INHOUDSTAFEL PRACTICA LEVENSMIDDELENMICROBIOLOGIE DEEL 1.
ALGEMEEN
1-1
1.1 AANWIJZINGEN VOOR MICROBIOLOGISCH ONDERZOEK 1.1.1 Veilig werken 1.1.2 Inrichting 1.1.3 Personeel 1.1.4 Persoonlijke hygiëne 1.1.5 Apparatuur 1.1.6 Beheer van apparatuur 1.1.7 Materialen 1.1.8 Media 1.1.9 Gieten van platen 1.1.10 Uitvoering van het onderzoek 1.1.11 Resuscitatie 1.1.12 Bebroeden (aëroob, anaëroob, micro-aëroob) 1.1.13 Microbiologisch laboratoriumafval 1.1.14 Het overenten 1.1.15 De sterilisatie
1-1 1-2 1-4 1-4 1-4 1-5 1-9 1-9 1-11 1-18 1-19 1-20 1-20 1-20 1-21 1-23
1.2 KWALITATIEVE METHODEN (grensreactie, MPN)
1-25
1.3 KWANTITATIEVE METHODEN (telling)
1-25
1.4 KWALITEITSBORGING 1.4.1 Eerstelijnscontrole 1.4.2 Tweedelijnscontrole 1.4.3 Derdelijnscontrole
1-26 1-26 1-26 1-26
1.5 VALIDATIE, VERIFICATIE EN NORMALISATIE 1.5.1 Validatie van methoden 1.5.2 Verificatie 1.5.3 Meetonzekerheid 1.5.4 Normalisatie
1-27 1-27 1-27 1-27 1-27
1.6 1.6.1 1.6.2 1.6.3 1.6.4 1.6.5 1.6.6
1-29 1-29 1-31 1-32 1-32 1-32 1-33
MONSTERNAME EN -TRANSPORT Monstername schema’s Keuze van de monsters Monstername van levensmiddelen Monstername van water Transport en bewaring Ontvangst en registratie
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Inhoudstafel p. 1
1.7 DE BEREIDING EN VERDUNNING VAN MONSTERS 1.7.1 Doel + principe 1.7.2 Verdunningsvloeistof 1.7.3 Verdunnen van vloeibare producten 1.7.4 Verdunnen van niet-vloeibare producten
1-34 1-34 1-35 1-35 1-37
DEEL 2. ONDERZOEK OP DETERMINATIE EN IDENTIFICATIE VAN MICRO-ORGANISMEN
2-1
2.1 HET ONDERZOEK VAN DE CULTUUREIGENSCHAPPEN 2.1.1 Het onderzoek van oppervlakkolonies 2.1.2 De groei-intensiteit, de geur en de kleur 2.1.3 De groei in een agarbodem 2.1.4 De groei in een gelatinebodem 2.1.5 Het gedrag in lakmoesmelk 2.1.6 Het gedrag in een vloeibare bodem 2.1.7 De bepaling van de groeivoorwaarden 2.1.8 De beweeglijkheid in een half vloeibare bodem 2.1.9 Groei in een specifieke koolstofbron 2.1.10 De groei van sporenvormende bacteriën 2.1.11 De groei in aanwezigheid van remmende stoffen
2-2 2-2 2-3 2-5 2-5 2-6 2-7 2-8 2-9 2-9 2-11 2-11
2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5
HET ONDERZOEK VAN DE BACTERIELE ENZYMATISCHE ACTIVITEITEN De dissimilatie van suikers, alcoholen en glucosiden De dissimilatie van N-verbindingen De afbraak van lipiden en lipoïden De oxydo-reductase reacties De reacties op bloed en plasma
2-13 2-13 2-21 2-23 2-23 2-25
2.3
GROEPERING EN IDENTIFICATIE VAN MICRO-ORGANISMEN
2-26
2.4
SCHIMMELDETERMINATIE
2-28
2.5
ALTERNATIEVE METHODE EEN VOORBEELD VAN EEN DIAGNOSTISCHE KIT: API 20 E
2-29 2-29
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Inhoudstafel p. 2
DEEL 3.
ONDERZOEK VAN MICRO-ORGANISMEN IN LEVENSMIDDELEN
BEPALING VAN DE AEROBE KIEMGETALLEN en eventueel aërobe bacteriesporen 3.1.1 Definitie 3.1.2 Inleiding 3.1.3 Telmethode 3.1.4 Bijzondere gevallen
3-1
3.1
3-3 3-3 3-3 3-4 3-6
3.2
BEPALING VAN HET ANAEROBE KIEMGETAL en eventueel anaërobe bacteriesporen (mesofiel) 3.2.1 Definitie 3.2.2 Inleiding 3.2.3 Telmethode
3-7 3-7 3-7
3.3 BEPALING VAN DE ENTEROBACTERIACEAE 3.3.1 Algemene kenmerken 3.3.2 Methodologie 3.3.3 Telling 3.3.4 Grensreactie 3.3.5 Telling via MPN
3-10 3-10 3-11 3-11 3-14 3-18
3.4 BEPALING VAN DE COLIFORMEN 3.4.1 Algemene kenmerken 3.4.2 Methodologie 3.4.3 MPN 3.4.4 Grensreactie 3.4.5 Telling
3-20 3-20 3-21 3-21 3-23 3-26
Bijlage over microbiologische criteria van levensmiddelen
3-28
DEEL 4
4-1
ONDERZOEK IN DE PRODUCTIEOMGEVING
4.1 ONDERZOEK VAN OPPERVLAKKEN
4-1
4.2 ONDERZOEK VAN HANDEN
4-1
4.3 ONDERZOEK VAN LUCHT
4-1
4.4 OPSPOREN VAN EEN HUISKIEM
4-1
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Inhoudstafel p. 3
DEEL 2: ONDERZOEK OP DETERMINATIE EN IDENTIFICATIE VAN MICRO-ORGANISMEN
Voor nader onderzoek van micro-organismen (bevestiging en identificatie of determinatie) tot op het geslacht- (genus) en / of soort- (species)niveau, is het noodzakelijk dat wordt uitgegaan van een reincultuur. Dit houdt in dat m.o. die in een bouillon of op een selectief voedingsmedium aanwezig zijn, moeten worden geënt op een vast voedingsmedium, zodanig dat losliggende kolonies worden verkregen. Op deze manier kan worden vastgesteld of de te onderzoeken cultuur bestaat uit 1 (reincultuur) of meerdere soorten m.o. Losliggende kolonies die aanwezig zijn op een selectief medium mogen meestal niet worden gebruikt bij de uitvoer van verdere bevestigingstesten. Selectieve media bevatten mogelijk componenten die van invloed zijn op een bevestigingstest waardoor bv. een valspositieve reactie wordt verkregen. → dus: karakteristieke (losliggende) kolonies die op een selectief voedingsmedium aanwezig zijn, worden afgestreken op een neutraal isolatiemedium als Nutriëntagar, Plate Count Agar (PCA) of Trypton Soya Agar (TSA). Vervolgens kan na bebroeding van het neutrale medium het bacteriemateriaal van een losliggende kolonie worden gebruikt voor bevestiging en / of nadere identificatie.
