aminozuren nodig in het voedingsmedium. De meest gebruikte organische stikstofbronnen zijn de peptonen. Dit zijn gedeeltelijk of geheel enzymatisch gehydrolyseerde eiwitten; de aanduiding pepton wordt meestal gebruikt, indien vlees enzymatisch wordt afgebroken. Peptonen bevatten fosfor, zwavel, verschillende mineralen en talrijke vormen van organische C- en N-verbindingen. Enkele voorbeelden zijn: pepton, trypton, proteosepepton, gepeptoniseerde melk en sojapepton. Andere organische stikstofbronnen zijn aminozuren en ureum.

BIJKOMENDE GROEISTOFFEN OF GROEIFACTOREN Groeistoffen zijn een groep verbindingen, die in uiterst geringe concentratie de groei van de micro-organisme regelen. De bacteriën zelf kunnen die groeistoffen of aanvullingsstoffen niet synthetiseren. Groeistoffen kunnen essentiële aminozuren, vitaminen, purinen, … zijn. Vleesextract, gistextract en moutextract behoren tot deze groep omdat ze niet nader omschreven groeistoffen bevatten. 

Vleesextract is een aftreksel van mager rundvlees. Dit aftreksel wordt op kooktemperatuur gebracht, ontvet en ingedampt tot een vaste substantie. Het bevat

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

peptiden, aminozuren, organische basen en zuren, mineralen en vitamines en vormt een aanvulling op pepton. 

Gistextract wordt door waterige extractie van geautolyseerde biergisten gewonnen en bezit een zeer hoog gehalte aan vitamine B. Dit preparaat wordt veel toegepast voor het kweken van gisten en schimmels.



Moutextract is een wateroplosbaar extract uit gerstenmout/kiemend graan gewonnen en bezit een hoog gehalte aan verschillende suikers, vooral aan maltose. Het wordt veel gebruikt voor het kweken van gisten en schimmels.

MINERALEN EN ZOUTEN Naast koolstof, stikstof en water hebben de micro-organismen de elementen K, P en S in de vorm van mineralen nodig. De elementen Na, Ca, Mg, en Fe zijn als ionen voor het ene organisme belangrijker dan voor het andere. Ze zijn meestal nodig in concentraties van 10-3 tot 10-4 M en worden macronutriënten genoemd. Zo hebben aërobe organismen meer Fe en fotosynthetische meer Mg nodig. De elementen Mo, Cu, Mn, en Zn zijn in zeer kleine hoeveelheden nodig voor enzymen te activeren. Deze worden sporenelementen genoemd. Mineralen kunnen toegevoegd worden als groeifactoren (macro- en sporenelementen), met als doel een bepaalde osmotische waarde te bekomen, of als doel hebben om de pH te bufferen. Zo worden de voedingsbodems voor saprofytische bacteriën, gisten en schimmels veelal verrijkt met een fosfaatbuffer. Een ander voorbeeld is het mengsel van de anorganische zouten KH2PO4/K2HPO4 die zowel als P-bron als omwille van zijn bufferend vermogen toegevoegd kan worden.

INHIBITOREN Inhibitoren of remstoffen zijn stoffen die bepaalde levensprocessen specifiek remmen. Tot de door micro-organismen gevormde remstoffen behoren tal van antibiotica (penicilline, streptomycine,…). Andere voorbeelden van inhibitoren zijn: KCN, natriumazide, rundergal, NaCl,...(zie verder ook bij selectieve media).

INDICATOREN EN SPECIFIEKE REAGENTIA De meest gebruikte indicatoren zijn zuur-base indicatoren, vb. om de zuurproductie aan te tonen. Wil men een bepaald eindproduct aantonen, dan kan men aan de voedingsbodem specifieke reagentia toevoegen. Vb. de productie van H2S wordt aangetoond door een Fe(III)reagens er 94

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

aan toe te voegen. Bij zwartverkleuring (ontstaan van FeS) kan de reactie als positief beschouwd worden.

STIJFMIDDEL OF GELERENDE STOF Voor een vast medium wordt agar toegevoegd in een concentratie van 1 tot 1,5%. Agar is een gelvormend polysaccharide, dat geëxtraheerd kan worden uit verscheidene soorten van zeewieren. Agar heeft geen voedingswaarde voor de meeste micro-organismen. Agar heeft de typische eigenschap dat het vloeibaar wordt bij 100°C en stolt bij 40-45°C. Eénmaal gestold, wordt het pas weer vloeibaar als je het verwarmt tot 100°C. Voor het bereiden van een vast cultuurmedium kan ook gebruik gemaakt worden van gelatine (10 tot 15%). Gelatine is een verzamelnaam voor allerlei lijmachtige, bij afkoeling gelerende stoffen. Gelatine is een proteïne, dat vervaardigd wordt uit het collageen van o.a. schapenvellen of kalfsbeenderen. Het vormt met water een elastische gel. De waterige oplossing stijft op bij 28°C en lager.

Men kan voedingsbodems indelen op basis van verschillende kenmerken. Een eerste manier van onderscheid maken, gebeurt naargelang hun samenstelling. 

Synthetische of chemisch gedefinieerde voedingsbodems

Deze zijn samengesteld uit exacte hoeveelheden van gekende, zuivere, chemische verbindingen. Ze kunnen volledig uit anorganische stoffen bestaan of uit een mengsel van organische en anorganische bestanddelen. In ieder geval zijn de nutriënten chemisch gedefinieerd en is hierdoor de exacte chemische samenstelling van het medium gekend. 

Niet-synthetische of complexe voedingsbodems

Deze cultuurmedia bevatten alle componenten die nodig zijn voor de groei van microorganismen maar de exacte chemische samenstelling van de componenten is niet gekend. Immers deze media zijn samengesteld uit verbindingen van plantaardige of dierlijke oorsprong, zoals peptonen, vleesextract, vleesinfusie, bloedserum, gistextract, e.a.

Dergelijke

componenten hebben een hoge voedingswaarde voor de micro-organismen maar zijn chemisch niet gedefinieerd en bijgevolg is de exacte chemische samenstelling van een complex medium niet gekend. Dit is echter niet altijd noodzakelijk voor het opkweken van micro-organismen. Een voorbeeld hiervan is BHI-broth of Brain Heart Infusion broth, een rijk medium dat courant gebruikt wordt voor het opkweken van bacteriën in een vloeibaar milieu.

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Oorspronkelijk werden overwegend niet-synthetische of complexe media gebruikt.

Zij

kwamen tot stand op basis van experimenten en niet als gevolg van exacte kennis van de samenstelling van voedingsbodems. Zo zijn melk, bloed, eigeel, groentesappen, zoals tomatensap, en leverextracten nog steeds veel gebruikte natuurlijke componenten. Ondanks het bezwaar dat niet-synthetische media niet goed reproduceerbaar kunnen zijn, worden ze toch nog veelvuldig gebruikt, omdat synthetische media vaak ingewikkeld van samenstelling zijn. Enkele bekende ingrediënten die aan voedingsbodems worden toegevoegd zijn peptonen, vleesextract, gistextract en moutextract.

Men kan voedingsbodems eveneens indelen naargelang de groeimogelijkheden. 

Niet-selectieve cultuurmedia of algemene voedingsbodems

Dit zijn algemene media die de noodzakelijke basiscomponenten bevatten om de groei van de meeste micro-organismen toe te laten. Een groot aantal verschillende groepen van bacteriën, gisten en schimmels kunnen hierop groeien. Aan deze media worden geen componenten toegevoegd die selecteren naar bepaalde groepen van micro-organismen. Een voorbeeld van een niet-selectief cultuurmedium is PCA (plate count agar), een commercieel beschikbaar cultuurmedium dat courant gebruikt wordt voor de bepaling van het totaal kiemgetal. 

Selectieve voedingsbodems

Dit zijn media waaraan bepaalde componenten (selectieve stoffen) toegevoegd worden die de groei van bepaalde groepen van micro-organismen afremmen of verhinderen maar geen invloed hebben op de groei van het gewenste micro-organisme (dat men vb. wenst te isoleren). Selectieve stoffen zijn vb. galzouten, antibiotica, kleurstoffen. Een voorbeeld van een selectieve voedingsbodem is Nutrient Agar waaraan kristalviolet toegevoegd wordt en dit voor de bepaling van de Gram-negatieve flora. De kleurstof kristalviolet is hierbij de selectieve stof omdat ze de groei remt van de Gram-positieve bacteriën. 

Differentiërende voedingsbodems

Aan dergelijke voedingsbodems wordt een soort van indicator, typisch een kleurstof, toegevoegd die differentiatie (onderscheid) toelaat tussen verwante groepen van microorganismen. Immers de differentiërende stoffen geven tijdens de groei van de kiemen op de voedingsbodem aanleiding tot kenmerkende veranderingen in het uiterlijk van de kolonies. Met

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

andere woorden op een differentiërende voedingsbodem vertonen bepaalde micro-organismen typische kolonies terwijl andere niet-typische kolonies vormen. Vele media zijn én selectief én differentiërend. Een voorbeeld van een selectieve en differentiërende voedingsbodem is Briljant Groen Agar (BGA) voor de isolatie van Salmonella. Dit medium bevat o.a. als C-bronnen de suikers lactose en sucrose, fenolrood als indicator of differentiërende stof en briljantgroen als selectieve stof (remt Gram-positieven). Salmonella kan lactose en sucrose niet fermenteren en zal als C-bron de eiwitextracten uit de bodem gebruiken. Bij fermentatie hiervan treedt geen verzuring op maar worden de eiwitten afgebroken tot aminozuren en eventueel tot NH3 waardoor de pH alkalisch blijft en de kleurindicator fenolrood rood blijft. Salmonella-kolonies hebben dus een rode kleur. Gramnegative bacteriën die geen Salmonella zijn en die lactose en sucrose wel kunnen fermenteren reageren verschillend. De fermentatie hievan zal gepaard gaan met de productie van zuur en de kleurindicator zal omslaan van rood naar geel waardoor gele kolonies ontstaan. 

Aanrijkingsmedia

Wanneer men een bepaald micro-organisme wil isoleren dat slechts in zeer geringe aantallen voorkomt of vergezeld is van een groot aantal ongewenste species, kunnen aanrijkingsmedia gebruikt worden om zo het aantal van het gewenste micro-organisme door groei te laten toenemen. Dergelijke media moeten optimaal zijn voor het gewenste micro-organismen zodat deze zich goed ontwikkelt: optimale hoeveelheid aan voedingsstoffen, optimale pH, enz…Deze bodems kunnen eventueel ook selectief zijn zodat andere voorkomende soorten moeilijk vermenigvuldigen. Aanrijkingsmedia zijn over het algemeen vloeibaar vb. Demi-Fraser broth voor de selectieve aanrijking van Listeria spp. in stalen van levensmiddelen.

Na het kiezen van een geschikte voedingsbodem zal de laborant eveneens de geschikte groeiomstandigheden moeten kiezen. Zo worden strikt aërobe en facultatief anaërobe microorganismen normaal in aanwezigheid van luchtzuurstof gekweekt. Bij het kweken van strikt anaërobe micro-organismen moeten echter bijzondere voorzieningen worden getroffen om de redoxpotentiaal van het medium voldoende te verlagen, zoals via het werken met een gesloten vat (“jar”) dat zuurstofvrij wordt gemaakt (Figuur 59).

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 59: Het anaëroob kweken in een jar of pot

4.8.2. Ophopen (niet kennen – zie laboratoriumvaardigheden) Het ophopen of aanrijken bestaat in feite uit het incuberen van het monstermateriaal (=de matrix), waaruit een gezocht micro-organisme moet worden geïsoleerd, in omstandigheden die voor het te isoleren micro-organisme optimaal en voor de begeleidende micro-organismen ongunstig zijn. Het gezochte micro-organisme zal dan door zijn snelle ontwikkeling de andere micro-organismen verdringen. Bij het selectief ophopen maakt men in veel gevallen gebruik van zgn. remstoffen, zoals kristalviolet, briljantgroen, galpreparaten, Na-azide en antibiotica (= selectieve componenten).

4.8.3. Isoleren (niet kennen – zie laboratoriumvaardigheden) Het isoleren - d.w.z. het vrij van andere organismen in handen krijgen - van micro-organismen uit monstermateriaal is niet altijd een eenvoudige opgave. Afgezien van de bijzondere kweekomstandigheden die sommige micro-organismen, zoals virussen, eisen, kan het isoleren moeilijkheden bieden, bijvoorbeeld omdat een micro-organisme in de onderzochte milieu’s steeds door vele andere soorten wordt begeleid. Het opgehoopte micro-organisme moet vervolgens worden geïsoleerd. Daartoe strijkt men met behulp van een entnaald een weinig van de ophopingsvloeistof uit op een geschikte vaste voedingsbodem die zich in een petrischaal bevindt. In veel gevallen heeft deze vaste voedingsbodem hetzelfde of een soortgelijke samenstelling, als waarin opgehoopt werd. Het strijken moet zo gebeuren, dat de kans op het na incubatie ontstaan van losliggende kolonies groot is (Figuur 60).

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 60: De reinstrijk

Aan de vorm en het uiterlijk van de kolonie kan men soms al waarnemen of men het gewenste micro-organisme al dan niet heeft geïsoleerd. Deze kenmerken van een kolonie zijn namelijk specifiek voor een bepaald micro-organisme en variëren van regelmatig tot onregelmatig, van bol- tot platvormig, van klein tot groot van afmeting, van dof, wollig tot glinsterend door slijmvorming en van gekleurd tot niet-gekleurd. Daar deze manier in veel gevallen onvoldoende is om de gewenste kolonies van de overige te onderscheiden, voegt men extra componenten aan de voedingsbodem toe. Daarmee wordt beoogd de kolonies van het te isoleren micro-organisme als gevolg van specifieke eigenschappen een typisch beeld te geven, zodat ze met het oog gemakkelijker van andere soorten zijn te onderscheiden (electiviteit of differentiatie). Zo is de vorming van gas uit lactose tijdens de ophoping in briljantgroen-gal-lactose-broth een aanwijzing dat bacteriën van de coligroep aanwezig kunnen zijn, terwijl bij kleuromslag van paars naar geel, veroorzaakt door zuurvorming uit glucose, in Na-azide-glucose-broomcresolpurper-broth de ontwikkeling van enterococcen wordt vermoed.

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Het micro-organisme wordt tenslotte onderworpen aan een aantal fysiologische testen, eventueel aangevuld met serologische en genetische identificatietesten, om het te bestuderen ter identificatie.

4.8.4.

Het

bewaren

van

een

isolaat

(niet

kennen

–

zie

laboratoriumvaardigheden) Een geïsoleerde stam kan gedurende kortere of langere tijd in leven worden gehouden (stockcultuur). Men kan gebruik maken van één van de volgende methoden: 

Gevriesdroogde toestand De belangrijkste en beste methode om stammen gedurende zeer lange tijd te bewaren is vriesdrogen. Ze worden dan onder vacuüm in dichtgesmolten glazen ampullen bewaard.



Op schuine agar (slant) De meest toegepaste methode om stammen gedurende korte tijd te bewaren is de stam na beënting en bebroeding op een schuine agarbuis (een ‘slant’) te bewaren bij 0-5°C.



In een bouillon Voor strikt anaërobe micro-organismen, zoals Clostridia, en voor micro-aërofielen, zoals melkzuurbacteriën, wordt vaak een vloeibaar cultuurmedium (in proefbuisje), al dan niet afgesloten via paraffine, gebruikt.



In diepgevroren toestand Tegenwoordig gebeurt het langdurig bewaren van stammen bij zeer lage temperaturen, zoals -80°C en in vloeibare stikstof van -196°C (cryopreservering). Om een grotere kans op overleving te krijgen wordt aan de vloeibare celcultuur vóór vriezen een cryoprotectieve stof (glycerol of polyglycol) toegevoegd.

4.9. Het tellen en meten van de groei van micro-organismen De vermeerdering van een microbiële populatie per volume-eenheid kan enerzijds via directe metingen van het aantal, van het volume of de cellulaire massa uitgevoerd worden of anderzijds via indirecte metingen van de concentratie aan bestanddelen of bepaling van de metabolische activiteit van de cultuur worden uitgevoerd.

100

Microbiologie H4: MicrobiĂŤle groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

4.9.1.

Microscopische

telling

(niet

kennen

â&#x20AC;&#x201C;

zie

laboratoriumvaardigheden) Deze techniek bestaat erin een gekende cultuurvolume te spreiden over een gekende oppervlakte van een bijzonder microscopisch draagglas (telkamer) en (eventueel) na kleuring het aantal cellen/sporen te tellen onder microscoop.

4.9.2. Telling via uitplating op voedingsbodems (niet kennen â&#x20AC;&#x201C; zie laboratoriumvaardigheden) Bij deze methode (=kolonietelling) worden verschillende decimale verdunningen van het staal op een vaste voedingsbodem in petriplaten gebracht. Iedere cel geeft na incubatie een kolonie (de cellen worden geteld als kolonievormende eenheden of kve) (Figuur 61).

1 ml

0,1 ml

Figuur 61: Uitplating volgens de gietplaatmethode (links) en de strijkplaatmethode (rechts)

101

Microbiologie H4: Microbiële groei ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

4.9.3. Turbiditeitsbepaling (niet kennen – zie laboratoriumvaardigheden) Een snelle methode voor het indirect bepalen van celaantallen is via turbiditeitsmetingen (Figuur 62). Een celsuspensie ziet er vanaf een zekere celconcentratie troebel uit omdat de cellen invallend licht verstrooien. Men spreekt van de troebelheid of turbiditeit of ook optische densiteit van de celsuspensie. Hoe meer cellen aanwezig, hoe meer het licht verstrooid wordt en hoe troebeler de suspensie. Turbiditeit kan gemeten worden met een fotometer of een spectrofotometer: hierbij wordt licht doorheen een celsuspensie gestuurd en wordt de hoeveelheid licht, dat niet verstrooid werd, gedetecteerd.

Figuur 62: Turbiditeitsmetingen van microbiële groei

Bij gebruik van een spectrofotometer wordt de lichtabsorptie van een bacteriële suspensie gewoonlijk bepaald door te bestralen met licht van een golflengte tussen 480-650 nm. De gemeten absorptie is proportioneel aan de celconcentratie, maar is tevens afhankelijk van de grootte en de vorm van de cellen alsook van de intrinsieke absorptie van het milieu. Dit betekent een kalibratie voor elke bacteriesoort en cultuurconditie. Deze bepalingsmethode is tamelijk precies, maar is enkel toepasbaar indien de bacteriële concentratie hoger is dan 10 6 cellen/ml en het milieu weinig lichtabsorptie vertoont.

102

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

5. HET MICROBIEEL METABOLISME 5.1. Enzymen 5.1.1. Rol in het microbieel metabolisme Een enzym is een eiwit, dat een bepaalde (bio)chemische reactie versnelt (of vertraagt), een katalysator. Een enzym maakt een chemische reactie in een cel mogelijk of versnelt deze zonder daarbij zelf verbruikt te worden of van samenstelling te veranderen. Wel bindt het enzym zich tijdens de reacties met het substraat, ze passen in elkaar als een sleutel in een slot (Figuur 63). Dit gebeurt voor elk enzym op een eigen manier, doordat elk enzym verschillend is en elk een eigen proces heeft waarbij het betrokken is.

Figuur 63: Werking van een enzym

Aangezien vrijwel alle biologische processen (synthese, groei, uitscheiding e.d.) door enzymen gekatalyseerd worden, worden de fysiologische eigenschappen of het karakter van een levend organisme (van een levende cel) bepaald door de enzymen die erin aanwezig zijn.

5.1.2.

Enzymstructuur

Enzymen kunnen bestaan uit meerdere delen, bijvoorbeeld meerdere eiwitten. Daarnaast hebben ze vaak ook nog een co-factor of een co-enzym, een kleinere component zonder welke het enzym zijn functie niet kan vervullen. Een cofactor kan een ion zijn bijvoorbeeld zink,

103

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

mangaan, koper, magnesium, ijzer, kalium of natrium. Een co-enzym kan een kleine organische molecule zijn vb. de B-vitamines thiamine (B1) en riboflavine (B2) of nicotinamide. Het coenzym fungeert in een cel vaak als een soort van aan/uit schakelaar. Enzymen worden benoemd naar het proces dat zij katalyseren, gevolgd door de uitgang -ase, vb. oxidoreductasen: katalyseren oxidatie- en reductiereacties.

5.1.3.

Enzymwerking

Voor de meeste (bio)chemische reacties bestaat een energiebarrière die overwonnen moet worden voordat de reactie plaats kan vinden. Deze barrière voorkomt dat complexe moleculen zoals proteïnen en nucleïnezuren spontaan afgebroken worden en is dus nodig voor het in stand houden van het leven. Wanneer er echter in de cel bepaalde metabole veranderingen vereist zijn, zullen bepaalde van deze complexe moleculen afgebroken moeten worden en zal de energiebarrière overwonnen moeten worden. Warmte zou de extra benodigde energie kunnen leveren (activatie-energie genoemd), maar de toename in temperatuur zou de cel vernietigen. Het alternatief is de verlaging van de activatieenergie door het gebruik van een katalysator. Dit is dan ook de rol die enzymen spelen. Zij reageren met het substraat waarbij een overgangscomplex wordt gevormd die minder energie vereist om de reactie te laten verlopen (Figuur 64). Het onstabiele tussenproduct zal snel worden afgebroken tot de reactieproducten en het onveranderde enzym is vrij te reageren met andere substraatmoleculen.

