TÉCNICAS ANALÍTICAS DE SEGUIMIENTO MICROBIOLÓGICO DE BRETTANOMYCES EN VINO Y BARRICAS Antonio Palacios; Ixone Borinaga y David Carrillo. Laboratorios Excell Ibérica S.L., C/ Planillo Nº 12, Pabellón B, 26006 Logroño, La Rioja. Tel. 941 445106, excelliberica@labexcell.com, www.labexcell.com. Palabras clave: microbiología, medios cultivo, PCR, barrica y Brettanomyces. Resumen: El seguimiento de los acontecimientos microbiológicos durante la vinificación puede llegar a ser una tarea sencilla, pero pocas veces se realiza en bodega. En este trabajo se presentan las diferentes técnicas microbiológicas disponibles en la actualidad, tanto para evaluar la actividad fermentativa, como para la detección de riesgos de contaminaciones durante la crianza del vino. Se trata de valorar cual es la técnica mejor adaptada según la información que se desea obtener y en el momento del proceso en el que se encuentra el vino. De esta forma, las técnicas clásicas mediante medios de cultivo selectivos son muy útiles cuando tenemos poblaciones importantes, es decir, procesos biológicos fermentativos o durante la crianza. Las técnica moleculares, gracias a su alta sensibilidad, son muy útiles para buscar presencia microbiana e identificarla cuando ya las formas de vida son escasas, como son procesos de filtración y embotellado. En este trabajo se aplican para valorar el estado higiénico del parque de barricas. Abstract: The microbiological monitoring during winemaking can be a simple task, but is rarely performed in the winery. In this paper we present various microbiological techniques nowadays available for the assessment of fermentative activity and for the detection of contamination risks during wine aging. The aim is to assess which technique is best suited according to the information to be obtained and when it is applied during the wine process. Thus, the classical techniques using selective culture media are very useful when we have large populations, for instance biological processes during fermentation or aging. Molecular techniques, thanks to its high sensitivity, are very useful to find and identify microbial presence when life forms are rare, such as filtration and bottling processes. In this paper we apply then to evaluate the hygienic statement of barrels park. Introducción: La viticultura y enología son ciencias muy desarrolladas que arrastran el peso de la tradición como elemento positivo de valorización en el producto, finalmente el vino. Este surge desde el viñedo en forma de uva y lo hace gracias a las transformaciones microbianas acontecidas en la bodega, los procesos de fermentación alcohólica y maloláctica. Pero estos procesos no son las únicas etapas en la elaboración del vino donde pueden participar microorganismos. Esto es posible ya desde las etapas pre-fermentativas, también participan de forma activa durante la fase de latencia entre alcohólica y maloláctica, y por supuesto está expuesto a la actividad de microorganismos durante su crianza y envejecimiento. Algunos de ellos deben ser considerados como contaminantes oportunistas que pueden modificar y desfigurar el perfil sensorial del vino. Entre los microorganismo problemáticos más habituales en bodega podemos encontrar los siguientes: Levaduras: Brettanomyces intermedius − Producción de fenoles volátiles (etil-fenoles) Zigosaccahromyces baïlli − Refermentación de azúcares residuales por la presencia de antisépticos
Bacterias acéticas: Acetobacter sp., Gluconobacter sp. : − Producción de ácido acético − Producción de acetato de etilo − Producción de ácidos grasos volátiles Bacterias lácticas: Lactobacillus sp. − Producción de aminas biógenas − Degradación láctica de glicerol Pediococcus sp. − Producción de aminas biógenes − Producción de acetil-tetrahidropiridina − Producción de acroleína Figura 1: fotografías al microscopio óptico de Brettanomyces, Zygosaccharomyces, Acetobacter, Lactobacillus y Pediococcus respectivamente.