Door een bepaald m.o. te onderzoeken op zijn cultuur- en enzymatische eigenschappen kan aan de hand van bepaalde determinatiesleutels het identificeren tot op de soort of het biotype mogelijk maken. Deze onderzoekingen worden toegepast op verschillende micro-organismen (reinculturen) en zijn belangrijk voor de bevestigingsreacties in het microbiologisch onderzoek van levensmiddelen en voor de identificatie en differentiatie van m.o.
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 1
2.1
HET ONDERZOEK VAN DE CULTUUREIGENSCHAPPEN
De groei van de microbenreincultuur wordt nagegaan op vaste, halfvaste (= semi-solide) en vloeibare bodems.
2.1.1 Het onderzoek van oppervlakkolonies
test 1 in labo
a) Benodigdheden: - stock cultuur - Petriplaat met Nutriënt Agar (NA) of Standaard Bouillon Agar (SBA) - öse b) Werkwijze: - neem met de geflambeerde en afgekoelde öse een weinig stock cultuur - maak nu onmiddellijk een massale enting op de NA in de Petriplaat - incubeer gedurende 20 u en beoordeel de oppervlak kolonies c) Beoordeling van de resultaten: De groei van de bacteriën tot zichtbare kolonies wordt nagegaan. Voor het beschrijven van de karakteristieke eigenschappen van de geïsoleerd liggende kolonies worden de termen gebruikt die in onderstaande figuur zijn aangegeven. Geef beschrijving van: - kolonievorm: - koloniehoogte: - kolonieranden: - kolonieoppervlak: - optische eigenschappen:
An Vandenhaute
puntvormig, rond, filamentvormig, onregelmatig, wortelachtig, spoelvormig plat, verheven, konvex, kussenvormig, uitspruitend gaaf, gegolfd, getand, gelobd, harig, gekruld zacht, ruw, slijmerig, effen, concentrische ring ondoorschijnend, doorschijnend melkachtig, glinsterend
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 2
2.1.2 De groei-intensiteit, de geur en de kleur a) Benodigdheden: - stock cultuur - schuine NutriĂŤnt Agar - Ăśse b) Werkwijze: - Breng op de schuine agarbodem een rechte lijnenting van de te onderzoeken cultuur aan (zie onderstaande figuur). - Incubeer minimum 24 uur bij optimale temperatuur.
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 3
c) Beoordeling van de resultaten: - de groei-intensiteit: +++ : zeer goede groei ++ : tamelijk goede groei : bijna geen groei -: geen groei - de geur; ga na of er een geur aanwezig is, zo ja, tracht deze dan te omschrijven - de kleur van de kolonie en eventueel verkleuring van de bodem - de groeivorm ; zie onderstaande figuur
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 4
2.1.3 De groei in een agarbodem a) Benodigdheden: - stock cultuur - NA = NutriÍnt Agar, recht opgesteven en circa 6 ml per proefbuis - steeknaald b) Werkwijze: - Raak met een geflambeerde en afgekoelde steeknaald de stock cultuur aan en maak een centrale, loodrechte enting. - Incubeer bij 20°C gedurende 24 u. c) Beoordeling van de resultaten: - de groei-intensiteit: over gans de lengte, top of onderaan - de groeivorm (zie figuur)
2.1.4 De groei in een gelatinebodem a) Benodigdheden: - stock cultuur - Standaard Bouillon Gelatine (SBG), recht opgesteven en circa 6 ml per proefbuis - steeknaald
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 5
b) Werkwijze: - Raak met een geflambeerde en afgekoelde steeknaald de stock cultuur aan en maak een centrale, loodrechte enting. - Incubeer bij 20°C gedurende 24 u. c) Beoordeling van de resultaten: - de vervloeiing van de gelatine (zie figuur)
2.1.5 Het gedrag in lakmoesmelk a) Benodigdheden: - stock cultuur - lakmoesmelk (LM), 10 ml per proefbuis - Ăśse b) Werkwijze: - Ent de stock cultuur in de lakmoesmelk - Incubeer 24 tot 48 u. c) Beoordeling van de resultaten: - de reductie van lakmoes - de stremming: zuur of leb (Met pH strookjes kan je zien of er zuur milieu ontstaan is. Indien er geen zuur milieu is en er is toch een stremming opgetreden dan heeft de bacterie zelf een enzymactiviteit (leb) om de stremming te weeg te brengen.) - de peptonisatie (eiwitafbraak): zwak, sterk, gas- en zuurvorming (bij zuurvorming is er een waterige laag bovenaan). An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 6
2.1.6 Het gedrag in een vloeibare bodem a) Benodigdheden: - stock cultuur - Nutriënt Bouillon of Standaard Bouillon (SB), ongeveer 8 ml per proefbuis - öse b) Werkwijze: - Ent de stock cultuur in de Nutriënt Bouillon. - Incubeer bij optimale temperatuur gedurende 48 u. c) Beoordeling van de resultaten: - de oppervlaktegroei: vlokkerig, met ring, met vlies, met membraan (zie fig).
