Citogenética Molecular: Protocolos Comentados by Editora Cubo

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Ribeirão Preto, SP, 2012 Citogenética Molecular: Protocolos Comentados

Citogenética molecular : protocolos comentados / Marcelo Guerra (coordenador). – Ribeirão Preto : Sociedade Brasileira de Genética (SBG), 2012. 132 p. ISBN 978-85-89265-15-7 1. Citogenética molecular - Protocolos. 2. Hibridização in situ. 3. FISH. 4. Imunocitogenética. 5. Mapeamento cromossômico. I. Guerra, Marcelo, coord.

Capa, projeto gráfico, diagramação e normalização

Prefácio A Citogenética distingue-se de outras áreas da Genética por demandar um treinamento técnico relativamente longo e por ser um trabalho fortemente artesanal, em que a qualidade e a beleza dos resultados dependem tanto dos protocolos utilizados quanto da habilidade individual do pesquisador. A automação nessa área tem feito apenas pequenos progressos, em relação àquela disponível em outras abordagens do genoma. Na Citogenética Molecular, o pesquisador, além de dominar a arte de preparar uma boa lâmina, precisa também estar familiarizado com técnicas moleculares e equipamentos mais sofisticados que possibilitem um maior poder de resolução. Isto não significa que seja indispensável dispor de equipamentos e condições técnicas especiais. Na prática, quase todos os equipamentos mais caros podem ser substituídos por outros mais simples e os práticos “kits” comerciais podem ser substituídos por soluções mais baratas, preparadas no laboratório e igualmente funcionais. Além disso, colaborações com outros laboratórios podem resolver muitos desses problemas de equipamentos e são sempre muito bem-vindas para todas as partes envolvidas. A importância da introdução dessas técnicas nos nossos laboratórios para trabalhos de rotina é indiscutível, embora as técnicas de coloração convencional continuem sendo muito úteis e geralmente mais rápidas e práticas. A escolha das técnicas a serem utilizadas (convencionais ou moleculares) depende essencialmente dos objetivos da pesquisa. Muito provavelmente, a maior parte dos fenômenos citológicos que podem ser investigados apenas com técnicas clássicas já foi extensamente estudada. Por outro lado, a aplicação de técnicas citogenéticas convencionais, principalmente em organismos pouco ou não estudados, pode trazer informações importantes para a citotaxonomia, citogeografia, análise de híbridos, melhoramento genético e várias outras situações em que o detalhamento da estrutura cromossômica não seja tão importante. Protocolos para as técnicas de coloração convencional, bandeamento cromossômico e outros procedimentos mais gerais podem ser encontrados nos livros “Como analisar cromossomos: um guia de técnicas em citogenética vegetal, animal e humana” (M. Guerra e M.J. de Souza, 2002, FUNPEC-Editora, Ribeirão Preto) e “Introdução à pesquisa em citogenética de vertebrados” (S. Kasahara, 2009, Editora SBG, Ribeirão Preto). Atualmente, técnicas de citogenética molecular são utilizadas na maioria dos nossos laboratórios, embora muitos se restrinjam à aplicação de poucos tipos de sonda a um determinado grupo de organismos. Este livro traz um conjunto de protocolos de hibridização in situ fluorescente (FISH) e imunocitogenética utilizados em diferentes grupos de organismos, comentados por pesquisadores com extensa experiência nessas técnicas e suas variantes. Uma observação atenta dos tempos, concentração das soluções e modos de realizar cada etapa nos diferentes protocolos