Debido a la circunstancial presencia de estos microorganismos contaminantes oportunistas en bodega, se hace necesario contar con herramientas analíticas microbiológicas que permitan hacer un seguimiento de los procesos biológicos a nivel preventivo y curativo. Exponemos a continuación la amplia gama de técnicas microbiológicas disponibles en el campo de la enología, empezando por las mas simples, que siempre pueden ser utilizadas en la misma bodega elaboradora, y terminando por las mas sofisticadas, ofrecidas normalmente por laboratorios especializados independientes. Técnicas de seguimiento microbiológico disponibles frente a Brettanomyces: 1-. Observación al microscopio óptico: Se trata de un control muy inmediato que presenta tiempos muy rápidos de ejecución del análisis como principal ventaja, además de su sencillez en el manejo y su bajo coste. Es muy eficaz para la realización de conteos celulares y de identificación de morfologías celulares. Como desventajas, podemos nombrar su baja sensibilidad, necesita poblaciones muy elevadas para poder determinar resultados fiables (>100.000 células/mL). Los errores de muestreo provocan distorsiones en la cuantificación, ya que se utilizan volúmenes extremadamente pequeños y Brettanomyces presenta localizaciones muy heterogéneas en el seno del vino. En este caso concreto, otro problema añadido es la gran variedad de morfologías distintas que los microorganismos puede ofrecer dependiendo de las condiciones del vino, especialmente en el caso de Brettanomyces.
2-. Medios de cultivo: Los análisis de microorganismos mediante el empleo de medios de cultivo selectivos es un método muy empleado en microbiología, principalmente en la industria agroalimentaria y médica. Es una técnica que puede ser empleada en bodega como control de calidad primario y a nivel interno. Lo más importante es la utilización de medios selectivos específicos para el micro-organismo que se quiere estudiar o verificar su presencia. Existen algunos problemas específicos asociados al método, como son la dificultad para diferenciar bacterias lácticas en cultivos genéricos. Centrándonos en el problema descrito en el artículo, el control de Brettanomyces necesita medios de cultivo muy específicos, por lo que normalmente se emplean inhibidores de crecimiento de levaduras y mohos, principalmente para evitar resultados llamados falsos positivos. Otro problema que podemos encontrarnos es el retraso en el crecimiento de los microorganismos dependiendo de los estados fisiológicos en los que se encuentran debido a las condiciones estresantes del vino. En el caso de Brettanomyces puede ser muy largo (8-10 días). El último aspecto a tener en cuenta es la presencia de posibles gérmenes viables no cultivables en función de su estado fisiológico en el momento del control, lo que origina los llamados resultados falsos negativos. 3-. Microscopía de epifluorescencia: La técnica de microscopía de epifluorescencia es realmente interesante y práctica. Necesita un microscopio capaz de emitir fluorescencia sobre la muestra a observar para poder diferenciar mediante marcaje selectivo estructuras biológicas o microorganismos con un interés en particular. Es la técnica conocida como FISH (Hibridación Fluorescente In Situ). En el caso de levaduras, se utiliza una sonda PNA específica con fluorocromo que se fija sobre el ADN ribosomal de las cepas de levaduras. La muestra en estudio se ilumina con luz de una determinada longitud de onda que es absorbida por el fluoróforo, haciendo emitir luz de determinadas longitudes de onda (células verdes para Brettanomyces). No es muy específico en el caso de Brettanomyces y presenta poca sensibilidad. Sin embargo, es muy práctico a nivel cuantitativo y puede resultar un análisis económico y rápido en su realización. 4-. Citometría de flujo: La citometría de flujo es una técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de ellas un rayo de luz. Para el análisis por citometría de flujo, las células deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido. Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con este causando dispersión del haz de luz. Basándose en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células. Además de la dispersión de la luz, si previamente a su análisis se coloca a las células marcadores con moléculas fluorescentes, se puede evaluar que tipo de células poseen los marcadores fijados para distinguirlas entre sí. El uso de distintas moléculas fluorescentes (con diferentes colores de fluorescencia) permite analizar la presencia de varios marcadores de manera simultánea. En el caso de levaduras, se utilizan fluorocromos específicos de
actividad esterasa. Esta técnica permite obtener resultados muy rápidos, con una gran especificidad según los microorganismo investigados, aunque por el momento es inespecífico para las especies de levaduras encontradas en bodega. Posé una sensibilidad de detección de 200 a 1.000 células/mL según las condiciones en las que se encuentren las muestras. Es una técnica muy adaptada para el seguimiento de cinética fermentativa y del estado fisiológico de las levaduras en fermentación, como es el caso de una detección prematura de paradas fermentativas.