Figuur 64: Verlaging van de activatie-energie door een enzym

104

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

5.1.4. Enzymkinetiek De kinetiek van een enzym gekatalyseerde reactie kan worden afgeleid uit de volgende reactievergelijking:

Hierbij staat E voor het enzym, S voor het substraat (reagens), en P voor het product. Het enzym-substraat complex wordt voorgesteld door ES. De reactiesnelheid wordt gegeven door de Michaelis-Mentenvergelijking:

Hierin is v de reactiesnelheid bij substraatconcentratie [S], Vmax is de maximale snelheid bij een verzadigingsconcentratie van substraat en Km is de substraatconcentratie waarbij geldt:

De meeste enzymen katalyseren processen met een snelheid van 1 tot 10.000 omzettingen per seconde per enzymmolecuul. De reactiesnelheid van een enzym is afhankelijk van de temperatuur, de zuurtegraad (pH) en de concentratie van enzym en substraat, de stof waarmee het enzym reageert. De snelheid van de enzymatische reactie neemt toe met een toenemende substraat concentratie, waarbij de maximale snelheid Vmax wordt bereikt wanneer alle actieve zijden van de enzymmoleculen zijn bezet. Het enzym is dan verzadigd waarbij de snelheid van de reactie wordt bepaald door de snelheid waarmee de actieve zijde het substraat in product kan omzetten. 5.1.4.1.

Temperatuur

De ruimtelijke structuur van eiwitten wijzigt met de temperatuur. Zo zijn de meeste enzymen inactief bij lage temperaturen. Ieder enzym heeft bij een bepaalde temperatuur (optimumtemperatuur) een maximale activiteit. De effecten van een verandering in temperatuur kunnen worden verklaard op basis van de kinetische theorie: een toename in temperatuur doet de moleculen sneller bewegen waarbij er dus meer botsingen plaatsvinden tussen de moleculen. Dit houdt in dat binnen een bepaalde grens (vb. 0 - 45 Â°C) de snelheid van de reactie

105

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

proportioneel is aan de temperatuur. Bij temperaturen boven normaal (vb. 60 °C) zullen enzymen denatureren; dat wil zeggen dat onder invloed van de hoge temperatuur de vorm en ruimtelijke opvouwing zullen veranderen waardoor het enzym zijn werking verliest. Bij steeds lager wordende temperaturen zullen de moleculen steeds minder snel bewegen en dus minder actief worden. 5.1.4.2.

Zuurtegraad

Ieder enzym werkt het best bij een bepaalde zuurtegraad (pH). De ruimtelijke opvouwing van een eiwitketen is onder meer afhankelijk van de pH en dit verklaart de sterke pHafhankelijkheid van de enzymatische activiteit. De meeste enzymen zijn slechts in een zeer beperkt pH-gebied optimaal actief (het optimum ligt doorgaans bij pH 5–8). Buiten dit pHgebied verliezen de enzymen, soms op irreversibele wijze, hun activiteit. Bij het denatureren van eiwitten worden de secundaire, tertiaire en quaternaire structuur verbroken omdat de balans tussen alle aantrekkende en afstotende krachten in een eiwitketen verstoord wordt. Hierdoor verandert de driedimensionale vorm van het eiwit. Sommige eiwitten zijn uit de aard van hun functie vrij goed bestand tegen denaturatie vb. huid, haar en nagels worden niet gemakkelijk gedenatureerd omdat ze veel disulfidebruggen bevatten. Veel enzymen worden echter snel gedenatureerd wanneer hun omgeving teveel gaat afwijken van de natuurlijke omstandigheden. Door denaturatie gaat de activiteit van het enzym verloren. Denaturatie kan op verschillende manieren gebeuren, bijvoorbeeld door temperatuurverhoging of pH-verandering. Meestal coaguleren (stollen) eiwitten bij het denatureren (stremmen, uitvlokken). Een bekend voorbeeld van denatureren door temperatuurverhoging is het geleren van het eiwit (albumine) van een ei tijdens het koken, het inactiveren van enzymen en het doden van bacteriën door verhitten.

5.1.5.

Enzymremming

Wil het enzym zijn effect kunnen uitoefenen, dan moet tussen enzym en substraat een kort en hecht contact zijn. Wordt die binding tussen enzym en substraat verhinderd, dan leidt dit tot enzymremming of enzyminhibitie. Er zijn 3 types van enzyminhibitie: 

competitieve enzyminhibitie;



niet-competitieve enzyminhibitie;



feedback inhibitie.

Wanneer het substraat (dat normaal bindt aan zijn enzym) concurrentie krijgt van een molecule waarvan de structuur erg lijkt op die van het substraat kan het de werking remmen

106

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

("competitieve inhibitie") (Figuur 65). De competitieve molecule (de competitieve inhibitor) bindt met het enzym en zorgt ervoor dat het enzym niet kan binden met zijn normale substraat, waardoor de enzymreactie wordt verhinderd. Deze stoffen kunnen celprocessen remmen of stoppen. Voorbeelden van competitieve enzymremmers zijn sommige pesticiden, zoals DDT, die de werking van belangrijke enzymen in het zenuwstelsel tegengaan. Veel antibiotica remmen specifieke enzymen in bacteriën. Zo blokkeert penicilline het actieve deel van een enzym, dat veel bacteriën gebruiken om hun celwand op te bouwen. Een ander typisch voorbeeld is de werking van sulfanilamide (een antimicrobieel geneesmiddel). Sulfanilamides inhiberen een enzym bij bacteriën voor de synthese van het vitamine foliumzuur. Sulfanilamides hebben een gelijkaardige structuur als para-aminobenzoëzuur (PABA) een intermediair bij de bacteriële vorming van foliumzuur.

Figuur 65: Competitieve inhibitie van enzymen; (a) de inhibitor concurreert met het normaal substraat voor binding met het actief centrum; (b) een competitieve inhibitor heeft gewoonlijk een chemische structuur gelijkaardig met het normale substraat

Andere stoffen remmen de enzymwerking doordat ze zich op een andere plaats (verschillend van het actief centrum) van het enzym hechten ("niet-competitieve inhibitie"), waardoor de vorm van het enzym verandert en de werkzaamheid van het enzym wordt verhinderd. Het substraat kan zich niet meer binden aan de actieve plaats, omdat deze een conformatieverandering heeft ondergaan en er zodoende geen sleutel (=substraat) / slot (=actieve plaats) principe kan plaatsvinden tussen substraat en enzym. Allostere of regulatorische enzymen (Figuur 66) zijn enzymen waarvan de katalytische activiteit specifiek beïnvloedbaar is door bepaalde metabolieten die gevormd worden als resultaat van de door het enzym gekatalyseerde reactie. Deze metabolieten binden op het enzym 107

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

op een andere plaats dan het actief centrum. Zij veranderen hierdoor de structuur/vorm van het enzym zodanig dat de activiteit geremd of gestimuleerd wordt; deze invloed op de enzymactiviteit noemt men een allosterisch effect. Zo kunnen stofwisselingprocessen gereguleerd worden. Heel vaak wordt de activiteit van het eerste enzym uit een reactieketen allosterisch geremd door het eindproduct van de reactieketen (negatieve terugkoppeling of feedback inhibitie). Zo stapelt het eindproduct zich niet op.

Figuur 66: Principe van het allosterisch effect van een allosterisch enzym; (a) binding van de allostere inhibitor en (b) feedback inhibitie

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Wil je meer weten? Lees dan deze tekst over “Milieu-aanpassing van bacteriën” Bacteriën bezitten veelal verbluffende mogelijkheden om zich aan te passen aan de in hun milieu heersende omstandigheden. Deze aanpassingen kunnen van genetische aard zijn of wel het gevolg zijn van direct door het milieu geïnduceerde veranderingen in de enzymatische samenstelling van de bacteriën. Een bekend voorbeeld van een genetische aanpassing is de resistentie-ontwikkeling tegen antibiotica zoals penicilline en streptomycine. In een populatie van bacteriën, die als geheel gevoelig is voor het antibioticum, kan een zeer klein aantal bacteriën (vb. 1 op de 1.000.000.000) voorkomen dat door een spontane verandering in hun erfelijke eigenschappen ongevoelig is geworden voor het desbetreffende antibioticum. Terwijl de normale bacteriën vergiftigd worden, zullen deze bacteriën (de mutanten) juist de kans krijgen zich ongestoord te ontwikkelen. Het is vooral de mogelijkheid om hun enzymatische samenstelling te wijzigen onder invloed van de milieu-omstandigheden die vele bacteriën in staat stelt zich snel aan te passen en op de 108

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

meest efficiënte manier te groeien (fysiologische aanpassing). Alle chemische reacties in levende organismen verlopen onder invloed van enzymen. Of een bacterie een bepaald enzym kan vormen, hangt in de eerste plaats af van haar genetische samenstelling. De aanpassing bestaat nu hierin dat de bacterie in werkelijkheid niet alle enzymen maakt waartoe zij genetisch in staat wordt gesteld, maar in vele gevallen slechts die welke onder de gegeven omstandigheden noodzakelijk zijn. Deze regulering van de enzymsynthese komt ook bij hogere organismen voor, maar is bij bacteriën het best bestudeerd. Het is duidelijk dat regulerende mechanismen de bacteriën in staat stellen zeer economisch met hun voedings- en energiebronnen om te springen; over het algemeen synthetiseren ze alleen die eiwitten (enzymen) die onder de heersende omstandigheden ook werkelijk nodig zijn. Deze regulering van de enzymsynthese is het sterkst bij bacteriën met een ‘flexibele’ stofwisseling (vb. grote diversiteit aan groeisubstraten; zowel in staat aëroob als anaëroob te groeien, enz.) en het minst bij bacteriën met een starre fysiologie (vb. vele cyanobacteriën, obligaat chemo-autotrofe bacteriën). -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

5.2. De stofwisseling van micro-organismen 5.2.1. Indeling van micro-organismen naar stofwisseling De verzamelnaam voor de (bio)chemische reacties die in de cel plaatsvinden, is stofwisseling of metabolisme. Metabolisme kan worden onderverdeeld in: 

katabolisme of dissimilatie: alle afbraakprocessen die energie opleveren (= bedrijfsstofwisseling);



anabolisme of assimilatie: alle biosynthetische reacties die energie kosten (= opbouwstofwisseling).

Micro-organismen kunnen worden ingedeeld volgens de energiebron die ze gebruiken (Tabel 9). Daarnaast wordt er ook gekeken naar de koolstofbron die ze gebruiken. De energie die nodig

is bij de levensverrichtingen van de cel, kan worden verkregen uit licht van de omgeving of uit bio-oxidaties van anorganische en organische verbindingen in de cel. Wanneer licht gebruikt wordt als primaire energiebron en de micro-organismen in staat zijn tot fotosynthese, worden ze fototroof genoemd. Daarnaast zijn er micro-organismen die uit anorganische of organische chemische verbindingen via oxidatiereacties energie winnen. Die organismen noemt men chemotroof.

109

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Er zijn micro-organismen die CO2 of een andere zogenoemde (anorganische) C1-verbinding als koolstofbron kunnen gebruiken; zij worden autotroof (zelfvoedend) genoemd. Daarnaast zijn er micro-organismen die voor hun koolstofbehoefte zijn aangewezen op organische koolstofbronnen, die noemt men heterotroof (voedsel van andere verkrijgend). Als we de twee karakteristieken – energiebron en koolstofbron – combineren, dan kunnen we spreken van fotoautotroof, foto-heterotroof, chemo-autotroof of chemo-heterotroof. Tabel 9: Indeling van micro-organismen naargelang hun energiebron en koolstofbron

5.2.2. Waar hebben M.O. energie voor nodig? Om arbeid te verrichten is er energie nodig. Elk organisme, ook micro-organismen, levert arbeid en verbruikt energie op verschillende manieren: 

Voor synthese:

Alles in de cel wordt opgebouwd bij een gewone (vrij lage) temperatuur. De reacties verlopen wel met behulp van biokatalysatoren of enzymen om de activeringsenergie te drukken, maar dat sluit niet uit dat geen energie meer nodig zou zijn. De biochemische reacties gaan zeer snel; zeker als men weet dat de meeste m.o. zich kunnen vermenigvuldigen binnen de 60 minuten. Dit resulteert in een intens metabolisme dat behoorlijk wat energie opslorpt. 

Voor actief membraantransport:

Er is diffusie van water doorheen het cytoplasmatisch membraan. Diffusie gaat van zelf, maar alle andere voedingselementen moeten actief de cel ingebracht worden. Ook moeten de afvalstoffen verwijderd worden. Dat vraagt energie. 

Voor verplaatsing:

Micro-organismen met flagellen en ciliën verplaatsen zich met een behoorlijke snelheid. Dat veronderstelt op zijn beurt een groot energieverbruik. 

Als lichtbron:

Sommige m.o. stralen licht uit: bioluminescentie. Ook daarvoor is er verbruik van energie.

110

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

5.2.3. Oxidatie- en reductiereacties als basis voor het metabolisme Het winnen van energie uit een chemische verbinding door een chemotroof vraagt het gebruik van een serie gekoppelde oxido-reductie reacties. Over het algemeen verstaan we onder oxidatie een reactie die een stof aangaat met moleculaire zuurstof. Deze definitie is niet volledig, aangezien in de cel veel oxidaties plaatsvinden zonder dat er moleculaire zuurstof aan te pas komt. Een betere definitie voor de oxidatie van een chemische verbinding is het verlies aan of de afgifte van elektronen, in veel gevallen gepaard gaande met het verlies aan H+-ionen. Zo is de reductie van een substraat niets anders dan de opname van elektronen, in veel gevallen gepaard gaande met de opname van H+-ionen. Bij de oxidatie van waterstof, zoals hierboven vermeld, worden in feite elektronen onttrokken aan de H-atomen en doorgegeven aan de Oatomen (Figuur 67). Bij oxidaties die in de cel plaatsvinden ter vrijstelling van energie (dissimilatie) worden vrijgekomen elektronen, in combinatie met H+-ionen, opgevangen door een verbinding, die fungeert als elektronenacceptor of H-acceptor. Deze kan de elektronen en de H+-ionen weer doorgeven aan een volgende acceptorverbinding.

Figuur 67: Schematische voorstelling van een oxidatie-reductie reactie

Fungeert moleculaire zuurstof in deze keten als laatste elektronenacceptor, dan spreken we van aĂŤrobe ademhalingsprocessen.

De energie die bij oxidatieprocessen vrijkomt, moet op de een of andere manier worden overgedragen aan de energieconsumerende of energiekostende biosynthetische processen, die dus in feite reductieprocessen zijn. Dit geschiedt in de meeste gevallen via de energierijke verbinding adenosinetrifosfaat (ATP) (Figuur 68).

111

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 68: Moleculaire structuur van adenosine trifosfaat (ATP)

Adenosinetrifosfaat bevat drie achter elkaar liggende fosfaatgroepen, die als pyrofosfaat zijn gebonden en zeer energierijk zijn, omdat bij hydrolyse in het overeenkomstige difosfaat (ADP) en monofosfaat (AMP) zeer veel energie vrijkomt. Indien nu uit een afbraakreactie energie vrijkomt, dan kan deze worden opgeslagen in ATP. Deze energie kan op een geschikt moment na splitsing van een fosfaatgroep weer worden afgestaan (Figuur 69).

Figuur 69: ATP-ADP cyclus bij anabole-katabole reacties

112

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Reducties betekenen in feite de opname van elektronen in moleculen, gepaard gaande met de opname van H+-ionen. Ze spelen een belangrijke rol bij de biosynthese van celcomponenten, zoals bij de CO2-assimilatie in fotosynthetische organismen. Bij de oxidatie- en reductiereacties fungeert het co-enzym nicotinamide adenine dinucleotide met of zonder fosfaatgroep (NAD of NADP) in gereduceerde toestand als H-donor (NADH) en in geoxideerde toestand als Hacceptor (NAD+ of NADP+). De NAD+-molecule die H-atomen in zich opneemt (NADH), wordt daarna weer geregenereerd tot de oorspronkelijke molecule (Figuur 70).

Figuur 70: De waterstofacceptor NAD

5.2.4. Energieleverende reacties Er zijn 4 types van katabolische energieleverende reacties: 1. AĂŤrobe respiratie of aĂŤrobe afbraak: finale elektronenacceptor is O2 (chemoheterotroof). 2. Fermentatie of vergisting (chemo-heterotroof). 3. Anaerobe respiratie of anaerobe afbraak: finale elektronenacceptor = anorganische verbindingen (chemo-heterotroof). 4. Energie door directe oxidatie van anorganische verbindingen (chemo-autotroof).

Bij de chemo-heterotrofen is de energie afkomstig van de oxidatie van organische verbindingen en heel vaak zijn dit de koolhydraten. De afbraak van de hoogmoleculaire koolhydraten (poly-

113

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

, oligo-, tri- en disacchariden) begint met hun splitsing door hydrolyse tot monosacchariden zoals vb. glucose. De verdere afbraak van monosacchariden, zoals glucose, kan op verschillende manieren plaatsvinden. De bekendste is de Embden-Meyerhof-pathway of glycolysis (Figuur 71), waarbij 1 mol glucose uiteindelijk wordt omgezet tot 2 mol pyrodruivenzuur. Dit proces speelt zich zowel af onder aërobe als onder anaërobe omstandigheden. De brutoreactie is 1 mol glucose  2 mol pyrodruivenzuur + 2 mol ATP + 2 mol NADH + 2H+

114

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 71: Glycolyse of Embden-Meyerhof-pathway

115

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

5.2.4.1. De aërobe respiratie Bij de aërobe respiratie wordt het via de glycolyse gevormde pyrodruivenzuur verder omgezet tot “actief acetaat” (acetyl-CoA) en vervolgens wordt het acetyl-CoA volledig “verbrand” via een keten van reacties in de zgn. citroenzuurcyclus of Krebscyclus of tricarbonzuurcyclus (TCA-cyclus) (Figuur 72).

Figuur 72: De verbranding van pyruvaat tot acetyl-CoA en de citroenzuur- of Krebscyclus

De elektronen, die in de glycolyse, in de verbranding van pyrodruivenzuur tot acetyl-coenzym-A en in de citroenzuurcyclus aan de substraten worden onttrokken ten gevolge van oxidatiereacties, worden via de zgn. elektronentransportketen of ademhalingsketen (Figuur 73) overgedragen aan zuurstof. Deze transportketen begint met het co-enzym NADH of

NADP(H) en eindigt met de cytochromen.

116

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 73: De elektronentransportketen (van de aërobe respiratie)

De moleculen waaruit deze keten bestaat, worden door het elektronentransport steeds afwisselend in geoxideerde en gereduceerde toestand gebracht, waarbij de vrijkomende energie wordt opgeslagen in ATP. De elektronentransportketen gebeurt bij prokaryoten ter hoogte van het celmembraan, terwijl bij eukaryote cellen dit op het binnenste membraan van de mitochondriën plaatsgrijpt.

5.2.4.2. De anaërobe respiratie Bij bacteriën met een aërobe respiratie worden de elektronen aan het einde van de elektronentransportketen overgedragen op moleculaire zuurstof. Sommige bacteriën kunnen deze elektronen echter bij afwezigheid van zuurstof overdragen op anorganische verbindingen, zoals nitraat, sulfaat en carbonaat. Dit proces benoemen we als anaërobe afbraak of anaërobe respiratie. De anaërobe respiratie is niet hetzelfde als de fermentatie (zie 5.2.4.3). Bij de fermentatie komt er geen elektronentransportketen aan te pas en wordt een kleinere hoeveelheid energie gevormd. De bacteriën die in staat zijn tot anaërobe respiratie, kunnen als volgt in groepen worden verdeeld: 

de denitrificerende bacteriën (facultatief anaëroob), die nitraat via nitriet reduceren tot moleculaire stikstof (nitraatreductie);

117

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------

de sulfaatreducerende bacteriën, die sulfaat, thiosulfaat of sulfiet reduceren tot H2S of sulfide (sulfaatreductie); deze bacteriën zijn, in tegenstelling tot de denitrificerende bacteriën, obligaat anaëroob. Voorbeelden hiervan zijn de bacteriën van de geslachten Desulfovibrio en Clostridium.



de methanogene of methaanproducerende bacteriën, die carbonaat reduceren tot methaan vb. Methanobacterium. Elektronen acceptor

Producten

NO3–

NO2–, N2 + H2O

SO42–

H2S + H2O

CO32 –

CH4 + H2O

5.2.4.3. Fermentatie Onder anaërobe omstandigheden kan het pyrodruivenzuur, gevormd via het EmbdenMeyerhof-schema, omgezet worden tot vele verschillende eindproducten, zoals azijnzuur, melkzuur, mierenzuur, barnsteenzuur, ethanol, butaandiol, butanol, propionzuur, boterzuur en aceton, samen met de gassen CO2 en H2. Het fermentatieproces resulteert in minder moleculen ATP en is dus energietisch gezien minder interessant voor de microbiële cel. Dit anaëroob proces wordt vergisting of fermentatie genoemd (Figuur 74).

Figuur 74: Enkele gekende fermentatieprocessen

118

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Twee bekende fermentatieprocessen zijn de melkzuurfermentatie door melkzuurbacteriën en de alcoholfermentatie door gisten.

