Epigenetica in practica medicala - Sorin Buzinschi by Editura Amaltea

Cuprins Abrevieri ...................................................................................................................................5 Lista figurilor ...........................................................................................................................7 Lista tabelelor ...........................................................................................................................9 Prefaţă ....................................................................................................................................11 Introducere .............................................................................................................................32 Capitolul 1 – Scurtă privire asupra influenţei factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală ............................................................................34 1.1. Transmiterea genetică a caracterelor ..........................................................................34 1.2. Transmiterea epigenetică a caracterelor ......................................................................37 1.3. Factori implicaţi în dezvoltarea embriofetală ..............................................................45 1.4. Genetic sau epigenetic: studii asupra gemenilor ........................................................51 1.5. Transmiterea epigenetică transgeneraţională .............................................................52 Capitolul 2 – Influenţa factorilor de mediu asupra dezvoltării fetale ................................56 2.1. Programarea metabolismului .....................................................................................56 2.2. Studii epidemiologice asupra efectelor programării metabolice ....................................57 2.2.1. Genotipul economic ..............................................................................................57 2.2.2. Fenotipul economic ................................................................................................58 2.2.3. Teoria răspunsului adaptativ predictiv ..................................................................64 Capitolul 3 – Opinii critice faţă de teoriile programării ......................................................68 Capitolul 4 – Modele experimentale legate de programarea fetală......................................71 4.1. Studii experimentale asupra mecanismelor de instalare a HTA ...................................72 4.1.1. Expunerea prenatală la glucocorticoizi ...................................................................72 4.1.2. Efectul restricţiilor de nutriţie proteică asupra tensiunii arteriale ............................74 4.1.3. Nefrogeneza şi sistemul renină-angiotensină ..........................................................76 4.2. Rezistenţa la insulină şi diabetul zaharat de tip 2 .......................................................78 4.2.1. Modificarea mediului intrauterin şi riscul pentru diabet în viaţa adultă ...................79 4.2.2. Modificări de dezvoltare a pancreasului .................................................................82 4.3. Factori epigenetici în sindromul metabolic ..................................................................83 Capitolul 5 – Studii clinice asupra modificărilor epigenetice ca sursă de patologie ..........87 5.1. Adaptarea permanentă la aportul nutriţional .............................................................88 5.2. Restricţia de dezvoltare intrauterină (IUGR) ................................................................90 5.3. Macrosomia fetală .....................................................................................................93 Capitolul 6 – Modificări epigenetice în bolile cardiovasculare ............................................96 6.1. Elemente epigenetice în ateroscleroză .........................................................................97 6.1.1. Dezvoltarea precoce a leziunilor aterosclerotice ......................................................97 6.1.2. Detectarea modificărilor vasculare determinate de flux ........................................101 6.1.3. Factori genetici cu rol aterogen.............................................................................103 6.1.4. Factori epigenetici în ateroscleroză.......................................................................106

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

Capitolul 7 – Remodelarea renală în hipertensiunea arterială ..........................................115 Capitolul 8 – Modificări genetice şi epigenetice în obezitate............................................123 8.1. Modificări ale metabolismului energetic în obezitate ................................................124 8.2. Genetica obezităţii ....................................................................................................129 8.3. Factori epigenomici în obezitate ................................................................................134 8.3.1. Modularea epigenetică a greutăţii: studii experimentale ........................................134 8.3.2. Reglarea epigenetică în patologia umană a obezităţii ............................................136 8.4. Modificări ale răspunsului imun în obezitate ............................................................144 Capitolul 9 – Factori epigenetici în diabetul zaharat de tip 2 ...........................................149 9.1. Determinanţi genetici în diabetul zaharat de tip 2.....................................................150 9.2. Date epidemiologice asupra diabetului zaharat de tip 2 ............................................151 9.3. Rezistenţa la insulină în diabetul zaharat de tip 2 ....................................................156 9.4. Originea rezistenţei la insulină .................................................................................157 9.4.1. Diabetul matern, creşterea fetală şi dezvoltarea pancreasului ...............................162 9.4.2. Disfuncţia mitocondrială în obezitate şi diabetul zaharat de tip 2 ..........................164 9.4.3. Componenta epigenetică a diabetului zaharat de tip 2 ..........................................169 Capitolul 10 – De la programarea metabolică la sindromul metabolic ..............................175 10.1. Influenţe nutriţionale asupra organizării metabolismului fetal ................................178 10.2. Ipoteze patogenice în sindromul metabolic ..............................................................183 10.3. Rolul obezităţii în sindromul metabolic ...................................................................184 10.4. Modificări cardiovasculare în sindromul metabolic..................................................188 10.5. Ficatul gras non-alcoolic ........................................................................................190 Capitolul 11 – Nutriţia şi reglarea genetică .......................................................................194 11.1. Nutrimentele ca molecule informaţionale ...............................................................194 11.2. Suportul genetic al nutriţiei: între cercetare şi aplicaţii ...........................................195 11.2.1. Acidul folic ........................................................................................................196 11.2.2. Vitamina D........................................................................................................198 11.2.3. Acizii graşi polinesaturaţi .................................................................................207 Capitolul 12 – Factori genetici în infecţiile copilului ........................................................218 12.1. Sistemul imunitar înnăscut în primele etape de viaţă .............................................219 12.2. Etapele răspunsului inflamator ..............................................................................221 12.3. Senzorii răspunsului inflamator .............................................................................221 12.4. Configuraţia TLRs la nou-născuţi şi la prematuri....................................................223 12.5. Variaţii genetice ale răspunsului gazdei faţă de patogeni .........................................224 12.6. Imunosupresia postinfecţioasă ..............................................................................226 12.7. Factori care conferă rezistenţa la infecţii .................................................................227 Capitolul 13 – Reglarea interrelaţiei gazdă – agenţi infecţioşi .........................................230 13.1. Transmiterea imunităţii materne la nou-născuţi şi sugari .......................................230 13.2. Rolul colonizării bacteriene a intestinului ...............................................................234 13.3. Microflora intestinală .............................................................................................236 13.3.1. Microflora intestinală în infecţiile digestive – transplantul fecal ...........................238 13.3.2. Modificări ale microbiotei în malnutriţia severă ..................................................240 13.3.3. Microbiota intestinală în obezitate ......................................................................241 13.3.4. Endotoxemia metabolică ....................................................................................242 13.4. Infecţiile şi ateroscleroza .........................................................................................244 13.5. Igiena alimentară şi răspunsul imun ......................................................................247 Capitolul 14 – Mecanisme epigenetice în infecţiile bacteriene .........................................252 Capitolul 15 – Influenţa reglării epigenetice asupra traiectoriei de viaţă a copilului ......256

Abrevieri NOTĂ: pentru unele noţiuni s-a păstrat denumirea în limba engleză alături de traducerea în limba română

ACE ADN ADNmi AGL DNMTs APOA 1 APOB APOE LPA ARA ARN ARNm ARNnc ATP BMI miARN SNPs CH3 CH3CO CI CpG HAT HDAC IGF-1 IGF-2 IGF-1r IGF-2r SGA IUGR MZ DZ DZ 2 Enzima 11βHSD2 GR GH MTHFR SAM SAH FAO VLBW ELBW

Enzima de conversie a angiotensinei Acid dezoxiribonucleic (DNAmi) Acid dezoxiribonucleic mitocondrial Acizi graşi liberi DNA methyltransferase, ADN metiltransferaze Gena apolipoproteinei A 1 Gena apolipoproteinei B Gena apolipoproteinei E Apolipoproteină a Arachidonic Acid Acid ribonucleic ARN mesager ARN necodant Adenozintrifosfat Body Mass Index, indice de masă corporală microARN Single nucleotide polymorphisms, polimorfisme pentru un singur nucleotid Gruparea metil Gruparea acetil Cardiopatie ischemică Cytosine-phosphate-guanine Histonacetiltrasferaze Histon-deacetilaze Insulin-like growth factor 1, factor de creştere asemănător insulinei 1 Insulin-like growth factor 2, factor de creştere asemănător insulinei 2 Receptor celular pentru IGF-1 Receptor celular pentru IGF-2 Small for gestational age, nou-născuţi mici pentru vârsta gestaţională Intrauterine growth retardation, întârziere în creşterea intrauterină Gemeni monozigoţi Gemeni dizigoţi Diabet zaharat de tip 2 11β-hidroxisteroid dehidrogenaza-2 Receptor celular pentru glucocorticoizi Growth hormone, hormon de creştere Metilen-tetrahidrofolat-reductază S-adenozilmetionina S-adenozilhomocisteina Food and Agriculture Organisation of the United Nations Very Low Birth Weight, copii cu greutate foarte mică la naştere Extremely Low Birth Weight, copii cu greutate extrem de mică la naştere