5-. PCR a tiempo real: Se trata de una técnica basada en PCR cuantitativo, siendo una variante de la reacción en cadena de la polimerasa clásica (PCR). Utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación del DNA. Para ello emplea, del mismo modo que el PCR convencional, un molde de ADN, cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específico. El PCR cuantitativo es la metodología más moderna disponible para el estudio de la expresión génica y para distinguir a nivel de cepas de levaduras y bacterias en vinos. Las principales ventajas son su alta sensibilidad y especificidad y la rapidez de ejecución. Como ventajas adicionales podemos citar la posibilidad de detección a partir de cualquier muestra biológica sin necesidad de que esta sea pura, por lo tanto es posible la detección de un microorganismo en particular, aún en presencia de otros microorganismos más abundantes. Su alta especificidad se basa en que para cada tipo de micro-organismo, existen secuencias de nucleótidos extremadamente específicos que permiten su diferenciación de forma inequívoca. Los pasos a seguir son el aislamiento, extracción y purificación del DNA. El aislamiento y lisis de las células de microorganismos es el paso más crítico. Después, se realiza la extracción y purificación de las moléculas de ADN para finalmente amplificarlas y así detectar las moléculas específicas de ADN diana y su detección por sondas específicas marcadas. Para la interpretación de resultados se elaboran curvas de calibración que permiten determinar las poblaciones presentes en las muestras a analizar. La especificidad y la multiplicidad de fragmentos y sondas fluorescentes utilizadas permiten la detección simultánea de diferentes tipos de micro-organismos y gracias a una curva de calibración efectuada para cada tipo de micro-organismo diana, es posible cuantificar de forma precisa la cantidad de células presentes en las muestras. Los resultados se obtienen muy rápidamente y los datos son observables mientras avanza el análisis. Los resultados son además fácilmente reproducibles y la cuantificación muy exacta, gracias al sistema de calibración que se realiza de forma previa a los análisis (ver figura 2). Hoy en día a nivel de PRC a tiempo real y para evitar falsos positivos y falsos negativos, se emplean sondas muy específicas del género Brettanomyces/Dekkera, lo que evita falsos positivos. Para evitar los falsos negativos se emplea además un patrón interno que de señal mostrando el buen funcionamiento del sistema. Otra ventaja adicional es que no hay procesos post-PCR (geles ni ensayos de hibridación), lo que constituye una ventaja en la puesta a punto y un ahorro de tiempo en la ejecución. Los tubos de reacción empleados en las analíticas son sistemas muy cerrados preventivos de contaminación ambiental, lo que facilita mucho la credibilidad de resultados. Figura 2: curvas de calibrado en PCR a tiempo real de la población de Brettanomyces considerando el ciclo umbral de amplificación de DNA utilizando sondas fluorescentes.
