AVFT 4 2014 by felipe espino

Contenido

Detección de furosemida y otras substancias en caballos de carrera Furosemide and detection of foreign substances in race horses Estefanny Da Silva, Valentina Rossini, Luis Rivero, Abelardo Morales, Aniceto Mendez, Kimberly Brewer, Thomas Tobin

Efecto de la apocinina sobre las alteraciones renales inducidas durante la preeclampsia experimental en rata Effect of apocynin on renal alterations induced during experimental preeclampsia in the rat Camacho Elsa e Israel Anita

Efecto de la combinación levotiroxina-clenbuterol sobre la arteria aorta en ratas Sprague-Dowley The effect of combined levothyroxine-clenbuterol over aortic artery in Sprague-Dowley rats María Armas, Claudia Guarino, Manuel Moya, Emilio Suniaga, Abelardo Morales Aniceto Méndez, Kimberly Brewer, Thomas Tobin.

Volumen 33, Número 4, 2014 ISSN 0798-0264

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Sociedad Venezolana de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica Dirección: Escuela de Medicina José María Vargas, Cátedra de Farmacología, piso 3, Esquina Pirineos, San José. Caracas - Venezuela. Telfs.:(0212)5619871 - (0414)1361811 (0414) 3805405 Fax: (0212)3214385 www.revistaavft.com e-mail: revista.avft@gmail.com Historia de la revista: AVFT nació en 1982 como una necesidad de tener en Venezuela y Latinoamérica de una revista científica que publique la investigación farmacológica básica y clínica de nuestro país y América Latina, así como la investigación en otras ciencias básicas como Bioquímica, Fisiología, Fisiopatología e Inmunología. Simultáneamente con su creación, también se fundo la Sociedad Interamericana de Farmacología Clínica y Terapéutica y la Sociedad Venezolana de Farmacología y Terapéutica, inmediatamente AVFT se convirtió en el Órgano Oficial de las Sociedades Venezolanas de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica. Se solicito la indización en el Index Médico Latinoamericano y luego AVFT fue seleccionada en los Índices Extramed de la Organización Mundial de la Salud y en el Latinoamericano de Revistas Científicas de la Universidad Autónoma de México. Desde hace una década el FONACIT y el CDCH la apoyan económicamente y la han seleccionada en el Núcleo de Revistas del FONACIT. El FONACIT considera a AVFT como una de las revistas científicas venezolanas arbitradas con contenido más original y de mayor interés. Algunos investigadores connotados como Marcelo Alfonzo, ltala Lippo de Becemberg, Alicia Ponte Sucre, Anita Israel, Luigi Cubeddu, etc. han escogido a AVFT para publicar sus hallazgos básicos y clínicos por su arbitraje, difusión e indización. Actualmente se ha remozado el Comité Editorial y los formatos adecuándolos a las exigencias de índices internacionales como el SCI, Excerpta Medica y Current Contents. A partir de 2002 AVFT se publicará cuatrimestralmente dado la mayor demanda científica. AVFT tradicionalmente ha publicado las reuniones anuales de Farmacología, ASOVAC, Facultad de Farmacia, del Instituto de Medicina Experimental y de Congresos de Farmacología organizados en nuestro país. Periodicidad Trimestral Título abreviado: AVFT

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Detección de furosemida

y otras substancias en caballos de carrera Furosemide and detection of foreign substances in race horses Estefanny Da Silva¹, Valentina Rossini¹, Luis Rivero², Abelardo Morales2 3, Aniceto Mendez3, Kimberly Brewer4, Thomas Tobin4 ¹Faculty of Pharmacy, Santa Maria University, Caracas-Venezuela, ²Division de Sanidad Animal Hipodromo La Rinconada, CaracasVenezuela, 3Department of Anatomy and Comparative Anatomic Pathology, College of Veterinary Medicine. University of Cordoba, Spain. 4Maxwell H. Gluck Equine Research Center, University of Kentucky, Lexington USA.

Recibido: 20/10/2013

Aceptado: 21/11/2013

Resumen

Abstract

La hemorragia pulmonar inducida por el ejercicio (EIPH) tiene una alta prevalencia en las carreras de caballos Pura Sangre en Venezuela; el tratamiento preventivo más común es la furosemida. Sin embargo, su uso ha causado mucho debate en los círculos ecuestres mundo ya pesar de ser favorable para el tratamiento o la prevención de HPIE, también se ha sugerido que su efecto de dilución urinaria que “enmáscara” la identificación de otras drogas. Esto representa un problema actual; se decidió tratar este asunto para determinar cuál es el efecto de la administración de furosemida en dosis de 0,2 mg, en 6 grupos de dos caballos con el uso concomitante de la acepromacina y dexametasona, en dosis de 0.03mg/ kg, 0,08mg /kg, 0.01mg/kg total 15mg respectivamente, 0.01mg/kg triamcinolona y glycopirrolato 1mg/kg. Se colectaron muestras de sangre y orina, y se determinó por ELISA competitiva la detección o no de las sustancias dentro de 72 horas después de la medicación. Todas las sustancias, así como la furosemida se detectaron en la sangre y la orina a lo largo de las 72 horas. En conclusión furosemida no alteró la detección en la sangre y la orina de las sustancias probadas en el primer post medicación 72 horas de la carrera de caballos.