TG NF-kB NO NOS GWAS PUFA IFN-γ REE BMR FTO MC4R NHS PPAR GLUT4 UCP OXPHOS PPARGC1A SM MCP-1 ROS NAFLD 25(OH)D 1,25(OH)D3 DBP VDR LC-PUFA EPA DHA GWAS TLRs LPS SIRS CARS

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

Trigliceride Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, factorul nuclear k de intensificare al celulelor B activate Nitric Oxide, oxid nitric Nitric Oxide Sintetase Genome-Wide-Association-Studies, studii lărgite asupra genomului Polyunsaturated Fatty Acids, acizi graşi polinesaturaţi Interferon Gamma Resting Energy Expenditure, cheltuială energetică de repaus Basal Metabolic Rate, rata metabolismului bazal Fat Mass and Obesity-Associated Protein, proteină asociată masei grase şi obezităţii Melanocortin 4 receptor, receptorul pentru melanocortină National Health Service, Serviciul Naţional de Sănătate, SUA Peroxisome Proliferator-Activated Receptor, receptorul activat al proliferării peroxisomale Glucose Transporter 4, transportorul membranar al glucozei Uncoupling Proteins, proteine de decuplare Oxidative phosphorylation, fosforilarea oxidativă Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Coactivator 1α, gena receptorului activat al proliferării peroxisomale Sindrom metabolic Monocyte Chemoattractant Protein-1, proteină chemoatractantă pentru monocite Reactive Oxigen Molecules, radicali liberi oxigenaţi Nonalcoholic Fatty Liver Disease, ficat gras nonalcoolic Vitamina D3, colecalciferol 1,25-dihidroxicolecalciferol, calcitriol D Binding Protein, proteină transportoare de vitamină D Vitamin D Receptor, receptorul pentru vitamină D Long Chain Polyunsaturated Fatty Acids, acizi grasi polinesaruraţi cu catenă lungă Eicosapentaenoic acid Docosahexaenoic acid Genome-wide association study, studiul extins al asocierilor genomice Toll Like Receptors, receptori celulari ai răspunsului imun înnăscut Lipopolizaharid Sindromul răspunsului inflamator sistemic Compensatory anti-inflammatory response syndrome, sindromul răspunsului compensator antiinflamator

Introducere

ub presiunea unor modificări majore ale patologiei din ultimele decenii, cercetarea medicală a adus în prim plan achiziţiile geneticii şi ale ramurii sale cele mai noi, epigenetica. Datele care îşi regăsesc un numitor comun în teritoriul epigenetic cuprind interrelaţiile gene-nutriţie, responsabile pentru derularea unor secvenţe metabolice care duc la obezitate, diabet zaharat de tip 2, boli cardiovasculare şi cancer. Sunt cuprinse în acest areal şi modificările mecanismelor imune, particularităţile instalării şi evoluţiei proceselor infecţioase şi chiar modularea comportamentală şi reacţia faţă de stres. Pe acest fundament a fost posibilă înţelegerea holistică a patogenezei bolilor multifactoriale pornind de la programarea nutriţională din viaţa fetală cu efecte manifeste în perioada de viaţă adultă sau la bătrâneţe. În baza achiziţiilor epigenetice a apărut necesară o reevaluare conceptuală care îmbogăţeşte medicina clasică cu noi instrumente de lucru şi permite un progres în terapeutica unor afecţiuni fixate în protocoale standardizate. Înţelegerea globală a patologiei vârstelor este îngreunată de diviziunea profesiei medicale între ramurile sale, decurgând din cantitatea uriaşă de informaţie a fiecărei specialităţi, fiecare cu un teritoriu bine delimitat şi fără interferenţe (deseori) cu alte discipline. Abordarea epigenetică traversează hotarele formale trasate de segmentarea pe specialităţi şi vârstă pornind de la realitatea unei continuităţi biologice de la etapa embrionară şi până la moarte. Descifrarea modului în care modificările epigenetice afectează dezvoltarea progresivă a unor afecţiuni s-a bazat pe studii epidemiologice, clinice şi experimentale. Relevant pentru lucrare este faptul că alături de argumentele derivate din patologia umană, în structura sa au fost incluse studii experimentale pe animale de laborator supuse în diferite etape unor modificări de nutriţie. Acestea au adus date de reglare endocrină şi metabolică, au permis observarea modificărilor ultrastructurale, ale metilării ADN, ale exprimării unor gene, manipularea nutriţiei fiind asemănătoare ca efecte cu procesele ce implică subiecţii umani. Organizarea pe capitole dezvoltă: • efectele programării metabolice asupra dezvoltării fetale şi ulterioare, marile teorii ale programării (genotipul economic, fenotipul economic, teoria răspunsului adaptativ preventiv); • modificările epigenetice ca sursă de patologie cardiovasculară cu detalierea dinamicii fenomenelor aterogene încă din perioade timpurii de dezvoltare şi inducţia hipertensiunii arteriale prin modificări sistemice şi renale; 32

Introducere

• configuraţia genetică şi epigenetică în obezitate, în diabetul zaharat de tip 2 şi în sindromul metabolic, fiind cunoscută dezvoltarea epidemică a acestor afecţiuni; • nutriţia ca reglator epigenetic şi intervenţia unora dintre principalele molecule cu efect asupra homeostaziei generale (acidul folic, vitamina D şi acizii graşi polinesaturaţi); • intervenţia factorilor genetici şi epigenetici în infecţiile copilului şi reglarea interacţiunii gazdă-agenţi infecţioşi prin microflora intestinală; • răspunsul organismului prin interfaţa sa cu microorganismele din mediu ca sursă de patologie acută sau cronică. De-a lungul lucrării, atenţia autorului a fost îndreptată asupra temelor care se adresează pediatrului care este provocat să descopere căile prin care dezvoltarea optimă din prima perioadă a vieţii poate oferi sănătate pentru următoarele.

Lucrări ale Prof. Dr. Sorin Buzinschi ca prim autor sau coautor: Dragomirescu M., Buzinschi S., Novac E. – Şocul infecţios, Edit. Academiei RSR, Bucureşti, 1979 Dragomirescu M., Novac E., Buzinschi S. – Patogenia infecţiilor, Edit. Facla, Timişoara, 1980 Maiorescu M., Anca I., Buzinschi S., Dumbrava D. – Bolile diareice acute ale sugarului şi copilului mic, Edit. Academiei RSR, Bucureşti, 1985 (traducerea cărţii în limba rusă 1991) Buzinschi S. – Curs Pediatrie, Univ. Transilvania, Braşov, 1997 Buzinschi S. – Note de Curs Pediatrie, Univ. Transilvania, Braşov, 2001 Buzinschi S. – Pediatrie practică pentru medicii de familie, Edit. Transilvania Expres, 2003 Buzinschi S. (coord.) – Elemente de nutriţie pediatrică, Edit. Lux, Braşov, 2006