Aplicaciones prácticas del PCR a tiempo real en bodega: Como aplicaciones prácticas del PCR a tiempo real en las tareas de bodega, encontramos muchas, desde la vigilancia de microorganismos en puntos críticos, como es la fase de latencia entre alcohólica y maloláctica, hasta la posibilidad de vigilar de forma estrecha el vino utilizado para el relleno de barricas, que debe ser continuamente vigilado para evitar la diseminación de contaminantes en el vino destinado al relleno de barricas. Sin duda alguna, esta práctica constituye unos de los puntos críticos mas importantes a cuidar para evitar extender la contaminación de unas barricas a otras, pues como es sabido, el vino es el vehículo principal de diseminación, pero la madera de las barricas es donde Brettanomyces anida de forma preferente. Desafortunadamente no existen sistemas de limpieza y desinfección del parque de barricas lo suficientemente potentes como para poder impedir su colonización puntual en el tiempo y su permanencia en el interior de la madera durante la crianza del vino, infectando de nuevo cualquier vino bajo en defensas que entre en contacto con la madera infectada. Continuando con la importancia de mantener en un estado lo más higiénico posible las barricas donde se lleva a cabo la crianza del vino, la evaluación del estado microbiológico de la madera a nivel externo e interno se vuelve fundamental. Como se puede observar en la fotografía que acompaña el texto, las levaduras contaminantes son capaces de invadir los micro-poros de la madera en profundidad, llegando según los expertos, a profundidades de incluso 6 milímetros, donde es difícil acceder con los sistemas actuales de limpieza y desinfección. Gracias a la técnica de PCR, unido a la cromatografía de gases, se puede estudiar el estado en el que se encuentran las barricas, además de facilitar la evaluación de la eficacia de los sistemas de limpieza implementados en bodega y evaluar su posible mejora mediante la incorporación de técnicas modernas, como la aplicación de agua ozonizada, vapor, ultrasonidos y tratamientos con microondas.
Otra de las aplicaciones de este tipo de análisis microbiológico recae en una de las operaciones más importantes en la preparación del vino para su comercialización. Se trata de la filtración justo antes del embotellado. Para evitar problemas durante el viaje desde bodega a destino y durante el almacenamiento en el punto de venta, se hace imprescindible filtrar los vinos, haciéndolo atravesar sistemas que retengan el mayor número de microorganismos posibles, o mejor dicho, que no los dejen pasar a la botella. Aquellos que logren atravesar esta barrera, pueden crecer lentamente y producir metabolitos que cambien o interfieran con su presencia en el perfil sensorial, a la vez que su crecimiento puede producir sedimentos y turbidez, menos preciando claramente el valor comercial del vino en el momento de su consumo. Como las poblaciones de microorganismos en esta etapa son muy bajas, se necesitan técnicas analíticas con niveles de sensibilidad muy altos, como es el caso del PCR a tiempo real, permitiendo identificar y cuantificar poblaciones residuales a niveles muy bajos, imposibles a nivel de detección para otras técnicas. Un ejemplo de los que se acaba de presentar, se puede observar en el caso práctico ilustrado en la tabla 1. Según los resultados obtenidos, el vino en cuestión necesita un sistema de filtración que garantice de forma absoluta un tamaño de poro de 0,65 micras, ya que la población analizada no sobrepasa los límites de seguridad establecidos para vino embotellado. En este caso, no sería necesario bajar a un tamaño de poro de 0,45 micras, por lo que el vino embotellado tendrá mayor presencia de coloides y estará menos “castigado” al ser filtrado por membranas más abiertas. Esta aplicación práctica permite entonces definir cuál es el mejor sistema de filtración del vino garantizando su estabilidad microbiológica. Tabla 1: poblaciones residuales de Brettanomyces, bacterias acéticas y Pediococcus en el mismo vino después de ser filtrado con diferentes dispositivos y tamaños de poro. Microorganismos contaminantes
Mezcla
Gelatina & Trasiego
Filtro de placas de 510 micras
Filtro de membrana 0,65 micras
Filtro de membrana 0,45 micras
Brettanomyces
103/mL
102/mL
<10/mL
<10/mL
<10/mL
Bacterias Acéticas
106/mL
104/mL
102/mL
<10/mL
<10/mL
Pedioccocus
103/mL
102/mL
102/mL
<10/mL
<10/mL
6-. Cromatografía de gases y espectrometría de masas en vino y en aguas de lavado de barricas usadas: El método recurre a la tecnología de Cromatografía Gaseosa acoplada a la Espectrometría de Masas (GC-MS) para analizar la posible presencia de etilfenoles en vino, con el fin de determinar el origen eventual de este defecto y así proceder a su reparación y bloqueo, evitando incluso que estos compuestos superen los umbrales de percepción, cosa que no es posible realizar únicamente mediante el análisis sensorial. De esta forma, es posible aplicar tecnologías enológicas preventivas en lugar de curativas, siendo siempre una actitud muy positiva de cara a la calidad del vino, pues los tratamientos curativos siempre erosionan la constitución general del mismo. La utilización de la técnica en