MELKZUURFERMENTATIE Sommige

melkzuurbacteriën

zetten

pyrodruivenzuur

geheel

tot

melkzuur

(homofermentatieve melkzuurvergisting) volgens onderstaande reactie:

COOH

| C=O

| + NADH2 

HC-OH

CH3

Pyrodruivenzuur

Melkzuur

NAD

Figuur 75: De homofermentatieve melkzuurfermentatie

Wordt door melkzuurbacteriën uit pyrodruivenzuur voornamelijk melkzuur gevormd, maar ook gassen en andere zuren, dan noemt dit heterofermentatieve melkzuurvergisting.

ALCOHOLFERMENTATIE Vooral de gist Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist/brouwersgist) is hiervoor gekend. De gist zet de glucose om in ethanol en CO2. Deze fermentatie vindt zijn toepassing bij de productie van bier, wijn en brood.

Figuur 76: De alcoholfermentatie

119

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

5.2.4.4. Oxidatie van anorganische verbindingen Bij sommige bacteriën kan de energie die nodig is voor de levensverrichtingen van de cel, worden verkregen door de oxidatie van anorganische verbindingen, zoals H2, CO2, NH3, NO2-, Fe2+, H2S, S en S2O32- (chemo-autotrofe dissimilatie). De elektronen die aan deze verbindingen worden onttrokken, worden via de elektronentransportketen overgebracht op zuurstof. De meeste chemo-autotrofe organismen zijn aëroob. Ze gebruiken CO2 als C-bron.

Enkele voorbeelden van chemo-autotrofe bacteriën: 

de nitrificerende bacteriën (komen algemeen voor in bodems, water en afvalwater, en oxideren ammonium tot nitraat):



2 NH3 + 3 O2  2 NO2- + 2 H+ + 2 H2O

Nitrosomonas

2 NO2- + O2  2 NO3-

Nitrobacter

de knalgasbacteriën: 2 H2 + O2  2 H2O



Hydrogenomonas

de kleurloze zwavelbacteriën (deze bacteriën gebruiken waterstofsulfide (H2S), elementair zwavel (S) of thiosulfaat (S2O32-) als energiebron, en kunnen groeien in zeer zure omgeving pH<2) :



2 H2S + O2  2 S + 2 H2O

Beggiatoa

S + 3 O2 + 2 H2O  2 H2SO4

Thiobacillus thiooxidans

de ijzerbacteriën: 4 Fe2+ + 10 H2O + O2  4 Fe(OH)3 + 8 H+

Leptospirillum ferrooxidans

5.2.5. Biosynthetische of energieconsumerende reacties Veel micro-organismen kunnen anorganische C-verbindingen assimileren (d.i. opbouw tot celbestanddelen), mits ook organische C-verbindingen aanwezig zijn (heterotrofe microorganismen). Worden deze anorganische verbindingen echter als enige C-bron gebruikt, dan noemt men deze organismen autotroof ten opzichte van koolstof.

120

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

5.2.5.1. Chemotroof

Figuur 77: Opbouw van koolhydraten

121

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 78: Opbouw van eiwitten

Figuur 79: Opbouw van vetten

122

Microbiologie H5: Metabolisme ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

5.2.5.2. Fototroof FOTO-AUTOTROFE MICRO-ORGANISMEN In wieren wordt koolstofdioxide uit de lucht als enige C-bron met behulp van licht als energiebron omgezet in suikers: 6 CO2 + 6 H2O + licht  C6H12O6 + 6 O2 Het licht dat de energie levert voor deze fotosynthese, wordt opgevangen door de groene chlorofylkleurstoffen. Er zijn ook verschillende groepen foto-autotrofe bacteriën, die onderling o.a. verschillen in de aard van de gebruikte elektronendonors en in de aard van de chlorofylachtige pigmenten. De cyanobacteriën gebruiken net als wieren water als elektronendonor (dus reductiemiddel) voor de fixatie van CO2. Hierbij wordt uit water zuurstof gevormd. Sommige cyanobacteriën alsook de purpere en groene zwavelbacteriën (Chromatiaceae resp. Chlorobiaceae) voeren een eenvoudiger fotosyntheseproces uit. Water kan hierbij niet als elektronendonor fungeren en er wordt dan ook geen zuurstof gevormd. In plaats daarvan kunnen gereduceerde zwavelverbindingen, zoals H2S (zwavelwaterstof), als elektronendonor optreden. 6 CO2 + 12 H2S + licht  C6H12O6 + 6H2O + 12S

FOTO-HETEROTROFE BACTERIËN (informatief) Deze gebruiken licht als energiebron en bouwen hun cel vooral uit organische substraten (vb. azijnzuur) op. Bij sterk gereduceerde organische substraten (vb. ethanol) is kooldioxide als extra koolstofbron nodig. Die purperbacteriën die overwegend foto-heterotroof zijn, werden ondergebracht in de familie Rhodospirillaceae. Wat betreft pigmenten en fijnstructuur zijn er geen grote verschillen met de purperen zwavelbacteriën. Vele Rhodospirillaceae groeien weliswaar het best foto-heterotroof, maar kunnen daarnaast ook wel foto-autotroof groeien met waterstof, of in sommige gevallen met thiosulfaat of ook zwavelwaterstof als elektronendonor. Omgekeerd kunnen diverse Chromatiaceae (= zwavelbevattende purperbacteriën) ook fotoheterotroof gekweekt worden. De meeste Rhodospirillaceae zijn facultatief chemoheterotroof; zij kunnen aëroob in het donker groeien, waarbij de verademing van organische substraten de benodigde energie oplevert.

123

Microbiologie H6: MicrobiĂŤle ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

6. MicrobiĂŤle ecologie 6.1. Mineralisatie en de C-, N- en S-cyclus De groei en het leven van de meeste planten is enkel mogelijk door de opname van anorganische (minerale) stoffen. (Figuur 80) Om blijvend over minerale verbindingen te kunnen beschikken moet de voorraad voortdurend aangevuld worden. Dit is enkel mogelijk wanneer, bij het afsterven van planten en dieren, de organische stoffen waaruit ze zijn opgebouwd, terug worden afgebroken tot de oorspronkelijke minerale verbindingen. Als dusdanig moet de stof in de natuur een kringloop of cyclus ondergaan. De afbraak van organische stoffen tot anorganische noemt men mineralisatie.

Figuur 80: Relatie tussen producenten, consumenten en de afbraakprocessen in een ecosysteem

124

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

6.1.1. Mineralisatie van organische verbindingen De mineralisatie van de organische stoffen, waaruit planten en dieren zijn opgebouwd, geschiedt door inwerking van micro-organismen, hoofdzakelijk bacteriën en fungi. Deze zijn van nature uit saprofyten wat betekent dat ze zich enkel kunnen ontwikkelen op dode organismen of op dode organische stoffen zoals hout, papier, uitwerpselen, melk, enz. De energie die bij de afbraak vrijkomt, wenden ze aan voor hun levensverrichtingen. Saprofytische bacteriën en fungi leven vooral in de bodem en in water. Van grote betekenis zijn sommige saprofytische bacteriën die leven in het darmkanaal van herkauwers. Zij vormen het enzym cellulase en daardoor kunnen de herkauwers een celluloserijke voeding (gras!) verwerken. Ook in het spijsverteringskanaal van de mens is een rijke bacteriënflora aanwezig.

Het voedsel dat van planten- en dierenresten afkomstig is, bestaat meestal uit complexe verbindingen: cellulose, lignine, vetten, zetmeel, eiwitten, pectinestoffen, cutine, chitine, enz. Voor al deze verbindingen zijn er soorten bacteriën of fungi die ze als voedingsstoffen kunnen verwerken. De complexe verbindingen worden veelal eerst, zoals in het spijsverteringsproces, enzymatisch gesplitst

eenvoudige

verbindingen.

verteringsproducten

worden

stofwisselingsreacties betrokken en de afbraakproducten die hierbij ontstaan zijn verbindingen die weer door andere organismen als voedingsstoffen of als grondstoffen gebruikt kunnen worden. Het gehele chemische afbraakproces wordt rotting of vertering genoemd. Het resultaat van de totale afbraak is dat in een reeks van biochemische reacties eenvoudige anorganische verbindingen en ionen gevormd worden: CO2, H2O, NH3, NH4+, NO2-, NO3-, H2S, SO42-, CO e.a. Anorganische ionen uit dieren (vb. in urine) en uit planten (uitloging van ionen uit de cellen van afgestorven plantedelen) komen rechtstreeks in de bodem of in het water terecht vb.: SO42, PO4-, Mg2+, Ca2+, K+ enz. De gehele omzetting heet ook mineralisatie. Aldus komen anorganische ionen en koolstofdioxide opnieuw ter beschikking van de autotrofe groene planten.

De biochemische omzettingen van de vele verbindingen uit planten en dieren zijn nog niet alle volledig gekend. De plantenresten bestaan vooral uit cellulose, lignine, pectinestoffen en eiwitten. De dierenresten bevatten vooral veel eiwitten en vetten.

125

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Cellulose komt met afgestorven plantendelen in grote hoeveelheden op de bodem terecht. Resten van waterplanten zakken in het slijk. De afbraak van cellulose gebeurt zowel door aërobe

als

door

anaërobe

organismen

(bacteriën,

schimmels,

straalschimmels,

myxobacteriën). De aërobe afbraak geschiedt in hoofdzaak door schimmels en heeft een belangrijk aandeel in de humusvorming. Zij is eveneens zeer intens in mesthopen. De anaërobe afbraak treedt op in moerassen, in modder van grachten en vijvers enz. Het zijn vooral bacteriën die hieraan meewerken. Bij de afbraak ontstaan organische zuren (azijnzuur, melkzuur enz.), waterstofgas en koolstofdioxide. Azijnzuur wordt door bepaalde bacteriën gesplitst in koolstofdioxide en methaan (moerasgas). Methaangas en waterstofgas kunnen weer door andere bacteriën verwerkt worden. De celluloseaantasting gaat samen met het losmaken van de cellen die door pectinestoffen aaneengekit zijn. Talrijke bacteriën zijn bij deze pectine-afbraak betrokken (o.a. Bacillus macerans, Clostridium pectinivorum). Zij spelen een belangrijke rol in de vlasroting. Over de aantasting van lignine en cutine is weinig gekend. Het zijn zeer resistente verbindingen die een belangrijk deel uitmaken van humus. De bladskeletten die men in de herfst vindt, wijzen erop dat lignine moeilijk aangetast wordt: de bladmoescellen, die vooral cellulose bevatten, worden vlug verteerd, de verhoute xyleemcellen niet. Bij de afbraak van zetmeel zijn verschillende schimmels (Mucor spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., Rhizopus spp.), straalschimmels en bacteriën (Bacillus subtilis, Bacillus macerans) betrokken. De afbraak van eiwitten gaat over peptiden en aminozuren. Zij kan zowel aëroob als anaëroob gebeuren. Allerlei micro-organismen werken aan de eiwitafbraak mee: bacteriën (Clostridium spp., Bacillus subtilis, Proteus spp.), schimmels (Saprolegnia spp. in water), straalschimmels (Streptomyces spp.). Bij deze afbraak ontstaan koolstofdioxide en zogenaamde secundaire rottingsproducten: NH3 (ammonificatie), H2S, methylmercaptaan, cresol. Deze verbindingen geven de karakteristieke geur aan rottingsprocessen (lijkgeur, mesthopen e.d.). De eiwitten worden in het dierenlichaam afgebroken tot stikstofhoudende verbindingen die in de urine teruggevonden worden (vb. ureum en urinezuur). Deze producten worden vervolgens door ureumbacteriën ontbonden. Zowel in de bodem als in het water hebben dieren (wormen, insecten,…) een actief aandeel in de afbraakprocessen. Zij breken niet alleen de organische planten- en dierenresten chemisch af maar zij zorgen ook voor een mechanische verkleining waardoor de uitwerpselen gemakkelijker door bacteriën en schimmels aangetast worden.

126

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

In de bodem is het de gemeenschappelijke actie van dieren, schimmels en bacteriën die leidt tot de vorming van humus. Dank zij hun activiteiten komen de koolstof-, stikstof- en waterstofatomen opnieuw ter beschikking van de autotrofe planten in een opneembare vorm. In het water verloopt het mineralisatieproces op dezelfde manier als in de bodem. De organische resten van planten en dieren of de afvalstoffen in rioolwater worden eerst door bacteriën en schimmels gedeeltelijk verwerkt tot eigen celmateriaal en gedeeltelijk gesplitst in eenvoudige, oplosbare organische en anorganische verbindingen. Protozoa voeden zich met deze verbindingen en met de bacteriën. Op hun beurt worden de ééncelligen gegeten door kleine schaaldieren die als voedselbron voor vissen dienen. Sommige dieren (aasdieren), zoals mossels, voeden zich rechtstreeks met organische afvalstoffen. Dankzij dergelijke voedingsketens worden de organische resten en de bacteriën, die schadelijk kunnen zijn voor de mens, uit het water verwijderd (biologische reiniging). Door verdere zuiveringen kan dergelijk water tot drinkwater omgevormd worden.

6.1.2. Koolstofcyclus Het meest essentiële element voor de vorming van organische verbindingen is per definitie koolstof. Autotrofe planten betrekken deze onder de vorm van de minerale verbinding CO2 uit de lucht. Hieruit ontstaan achtereenvolgens plantaardige en dierlijke organische verbindingen. Het continu onttrekken van CO2 aan de lucht veronderstelt een even continue aanvulling, wat trouwens bevestigd wordt door het min of meer constant blijven van het CO2-gehalte in de lucht gemiddeld 0,03 volume-% (0,6 mg per liter lucht). De kringloop met betrekking tot CO2 wordt aangeduid als de koolstofcyclus (Figuur 81).

(1) CO2 in de lucht wordt door foto-autotrofe planten en algen opgenomen. Door fotosynthese wordt het omgezet tot sacchariden (suikers, zetmeel, cellulose) terwijl andere biosynthesen het ontstaan geven aan eiwitten, lipiden, enz. Globaal genomen betekent dit de omzetting van CO2 tot plantaardig gebonden koolstof.

(2) Planteneters nemen de plantaardige koolstofverbindingen op en bouwen ze om tot koolstofverbindingen eigen aan hun organisme, zo vb. plantaardig zetmeel tot dierlijk zetmeel (glycogeen). Dit betekent het ontstaan van dierlijk gebonden koolstof.

(3) Vleeseters betrekken de koolstof uit organische verbindingen van dierlijke oorsprong. Na ombouw blijven uiteraard verbindingen van die aard behouden. 127

Microbiologie H6: MicrobiĂŤle ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

(4) Door de ademhaling van planten en dieren wordt weer CO2 aan de atmosfeer vrijgegeven.

Figuur 81: Koolstofcyclus

(5) De resten van afgestorven planten en dieren ondergaan een mineralisatieproces dat naargelang de omstandigheden volledig of slechts gedeeltelijk kan verlopen. Is het proces volledig dan ontstaan uitsluitend minerale verbindingen waarbij de koolstof omgezet wordt tot CO2. Bij gedeeltelijke mineralisatie heeft men naast de ongewijzigde resten een complex van nieuwe organische verbindingen en minerale stoffen. Dit geheel is humus waarvan de afzetting het ontstaan geeft aan veenlagen. Humus bestaat vooral uit resten van plantaardige oorsprong.

(6) Door de inwerking van grondwater en onder druk van de afzettingsgesteenten, kan humus omgevormd worden tot turf en bruinkool. Hoge druk en een relatief hoge temperatuur ingevolge aardplooiingen kunnen de afscheiding van koolstof bewerken en tot de vorming van steenkool leiden. Zoals gekend geeft de verbranding hiervan weer het ontstaan aan CO2.

128

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

(7) Hoofdzakelijk plantaardige maar ook dierlijke resten afgezet op de zeebodem ondergaan daar rotting (ontbinding) waarbij andere organische verbindingen ontstaan die een sliklaag vormen, sapropelium (= rottingsslib; Gr. sapros = rottend, pèlos = slijk) genoemd. In sommige gevallen wordt dit sapropelium bedekt door een laag afzettingsgesteenten. Ondergaat deze steenlaag een plooiing zodat een hoge druk heerst, dan kan het omgezet worden tot

aardolie

aardgas.

Bij

aanwending

van

aardolieproducten

(hoofdzakelijk

koolwaterstoffen) en aardgas als brandstof, keert ook langs deze weg een enorme hoeveelheid CO2 terug in de atmosfeer.

(8) Een hoeveelheid CO2 uit de lucht wordt door de regen opgenomen. Dit CO2-houdende regenwater lost de kalksteen (CaCO3) uit de bodem op, in overeenstemming met de reactievergelijking: CaCO3 + CO2 + H2O  Ca(HCO3)2 Ca-carbonaat

Ca-waterstofcarbonaat

onoplosbaar in water

oplosbaar in water

Hierbij ioniseert het oplosbare waterstofcarbonaat: Ca(HCO3)2  Ca2+ + 2 HCO3Deze reacties zijn omkeerbaar zodat in de zee het evenwicht heerst CaCO3 + CO2 + H2O  Ca2+ + 2 HCO3Zeeorganismen (koralen, ééncelligen, weekdieren,...) bouwen uit de ionen in oplossing hun schelpen of skeletten van CaCO3 op waarbij CO2 vrijkomt (evenwicht verplaatst zich naar links).Bij het afsterven, verhoogt dit de voorraad aan CaCO3 in de zee. Stijgt het CO2-gehalte in de lucht dan lost een gedeelte op in het zeewater en wordt het door de voorraad aan CaCO3 gebonden tot HCO3--ionen (evenwicht verplaatst zich naar rechts). Daalt het CO2-gehalte in de lucht dan verplaatst zich dit evenwicht weer naar links zodat CO2 vrijkomt. Dit is de regularisatie van het CO2-gehalte langs de zee.

6.1.3. Stikstofcyclus Stikstof behoort tot de onmisbare elementen in het leven van planten en dieren. Het is immers noodzakelijk voor de synthese van eiwitten. Met ± 80 % N2 in de lucht zou men geneigd zijn te denken dat lucht de belangrijkste stikstofbron vormt voor plant en dier. Dit is echter niet het geval. Op weinig uitzonderingen na (stikstofgasfixerende bacteriën - vleesetende planten) betrekken de planten het element N onder de vorm van minerale verbindingen uit de bodem (hoofdzakelijk nitraten, eventueel o.a. ook NH4-verbindingen). Om een tekort hieraan te 129

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

voorkomen moet die voorraad voortdurend aangevuld worden hetzij langs natuurlijke weg, hetzij langs kunstmatige weg (bemesting). Dieren nemen enkel organische N-verbindingen op (eiwitten), gevormd door planten of afkomstig van dierlijke organismen. Dit alles veronderstelt weer een kringloop, stikstofcyclus (Figuur 82) genoemd.

Figuur 82: Stikstofcyclus

(1) Stikstofgas uit de lucht kan, langs natuurlijke weg, in gebonden toestand in de bodem terecht komen op twee manieren. 1a. Door elektrische ontladingen (bliksem) kunnen stikstofgas en zuurstofgas, beide in de lucht aanwezig, gebonden worden tot stikstofoxide (NO). Stikstofoxide wordt door de aanwezige luchtzuurstof spontaan tot stikstofdioxide (NO2) geoxideerd. De stikstofoxiden komen in de bodem terecht door de regen waarbij het water meteen zorgt voor de omzetting tot nitraat- en nitrietionen (NO3- en NO2-) 2NO2 +H2O  HNO3 + HNO2 1b. Sommige micro-organismen (stikstofgasfixerende bacteriën) in de bodem kunnen vrij stikstofgas fixeren en met behulp van sacchariden die ze betrekken uit andere levende organismen, zo eiwitten vormen. Wanneer ze afsterven worden deze eiwitten gemineraliseerd. Het zijn dergelijke bacteriën die voorkomen in de wortelknolletjes van 130

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

vlinderbloemigen (lupine, boon, erwt, klaver,...). Via deze bacteriën kunnen die planten vrij stikstofgas binden en later door ammonificatie de bodem verrijken aan nitraten. In de bodem komen ook vrijlevende stikstofgasfixerende bacteriën voor die zo de aanvoer van stikstof in de kringloop bewerkstelligen.

(2) Met de nitraten uit de bodem als stikstofbron en met de sacchariden, die ze zelf opbouwen, eventueel ook gebruik makend van S, P, e.a. verbindingen, synthetiseren de planten eiwitten. Dit biochemisch proces komt dus neer op de omzetting van mineraal gebonden stikstof tot organisch gebonden stikstof.

(3) Plantenetende dieren nemen planten op als voedsel en bekomen langs die weg organisch gebonden stikstof (eiwitten) en bouwen ze om tot verbindingen eigen aan hun organisme (dierlijke eiwitten). Deze vormen dan op hun beurt een bron van eiwitten voor de vleeseters.

(4) De afbraak van eiwitten van afgestorven planten en dieren leidt weer tot de mineralisatie van de organische N-verbindingen. Hierbij ontstaan achtereenvolgens NH3 (NH4+) (ammonificatie), NO2- en NO3- (nitrificatie). In de bodem wordt uit het vrijkomende ammoniak

bijna

onmiddellijk

ammoniumzouten

gevormd

(vooral

carbonaten

waterstofcarbonaten) en dankzij de negatief geladen bodemcolloïden blijft het NH4+-ion gemakkelijk vastgehouden. Deze ammoniumzouten kunnen rechtstreeks opgenomen worden door de groene planten maar meestal ondergaan zij nitrificatie en worden de NO3--ionen opgenomen. Het negatieve nitraation wordt niet geadsorbeerd aan de bodemcolloïden en wordt gemakkelijk met het regenwater uitgeloogd.