1 Scurtă privire asupra influenţei factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

1.1. Transmiterea genetică a caracterelor Copilăria reprezintă o perioadă de dezvoltare rapidă caracterizată prin acumulări impetuoase fizice şi psihointelectuale. În acelaşi timp, susceptibilitatea biologică şi vulnerabilitatea faţă de factori ai mediului determină o patologie specifică vârstei. Unele particularităţi ale copilului, cum ar fi ritmul respirator mai rapid, consumul ridicat de lichide şi nutrimente faţă de greutatea corporală, suprafaţă mare a corpului în raport cu greutatea, adaugă potenţiale riscuri de îmbolnăvire. Se estimează că aproximativ 30% din populaţia globului este reprezentată de copii care deţin şi o pondere egală a patologiei. Înţelegerea globală a patologiei vârstelor este îngreunată de diviziunea profesiei medicale, existând neonatologi, pediatri, medici de adulţi, gerontologi şi multe alte specialităţi, fiecare cu un teritoriu bine delimitat şi fără interferenţe (de obicei) cu alte discipline. De aici vin dificultăţile de înţelegere holistică a unor capitole de patologie care traversează vârstele. După ce Watson şi Crick au descris modelul structural al ADN, genetica a devenit parte a medicinei moderne. Proiectul Genomului Uman, pas important în progresul medicinei, a identificat toate genele din ADN, stabilind că persoane neînrudite, din populaţii diferite, au în comun 99,9% din gene, diferenţele interpersonale fiind determinate de 0,1% din secvenţele de ADN ce constituie polimorfisme pentru un singur nucleotid (single nucleotide polymorphisms – SNPs) (1). Îmbolnăvirile pot fi datorate unor factori 34

Influenţa factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

genetici (mai ales mutaţii), condiţionate genetic (boli multifactoriale) sau fără condiţionare genetică. Bolile adultului sunt în majoritate multifactoriale, bazate pe o predispoziţie genetică care se exprimă în anumite condiţii de mediu, punctul de plecare fiind deseori situat la vârsta copilăriei. Limbajul genetic apelează la o serie de termeni dintre care îi prezentăm pe cei mai utilizaţi (2)(3):

• Genă: porţiune distinctă din ADN ce codează instrucţiuni pentru sinteza de proteine; fiecare dintre cele 20.000 de gene din celulă conţine informaţia genetică care ghidează creşterea, dezvoltarea şi starea de sănătate. • Cromozomi: genele sunt împachetate formând cromozomi. Fiecare cromozom constă în 2 lungi lanţuri de ADN răsucite în dublu helix şi localizate în nucleu. Deoarece cromozomii din nucleul celular sunt dispuşi în perechi, şi genele constitutive sunt dispuse, de asemenea, în perechi. În corpul uman sunt 46 de cromozomi, formând 23 de perechi; dintre aceştia 22 sunt numiţi autosomali, iar o pereche formează cromozomii sexuali X şi Y. • Genom: totalitatea ADN-celular (din nucleu şi mitocondrii). • Codul genetic: setul complet al instrucţiunilor genetice; este format din lanţuri foarte lungi de „litere“ chimice: adenina (A), guanina (G), timina (T) şi citozina (C). Fiecare „cuvânt“ de informaţie genetică este format de 3 din cele 4 litere (triplet); el poartă informaţia pentru sinteza unui aminoacid. • Mutaţie: schimbări în ordinea perechilor A, D, T, C care transformă gena iniţială într-o altă diferită denumită alela. • Alelele sunt secvenţe de ADN diferite, cu acelaşi locus, care pot determina sau nu trăsături fenotipice specifice. Aceste modificări pot fi punctiforme prin SNPs şi pot reprezenta markeri specifici personali în condiţii de sănătate sau boală. Un individ care posedă alele diferite în loci omologi este heterozigot; dacă ambele alele sunt identice el este considerat homozigot. • Cromatină: complex nuclear format de ADN şi histone. • Nucleozomi: parte a cromatinei compusă dintr-o scurtă porţiune a ADN înfăşurată pe un centru de proteine (histone).

Scurtă privire asupra modului de funcţionare a sistemului genetic Molecula de ADN reprezintă baza chimică a eredităţii şi suportul informaţional pentru sinteza proteinelor care asigură identitatea ţesuturilor, organelor şi a organismului în ansamblu. Transmiterea fidelă a informaţiei genetice de la o generaţie la alta se realizează prin replicarea moleculei de ADN. Pe această cale apar 2 molecule identice incluse în celule fiice, care la rândul lor prin diviziuni succesive duc mai departe mesajul genetic parental. Exprimarea informaţiei genetice cuprinse în molecula de ADN se realizează prin parcurgerea a 2 etape:

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

• Transcripţia asigură copierea informaţiei din ADN într-o moleculă de ARN denumit mesager (ARNm). Procesul se desfăşoară atât în nucleu, cât şi în mitocondrii (pentru ADN-ul mitocondrial). • Translaţia decodifică mesajul genetic care este preluat în citoplasma de ribozomi; duce la sinteza unui polipeptid care va deveni o proteină funcţională. Prin aceste procese se asigură fluxul de informaţie din lumea vie, inclus în „dogma centrală“ a geneticii moleculare. Aceasta sintetizează cele 3 procese principale (replicare, transcripţie, translaţie) care asigură continuitatea genetică a fiinţelor vii. ADN  transcripţie  ARNm  translaţie  Proteine Celulele organismului conţin o cantitate similară de ADN care include setul complet de gene pentru specificarea tuturor caracterelor celulei. Expresia acestora este însă diferită; genele comune (housekeeping genes) sunt active în toate celulele şi asigură controlul asupra sintezei de produşi proteici necesari funcţionării celulei. Alte gene au o manifestare limitată, pe când o serie de gene nu se exprimă fiind permanent inactivate. Genele specifice se exprimă numai în anumite ţesuturi sau tipuri de celule, având rolul de diferenţiere şi specializare organică sau celulară. Pentru a regla nivelul la care este exprimată fiecare genă există un set complex de proteine reglatoare care se leagă de unele părţi ale ADN codant pentru fiecare genă. (2,3). În afara perioadelor de diviziune, materialul genetic se găseşte sub formă de cromatină dispersată în nucleu ce conţine în principal ADN şi histone (proteine bazice implicate în organizarea spaţială a ADN). La iniţierea procesului de mitoză, cromatina se condensează şi se împarte în cromozomi, care după duplicare se împart în proporţii egale în celulele fiice. Odată ce noile celule au fost formate, cromozomii se derulează şi se extind sub formă de eucromatină. Spre deosebire de eucromatina care reprezintă segmentul activ al genomului, heterocromatina reprezintă forma condensată, inactivă a conţinutului nuclear. Configuraţia deschisă a cromatinei face accesibile genele procesului de transcripţie (2). Arhitectura unei gene implică secvenţe codante şi necodante. Într-o manieră clară, Covic et al (2) explică modul de funcţionare al mecanismului genetic. Astfel, genele conţin o secvenţă promoter şi (frecvent) o secvenţă activatoare (enhancer) cu rolul de a asigura fidelitatea transcripţiei. Regiunea codantă centrală care va fi copiată în ARNm este mărginită la cele 2 capete de secvenţe care nu vor fi transcrise, dar care asigură fidelitatea transcripţiei. În principal elementele structurale ale genei sunt exonii (codifică părţi ale proteinei care va fi copiată), intronii (elemente care intervin probabil în selecţia şi combinarea exonilor) şi secvenţe care asigură iniţierea şi terminarea transcripţiei (promotorul cu secvenţe TATA box, GC box, CAAT box), regiunea de reglare 3’. De remarcat că aproximativ 98% din genomul uman este format din zone de ADN necodant cu funcţii parţial cunoscute. Între acestea, secvenţe repetitive care formează circa 50% din genom sunt reprezentate de transpozoni, elemente genetice

Influenţa factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

FIGURA 1. Structura şi expresia unei gene După http://genome.wellcome.ac.uk.

care pot migra în cadrul moleculei de ADN. Rolul ADN necodant este în continuă reevaluare după descoperirea rolului transpozonilor în transmiterea epigenetică a unor caractere. Genele ADN pentru ARN necodant (ARNnc) transcriu sinteza unor molecule cu roluri multiple în interiorul celulei: reglarea expresiei şi funcţiei genelor, diferenţierea celulară, reglarea ciclului celular, enumerare care se poate extinde în zone în curs de cercetare. Mai mult decât un intermediar care „aduce“ mesajul genetic din nucleu în citoplasmă, moleculele de ARN care nu sunt translate în proteine, prin polimorfismul lor contribuie la reglarea funcţiilor genelor pe care le controlează, dar şi la patologia indusă de acestea. Variaţiile codului genetic: modificările individuale care caracterizează şi identifică fiecare persoană se produc prin variaţii în secvenţa „literelor“ mesajului, prin deleţia sau inserţia unor secvenţe scurte sau prin creşterea/pierderea unor segmente de ADN. Unele dintre variaţiile informaţiei genetice nu produc diferenţe în modul de citire a mesajului sau a proteinelor produse de celulă. Dacă aceste variaţii individuale depăşesc ca frecvenţă 1% din populaţie sunt numite polimorfisme. Efectul lor se poate traduce în susceptibilitate crescută pentru anumite boli, efecte adverse pentru unele medicamente sau substanţe chimice din mediu, dar şi prin rezistenţa crescută faţă de anumiţi agenţi patogeni. Între acestea, variaţiile pentru un singur nucleotid (SNPs) sunt cele mai mult studiate.