modo de espacio de cabeza (HS-SPME) para aislar y concentrar las moléculas específicas sin utilización de solventes y de manera automática, permite no provocar modificaciones sobre las muestras a analizar. El método utilizado es lineal, específico, seguro y repetible, con límites de detección más bajos que los umbrales de percepción (ver figura 4). Es un método entonces complementario y confirmativo de los problemas detectados mediante análisis sensorial y por supuesto, microbiológicos. La cromatografía de gases es también muy útil para verificar el estado higiénico del parque de barricas de una bodega. Para ello, el laboratorio Excell ha desarrollado una metodología muy práctica consistente en el análisis mediante cromatografía de etilefenoles (etilfenol y etilguaiacol), acetato de etilo y anisoles al mismo tiempo en las aguas de lavado de barricas usadas. Se trata de un método de análisis rápido que permite la detección y la cuantificación simultánea de los 5 contaminantes, que aparecen a nivel metabólico por la posible presencia de levaduras contaminantes Brettanomyces y de bacterias acéticas. Los anisoles aparecen como contaminantes químicos por otros motivos no estudiados aquí, pero frecuentes en barricas usadas. La gran ventaja del análisis cromatográfico en aguas de lavado de barricas usadas estriba en que el muestreo es muy significativo y permite por tanto realizar barridos analíticos muy extensos, evaluando la calidad higiénica del parque de barricas completo a nivel de riesgo y verificar si los sistemas de lavado y de higienizado en las trasiegas están resultando eficaces, (ver esquema de muestreo en figura 3). En la misma muestra de agua de lavado, además se puede evaluar mediante PCR a tiempo real y medios de cultivo las poblaciones activas de microorganismos contaminantes para estimar su población interna. Figura 3: esquema gráfico de la recogida de muestras en la evaluación del estado microbiológico del parque de barricas y de sus sistemas de limpieza.
Para ello, es necesario contar con un histórico importante a nivel de datos obtenidos a lo largo de varios años y con diferentes tipologías de barricas, con el objetivo de poder interpolar los resultados provenientes de analíticas concretas. El conocimiento además de la presencia de anisoles en la madera, agranda el beneficio de este tipo de técnica analítica, ya que estos contaminantes químicos pueden afectar gravemente las características sensoriales del vino. Comparación de las distintas técnicas microbiológicas: Todas las técnicas presentadas en el artículo son útiles para evaluar el estado microbiológico del vino a nivel de Brettanomyces, tanto a nivel de control de calidad como en el diagnóstico del posible problema. Los medios de cultivo y la observación al microscopio son técnicas sencillas que pueden ser empleadas directamente en bodega y que por su escaso coste pueden ser utilizadas para barridos
sistemáticos muy amplios. Son herramientas que pueden funcionar a modo de alarma, para que otras técnicas más complejas y específicas, normalmente ofrecidas por laboratorios especializados, puedan determinar de forma precisa el nivel de riesgo y el tipo de problema y como solucionarlo. En el ejemplo que se muestra en la figura inferior, podemos comparar las diferentes técnicas microbiológicas y químicas, incluyendo cata, según sus grados de sensibilidad y cuando éstas serían capaces de detectar un problema de contaminación por parte de Brettanomyces en bodega y por lo tanto, cuando se podría tomar decisiones de respuestas curativas para solucionarlo. Este gráfico muestra la evolución en dos años de la población de Brettanomyces. Como se puede observar, la estación del año donde más aumenta la población de las levaduras contaminantes es en primavera, mientras que cuando aumenta la presencia de etilfenoles en el vino es posteriormente a estos crecimientos poblacionales, posiblemente lo hacen en su fase de muerte. Esto puede ser debido a una respuesta en situación de estrés por parte de la levadura o a la actividad enzimática residual después de su muerte y/o a la autolisis de las propias células contaminantes. En líneas rojas se representa el momento en el que las distintas técnicas analíticas de seguimiento del vino serían capaces de dar señales de alarma y por tanto, de cuando el enólogo podría tomar decisiones resolutivas. Como podemos ver, las técnicas microbiológicas permiten actuar prácticamente en el origen del problema, especialmente el PCR a tiempo real, y lo hacen de forma anticipada respecto al análisis químico por cromatografía, y esta a su vez, de forma muy anticipada frente al análisis sensorial, que lo haría a los dos años desde el comienzo de la contaminación. Figura 4: Límite de detección por cata, Límite de cuantificación por cromatografía de gases, Límite de cuantificación por medidos de cultivo específicos y Límite de cuantificación por PCR a tiempo real. Barras: población de Brettanomyces, Línea punteada: evolución del contenido en etilfenoles.
