Diagnóstico de la mastitis en ovejas (y II

En la primera parte describimos la importancia de las principales pruebas y métodos que se utilizan para diagnosticar la mastitis en ovino lechero. A continuación nos centraremos en el diagnóstico microbiológico a través del cultivo bacteriológico y los distintos medios utilizados.

Carlos Bedolla Cedeño1*, José Carlos Bedolla García1, Alejandro Córdova Izquierdo2 . 1Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. 2Dpto. de Producción Agrícola y Animal. Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco. Contacto con el autor: bedollajl@yahoo.com.mx

El diagnóstico microbiológico a través del cultivo bacteriológico en casos de brotes de mastitis clínicas es muy necesario, porque, por lo general, los signos clínicos son confusos y hay que tratar de obtener un diagnóstico preciso.

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO A TRAVÉS DEL CULTIVO BACTERIOLÓGICO

Los estafilococos crecen en los medios de cultivo ordinarios, como el agar nutritivo, si bien para la siembra de muestras clínicas (leche mamítica) se utiliza habitualmente el agar sangre (preferentemente de oveja), medio en el que puede apreciarse la capacidad hemolítica producida por las bacterias.

Existen varios medios selectivos para los estafilococos, como el agar sal manitol y el medio de Baird-Parker, que se utiliza principalmente para el análisis de alimentos. Las colonias aparecen normalmente a las 24 horas de incubación, pudiendo alcanzar los 4 mm de diámetro. Estas colonias son redondas, lisas y brillantes y en agar sangre opacas, lo que las diferencia de las colonias de los estreptococos β-hemolíticos, que son más pequeñas y translúcidas. Las colonias pueden ser o no pigmentadas mostrando en este caso distintas tonalidades, desde el crema pálido al amarillo vivo.

El criterio generalmente utilizado para la identificación de las especies patógenas es la capacidad de coagular el plasma. Esta capacidad se determina bien con una prueba de tubo o bien con una en portaobjetos. • La prueba en tubo Permite detectar la coagulasa libre y se realiza añadiendo a 0,5 ml de plasma de conejo citratado o con EDTA un par de gotas en un cultivo líquido de 18 horas, o bien de una suspensión densa preparada a partir de un cultivo de agar. La lectura de la prueba se hace a las 4 y a las 24 horas.

• La prueba de la coagulasa En parte permite detectar el clumping factor y se realiza preparando una suspensión muy densa de bacterias en una gota de agua depositada en un portaobjetos y, sobre la suspensión, se añade con un asa de platino una gota de plasma de conejo y se mezcla rotando el asa (figura 1).

TÉCNICA DE SEMBRADO PARA EL CULTIVO BACTERIOLÓGICO

Para identificar bacterias en la leche se toman de la muestra con una asa o hisopo aproximadamente 30 µl de la leche, se colocan en una placa de agar sangre, agar McConkey y agar 110 Staphylococcus, y se hace la primera estría para realizar el cultivo (figura 2).

FIGURA 2. Inoculación (siembra de las muestras). FIGURA 3. Incubación de los cultivos.

Las placas se incuban a 37 °C durante 24 horas en condiciones de aerobiosis; en caso de observar crecimiento, se incuban durante 48 horas más hasta descartar crecimiento bacteriano (figura 3).

Los cultivos son examinados para identificar la morfología macroscópica de las colonias desarrolladas y estimar su número relativo, de acuerdo con el número de cuadrantes del agar donde se observa crecimiento bacteriano. A partir de las colonias representativas se realiza un frotis fijo teñido con tinción Gram para guiar la identificación bioquímica.

MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS

Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se deben sembrar sobre el medio elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias. Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, el nitrógeno, el dióxido de carbono y el hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan el aporte extra de factores de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura, entre otros. Para esto se requieren los medios de cultivo específicos Agar sangre, Agar 110 Estafilococos, Agar MacConkey y Agar EMB.

AGAR SANGRE

Es un medio de cultivo utilizado para el aislamiento de muchos microorganismos. Al ser suplementado con sangre ovina, permite el crecimiento de microorganismos nutricionalmente exigentes y clara visualización de la reacción de hemólisis (figura 4).

AGAR 110 STAPHYLOCOCCUS (SAL Y MANITOL)

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial para el aislamiento de diferentes estafilococos a partir de distintas muestras. El manitol es el hidrato fermentable de carbono y el cloruro de sodio en alta concentración es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante. El rojo fenol indica el pH. Las bacterias que crecen en este medio producen ácidos modificando el pH del agar.

AGAR MACCONKEY

Es un medio de diferenciación selectivo para el aislamiento y la diferenciación de Enterobacteriaceae y otros bacilos gramnegativos a partir de muestras clínicas (figura 5). Pero es solo ligeramente selectivo, dado que la concentración de sales biliares que inhiben los microorganismos grampositivos es baja en comparación con otros medios en placa entéricos. Se recomienda el uso de este medio en muestras clínicas con posible flora microbiana mixta.