Exercise Induced by Pulmonary Hemorrhage (EIPH) has a high prevalence in Thoroughbred horse racing in Venezuela; the most common preventative treatment is the diuretic furosemide. However, its use has caused much debate in world equestrian circles since despite being favorable for the treatment or prevention of EIPH, it has also been suggested that its effect urinary dilution which “masks” identification of other drugs. This represents a current problem; it was decided to address this matter to determine what the effect of the administration in 6 group of two horses of furosemide at a dose of 0.2mg/kg on the concomitant use of acepromazine and dexamethasone, at doses of 0.03mg/kg, 0.08mg/kg, 0.01mg/ kg to 15mg total respectively, triamcinolone 0.01mg/kg and glycopirrolate 1mg/kg. Samples of blood and urine were collected, which was determined by competitive ELISA the detection or otherwise of the foreign substances in question within 72 hours post medication. Blood and urine samples were collected very hour for 72 hours post medication and the samples were analyzed by a commercial competitive ELISA. All substances as well as furosemide were detected in blood and urine throughout the72 hours. In conclusion furosemide did not alter the detection in blood and urine of the tested substances in the first 72 hours post medication in the race horse.

Palabras claves: EIPH, furosemida, acepromacina, dexametasona, triamcinolona.

Keywords: EIPH, furosemide, acepromazine, dexamethasone, triamcinolone.

Introducción Los reglamentos de la medicación en las pistas de carreras en el Caribe, en América Central y América del Sur se basan en los de la ARCI (Asociación Internacional Comisionada de Carreras y AORC (Asociación Oficial de Químicos de Carreras)25. Algunos países, sin embargo, cuentan con una legislación y una reglamentación específica.

Ejemplos de países con legislación específica incluyen Argentina, Brasil, Uruguay y Venezuela. Las Normas Nacionales de Venezuela de la carrera de caballos , en efecto, en 1995, declara: La administración de cualquier medicamento con los caballos inscritos para participar en carreras es prohibida, así como cualquier sustancia química, droga o sustan-

En la actualidad en el mundo hípico a nivel mundial ha sido afectado por numerosos casos de detección de substancias prohibidas en carreras de caballos en países como USA, Inglaterra, España y Venezuela no escapa de esta realidad. Numerosos son los casos al año que reportan el uso de substancias prohibidas en las carreras de caballos entre los que destacan: En 1992-1993, cuatro caballos del Horse Racing Board de California USA (fueron positivos a la detección de clembuterol) en Hollywood Park y Santa Anita5. En 2008 en los Juegos olímpicos 4 caballos fueron descalificados por el uso de substancias prohibidas por la Federación Ecuestre Internacional (específicamente un analgésico identificado como capsaisin, similar en Atenas 2004 fueron descalificados por el uso de fluphenazine and zuclopenthixoly en Sidney 20006,7. En 2009 en el Campeonato Abierto de Polo en Wellington Florida USA, 21 caballos de un equipo representante de Venezuela presentaron muerte súbita asociada con la medicación con selenio8,9. En los establos de Newmarket en Inglaterra, las Autoridades de Caballos Británicas (BHA), determinaron que 11 caballos dieron positivo en abril de 2013, y más de 20 caballos entrenados en pruebas de resistencia en han estado involucrados en casos de dopaje y sancionados por el tribunal disciplinario de la Federación Ecuestre Internacional (FEI) desde 2005. Según los archivos de acceso público, 16 de los caballos dieron positivo en la competencia a los esteroides naturales o manufacturados. (estanozolol), según señalan los informes de la FEI10,11. En 2012 más de 30 caballos han dado positivo por una (demorphin) sustancias ilegales para mejorar el rendimiento12,13. Recientemente la Asociación de Benevolencia Protectora de Florida Horsemen reporto que son más de 125 pruebas positivas de clembuterol. Dos casos de muerte después de la carrera asociada mostraron rastros de rodenticidas, pero no del tipo utilizado por los hipódromos de California14. En Europa: España también fue reportado en caballos pura sangre de carreras de dos casos de dopaje con estanozolol y 16 -B- hydroxystanozonol en 2013. En Milán Italia 2010 las autoridades dieron a conocer un aumento de dopaje de caballos en carreras oficiales, tema relacionado