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pode ajudar a entender o que é essencial na técnica. É bem provável que o protocolo que você conhece difira do recomendado em um determinado capítulo. Isso se deve principalmente ao fato de que não existe uma maneira única de fazer bandeamento C, FISH ou qualquer outra técnica. Para que os usuários desses protocolos possam tirar dúvidas e obter o seu máximo proveito, os e-mails de todos os colaboradores estão disponibilizados para serem utilizados sempre que necessário. A fundamentação teórica e comentários sobre a aplicação dessas técnicas foram evitados aqui por já terem sido apresentadas anteriormente no livro “FISH: conceitos e aplicações na citogenética” (M. Guerra, org., 2004, Sociedade Brasileira de Genética, Ribeirão Preto). Gostaria de ressaltar que a elaboração desse livro se deveu principalmente aos colegas que aceitaram a proposta de divulgar os protocolos utilizados em seus laboratórios, destacando os pontos que consideram críticos para o sucesso da técnica. Embora eu tenha feito pequenas sugestões em todos os capítulos, a responsabilidade sobre cada capítulo, incluindo os conceitos, o preparo das soluções, a originalidade das fotos e esquemas, etc., é exclusiva dos seus respectivos autores. No meu laboratório contei ainda com a valiosa colaboração da amiga Ana Emilia, meu braço direito no laboratório, que me ajudou na revisão de alguns aspectos do livro, e do amigo Gustavo Souza, pela maravilhosa foto dos cromossomos de Nothoscordum arenarium especialmente trabalhada para a capa deste livro. Muito importante também foi a atenção do Gustavo, Larissa e Karen, da Editora Cubo, sempre empenhados em colaborar da melhor maneira possível na elaboração final do livro. A todos sou imensamente grato.

Marcelo Guerra

Colaboradores André Luís Laforga Vanzela Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR. E-mail: andrevanzela@uel.br

Andrea Pedrosa Harand Departamento de Botânica, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE. E-mail: andrea.pedrosaharand@pesquisador.cnpq.br

Cesar Martins Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, UNESP - Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP. E-mail: cmartins@ibb.unesp.br

Gianna Carvalheira Departamento de Morfologia e Genética, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP. E-mail: carvalheira@unifesp.br

Marcelo Guerra Departamento de Botânica, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE. E-mail: marcelo.guerra@pq.cnpq

Marcelo Ricardo Vicari Departamento de Biologia Estrutural, Molecular e Genética, Universidade Estadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa, PR. E- mail: vicarimr@pq.cnpq.br

Maria Isabel Melaragno Departamento de Morfologia e Genética, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP. E-mail: melaragno.morf@epm.br

Marta Svartman Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG. E-mail: svartmanm@icb.ufmg.br

Sumário Capítulo 1 Introdução às técnicas de FISH e imunocitogenética ...................... 1 Capítulo 2 Hibridização in situ em plantas ....................................................... 7 Capítulo 3 Hibridização in situ de BACs.......................................................... 35 Capítulo 4 Hibridação in situ em cromossomos de peixes .............................. 59 Capítulo 5 Hibridização in situ em mamíferos ............................................... 89 Capítulo 6 FISH em cromossomos humanos..................................................101 Capítulo 7 Imunocitogenética.........................................................................111

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Capítulo 1

Introdução às Técnicas de FISH e Imunocitogenética Marcelo Guerra Departamento de Botânica – UFPE 1. Introdução 2. Uso dos protocolos 3. Escolha e conservação de drogas e equipamentos 4. Anotações gerais no laboratório 5. Conservação e descarte de soluções 6. Conservação de lâminas coradas 7. Documentação fotográfica e publicação dos dados Referências

1. Introdução As técnicas de FISH e imunocitogenética utilizadas em diferentes organismos são muito parecidas. Nos capítulos seguintes são apresentados protocolos completos para alguns dos grupos de organismos mais estudados. É interessante comparar determinadas etapas dos protocolos da FISH em diferentes organismos. Em qualquer caso, o nível de organização necessário para o bom funcionamento do laboratório é muito mais exigente. Abaixo seguem algumas recomendações de ordem prática e geral, que poderão ajudar no melhor funcionamento do laboratório. Entre os vários outros textos sobre técnicas de citogenética molecular, destaco o livro de Schwarzacher e Heslop-Harrison (2000) que, por sua clareza e abrangência, influenciou a citogenética molecular vegetal em todo o mundo e pode ser igualmente útil para quem trabalha com outros organismos. Para cromossomos humanos e de animais, uma visão abrangente das diferentes técnicas baseadas em FISH pode ser encontrada nos numerosos capítulos dos livros de Bridger e Volpi (2010) e no de Liehr (2009), que inclui um capítulo com endereços na internet para diversas técnicas e literatura. Uma visão complementar da história da citogenética, com os seus princípios teóricos e diversos protocolos de citogenética humana, pode ser encontrada no livro de Maluf e Riegel (2011).