(5) Bij de eiwitstofwisseling in dierlijke organismen worden de stikstofhoudende afbraakproducten, hoofdzakelijk ureum, CO(NH2)2, afgescheiden via de urine. In de bodem wordt dit door bacteriële werking omgezet tot NH3 (NH4+) en zo door nitrificatie omgevormd tot NO3-.

(6) Anaërobe denitrificerende bacteriën zullen nitraten afbreken waarbij vrij stikstofgas ontstaat. Aangezien die stikstof niet door planten kan opgenomen worden keert ze terug in de atmosfeer. Hierdoor wordt de grond steeds armer aan stikstofverbindingen zodat men spreekt van denitrificatie van de bodem.

131

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De stikstofverliezen worden echter biologisch, en in cultuurgronden opzettelijk, gedekt. Het belangrijkste biologisch proces waardoor het nitraatgehalte in de bodem verhoogd wordt, is de stikstofgasfixatie door bacteriën in de knolletjes van vlinderbloemigen. Daarnaast komen er over de gehele wereld heterotrofe, vrijlevende bacteriën voor in de bodem, die in staat zijn om stikstofgas te binden in stikstofverbindingen, de zgn. vrijlevende stikstofgasfixerende bacteriën. De best gekende zijn Azotobacter spp. (Gram(-) aëroob, o.a. Azotobacter chroococcum) en Clostridium spp. (anaëroob, o.a. Clostridium pasteurianum). Hun activiteit is sterk afhankelijk van de minerale samenstelling en van de pH van de bodem. Het opgenomen stikstofgas wordt met behulp van energie uit de ademhalingsprocessen gereduceerd tot NH3 dat dan in aminozuren en vervolgens in eiwitten verwerkt wordt. Na afsterven van de bacteriën wordt de eiwitstikstof, na ammonificatie en nitrificatie, tot nitraatstikstof omgezet. Het is mogelijk dat levende bacteriën ook eenvoudige organische stikstofverbindingen uitscheiden die door de hogere planten opgenomen kunnen worden.

Figuur 83: Microbiële omzettingen in de stikstofcyclus

In cultuurgronden ten slotte worden de stikstofverliezen in belangrijke mate gedekt door natuurlijke en kunstmatige meststoffen. Om een bemesting doeltreffender te maken worden meststoffen voorgesteld die trager het ammonium vrijstellen (b.v. ureum via urease omgezet in NH4+) zodat geen overtollige nitraathoeveelheden kunnen ontstaan die wegspoelen of denitrificatie ondergaan. 132

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

6.2. Bodemmicrobiologie 6.2.1. Microbiële diversiteit in de bodem De bodem is niet alleen de standplaats voor de planten, maar ook de woonplaats van dieren: en micro-organismen, die met miljoenen per ha voorkomen. Zowel voor wat het aantal als voor wat de werking betreft, zijn de belangrijkste echter de microorganismen (bacteriën en schimmels). Het zijn vooral de micro-organismen die van de bodem een levend complex maken; samen met de opname van de voedingsstoffen door de plantenwortels, zijn de omzettingen door de micro-organismen zeer ingewikkelde verschijnselen. Het gewicht van de levende organismen (bodemdieren + micro-organismen) in de bovengrond wordt geschat op 25.000 kg/ha (N.B. het totale gewicht van 20 cm vochtige bovengrond is ongeveer 3.000.000 kg/ha. Van de micro-organismen (20.000 kg/ha) zijn de bacteriën (10.000 kg/ha) de belangrijkste (Tabel 10). Tabel 10: Aantal en gewicht van micro-, meso- en macro-organismen in de bovenste 15 cm van een akkerland (gematigde streken) Aantal Microflora (µm)

Gewicht kg/ha

Per g grond

Bacteria

6x108

104

Fungi

4x105

104

Algae

104

140

Microfauna (<100 µm) Rhizopoda (wortelpotigen)

Per 1000 cm3 grond 15x108

370

5x103

Flagellata (flagellaten) Ciliata (wimperdiertjes) Nematoda (aaltjes) Mesofauna (100 µm – 1 cm)

Per 1000 cm3 grond

Acari (mijten)

150

Collembola (springstaarten)

200

Enchytreida (borstelwormen)

Macrofauna (> 1 cm)

Per 1000 cm3 grond

Arthropoda: o.a. Insecta, Araneae (spinnen)

Gastropoda (slakken)

Lumbricidae e.a. (aardwormen)

4000

Talpidae (mollen)

133

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Nuttige bodembacteriën zijn de humificerende bacteriën (Bacillus spp., Cellulomonas,…) die het organische afval door mineralisatie opruimen (saprofyten), de nitrificerende bacteriën (Nitrosomonas: NH4+  NO2- en Nitrobacter: NO2-  NO3-) en N-fixerende bacteriën (de vrij levende Azotobacter, ca. 10-30 kg N/ha/jaar, en Rhizobium, ca. 40-200 kg N/ha/jaar). De meeste schadelijke bodembacteriën zijn anaëroob, en zetten de organische stof om in schadelijke, giftige verbindingen. De denitrificerende bacteriën zetten de nitraten om in ammonium (Pseudomonas: NO3-  NH4+) en verder in N2. Schimmels (10.000 kg/ha) kunnen de overhand nemen in het ontbindingsproces wanneer de omstandigheden ongunstig zijn voor de humusvormende bacteriën, nl. als de grond te zuur is of als lucht en water in een slechte verhouding aanwezig zijn. Bodemschimmels komen o.a. voor op de wortels van de gewassen en veroorzaken aanzienlijke schade, vooral bij kiemplantjes, vb. voetziekten bij graangewassen (vooral tarwe) en smeulziekten bij tuingebouwgewassen (sla, bonen,…).

Ze ontwikkelen zich bij lage

temperatuur en hoge vochtigheidsgraad. Wieren zijn van geringe betekenis in de landbouw. In de tuinbouw komen ze meer voor. De groenwieren veroorzaken het zogenaamde ‘groen’ op de stam van de fruitbomen en op de bloempotten en hun teelaarde.

Ook de hydroteelt kan te lijden hebben aan overdadige

algengroei.

6.2.2. Beïnvloeding van het bodemleven De aantallen en soorten bodemorganismen lopen sterk uiteen in verschillende grondsoorten. Belangrijke factoren die hierop invloed hebben, zijn: 

voeding, vooral organisch materiaal:



vocht;



zuurgraad;



temperatuur;



aëratie;



algemene bodemgesteldheid;



ingrepen door de mens.

Een goed bodemleven is over het algemeen te verwachten op niet te droge, humeuze, neutraal tot zwak alkalisch reagerende gronden die regelmatig van vers organisch materiaal worden voorzien. Dit zijn gronden waarop ook de hogere planten het beste groeien.

134

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Voor een goed bodemleven wordt vooral op bouwland te weinig organische bemesting toegepast en ligt het land te lang kaal. Grasland heeft een veel beter bodemleven. Bij vochtgebrek kunnen sommige organismen zich inkapselen, vb. wormen en vele bacteriën. Wormen kunnen ook naar diepere vochtiger lagen uitwijken. Op voortdurend droge gronden neemt het bacterieleven echter sterk af en komen vooral de schimmels tot ontwikkeling. Op gronden met een lage pH komen de voor de omzetting van organische stof belangrijke bacteriën en actinomyceten weinig voor, terwijl het aantal schimmels veel groter is dan op alkalische gronden. Op zure zandgronden ontstaan dan ook in het bos vaak dikke strooisellagen. Met de volgende menselijke ingrepen wordt het bodemleven beïnvloed en wordt vaak een min of meer natuurlijk evenwicht verstoord: •

cultuurmaatregelen;

•

toevoer van bodemorganismen;

•

specialisatie van bedrijfsvoering;

•

grondontsmetting en gebruik van chemische bestrijdingsmiddelen;

•

toevoer van zware metalen.

Cultuurmaatregelen zoals ontwatering, bemesting, bekalking, beregening, zijn over het algemeen gunstig voor het bodemleven; ploegen en schoffelen zijn daarentegen minder gunstig (waarom?). Toevoer van bodemorganismen is in ons land geen normale cultuurmaatregel. Wanneer de omstandigheden gunstig worden voor het bodemleven, komt dit meestal wel ‘vanzelf’ op gang. Meestal zijn er wel kiemen aanwezig in bermen, houtwallen of percelen in de buurt. In de Zuiderzeepolders, waar vóór de inpoldering geen wormen waren, is gebleken dat na enten van wormen deze zich snel verspreiden en het aantal per m2 snel toeneemt. Specialisatie op akker- en tuinbouwbedrijven betekent, dat op eenzelfde perceel vaak eenzelfde gewas terugkomt. In deze enge vruchtwisseling nemen de aantallen schadelijke organismen sterk toe omdat de waardplanten te vaak terugkomen. De ‘bodemmoeheid’ veroorzaakt door cystenaaltjes in de aardappelteelt is een bekend gevolg hiervan. Door grondonderzoek kan vastgesteld worden of de grens van het aantal aaltjes waarbij schade kan worden verwacht, reeds is bereikt. Door grondontsmetting kan het aantal schadelijke micro-organismen sterk worden verminderd. Ook andere bodemorganismen lopen dan echter in aantal sterk terug. Men merkt dit aan de grote hoeveelheid dode biomassa die na vertering een extra stikstofeffect geeft. Dit laatste is mede het gevolg van een sterk verminderde nitrificatie na ontsmetting. Hierdoor wordt 135

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

minder stikstof uitgespoeld. Het jaar volgend op grondontsmetting kan dan ook op stikstofmest worden bespaard. Wanneer de giftige stof is uitgewerkt en afgebroken, herstelt het bodemleven zich meestal snel. Dit is ook het geval hij de meeste chemische bestrijdingsmiddelen en vele andere ‘bodemvreemde’ stoffen die in de grond zijn terechtgekomen. Hoe rijker in aantal en soorten het bodemleven is, des te sneller en beter deze afbraak gaat. Men spreekt wel van de ‘bioveerkracht’ van de grond. Er is echter toch wel vastgesteld dat vb. in boomgaarden die veel bespoten worden, weinig wormen in de grond voorkomen. Zware metalen die in de grond terecht komen worden niet afgebroken door het bodemleven. Ze hopen zich dus op en kunnen bij hoge concentratie vergiftigend werken op bodemorganismen en planten en uiteindelijk ook op mens en dier. Gevaren dreigen o.a. van het koper in varkensmest, en diverse zware metalen in stadsvuilcompost, afvalwaterzuiveringsslib en industrieafval. Er is vb. al fosfaatgebrek geconstateerd bij maïs doordat de bacteriën die fosfaten omzetten niet meer functioneren als gevolg van het hoge kopergehalte in de grond.

6.3. Symbiose Bij de parasitaire levenswijze onttrekt de ene partner gronden voedingsstoffen aan de andere, waardoor deze in mindere of meerdere mate schade ondervindt. Organismen van verschillende aard kunnen echter ook een eenheid vormen waarbij de beide partners voordeel hebben. Een dergelijke samenleving wordt symbiose genoemd en de partners symbionten. Naarmate de symbiose beter onderzocht werd, werd vastgesteld dat de symbionten naast gronden voedingsstoffen ook plantenhormonen aan elkaar onttrekken. De vijf grote groepen organismen (bacteriën, fungi, wieren, hogere planten en dieren) kunnen verschillende soorten combinaties vormen. 

Een korstmos is een symbiose van wieren en fungi.



Bacteriën die in de darm van herkauwers, houtetende insecten, of in de menselijke darm leven, vormen een symbiose met hun gastheer.



Symbiontische groei van 2 bacterietypes wordt protocoöperatie genoemd.



Alleen het samenleven van bacteriën, wieren of fungi met hogere planten wordt hier verder besproken. Bacteriën, schimmels en wieren die in het plantenweefsel van een hogere plant leven, worden endofyten genoemd.

136

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

6.3.1. Samenleving van bacteriën met hogere planten De bacteriën leven hetzij in de bladeren, hetzij in de wortels van de hogere plant. Men vermoedt dat de bacteriën noodzakelijke plantenhormonen vormen die de plant niet zelf kan synthetiseren. Dit is vergelijkbaar met sommige bacteriën die in het spijsverteringskanaal van dieren onontbeerlijke vitaminen voor hun gastheer vormen. 4.3.1.1. Rhizobium met vlinderbloemigen Deze symbiose is de samenleving van bacteriën met de wortels van vlinderbloemigen. Deze endofyten zijn, naargelang de soort vlinderbloemige, één of andere soort van het geslacht Rhizobium en omdat ze knolletjes doen ontstaan op de wortel van de plant, noemt men ze ook wortelknolletjesbacteriën (aërobe, G-, beweeglijke staafjes). Over deze symbiose wordt al lange intensief onderzoek verricht met het oog op de landbouwkundige en ecologische belangen die aan dit proces verbonden zijn (Figuur 84).

Rhizobiumbacteriën kunnen wortelharen van de plant infecteren en van daaruit wortelknolletjes vormen. In zo’n knolletje kunnen ze atmosferische stikstof uit de lucht fixeren en er vervolgens ammonium uit vormen. 

De plant profiteert daarvan, omdat ammonium dat op deze manier in de plant beschikbaar komt, benut wordt voor de synthese van aminozuren.



De bacterie van haar kant profiteert van de symbiose met de plant, omdat de plant de energie levert die de bacterie nodig heeft voor de stikstofbinding: de planten leveren 10 tot 30 % van alles wat ze door fotosynthese produceren onder de vorm van sucrose aan de wortelknolletjes met de bacteriën.

De planten zorgen bovendien voor een noodzakelijke lage zuurstofdruk. Dit is nodig omdat het nitrogenase-enzym, dat voor de stikstofbinding zorgt, erg zuurstofgevoelig is. Onder normale omstandigheden is noch de plant, noch de bacterie (als vrijlevend organisme) tot stikstofbinding in staat. In reinculturen van Rhizobium is pas stikstofbinding mogelijk onder nauwkeurig

ingestelde

micro-aërofiele

(lager

dan

atmosferische

zuurstofspanning)

omstandigheden. Gebleken is dat Rhizobium een zekere hoeveelheid zuurstof nodig heeft ten behoeve van zijn aëroob energiemetabolisme, terwijl aan de andere kant het voor stikstoffixatie verantwoordelijke enzymcomplex (nitrogenase) door sporen zuurstof geïnactiveerd wordt. In de wortelknolletjes zorgt het zuurstofbindend eiwit leghemoglobine voor een laag maar constant niveau van de vrije zuurstof waardoor aan de tegenstrijdige eisen met betrekking tot 137

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

de zuurstofvoorziening kan worden voldaan. Hoewel dit rode, ijzerhoudende eiwit altijd in gezonde, stikstoffixerende wortelknolletjes wordt aangetroffen, is noch de plant, noch de bacterie in staat het eiwit in afwezigheid van de partner te produceren. Vorming ervan wordt geïnduceerd door interactie tussen beide organismen.

Al in de oudheid werd opgemerkt dat vlinderbloemigen (klaver, luzerne, lupinen, bonen, goudenregen, brem enz.) op een N-arme bodem, zelfs op een heel onvruchtbare zandbodem, kunnen groeien. Graangewassen die verbouwd worden op dergelijke bodems na onderspitten van vlinderbloemigen, zogenaamde groenbemesting, geven een zeer hoge opbrengst. In een akker die gedurende 15 jaar braak bleef liggen, bedroeg het nitraatgehalte van de bodem 0,027 %. Nadat die akker gedurende 15 jaar met lupinen beplant werd en stikstofvrije meststoffen kreeg, steeg het gehalte tot 0,087%, driemaal zoveel. Uit studies blijkt dat in een luzerneveld ongeveer 50 g N2 per m2 per jaar gefixeerd wordt.

Mechanisme van de wortelknolvorming De stikstofverrijking van de bodem is het gevolg van de activiteit van de Rhizobium-bacteriën. Het zijn aërobe bacteriën die als saprofyt vrijlevend in de meeste bodems voorkomen. Zij kunnen zich via flagellen bewegen. Indien zich in de bodem een vlinderbloemige plant ontwikkelt, dringen de bacteriën langs de wortelharen de wortel binnen en vermeerderen er zich ten koste van de wortelweefsels. In dit stadium zijn zij parasitair. Een gedeelte ervan wordt verteerd en de eiwitten van de bacteriën vormen een eerste stikstofbron voor de plant. Nadien reageert de wortel door een sterke groei van de geïnfecteerde plaatsen en er worden macroscopisch zichtbare wortelknolletjes gevormd. Het geleidingsweefsel vormt vertakkingen naar het knolletje toe; de bacteriën vermenigvuldigen zich sterk. In dit stadium worden de knolletjes volwassen en begint de symbiose. De bacteriën onttrekken water, zouten en sacchariden aan de plant. Zij nemen stikstofgas op uit de lucht die in de bodem en in de intercellulairen aanwezig is en reduceren het tot ammonium, waaruit door de plant dan aminozuren gesynthetiseerd kunnen worden. Deze aminozuren dienen voor de aanmaak van eiwitten, zowel voor de bacteriën als voor de plant. De gevormde organische stikstofverbindingen kunnen langs verscheidene wegen in de bodem komen: door rechtstreekse uitscheiding van aminozuren, door afsterven van knolletjes en van gehele planten en, in cultuurgronden, door het omploegen van de planten. Deze verbindingen

138

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

ondergaan dan ammonificatie en nitrificatie waardoor het gehalte aan opneembare stikstof in de bodem toeneemt.

Slechts bepaalde soorten planten ontwikkelen gespecialiseerde wortelknolletjes die nodig zijn voor stikstofbindende bacteriën. De juiste afstemming van plant en bacterie komt tot stand door middel van het uitwisselen van chemische verbindingen. De plantenwortel synthetiseert een bepaalde flavonoïde stof die bindt aan een receptoreiwit in een compatibele Rhizobiumbacterie, waardoor genen in de bacteriële cel geactiveerd worden. Een aantal van deze geactiveerde genen zorgt voor de vorming van een specifiek polysaccharide (“nod factor”). Compatibele planten herkennen deze chemische verbinding en initiëren veranderingen in de wortel die leiden tot de vorming van knolletjes om de bacteriën heen.

Figuur 84: Symbiose van wortelknolletjesbacteriën met vlinderbloemigen

139

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Het bezit van stikstofgasfixerende micro-organismen maakt de vlinderbloemige planten in zekere mate onafhankelijk van het stikstofgehalte van de bodem zodat zij kunnen gedijen op arme heide- en zandbodems. Er bestaan ook vrijlevende stikstofgasfixerende bacteriën zowel in zuurstofrijke als in zuurstofarme bodem. In de strikte zin kunnen wij hier niet van symbiose spreken. Toch is hun betekenis voor de andere planten gelijkaardig. 4.3.1.2. Andere vormen van endofytische symbiose Er zijn nog andere gevallen van endofytische symbiose gekend: blauwwieren (o.a. Anabaena spp.) die symbiotisch leven met levermossen, cycadeeën en watervarens; blauwwieren die deel uitmaken van korstmossen; straalschimmels (Frankia spp.) en nog onbekende endofyten die leven in de wortel van de els (met knolletjesvorming), de gagel en de duindoorn. Niet alleen in de wortels maar ook in de bladeren van hogere planten komen symbiontisch levende bacteriën voor. De fyllosfeer (het bladoppervlak) bevat in het algemeen een specifieke microflora. De samenstelling van deze flora verschilt van die in de bodem en bestaat voornamelijk uit saprofytische (heterotrofe) bacteriën, zoals Erwinia herbicola en Pseudomonas syringae. Deze laatste kan vorstschade aan planten toebrengen. Wanneer de temperatuur beneden het vriespunt daalt, zal het water op het bladoppervlak onderkoeld raken en pas bevriezen bij temperaturen flink onder het vriespunt. Zijn echter P. syringae cellen op het blad aanwezig, dan treden deze als kern voor de vorming van ijskristallen op. Een specifieke component in het buitenmembraan van deze bacterie is daarvoor verantwoordelijk. Een mogelijke aanpak voor de bestrijding van hierdoor optredende vorstschade is het gebruik van zogeheten "ice-minus" mutanten, die de bewuste verbinding niet meer maken, en waarmee vorstgevoelige cultuurgewassen kunnen worden beënt.

6.3.2. Zwamwortelsymbiose (Mycorrhiza’s) In de bodem leven verscheidene soorten fungi. Sommige zijn saprofyten, andere leven parasitair ten koste van plantenweefsels en vernietigen de planten (wortelrotzwammen). Vele andere dringen de wortels van planten binnen en leven in symbiose ermee. De wortel kan dan in sommige gevallen een bijzondere structuur vertonen die men zwamwortel of mycorrhiza noemt. Mycorrhizae zorgen voor een betere opname door de plant van nutriënten en water, dragen bij aan het transport van metabolieten en groeiregulatoren van plant tot plant, en bieden bescherming tegen wortelpathogenen. Voor de fungus is het belangrijkste voordeel dat deze door de plant van een organische koolstof- en energiebron wordt voorzien. Men onderscheidt

140

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

ectotrofe en endotrofe zwamwortelsymbiosen. In het eerste geval vormen de zwamdraden een witte mantel rond de wortel en zij dringen hoogstens tussen de cellen van de epidermis in de schors. De wortelharen ontbreken en de opneming van water en zouten gebeurt doorheen de mantel. Bij de den vb. zijn de zwamwortels vorkvormig vertakt.