En Sudamérica se han reportado casos de dopaje en los caballos de carrera. En el 1991 la carrera internacional de caballos Clásico del Caribe (Caribe Horse Racing Confederación), Venezuela un caballos fue descalificado por usar drogas prohibidas (fenilbutazona y Lasix). En Argentina se detectó N- Butilescopolamina Bromuro de caballos pura sangre de carreras en 2012 y un caso de acepromacina en Brasil los casos de dopaje pura sangre de carreras de caballos se detectó Flunixin meglumine, en 2009. En Chile en el año 2010 el dopaje por clembuterol fue detectado en caballos pura sangre de carreras. En Colombia cuatro caballos de paso colombianos fueron positivos a la cafeína y la teofilina en 2010. En México dos casos positivos por clembuterol en el Hipódromo de las Américas en 2011. En Panamá 14 casos de caballos de dopaje positivo a la cocaína en 2005. Puerto Rico nueve casos un Ethorphine positivo en 2005. En Uruguay 12 casos de dopaje a la cafeína positivo en 2012, 17 casos de dopaje en 2011 y 29 casos de dopaje en 2010. En Arabia Saudita en 2010 dos caballos fueron positivos una fenilbutazona y oxiphenbutazone. En Australia en 2013 entrenador acusado por dopaje del ganador Tamworth Copa prusiana Secret15. En Hong Kong en 2013, diecisiete caballos de los establos de tres instructores de Hong Kong han dado positivo por la sustancia prohibida zilpaterol, una sustancia que se utiliza para producir el crecimiento muscular en el ganado vacuno16 y 17 casos de dopaje positivo a clembuterol Hong Kong Jockey Club17. El empleo de furosemida, en carreras de caballos permitida por el Reglamento de Carreras, ha generado a lo largo de los años que debido a su efecto de diuresis puede afectar la detección de otras substancias prohibidas, en los exámenes toxicológicos. En virtud de esta importante área de estudio planteamos como objetivo la detección de furosemida y otras substancias en caballos de carreras en Venezuela.

Materiales y métodos Se estudiaron un total de 10 equinos (Eqqus caballus), de raza Pura Sangre de Carreras 5 de sexo macho y 5 hembras. En la División de Sanidad Animal en el Hipódromo “La Rinconada”, Caracas-Venezuela. El peso promedio fue de 450 kg, con una edad comprendida entre 2-4 años. Bajo similares condiciones de manejo, alimentación y en actividad atlética. Los équidos fueron clasificados por grupo de tratamiento como muestra la siguiente tabla (Tabla 1): 1.- Tabla Clasificación de grupos de tratamiento, número de caballos, medicación, dosis y vía de administración:

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 33, número 3, 2014

Ningún medicamento puede administrarse a partir de los cinco5 días antes de la participar en el concurso público hasta que el caballo deja de estar bajo el control de las autoridades hípicas. Excepciones de cumplimiento el tiempo proporcionado en el presente documento, es el uso de furosemida y fenilbutazona, que se puede administrar por prescripción veterinaria bajo la siguiente esquema: La administración de furosemida puede ser de hasta cuatro4 horas antes de la competición, que incluirá una dosis máxima de 250mg. La administración de fenilbutazona puede ser de hasta veinticuatro24 horas antes de la competición en la que el animal va a participar, en una la dosis no superior a dos (2) gramos (Reglamento Nacional de Carreras de Caballos, vigente año 1995)25.

con millones de apuestas ilegales que se mueve el sector ecuestre en ese país. Los animales se someten muchas veces cócteles anabólicos, analgésicos, antipiréticos, antiinflamatorios, agentes citotóxicos, diuréticos, cortiscosteroide y la hemostasia. Incluso las altas dosis de viagra (Sildenafil) detectados en yeguas.

AVFT

cia de cualquier naturaleza que pretende alterar o modificar de cualquier modo la capacidad de locomoción del caballo.

Grupos de Tratamiento

Número de caballos

Medicación, dosis y vía de administración.

Control (-)

Solución fisiológica 10ml IV.

Control (+) Furosemida

Furosemida 0.2mg/kg IV.

Furosemida + Acepromacina

Furosemida 0.2mg/kg IV.

Acepromacina 0.03mg/kg IV.

Furosemida + Dexametasona

Furosemida 0.2mg/kg IV.

Dexametasona 0.08mg/kg IV.

Furosemida + Triamcinolona

Furosemida 0.2mg/kg IV.

Triamcinolona 15mg IV.

Furosemida + Glicopirrolato

Furosemida 0.2mg/kg IV.

Glicopirrolato 0.01mg/kg IV.

Resultados Una vez establecida la clasificación de los grupos experimentales y la medicación se procedió a realizar la toma de muestras de orina mediante la técnica de la sonda urogenital y la toma de muestras de sangre de la vena yugular izquierda, durante cada hora las primeras 8 horas y posteriormente a las 12 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas. Las muestras de orina y de sangre fueron analizadas mediante el empleo de Kits comerciales para ELISA competitivo: Furosemide ELISA Kit (1042191 NEOGEN Corporation), Dexamethasone ELISA Kit (101519 BIOKITS), Triamcinolone ELISA Cat. No.: 5081TRIA, GlycopyrrolateELISA Kit Glycopyrrolate Drug Detection ELISA Kit 102019 Neogen Corporation, MaxSignal® Acepromazine/Tricyclics ELISA Test Kit BO_5014 MEDIBENA Life Science & Diagnostic Solutions. Los resultados fueron tabulados por hora y posteriormente se analizados en base a la hora de detección.

Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla (Tabla 2). La furosemida fue detectable tanto en sangre como en orina desde la segunda hora y hasta seis horas después de la medicación en todos los casos excepto en el grupo control que no fue administrada. La acepromacina se detectó en sangre y orina desde la hora 1 y hasta la hora 7. La última detección fue en la hora 8 después de la medicación solo en orina. La dexametasona se detectó en sangre y orina en las primeras 5 horas. Solo en un equino fue detectada en sangre y orina en hasta la hora 8 después de la medicación. La detección del glicopirrolato se realizo en sangre como en orina a partir de la hora 1 y detectada solo hasta la hora 5. 4. La triamcinolona en el equino se detectó por primera vez a la segunda hora, posteriormente a las 24 y 48 horas después de la medicación.

Tabla 2.- Resultados toxicológicos por medicación y por hora de estudio. HORA Positivo

Furosemida + Acepromacina

Grupo Control Negativo

Equino 2A

Equino 3A

Furosemida + Dexametasona

Equino 2D

Equino 3D

Furosemida + Glicopirrolato

Equino 2G

Equino 3G

Furosemida + Triamcinolona Equino 2T

Equino 3T

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Agradecimiento Este estudio fue financiado por el Consejo de Desarrollo Humanístico y Científico de la Universidad Central de Venezuela: PG 11-00-6631-06 CDCH-UCV, PI N°11-8150-2011/1 CDCH-UCV y la División de Sanidad Animal del Hipódromo “La Rinconada”.

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El uso de substancias prohibidas en competencias de caballos es un problema que afecta de manera severamente a la industria equina a nivel mundial. La aplicación ilegal de cualquier substancia, excepto dieta normal, con la característica de modificar las capacidades naturales y actuales del caballo en el momento de la carrera27 define a las substancias prohibidas. A lo largo de los años muchas substancias prohibidas han sido reportadas a partir de 19621, alcaloides3 sulpirina, aminopiryne, antipirine22, cafeína18, la clorpromazina y fenobarbital19, diazepam2, corticosteroides24, anestésicos locales4, ethorphine26, morfina21, betametasona23, dipirona20, el cortisol y el clenbuterol y glicopirrolato25. Estas substancias presentan múltiples efectos secundarios, con consecuencias directas sobre la salud del caballo y en muchos casos terminan con daños irreversibles e incluso la muerte, o la eutanasia del caballo. Las técnicas de detección de drogas en sangre y orina, cada año son perfeccionadas con el propósito de detectar con alta sensibilidad las substancias prohibidas, entre las pruebas se destacan la cromatografía de masas, el radioinmunoensayo, la cromatografía liquida (HPLC), que comparativamente con la técnica de ELISA presentan mayor sensibilidad. En general los reglamentos de las carreras de caballos Pura Sangre permiten el uso de dosis terapéuticas de furosemida, reguladas con el fin de prevenir la hemorragia pulmonar inducida por el ejercicio25. La detección de cada uno de los medicamentos empleados en conjunto con la furosemida coincidió con los reportes en la literatura internacional de la farmacocinética y farmacodinamia25. En conclusión la medicación con furosemida no altero la detección en la sangre y en la orina de substancias prohibidas durante las primeras 72 horas post-medicación en los caballos Pura Sangre de Carreras.

6. En:http://www.abc.net.au/news/stories/2008/08/22/2343334. htm?site=olympics/2008

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Discusión

Efecto de la apocinina

sobre las alteraciones renales inducidas durante la preeclampsia experimental en rata Effect of apocynin on renal alterations induced during experimental preeclampsia in the rat Camacho Elsa e Israel Anita Laboratorio de Neuropéptidos. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. Caracas - Venezuela.

Recibido: 20/10/2013

Aceptado: 21/11/2013

Resumen

La preeclampsia (PE) es un trastorno multisistémico del embarazo caracterizado por hipertensión, proteinuria y edema, que se asocia con la disfunción endotelial generalizada y el estrés oxidativo. En el embarazo normal, los mecanismos de vasodilatación sugieren que el óxido nítrico (NO) es el más importante mediador en la reducción de la resistencia vascular, mientras que en la PE la respuesta dilatadora dependiente de endotelio y mediada por el NO se encuentra reducida. Se ha demostrado que la inhibición de la síntesis del NO mediante la administración crónica de L-NAME en ratas preñadas, resulta en un modelo animal que ocasiona un síndrome similar a la PE, el cual cursa con hipertensión, insuficiencia renal, proteinuria, incremento de la producción anión superóxido y una reducción de la actividad de las enzimas antioxidantes renales como la catalasa (CAT), la superóxido dismutasa (SOD) y la glutatión peroxidasa (GPX). Debido al papel preponderante del estrés oxidativo en la PE, en el presente estudio evaluamos si la inhibición de la producción de especies reactivas de oxígeno mediante el uso de un agente desacoplante de la NAD(P)H oxidasa como lo es la apocinina, podría revertir los signos de PE experimental en ratas. Para ello, se determinó el efecto de la apocinina sobre el número y el peso de los fetos, la presión arterial media, la proteinuria, la excreción urinaria de sodio y potasio y la ac-