- de troebelheid: licht, middelmatig, sterk of geen troebelheid - het sediment: * de hoeveelheid: overvloedig, gering of geen * de aard: hard, compact, vlokkig, korrelig, slijmerig of kleverig
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 7
2.1.7 De bepaling van de groeivoorwaarden 2.1.7.1 De temperatuur a) Benodigdheden: - stock cultuur - 4 buisjes NA recht opgesteven en circa 10 ml per proefbuis - steeknaald b) Werkwijze: - Raak met een geflambeerde en afgekoelde steeknaald de stock cultuur aan en maak een centrale, loodrechte enting in de 4 proefbuizen. - Incubeer bij 5, 20, 37 en 55 ° C. c) Beoordeling van de resultaten: van de 4 proefbuizen: - de groei-intensiteit - de groeivorm
2.1.7.2 De zuurtegraad Hierbij wordt de invloed van de pH op de groei nagegaan door toevoeging van een buffer aan SB.
2.1.7.3 De vrije zuurstof a) Benodigdheden: - stock cultuur - tot op 45 ° C afgekoelde NA (vloeibaar dus) - öse - steriel proefbuisje b) Werkwijze: - schud een öse uit in een proefbuisje met gesmolten en tot op 45 ° C afgekoelde vloeibare NA - Giet het geënte buisje aseptisch en langzaam over in een steriel proefbuisje - Incubeer bij passende temperatuur. c) Beoordeling van de resultaten: - aërobe of oppervlaktegroei - anaërobe of dieptegroei
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 8
2.1.8 De beweeglijkheid in een half vloeibare bodem test 2 in labo Naast de directe opsporing van de beweeglijkheid met de techniek van de hangende druppel, kan men door het uitzwermen vanaf de entlijn in een halfvloeibare bodem, beweeglijke soorten opsporen en op die manier scheiden van de onbeweeglijke soorten. a) Benodigdheden: - stock cultuur - SIM agar (6 cm in proefbuis) - steeknaald b) Werkwijze: - Maak een centrale, rechte steekenting - Incubeer bij optimale temperatuur 18 tot 24 uur c) Beoordeling van de resultaten: De identificatiebodem SIM-agar laat toe naast de beweeglijkheid ook de indolvorming en de H2S-productie te testen. S --- H2S-productie I --- Indolvorming M --- Mobiliteit (beweeglijkheid) H2S-vorming wordt aangetoond door zwartverkleuring langs de entlijn. Indol: (zie ook verder) Indien na het toevoegen van 0,5 ml Kovacs reagens een roodbruine kleur verschijnt is de reactie positief (er is indolvorming). Mobiliteit: Ga op regelmatige tijdstippen de groei in buisjes na: - groei langs de entstreep: onbeweeglijke soorten - groei vanaf de entstreep, uitspreidend over de breedte: beweeglijke soorten
2.1.9 Groei in een specifieke koolstofbron 2.1.9.1 De citraatdissimilatie test 3 in labo Sommige m.o. kunnen citraat als enige koolstofbron gebruiken (in plaats van koolhydraten). Deze eigenschap kan zowel in vloeibaar (Kosercitraatmedium = KC) als op vast milieu (Simmons citraat-agar = SCA) aangetoond worden en wordt vooral bepaald voor de differentiatie van de Enterobacteriaceae.
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 9
a) Benodigdheden: - stock cultuur - schuine SCA = Simmons citraat-agar - öse b) Werkwijze: - Ent streepsgewijze de te onderzoeken cultuur - Incubeer gedurende 24 uur bij 30 of 37 ° C c) Beoordeling van de resultaten: Beoordeel de groei: alkalivorming, door verdwijnen van de citraatgroep, wordt aangetoond door een kleurverandering van de voedingsbodem. Wanneer de voedingsbodem van groen naar blauw verkeurt dan is de reactie positief. In SCA is broomthymolblauw aanwezig als kleurindicator. Omslaggebied van broomthymolblauw: pH: 7,6 blauw blauwgroen pH: 6,8 groen groengeel pH: 6,0 geel
2.1.9.2 De malonaatdissimilatie Sommige bacteriën zoals Enterobacter en Arizona zijn in staat een synthetische bodem met ammoniumsulfaat en natriummalonaat als enige Nen C-bron te ontwikkelen. Door het verbruik van natriummalonaat als energiebron wordt, door het verdwijnen van de zuurradicaal, de bodem alcalisch. Bij positieve reactie wordt de bodem blauw gekleurd in een Malonaatbouillon (MB).
2.1.9.3 De acetaatdissimilatie Sommige bacteriën zoals Salmonella, Arizona, Citrobacter, Enterobacter en de meeste stammen van Escherichia coli kunnen in een minerale voedingsbodem natriumacetaat als enige C-bron gebruiken. Proteus en Providencia kunnen dit niet. Door het verbruik van dit acetaation, als enige energiebron, wordt de bodem alkalisch en daarom, bij positieve reactie, wordt de toegevoegde indicator blauw gekleurd in de Acaetaat-agar (A.A.).
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 10
2.1.10 De groei van sporenvormende bacteriën a) Benodigdheden: - stock cultuur - dubbelsterke Nutriënt bouillon = standaard bouillon (SB), 3 ml per buisje - öse - proefbuisjes met 3 ml steriel water b) Werkwijze: - Suspendeer een oogje van de bacteriecultuur in 3 ml water - Stel het buisje gedurende 5 minuten in een kokend waterbad - Koel af en voeg 3 ml dubbelsterke standaard bouillon toe - Incubeer bij optimale temperatuur gedurende 48 uur c) Beoordeling van de resultaten: Beoordeel de groei. Indien groei optreedt zijn sporenvormende bacteriën aanwezig.