Ectotrofe zwamwortelsymbiose komt voor bij sparren, lorken, berken, beuken en vele andere bomen. De zwammen (vnl. Basidiomyceten) zijn veelal boleten, amanieten, melkzwammen, en soms vormt één soort een symbiose met slechts één of met slechts enkele bomen (gele ringboleet met lork, berkenboleet en baardige melkzwam met berk, vliegezwam met dennen en berken, bruine ringboleet met naaldbomen, rosse boleet met berk en ratelpopulier). De massale ontwikkeling van paddestoelen in de herfst zou o.a. in verband staan met de afvoer van grote hoeveelheden sacchariden naar de wortels van de bomen.

De endotrofe zwamwortelsymbiose komt veel vaker voor; ze wordt aangetroffen bij meer dan 90 % van de landplanten, soms bij bomen maar vooral bij niet-houtige gewassen waaronder grassen en vele voedselgewassen, zoals maïs, tarwe, uien, tomaten en vlinderbloemigen. In dit geval leven de zwamdraden in de cellen van de wortel en staan in verbinding met het milieu. Zij werd vooral bestudeerd bij orchideeën en heidekruidachtigen. Naarmate de zwamdraden zich ontwikkelen in de wortel worden zij verteerd. Over de fysiologie van de zwamwortelsymbiose is nog maar weinig geweten. Zaden van orchideeën hebben weinig reservevoedsel en kunnen alleen in de aanwezigheid van bepaalde schimmels ontkiemen. Deze bezorgen het kiemplantje sacchariden, aminozuren, enzymen en plantenhormonen. In volwassen toestand kunnen de orchideeën zonder de schimmels leven, alhoewel men ze bij onderzoek steeds aantreft.

Dennen vormen geen zwamwortels als gemakkelijk opneembare stikstof-, fosfor-, kalium- en calciumzouten in de bodem ter beschikking staan. Waar dit niet het geval is, vb. in zure humusbodems, worden ze wel gevormd. Hetzelfde geldt voor heidekruid, dopheide en bosbes. Men meent dan ook dat de schimmels afvalstoffen uit de bodem enzymatisch verteren en de verteringsproducten doorgeven aan de hogere planten. Dit zou vooral gelden voor eiwitten en fosforverbindingen. In ruil krijgt de schimmel sacchariden en plantenhormonen van de autotrofe plant. In het geval van het vogelnestje (orchidee) en het stofzaad (afvalplant uit de heide familie) worden alle organische verbindingen door de schimmels geleverd.

141

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 85: Zwamwortels bij een orchidee (Neottia): links: doorsnede van de worteltop (de grijze cellen bevatten de zwamdraden); rechts: detail van deze cellen (de zwamdraden zijn duidelijk zichtbaar)

Figuur 86: Enkele mycorrhiza-types

6.3.3. Planteneters en hun pensflora Bij de niet-herkauwer volgt de belangrijkste microbiële werking na de spijsverteringsenzym activiteit van het dier; bij de herkauwer daarentegen gaat een intensieve microbiële werking vooraf aan de darmenzymen. Het maagcomplex van een rund is een fermentatieruimte van 100 à 200 liter; het paard bevat een maagvolume van ongeveer 10 liter en caecum en dikke darm van ca. 120 liter. 142

Microbiologie H6: Microbiële ecologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Het spijsverteringskanaal van de koe bestaat uit vier opeenvolgende magen, waarvan de pens de grootste is. Deze heeft als belangrijkste taak cellulose en andere plantaardige koolhydraatpolymeren (zetmeel, xylaan, pectine, fructosaan) af te breken. De pens is te beschouwen als een kweekvat (circa 100 liter) waarin de micro-organismen in semi-continue cultuur groeien. Het fijngekauwde gras wordt in de pens gemengd met een enorme hoeveelheid speeksel (100-200 liter per dag) waarin fosfaat (PO43-), bicarbonaat (HCO3-) en ureum voorkomen, maar hydrolytische enzymen ontbreken. Verder biedt de pens een omgeving met een constante temperatuur (37-39°C) en zorgen samentrekkingen van de penswand voor een zekere mechanische menging van de inhoud. Deze omstandigheden maken de pens tot een aantrekkelijke habitat voor uiteenlopende soorten (anaërobe) micro-organismen. In de pens (bevat ca. 1010 bacteriën/ml, 105 protozoa/ml) van de herkauwers evenals in de blinde darm van de andere planteneters krioelt het van ééncelligen, vnl. wimperdiertjes en bacteriën. Deze protisten voeden er zich met plantaardige, organische verbindingen. Een groot deel van deze ééncelligen wordt door het grotere dier verteerd, waardoor zij een extra eiwitbron vormen. Tevens worden bepaalde polysacchariden, o.a. cellulose, hoofdzakelijk dank zij de enzymen van de protisten omgezet tot monosacchariden en vervolgens tot vetzuren (vnl. azijnzuur, propionzuur en boterzuur) + methaan, CO2, N2, H2, H2S (± 900 l gasproductie/dag). De anaërobe afbraak van cellulose door bacteriën in de pens maakt het herkauwers, zoals de koe, mogelijk op een celluloserijk dieet (gras) te leven. Zoogdieren zijn niet in staat het enzym cellulase te vormen. De koe groeit in feite vooral op de lagere vetzuren die bij de gisting gevormd worden. De organische zuren passeren de wand van de pens en komen in het bloed terecht. De koe gebruikt deze verbindingen als koolstof- en energiebron. De micro-organismen in de pens zorgen ook voor de vorming van essentiële aminozuren en vitaminen. Microbiële biomassa die met de voedselresten via de lebmaag wordt afgevoerd, wordt afgebroken waarbij aminozuren en vitaminen beschikbaar komen voor absorptie in de dunne darm.

143

Microbiologie H7: Taxonomie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

7. TAXONOMIE, NOMENCLATUUR EN IDENTIFICATIE 7.1. Taxonomie en identificatie De taxonomie houdt zich bezig met de ordening van micro-organismen en heeft als doel het na bestudering volgens een vast systeem herkennen en indelen van nieuwe geïsoleerde microorganismen. Micro-organismen met overeenkomstige eigenschappen worden gegroepeerd en gescheiden van deze met verschillende eigenschappen. De taxonomie, de wetenschap van de classificatie - het proces om organismen in te delen in verwante of gerelateerde groepen, met als doel deze gemakkelijk te kunnen identificeren en te bestuderen - omvat twee belangrijke subdisciplines: 

identificatie: het proces om organismen in te delen bij een bepaalde groep;



nomenclatuur: een systeem van naamgeving aan organismen.

Om een micro-organisme te karakteriseren en te identificeren zijn diverse technieken bruikbaar/beschikbaar,

waaronder

microscopisch

onderzoek,

cultuurkarakteristieken,

biochemische testen, en DNA-analyse (nucleïnezuuranalyse). Welke testen en combinaties best gebruikt worden is afhankelijk van het te onderzoeken micro-organisme.

De micro-organismen werden in eerste instantie, in navolging van de indeling van planten en dieren, ingedeeld volgens een hiërarchisch systeem in verschillende groepen of taxa. Hierbij is het domein de hoogste vorm van een biologisch taxon, gevolgd door de rijken. Biologen groepeerden de levende wezens vroeger in 5 rijken: Plantae (planten), Animalia (dieren), Fungi, Protista (Protisten) en de Monera (prokaryoten). Later werd echter duidelijk dat de vijf rijken niet weergaven hoe het leven op aarde ontstaan en geëvolueerd was. In tegenstelling tot die 5 rijken, heeft het cellulair leven op aarde zich ontwikkeld langs drie belangrijke evolutionaire lijnen, domeinen genoemd. Twee van de drie domeinen (Bacteria en Archaea) zijn zuiver microbieel van aard en bevatten enkel prokaryote cellen, het derde domein bevat de Eukaryoten (Eukarya) (Figuur 87). Intussen werd de indeling in 5 rijken verder uitgebreid naar 6 rijken: Eubacteria, Archaebacteria, Protista, Fungi, Plantae en Animalia. De laagste taxonomische eenheid is de soort (species); een aantal soorten worden ondergebracht in één geslacht (genus), een aantal geslachten in één familie. Dit loopt verder via orde, klasse en afdeling (phylum) ten slotte uit op het niveau van rijk en domein.

144

Microbiologie H7: Taxonomie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 87: De universele fylogenetische boom van het leven

Het opsporen van genetische verwantschap bij prokaryoten is moeilijker dan bij planten en dieren. Niet alleen hebben prokaryoten minder verschillen in grootte en vorm, tevens ondergaan ze geen seksuele reproductie. Bij hogere organismen zoals planten en dieren is de basis taxonomische eenheid, een species, en deze wordt gewoonlijk beschouwd als een groep van morfologische gelijke organismen met de mogelijkheid via het onderling kruisen om vruchtbare nakomelingen op te leveren. Dit kan niet worden toegepast bij prokaryoten waardoor dit de classificatie moeilijk maakt.

In eerste instantie werden micro-organismen ingedeeld op grond van morfologische en cultuurkenmerken - cultuurkenmerken zijn de morfologische eigenschappen van een microorganisme op of in vloeibare of vaste voedingsbodems - zoals: 

vorm en grootte van de cellen tijdens hun levenscyclus;



de aan- of afwezigheid van flagellen en de wijze waarop die aan de cel zijn gehecht;



de vorm van de kolonie die van de cultuur is verkregen op een vaste voedingsbodem.

Aangezien bacteriën vroeger het meest in de belangstelling stonden en veel kleiner van afmetingen zijn dan schimmels, gisten, protozoën en wieren, had men voor de bacteriën al gauw

145

Microbiologie H7: Taxonomie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

behoefte aan meer kenmerken, zoals de Gramkleuring en biochemische eigenschappen (vb. vergisting van diverse organische verbindingen zoals glucose, lactose, citraat, zetmeel,...). De klassieke bacteriĂŤle taxonomie steunt traditioneel dan ook op wat genoemd wordt de fenotypische eigenschappen van de bacteriecel: deze omvatten hoe een bacterie eruit ziet, zijn energiemetabolisme, zijn enzymen en andere eigenschappen (Tabel 11, Figuur 88 en Figuur 89). Door van een ongekende bacterie verschillende van deze fenotypische kenmerken te bepalen, kan al de verzamelde informatie gebruikt worden om het organisme te identificeren tot op een bepaald niveau vb. speciesniveau.

Tabel 11: Enkele fenotypische kenmerken van taxonomische waarde Soort

Testen

I. Morfologie II. Beweeglijkheid III. Voeding en fysiologie

Vorm, afmetingen, gramreactie, organisatie van flagellen indien aanwezig Beweeglijk via flagellen, via glijden, via gasvesikels, niet beweeglijk Mechanisme van energie-omzetting (fototroof, chemo-organotroof); zuurstofbehoefte, invloed van temperatuur en pH op groei, zoutvereisten/tolerantie; vermogen om verschillende C-,N-,S-bronnen te gebruiken

IV. Andere factoren

Pigmenten, pathogeen karakter, antibioticagevoeligheid

Figuur 88: Klassieke identificatiesleutel voor Gram-positieve bacteriĂŤn

146

Microbiologie H7: Taxonomie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 89: Klassieke identificatiesleutel voor Gram-negatieve bacteriën

Met de ontwikkelingen in de moleculaire biologie en de genetica raakt men naast de fenotypische eigenschappen ook geïnteresseerd in 1) Genetische eigenschappen Genetische eigenschappen of de samenstelling van het DNA als kenmerk bij de taxonomie, omdat het fenotype van het organisme uiteindelijk is terug te voeren tot het genotype. Een belangrijke eigenschap hierbij is de GC-verhouding, gedefinieerd als het percentage van guanine en cytosine in het DNA van een organisme. Het percentage van het complementaire basenpaar cytosine + guanine (c + g) is voor elke bacteriesoort binnen bepaalde grenzen constant en daardoor karakteristiek. 2) Moleculaire eigenschappen De moleculaire taxonomie of chemotaxonomie deelt de micro-organismen in op basis van moleculaire analyses van één of meer celbestanddelen (DNA, eiwitten, vetzuren,…). a. De DNA-gebaseerde methoden omvatten genomische hybridisatietechnieken zoals DNA-DNA hybridisatie en DNA-RNA hybridisatie, PCR-gebaseerde methoden zoals DNA-fingerprinting technieken (vb. RAPD-PCR), de DGGE-techniek (denaturing

gradient

gelelectroforese),

DNA-sequencing

het

rRNA-

oligonucleotide-onderzoek (16S rRNA sequencing, ribotyping) (zie deelOLOD biotechnologie). b. Eiwitgebaseerde methoden

147

Microbiologie H7: Taxonomie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

c. Vetzuuranalyse of FAME (fatty acid methylester)-analyse: karakterisatie van de types en verhoudingen van vetzuren aanwezig in het cytoplasmatisch membraan en buitenmembraanlipiden (Gram-). d. Immunologische methoden: gebaseerd op de specifieke antigen-antilichaamreactie (serologie)

Figuur 90 toont een samenvattend overzicht van een aantal mogelijke identificatiestappen.

Figuur 90: Een aantal mogelijke identificatiestappen bij bacteriën

Binnen een bepaalde bacteriesoort (of species) kan nog variatie van eigenschappen optreden. Op basis van serologische bepalingen, waarbij men antigene eigenschappen vaststelt, kunnen subtiele verschillen in een gegeven soort worden onderscheiden; men spreekt dan van serotypes of serovars. Wil men nog fijnere verschillen waarnemen, dan kan soms gebruik worden gemaakt van de zgn. faagtypering, waarbij een bepaald bacteriofaagtype alleen zeer specifieke stammen binnen een soort aantast. Men spreekt in dat geval van faagtypen. Types die verschil in biochemische reacties vertonen maar toch duidelijk tot eenzelfde soort behoren, noemt men biotypes of biovars. Morfotypen of morfovars verschillen in hun morfologische en structurele karakteristieken. De kleinste eenheid die we in een soort kunnen onderscheiden, noemen we een stam of een isolaat. Een stam is een cultuur, die uit één cel is ontstaan.

148

Microbiologie H7: Taxonomie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

7.2. Nomenclatuur Net als bij die van planten en dieren wordt bij de naamgeving van micro-organismen gebruik gemaakt van de zgn. binomiale nomenclatuur volgens Linnaeus. Elke soort bezit twee Latijnse namen, die internationaal zijn overeengekomen en worden toegepast. De eerste naam is de geslachtsnaam, die met een hoofdletter begint; de daaropvolgende soortnaam begint met een kleine letter vb. Escherichia coli. Bacteriennamen worden steeds schuin (cursief of italic) gedrukt. Naast de wetenschappelijke naam wordt ook wel eens de triviale naam gebruikt. Zo spreekt men wel van pneumococ en colibacterie. De familienaam eindigt altijd op -aceae, zoals vb. Enterobacteriaceae, de naam van een orde op -ales, zoals Eubacteriales.

7.3. Taxonomie van de schimmels De fungi vormen een grote groep van ca. 130 000 bekende soorten (en tal van onbekende soorten), bevatten geen chlorofyl en vertonen een heterotrofe levenswijze. Sommige leven saprofytisch op rottend plantaardig en dierlijk materiaal, anderen parasitisch. De classificatie of taxonomie van de schimmels is in de eerste plaats gebaseerd op morfologische kenmerken, zoals het vermogen om geslachtelijke sporen te vormen. In de modernere taxonomische indeling kunnen 5 hoofdphyla van fungi onderscheiden worden:

perfecte fungi

Chytridiomyceten

Zygomyceten

Ascomyceten

Basidiomyceten

Fungi Imperfecti (Deuteromyceten)

lagere schimmels

hogere schimmels

CHYTRIDIOMYCETEN De vertegenwoordigers van deze klasse zijn de meest primitieve soorten onder de schimmels. Deze lagere schimmels hebben geen echte hyfen.

ZYGOMYCETEN Ze hebben coenocytische hyfen zonder septa. Het mycelium, een stevig vertakt cellenstelsel, bestaat uit een meerkernige, ĂŠĂŠncellige massa van cytoplasma zonder tussenwanden. In tegenstelling tot de overige klassen worden bij de Zygomyceten de ongeslachtelijke sporen gevormd in een zakvormig lichaam, dat sporangium wordt genoemd. De meeste soorten komen in het water voor, terwijl een relatief kleine groep in de grond aanwezig is.

149

Microbiologie H7: Taxonomie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De in water voorkomende schimmels van deze klasse vormen in het zygosporangium beweeglijke sporen (zoösporen), die op hun beurt op een andere plaats weer uitgroeien tot een nieuw sporangium met een wortelachtig mycelium (rhizoïden) in of op het substraat. De in de grond voorkomende schimmels van deze klasse vormen, net als de overige schimmels, onbeweeglijke sporen, eveneens in een sporangium. Typische voorbeelden van deze groep zijn de geslachten Rhizopus en Mucor. Rhizopus nigrificans is de gewone zwarte broodschimmel.

Opm. Oömycten zijn een groep die vroeger onder de schimmels geklasseerd werden maar eigenlijk geen schimmels zijn. Vele zijn, vooral onder vochtige omstandigheden, erg schadelijk voor de planten en leven als parasiet, o.a. Phytophtora infestans (verwekker van de aardappelziekte) en Plasmopara viticola (verwekker van de valse meeldauw). Anderen zijn niet rechtstreeks verantwoordelijk voor een ziekte maar verzwakken de plant zodanig dat deze weer gevoeliger worden aan secundaire infecties.

ASCOMYCETEN (zakjeszwammen) De geslachtelijke sporen van deze klasse worden gevormd in een zakvormige cel (ascus), bestaande uit normaal 8 ascosporen (endosporen). De ongeslachtelijke sporen ontstaan vrij aan de uiteinden van de hyfen. In het mycelium zijn tussenwanden aanwezig, want dit bestaat uit een aantal cellen. Naargelang de bouw van de ascocarp en de ascus worden een 6-tal subklassen onderscheiden. Ook deze groep herbergt veel fytopathogenen, o.a. de meeldauwschimmels Erisipha en Spaerotheca. Nectria verwekken kankerziekten bij bomen en Claviceps purpurea is de moederkorenschimmel. Ook de truffels behoren tot deze groep.

BASIDIOMYCETEN (steeltjeszwammen) Dit is de grote groep van de zogenaamde paddestoelen (Figuur 91). Het vruchtlichaam (basidium of basidiocarp) dat wij de paddestoel noemen, is een bovengrondse uitgroei van het mycelium. De basidia zijn sporendragende cellen met 4 exosporen (basidiosporen) op steeltjes. De geslachtelijke sporen (basidiosporen) van deze klasse ontstaan dus uitwendig. Ongeslachtelijke sporen worden zelden gevormd, terwijl het (meercellige) mycelium meestal in of op het substraat aanwezig is. Het vegetatieve gedeelte (mycelium) wordt dus aan ons oog onttrokken, omdat het zich onder de grond bevindt. Het vruchtlichaam met de geslachtelijke sporen geeft boven de grond het typische beeld van een paddestoel.

150

Microbiologie H7: Taxonomie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 91: Basidiomyceten

DEUTEROMYCETEN (FUNGI IMPERFECTI) Dit is een heterogene groep van schimmels, waarbij tot dusverre geen geslachtelijke sporen zijn waargenomen. Indien bij een dergelijke schimmelsoort geslachtelijke voortplanting zou worden geconstateerd, dan zou deze worden ondergebracht bij de Ascomyceten of Basidiomyceten. Ze kunnen tegenwoordig aan de hand van rRNA-analyse in een overeenkomstige groep worden geplaatst. Bekende geslachten uit deze klasse zijn Aspergillus, waarvan de ongeslachtelijke sporen (conidia) radiaal rondom een rond uiteinde van een speciale hyfe (conidiofoor) worden gevormd, en Penicillium, waarvan de ongeslachtelijke sporen als penseelachtige clusters worden gevormd. Andere bekende geslachten zijn Fusarium, Oospora, Cladosporium, Alternaria, Botrytis en Monilia.

7.4. Taxonomie van de gisten Bij de taxonomie van de gisten worden eveneens behalve morfologische en culturele ook biochemische kenmerken in de indeling betrokken.

Onder de Ascomyceten, Basidiomyceten en Deuteromyceten van de schimmels zijn groepen, gisten genaamd, die het vermogen om mycelium te vormen voor het grootste deel hebben verloren en ĂŠĂŠncellig zijn geworden. Zij onderscheiden zich ook van de schimmels door: 151

Microbiologie H7: Taxonomie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------

de ongeslachtelijke vermeerdering door knopvorming of splijting in plaats van door sporenvorming;



het vermogen tot het uitvoeren van een aantal chemische omzettingen, die als regel bij schimmels niet worden waargenomen; in het bijzonder de omzetting van suikers in ethanol en kooldioxide, de zgn. suikervergisting.