2. Uso dos protocolos Para utilizar esses protocolos, é recomendado que você leia primeiramente todo o protocolo, certifique-se de que tudo que vai precisar até a conclusão da técnica (geralmente dois dias seguidos) estará disponível em quantidade suficiente e em bom estado de uso. Isso inclui anticorpos, solução de uso dos tampões, fluorocromos, banho-maria previamente estabilizado na temperatura que vai necessitar, gelo picado, etc. Para facilidade de trabalho, é altamente recomendável que você mesmo construa um protocolo simplificado para servir de guia durante o andamento da técnica.

Introdução às Técnicas de FISH e Imunocitogenética

Ao utilizar pela primeira vez um protocolo procure segui-lo fielmente, utilizando como controle um material já estudado com aquela técnica. A maioria das técnicas exige experiência prévia com o protocolo ou com o organismo em estudo. A primeira tentativa de uso de um protocolo raramente funciona tão bem, por isso, não mude de protocolo antes de se certificar de que o primeiro realmente não funciona. O ideal é fazer um curto treinamento em um laboratório onde a técnica já esteja bem estabelecida. As condições próprias de cada laboratório, como a qualidade da água, os reagentes mais simples, geralmente de fabricação nacional, ou as condições de transporte e manutenção dos reagentes, podem influir nos resultados de um mesmo protocolo utilizado em distintos laboratórios, exigindo pequenas adaptações. Embora existam diversos protocolos diferentes para hibridizar um mesmo tipo de sonda em um mesmo tipo de organismo, é preciso ter cuidado com a introdução de variações nos protocolos. Em muitos protocolos um passo aparentemente sem muita importância (a temperatura de fixação das células, o tempo de envelhecimento da lâmina, os banhos em álcool absoluto, a temperatura certa de incubação, etc.) pode ser fundamental para a obtenção de bons resultados. Não raro, a fundamentação teórica de muitos passos dos protocolos é desconhecida e seu uso se deve à adaptação empírica de outros protocolos. Caso uma determinada alteração pareça mais eficaz que o recomendado no protocolo, repita algumas vezes o procedimento padrão e o procedimento alterado para ter certeza que não foi um acidente. Procure ver se essa alteração funciona melhor também em experimentos de outros colegas. A maioria das alterações deve ser citada como modificações de determinado protocolo. Por outro lado, mudanças de protocolo mais significantes merecem redesenhar o experimento, de forma a que as variantes introduzidas sejam bem controladas, e realizar uma publicação à parte (veja, por exemplo, Cuadrado e Houben, 2010; Chelysheva et al., 2010).

3. Escolha e conservação de drogas e equipamentos Para o trabalho de pesquisa, a qualidade das drogas e equipamentos deve sempre ser priorizada. Às vezes, uma droga mais cara pode evitar insucessos em repetidas tentativas e se tornar mais econômica ao final. Cheque sempre a validade dos produtos e as condições de transporte. Se possível, faça um teste com as drogas mais sensíveis logo que as receba. Nunca opte por equipamentos baratos de marca desconhecida, porque, em geral, têm óptica ou mecânica inferior e baixa durabilidade, e evite comprar marcas das quais você desconhece a assistência técnica. Há pouca diferença, por exemplo, entre as marcas de fotomicroscópios mais bem estabelecidas no mercado. As câmeras fotográficas e os softwares que permitem capturar e sobrepor imagens podem ser de marcas diferentes dos microscópios e, aqui sim, há diferenças importantes entre marcas. Uma troca de e-mails com colegas que possuem essas marcas pode ajudar muito na escolha certa, principalmente em relação à assistência técnica. Kits, primers, etc., geralmente vêm com uma ‘bula’, indicando as principais características e algumas recomendações técnicas de uso. Guarde as bulas em uma pasta colecionadora e mantenha a pasta num armário de fácil acesso para todos.

