Hình 2.10: Các bước nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả

Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.

Bước 2: Cố định tế bào

Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2÷3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính.

Bước 3: Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước, thầm khô.

Bước 4: Nhuộm bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

Bước 5: Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.

Bước 6: Nhuộm tiếp bằng dung dịch safranin trong 2÷3 phút, rửa nước, để khô. Lần nhuộm này cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ hồng (nhuộm safranin).

Bước 7: Soi kính, dùng vật kính dầu 100x.

Hình 2.10: Các bước nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả. 2.2.4. Thử nghiệm tính di động của vi khuẩn • Mục đích: xác định khả năng di động của vi khuẩn • Cơ sở: vi sinh vật di động đã sử dụng lông roi để di chuyển ra ngoài đường cấy và xuất hiện mờ khói trong môi trường [1]. • Cách tiến hành:

- Chuẩn bị môi trường N92M2 thạch mềm (0,5% agar).

- Dùng đầu nhọn que cấy lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn, thận trọng di chuyển đầu que cấy trên một đường vào sâu trong ống nghiệm chứa môi trường thạch mềm, không chọc que cấy xuống tận đáy ống nghiệm. - Nuôi trong bình hút ẩm khị khí ở nhiệt độ phòng, tiến hành quan sát sau 2÷3 ngày nuôi cấy. - Tiến hành tương tự với mẫu đối chứng là vi khuẩn Lactobacillus casei, dùng môi trường Cao thịt- Peptone (Thành phần môi trường bao gồm: Agar 20g, peptone 10g, cao thịt 10g, NaCl 5g, hòa tan trong 40ml nước cất, thanh trùng ở 1210C/2h) [16].

- Quan sát hiện tượng xảy ra: + Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường, và phát triển lan ra khỏi vết cấy. + Vi khuẩn không có khả năng di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục. 2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng SRB mới được phân lập

Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào. Phương pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng. Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất [11].

Thông thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phương pháp truyền thống, người ta thường dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa phân loại được sử dụng rộng rãi nhất là khóa phân loại Bergey (Bergey‘s Manual of Systematic Bacteriology) [24].

Để xác định được đâu là điều kiện tối ưu cho khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn SRB các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cơ chất, nguồn nito, yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH, đã tuần tự được thực hiện.

Chủng vi khuẩn SRB được nuôi cấy trên môi trường N92M2 với sự thay đổi một số thành phần của môi trường như: nguồn cơ chất, nguồn nito, yếu tố nhiệt độ, pH.