2.1.11 De groei in aanwezigheid van remmende stoffen 2.1.11.1 De KCN-tolerantietest De groeiremmende werking van Kaliumcyanide dient voor het differentiëren van de Enterobacteriaceae. Salmonella groeit niet in een KCN-medium. Klebsiella en Proteus groeien wel in dit medium; Escherichia coli wordt geremd.
2.1.11.2 De zoutremming test 4 in labo De remmende werking van 6,5 % keukenzout dient voor het onderscheid te maken tussen Enterococcus spp. en de streptococcen. Enterococcen kunnen groeien bij 6,5% zout, streptococcen niet. Ook Staphylococcus is halotolerant, E.coli niet. a) Benodigdheden: - stock cultuur - zoutbouillon met 6,5 % zout (ZoB) Los 10 g pepton, 10 g glucose, 65 g NaCl op in 1000 ml water. Steriliseer 15 minuten bij 120 ° C. Eind pH 6,8.
- öse b) Werkwijze: - Ent de cultuur in de zoutbouillon. - Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 - 48 uur. c) Beoordeling van de resultaten: Beoordeel of er al dan niet groei optreedt. An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 11
2.1.11.3 De 40 % gal remming test 5 in labo De remming veroorzaakt door de aanwezigheid van 40 % gal wordt aangewend voor het differentiëren van de streptococcen. Enterobacteriaceae kunnen goed leven bij een hoge galconcentratie (het zijn typische darmbacteriën). a) Benodigdheden: - stock cultuur - galbouillon 40 % (GaB), 10 ml per buis Los 5 g lactose, 5 g pepton, 5 g trypton en 5 g vlees extract poeder (Lab Lemco Poeder) op in 1000 ml water. Voeg aan 600 ml basismedium een oplossing van 40 g ossengal in 360 ml water toe. Steriliseer 20 minuten bij 120 ° C. Eind pH: 7,0.
- öse b) Werkwijze: - Ent de cultuur in de galbouillon. - Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur. c) Beoordeling van de resultaten: Beoordeel of er al dan niet groei optreedt.
2.1.11.4 De 0,1 % methyleenblauwremming De groeiremming door 0,1 % methyleenblauw in melk helpt voor het differentiëren van de fecale streptococcen. Na incubatie wordt nagegaan of de kleurstof gereduceerd werd en of er eventueel stremming opgetreden is.
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 12
2.2
HET ONDERZOEK VAN DE BACTERIELE ENZYMATISCHE ACTIVITEITEN
2.2.1 De dissimilatie van suikers, alcoholen en glucosiden Om onderscheid te maken tussen families, geslachten en soorten bacteriën wordt er vaak gebruik gemaakt van diverse suikerfermentatietesten. De fermentatie van suikers kan op diverse manieren worden bepaald. Onder andere met behulp van Brilliant Green Bile (BGB)-bouillon, glucose-agar, Kligleragar, Oxidatieen Fermentatie (O/F)-medium en Triple Sugar Iron (TSI)-agar. Als geen specifiek medium voor de fermentatie van een suiker wordt gegeven, wordt gebruik gemaakt van een algemeen fermentatiemedium als glucose-agar. In plaats van glucose wordt dan de gewenste suiker toegevoegd zodat kan worden bepaald of fermentatie daarvan mogelijk is. De media bevatten naast de aanwezigheid van één of meer suikers een pH-indicator waardoor, indien een suiker wordt gefermenteerd, het medium van kleur verandert. Het medium krijgt dan de ‘zure’ kleur van de desbetreffende pH-indicator. Vaak wordt fenolrood of broomcresolpurper als pH-indicator gebruikt. Overzicht van enkele indicatoren: Indicator
PH-omslaggebied
Thymolblauw Broomfenolblauw Kongorood Broomcresolgroen Methylrood Broomcresolpurper Chinablauw Broomthymolblauw Fenolrood Cresolrood Thymolblauw Fenolftaleïne
1,2 tot 2,8 3,0 tot 4,6 3,0 tot 5,2 3,8 tot 5,4 4,4 tot 6,2 5,2 tot 6,8 6,0 tot 7,6 6,8 tot 8,4 7,0 tot 8,8 8,0 tot 9,6 8,3 tot 10
Kleuromslag
Rood naar geel Geel naar blauw Blauw naar rood Geel naar blauw Rood naar geel Geel naar purper Blauw naar geel Geel naar blauw Geel naar rood Geel naar purper Geel naar blauw Kleurloos naar rood
De zuurproductie kan zowel in een vloeibare als vaste voedingsbodem nagegaan worden. Vloeibare bodems (vb. BGB-bouillon) kunnen ook een omgekeerd Durhambuisje bevatten. Als lactose wordt gefermenteerd is dit te zien aan het daarbij ontstane gas dat deels wordt opgevangen in het (omgekeerde) buisje. Overigens is bij de vaste media gasvorming waar te nemen in de vorm van bellen of scheuren in het medium of door het omhoogschuiven van het medium vanaf de bodem. An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 13
2.2.1.1 De zuur- en gasvorming in een vloeibaar milieu test 6 in labo a) Benodigdheden: - stock cultuur - proefbuisjes, gevuld en gesteriliseerd met 10 ml Lactose bouillon en Durhambuisjes - öse - kleurindicator vb. broomthymolblauwoplossing b) Werkwijze: - Inoculeer het voedingsmedium - Incubeer 48 uur bij optimale temperatuur c) Beoordeling van de resultaten: - de gasvorming (luchtbel in Durhambuisje)
- de zuurvorming of alkalivorming door toevoegen van enkele druppels kleurindicator. Bij broomthymolblauw: pH: 7,6 blauw pH: 6,8 groen pH: 6 geel 2.2.1.2 Het oxidatief en fermentatief metabolisme van koolhydraten Suikers kunnen op 2 manieren worden gesplitst, namelijk fermentatief of oxidatief. Strikt aërobe bacteriën kunnen een suiker alleen onder aërobe omstandigheden afbreken, terwijl de facultatief anaëroben dit zowel aëroob als anaëroob kunnen doen. Het anaëroob afbreken noemt men vergisten of fermentatie, het aëroob afbreken oxidatie. Als een suiker wordt gefermenteerd verandert het medium in de gehele buis, terwijl bij oxidatie alleen aan de oppervlakte kleurverandering plaatsvindt. a) Benodigdheden: - stock cultuur - proefbuisjes gevuld en gesteriliseerd met Oxidatie- en Fermentatie (O/F)-medium (Basismedium met glucoseoplossing en broomthymolblauw) - steeknaald b) Werkwijze: - Beënt met een diepe rechte centrale steekenting de gesteriliseerde en recht opgesteven buisjes, steek tot op de bodem - Incubeer bij 30 ° C of 37 ° C gedurende 24 uur. An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 14
c) Beoordeling van de resultaten: - geen dissimilatie: buisje volledig paars (zelfs bovenaan intenser) - oxidatieve dissimilatie: geelverkleuring bovenaan - fermentatieve dissimilatie: volledige geelverkleuring (glucosefermentatie) - gasvorming: scheuren en / of gasbellen Bebroed negatieve buizen nogmaals 24 uur bij 30 of 37 ° C en beoordeel deze opnieuw.