1.2. Transmiterea epigenetică a caracterelor Epigenetica reprezintă un domeniu nou, în plină extensie a ştiinţelor medicale. Numeroase date au sugerat că transmiterea genetică a caracterelor nu poate explica

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

pe deplin caracteristicile fenotipice ale organismelor. Alţi factori necodaţi în secvenţa ADN, din ce în ce mai bine cunoscuţi, s-a dovedit că joacă un rol profund în menţinerea stării de sănătate sau în apariţia îmbolnăvirilor. Mecanismele epigenetice pot explica modul cum zigotul care se dezvoltă în peste 220 de tipuri de celule care conţin acelaşi ADN se diferenţiază în celule şi organe cu structură şi funcţii diferite. Modificările epigenetice pot explica cum gemeni monozigoţi devin discordanţi ca arie de patologie şi timp de apariţie a unor afecţiuni. Prin mecanismele epigenetice putem explica impactul biologic al factorilor de mediu, cum ar fi compuşii chimici din dietă, agenţi fizici, noxe cancerigene sau interacţiuni socio-emoţionale (1). Pentru majoritatea autorilor termenul de epigenetică se referă însă la moştenirea epigenetică, adică variaţiile în expresia genelor declanşate de diferiţi stimuli se pot transmite de la o generaţie la alta. Spre deosebire de patrimoniul genetic, modificările epigenetice sunt reversibile în următoarele generaţii, plasticitatea şi evoluţia permanentă a organismelor fiind asigurată pe această cale. Analiza factorilor multipli care contribuie la expresia genelor poate oferi soluţii în profilaxia, diagnosticul şi tratamentul a numeroase boli (4). Deci termenul de epigenetică se referă la studiul modificărilor moştenite în exprimarea genelor fără a fi însoţite de modificări ale structurii lor primare, adică secvenţele nucleotidelor. Aceste modificări care au loc sub acţiunea unor factori diverşi sunt transmisibile de la o generaţie celulară la alta şi de la o generaţie la alta prin memoria epigenetică celulară. Glosar de termeni epigenetici, după Smith, 2011 (5), modificat • Epigenetică: reglarea înnăscută însă reversibilă a diferitelor funcţii genomice care se produc independent de secvenţele ADN. Reglarea epigenetică este mediată de metilarea ADN, modificări fizice ale structurii cromatinei şi de acţiunea moleculelor de ARN necodante. • Cromatina: complex format de ADN, histone şi alte proteine care compun cromozomii. Modificările chimice ale ADN şi ale histonelor determină reglarea structurii cromatinei. Cromatina condensată (heterocromatina), în care ADN şi proteinele histonice sunt strâns împachetate, blochează accesul factorilor transcripţionali la expresia genelor. Forma de cromatină deschisă permite factorilor transcripţionali să acceseze ADN şi să determine transcripţia. • Metilarea ADN: fixarea grupului metil în poziţia 5 a inelului citozin-pirimidinei (C) din structura citozin-guanina dinucleotidica (CpG), reacţie catalizată de ADN metiltransferaze (DNMTs). Metilarea ADN este un proces epigenetic determinant pentru represia transcripţiei prin sistarea ataşării factorilor transcripţionali. Până la 70-80% dintre dinucleotidele CpG din genomul uman sunt metilate; cele nemetilate se găsesc la nivelul insulelor CpG din promotorul majorităţii genelor, iar metilarea citozinei din interiorul lor determină represia transcripţiei.

Influenţa factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

• Modificările histonelor: modificări covalente posttranslaţionale ale histonelor, care au loc în zone specifice prin acetilare, metilare, fosforilare şi alte procese. Ele modulează expresia genelor prin schimbarea structurii cromatinei. Ca şi metilarea ADN, modificările histonelor sunt dinamice şi reglate activ de enzimele catalitice ale gazdei. • Imprinting genomic: proces epigenetic prin care este exprimată numai o singură alelă provenind de la unul dintre părinţi. Este un proces fundamental pentru creştere şi dezvoltare. • Inactivarea cromozomului X: proces prin care se inactivează una dintre cele 2 copii ale cromozomului X de origine feminină. Cromozomul X inactivat prin hipermetilarea insulelor CpG este menţinut ca alelă silenţioasă permanent. • Moştenirea epigenetică: semnalele epigenetice sunt transmise pe cale mitotică; se consideră ca sunt resetate în cursul gametogenezei şi nu sunt transmise în procesul de meioză. Unii markeri epigenetici nu sunt complet eliminaţi în cursul meiozei şi constituie substratul moştenirii epigenetice transgeneraţionale.

Epigenetica s-a constituit ca disciplină de cercetare în anii 1970-1980, când geneticienii s-au lovit de dificultăţi de a înţelege de ce unele modificări stabile în funcţia genomului nu au putut fi explicate prin schimbări în secvenţa ADN. Odată cu înţelegerea mecanismelor moleculare de organizare a genomului au fost identificaţi markerii funcţionali ai genelor care determină apariţia unor fenotipuri diferite. S-a definit astfel un mecanism complex prin care schimbări ale mediului influenţează transmiterea de la o generaţie la alta a unor caractere: modificări ale genelor, altele decât mutaţiile, determină funcţionarea genelor. Pe cale epigenetică, diferiţi factori au acces direct la mecanismul de transcripţie modulând iniţierea transcripţiei, elongarea şi oprirea procesului. Prin mecanisme de tipul închis/ deschis se reglează intensitatea sau scăderea expresiei genelor. Incluse în memoria celulară ca factori anticipativi ai unor condiţii ulterioare, aceste date „de inventar“ vor constitui baza unui program de supravieţuire în perioada postfetală. Mai mult, variaţiile epigenetice acţionează şi în perioadele de viaţă adultă, fiind modulatori permanenţi de răspuns la toxice din mediu, infecţii, variaţii majore ale aportului nutriţional (2,6,7). Reprogramarea epigenetică în cursul dezvoltării şi moştenirea unor achiziţii epigenetice reprezintă printre cele mai noi idei în biologia modernă, modificările epigenetice fiind un factor de impact asupra generaţiilor următoare şi potenţială sursă a evoluţiei. Cele mai studiate modificări epigenetice sunt: • Metilarea ADN • Codul histonelor • Expresia microARN (miARN) Metilarea ADN: ADN-ul uman conţine zone bogate în elemente CpG (numite insule CpG) caracterizate prin prezenţa secvenţei Citozina-fosfat-Guanina care poate