AGAR EMB

Es un medio ligeramente selectivo para el aislamiento y la diferenciación de bacilos gramnegativos entéricos (Enterobacteriaceae y otros bacilos gramnegativos) a partir de muestras clínicas (figura 6). Contiene colorantes azul de metileno y eosina Y. Los colorantes también actúan como indicadores diferenciales en respuesta a la fermentación de la lactosa o la sacarosa por parte de los microorganismos: • Los coliformes producen colonias de color negro azulado. • Las colonias de Salmonella y Shigella son incoloras o de color ámbar transparente. • Las colonias de Escherichia coli pueden exhibir un brillo verde metálico característico debido a la rápida fermentación de la lactosa.

El conjunto de medios de aislamiento de baja selectividad para Salmonella en muestras fecales y de otros tipos incluye el EMB Agar (con y sin sacarosa).

Este medio puede inhibir el crecimiento de las bacterias grampositivas como los estreptococos fecales, estafilococos y levaduras, o bien favorecer su crecimiento con formación de colonias puntiformes.

AGAR TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO)

do estos fermentan, la producción resultante de ácido es detectada por el indicador rojo fenol. Se producen cambios de color: amarillo para la producción de ácido y rojo para la alcalinización. Dado que la lactosa y la sacarosa se encuentran presentes en concentraciones mucho más elevadas que la glucosa, la formación de ácido en la base del tubo se debe a dichos azúcares. La formación de ácido a partir de la glucosa es suprimida por la oxidación de una pequeña cantidad de ácido en el área inclinada del tubo, lo que genera una reacción de pH neutro o alcalino cuando se fermenta solo glucosa. La sacarosa añadida permite la exclusión de determinados organismos coliformes y las especies de Proteus que pueden atacar la sacarosa, pero no la lactosa.

La mayoría de las cepas de Proteus, de las que se sabe que producen sulfuro de hidrógeno en pH neutro o alcalino, acidifican el medio, dado que fermentan sacarosa y no presentarán color negro en este medio, mientras que las cepas de Salmonella no fermentadoras de sacarosa ni de lactosa producen colonias de color negro.

Procedimiento Incubar las placas en condiciones aerobias a 35 y 37 °C, por un periodo de 18 a 24 horas. Incluye un medio no selectivo tal como el agar Columbia con sangre de carnero al 5 % como referencia de crecimiento: • Escherichia coli ATCC 25922. Crecimiento de bueno a excelente; colonias amarillas, medio amarillo alrededor de las colonias. • Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Crecimiento de bueno a excelente, colonias rosas con centros negros; el medio es de color rojo. • Salmonella Abony DSM 4224. Crecimiento de bueno a excelente, colonias rosas con centros negros; el medio es de color rojo. • Shigella flexneri ATCC 12022. Crecimiento de bueno a excelente; colonias rosas, el medio es de color rojo.

El crecimiento en este medio debe someterse a mayor diferenciación mediante pruebas bioquímicas y/o serológicas para proporcionar una identificación completa de las cepas aisladas.

Forma de reporte de resultados: • 1. K/A (fermentación de glucosa solamente). • 2. A/A (fermentación de glucosa y lactosa). • 3. K/K (no fermentación de glucosa y lactosa).

Los resultados se escriben siempre siguiendo un patrón. Primero la reacción del pico de flauta seguida por la reacción de la capa profunda, separadas por una barra.

AGAR UREA

Es un medio utilizado para diferenciar microorganismos en función de la actividad ureásica (figura 8). Se

FIGURA 4. Agar base sangre (labmedibac.com.ec).

7 8 9 FIGURA 5. Agar MacConkey. FIGURA 6. Agar EMB (teoma.es).

10 11 12

FIGURA 7. Agar TSI (Lab Medibac). FIGURA 8. Agar urea (teoma.es). FIGURA 9. Agar Citrato (Lab Medibac). FIGURA 10. Agar SIM (wanted.de). FIGURA 11. Agar gelatina (ranrzmn.com). FIGURA 12. Agar MR VP (ucv.ce).

utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp, otras enterobacterias y estafilococos. En el medio de cultivo la tripteína y la glucosa aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH.

Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoniaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa y acelera la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea. Se recomienda especialmente para la detección de la actividad ureásica en bacterias. Este es el caso de Klebsiella spp, Enterobacter spp y Citrobacter spp.

AGAR CITRATO DE SIMMONS

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias en función de la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía (figura 9). En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático.

El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, el azul de bromotimol es el indicador de pH que vira al color azul en medio alcalino y el agar es el agente solidificante. El medio de cultivo es diferencial en función de que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad. El medio entonces vira al azul lo que indica la producción de citrato permeasa.

AGAR FENILALANINA

Es un medio para la diferenciación de bacilos entéricos sobre la base de su capacidad para producir ácido fenilpirúvico por desaminación oxidativa. La fenilalanina sirve como sustrato para las enzimas capaces de producir desaminación de la fenilalanina para formar ácido fenilpirúvico. La adición de 4o5 gotas de la solución de cloruro férrico acuoso al 10 % (o una solución de cloruro férrico acuoso al 12 % acidificada con 2,5 ml de HCl concentrado por 100 ml de reactivo) a los cultivos después de la incubación, da como resultado la generación de un color verde de claro a intenso (reacción positiva) o ausencia de color (reacción negativa).