2.2.1.3 Fermentatie van glucose en lactose met Kligleragar a) Benodigdheden: - stock cultuur - proefbuisjes met Kligleragar, in schuine positie gestold. In dit medium zit o.a. lactose (10 x meer aanwezig dan glucose) glucose ammoniumijzersulfaathexahydraat fenolrood - steeknaald b) Werkwijze: - Beënt de buis met een streep op het oppervlak en een rechte steek tot onderin de buis. - Incubeer gedurende 24 uur bij 30 of 37 ° C. c) Beoordeling van de resultaten: In dit medium werd de verhouding van de hoeveelheid glucose en lactose zo gekozen dat de vergisting van beide suikers kan nagegaan worden. Indien de geënte bacterie enkel glucose vergist zal nadat, onder de aërobe omstandigheden van de schuine oppervlakte, de totale hoeveelheid glucose omgezet is, een alkalisatie optreden. In de anaërobe voorwaarden van de steekcultuur treedt deze alkalisatie niet op. Bij de omzetting van glucose alleen is het stompje geel en de schuine oppervlakte rood (doordat zuurstof het zuur neutraliseert). Indien eveneens lactose omgezet wordt, worden zowel het stompje als de schuine oppervlakte geel verkleurd.
Stompje Geel Geel Rood (onveranderd) Zwartverkleuring Bellen of scheuren An Vandenhaute
Schuine oppervlakte Rood Geel Rood
Besluit Glucose dissimilatie Glucose en lactose dissimilatie Geen gluc.diss. en geen lact.dissimilatie H2S-vorming Gasvorming
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 15
2.2.1.4 Fermentatie van suikers (glucose, lactose en sucrose) met Triple Sugar Iron (TSI)-agar test 7 in labo a) Benodigdheden: - stock cultuur - proefbuisjes met Triple Sugar Iron (TSI)-agar, in schuine positie gestold. In dit medium zit o.a. lactose (10 x meer aanwezig dan glucose) sucrose (10 x meer aanwezig dan glucose) glucose ijzercitraat natriumthiosulfaat fenolrood - steeknaald b) Werkwijze: - BeÍnt de buis met een rechte steek tot onderin de buis en bij het intrekken van de naald wordt er een streep getrokken op de oppervlakte van de schuine zijde van de slant. - Incubeer gedurende 24 uur bij 30 of 37 ° C. c) Beoordeling van de resultaten: omslag fenolrood: pH 8,8 pH 6,8
Stompje (= bodem) Geel Geel Rood (onveranderd) Zwartverkleuring Bellen of scheuren
Schuine oppervlakte (= slant) Rood Geel Rood
Buis 1 (uiterst links): Buis 2: Buis 3: Buis 4 (uiterst rechts): An Vandenhaute
rood geel
Besluit Glucose dissimilatie Glucose en lactose of sucrose dissimilatie Geen gluc.diss. en geen lact.dissimilatie H2S-vorming Gasvorming
gasvorming + volledig geel geel stompje + rode schuine oppervlakte zwartverkleuring + rode schuine oppervlakte volledig rood
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 16
Principe: De TSI bodem dient om een differentiatie te maken tussen de verschillende geslachten van Enterobacteriaceae op basis van de koolhydraatfermentatie en H2S productie. Om de fermentatie van KH te observeren gebruikt men 1% lactose, 1% sucrose en 0,1% glucose in het medium. De zuur-base indicator fenolrood wordt toegevoegd om de fermentatie van de KH (door de productie van zuur) na te gaan; fenolrood wordt namelijk geel bij zuur milieu. Na incubatie kan de fermentatie activiteit van het micro-organisme afgelezen worden: ● alkalische slant (rood) en zure bodem (geel) met of zonder gasproductie: Alleen glucose is gefermenteerd. Het organisme heeft een voorkeur om glucose eerst af te breken. Aangezien glucose in de TSI-agar slechts weinig aanwezig is zal de kleine hoeveelheid zuur die daaruit gevormd werd snel geoxideerd worden op de slant (schuine zijde), daar is namelijk veel zuurstof aanwezig. Het aanwezige pepton in het medium zal ook het medium meer alkalisch maken. In de bodem blijft het gevormde zuur aanwezig omdat daar een lagere zuurstofspanning heerst en er een tragere groei van het micro-organisme is. ● zure slant (geel) en zure bodem (geel) met of zonder gasproductie: Lactose en/of sucrose zijn gefermenteerd. Doordat deze koolhydraten in hogere concentraties aanwezig zijn, kan de fermentatie blijven doorgaan waarbij de gevormde zuren blijven en zowel de slant als de bodem geel zien. ● alkalische slant (rood) en alkalische bodem (rood) of geen verandering (oranjerode) bodem. Er zijn geen koolhydraten gefermenteerd. In de TSI-agar is ook Natriumthiosulfaat en Ijzercitraat aanwezig. Alleen micro-organismen die tijdens het incuberen in staat zijn om H2S te produceren tonen een uitgesproken zwarte verkleuring in de bodem van de agar door de het neerslaan van het onoplosbare ijzersulfide. Natriumthiosulfaat is een substraat voor H2S-productie en samen met het ijzer uit ijzercitraat vormt dit ijzersulfide (zwart).