tividad de las enzimas antioxidantes CAT, SOD y GPx de la corteza renal, en un modelo experimental de preeclampsia inducido por el tratamiento con L–NAME en ratas de 13 días de gestación. El tratamiento crónico con L-NAME en ratas preñadas incrementó la PAM (+20 mmHg), produjo proteinuria, redujo el peso promedio de los fetos, sin embargo no alteró significativamente el número de ellos. La inhibición de la sintasa del óxido nítrico en las ratas preñadas redujo la actividad de las tres enzimas antioxidantes evaluadas. El tratamiento crónico con apocinina, revirtió el incremento de la presión arterial, la proteinuria, la reducción del volumen urinario y de la excreción urinaria de sodio y potasio, así como la disminución de la actividad de las enzimas antioxidantes inducida por el L-NAME en ratas preñadas. Estos hallazgos sugieren que la PE experimental cursa con alteración de la función renal asociada a la reducción de la actividad antioxidante. Igualmente indican que estas acciones están mediadas por un incremento de la producción de especies reactivas de oxígeno, por lo que el uso terapéutico de los antioxidantes como estrategia farmacológica en la preeclampsia parece ser prometedor. Palabras clave: preeclampsia, apocinina, catalasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa

Abstract Preeclampsia (PE) is a multisystem disorder of pregnancy characterized by hypertension, proteinuria and edema. PE is associated with endothelial dysfunction, oxidative stress and decreased endothelial nitric oxide synthase activity. The mechanisms of normal pregnancy-associated vasodilatation suggest that nitric oxide (NO) is the most important mediator for the reduction of vascular resistance. Many studies demonstrated reduction of endothelium-dependent dilator response mediated by NO in PE. It has been shown that the inhibition of NO synthesis by chronic administration of L-NAME to pregnant rats results in an animal model which causes a PE-

like syndrome, which is associated with hypertension, renal failure, proteinuria, increased superoxide anion production and a reduction of the kidney activity of antioxidant enzymes such as catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPX). Due to the important role of oxidative stress in the PE, in this study we evaluated whether inhibition of the production of reactive oxygen species uncoupling NAD(P)H oxidase with apocynin, could prevent signs of experimental PE in rats. For this purpose, we determined the effect of apocynin on the number and the weight of the fetuses, mean blood pressure, proteinuria, urinary excretion

Introduccion En la actualidad se desconoce con exactitud la etiología de la preeclampsia (PE), pero la evidencia de los últimos años apunta hacia nuevos mecanismos potenciales que posiblemente media la patogénesis de la hipertensión durante la PE. Aún cuando se han implicado factores genéticos, inmunológicos y ambientales, el enfoque reciente establece una clara relación entre la disfunción endotelial y la hipertensión inducida por el embarazo (Roberts y col., 2003; Granger y col., 2001). Se ha propuesto que el proceso fisiopatológico que subyace en la PE ocurre en dos estadios: el primero la reducción de la perfusión de la placenta y el segundo en los síndromes clínicos maternos (Roberts y col., 2003; Roberts y col., 2005). La isquemia/hipoxia de la placenta, a su vez, resulta en la liberación de una variedad de factores que ejercen efectos profundos sobre el flujo sanguíneo y la regulación de la presión arterial (Roberts y col., 2003; Roberts y col., 2005; Granger y col., 2001; Granger y col., 2002). Estos factores incluyen la liberación de un conjunto de moléculas como el receptor-1 soluble de VEGF (sFlt-1), el auto-anticuerpo del receptor AT1 de la angiotensina (AT1-AA) y, citoquinas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) el cual, a su vez, genera una disfunción endotelial generalizada en la madre (Roberts y col., 2003; Granger y col., 2002). Esta disfunción se manifiesta a través del incremento en la formación de factores circulantes como la endotelina, las especies reactivas de oxígeno (EROs), el tromboxano, el ácido 20-hidroxieicosatetaenóico (20-HETE), y un aumento de la sensibilidad vascular a la angiotensina II (ANG II) (Roberts y col., 2003; Granger y col., 2002). Más aún, la PE se asocia con una reducción de la formación de vasodilatadores como el óxido nítrico y la prostaciclina (Roberts y col., 2003; Granger y col., 2002). Todas estas alteraciones vasculares no solo llevan a

