8.2 MONITORAGGIO E INDICATORI DI RISULTATO MICROBIOLOGICO

Come già descritto per gli indicatori riguardanti i patogeni batterici e micotici ,il risultato finale del processo di sanificazione è quello di ottenere un ambiente il più salubre possibile, controllando in modo ottimale il rischio di contrarre patologie da parte dei fruitori dei locali sanificati.

Anche nel caso dei virus, pertanto, il risultato è ottenuto garantendo l’assenza (o presenza soltanto in tracce), sulle superfici trattate e nell’aria dei locali, dei virus patogeni potenzialmente in grado di infettare chi vi soggiorna.

E’ quindi necessario, come già descritto, predisporre un piano di campionamento, dedicare un budget adeguato alla realizzazione di tale attività, ed effettuare i campionamenti sulle superfici e nell’aria al fine di valutare la presenza di contaminanti virali potenzialmente patogeni.

Al momento, le normative potenzialmente utilizzabili per la valutazione della presenza e della quantità di virus presente in un campione fanno unicamente riferimento a metodi di indagine biologica, in cui il titolo del virus ricercato viene misurato ed espresso come TCID50, cioè dose infettante in grado di provocare comparsa di effetto citopatico (CPE) in almeno il 50% delle cellule bersaglio in coltura. Il titolo viene di norma espresso in forma logaritmica, ed è calcolato mediante inoculazione diretta di diluizioni scalari del campione contenente il virus in idonee colture cellulari seminate in piastre da 96 pozzetti (UNI EN 14476:2019; UNI EN 16777:2019 e similari).

Questi metodi di indagine, tuttavia, mal si applicano a monitoraggi ambientali, per diversi motivi:

- Sono utilizzabili per quantitativi elevati o discreti di virus, ma non per mettere in evidenza quantitativi relativamente bassi di virus, quali quelli che ci si possono aspettare in ambiente ospedaliero;

- Mettono in evidenza solo i virus infettanti, e non quelli totali presenti ma che potrebbero perdere la capacità infettante anche a causa delle metodiche di campionamento e trasporto dei campioni;

- Sono laboriose e necessitano di tempi prolungati, in quanto necessitano della crescita dei virus nelle cellule bersaglio: tali cellule devono essere preventivamente coltivate ed espanse, e una volta infettate per la visualizzazione del CPE possono essere necessari molti giorni in coltura;

- Non sono utilizzabili per virus che non causano un CPE ben evidenziabile in coltura, per i quali è poi necessario aggiungere successive analisi molecolari o sierologiche (ad esempio immunofluorescenza per evidenziare la presenza di antigeni virali);

- Necessitano di laboratori di microbiologia di idonea classe di rischio: ad esempio, per crescere in coltura virus di classe 3 (come ad esempio il SARSCoV-2) è obbligatorio l’uso di un laboratorio BSL3 (Bio Safety Level 3);

- Sono in generale costose, per la necessità di strumentazione come: cappa flusso laminare biohazard di classe II, incubatore termostatato con CO 2, plasticheria sterile per colture cellulari, terreni di coltura per cellule, pipettatori e microdosatori sterilizzabili, microscopio ottico e a fluorescenza, ecc

- Sono utilizzabili solo per i virus di cui si hanno a disposizione i sistemi cellulari permissivi alla crescita del virus in esame, che consentono quindi la replicazione e propagazione del virus, e l’evidenziazione del suo CPE;

- Necessitano di personale addestrato e i risultati dipendono fortemente dalla manualità e dall’esperienza degli operatori.

Al contrario, le metodiche di indagine di tipo molecolare appaiono di utilizzo più immediato, più semplice, e meno costoso.