Citogenética Molecular: Protocolos Comentados

4. Anotações gerais no laboratório Cada pesquisador na bancada necessita de ao menos duas cadernetas de trabalho: uma caderneta de técnicas, com detalhes dos protocolos utilizados no seu laboratório, e outra de resultados, com todos os dados do material, alguma alteração casual durante os procedimentos, os resultados da análise das lâminas, etc. Muitas vezes, as anotações da análise de uma lâmina na caderneta são tão importantes quanto as fotos obtidas daquela lâmina. Certifique-se de que você possui anotadas todas as informações sobre os produtos e equipamentos utilizados (marca, modelo, número de catálogo, etc). Essas informações poderão ser úteis na redação do trabalho ou anos depois, principalmente durante estágios noutros laboratórios. É aconselhável colocar data em praticamente tudo (nas cadernetas, nas etiquetas de fixação, nos vidros de soluções, nas lâminas, etc.), não apenas para se certificar da idade das lâminas, soluções, etc., mas para eventualmente reconstituir o que pode ter causado um resultado inesperado. Nunca delegue à sua própria memória a função de guardar qualquer dado.

5. Conservação e descarte de soluções Todos os corantes, fluorocromos, anticorpos ligados a fluorocromos, etc. devem ser guardados em recipiente escuro ou protegido da luz com papel alumínio. Dependendo da solução pode ser guardada no freezer ou na geladeira (veja no rótulo). Congelar e descongelar uma solução várias vezes pode alterar fortemente suas propriedades, principalmente proteínas (anticorpos, enzimas). Por essa razão, em muitos casos é preferível dividir a solução original em pequenas alíquotas etiquetadas individualmente. As soluções utilizadas nessas técnicas (principalmente os ácidos, antimitóticos, fluorocromos, etc) não devem ser descartadas na pia, mas sim estocadas em garrafas de vidro, bem fechadas e, posteriormente, recolhidas por firmas especializadas nesse tipo de descarte. Lâmpadas fluorescentes usadas também não podem ser jogadas no lixo comum. Caso não exista em sua instituição um serviço especializado no recolhimento desses resíduos, estoque provisoriamente em grandes botijões e solicite providências da administração. É importante ter também um recipiente de vidro de boca larga, com tampa de rosca e capacidade para cerca de 2 a 3 litros que permita receber lamínulas retiradas das lâminas utilizando jatos de água ou tampão.

6. Conservação de lâminas coradas As lâminas coradas que deseja guardar por muito tempo podem ser mais bem conservadas em uma caixa porta-lâminas na geladeira. Ao analisar lâminas estocadas por muito tempo, mesmo quando conservadas a –20 °C, considere a possibilidade de que algumas propriedades do DNA, das proteínas ou dos fluorocromos podem ter sido alteradas com o tempo. Algumas frações da cromatina, especialmente certos tipos de heterocromatina, podem aparecer apenas após esse envelhecimento ou podem alterar suas propriedades de coloração durante o envelhecimento. As melhores lâminas podem ser descoradas e utilizadas imediatamente em uma coloração sequencial ou refixadas, conservadas secas em caixas apropriadas no freezer e utilizadas depois em outra coloração.