El óxido nítrico (NO), un potente vasodilatador liberado por las células endoteliales, inhibe la agregación plaquetaria y la adhesión al endotelio y, está involucrado en el control de la presión arterial (Lyall y Greer 1996). El NO es producido en la circulación fetoplacentaria, contribuyendo al control del tono vascular y atenuando las acciones de los vasoconstrictores (Myatt y col., 1992; Lyall y Greer, 1996). La NO sintasa de la vasculatura vellosa placentaria corresponde a la isoforma endotelial tipo III dependiente calcio-calmodulina (Myatt y col., 1992), y está presente en las venas y arterias umbilicales, arterias y venas coriónicas, y en el sinciociotrofoblasto. Debido a la fuerte evidencia que indica el papel primordial del NO y su desregulación en la PE, caracterizamos un modelo experimental que resulta de la inhibición crónica de la síntesis de NO mediante la administración de L-NAME a ratas preñadas (Camacho y col., 2011). En este modelo de PE, las ratas preñadas tratadas con L-NAME desarrollan hipertensión de manera dependiente de la dosis, así como potenciación de las respuestas presoras a la ANG II, la vasopresina y la noradrenalina (Molnar y Hertelendy, 1992), proteinuria y un incremento de la agregación plaquetaria, similar a los cambios que ocurren en la PE humana. También ocurre disfunción renal, vasoconstricción de las arterias renales, y una disminución en la tasa de filtración gromerular (TFG), alteraciones en la placenta, y trombosis intravascular, todos estos signos similares a la PE desarrollada en humanos (Pandhi y col., 2001). Aún cuando se conoce parcialmente las generalidades acerca de este modelo experimental de PE, es elusiva la contribución relativa del estrés oxidativo y de la actividad de las enzimas antioxidantes renales en la PE inducida por inhibición crónica de la síntesis de óxido nítrico en ratas preñadas. Al respecto, se ha demostrado en células musculares lisas, en trofoblastos y placentas, que tanto la ANG II como los anticuerpos anti-AT1 (AT1-AA) proveniente de la sangre de madres preeclámpticas fueron capaces de incrementar la producción de EROs, los componentes de la NAD(P)H oxidasa, p22, p47 y p67 y la activación de la NF-ƙB. Estos efectos fueron bloqueados por el losartán, un bloqueante del receptor AT1, por el difenil-eneiodonio (DPI) un inhibidor de la NAD(P)H oxidasa y por la administración de un mimético de la SOD (Dechend y col., 2003), lo que sugiere la participación del sistema angiotensinergico y la producción de especies reactivas de oxígeno en la PE. Si ello es así, nos planteamos la posibilidad que la apocinina, un desacoplante la NAD(P)H oxidasa, podría prevenir los efectos deletéreos observados en la preeclampsia experimental en rata.

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Key words: preeclampsia, apocynin, catalase, superoxide dismutase, gluthation peroxidase.

la hipertensión, sino a la disfunción de múltiples órganos, entre ellos el riñón (Roberts y col., 2003, Roberts y col., 2005, Granger y col., 2002).

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of sodium and potassium and the activity of the renal cortex enzymes CAT, SOD and GPx, in an experimental model of preeclampsia induced by treatment with L-NAME in rats of 13 days of gestation. Chronic treatment with L-NAME in pregnant rats increased MAP (+20 mmHg), produced proteinuria and reduced the weight of the fetuses. The inhibition of nitric oxide synthesis in pregnant rats reduced the activity of the three antioxidants enzymes evaluated. Chronic treatment with apocynin, prevented the increase in blood pressure, proteinuria, volume reduction and decreased urinary excretion of sodium and potassium as well as the reduction of antioxidant enzyme activity induced by L-NAME in pregnant rats. These findings suggest that impaired renal function observed in the experimental PE is associated with the reduction of antioxidant activity which is prevented by apocynin treatment. Also indicate that these actions are mediated by increased production of reactive oxygen species, in consequence the therapeutic use of antioxidants as pharmacological strategy to prevent preeclampsia seems promising.

Materiales y metodos Animales y protocolos de experimentación como animales de experimentación se utilizaron ratas hembras primigestas, de la cepa Sprague-Dawley, de 12-13 semanas de edad, provenientes del Bioterio del Instituto de Medicina Experimental de la UCV (Caracas), mantenidas bajo libre acceso al agua y a la comida (Ratarina®) hasta el momento del experimento. Después del apareamiento, la presencia del espermatozoide en el frotis vaginal marca el día 1 de la gestación. A partir del día 13 de la gestación, los animales se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos. Los animales del grupo I recibieron una dosis de 50 mg/kg/día de Nw-nitro-L-arginina (L-NAME) administrada por vía intraperitoneal, durante 7 días. El grupo II recibió solo vehículo (solución fisiológica). El grupo III recibió apocinina (33 μg/Kg/día, i.p.) durante 7 días y el grupo IV recibió el tratamiento combinado de L-NAME+ apocinina durante 7 días. Todos los animales fueron pesados dos veces a la semana y se les determinó la presión arterial sistólica, diastólica y frecuencia cardiaca. Al día 20 de la gestación, los grupos experimentales de animales fueron colocados en jaulas metabólicas individuales para la recolección de orina de 24 horas. Inmediatamente después de la recolección de las muestras de orina los animales fueron sacrificados por decapitación, se recolectaron muestras del riñón y fetos los cuales fueron colocadas inmediatamente en hielo. Los fetos fueron cuantificados y pesados y las cortezas renales fueron homogenizadas y congeladas a -20 ºC, hasta su utilización en los ensayos respectivos.