- Sono in grado di mettere in evidenza anche quantitativi molto bassi di virus;

- mettono in evidenza tutti i virus presenti, anche quelli defettivi o che hanno perso l’infettività a causa di campionamento o trasporto effettuati in condizioni non ottimali;

- possono fornire il risultato entro 24 ore dal campionamento;

- sono utilizzabili su qualsiasi tipo di virus, inclusi quelli che non determinano CPE evidente in colture cellulari;

- possono essere effettuate in laboratori di microbiologia BSL2, in quanto non comportano la propagazione di virus infettante, ma anzi il virus viene immediatamente inattivato dai processi di analisi;

- sono in generale meno costose e laboriose rispetto alle procedure di analisi biologica, in quanto necessitano di: cappa flusso laminare biohazard di classe II e degli strumenti/reagenti per biologia molecolare (termociclatore ed eventuale estrattore);

- grazie a sistemi “in kit” e strumenti sempre più maneggevoli, è richiesta una formazione più semplice per gli operatori che devono svolgere le analisi.

8.3 ANALISI DI SUPERFICIE

La contaminazione virale sulle superfici può essere messa in evidenza mediante campionamento superficiale con la tecnica del tampone .

Modalità di campionamento: la dimensione della superficie campionata deve essere nota (preferibilmente 10x10 cm) e viene a tale scopo utilizzata una mascherina sterile di dimensioni adeguate. Il campionamento viene effettuato come già descritto per le componenti batteriche/ micotiche. Il materiale che costituisce il tampone deve essere sterile e con punta di rayon, o altro materiale che consenta un efficace recupero ed estrazione di acidi nucleici virali dal campione raccolto. Il tampone deve essere preventivamente inumidito con soluzione fisiologica sterile, e una volta raccolto il materiale da analizzare dovrà essere poi immediatamente posto in una provetta sterile contenente un piccolo volume (0.5-2 ml) di soluzione tamponata sterile, eventualmente già contenente un inattivante, importante soprattutto in caso ci si aspetti la possibile presenza di virus in classe di rischio 3.

Trattamento e trasporto dei campioni: Il campione dovrà essere immediatamente refrigerato e trasportato preferibilmente entro 4 h (comunque non oltre 24 h) al laboratorio, dove potrà essere processato immediatamente oppure congelato a -80°C fino al momento dell’analisi. Se non è possibile trasportare immediatamente il campione al laboratorio, questo può essere congelato immediatamente a -80°C e scongelato al momento dell’analisi: fino al momento dell’analisi il campione non dovrà subire alcuno scongelamento, pertanto, se necessario, il trasporto dovrà essere effettuato in ghiaccio secco, per garantire il mantenimento del congelamento del campione trasportato.

8.4 ANALISI DELL’ARIA

La contaminazione virale sulle superfici può essere messa in evidenza mediante campionamento dell’aria con campionatore attivo, scegliendo punti, volume di aria e frequenza di campionamento come già descritto (pag 98-99). Tuttavia, non possono essere utilizzati i normali aspiratori o strumenti già descritti nelle pagg 101-103 delle Linee Guida, ma è necessario utilizzare aspiratori appositamente studiati a tale scopo.

Modalità di campionamento:

Per l’analisi dell’aria è possibile utilizzare aspiratori appositamente studiati per consentire la raccolta di particelle delle dimensioni dei virus (< 1 micron) da un volume di aria raccolta.

Brevemente, gli strumenti che possono essere utilizzati per la rilevazione della contaminazione virale nell’aria includono:

- campionatori ciclonici tipo NIOSH BC-112 (Figura 3), oppure i più recenti modelli BC-251 (figura 1b), che raccolgono il materiale aerodisperso in provette, separabili per volume e dimensioni;

- campionatori attivi tipo quello rappresentato in fig.4, che raccolgono il materiale aerodisperso su membrane gelificate che possono poi essere utilizzate per l’estrazione del materiale genetico delle particelle raccolte; il campionatore è simile a quello già descritto per batteri e miceti, ma il flusso di aspirazione è regolabile, per evitare un impatto eccessivo sulle membrane di raccolta; tali membrane possono essere utilizzate per le successive analisi molecolari in quanto completamente solubili in mezzo acquoso (il che consente il recupero dei virus e la successiva estrazione del loro materiale genetico); ciò non è invece possibile utilizzando le normali piastre di terreno agarizzato montate sui campionatori utilizzati per batteri e miceti, che non possono quindi essere usate per questo scopo.