Introdução às Técnicas de FISH e Imunocitogenética

7. Documentação fotográfica e publicação dos dados A documentação fotográfica é um item fundamental tanto para a análise final dos dados quanto para a construção de um banco de dados do laboratório. Como rotina, deve ser feito um registro não apenas das melhores metáfases, mas também de algumas prófases bem espalhadas e de núcleos interfásicos com a estrutura da cromatina representativa do material analisado. A organização das fotos em pastas e subpastas, nomeadas por aluno, por material, por ano, etc., é fundamental para resgatar todos os dados corretamente. Fotos de diferentes lâminas devem sempre ser arquivadas em subpastas separadas e identificadas. As fotos salvas no computador do fotomicroscópio devem ser transferidas periodicamente para um HD externo. Ao menos uma vez por semestre ou por ano, devem ser feitas duas cópias extras de segurança dos dados do HD externo em DVD: uma para o aluno e outra para o laboratório. As fotos devem, antes de tudo, ilustrar claramente os resultados relatados. Nunca publique fotos desfocadas, mesmo que tenha vários motivos para isso. Fotos de fluorescência devem ter um fundo preto uniforme, sem perder o contorno natural dos cromossomos e sem apagar nenhum dos sinais que devem ser mostrados. Se o objetivo da foto for mostrar um sítio de FISH muito pequeno e, para isso, for necessário clarear muito a imagem, apresente a célula com contraste e brilho normais e acrescente um inserto com o cromossomo em questão ampliado e com contraste ideal para aquele cromossomo. Trabalhando com sinais muito pequenos é fácil encontrar falsos sinais. Se sua foto precisar de muita manipulação de brilho e contraste para mostrar o que você está querendo, pode ser que o sinal que você quer mostrar seja apenas um artefato. Essas técnicas facilmente geram falsos sinais, especialmente em lâminas com muita precipitação da sonda (background). Afora isso, o autor de um trabalho tem bastante liberdade para ajustar o brilho e contraste das imagens e mesmo modificar as cores dos fluorocromos, desde que essas modificações fiquem explicitadas na publicação. Na foto da capa deste livro algumas cores da imagem original foram substituídas por cores complementares e posteriormente invertidas, de maneira a obter um fundo branco, mas todos os sinais originais foram mantidos e nada foi isoladamente apagado. Nunca altere setores isolados da imagem com recursos do Adobe Photoshop® ou similar porque neste caso o conteúdo da imagem estará sendo forjado. Com as facilidades das câmaras digitais, há uma tendência a gerar mais “lixo fotográfico”, deixando, às vezes, de documentar muito bem as melhores células. Toda foto potencialmente candidata a uma publicação deve ser repetida uma ou mais vezes até obter o melhor contraste, brilho, detalhamento do motivo principal, etc. Nunca confie no jeitinho que você poderá dar posteriormente com o Adobe Photoshop®. Antes de descartar uma lâmina, certifique-se de que as fotos ficaram boas e que você não vai precisar mais dessa lâmina para uma coloração sequencial ou para aumentar a amostra de células investigadas. Ao montar a prancha com seus resultados para publicação, considere a possibilidade de os diagramadores reduzirem o tamanho das pranchas, deixando algum detalhe a ser mostrado pouco evidente (nesses casos, setas ou insertos com ampliação de detalhes são importantes). Certifique-se de que todas as letras, palavras ou desenhos que acompanham a prancha estão proporcionais e com um tamanho adequado ao espaço permitido pela revista, e que não serão significativamente prejudicados por uma eventual redução de até 50% pelo diagramador.

Citogenética Molecular: Protocolos Comentados

Por fim, ao tentar a melhor revista em que seu trabalho poderá ser publicado, prepare seu espírito para a recusa do manuscrito e mesmo para uma eventual avaliação improcedente dos revisores. Mesmo os melhores pesquisadores brasileiros e estrangeiros não estão livres dessa decepção. O importante é prestar atenção às críticas dos revisores e não perder o entusiasmo em transformar o manuscrito em um artigo. Uma vez submetido para publicação, o manuscrito deve ser sua prioridade número um no laboratório, até que ele seja efetivamente publicado.

Referências Bridger, J.M., Volpi, E.V. (Ed.) 2010. Fluorescent in situ hybridization (FISH): protocols and applications. Springer, New York, 451 pp. Chelysheva, L., Grandont, L., Vrielynck, N., le Guin, S., Mercier, R., Grelon, M. 2010. An easy protocol for studying chromatin and recombination protein dynamics during Arabidopsis thaliana meiosis: immunodetection of cohesins, histones and MLH1. Cytogenet Genome Res 129:143153. PMid:20628250. http://dx.doi.org/10.1159/000314096 Cuadrado, A., Houben, N. 2010. A novel, simple and rapid nondenaturing FISH (ND-FISH) technique for the detection of plant telomeres. Potential used and possible target structures detected. Chromosome Res 17:755-62. PMid:19669910. http://dx.doi.org/10.1007/s10577-009-9060-z Liehr, T. (Ed.) 2009. Fluorescence in situ hybridization (FISH) – application guide. Springer, Berlin, 445 pp. Maluf, S.W., Riegel, M. 2011. Citogenética humana. Artmed, Porto Alegre, 334 pp. Schwarzacher, T., Heslop-Harrison, J.S. 2000. Practical in situ hybridization. BIOS Scientific Publishers Ltda, Oxford, 199 pp.