Los miembros de los géneros Proteus, Morganella y Providencia producen resultados positivos. Otros géneros dentro de Enterobacteriaceae son negativos a la producción de ácidos fenilpirúvicos.

AGAR SIM

El medio SIM es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno por los microorganismos (figura 10). Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. Medio de cultivo en el cual la tripteína y la peptona aportan nutrientes para el desarrollo microbiano. El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas y particularmente de la tripteína y puede ser metabolizado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehído del reactivo de Ehrlich o de Kovac’s, para originar un compuesto de color rojo.

A partir del tiosulfato de sodio los microorganismos pueden generar ácido sulfhídrico que reacciona con el hierro presente formándose un compuesto de color negro. El agar es el agente solidificante y a esta concentración le otorga al medio la propiedad de ser semisólido, condición necesaria para detectar movilidad, que se evidencia por el enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá de la línea de siembra del microorganismo en estudio.

AGAR GELATINA

Se usa para valorar la licuefacción de la gelatina por acción de las gelatinasas bacterianas producidas por algunas enterobacterias (figura 11). La reacción positiva hace que el medio permanezca líquido tras la incubación aún después de dejarse en refrigeración durante media hora. La reacción negativa permite nuevamente la solidificación. • Proteasas o gelatinasas (+): en esta prueba se determina la producción de enzimas de carácter proteolítico en un medio nutritivo de gelatina. Se observa que la gelatina se licúa (pasa de estado sólido a líquido) dado que ha sido hidrolizada hasta aminoácidos individuales. • Proteasas o gelatinasas (-): se observa que la gelatina continúa en estado sólido y no pierde su consistencia.

AGAR MR-VP

El MR-VP es un medio diferencial para enterobacterias basado en la reacción del rojo metilo (MR) y del acetilmetilcarbinol (VP, Voges-Proscauer) (figura 12). Clark y Lubs fueron los primeros es usar el MR como indicador de la acidificación en los cultivos de coliformes y enterobacterias. Esta prueba quedó referenciada como la reacción de rojo metilo. Estrechamente asociada con la reacción anterior, está la prueba descrita por Voges y Proscauer, que detectaron que si ciertos cultivos eran tratados con hidróxido potásico, al cabo de un tiempo tenía lugar una reacción colorimétrica, debido a la producción del acetilmetilcarbinol. Posteriormente el hidróxido sódico se ha

FIGURA 13. Prueba de catalasa. FIGURA 14. Prueba de coagulasa.

optimizado por el uso de α-naftol al 5 % en alcohol etílico combinado con hidróxido potásico al 40 %.

Una vez que los tubos han sido inoculados con las cepas detalladas en la tabla, se obtienen los resultados indicados en la misma después de incubar 48 horas a 35 o 37 °C.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48 horas. A este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a metabolizar. No obstante, algunas de estas pruebas pueden realizarse de forma rápida tras incubación unas 2-6 horas. En general, se trata de reacciones enzimáticas cromogénicas o pruebas convencionales.

PRUEBA DE CATALASA

La catalasa es una enzima antioxidante común producida naturalmente en casi todos los organismos vivos. Las reacciones en la catálisis son importantes ya que ayudan a descomponer el peróxido de hidrogeno en oxígeno y agua (figura 13).

La enzima descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno: 2 H2O2 -> 2 H2O+O2. Así las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, producto final del metabolismo aerobio de los azúcares.

Resultados después de incubar 48 horas a 35 o 37 °C los tubos inoculados con las cepas detalladas.

CEPA CRECIMIENTO REACCIÓN ROJO METILO (MR)

REACCIÓN VOGES- PROSCAUER (VP) Escherichia coli ATCC 25922 Bueno Positiva (rojo) Negativa Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Bueno Negativa (amarillo) Positiva (rojo) Klebsiella pneumoniae ATCC 23357 Bueno Positiva (rojo) Negativa

PRUEBA DE COAGULASA

• Procedimiento: mezclar un asa cargada con el microorganismo obtenido de un cultivo en medio sólido, o 0,1 ml de un cultivo en un medio líquido, con 0,5 ml de plasma de conejo, contenido en un tubo pequeño de aproximadamente 7 mm de diámetro. • Incubación: en baño de agua a 37 °C y examinar periódicamente.

Se considera que la prueba es positiva si el plasma es coagulado en 3-4 horas, aunque algunas cepas con escasa producción de coagulasa solo coagulan el plasma después de 24 horas de incubación.

S. aureus tiene dos tipos de coagulasa (figura 14): • Endocoagulasa o coagulasa ligada. Actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado. • Exocoagulasa o coagulasa libre: actúa mediante la activación de un factor (CRF), formándose un complejo coagulasa–CRF, que reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina.

CONCLUSIÓN

Se concluye que es de suma importancia conocer las diferentes pruebas y métodos de diagnóstico de la mastitis en las ovejas para hacer uso de ellos en el momento que se requieran, con la finalidad de evitar pérdidas económicas y eliminación de los animales enfermos.