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

fi uşor metilată odată cu formarea 5-metilcitozinei. Metilarea insulelor CpG ale unei gene specifice în regiunea promotorului blochează transcripţia sa. Un grad ridicat de metilare produce scăderea accesului factorilor transcripţionali la regiunea promotorului, pe când lipsa metilării creşte accesibilitatea şi activitatea transcripţională. Regiunea promotor a unei gene este secvenţa de ADN de care se leagă enzima ARN polimeraza pentru a începe transcripţia mARN; gradul de metilare al promotorului poate regla expresia unei gene. Pentru funcţionarea genelor sunt active în majoritatea cazurilor ambele copii; pentru un număr redus de gene este însă activă numai o copie. Numai în cazul acestora funcţionarea ambelor gene devine sursă de patologie exprimată în sindroame genetice. Inactivarea unei gene se produce prin procese de metilare ale ADN care blochează activitatea uneia dintre copiile genei. Pe această cale se evită implicarea genei în fabricarea de proteine. Prin adăugarea grupului metil la structura ADN se poate stabili dacă copia genei provine de la tată sau de la mamă, furnizând celulei informaţii despre gena care trebuie folosită pentru sinteza unor proteine. Modificările cromatinei sunt controlate epigenetic în mare parte prin metilarea ADN şi acetilarea histonelor, fenomene care sunt dependente de mediul intracelular (substraturi, hormoni, vitamine, minerale etc). Datorită lor se selectează genele active şi partitura genetică a codului epigenetic care conduce la apariţia

FIGURA 2. Reprezentare schematică a modificărilor epigenetice După Relton şi Smith, 2010 (8)

Influenţa factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

fenotipului specific. Metilarea, prin ataşarea grupului metil într-o zonă specifică a genei, acţionează ca o pedală modificând forma deschisă (activă) într-o formă închisă (parţial inactivă) a genei. Sursa de grupări metil o reprezintă alimentaţia, iar pasajul către ADN este asigurat prin metabolismul folaţilor şi metioninei. Radicalul metil (CH3) provenind din S-adenosilmetionina se ataşează moleculei de citozină prin acţiunea unei metiltransferaze. Prin metilare se produce astfel 5-metilcitozina, iar adenozinmetionina se transformă în adenozinhomocisteină.

• Cromozomii sunt compuşi din cromatină, constând din ADN înfăşurat în jurul a 8 unităţi de proteine histonice. Fiecare octamer histonic reprezintă un nucleozom. Fiecare coadă histonică poate fi modificată prin fosforilare (Ph), metilare (Me) sau acetilare (Ac). Moleculele de ADN sunt metilate prin adiţia unui grup metil la carbon în poziţia 5 a bazei de citozină când se poziţionează adiacent cu guanina (situri CpG), reacţie catalizată de ADN metiltransferaze. Metilarea ADN represează activitatea genei. Transcripţia implică conversia ADN la ARN mesager (ARNm), care uzual este represat prin metilarea ADN şi deacetilarea histonelor. ARNm este translatat într-un produs proteic, însă acest proces poate fi represat prin legarea de microARN (miARN) la ARNm. miARN poate fi implicat şi în stabilirea metilării ADN şi poate influenţa structura cromatinei prin reglarea modificărilor histonelor. Relton şi Smith, 2010 (8)

În genomul uman majoritatea nucleotidelor GpG sunt metilate, menţinând o stare de funcţionare standard a mecanismului genetic. Insulele CpG pot comuta forma activă la starea de represie a transcripţiei prin modificarea fizică a cromatinei de la forma deschisă (eucromatina) la forma compactă (heterocromatina). În această configuraţie factorii de transcripţie nu pot fi cuplaţi şi sinteza de ARNm este inhibată (Fig. 3). Metilarea citozinei poate marca molecula de ADN în mod stabil, acesta fiind transmis sub această formă celulelor fiice la fiecare diviziune. Gruparea metil joacă un rol decisiv în controlarea genelor implicate în dezvoltarea pre şi postnatală, aici fiind incluse şi genele imprintate. Metilarea ADN permite diferenţierea stabilă a tipurilor de celule în diferite organe. Modelul epigenetic clasic consideră că variaţiile epigenetice se produc exclusiv în perioada prenatală. După alte opinii procesele de metilare rămân active continuu de-a lungul vieţii, fiind modul prin care mediul afectează fenotipul (9). De menţionat că modificările reversibile ale unor gene (active/silenţioase) în funcţie de gradul lor de metilare le fac accesibile la stimuli biochimici, instrucţiuni hormonale, componente ale dietei, substanţe toxice sau medicamente. Procesul de metilare ca memorie a ADN a determinat menţinerea unui

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

FIGURA 3. Reprezentare schematică a organizării cromatinei şi a expresiei genelor: formarea nucleozomilor din moleculele de ADN înfăşurate pe octamerii de histone; modificările histonelor; metilarea ADN; forma deschisă şi contrasă a genelor Modificat după Rodenhiser şi Mann, 2006 (7)

pattern de expresie a genelor în ţesutul muscular, adipos sau hepatic în obezitate, rezistenţa la insulină, diabet şi bolile cardiovasculare (10). Histonele sunt proteine alcaline care asigură împachetarea ADN în unităţile structurale nucleare numite nucleozomi. Ele reprezintă proteinele principale ale cromatinei. Împachetarea ADN nu reprezintă numai o modalitate mecanică de a stoca şi proteja ADN, ci şi o modalitate eficientă de a comuta genele în poziţie deschisă sau închisa. Pe această cale se reglează accesul factorilor transcripţionali la regiunea promotorului, deci posibilitatea unor gene de a fi transcrise. Structura histonelor poate fi modificată prin procese de metilare/demetilare, acetilare/

Influenţa factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

dezacetilare, fosforilare ca şi prin alte intervenţii, prin care se realizează „codul histonelor“. Se acceptă în general că metilarea histonelor produce diminuarea transcripţiei prin compactarea cromatinei, iar acetilarea lor induce relaxarea cromatinei şi activarea genelor (7,9,10,11). Activitatea grupului acetil (CH3CO) este reglată în celulele normale de către activitatea histon – acetiltransferazelor (HAT) şi a histon-deacetilazelor (HDAC), dezechilibrul lor fiind implicat în procesele neoplazice (12). Modificările histonelor împreună cu metilarea insulelor CpG la nivelul promotorilor controlează epigenetic represia activităţii unor gene (gene silencing). Se acceptă că metilarea ADN asociată cu dezacetilarea histonelor produce scăderea transcripţiei pe când demetilarea ADN împreună cu acetilarea histonelor relaxează structura ADN şi permit activarea transcripţiei. Silenţiul transcripţional prin hipermetilarea aberantă a insulelor CpG a fost demonstrat în aproape toate tipurile de tumori (12). Unele dintre genele în stare de silenţiu includ gene supresoare tumorale şi gene implicate în detoxifierea carcinogenilor, răspunsuri hormonale şi de control asupra ciclului celular. Rolul microARN (miARN) în reglarea expresiei genelor ARN codant migrează numai în parte din nucleu în citoplasmă, restul fiind degradat în nucleu ca urmare a reglajului genetic. Moleculele de ARN necodant participă la procesele epigenetice prin reprimarea sau activarea a numeroase gene. MicroARN sunt molecule de ARN de mici dimensiuni, având 21-24 de nucleotide în compoziţie; acţionează ca reglatori posttranscripţionali ai expresiei genelor. Ele se leagă de molecula de ARN mesager (ARNm) a genei ţintă şi duc la represia transcripţională sau la degradarea moleculei de ARN blocând mecanismul de translaţie. Prin acţiunea lor miARN creează un mecanism de modulare a sintezei proteice având control asupra 60% din genele codante pentru proteine (13). Mecanismele epigenetice proprii organismului în diferite etape de dezvoltare sunt încă incomplet descifrate. În cursul dezvoltării embrionare procesele de metilare şi demetilare se succed pentru stabilirea şi menţinerea diferenţierii celulare. În cazul prezenţei a 2 cromozomi X la sexul feminin, pentru a se evita exprimarea dublă a acestora, unul dintre aceştia este inactivat aleator în fiecare celulă. Inactivarea cromozomului X are loc în timpul dezvoltării fetale şi se menţine de-a lungul vieţii (amprentare genomică). În lumea animală, pisicile femele tortoiseshell cu blana în culori diferite sunt rezultatul unui joc genetic în care un cromozom X ce conţine gena culorii blănii este inhibat aleator în celulele epiteliale. Genele autosomale conţin 2 copii sau alele care provin de la fiecare părinte din momentul fertilizării. În majoritatea lor, genele se exprimă simultan prin ambele alele. În situaţii rare (sub 1%) expresia genei provine de la un singur părinte, adică de la o singură alelă, fenomen denumit imprinting parental. Prin acest proces numit şi amprentare genomică se explică apariţia unor boli genetice. Ele pot fi determinate de defecte ale alelei purtătoare sau de exprimare bialelică (ex. sindromul PraderWilli, sindromul Angelman, sindromul Beckwith-Wiedeman). În cazul sindromului