Introdução às Técnicas de FISH e Imunocitogenética

Capítulo 2

Hibridização in situ em Plantas André Luís Laforga Vanzela Departamento de Biologia Geral – UEL

1. Obtenção, pré-tratamento e estocagem das lâminas 2. Obtenção das sondas 2.1. Obtenção de DNA plasmidial em pequena escala (Mini Prep) 2.2. Obtenção de DNA satélite 2.2.1. Extração de DNA genômico 2.2.2. Limpeza de DNA genômico 2.2.3. Clivagem de DNA genômico com enzimas de restrição 2.2.4. Eletroforese em gel de agarose 2.3. Obtenção de retroelementos 2.3.1. PCR com primers degenerados e isolamento das bandas 3. Marcação das sondas 3.1. Nick translation 3.2. Random primers 3.3. PCR 4. Controle da marcação das sondas (dot blot) 5. Hibridização in situ com fluorocromos 5.1. Pré-tratamento das lâminas 5.2. Preparo da mistura de hibridização 5.3. Banhos pós-hibridização 5.4. Detecção da sonda 6. Observação e registro das imagens 7. Preparo de soluções Páginas úteis Referências Leituras recomendadas

1. Obtenção, pré-tratamento e estocagem das lâminas A coleta, o pré-tratamento e a fixação de raízes ou outro tecido vegetal para a confecção de lâminas seguem os mesmos critérios indicados para a coloração convencional e bandamento cromossômico (Guerra e Souza, 2002). Como a hibridização in situ é um procedimento bastante caro e que envolve inúmeras etapas, é importante pré-tratar e fixar somente raízes excelentes e com reagentes de ótima qualidade. Um dos maiores problemas enfrentados para a obtenção de boas células é a presença excessiva de citoplasma, o que pode ser minimizado com uma boa fixação. Algumas medidas que podem auxiliar na obtenção de lâminas boas para a FISH são descritas a seguir: a) Utilize sempre raízes novas, com as pontas esbranquiçadas e sem sinais de parede celular muito densa.

Hibridização in situ em Plantas

b) Prepare fixadores sempre no momento do uso, agite por uma hora após adicionar as amostras e, se possível, faça uma troca de fixador antes de estocar as amostras no freezer. c) Utilize sempre lâminas novas e limpas e, assim que preparadas, procure fazer a FISH com um ou dois dias após o preparo. Caso não seja possível, estoque as lâminas em álcool absoluto ou secas, sempre a –20 °C. d) As lâminas podem ser coradas com Giemsa 2%, as metáfases fotografadas (desde que a lamínula seja montada em água), descoradas em ácido acético 20% por 20 minutos, desidratadas em álcool 70 e 100%, por 5 minutos cada uma, e utilizadas para a FISH. e) As lâminas podem ser coradas com DAPI (2 μg/mL), ou em uma solução composta por tampão McIlvaine ou outro meio de montagem para fluorescência acrescido de DAPI (24 μL de meio de montagem para fluorescência e 1 μL de DAPI), as metáfases fotografadas, descoradas em fixador, desidratadas em álcool 70 e 100%, por 5 minutos, e utilizadas para a FISH. f) Como tratamentos adicionais para minimizar o efeito do citoplasma, as lâminas podem ser tratadas com 25 μL de enzima (celulase 2%: pectinase 20%, p:v), podendo ser seguidos por um tratamento com proteinase K ou pepsina (1 μL de enzima para 100 μL de 2× SSC) por 30 minutos, com um banho em 2× SSC entre os dois tratamentos e, no final, desidratadas em álcool 70 e 100%, por 5 minutos, e utilizadas para a FISH.