Células viables
4-Etilfenol mg/L
LD: Cata
LC: Cromatografía LC: Medios cultivo LC: PCR tr Días
invierno
primavera
verano
En la tabla inferior, mostramos los momentos oportunos para cada tipo de análisis microbiológico y/o químico dependiendo de las distintas fases de la elaboración del vino, de su coste y de su eficacia. La citometría de flujo principalmente sirve para medir actividad y su intensidad. No es interesante ni para cuantificar ni identificar microorganismos, si no que su principal ventaja
radica en medir actividad fermentativa, por lo que puede ser empleada durante los procesos fermentativos, principalmente durante la fermentación alcohólica y maloláctica. La cromatografía de gases y espectrometría de masas nos da una idea precisa de la concentración del metabolito en el vino y del daño ya ocasionado por su presencia, siendo entonces interesante para medir etilfenoles al final de la fermentación alcohólica, final de maloláctica y antes de los coupages finales. Los medios de cultivo resultan interesantes especialmente para el control en la fase de latencia entre alcohólica y maloláctica, durante la crianza y para la comprobación de los sistemas de filtración. La microscopia de epifluorescencia es más útil cuando el nicho ecológico está bien ocupado, o sea, en mostos y durante la fermentación. El PCR a tiempo real resulta útil en cualquier fase del ciclo productivo del vino, desde la viña hasta el embotellado. Resulta especialmente ventajoso cuando tenemos poblaciones muy grandes y heterogéneas y buscamos pequeñas contaminaciones entre ellas o cuando realmente las poblaciones pueden ser muy pequeñas y necesitamos una gran sensibilidad, como es el caso del vino embotellado.
Tabla 2: Momentos óptimos para aplicar las diferentes técnicas de seguimiento: citometría de flujo, cromatografía de gases y espectrometría de masas, medios de cultivo específicos, microscopio de epiflourescencia y PCR a tiempo real.
Fases microbiológicas del vino
Citom.
CGSM
Medios
Fase prefermentativa Fermentación Alcohólica
*
Fin FA
*
E.F.
PCR
*
* *
*
Fase de latencia FA y FML
*
*
*
*
*
*
*
Fin FML
*
*
Crianza
*
*
*
Procesos limpieza y estabilización
*
*
Filtración
*
*
Embotellado
*
*
Conclusiones:
• Los análisis microbiológicos son necesarios para realizar controles de calidad en todas las fases de la vinificación y también para la resolución de problemas, especialmente en el caso de Brettanomyces. • Hay técnicas muy útiles para ser empleadas directamente en bodega, como es la observación al microscopio y el empleo de medios de cultivo selectivos específicos. • La técnica de PCR a tiempo real constituye en la actualidad la técnica mas fina y fiable y con los niveles de sensibilidad más bajos. Especialmente útil en la
búsqueda de contaminantes minoritarios en poblaciones heterogéneas y cuando los niveles poblacionales son muy bajos, como es después de la microfiltración y en el embotellado.
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