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

Prader-Willi, cromozomul patern 15 deţine (în 70% dintre cazuri) o deleţie prezentă în fiecare celulă a corpului. Anomaliile de dezvoltare provin din faptul că gena parentală este defectă, iar gena maternă este inactivată. Datele oferite de epigenetică stabilesc unele repere de ordin general: 1. Organismul este în permanentă schimbare fenotipică ca răspuns la variaţiile mediului; 2. Programarea epigenetică prin modularea expresiei genelor în viaţa intrauterină/copilărie este stabilă în cursul dezvoltării şi maturităţii; 3. Între condiţiile iniţiale de funcţionare ale epigenomului şi perioade ulterioare de viaţă se pot produce diferenţe, sursă de patologie metabolică şi cardiovasculară; 4. Terapia eficientă a unora dintre aceste boli demonstrează cel puţin în parte caracterul dinamic şi reversibil al unor modificări epigenetice. 5. Demonstrarea pas cu pas a modificărilor epigenetice transgeneraţionale şi în cursul evoluţiei individuale este un proces asumat de medicină modernă. TABELUL 1. Comparaţie între factorii cheie genetici şi epigenetici Cod ADN

Cod epigenetic

Conservare ridicată în cursul mitozei și meiozei, ereditate mendeliană Diferenţe interindividuale în secvenţele primare, relevante pentru boli

Parţial conservat în cursul mitozei și meiozei

Conservare puternică în cursul evoluţiei Identic în toate tipurile de celule Necesită terapie genică

Codul epigenetic funcţionează prin interacţiune cu codul ADN Diferenţe rapide în cursul evoluţiei Diferenţe între tipurile de celule, răspuns la mediu Răspuns la intervenţie terapeutică

Modificat după Turgeon şi col, 2014 (14)

În organismele multicelulare toate celulele deţin un cod genetic identic (adenina, timina, citozina, guanina) care este conservat în cursul replicării celulare prin mitoză şi meioză. Acest cod a fost menţinut în totalitate în evoluţia de la organisme unicelulare la cele multicelulare. Spre deosebire, codul epigenetic este parţial conservat în meioză şi mitoză şi exprimă diferenţe rapide între specii. Notabil, el este diferit în toate celulele organismelor multicelulare şi răspunde la mediu, fiind o ţintă pentru intervenţii farmacologice (14). Studiile epidemiologice şi numeroase cercetări experimentale pe animale au arătat că în anumite perioade critice de dezvoltare unele dereglări ale dietei pot perturba modul de dezvoltare al organismului provocând schimbări persistente în structura organelor, expresia genelor şi a căilor metabolice. Termenul de „imprinting metabolic“ cuprinde răspunsurile adaptative nutriţionale ca răspuns la „oferta“ mediului matern sau la condiţiile ulterioare din copilărie.

Influenţa factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

1.3. Factori implicaţi în dezvoltarea embriofetală Creşterea fetală este controlată prin unitatea funcţională uter, placentă şi făt. La nivel celular şi organic aportul nutritiv, oxigenarea şi factorii endocrini sunt determinanţii cei mai importanţi. Stimularea mitozelor reprezintă funcţia majoră a IGF2, pe când IFG1 induce diferenţierea celulară (15). Hormonul de creştere (GH) apare în circulaţia fetală la 12 săptămâni de gestaţie, însă rolul său în creşterea intrauterină nu este clar. GH este implicat în sinteza proteinelor transportoare ale IGF (IGF-binding proteins) care au un rol major în creşterea fetală (15). Exprimarea genică în perioada intrauterină este determinată de interacţiunea contradictorie dintre genele de origine paternă şi cele de origine maternă. Ipoteza conflictului parental sau teoria imprintingului genomic are în vedere „interesele diferite“ ale genitorilor: gena care codează IGF2, promotor al creşterii este de origine paternă, pe când gena receptorului IGF2 (IGF2r) care îl poate inactiva este de origine maternă (16,17). Numeroase influenţe asupra exprimării genelor, provenind din mediu, pot modifica dezvoltarea fetală, evoluţia postnatală a copilului şi adultului ca şi patologia lor de-a lungul vârstelor (ipoteza originii fetale a bolilor). Familia IGF şi receptorii lor • IGF-1 (insulin-like growth factor 1) sau somatomedina C este un hormon a cărei moleculă este codată de gena IGF-1. Este produs în principal în ficat, dar şi în unele ţesuturi în cursul proceselor de reglare autocrină. Este legat de o proteină transportoare (IGFBP) care funcţionează ca vehicul către organele ţintă. Fiind un mediator al acţiunii hormonului de creştere (GH), stimulează creşterea tuturor celulelor corpului. • IGF-2, hormon proteic sintetizat în ficat, este exprimat fiziologic numai din alele paterne. Considerat un factor major de creştere şi dezvoltare fetală, îşi exercită acţiunea prin legare pe receptorul IGF-1 (IGF-1r). • Receptorul IGF-1 (IGF-1r), molecula proteică localizată la suprafaţa celulelor, este activat de IGF-1 şi de IGF-2. Are rol important în creştere; la adult posedă efecte anabolice. Studii experimentale au arătat că şoarecii cu o singură copie funcţională a IGF-1r prezintă o scădere cu 15% din masa corporală. • Receptorul IGF-2 (IGF-2r), receptor hormonal de origine maternă, se leagă de IGF-2 la suprafaţa celulelor; are rolul de a capta moleculele acestuia pentru a le deturna de la interacţiunea cu IGF-2.

Copiii cu defecte ale genei pentru IGF-1 şi a IGF-1r (receptorul pentru IGF-1) prezintă retard de creştere intrauterină şi greutate mică la naştere (16). Este cunoscut sindromul Laron caracterizat prin nanism sever, scăderea importantă a

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

IGF-1 şi rezistenţa la afecţiuni maligne şi diabet. Deoarece IGF-2 controlează transportul activ de glucoză şi aminoacizi transplacentar, expresia crescută a acestuia produce sporirea greutăţii fetale, fiind implicat împreună cu alte modificări în apariţia sindromului Beckwith-Wiedeman. În studii populaţionale, niveluri crescute ale IGF-1, IGF-2 şi ale insulinei în probe de sânge din cordonul ombilical au fost corelate pozitiv cu greutatea la naştere (18). Genele fetale care reglează metabolismul insulinei (INS-VNTR, glucochinaza) şi a factorilor de creştere insulin-like (IGF-1, IGF-2) determină dezvoltarea fetală prin valorificarea nutriţiei (19). Un rol important în stabilirea greutăţii la naştere îl deţine interacţiunea genelor materne şi paterne în ceea ce s-a numit „războiul sexelor“ sau războiul genomic. Mama „este interesată“ de supravieţuirea ei, conservarea substraturilor şi diminuarea greutăţii fetale, transmiţând gene care restrâng creşterea fetală. Tatăl „interesat“ în promovarea creşterii fetale, supravieţuire fetală, greutate mai mare la naştere transmite gene paterne ca IGF-2. Factorii IGF-1 şi IGF-2 stimulează creşterea acţionând asupra receptorului IGF-1r. Al doilea tip de receptor, a cărui genă este de provenienţă exclusiv maternă, IGF-2r, se opune creşterii prin captarea şi degradarea IGF-2.(17). În afară de acţiunea IGF-2r care leagă moleculele de IGF la suprafaţa celulei, urmând a fi degradate, un alt mecanism implică complexul imprintat de gene IGF-2/H19. Astfel, gena H19 are rol de reglare negativă a creşterii în greutate şi a proliferării