De gisten worden analoog aan de schimmels - in eerste instantie ingedeeld in geslachtelijkesporenvormende en niet-sporenvormende gisten en worden als regel aangeduid als sporogene, resp. asporogene gisten. De bij de gisten waargenomen geslachtelijke sporen worden - evenals die van sommige schimmels gevormd in een cel, ascus genaamd. Dergelijke sporen noemt men ascosporen. Het systematisch classificeren van de gisten bereikt men overigens niet meer hoofdzakelijk langs morfologische weg, doch veeleer met behulp van biochemische kenmerken. De voornaamste hiervan zijn het al of niet vergisten, resp. assimileren van suikers, zoals glucose, fructose, lactose, raffinose en maltose of van polyalcoholen, zoals mannitol en sorbitol. Men onderscheidt drie groepen: 1. ascosporogene gisten, o.a. de geslachten Saccharomyces en Pichia; 2. basidiosporogene gisten: enkele geslachten, die tot de Basidiomycetes behoren; 3. asporogene gisten, o.a. de geslachten Candida, Rhodotorula, Brettanomyces. Tot de ascosporogene gisten behoren o.a. de geslachten Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Hansenula, Endomycopsis en Saccharomycodes. Tot de asporogene gisten behoren o.a. de geslachten Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Rhodotorula en Torulopsis.

7.5. Taxonomie van de bacteriën Tegenwoordig worden de bacteriën, op grond van celwandopbouw, celmembraanlipidesamenstelling en de volgorde van het 16S-rRNA (een type RNA dat voorkomt in ribosomen) verdeeld in 2 grote groepen (Figuur 92): 

BACTERIA (of “echte” bacteriën): hiertoe behoren de Gramnegatieven, de Grampositieven, de Cyanobacteriën, de Mycoplasmas, de Rickettsiae, en de Chlamydiae. Meer dan 80 fyla van Bacteria zijn momenteel gekend. Figuur 7.4 toont de belangrijkste fyla binnen deze groep.



ARCHAEA: de lipiden van hun celwand zijn heel anders dan die van de Eubacteriën. Tevens ontbreekt het kenmerkende muraminezuur in hun peptidoglycaanlaag.

Hiertoe

behoren

methaanbacteriën,

thermofiele 152

Microbiologie H7: Taxonomie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

zwavelbacteriën en extreem halofiele bacteriën. De “Oerbacteriën” te beschouwen als de 1ste levende micro-organismen op aarde: komen voor o.a. in heetwaterbronnen, S-bronnen; extreme omstandigheden aangaande temperatuur, druk en chemische samenstelling.

Figuur 92: Belangrijkste fyla van Bacteria gebaseerd op 16S ribosomaal RNA gensequentie

7.6. Taxonomie van de virussen Geheel anders ligt het met de classificatie van virussen. Het onderscheid dat aanvankelijk tussen virussen werd gemaakt, berustte op het type weefsel waarin zij zich vermeerderen en op de soort verschijnselen die ze veroorzaken. Bij de moderne classificatie spelen deze kenmerken nog slechts een geringe rol: nu op basis van DNA/RNA-nucleïnezuur (enkel- of dubbelstrengig), vorm (symmetrisch, schroefvormig), opbouw eiwitmantel, aanwezigheid membraan (enveloppe). Zoals vroeger met bacteriën worden in oudere classificatie systemen de virussen ingedeeld volgens de ziekte die ze veroorzaken, zoals poliomyelitis en poliomyelitis virus. Modern worden virussen ingedeeld volgens hun structurele bouwelementen: 

type nucleïnezuur;



grootte en symmetrie van het kapsel;



aanwezigheid of afwezigheid van een enveloppe;



plaats van assemblage binnen de gastheercel (nucleus of cytoplasma).

153

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

8. INDUSTRIËLE MICROBIOLOGIE 8.1. Inleiding Micro-organismen spelen een belangrijke rol bij tal van industriële processen. Algemeen kunnen microbiële processen in 5 grote groepen worden ingedeeld, afhankelijk van de functie die micro-organismen hierbij vervullen: 1.

microbiële celproductie: processen, waarbij micro-organismen die in een cultuurmedium zijn gegroeid, het product vormen. De cellen worden hierbij uit het cultuurmedium geoogst en eventueel gezuiverd.

metabolietenproductie: processen, waarbij metabolieten die tijdens de groei van micro-organismen in een cultuurmedium zijn gevormd, het product vormen. Hieronder vallen ook verbindingen die van nature niet in de stofwisseling van het organisme voorkomen, maar die ontstaan door een kleine chemische wijziging van een aan het cultuurmedium toegevoegde verbinding, zoals bij de steroïden. De metabolieten of de ontstane verbindingen worden geïsoleerd en eventueel gezuiverd door fysische en/of chemische methoden.

enzymproductie

gefermenteerd product: processen, waarbij het cultuurmedium zelf na groei van micro-organismen het product vormt.

omzetten van afvalproducten

Biotechnologie is het gebruik van levende organismen of onderdelen van organismen met als doel waardevolle producten te maken. Het woord biotechnologie bestaat uit twee delen: bio, dat aangeeft dat het met leven te maken heeft en technologie, dat laat zien dat er menselijke vaardigheid en kennis aan te pas komt. Biotechnologie betekent dus eigenlijk dat de mens een handeling uitvoert met een (deel van een) organisme, zodat er een waardevol product ontstaat. Biotechnologie is te onderscheiden in twee delen: 

klassieke biotechnologie waarbij het genetisch materiaal van het gebruikte organisme niet veranderd wordt.



moderne biotechnologie, of gentechnologie, waarbij het genetisch materiaal van het gebruikte organisme wel is veranderd. Via recombinant DNA-technologie is het mogelijk snel de genetische eigenschappen van organismen te wijzigen om gewenste/betere kenmerken te verkrijgen. 154

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

8.2. Het fermentatieproces Traditioneel verliepen de gewenste microbiële processen bij veel gefermenteerde voedingsmiddelen als gevolg van de natuurlijk aanwezige micro-organismen (spontane fermentatie) of door het uitgangsproduct te enten met een klein gedeelte van het reeds gefermenteerde product (back slopping). Omdat bij deze traditionele manier van enten de kwaliteit en kwantiteit van het eindproduct sterk varieerde, wordt tegenwoordig de voorkeur gegeven aan meer gecontroleerde fermentatieprocessen, waarbij zorgvuldig geselecteerde stammen (starterculturen of starters) geënt worden in een steriel cultuurmedium (vloeibaar of vast) zodat andere, eventueel aanwezige, micro-organismen de fermentatie niet kunnen verstoren.

Voor het al of niet slagen van een fermentatieproces zijn de eigenschappen van de gebruikte micro-organismen essentieel. Zijn het geleide fermentatieprocessen dan moeten de stammen op laboratoriumschaal worden uitgetest, voordat ze op industriële schaal worden toegepast. Er zijn een aantal methoden om stammen te verbeteren (vb. voor het verkrijgen van een hogere opbrengst): 

conventionele mutatietechnieken zijn die waarbij mutatie-inducerende agentia (radioactieve straling, UV-licht en verschillende chemische stoffen) worden gebruikt om de genen van het micro-organisme te veranderen zodat toevallig een beter producerende stam ontstaat;



moderne, genetische recombinatietechnieken; zoals protoplastenfusie, inbouwen van DNA-stukken.

De keuze van een cultuurmedium is wellicht bijna even belangrijk als het soort microorganisme dat de fermentatie uitvoert. Een vereenvoudigde chemische vergelijking voor een cultuur van micro-organismen is: Cellen + C + (O2) + N + groeifact. + E  meer cellen + product + warmte + H2O + (CO2) Het

kweekmedium

bevat

goedkope

grondstoffen,

dikwijls

bijproducten

van

voedingsmiddelenindustrie: b.v. maïsweekwater (afvalstroom bij de productie van zetmeel en suikerstropen), melasse, wei. De micro-organismen in een fermentor krijgen hun stikstof meestal in de vorm van zouten, zoals ammoniumsulfaat en ammoniumacetaat, of als ureum. Verder krijgen ze mineralen zoals fosfor, magnesium en andere sporenelementen.

155

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De industriële toepassing van micro-organismen vereist vaak het werken met grote hoeveelheden cultuurmedium in grote fermentoren (> 200 m3) (Figuur 93). Deze fermentors moeten bij geleide fermentaties zodanig geconstrueerd zijn, dat de best mogelijke procesomstandigheden kunnen worden gecreeërd en ze moeten steriliseerbaar zijn. Dat betekent dat men ervoor moet zorgen dat de fermentor en het medium zelf steriel zijn en blijven. Dit houdt vb. in dat, indien onder strikt aërobe omstandigheden moet worden gefermenteerd, steriele gereinigde lucht (via filters) in het cultuurmedium moet worden geblazen. Het bij het microbiële metabolisme vrijkomende kooldioxide wordt met behulp van de overtollige zuurstofarme lucht weer uit de fermentor geleid. Hoewel de luchtbelletjes in het medium zorgen voor een zekere menging van de microorganismen in de vloeistof, is deze menging in sommige gevallen niet voldoende, vooral indien het organisme veel zuurstof nodig heeft. In dat geval en ook in de gevallen, waarbij geen lucht of een ander gas wordt ingeblazen, wordt een roermechanisme in de fermentor gebouwd. Het steriel houden van de fermentor houdt ook in dat er op een steriele manier monsters, ter controle van het proces, moeten kunnen worden genomen. Indien door een vloeistof in een fermentor lucht wordt geleid, treedt in veel gevallen schuimvorming op, waardoor het proces kan worden gestoord; vandaar dat in die gevallen een antischuimmiddel moet worden toegevoegd of het schuim langs mechanische weg moet worden verwijderd. Om de procesomstandigheden zoveel mogelijk in de hand te houden, wordt soms de temperatuur van het medium binnen bepaalde grenzen constant gehouden. Ook de pH van het medium kan voortdurend worden gecontroleerd en geregeld; een mechanisme zorgt ervoor dat, indien bijvoorbeeld de pH tijdens de fermentatie zakt (zuurvormende micro-organismen), automatisch een alkalische oplossing aan het medium wordt toegevoegd om de pH weer op de oorspronkelijke waarde terug te brengen (pH-stat fermentaties). Tot nu toe hebben we uitsluitend gesproken over discontinue (of “batch”-gewijze) fermentaties, waarbij een groot volume in een gesloten cultuurvat wordt geënt en er geen voedingsstoffen toegevoegd worden of stofwisselingsproducten afgevoerd worden en waarbij de fermentatie pas wordt beëindigd, wanneer de maximumopbrengst is verkregen. Er bestaan echter ook continue fermentaties, waarbij vers cultuurmedium hetzij continu, hetzij met regelmatige tussenpozen wordt toegevoegd tijdens de fermentatie. Dit gaat dan gepaard met het continu of op regelmatige tijdstippen verwijderen van cultuurmedium waarin de gewenste groei is opgetreden en/of de metabolieten zijn ontstaan. 156

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 93: Schematische voorstelling van een ideale fermentor-unit

Een continue fermentatie kan op verschillende manieren worden uitgevoerd: 

een fermentatie, waarbij in één enkel cultuurvat of fermentor een evenwicht tussen de hoeveelheid inkomende cultuurvloeistof en de hoeveelheid uitgaande cultuurvloeistof (inclusief de gegroeide cellen) wordt ingesteld (“ééntrapssysteem”);



een fermentatie, waarbij de uitgaande cultuurvloeistof inclusief de gegroeide cellen deels of volledig wordt teruggevoerd naar het cultuurvat of de fermentor (“recycling”). Dit wordt bijvoorbeeld toegepast, indien het substraat in het cultuurmedium nog verder kan worden afgebroken. Ook komt het wel eens voor, dat alleen een klein gedeelte van de geoogste cellen wordt teruggevoerd met het doel hogere opbrengsten aan metabolieten te verkrijgen, wanneer het substraat in kleine concentraties aanwezig is;

157

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------

een fermentatie, die in twee of meer trappen verloopt (“meertrapssysteem”). Hierbij wordt gebruik gemaakt van een aantal cultuurvaten of fermentors, die in serie zijn opgesteld. Deze manier van fermenteren wordt toegepast, indien de groei van de microorganismen niet synchroon loopt met de biochemische reacties die ze zouden moeten uitvoeren. Zo kan dan de groei plaatsvinden in de eerste fermentor, terwijl de gewenste biosyntheses zich voltrekken in de tweede en de volgende fermentors.

Systematische studies van stammen, kweekmedia en apparatuur hebben de penicillineproductie bijvoorbeeld geleidelijk opgevoerd met een factor 6000 van 5mg/l tot ongeveer 30g/l.

De beënting van de fermentor wordt trapsgewijs uitgevoerd, waarbij men gebruik maakt van steeds grotere volumina (opschalingsfase). Als de fermentatie is geëindigd, moet het gewenste product geoogst of geïsoleerd en daarna eventueel gezuiverd worden (opwerkingsfase). Wanneer het micro-organisme het product vormt, worden de cellen uit het vloeibare cultuurmedium geoogst door centrifugatie, filtratie of sedimentatie en zonodig gewassen. Vormen één of meer metabolieten in het cultuurmedium het product, dan worden deze door chemische en/of fysische methoden geïsoleerd en eventueel gezuiverd.

8.3. Micro-organismen als product Microbiële cellen (biomassa) worden in grote hoeveelheden gekweekt voor o.a. de productie van vaccins, starterculturen, bakkersgist, bodem-, zaad- en bladinocula (Rhizobium, Azospirillum, Pseudomonas syringae), bio-insecticiden, single cell protein (SCP) en oil (SCO).

8.3.1. Micro-organismen als voedselbron Paddestoelen die tot het phylum van de Basidiomycota van de fungi behoren, worden reeds lang als voedsel gebruikt.

In tegenstelling tot gefermenteerde levensmiddelen, waarbij een plantaardig of dierlijk product met behulp van micro-organismen wordt omgezet tot een ander, veelal hoogwaardiger levensmiddel, is een andere bedoeling van het kweken van micro-organismen de microbencellen zelf, in gedraagde vorm, te consumeren als proteïnerijk levensmiddel of om uit het geproduceerde celmateriaal voedzame bestanddelen (o.a. vitamines) te halen. De naam

158

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

ééncellig eiwit of single cell protein (SCP) werd gekozen om te verdoezelen dat er microben mee gemoeid zijn. Het doelbewust produceren van micro-organismen voor menselijke consumptie gebeurde voor het eerst op industriële schaal in de Eerste Wereldoorlog. Door het grote tekort aan voedsel werd toen in Duitsland gist geproduceerd, dat moest dienen als eiwitsuppletie voor het oorlogsrantsoen. De gist werd gecultiveerd op melasse en ammoniumzouten. Ook gedurende WOII werd voedsel van mens en dier aangevuld met gistcellen, ditmaal op afvalstromen uit de papierindustrie. Sindsdien zijn diverse SCP-productieprocessen opgestart, waarbij hoofdzakelijk gisten (Saccharomyces, Candida, enz.) maar ook schimmels (Trichoderma, Rhizopus, Fusarium enz.), bacteriën (Methylophilus methylotrophus) en algen (Spirulina, Chlorrella, enz.) als microorganisme op grote schaal worden gekweekt, op relatief eenvoudige en goedkope substraten die vaak toch als afvalstoffen worden beschouwd, en dit voor dierlijke en ook voor menselijke consumptie. Enkele voorbeelden: 

In Engeland heeft het bedrijf ICI (Imperial Chemical Industries company) in de jaren ‘80 werelds grootste fabriek voor “single cell protein” gebouwd. De fabriek - kosten ± 3 miljard frank - was in staat om 50.000 ton “Pruteen” per jaar te produceren (in de praktijk 700 ton/jaar, constant problemen door contaminatie). Het micro-organisme Methylophilus methylotrophus werd er aëroob gekweekt op methanol en ammoniak. Methanol werd hiertoe geproduceerd uit noordzeegas. De concentratie aan cellen in de air-lift-fermentor was ca. 30 gram per liter. De cellen werden geconcentreerd en vervolgens gedroogd. Het product, gekend als “Pruteen”, bevatte 72% eiwit, met een hoog gehalte aan lysine, methionine en vitaminen, en 8,6% lipiden en is sterk vergelijkbaar met vismeel. Pruteen werd als additief toegepast in veevoeders. Ondanks dat de voedingswaarde veel hoger is dan van soja, bleek de productie niet te kunnen concurreren tegen die van soja. Pruteen is een economische mislukking geworden en zijn productie werd stopgezet.



In Frankrijk produceert het Bel Fromagerie proces 6000 ton SCP/jaar uit wei via de gist Kluyveromyces marxianus.



Een schimmeleiwit (Mycoprotein – Fusarium venenatum) wordt onder de handelsnaam “Quorn” in de handel gebracht. Mycoprotein wordt op een voedingsbodem van glucose en ammoniak gekweekt, en is betrekkelijk gemakkelijk te isoleren.

159

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------

Eéncellige algen, die pigmenten voor fotosynthese bevatten, zijn in vergelijking tot meercellige groene planten zeer efficiënte eiwitproducenten. Dat komt omdat hun stofwisseling niet gericht hoeft te zijn op de productie van allerlei structuurelementen (bladeren, wortels,...), maar op die van nieuwe algencellen en actief protoplasma. Eiwitmateriaal uit algen als Chlorella, Spirulina en Scenedesmus wordt gewonnen als dikke suspensie, pasta, poeder en in korrelvorm.

In het algemeen blijft er echter een negatieve psychologische houding ten aanzien van zelfs volkomen veilige SCP-producten voor menselijke consumptie bestaan.

8.3.2. Productie van vaccins Mensen en dieren verdedigen zichzelf tegen "vreemde" virussen, bacteriën, schimmels en andere lichaamsvreemde stoffen met behulp van het immuunsysteem. Antilichamen spelen in dit immuunsysteem een belangrijke rol doordat deze specifiek de lichaamsvreemde stof (het antigeen) herkennen en elimineren. Vaccinatie om te beschermen tegen infecties door bacteriën of virussen, wordt al heel lang toegepast, zowel bij de mens als bij het dier. Voor sommige infectieziekten geldt immers dat men na genezing niet zo gemakkelijk opnieuw ziek wordt, als men weer wordt besmet met het ziekteverwekkende micro-organisme. Bij deze zgn. immuniteit spelen de na het eerste contact opgewekte antilichamen een belangrijke rol. De immuniteit kan zich ook uitstrekken tot gelijksoortige micro-organismen, waarvan de antigene structuren overeenkomen met die van de eigenlijke ziekteverwekkers. De antilichamen worden alleen opgewekt, als lichaamsvreemde substanties (antigenen) de gastheer binnenkomen. Deze antilichamen zijn zeer specifiek; ze reageren alleen met de lichaamsvreemde stoffen, waardoor ze zijn opgewekt, alsmede met daaraan zeer verwante stoffen. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Indien een lichaamsvreemde stof voor de eerste keer in het bloed voorkomt worden ze door speciale cellen, de macrofagen, opgenomen. De macrofagen zullen de virussen of de bacteriën voor het grootste gedeelte vernietigen. Een deel zal echter het oppervlak van de macrofaag bezetten en de lymfocyten zullen aangezet worden antilichamen te maken. Nadat die antilichamen aan het antigeen gebonden zijn wordt het antigeen onschadelijk gemaakt, bijvoorbeeld doordat het neerslaat, het afgeschermd is door de antilichamen of doordat het aangeboden wordt aan macrofagen waardoor ze onschadelijk gemaakt worden.

160

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Bij een eerste infectie is het tempo waarmee antilichamen aangemaakt worden niet zo hoog. Het kost enkele dagen om voldoende antilichamen te vormen bij zo'n eerste blootstelling. Bij een volgende infectie is de reactie veel sneller, omdat de eerste keer zogenaamde geheugencellen aangemaakt worden. Bij een eerste keer zullen door die trage reactie vaak zeer ernstige ziekteverschijnselen waarneembaar zijn. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Deze immuniteit is ook kunstmatig op te wekken door vaccinatie. Het antigeen wordt dan geïnjecteerd waardoor de immuunrespons plaats vindt. Het ingebrachte antigeen wordt dan wel op zodanige wijze verzwakt dat het niet meer de ziekte kan veroorzaken. Het vaccin bevat dan de dode of verzwakte ziekteverwekkende bacteriën of virussen. Op deze manier zijn er veel vaccins ontwikkeld tegen ziektes. Ook bij de bestrijding van ziekten bij de veestapel heeft men vaccins nodig. Daar bacteriën, virussen en andere micro-organismen ook zijn opgebouwd uit lichaamsvreemde substanties, wekken ze ook antilichamen in de gastheer op. Bij bacteriën is dit het gevolg van de aanwezigheid van antigene substanties in celwand, flagellen of kapsel. Ook kunnen sommige extracellulair gevormde microbiële metabolieten, waaronder exotoxinen, antigene werking bezitten, zoals het difterie- en het tetanustoxine. Bacteriële vaccins zoals die tegen cholera, kinkhoest, tyfus en paratyfus bestaan uit de afgedode bacteriën. Het vaccin tegen tuberculose bevat echter afgezwakte maar nog levende tuberculose bacteriën. Voorbeelden van virus-vaccins zijn de vaccins tegen pokken, influenza, mazelen en polio. Voor de productie van virusvaccins wordt gebruik gemaakt van dierlijke cellen. Cellen uit een weefsel van een dier worden met trypsine behandeld. Hierdoor laten de cellen los. De op deze manier verkregen celsuspensie kan vergelijkbaar met bacteriën gekweekt worden. Daarnaast wordt ook gebruik gemaakt van virussen die gekweekt zijn in embryo's van kippeneieren. Het kweken van dierlijke cellen in flessen of een fermentor wijkt om verschillende redenen af van het kweken van micro-organismen. De media waarin de cellen gekweekt worden zijn veel complexer. Allerlei aminozuren, hormonen en vitaminen moeten toegevoegd worden om celgroei te laten plaats vinden. Vaak wordt aan deze media dierlijk serum toegevoegd. Een nadeel van het toevoegen van serum vormen de kosten. Als de bacteriën of virussen in het kweekmedium zijn geproduceerd, dan worden ze geïnactiveerd door een chemische behandeling of door een fysische behandeling (met behulp

161

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

van hitte, UV- of gamma-bestraling) en daarna gezuiverd door centrifugatie, adsorptie of extractie. Levende vaccins worden geconserveerd door vriesdrogen of diepvriezen. Bij al deze bewerkingen is het van groot belang dat er nauwkeurig gewerkt wordt. Omdat het vaccin direct in het bloed gebracht wordt, moet het vaccin zeer zuiver en steriel zijn. Met het oog op die veiligheid is de kwaliteitscontrole dan ook zeer groot. De ontwikkeling van vaccins is een dure aangelegenheid. Er moet niet alleen een productieproces ontwikkeld en opgeschaald worden, maar het vaccin moet ook uitgebreid getest worden op de werkzaamheid, veiligheid en stabiliteit. In eerste instantie worden hiervoor dierproeven gebruikt, later worden ook klinische tests bij mensen uitgevoerd. De rDNA-technologie kan ook een bijdrage leveren tot de veiliger productie van vaccins. Als een pathogeen micro-organisme, ook al is het verzwakt, op grote schaal gekweekt moet worden, is daaraan een zeker risico verbonden. Zo is voor de productie van een vaccin tegen het monden klauwzeervirus een apart, streng beveiligd laboratorium nodig om het virus in grote hoeveelheden te kweken. Vaccinatie met één essentiele antigene component van het pathogene organisme in plaats van met het gehele organisme, is in principe een veiliger strategie: zo worden modern reeds verschillende vaccins (b.v. tetanusvaccin) bereid door één essentiële component na genklonering in een onschadelijke bacterie te brengen en deze dan op te kweken voor de vaccinaanmaak.