Los procedimientos empleados en los experimentos fueron sometidos para su aprobación, al Comité de Bioterio de la Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela. Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las buenas prácticas para el manejo de animales de laboratorio (NIH Guide, 1996). Determinación de la presión arterial (pa) y de la frecuencia cardiaca (FC) Para la determinación de la PA (PAS y PAD) y FC se utilizó el método indirecto no invasivo mediante el empleo de un pletismógrafo digital de cola (Digital Pressure Meter LE 5000, LETICA y el Pressure Cylinder LE 5100, LETICA® Scientific lnstruments, Barcelona, España). Para ello, las ratas fueron calentadas en una estufa graduada a 42 ºC durante 15 minutos, y luego colocados en un cepo para la determinación no invasiva de los parámetros cardiovasculares. Estos fueron determinados a la misma hora del día durante los períodos de entrenamiento y del experimental. La PAM fue calculada de acuerdo a la formula: PAD+1/3(PAS-PAD). Cuantificacion de la excrecion urinaria de proteinas Se empleó el método colorimétrico basado en el método de Biuret, en el cuál se determina la cantidad de proteínas presentes en la orina mediante la formación de un quelato coloreado, donde ocurre una reacción entre los iones cúprico y los enlaces peptídicos. El método se fundamenta en la

co-precipitación de proteínas, en presencia del reactivo de rojo Ponceau y la adición del ácido tricloroacético. La concentración de proteínas en orina se calculó mediante la utilización de una curva estándar de albúmina sérica de bovino en valores de concentraciones decrecientes que van desde 8 a 0,125 mg/mL. Los resultados se expresaron como mg de proteína/100 gramos de peso corporal (Pesce y Strande, 1973). Determinacion de la actividad enzimatica de la catalasa (CAT) La actividad de la catalasa fue determinada empleando una modificación del método de Aebi (1984), que se basa en la disminución de la absorbancia del H2O2 debido a su degradación enzimática, y monitoreada a una longitud de onda de 240 nm, a 25oC. Brevemente, en una celda de cuarzo se colocaron 25 μL de homogenizado del tejido diluído 1.33 en amortiguador de fosfatos 10 mM (pH 7,0), se adicionaron 725 μL de H2O2 7,7 mM e inmediatamente se midió el cambio de absorbancia a 240 nm, a los 15 y 30 segundos. De acuerdo a Aebi, se utiliza la constante de reacción de primer orden (k) como la unidad de actividad de la CAT, la cual queda definida de acuerdo a la siguiente fórmula: k = (1/t) (2,3 x log A1/ A2), donde t es el intervalo de tiempo medido (seg), A1 y A2 son las absorbancias del H2O2 en los tiempos t1 y t2. Los resultados se expresaron como k/mg de proteína. Determinacion de la actividad de la enzima superoxido dismutasa (SOD) La actividad de SOD se determinó mediante una modificación del método de Oberley y col. (1984), el cual mide la capacidad SOD presente en la muestra para inhibir la reducción del azul de nitrotetrazolio (NBT) por el anión superóxido generado a través del sistema de la xantina-xantina oxidasa presente en la mezcla de reacción. Los resultados son expresados como U/mg proteína. Una U de actividad SOD se define como la cantidad de enzima requerida para inhibir en un 50% la formación de los cristales de formazán. Determinacion de la actividad de la glutation peroxidasa (GPx) La actividad de la glutatión peroxidasa (GPx) fue determinada de forma indirecta de acuerdo al método descrito por Flohé (1984), mediante una reacción acoplada con la glutatión reductasa. El glutatión reducido es empleado por la GPx para reducir el peróxido de hidrógeno, el cual es regenerado por la glutatión reductasa a partir de glutatión oxidado y NAD(P)H. La reacción mide la disminución de la absorbancia a 340 nm debido a la desaparición de NAD(P)H. Los resultados fueron expresados como actividad enzimática en U/mg proteína (ε = 6.22 mM−1 cm−1). Una U de GPX representa un mmol de NAD(P)H oxidado/min por mg proteína. Determinacion las proteinas tisulares Las proteínas tisulares totales fueron determinadas por el método de Lowry y col. (1951) utilizando albúmina sérica de bovino como patrón. Los resultados fueron expresados como mg de proteínas/10 ml.

Análisis estadístico Todos los resultados fueron expresados como la media más o menos el error estándar de la media (X ± EEM). Las diferencias entre los grupos se determinaron mediante el uso de la prueba de “t” de Student y el análisis de varianza de una vía (ANOVA). Un valor de p<0,05 fue considerado como estadísticamente significativo. Resultados Efecto de la apocinina sobre la morfometría fetal Aún, cuando se observó que no hubo variaciones en el número de fetos vivos posterior al tratamiento con L-NAME en las ratas preñadas cuando se compara con las ratas preñadas controles, sin embargo se observó una disminución significativa del peso fetal asociada a la presencia de reabsorción fetal. El tratamiento con apocinina, no alteró los parámetros evaluados; sin embargo, redujo la reabsorción fetal (Tabla I).