2. Obtenção das sondas Para os casos em que o fragmento de DNA a ser hibridizado estiver inserido em um plasmídeo, será necessário preparar um meio para cultivar bactérias a fim de obter grande quantidade de plasmídeos e, consequentemente, de insertos. Este é o caso das sondas de DNA ribossomal de trigo, amplamente utilizadas na FISH em plantas. Os plasmídeos pTa 71, contendo o fragmento de DNAr 45S, e pTa 794, contendo o fragmento de DNAr 5S, foram construídos por Gerlach e Bedbrook (1979) e Gerlach e Dyer (1980) e, hoje, encontram-se espalhados por laboratórios de vários países. Para obter estas sondas, é necessário replicar as bactérias em meio de cultura líquido e seletivo, contendo um ou mais antibióticos específicos para a construção plasmidial que se deseja replicar.

2.1. Obtenção de DNA plasmidial em pequena escala (Mini Prep) a) Separe um erlenmeyer e adicione 0,2 g de meio LB/Broth Base (Solução 7.1) para 10 mL de água destilada. Autoclave o meio, aguarde até que o meio esfrie e adicione o antibiótico correspondente à construção plasmidial. Normalmente utilizamos 10 mL de meio, contendo 50 μg de ampicilina (Solução 7.2) para cada mL de meio. b) Adicione 5 μL do estoque de bactérias contendo o plasmídeo desejado. Caso a bactéria esteja em placa com meio sólido, retire uma pequena amostra da colônia com uma alça metálica esterilizada e introduza-a no meio líquido. Incube o meio a 37 °C em agitação lenta por toda a noite.

Atenção • A E. coli cresce muito bem em 16 à 18 horas à 37 °C sob agitação. Normalmente, coloca-se a cultura às 18 horas para a obtenção de um bom volume de bactérias às 10 horas

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da manhã do outro dia. Se por alguma eventualidade a extração dos plasmídeos tiver que ser realizada em outro momento, mantenha a colônia em geladeira até o início da preparação. O período em geladeira não deverá ser superior a dois dias, para evitar a degradação do meio e a morte celular. • Para manter uma coleção de bactérias, transfira 200 μL da cultura para um microtubo limpo e autoclavado e adicione 800 μL de meio Hogness (Solução 7.3) ou glicerol, também autoclavado. Em seguida, estoque a –80 °C. Se possível, renove esta colônia a cada ano. a) Após o cultivo das bactérias, distribua o meio em microtubos de 1,5 mL e centrifugue a 14.000 rpm por 2 minutos para concentrar a colônia toda no fundo do microtubo. Descarte o sobrenadante e deixe o microtubo com a boca para baixo sobre uma folha de papel, para retirar o máximo possível de meio. Este procedimento poderá ser repetido mais uma vez, com a finalidade de aumentar o número de bactérias em cada microtubo, obtendo uma maior concentração de plasmídeos em um número menor de microtubos. b) Quando o precipitado estiver quase seco, ressuspenda-o com 100 μL de solução de lise, GTE (Solução 7.4). Para isto, utilize um agitador vortex ou então bata com o dedo intensamente no microtubo. A agitação vigorosa é importante para que todas as bactérias sejam rompidas. Deixe a solução à temperatura ambiente por 5 minutos. c) Adicione 200 μL da solução de desnaturação, NaOH/SDS (Solução 7.5), recém-preparada. Feche o tubo e agite o conteúdo suavemente, invertendo o tubo 5 vezes, assegurando que toda a área interna do tubo tenha entrado em contato com esta solução. Neste ponto, não faça movimentos bruscos com o microtubo para não fragmentar o DNA. Isto é importante na separação dos DNAs genômico e plasmidial. Mantenha esta solução no gelo por 5 minutos. d) Adicione 150 μL da solução de separação, acetato de potássio/ácido acético (Solução 7.6), recém-preparada. Feche o tubo e agite suavemente, por inversão, como mencionado anteriormente. Mantenha o microtubo em gelo por 5 minutos. Após este tempo, centrifugue a 14.000 rpm por 5 minutos e transfira o sobrenadante para outro microtubo limpo, cuidando para não transferir o precipitado branco para o microtubo novo. Assegure-se de que o sobrenadante esteja limpo e anote o volume transferido. e) Adicione ao sobrenadante o mesmo volume de fenol-clorofórmio (1:1, v:v), recém preparado. Agite suavemente os microtubos, invertendo-os até que a solução fique bastante homogênea. Repita esse movimento durante 10 minutos. Centrifugue a 12.000 rpm durante 5 minutos e transfira o sobrenadante para um novo microtubo. Cuidado para não transferir o precipitado (fase intermediária). f) Trate o sobrenadante com RNAse (Solução 7.7) por 30 minutos a 37 °C (1 μL de RNAse a 100 mg/mL para cada 100 μL de solução). Precipite o DNA com 2 volumes de etanol P.A. à temperatura ambiente. Centrifugue por 5 minutos a 14.000 rpm, elimine o sobrenadante e coloque o microtubo de boca para baixo sobre papel até secar bem. Em seguida, adicione 30 μL de TE, pH 8,0 (Solução 7.8) e deixe o precipitado dissolver por pelo menos 12 horas na geladeira, sem agitar.