8.3.3. Productie van bio-pesticiden Verschillende Bacillus-soorten werden bestudeerd om te worden gebruikt als biologische insecticiden. Het toxine van de bacterie Bacillus thuringiensis, het Bt-eiwit, wordt reeds benut als biologisch bestrijdingsmiddel tegen plantenvraat door insectenlarven (o.a. diverse vlinderrupsen zoals de bastaard-satijnvlinder en de satijnvlinder), en vormt zodoende soms een goed alternatief voor chemische bestrijdingsmiddelen. Bacillus thuringiensis bevat in een organel in zijn cel eiwitkristallen (het Bt-eiwit), die parallel met de sporulering worden gevormd (paraspore). Deze eiwitkristallen zijn onoplosbaar in neutraal en in licht zuur milieu, maar oplosbaar in alkalisch milieu. Na het opeten van deze Bt-eiwitbevattende Bacillus-soort door de larve van sommige insectensoorten, lost het eiwit op in het daar aanwezige alkalisch milieu, wordt geactiveerd door een darmprotease, en gaat toxisch werken. De larven sterven meestal binnen 2 à 8 uur na inname van dit eiwit, dat echter niet toxisch is voor warmbloedige dieren, planten en bijen. Dit eiwitachtige insecticide wordt geproduceerd door Bacillus thuringiensis te laten groeien in een geschikt medium en na sporulering te oogsten en tot poeder te verwerken. 162

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De effectiviteit van de ingezette bacteriën is echter niet altijd even groot, omdat B. thuringiensis-bacteriën zich vaak niet handhaven op de planten die men wil beschermen. De voor de hand liggende oplossing voor dit probleem is de informatie voor het Bt-toxine, met behulp van de rDNAtechnologie, in te brengen in een Pseudomonas-soort die op de plant kan koloniseren. Ook heeft men de Bt-genen gebracht in bacteriën die bekend staan als endofyten, die in symbiose met de plant leven. Er zijn ook experimenten uitgevoerd waarbij de genetische informatie voor het Bt-toxine met behulp van het Ti-plasmide van de bacterie Agrobacterium tumefaciens werd ingebouwd in het genoom van de plant zelf (vb. tomaat, graan, katoen, aardappel,… worden pestresistent). Veldproeven in de Verenigde Staten hebben laten zien dat plaagbestrijding op deze manier een goed alternatief vormt voor de chemische bestrijding. Andere toepassingen van micro-organismen ter bestrijding van ongewenste organismen zijn: 

Pseudomonas spp. (een bacterie voor zaai en pootgoed ter bescherming tegen bodemschimmels);



Baculovirussen (ter bestrijding van rupsen van de satijnvlinder op wilg en populier);



Verticillium lecanii (parasiet van de witte vlieg en van bladluis).

8.4. Metabolieten als product Primaire metabolieten zijn verbindingen (aminozuren, nucleotiden, vitamines, co-enzymen, alcoholen en organische zuren) die vereist zijn als intermediairen voor de groei van het microorganisme zelf, maar die door bepaalde zorgvuldig geselecteerde stammen overmatig worden geproduceerd. Deze “verkwistende” micro-organismen (hyperproducenten) worden dan door de fermentatie-industrie verder “aangepast” tot superproductie van voornoemde metabolieten via mutatie of r-DNA technologie. Secundaire metabolieten zijn stoffen, welke niet direct vereist zijn voor de groei en leefbaarheid van de microbiële cel maar niettemin toch worden gevormd. Hiertoe behoren antibiotica, toxines, alkaloïden, gibberellines en een breed gamma van farmacologisch actieve stoffen met een grote economische waarde. Micro-organismen produceren deze secundaire metabolieten uit primaire metabolieten langs complexe biochemische wegen.

Voorbeelden van microbiële secundaire metabolieten die worden toegepast als toevoegingen of hulpstoffen in voedingsmiddelen en veevoeder: 

conserveermiddelen voor voedingsmiddelen (nisine, natamycine)



pigmenten (carotenoïden, monascine)



voederadditieven (avoparcine, bacitracine, fylosine, virginiamycine, nosiheptide,...) 163

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------

coccidiostatica (monensine, lasalocide, salinomycine,...)



anthelmintica (hygromycine, destomycine, avermectines,...)



antibacteriële stoffen (tetracyclines)



antifungale stoffen (griseofulvine)



antivirale stoffen



plant-disease-controllers (blasticidine S, validamycine, griseofulvine, cycloheximide)



enzyminhibitoren (polyoxine)



gibberellines



biopolymeren (xanthaan, poly--hydroxyboterzuur, pullulaan,...)

Deze stoffen komen exclusief voor bij micro-organismen, en fermentatie is de enige bekende productiewijze. De stoffen worden o.a. in de voedingsmiddelen- en veevoederindustrie als toevoegingen en/of hulpstoffen (direct of indirect) aangewend. Vele van deze stoffen verhogen, verbeteren of beschermen de plantaardige en dierlijke productie en zijn dus indirect van groot belang voor onze voeding.

8.4.1. Antibiotica Antibiotica kunnen infecties van bacteriën helpen bestrijden door ze in hun groei te remmen. Alexander Fleming deed in 1928 de waarneming bij bacteriën van het geslacht Staphylococcus die in een petrischaal geremd bleken te worden door de gelijktijdige aanwezigheid daarin van de schimmel Penicillium notatum. Dit onderzoek leidde tot de ontdekking en de bereiding van penicilline. Niet direct na de ontdekking van penicilline door Fleming was penicilline een groot succes. Penicilline bleek zeer instabiel te zijn en zeer moeilijk te isoleren. Pas in 1940 werd het zuivere penicilline uit de cel geïsoleerd door Florey en Chain. Klinische tests lieten toen zien wat het therapeutische belang van penicilline was. In Wereldoorlog II ontstond een grote behoefte aan penicilline. Om aan de steeds maar groeiende vraag te kunnen voldoen stond de fermentatie-industrie voor het probleem snel en op grote schaal penicilline te produceren (Figuur 94).

164

Microbiologie H8: IndustriĂŤle microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 94: Productieproces van penicilline en antibioticagram

165

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

De eerste penicillineproducerende stammen hadden slechts een lage productopbrengst, dat wil zeggen de hoeveelheid penicilline die geproduceerd werd per hoeveelheid schimmel was erg laag. Bij de ontwikkeling van het proces is daarom erg veel aandacht besteed aan het omhoog brengen van die productiviteit. Het omhoog brengen van die productiviteit is op 3 manieren gedaan: 

Selectie van stammen: de ene schimmel is niet zo productief als de andere. Door meer productieve stammen te selecteren, kan je steeds betere opbrengsten krijgen.



Optimalisatie van de synthese: door aan de schimmel bepaalde stoffen toe te voegen zal de schimmel meer penicilline gaan produceren.



Procesvoering: de eerste twee manieren proberen de schimmel beter zijn best te laten doen. Maar je kunt ook proberen meer schimmel per m3 reactor te krijgen. Hierdoor zal er meer penicilline gevormd worden. Dit gebeurt door de procesomstandigheden te optimaliseren.

Toepassingen Behalve in de geneeskunde van mens en dier vinden sommige antibiotica ook toepassing als bestrijdingsmiddelen van bacteriële plantenziekten. Veel antibiotica werden ook op grote schaal gebruikt als middel ter bevordering van de groei van vee (rundvee, varkens, pluimvee). Hiervoor worden ze in kleine hoeveelheden door het voer gemengd. Ook bij de conservering van industriële producten, zoals papier, leder en verven, bieden antibiotica interessante toepassingen.

Een antibioticum kan specifiek gericht zijn tegen een bepaalde soort of een kleine groep van microben. In zulk een geval spreekt men van een antibioticum met "smal werkingsspectrum". Andere zijn echter minder specifiek zodat een breed spectrum van uiteenlopende microben daardoor bestreden kunnen worden (= breedspectrum-antibiotica). De antibiotica of chemotherapeutica werken selectief en verschillen hierin van de desinfectantia die tengevolge van hun weinig selectieve werking opgevat kunnen worden als algemene cel- of protoplasmavergiften.

Een classificatie van de antibiotica kan gebeuren volgens de micro-organismen die ze produceren

(bacteriën,

fungi,

actinomyceten),

ofwel

gebaseerd

zijn

hun

werkingseigenschappen (Figuur 95) en doelgroep (bacteriostatisch, bactericidaal, fungistatisch, fungicidaal) of werkingsmechanismen of volgens hun chemische structuur. 166

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 95: Invloeden van antibiotica op de bacterieconcentratie: A. latente fase; B. latente tijd voor de werking van het antibacteriële agens duidelijk wordt

Volgens de chemische structuur van de antibiotica kunnen volgende groepen onderscheiden worden: 

antibiotica met aminozuur- en oligopeptide structuur (vb.penicilline, cefalosporine, chloramfenicol);



antibiotica

met

een

tetracycline

structuur

(chloortetracycline,

tetracycline,

oxytetracycline en derivaten); 

antibiotica met een glycosidische en oligosaccharide structuur (streptomycine, neomycine, novobiocine, kanamycine);



antibiotica met een polypeptide structuur (bacitracine, cycloserine, actinomycine, fungistatine, gramycidine, mitamycine, nisine, polymyxines, subtiline, colistine);



antibiotica met macrolide structuur (erythromycine, oleandomycine, methymycine, spiramycine, rifamycine) ;



antibiotica met een polyeen structuur;



antibiotica met een steroïde structuur.

167

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Antibiotica kunnen ingedeeld worden in groepen naargelang hun werkingsmechanisme of de structuur waarop zij ingrijpen (Figuur 96): 

middelen die de structuur van de celwand veranderen (penicilline, cefalosporine);



middelen die de vorming van de celmembraan remmen (vb. polymyxine);



middelen

die

eiwitsynthese

remmen

(vb.

chloramfenicol,

tetracycline,

streptomycine); 

middelen die de nucleïnezuursynthese remmen (vb. rifampicine, quinoline);



middelen met een antimetabole werking (vb. sulfanilamide).

Figuur 96: Voorbeelden van antibiotica aangrijpingspunten

Antibioticaresistentie Niet lang nadat penicilline algemeen in gebruik werd genomen, werden stammen van Staphylococcus aureus gevonden die niet meer reageerden tegen een behandeling, en rond 1950 waren penicillineresistente S. aureus een frequente oorzaak van infecties in hospitalen. Een decennium later is een semi-synthetische vorm van penicilline geïntroduceerd, met name methicilline; dit werd niet geïnactiveerd door de β-lactamase enzymen die penicilline G 168

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

inactiveerden. Binnen een jaar kwamen de eerste rapporteringen van S. aureus stammen die niet reageerden op methicilline. De mate van voorkomen van methicilline-resistente S. aureus (MRSA) is intussen sterk toegenomen en vormt een belangrijke bron van infecties. In 1980 werd het synthetisch fluoroquinoline geïntroduceerd om MRSA te bestrijden; al binnen een jaar hadden 80% van de geïsoleerde stammen resistentie hiertegen ontwikkeld. Vancomycine werd beschouwd als het laatste hulpmiddel voor de behandeling van MRSA. Een geval van vancomycine-resistente Staphylococcus aureus (VRSA) dook op in Japan in 1996; een aantal maanden later bereikte het de VS. Dit betekent een serieus gevaar; sommige van deze stammen reageren tegen een cocktail van antibiotica, en diverse personen zijn al gestorven aan niet te genezen VRSA infecties.

Bacteriën kunnen diverse resistentie mechanismen ontwikkelen: 

beperking van penetratie van het antibioticum in de cel of targetplaats;



het antibioticum uit de cel pompen;



ontbreken van een passende target voor het antibioticum;



ontwikkelen alternatieve biochemische routes;



produceren van enzymen die het antibioticum neutraliseren;



mutaties waardoor de targetmolecule wijzigt.

8.4.2. Vitamines Industrieel geproduceerde vitamines worden in belangrijke mate gebruikt in de diervoeding (voor een betere productie van melk, eieren en vlees), in de menselijke voeding en voor farmaceutische doeleinden. Deze worden chemisch gesynthetiseerd ofwel via microbiële fermentatie (biochemisch) aangemaakt. Voorbeelden van vitaminen, die biochemisch op industriële schaal aangemaakt worden, zijn: cyanocobaltamine (vit. B12), riboflavine (vit. B2), vitamine C, -caroteen (precursor van vit. A, kleurstof in voedsel).

8.4.3. Aminozuren De markt en de productie van aminozuren op industrieel niveau via micro-organismen is stijgend, en hierin heeft glutaminezuur en zijn zouten (Na- en Ca-glutamaat) qua waarde en volume (ca. 65 %) verreweg het grootste aandeel (360.000 ton), gevolgd door methionine en lysine (40.000 ton). 169

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Aminozuren worden in de levensmiddelenindustrie vooral toegepast als smaakversterker (glutamaat) en ter verhoging van de (eiwit-)voedingswaarde. Daarnaast zijn zij soms grondstoffen voor de bereiding van andere ingrediënten, zoals vb. fenylalanine en asparaginezuur voor de productie van de zoetstof aspartaam. Voor de veevoederindustrie worden verschillende essentiële aminozuren (L-lysine, methionine) via microbiologische weg geproduceerd.

8.4.4. Enzymen Veel micro-organismen maken enzymen aan en kunnen makkelijk worden ingezet voor enzymproductie op industriële schaal. Ze worden in fermentoren gekweekt en tijdens deze groei produceren ze hun enzymen. Na een aantal dagen worden de enzymen uit het cultuurmedium geïsoleerd en worden de overgebleven micro-organismen vernietigd. Deze enzymen met industriële toepassingen worden op grote schaal gefabriceerd en kennen grootschalige toepassingen (Figuur 97). In het midden van de jaren 1970 werd het mogelijk om micro-organismen genetisch te wijzigen. Als men het gen voor een bepaald enzym in een bacterie of gist inbracht, kreeg men een genetisch gewijzigd organisme (GGO) dat dit enzym zelf kon produceren. De grote hedendaagse enzymenfabrikanten produceren veel van hun enzymen met behulp van GGO's. Voorbeelden van industriële enzymen zijn amylases (zetmeelverwerking, brouwerij, bakkerij, veevoeding), proteases (zuivel, brouwerij, bakkerij, vlees, veevoeding, wasproducten), pectinases (vruchtensappen),…

170

Microbiologie H8: IndustriĂŤle microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Figuur 97: Voorbeelden van toepassingen van enzymen in ons dagelijks leven

171

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

8.5. Het gefermenteerd cultuurmedium als product 8.5.1. Humane voeding In tegenstelling tot de voorzorgsmaatregelen die bij het conserven van levensmiddelen worden genomen om het aantal micro-organismen in levensmiddelen te beperken (door verhitten, drogen, koelen, bestralen,...) worden bij de productie van een bepaalde groep van levensmiddelen de omstandigheden zodanig gekozen, dat microbiële groei daarin selectief wordt gestimuleerd. Dergelijke voedingsmiddelen worden gefermenteerde voedingsmiddelen (Tabel 8.2) genoemd. Deze kunnen alleen worden bereid met behulp van de activiteit van micro-organismen. Wijn bijvoorbeeld kan alleen door gistcellen uit druivensap worden bereid; om bij de broodbereiding het deeg te doen rijzen is gist onontbeerlijk; melkzuurbacteriën zijn vereist om van melk yoghurt te maken en om zuurkool en salami te bereiden; schimmels zijn noodzakelijk bij de bereiding van Roquefort en Camembert. De gefermenteerde levensmiddelen worden bereid uit grondstoffen van zowel plantaardige als dierlijke oorsprong. Vele gefermenteerde levensmiddelen zijn zeer belangrijk voor de voedselvoorziening van de mens in grote delen van wereld (Tabel 12). Tabel 12: Belangrijke gefermenteerde voedingsmiddelen PRODUCTEN ZUIVELPRODUCTEN Gerijpte kaas Kefir Kumiss Yoghurt

GRONDSTOF

Acidophilus melk Bifidus melk

Melk Melk

Melk Melk Merriemelk Melk

VLEES- EN VISPRODUCTEN Gerookte ham Varkensham Droge worst Varkensvlees Vis vis (+ groenten, rijst) PLANTAARDIGE PRODUCTEN Cacaobonen Cacaodoppen Koffiebonen Koffiebessen Miso Sojabonen Olijven,zuurkool,ui, komkommers Sojasaus Sufu Tempeh DRANKEN Arak Bier

MICRO-ORGANISMEN melkzuurbacteriën melkzuurbacteriën + gist melkzuurbacteriën + gist S. thermophilus L. bulgaricus L. acidophilus Bifidobacterium MZB

HERKOMST algemeen O-Europa, ZW-Azië Rusland algemeen vele landen vele landen andere

Aspergillus Z-VS Penicillium spp. Pedioc.,Microc. Europa, Staph.,Lactob. Amerika vnl.bacteriën (+ schimmels) Japan, ZO-Azië Afrika, Z-Amerika Brazilië, Zaïre, Indië Japan algemeen L.

Sojabonen Sojabonen Sojabonen

gisten gisten schimmels + gisten L. mesenteroides L. plantarum schimmels, gisten, Mucor spp. Rhizopus spp.

Rijst Granen

gisten, bacteriën gisten

Verre Oosten algemeen

Japan Lactobacillus China Indonesië

172

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------Cider Mezcal, Pulque Sake Wijn Azijn

Appels century plant, agave Rijst druiven + andere vruchten cider, wijn

BROOD Brood,zuurdesem roggebrood

Meel

zuur

gisten gisten Saccharomyces sake gisten Acetobacter spp. gisten, MZB

algemeen Mexico Japan algemeen Gluconobacter algemeen

algemeen

Afhankelijk van het type en het aantal micro-organismen, de samenstelling van de grondstof en de heersende omstandigheden kunnen één of meerdere biochemische reacties op de voorgrond treden bij de bereiding van "fermented foods". In vruchten met relatief veel suiker, domineert de omzetting van suiker tot alcohol en CO2 door gistcellen. Dit is de belangrijkste reactie bij de bereiding van alcoholische dranken. In melk is de omzetting van lactose tot melkzuur door melkzuurbacteriën de hoofdreactie, die de basis vormt voor de bereiding van diverse zuivelproducten zoals kaas en yoghurt. Bij de fermentatie van sojabonen door schimmels tot sojasaus, tempeh en andere producten is de afbraak van proteïnen tot laagmoleculaire peptiden en aminozuren de belangrijkste verandering. De fermentaties gaan vaak gepaard met veranderingen in uiterlijk, consistentie, structuur, smaak, kleur en aroma van het oorspronkelijk product. Deze veranderingen maken het eindproduct attractiever dan de oorspronkelijke grondstof en de consument is er aan gehecht geraakt. Behalve verbeteringen van genoemde eigenschappen zijn gefermenteerde levensmiddelen in het algemeen gemakkelijker te verteren; ze zijn veelal ook voedzamer en vooral langer houdbaar dan het oorspronkelijke product. Dat gefermenteerde levensmiddelen in het algemeen een hogere voedingswaarde dan de oorspronkelijke grondstoffen hebben is toe te schrijven aan de microbieel-enzymatische afbraak van polymere stoffen tot eenvoudige opneembare suikers en suikerderivaten. Naast afbraak van complexe verbindingen, worden er tijdens de fermentaties ook nieuwe nuttige stoffen gesynthetiseerd, zoals organische zuren, nucleotiden, aminozuren en vitamines.

8.5.2. Diervoeding Het inkuilen van groenvoeder (ensileren) is eveneens een belangrijk fermentatieproces, dat betrekkelijk kleinschalig maar zeer algemeen toegepast een bijdrage levert tot enerzijds de bewaring van veevoeder en anderzijds tot een betere en efficiëntere voeding van het vee.