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 17
2.2.1.5 De methylroodtest en de Voges-Proskauertest (vorming van acetylmethylcarbinolvorming test 8 in labo Volgens hun fermentatief vermogen kunnen de Enterobacteriaceae in 2 groepen ingedeeld worden: * de methylroodpositieve groep: fermenteren uit glucose mierenzuur, azijnzuur, melkzuur, wijnsteenzuur en ethanol. Deze zuren geven de voedingsbodem een pH lager dan 4,5. * de methylroodnegatieve groep: vormen uit glucose een geringer hoeveelheid van deze zuren, meer ethanol en 2,3-butyleenglucol. De voedingsbodem heeft een pH hoger dan 4,5. Als tussenproduct van het 2,3-butyleenglucol wordt acetylmethylcarbinol gevormd. Met de Voges-Proskauer (VP)-test wordt vastgesteld of bacteriemateriaal, na fermentatieve afbraak van glucose, acetylmethylcarbinol (ook acetoïne genoemd) produceert. In aanwezigheid van zuurstof wordt het acetylmethylcarbinol geoxideerd tot diacetyl. Diacetyl reageert vervolgens met een bepaald eiwit dat aanwezig is in pepton en kreatine waardoor een rozerode verbinding wordt gevormd in alkalisch milieu. a) Benodigdheden: - stock cultuur - proefbuisjes gevuld met circa 10 ml VP-medium (vloeibaar medium) - MR-oplossing: Los 0,1 g MR op in 300 ml ethanol 95% en leng met water aan tot 500 ml. - NaOH 40% - alfa-naftol (5 g in 100 ml ethanol) - öse b) Werkwijze: - Beënt de buis met de stock cultuur - Incubeer 3 dagen bij 30 ° C en verdeel de cultuur in 2 helften - MR-test: voeg aan het ene buisje 2 tot 5 druppels MR-oplossing - VP-test: voeg aan het andere buisje 5 ml NaOH 40% toe en 3 ml alfa-naftol. Schud krachtig. c) Beoordeling van de resultaten: - MR-test: is positief --- rood pH < 4,5 is negatief --- geel pH > 4,5 - VP-test: is positief --- roodverkleuring :aanwezigheid van acetoïne is negatief --- geen roodverkleuring: geen aanwezigheid van acetoïne An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 18
2.2.1.6 Fermentatie van suikers op de Eosine Methyleen Blauw agar (EMB)
test 9 in labo a) Benodigdheden: - stock cultuur - Petriplaat met Eosine Methyleen Blauw agar (EMB) Dit medium is een selectief en differentieel medium die gebruikt wordt om fecale coliformen te isoleren. Het bevat o.a. - eosine en methyleenblauw: * zijn pH-indicatoren die bij lage pH een donker paars neerslag vormen * remmen de groei van Gram+ bacteriën - lactose - öse b) Werkwijze: - neem met de geflambeerde en afgekoelde öse een weinig stock cultuur - maak nu onmiddellijk een massale enting op de EMB in de Petriplaat - incubeer gedurende 24 u en beoordeel de oppervlak kolonies c) Beoordeling van de resultaten: - krachtige fermenters van lactose of sucrose (produceren veel zuur) → donker paarse kolonies - Escherichia coli (ook een krachtige fermenter) → geeft kolonies met een groene metalen glans - Trage of zwakke fermenters → roze kolonies - Niet lactose- of sucrosefermenters → witte kolonies = geen fecale coliformen!
2.2.1.7 Fermentatie van mannitol op de Mannitol Salt Agar (MSA) test 10 in labo a) Benodigdheden: - stock cultuur - Petriplaat met Mannitol Salt Agar (MSA) Dit medium is een selectief en differentieel medium met een hoge zoutconcentratie (7,5 %) die gebruikt wordt om selectie te maken in het geslacht Staphylococcus (deze kunnen de hoge zoutconcentratie tolereren). Het bevat o.a. - hoge zoutconcentratie - fenolrood: pH-indicator die bij lage pH geel wordt - mannitol - öse An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 19
b) Werkwijze: - neem met de geflambeerde en afgekoelde öse een weinig stock cultuur - maak nu onmiddellijk een massale enting op de MSA in de Petriplaat - incubeer gedurende 24 u en beoordeel de oppervlak kolonies c) Beoordeling van de resultaten: - Meeste pathogene Staphylococcen (o.a. Staphylococcus aureus) kunnen mannitol fermenteren (waarbij zuren gevormd worden) → kolonies + bodem geel - Meeste niet pathogene Staphylococcen kunnen mannitol niet fermenteren → geen gele kolonies/geen gele bodem (weinig of geen zuur) Wel witte kolonies. Opm: vele bacteriën groeien sowieso niet door de hoge zoutconcentratie
2.2.1.8 De ß-Galactosidasetest of de ONPG-test (orthonitrophenylgalactoside) Met deze test wordt bepaald of de bacterie beschikt over het enzym ßgalactosidase. Dit enzym kan de galactosidebinding van lactose splitsen. Lactose bestaat uit glucose en galactose die onderling verbonden zijn met een ß-galactosidebinding. Om te bepalen of het enzym aanwezig is, wordt aan een zoutoplossing met bacteriemateriaal, ß-galactosidasereagens toegevoegd. Dit reagens bevat orthonitrofenylgalactoside (ONPG) dat qua structuur op lactose lijkt. Als de bacterie over het enzym beschikt wordt het kleurloze ONPG gesplitst en komt galactose en het geel gekleurde orthonitrofenol vrij. Bij het ontstaan van een gele kleur is de test dus positief en is ß-galactosidase aanwezig. Overigens wordt bij de uitvoer van de test ook nog tolueen toegevoegd. Dit bevordert het vrijkomen van het enzym uit de bacteriecel.