Hibridização in situ em Plantas

Atenção • Se ao final da precipitação (antes de adicionar o TE) houver muito sal no microtubo (precipitado branco e pouco solúvel), adicione à solução 1 mL de etanol 70% e agite o microtubo, centrifugue por 5 minutos a 14.000 rpm, descarte o sobrenadante e deixe secar novamente. Ressuspenda em 30 μL de TE, deixe o precipitado dissolver e estoque o DNA a –20 °C. Quantifique o DNA e anote no microtubo. A quantidade do DNA extraído pode ser feita com o auxílio de espectrofotômetro, flourômetro ou eletroforese em mini-gel, e a certificação do inserto pode ser feita por PCR com iniciadores (primers) que flanqueiam o inserto. Ambos são importantes para o processo de marcação da sonda.

2.2. Obtenção de DNA satélite Algumas espécies possuem cromossomos com um número elevado de bandas heterocromáticas, as quais podem ser utilizadas em trabalhos de isolamento, caracterização e localização de DNAs satélites. Por serem de caráter repetitivo, a chance de gerar sinais na hibridização in situ é elevada. Para isto, é necessário obter DNA genômico em grande quantidade e puro, para que sirva como base no isolamento dos segmentos repetitivos. Uma vez com o DNA genômico em mãos, o DNA satélite pode ser isolado por diferentes maneiras. Aqui descreveremos o método de obtenção de DNA satélite por clivagem de DNA genômico com enzimas de restrição. Para isso é necessário: 1) extrair o DNA genômico; 2) limpar o DNA extraído; 3) clivar o DNA com enzimas de restrição.

2.2.1. Extração de DNA genômico a) Antes de iniciar a extração, verifique se os equipamentos a serem utilizados estão ligados e ajustados para os tratamentos, e se todas as soluções estão preparadas e em condições de uso. b) Prepare o tampão de extração (Solução 7.9) no momento da sua utilização, de acordo com a quantidade de folha a ser utilizada (cerca de 3 mL para cada 50 mg de folhas jovens). Coloque as folhas em um almofariz, adicione nitrogênio líquido e, durante sua evaporação, macere as folhas com um pistilo até obter um pó bem fino. c) Adicione ao almofariz 3 mL de tampão de extração e continue fazendo movimentos leves com o pistilo até obter uma solução homogênea. Transfira a solução para microtubos estéreis de 1,5 mL e coloque-os em banho-maria entre 60 e 65 °C, por pelo menos 1 hora, agitando-os a cada 10 minutos. Este tempo poderá ser ampliado até 3 horas, caso o DNA não fique puro nas primeiras extrações. d) Retire os tubos do banho e adicione 1 μL de proteinase K (Solução 7.10) para cada 100 μL de solução. Agite a solução e mantenha no banho-maria por mais 30 minutos, agitando-os a cada 10 minutos. Retire os microtubos do banho-maria e, assim que a solução atingir a temperatura ambiente, centrifugue a 12.000 rpm durante 10 minutos. e) Transfira o sobrenadante para outro microtubo limpo, anote o volume retirado, adicione o mesmo volume de fenol-clorofórmio (1:1, v:v). Inverta o microtubo suavemente várias vezes, até conseguir uma emulsão homogênea. Centrifugue a 12.000 rpm durante 10 minutos e transfira o sobrenadante para um novo microtubo, tomando cuidado para não transferir precipitados da interface.

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