FIGURA 4. Interacţiunea dintre IGF-1, IFG-2 şi receptorii lor în reglarea creşterii fetale în modelul experimental pe şoarece; IGF-1 şi IFG-2 stimulează creşterea intrauterină acţionând asupra receptorului IGF-1r. Al doilea tip de receptor, IGF-2r, se opune creşterii prin degradarea IGF-2 După Hokken-Koelega, 2008, modificat (20)

Influenţa factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

FIGURA 5. Efectul depleţiei IGF-2 asupra creşterii fetale în modelul experimental După Hokken-Koelega, 2008, modificat (20)

celulare. Gena H19 este transmisă numai de alela maternă fiind hipo/nemetilată, pe când cea paternă, metilată, nu este exprimată în cadrul fenomenului de imprinting (Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6). Şoarecii fără IGF-2 (IGF-2 knockout), gena fiind de origine paternă, au greutatea la naştere 60% din normal prin scăderea greutăţii placentei şi a transportului nutritiv transplacentar. Experimentul a dovedit că gena paternă IGF-2 stimulează creşterea fetală Şoarecii fără receptorul IGF-2r de origine maternă (IGF-2r knockout) prezintă creşterea de 4 ori a nivelului IGF-2 şi creşterea greutăţii la naştere. Gena are efecte specifice prin transmiterea unor alele materne către făt Ong, 2008 (18). Studii experimentale pe şoareci au arătat că animalele care nu posedă IGF-2 au greutate mică la naştere (60% din normal), iar greutatea placentei este redusă proporţional. Dacă se elimină ambele alele IGF-2 sau numai cea de provenienţă paternă, deficitul de dezvoltare este similar, indicând că numai alela paternă este implicată în stimularea creşterii fetale. În situaţia când este eliminat receptorul matern pentru IGF-2 (type 2 IGF receptor knockout mouse – IGF-2r) se constată o creştere de 4 ori

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

FIGURA 6. Efectul depleţiei IGF-2r asupra creşterii fetale în modelul experimental După Hokken-Koelega, 2008, modificat (20)

a nivelului IGF-2, creşterea greutăţii fetale (135% din normal), ceea ce arată că efectul frenator este transmis specific de alela maternă (16,18,19). Participarea IGF2 în dezvoltarea placentară şi fetală poate fi influenţată de starea de metilare a acestuia. O metilare aberantă a ADN-ului IGF-2 a fost corelată cu creşterea expresiei genei, creşterea nivelurilor circulante ale IGF-2, cu riscul copiilor de a deveni supraponderali şi obezi (21). În cazul sindromului Silver-Russell, hipometilarea genei IGF-2 şi H19 au ca rezultat apariţia unui nanism primar asociat cu tulburări ulterioare de dezvoltare. Riscul apariţiei defectelor de tub neural, consistent diminuat prin suplimentarea gravidelor cu acid folic, a fost atribuit creşterii metilării genei IGF-2 (22) (Tabelul 2). O parte din naşterile premature sunt considerate spontane (de etiologie necunoscută), altele la indicaţie (preeclamsie, sarcini multiple, diabet gestaţional, anomalii materne sau fetale). Diferite studii au identificat multipli factori de risc pentru naşterile premature: rasă, factori socioeconomici, stres psihosocial, factori comportamentali, istoric de patologie şi variante genetice. Deficitul de vitamina D matern prin lipsa de aport sau prin polimorfism pentru un singur nucleotid (SNP) pentru

Influenţa factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

TABELUL 2. Factori genetici care influenţează creşterea fetală Boli genetice materne IGF-1↑, IGF-2↑, insulină↑în cordonul ombilical Mutaţii ale genei IGF-1 şi IGF-1r Mutaţii ale familiei genei HNF1α↑, HNF1β, HNF4α Metilarea aberantă a IGF-2 Mutaţii ale genei pentru insulină (INS-VNTR) Mutaţii ale genei pentru glucochinază

Observaţii şi Restricţie în dezvoltarea intrauterină, Referinţe studii clinice malformaţii, diferite sindroame bibliografice Studii clinice Creşterea greutăţii la naştere 16, 18, 19, 21 Studii clinice Retard de creştere intrauterină, greutate mică la naştere Studii clinice Greutate crescută la naştere, hiperinsulinism, diabet MODY Studii clinice Greutate crescută la naştere, sindrom Beekwith-Wiedeman Studii clinice Hiperinsulinemie, obezitate în cursul dezvoltării Studii clinice Scăderea secreţiei de insulină, hiperglicemie

16 17 2, 16, 19, 21 20, 23 20

receptorul pentru vitamina D creşte riscul pentru SGA (24). Infecţiile „in utero“ favorizate de polimorfismele genetice ale mediatorilor inflamaţiei determină instalarea corioamniotitei; ele răspund de aproximativ 80% din naşterile premature sub 30 de săptămâni (25,26,27). În afară de riscul crescut pentru infecţii în copilărie, prematuritatea deţine o impresionantă încărcătură de patologie din care enumerăm: paralizii cerebrale, deficite senzoriale, tulburări de limbaj, scăderea performanţelor cognitive, afecţiuni respiratorii cronice (astm în principal). Copiii cu greutate mică la naştere (small for gestaţional age, SGA) Creşterea intrauterină şi greutatea la naştere sunt determinate de funcţia placentară, de durata sarcinii şi sunt influenţate de nutriţia maternă, vârsta mamei şi gradul copilului, factori genetici, endocrine şi exogeni (toxice, fumat) (15). Termenul de întârziere în creşterea intrauterină (intrauterine growth retardation, IUGR) este utilizat deseori ca sinonim cu SGA, deşi cauzele care le produc pot fi diferite. Astfel, IUGR reprezintă un proces patologic care împiedecă fătul să ajungă la potenţialul său de creştere, deşi sarcina este dusă până la termen. În cadrul denumirii de SGA pot fi incluşi copiii născuţi normal în anumite arii geografice sau în cadrul unor grupe etnice. Între aceştia se diferenţiază nou-născuţi cu greutate mică, având lungimea normală, sau alţii la care este afectată şi creşterea în lungime. Evoluţia lor este diferită: cei care prezintă numai diminuarea greutăţii la naştere vor prezenta o creştere rapidă în primele 6 luni de viaţă şi până la vârsta de 2 ani (peste 80%), pe când cei scurţi continuă să se dezvolte încet şi vor rămâne scunzi ca adulţi (28). Un procent de 10-15% dintre copiii născuţi SGA vor continua să rămână cu o statură semnificativ mai mică (înălţime < 2DS) în copilărie şi în viaţa adultă (11). Nu este clar modul cum funcţionarea metabolismului şi a reglărilor endocrine vor influenţa starea lor de sănătate la vârsta adultă sau dacă între viitorul de patologie al

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

FIGURA 7. Raportul dintre greutate şi vârsta gestaţională După en.wikipedia.org/wiki/File:Weight_vs_gestational_Age.jpg

prematurilor sau a celor „small for date“ există deosebiri însemnate. Studii experimentale au sugerat că malnutriţia fetală în prima parte a gestaţiei are ca efect naşterea unor pui mici însă normal proporţionaţi, pe când carenţe în ultima parte a gestaţiei duce la modificarea proporţiilor corpului, dar nu şi a greutăţii. Studii pe nou-născuţi la termen şi prematuri au arătat că creşterea accelerată în greutate în perioada de sugar şi, mai ales, în primele săptămâni de viaţă pot produce ulterior exces ponderal, rezistenţa la insulină, niveluri ridicate de leptină şi HTA în următoarele 2 decade de viaţă (5,29,32). Încă din 1991, Hales et al (31) au evidenţiat creşterea de 6 ori a incidenţei diabetului la născuţii sub 2.500 g. Willemsen şi col (30) consideră că subiecţii cu restricţie de dezvoltare intrauterină şi născuţi prematur, ca adulţi vor avea un profîl de risc cardiovascular ridicat, valori ridicate tensionale

Influenţa factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

sistolice şi diastolice, secreţie ridicată de insulină pe fond de insulinorezistenţă, comparativ cu cei cu restricţie de dezvoltare intrauterină, născuţi la termen.