2.2.1.9 De amylasetest De zetmeelafbraak kan nagegaan worden op een zetmeelbouillonagar en aangetoond worden met een lugoloplossing.
2.2.1.10 Esculinehydrolyse Dit is een belangrijke test voor de differentiatie van streptococcen. Met het medium esculinehydrolyse-agar wordt bepaald of het bacteriemateriaal esculine kan hydrolyseren. Het medium bevat in de eerste plaats esculine. Door bepaalde bacteriën kan dit worden gehydrolyseerd tot esculetine. Daarnaast bevat het medium ijzer(III)citraat. Het omzettingsproduct esculetine vormt met ijzer een zwarte verbinding, waardoor de agar zwart verkleurt. An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 20
2.2.2 De dissimilatie van N-verbindingen Naast de dissimilatie van koolhydraten is het nagaan van de afbraak van bepaalde eiwitten, peptiden, amiden en aminozuren een belangrijk hulpmiddel voor de determinatie van micro-organismen.
2.2.2.1 De gelatinase-activiteit Sommige bacteriën beschikken over het proteolytische enzym gelatinase dat gelatine kan afbreken. Gelatine wordt bij temperaturen van 22 ° C en hoger vloeibaar. Na beënten en bebroeden van een gelatinebevattend medium in een buis wordt de buis in de koelkast geplaatst. Is de gelatine afgebroken dan blijft de inhoud van de buis vloeibaar en beschikt de bacterie over gelatinase. Wordt de inhoud vast, dan is de gelatine niet afgebroken. (zie ook 2.1.4)
2.2.2.2 De caseasetest Melkeiwit of caseïne wordt gesplitst in oplosbare peptiden. Op melkagar wordt door caseolyse de kolonie omgeven door een heldere zone (hofvormig).
2.2.2.3 De desaminase-activiteit - Ammoniadetectie met acetamidebouillon en Nesslerreagens Door de hydrolytische desaminase-activiteit wordt NH3 vrijgesteld, dat aangetoond wordt met het Nesslerreagens.
2.2.2.4 De ureasetest Deze test wordt vooral gebruikt bij het onderzoek van de Enterobacteriaceae. Bacteriën die beschikken over urease-enzymen zijn in staat om ureum te splitsen in onder andere ammoniak. De media (vb. ureumagar ureumtryptofaanmedium) waarmee de aanwezigheid van urease wordt bepaald bevatten naast het substraat ureum ook de pH-indicator fenolrood. Indien ureum wordt afgebroken zal de pH van het medium stijgen dankzij de vorming van ammoniak dat alkalisch is. Het medium krijgt dan de basische kleur (rood) van de pH-indicator.
2.2.2.5 De hippuraat-hydrolysetest Er wordt nagegaan of de bacterie door middel van het enzym hippuraat-hydrolase natriumhippuraat kan splitsen (hydrolyseren) in benzoëzuur en glycine. De An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 21
hydrolyse kan worden waargenomen door één van beide eindproducten (meestal glycine) aan te tonen. De aanwezigheid van glycine wordt vastgesteld met ninhydrinereagens. Bij een positieve test ontstaat een dieppaarse kleur terwijl bij een negatieve test geen kleurverandering wordt waargenomen.
2.2.2.6 De fenylalanine-deaminase In deze test wordt vastgesteld of de bacterie over enzymen beschikt die in staat zijn het aminozuur fenylalanine te deamineren (verwijderen NH2-groep) tot fenylpyrodruivezuur. Deze test wordt uitgevoerd met behulp van het reagens dat ook wordt gebruikt bij de tryptofaan-deaminasetest, ook wel ijzerchloride-oplossing (10%) genoemd. Dit reagens bevat driewaardige ijzerionen. Door een reactie van fenylpyrodruivezuur met de ijzerionen, treedt een licht- tot donkergroene verkleuring op. De reactie is dus positief wanneer deze verkleuring optreedt. Bij een negatieve test vindt geen kleurverandering plaats en blijft de kleur van het reagens behouden.
2.2.2.7 H2S-vorming Sommige bacteriën zijn in staat om zwavel vrij te maken uit zwavelbevattende aminozuren en produceren H2S. Deze bacteriën beschikken over het enzym cysteïne-desulfhydrase (cysteïnase) en kunnen zwavel vrijmaken uit vb. pepton, cysteïne en thiosulfaat. Gevormd H2S-gas kan worden aangetoond door metalen (vb. ijzer(III)citraat of ammoniumijzer(II)sulfaat) aan het medium toe te voegen zodat een zwarte metaalsulfideverbinding ontstaat. Voorbeelden van media waarmee de vorming van H2S kan worden aangetoond zijn Triple Sugar Iron (TSI)-agar, Kligleragar en SIM-agar. Elke zwarte verkleuring wijst op een positieve test, bij een negatieve test is geen zwarte kleur te zien.