173

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Op de meeste landbouwbedrijven is kuilvoeder de basis van het voedersysteem. De landbouwer beschikt op deze manier het ganse jaar door over een kwaliteitsvol ruwvoeder. Inkuilen (ensileren) is een techniek waarbij de activiteit van de melkzuurbacteriën gebruikt wordt om het voeder (gras, maïs) te bewaren. Als gevolg van de werking van de melkzuurbacteriën daalt de pH van de kuil en stabiliseert deze zich rond pH 4. Door deze verzuring blijft het kuilvoeder verschillende maanden bewaarbaar. De ontwikkeling van de schadelijke bacteriën wordt afgeremd. De kwaliteit van het ingekuilde voeder en de weersomstandigheden bij het inkuilen, zijn belangrijke parameters voor de kuilkwaliteit. De snelheid van verzuren is echter bepalend voor de eindkwaliteit van het kuilvoeder.

De fermentatie van de kuil gebeurt in verschillende fasen: 1. Tijdens het inkuilen ademt de plant. De enzymen in de plant ontbinden een deel van de stikstofverbindingen. 2. De coli-bacteriën ontwikkelen zich eerst en starten de verzuring. Met de plantsuikers en aminozuren als grondstof produceren zij azijnzuur, koolzuurgas en ammoniak. Zij zijn actief tot pH 4,5. 3. De melkzuurbacteriën nemen stilaan het werk over en produceren melkzuur op basis van suikers en organische zuren. Als alle optimale voorwaarden vervuld zijn, daalt de zuurtegraad beneden pH 4. De proteolytische enzymen stoppen hier alle activiteit. Tijdens de fermentatie worden aromastoffen, zoals diacetyl, gevormd die het product smakelijk maken voor het vee. In het geval dat de verzuring te traag gebeurt (aanleg van de silo over verschillende dagen, weinig snel vergistbare suikers, vervuiling met aarde) kunnen boterzuurbacteriën (Clostridium tyrobutyricum) de overhand nemen. Zij ontbinden het melkzuur en de suikers in azijnzuur en boterzuur. De aminozuren worden omgezet in ammoniak en vluchtige vetzuren. Deze boterzuurbacteriën verminderen in belangrijke mate de kwaliteit van de melk (afkomstig van vee gevoederd met dit kuilvoer) (verschijnsel “laat los” bij kaas). Bij het openen van de kuil herneemt de fermentatie. Gisten en schimmels verbruiken de zuren en de suikers. De pH van de kuil stijgt, de smakelijkheid en de voederwaarde van de kuil dalen.

174

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

8.6. Microbiologische processen bij omzettingen van afvalproducten 8.6.1. Microbiologische processen bij de waterzuivering Meestal bestaat de vuilvracht in het afvalwater hoofdzakelijk uit organisch materiaal, en is dit organisch materiaal in het algemeen vlot biologisch afbreekbaar. Via afvalwaterzuivering wordt de BOD of BZV (het biochemical oxygen demand of biochemisch zuurstof verbruik) uitgedrukt in mg/liter, met name de hoeveelheid zuurstof nodig om het organisch materiaal biologisch/microbiologisch af te breken, verlaagd. Een hoge BOD-waarde betekent dat er een hoge concentratie aan biodegradeerbaar organisch materiaal aanwezig is in het water, met andere woorden hiervoor is een hoge zuurstofhoeveelheid nodig bij de biologische afbraak. De gemiddelde BOD van afvalwater bedraagt 300-400 mg/l, in natuurlijke waters is die gewoonlijk 5-10 mg/l. De zuivering van een afvalwater verloopt in drie fasen: Primaire fase: Het doel van de primaire fase is het afvalwater zo voor te behandelen zodat de eigenlijke (biologische) zuivering vlot verloopt; vb. bestaande uit roosters (verwijderen grof materiaal), voorbezinking (verwijderen bezinkbaar particulair materiaal), vetvang (verwijderen vet), buffervat (o.a. neutralisatie van de pH). Hierbij kan gemiddeld 50% van de vaste bestanddelen en 25% van het BOD worden verwijderd. Secundaire fase: Binnen deze fase van de zuivering wordt het biologisch afbreekbaar materiaal door microorganismen tot eenvoudige anorganische moleculen gedegradeerd. Door dit proces worden de organische stoffen, die in opgeloste, niet opgeloste of colloïde vorm in het afvalwater aanwezig zijn, veranderd in bezinkbare stoffen, water en koolstofdioxide. De secundaire fase kan zowel aëroob als anaëroob geschieden.

Aërobe zuivering (Figuur 98): essentieel bij de aërobe behandeling van afvalwater is de zuurstofbehoefte van de bacteriën. De zuurstofvoorziening staat centraal opdat de bacteriën het organisch materiaal zouden kunnen oxideren waarbij energie en voedingsstoffen vrijkomen voor de opbouw van celmateriaal.

In vrijwel alle gevallen wordt de zuurstof via lucht

mechanisch of middels doorborreling in het water gebracht. Met een aërobe zuivering kan een rendement van 99% worden bereikt wat volstaat wil men de normen voor lozen op oppervlaktewater respecteren. Via een actief slib proces worden onder aërobe omstandigheden

175

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

biovlokken gevormd die het organisch materiaal in het afvalwater metaboliseren met vorming van water, CO2 en biomassa (slib).

Het slib wordt verwijderd via bezinking in een

sedimentatietank. Een andere werkwijze is via een biofilter: hier ontwikkelt een biofilm op een drager die het organisch materiaal in het afvalwater reduceert. De biofilm is ongeveer 2 mm dik en bestaat uit een mengsel van bacteriën, fungi, algen, protozoa en nematoden.

Anaërobe zuivering: bij een hoge belasting (B.O.D. > 5.000 mg/l) wordt meestal geopteerd de afbraak van het afvalwater anaëroob te laten geschieden. Belangrijk is hier dat in de afgesloten reactor (digester) geen menging van zuurstof met het anaërobe slib mogelijk is. Zuurstof wordt door de methanogene bacteriën duidelijk ervaren als een toxische component. Gezien het feit dat geen beluchting plaatsvindt, wordt energie gespaard. Daarentegen dient een temperatuur van 35°C in de digester te heersen opdat het afbraakproces optimaal zou plaatsgrijpen. De verwarming van het afvalwater is noodzakelijk wat op zijn beurt energie vraagt. Een gedeelte van deze energie kan worden geleverd door de verbranding van het methaangas dat tijdens het afbraakproces ontstaat. De stapsgewijze afbraak verloopt als volgt: 

organische bestanddelen  organische zuren, CO2, H2



organische zuren  acetaat, CO2, H2



acetaat, CO2, H2  methaan (CH4)

Bij de anaërobe zuivering kan slechts een rendement van 90% worden bereikt zodat steeds een aanvullende weliswaar beperkte aërobe zuivering noodzakelijk is wil men op oppervlaktewater lozen. Bij de secundaire zuivering wordt het afbreekbaar materiaal gedeeltelijk omgezet tot biomassa dat nadien als slib wordt verwijderd. Dit gestabiliseerd slib kan als bodemverbeteraar worden gebruikt, maar de toepassingen in de praktijk zijn beperkt wegens het risico van aanwezigheid van polluanten. Het is de bedoeling via het zuiveren van afvalwater de vuilvracht (organisch materiaal) te elimineren. Naast slib worden ook volgende producten gevormd in het afbraakproces: 

water en koolstofdioxide in de aërobie;



water, koolstofdioxide en methaangas (CH4) bij de anaërobie.

176

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Tertiaire fase: Deze fase kan fysische, chemische of biologische processen omvatten. In de toekomst zal meer en meer aandacht worden geschonken aan de tertiaire behandeling van het geklaarde water. Dit ter ontlasting van het milieu wat betreft de voedingszouten (nitraten en fosfaten) en eventueel met het oog op hergebruik van het geklaarde water. De tertiaire behandeling kan bestaan uit: 

zandfiltratie;



verwijdering van fosfaat en nitraat (voedingszouten): voor het verwijderen van die stoffen kan men gebruik maken van specifieke chemische behandelingen (vb. via toevoeging van calciumsulfaat fosfaat verwijderen) of via een microbiologische aanpak: met behulp van Acinetobacter spp. wordt fosfaat opgestapeld onder de vorm van fosfaatbolletjes in de cel; stikstof wordt uit het afvalwater verwijderd onder zuurstofarme condities met behulp van bacteriën die ammonium via nitraat tot N2 omzetten (denitrificatie);



desinfectie.

Figuur 98: Schema van een afvalwaterzuiveringsinstallatie (aërobe)

8.6.2. Composteren Bij het composteren wordt organisch materiaal samen met O2 door micro-organismen omgezet in microbiële biomassa en restmateriaal gepaard gaande met warmtevrijstelling.

177

Microbiologie H8: Industriële microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------

Belangrijke microbiota hierbij zijn mesofiele en thermofiele bacteriën (Pseudomonas, Proteus, Bacillus, Streptomyces,…) en fungi (Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Chaetomium,…). Composteren gaat gepaard met een temperatuurstijging tot 70°C waardoor pathogene bacteriën en onkruidzaden worden vernietigd. Compost wordt gebruikt als bodemverbeteraar en organische meststof.

8.6.3. Bioremediatie Bioremediatie is het gebruik van biologische middelen, zoals bacteriën en fungi om polluenten af te breken of te neutraliseren onder bepaalde omstandigheden. Hierbij kunnen bepaalde micro-organismen worden geïntroduceerd in de gepollueerde omgeving of beter kan gebruik gemaakt worden van al aanwezige micro-organismen; deze worden gestimuleerd in hun ontwikkeling door het toevoegen van bepaalde nutriënten (biostimulatie).

178

Microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------

Lijst met afbeeldingen Figuur 1 Eerste tekeningen van bacteriën van Antonie Van Leeuwenhoek _______________________________ 11 Figuur 2: Experiment van Pasteur ter weerlegging van de theorie van de spontane generatie __________ 13 Figuur 3: Koch’s onderzoek naar relaties tussen ziekten en micro-organismen__________________________ 16 Figuur 4: Eenvoudige, doch niet algemeen aanvaarde, indeling van de levende natuur, volgens Haeckel (1866) __________________________________________________________________________________________________ 19 Figuur 5: Indeling in 3 domeinen en 6 rijken door Woese (1990) _______________________________________ 20 Figuur 6: De prokaryotische versus eukaryotische cel __________________________________________________ 22 Figuur 7: De prokaryote (links) en eukaryote cel (rechts)_______________________________________________ 22 Figuur 8: Indeling van de microbiële wereld ____________________________________________________________ 25 Figuur 9: Electronenmicroscopische opname van de bacterie Escherichia coli ___________________________ 25 Figuur 10: Situering van het genetisch materiaal in cellen ______________________________________________ 27 Figuur 11: Elektronenmicroscopische opname van 2 circulaire DNA-moleculen _________________________ 27 Figuur 12: Van gen tot eiwit ____________________________________________________________________________ 30 Figuur 13: De eiwitsynthese: de genetische code levert het recept voor de volgorde van de aminozuren van een eiwit ___________________________________________________________________________________________ 31 Figuur 14: Opbouw van de celwand van Gram+ en Gram- bacteriën_____________________________________ 35 Figuur 15: De Grampositieve celwand __________________________________________________________________ 35 Figuur 16: De Gramnegatieve celwand _________________________________________________________________ 35 Figuur 17: (a) Gramkleuringsprocedure en (b) Gramkleuring kleurt de Gram-positieve cellen (Staphylococcus aureus) purper-blauw en de Gram-negatieve cellen (Escherichia coli) rood-rose ______ 36 Figuur 18:Kapsel van een bacterie ______________________________________________________________________ 37 Figuur 19:De verschillende stadia in de vorming van een endospore ____________________________________ 40 Figuur 20: Microscopische structuur van schimmels (links: meercellige éénkernige schimmel met septa = apocytisch; rechts = ééncellige, meerkernige schimmel zonder septa = coenocytisch) _________________ 43 Figuur 21: Ongeslachtelijke vermenigvuldiging bij Penicillium __________________________________________ 44 Figuur 22: Ongeslachtelijke vermenigvuldiging bij Rhizopus ____________________________________________ 44 Figuur 23:De ascocarp, het vruchtlichaam van de Ascomyceten ________________________________________ 45 Figuur 24: De basidiocarp, het vruchtlichaam van de Basidiomyceten __________________________________ 45 Figuur 25: Voorbeelden van cellulaire slijmzwammen ___________________________________________________ 46 Figuur 26:Vorming van een sporangium bij de acellulaire Myxomyceten ________________________________ 46 Figuur 27: De levenscyclus van de echte of acellulaire slijmzwammen __________________________________ 47 Figuur 28: Aantal vormen van vruchtlichamen van de Myxomyceten ___________________________________ 47 Figuur 29: Gistcellen onder de microscoop ______________________________________________________________ 48 Figuur 30: Diverse morfologische vormen van bacteriën ________________________________________________ 50 Figuur 31:Electronenmicroscopische opname van een doorsnede van Methanopyrus kandleri, behorende tot de Archaea __________________________________________________________________________________________ 52 Figuur 32:Levenscyclus van de myxobacteria ___________________________________________________________ 54 Figuur 33: Protozoa groepen uit water en afvalwater ___________________________________________________ 55

179

Microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -------------------------Figuur 34:Voorbeelden van algen in water en afvalwater (1) Chlamydomonas; (2) Scenedesmus; (3) Spyrogira; (4) Navicula; (5) Tabellaria; (6) Synedra; (7) Euglena; (8) Ceratium; (9) Gymnodynium ___ 57 Figuur 35:Verschillende vormen van wieren uit zuiver water ____________________________________________ 58 Figuur 36: Bacteriofagen onder de microscoop (50 000 maal vergroot) _________________________________ 59 Figuur 37: Structuur van een virus _____________________________________________________________________ 60 Figuur 38: Verschil in opbouw van verschillende types virussen ________________________________________ 61 Figuur 39: Geslachtelijke voortplanting _________________________________________________________________ 64 Figuur 40: Schematisch overzicht van het proces van splijting bij bacteriën (A: staafvormige, B: bolvormige) _____________________________________________________________________________________________ 65 Figuur 41: DNA-replicatie _______________________________________________________________________________ 66 Figuur 42: Bacteriële groeicurve met verschillende fasen _______________________________________________ 68 Figuur 43: Transformatie _______________________________________________________________________________ 71 Figuur 44: Conjugatie ___________________________________________________________________________________ 71 Figuur 45: Transductie __________________________________________________________________________________ 72 Figuur 46: Knopvorming bij gisten ______________________________________________________________________ 73 Figuur 47: Ongeslachtelijke voortplanting bij schimmels ________________________________________________ 74 Figuur 48: Ongeslachtelijke voortplanting bij gisten (Ascomyceten) kan zowel in het haploïde als in het diploïde stadium van de levenscyclus ___________________________________________________________________ 74 Figuur 49: De levenscyclus van een fungus _____________________________________________________________ 76 Figuur 50: Levenscyclus van een ascomycete schimmel ________________________________________________ 77 Figuur 51: Levenscyclus van een ascomycete gist ______________________________________________________ 77 Figuur 52: Levenscyclus van een Basidiomyceet ________________________________________________________ 78 Figuur 53: Levenscyclus van Rhizopus (boven: eenvoudige voorstelling, onder: complexere voorstelling) _________________________________________________________________________________________________________ 79 Figuur 54: Bacteriofagen die zich vasthechten aan de wand van een bacterie (26.000X) _______________ 80 Figuur 55: Lytische en lysogene faagcyclus _____________________________________________________________ 81 Figuur 56: Bacteriofagen die zich vasthechten aan de wand van een bacterie (26.000X) _______________ 82 Figuur 57: Vermenigvuldiging van dierlijke DNA-virus __________________________________________________ 83 Figuur 58: Diverse microbiële groepen in functie van hun zuurstoftolerantie ____________________________ 89 Figuur 59: Het anaëroob kweken in een jar of pot ______________________________________________________ 98 Figuur 60: De reinstrijk _________________________________________________________________________________ 99 Figuur 61: Uitplating volgens de gietplaatmethode (links) en de strijkplaatmethode (rechts) __________ 101 Figuur 62: Turbiditeitsmetingen van microbiële groei __________________________________________________ 102 Figuur 63: Werking van een enzym ____________________________________________________________________ 103 Figuur 64: Verlaging van de activatie-energie door een enzym ________________________________________ 104 Figuur 65: Competitieve inhibitie van enzymen; (a) de inhibitor concurreert met het normaal substraat voor binding met het actief centrum; (b) een competitieve inhibitor heeft gewoonlijk een chemische structuur gelijkaardig met het normale substraat ______________________________________________________ 107 Figuur 66: Principe van het allosterisch effect van een allosterisch enzym; (a) binding van de allostere inhibitor en (b) feedback inhibitie ______________________________________________________________________ 108 Figuur 67: Schematische voorstelling van een oxidatie-reductie reactie________________________________ 111

180

Microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -------------------------Figuur 68: Moleculaire structuur van adenosine trifosfaat (ATP) _______________________________________ 112 Figuur 69: ATP-ADP cyclus bij anabole-katabole reacties ______________________________________________ 112 Figuur 70: De waterstofacceptor NAD __________________________________________________________________ 113 Figuur 71: Glycolyse of Embden-Meyerhof-pathway ___________________________________________________ 115 Figuur 72: De verbranding van pyruvaat tot acetyl-CoA en de citroenzuur- of Krebscyclus ____________ 116 Figuur 73: De elektronentransportketen (van de aërobe respiratie) ____________________________________ 117 Figuur 74: Enkele gekende fermentatieprocessen ______________________________________________________ 118 Figuur 75: De homofermentatieve melkzuurfermentatie _______________________________________________ 119 Figuur 76: De alcoholfermentatie ______________________________________________________________________ 119 Figuur 77: Opbouw van koolhydraten __________________________________________________________________ 121 Figuur 78: Opbouw van eiwitten _______________________________________________________________________ 122 Figuur 79: Opbouw van vetten _________________________________________________________________________ 122 Figuur 80: Relatie tussen producenten, consumenten en de afbraakprocessen in een ecosysteem _____ 124 Figuur 81: Koolstofcyclus ______________________________________________________________________________ 128 Figuur 82: Stikstofcyclus _______________________________________________________________________________ 130 Figuur 83: Microbiële omzettingen in de stikstofcyclus _________________________________________________ 132 Figuur 84: Symbiose van wortelknolletjesbacteriën met vlinderbloemigen _____________________________ 139 Figuur 85: Zwamwortels bij een orchidee (Neottia): links: doorsnede van de worteltop (de grijze cellen bevatten de zwamdraden); rechts: detail van deze cellen (de zwamdraden zijn duidelijk zichtbaar) ___ 142 Figuur 86: Enkele mycorrhiza-types ___________________________________________________________________ 142 Figuur 87: De universele fylogenetische boom van het leven __________________________________________ 145 Figuur 88: Klassieke identificatiesleutel voor Gram-positieve bacteriën ________________________________ 146 Figuur 89: Klassieke identificatiesleutel voor Gram-negatieve bacteriën _______________________________ 147 Figuur 90: Een aantal mogelijke identificatiestappen bij bacteriën _____________________________________ 148 Figuur 91: Basidiomyceten_____________________________________________________________________________ 151 Figuur 92: Belangrijkste fyla van Bacteria gebaseerd op 16S ribosomaal RNA gensequentie ___________ 153 Figuur 93: Schematische voorstelling van een ideale fermentor-unit ___________________________________ 157 Figuur 94: Productieproces van penicilline en antibioticagram _________________________________________ 165 Figuur 95: Invloeden van antibiotica op de bacterieconcentratie: A. latente fase; B. latente tijd voor de werking van het antibacteriële agens duidelijk wordt __________________________________________________ 167 Figuur 96: Voorbeelden van antibiotica aangrijpingspunten ____________________________________________ 168 Figuur 97: Voorbeelden van toepassingen van enzymen in ons dagelijks leven ________________________ 171 Figuur 98: Schema van een afvalwaterzuiveringsinstallatie (aërobe) __________________________________ 177

181

Microbiologie ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------

Lijst met tabellen Tabel 1: Overzicht van de vroege ontdekkingen van ziekteverwekkende bacteriën ................................16 Tabel 2: Vergelijkende tabel tussen Eukaryote en Prokaryote cellen .............................................................24 Tabel 3: Vergelijking van Bacteria, Archaea en Eukaryoten ...............................................................................24 Tabel 4: Vermeerdering van bacteriën in 12 uur, met een delingstijd van 20 minuten ..........................69 Tabel 5: Indeling van de micro-organismen in functie van temperatuursinterval voor groei ...............86 Tabel 6: Groei van micro-organismen in functie van de pH ...............................................................................87 Tabel 7: Min. aw-waarden voor de groei van micro-organismen ......................................................................90 Tabel 8: Minimale aw-waarde voor microbiële groei en mogelijk voedselbederf bij levensmiddelen met een bepaalde zout of suiker% in de waterige fase........................................................................................90 Tabel 9: Indeling van micro-organismen naargelang hun energiebron en koolstofbron .......................110 Tabel 10: Aantal en gewicht van micro-, meso- en macro-organismen in de bovenste 15 cm van een akkerland (gematigde streken) ...........................................................................................................................133 Tabel 11: Enkele fenotypische kenmerken van taxonomische waarde ........................................................146 Tabel 12: Belangrijke gefermenteerde voedingsmiddelen ................................................................................172

182