1.4. Genetic sau epigenetic: studii asupra gemenilor În modelele genetice clasice s-a considerat că heterogenitatea de răspuns a indivizilor la diferite îmbolnăviri sau variaţiile fenotipice sunt datorate fondului genetic. Pentru diferenţierea dintre influenţa factorilor genetici şi cei de mediu în etiologia bolilor netransmisibile (exprimată prin partitura epigenetică), au fost efectuate studii asupra gemenilor mono şi dizigoţi. Gemenii monozigoţi (MZ) deţin acelaşi genotip deoarece provin din acelaşi zigot, pe când gemenii dizigoţi (DZ) conţin în proporţie de ~50% gene comune. Deoarece gemenii MZ sunt genetic identici pot fi consideraţi modele experimentale naturale ideale pentru studiul influenţei factorilor de mediu ca determinanţi ai bolilor complexe netransmisibile (32). Gemenii MZ sunt 100% concordanţi pentru transmiterea bolilor monogenice (2). Pentru bolile multifactoriale componenta genetică depăşeşte 50% la gemenii MZ (depresie, autism, astm etc), pentru altele, cum ar fi HTA şi DZ 2, aceasta nu trece de 25% (Fig. 8).

Dizigoţi

FIGURA 8. Rata de concordanţă a gemenilor monozigoţi (MZ) şi dizigoţi (DZ) în afecţiunile comune complexe Modificat după Smith şi Mill, 2011 (5)

EPIGENETICA ÎN PRACTICA MEDICALĂ

Heritabilitatea calculată pentru bolile comune cardiovasculare variază între 30 şi 50%. Cu toate acestea, într-un studiu asupra ratei deceselor prin boli cardiovasculare în Swedish Twin Registry, s-a raportat o rată de concordanţă pentru gemenii MZ de sex masculin şi feminin de numai 25,4%, respectiv 19,4% (33). Pentru afecţiunile cardiovasculare, în cazul gemenilor DZ componenta genetică se arată şi mai slabă. Discordanţa dintre patologia gemenilor MZ oferă posibilitatea de a studia modul în care indivizi identici genetic dezvoltă o patologie diferită şi sugerează că factorii nongenetici influenţează profund susceptibilitatea pentru afecţiunile cronice netransmisibile. Modificările epigenetice care au loc în viaţa pre şi postnatală pot explica mecanismele variaţiilor fenotipice pentru multe afecţiuni; nu este clar însă în ce proporţie unele îmbolnăviri depind de fondul genetic şi cât de influenţele epigenetice. Fraga et al (34) au constatat că deşi gemenii MZ sunt identici în primii ani de viaţă, odată cu avansarea în vârstă prezintă diferenţe remarcabile în conţinutul global şi distribuţia genomică a 5-metilcitozinei şi a acetilării histonelor la o treime dintre aceştia, cu impact în expresia genelor. S-au demonstrat modificări epigenetice consistente ale genomului la gemeni monozigoţi de-a lungul vieţii, privind diferenţe în gradul de metilare al ADN, evidente într-o serie de afecţiuni ca HTA, DZ 2, lupusul eritematos, b Crohn (5). În afecţiunile psihiatrice concordanţa între gemenii monozigoţi este foarte ridicată, însă nu deplină. Şi la aceştia proporţia de neconcordanţă este datorată unor factori epigenetici ca metilarea ADN. Studiul cantitativ asupra stării de metilare a unor situri ale genei COMT la perechi de gemeni în vârstă de 5 ani a arătat de pe acum considerabile variaţii ale nivelului de metilare la perechile de MZ testate (35).

1.5. Transmiterea epigenetică transgeneraţională Într-o sinteză a datelor epidemiologice asupra transmiterii epigenetice a unor caractere, Rockholm şi col (36) au arătat că apariţia de elemente ale sindromului metabolic ca obezitatea şi DZ 2 s-au constituit în generaţii, pe perioade îndelungate de timp. Astfel, studii efectuate în Suedia pentru mai mult de 100 de ani pun în evidenţă faptul că bărbaţii care au avut acces larg la produse alimentare în perioada prepubertară au avut nepoţi cu risc ridicat de deces prin DZ 2. În consens, alte studii au arătat că mortalitatea prin diabet şi boli cardiovasculare a fost influenţată de starea nutriţională a părinţilor şi bunicilor. Date obţinute pe largi cohorte de subiecţi de ambele sexe urmăriţi pe o perioadă de 21 de ani pentru părinţi şi 47,8 ani pentru bunici, efectuate în Suedia, relevă o legătură între greutatea la naştere (Nutriţia fetală) şi mortalitatea în cele 2 generaţii care le preced (37). Kaati şi col (38) constată că rata mortalităţii prin evenimente cardiovasculare şi diabet la nepoţi s-a corelat cu starea nutriţională a bunicilor într-o modalitate corelată cu sexul acestora (bunici la nepoţi, bunice la nepoate). Aceste studii, ca şi numeroase altele, sprijină

Influenţa factorilor genetici şi epigenetici în dezvoltarea embriofetală

ideea că există o memorie a mediului de viaţă transmisă prin gameţi şi reflectată în tulburările metabolice ale urmaşilor (39). S-a considerat mult timp că modificările epigenetice din timpul vieţii sunt şterse pe parcursul gametogenezei, adică spermatozoidul şi ovulul nu vor purta experienţa epigenetică dobândită de genitori. Cu toate acestea, datele actuale evidenţiază că markerii epigenetici nu sunt în întregime înlăturaţi la pasajul dintre generaţii şi că elemente din existenţa predecesorilor pot trece la copii, nepoţi şi urmaşii lor. Moştenirea epigenetică transgeneraţională are ca rezultat formarea unor fenotipuri în generaţii succesive, ca rezultat al modificărilor epigenetice transmise prin gameţi (5,39). Conservarea datelor oferite de mediu poate fi un mecanism de adaptare funcţional, dar şi sursa de tulburări metabolice. Unele dintre numeroasele exemple de transmisie epigenetică vin din cercetarea experimentală în care dezechilibre nutriţionale din prima generaţie sunt sursa de obezitate, rezistenţa la insulină, DZ 2 şi ateroscleroza la generaţiile următoare (40,41,42). Moştenirea epigenetică transgeneraţională şterge demarcaţia dintre transmiterea bazată pe secvenţele ADN şi cea epigenetică si, deşi încă o noţiune controversată, schimbă concepţia că bolile cronice complexe sunt în întregime de origine genetică (5,41,42, 43). Destinaţia finală a acestor cercetări o reprezintă politicile de sănătate publică care trebuie să facă faţă unui val de schimbări rapide în starea de nutriţie şi de patologie în diferite colţuri ale lumii. Din acest punct de vedere au fost sintetizate unele puncte de vedere (14):

• Riscul de îmbolnăviri (ex. diabet, boli cardiovasculare, obezitate) poate fi exacerbat de starea nutriţională a generaţiilor anterioare; • Modificările induse de alimentaţie sunt transmise generaţiilor următoare prin mecanisme epigenetice (ex. metilarea ADN); • Schimbările epigenetice câştigate nutriţional pot fi în unele cazuri legate de sex şi pot genera consecinţe, de asemenea, legate de sex în starea de sănătate a generaţiilor ulterioare; • Modificările epigenetice se produc în perioada de vârf de reformare a profilului epigenetic (ex. perioada de gestaţie şi poate în stadiul avansat de maturare a celulelor spermatice la băieţi – perioada prepubertară).

Astfel, orice schimbare în disponibilitate de hrană pentru o generaţie va constitui „un semnal“ pentru generaţia următoare de a face unele ajustări ale fiziologiei, fiind „instruită“ asupra oportunităţilor nutriţionale (43). Consumul dietelor de tip vestic (hipercalorice, bogate în lipide şi carbo hidraţi), în esenţă obezogene, funcţionează ca semnal alimentar inadecvat pentru generaţia (generaţiile?) următoare ca opţiune nutriţională.