2.2.2.8 De indoltest Sommige bacteriën zijn in staat om tryptofaan of trypton te splitsen waarbij indol wordt gevormd. De voedingsbodem waarmee indolvorming wordt getest dient daarom tryptofaan of trypton te bevatten. Indol wordt vervolgens aangetoond door Kovacsreagens toe te voegen. Dit reagens bevat 1,4-dimethylaminobenzaldehyde dat samen met indol een roodgekleurde verbinding vormt. Bij een positieve reactie ontstaat een rode ring. Bij een negatieve reactie ontwikkelt zich geen kleur; het medium neemt de gele kleur van het reagens aan. → zie test 2.1.8 op SIM-medium
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 22
2.2.2.9 De aminozuur-decarboxylasetest Bacteriën die beschikken over decarboxylase-enzymen zijn in staat van aminozuren de carboxylgroep (-COOH) af te splitsen. Dit proces heet decarboxylering. Als substraat worden bij deze test respectievelijk lysine, arginine, ornithine, tyrosine of andere amoinozuren gebruikt. Daarnaast is de pH-indicator broomcresolpurper in het medium aanwezig. Als decarboxylase-enzymen aanwezig zijn ontstaan aminen en CO2. Hierdoor stijgt de pH en krijgt de pH-indicator de basische kleur paars. Een gele kleur (zuur) in de buis duidt op een negatieve reactie en decarboxylatie heeft niet plaatsgevonden.
2.2.3 De afbraak van lipiden en lipoïden 2.2.3.1 De lipasetest Door de vetsplitsende werking van micro-organismen worden lipiden gehydrolyseerd met vrijstelling van vetzuren en glycerol.
2.2.3.2 De lecithinasetest Lecithinase is een fosfolipase en is in staat lecithine te splitsen in fosforylcholine, glycerol en vetzuren.
2.2.4 De oxydo-reductase reacties 2.2.4.1 De katalasetest Deze test is een belangrijke bevestigingsreactie voor aërobe micro-organismen. Er wordt bepaald of het enzym katalase aanwezig is in de bacterie. Bepaalde bacteriën bezitten dit enzym. Katalase splitst waterstofperoxide (H2O2) (giftig voor de cellen) in water (H2O) en zuurstofgas (O2). Het ontstaan van belletjes direct na het toevoegen van waterstofperoxide-oplossing (3%) duidt op de aanwezigheid van katalase. In dat geval is de test positief. a) Benodigdheden: - H2O2 (3%) (v/v) oplossing – vers bereid - objectglaasje - entnaald - kolonie van de te onderzoeken bacterie (van 2.2.1) An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 23
b) Werkwijze: - Breng een druppel waterstofperoxide-oplossing (3%) aan op een objectglaasje. - Haal met een steriele entnaald wat materiaal af van de rand van een losliggende kolonie. Breng het over in de H2O2-oplossing op het objectglas en meng. c) Beoordeling van de resultaten: - Beoordeel op gasproductie (vorming van belletjes binnen 30 seconden). - De test is positief als gas wordt gevormd.
2.2.4.2 De oxidasetest De oxidasetest geeft aan of de bacterie het enzym oxidase bezit. Oxidase is alleen aanwezig bij aërobe en facultatief anaërobe bacteriën. Strikt anaëroben bezitten dit enzym niet. Een uitzondering hierop vormt één soort van het geslacht Bacteroïdes. De oxidasetest wordt uitgevoerd met behulp van oxidasereagens. Dit reagens bevat het substraat N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4-fenyleendiaminedihydrochloride dat door oxidase wordt omgezet in een paars / blauwgekleurd product. Indien het enzym niet aanwezig is treedt geen verkleuring op binnen de aangegeven tijdsduur. a) Benodigdheden: - oxidasereagens (1%) - entnaald - kolonie van de te onderzoeken bacterie (van 2.1.1) b) Werkwijze: - Haal met een steriele entnaald wat materiaal af van de rand van een losliggende kolonie. - Breng het over op een filterpapiertje dat is bevochtigd met het oxidasereagens. c) Beoordeling van de resultaten: - De test is positief als de kleur van het filterpapier binnen 10 seconden verandert in violet of diepblauw (oxidase aanwezig). Als de kleur niet verandert, is de test negatief.
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 24
2.2.4.3 De nitraatreductase reactie Met deze test wordt bepaald of de bacterie het enzym nitratase kan vormen en dus het vermogen bezit om nitraat (NO3-) dat aanwezig is in vb. nitraatmedium, tot nitriet (NO2-) of tot vrij stikstofgas (N2) te reduceren. Dit proces vindt meestal plaats onder anaĂŤrobe omstandigheden. De aanwezigheid van nitriet kan worden aangetoond met behulp van een nitrietreagens. Dit geeft samen met nitriet een rode kleur (positieve reactie). Indien binnen 10 minuten geen kleurverandering wordt waargenomen, blijven 2 mogelijkheden over: of het nitraat is niet omgezet of het nitraat is omgezet in nitriet, dat al verder is gereduceerd tot stikstof. Om deze gevallen te onderscheiden wordt een klein beetje zinkpoeder toegevoegd. Zinkpoeder katalyseert de omzetting van nitraat tot nitriet. Indien na het toevoegen van zinkpoeder een rode kleur verschijnt betekent dit dat er nog nitraat aanwezig was en is de reactie negatief. Indien er na 10 minuten geen kleurverandering plaatsvindt was er geen nitraat meer aanwezig en was het gevormde nitriet verder omgezet in stikstof. In dat geval is de test positief.
2.2.5 De reacties op bloed en plasma 2.2.5.1 De hemolysetest
2.2.5.2 De coagulasetest Deze test wordt gebruikt om karakteristieke Staphylococcus aureus kolonies van Baird-Parker (BP)-agar te bevestigen. Het is een belangrijke bevestigingstest voor pathogene Staphylococcus aureus stammen. Coagulase is een enzym dat alleen door S. aureus en andere coagulase positieve staphylococcen wordt geproduceerd. Door bacteriemateriaal van karakteristieke kolonies te suspenderen en te bebroeden in een buis met plasma van (konijnen)fibrinogeen kan worden vastgesteld of daadwerkelijk S. aureus is geĂŻsoleerd. Dit is te zien als een klontering doordat fibrinedraden tussen de bacteriecellen worden gevormd.
An Vandenhaute
Practica Levensmiddelenmicrobiologie
Deel 2 p. 25