Figura 1

Curso temporal del efecto de la apocinina sobre el incremento de la presión arterial inducido por el L-NAME en ratas preñadas. (○) Grupo Control (NaCl 0,9% i.p.), (▲) Nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) 50 mg/Kg/día, (▼) Apocinina: 33 μg/Kg/día y (♦) L-NAME+APO. Los valores representan la media ± EEM de N= 4 por grupo. ***p<0,001 comparado con ratas control, APO y L-NAME+APO; **p<0,01 comparado con ratas tratadas con APO y *p<0,05 comparado con ratas tratadas con APO.

Figura 2

El tratamiento a ratas preñadas con L-NAME durante 7 días consecutivos, incrementó la presión arterial media cuando se compara con las ratas preñadas controles. Los valores promedios de la PAM fueron: ratas preñadas controles: 107,41 ± 3,2 mmHg vs. L-NAME: 149,7 ± 3 mmHg (p<0,001). El tratamiento de las ratas preñadas con apocinina (33 μg/Kg/día), por si mismo no alteró el curso temporal de la presión arterial media; sin embargo, previno parcialmente el incremento de la PAM inducida por la inhibición de la síntesis del óxido nítrico en las ratas preñadas (figura 1). Por otra parte, al cuantificar el efecto de la apocinina sobre el incremento de las proteínas totales excretadas en orina durante 24 horas en ratas preñadas tratadas con L-NAME, se observó que el tratamiento con L-NAME produjo un incremento significativo de las proteínas totales urinarias y el tratamiento con apocinina no afectó los niveles basales de excreción urinaria de proteínas, pero previno el incremento de la excreción urinaria de proteínas inducido por el L-NAME (figura 2). Efecto de la apocinina sobre el volumen urinario, y la excreción urinaria de sodio y potasio en ratas preñadas tratadas con L-NAME

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Efecto de la apocinina sobre los cambios en la presión arterial media y en la excreción urinaria de proteínas en ratas preñadas tratadas con L-NAME.

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Determinación del volumen urinario y de la excreción urinaria de Na+ y K+ El volumen de orina se determino volumétricamente y se expresó en mL/100 g de peso corporal. La cantidad de sodio y potasio en las muestras de orina recolectadas, se determinó mediante fotometría de llama (Corning® 405 de Corning Medical Instruments, Halsted, Essex, RU.) Los resultados se expresaron en µEq/mL de orina y corregidos por 100 g de peso corporal.

83 Efecto de la apocinina sobre la excreción urinaria de proteínas en ratas con preeclampsia experimental. Control (NaCl 0,9% i.p.) y L-NAME (50 mg/Kg/día i.p., durante 7 días) y apocinina (33 μg/Kg/día). Los valores representan la media ± EEM. *p<0,05 comparado con ratas preñadas control. #p<0,05 comparado con ratas preñadas tratadas con L-NAME.

En la figura 3, se muestra el efecto de la apocinina, 33 μg/ Kg/día durante 7 días consecutivos, sobre el volumen urinario en ratas preñadas controles y tratadas durante 7 días con L-NAME. Como se observa, el tratamiento con L-NAME redujo significativamente el volumen urinario y el tratamiento con apocinina revirtió el efecto reductor del volumen urinario inducido por L-NAME. En relación a la excreción de electrolitos, el tratamiento el tratamiento con L-NAME redujo significativamente la excreción urinaria de sodio y potasio. La apocinina no alteró la excreción urinaria de sodio y potasio basal, pero logró prevenir la reducción de la excreción urinaria de sodio y potasio inducida por el L-NAME (figura 4).

Figura 3

Figura 4

Efecto de la apocinina sobre el volumen urinario en ratas con preeclampsia inducida por el tratamiento con L-NAME. Control (NaCl 0,9% i.p.) y L-NAME (50 mg/Kg/ día i.p., durante 7 días y apocinina 33 μg/Kg/día. Los valores representan la media ± EEM. ***p<0,001 comparado con el grupo control. ###p<0,001 comparado con el grupo tratado con L-NAME.

Efecto de la apocinina sobre la excreción urinaria de sodio y potasio en ratas con preeclampsia inducida por el tratamiento con L-NAME. Control (NaCl 0,9% i.p.) y L-NAME (50 mg/Kg/día i.p.), durante 7 días, apocinina (33 μg/Kg/día). Los valores representan la media ± EEM. *p<0,05 comparado con ratas preñadas control. #p<0,05 comparado con ratas preñadas tratadas con L-NAME.

84 Figura 5

FIGURA 5. Efecto de la apocinina sobre la actividad de las enzimas antioxidantes (SOD, CAT y GPx) renales en ratas con preeclampsia inducida por el tratamiento con L-NAME. Control (NaCl 0.9% i.p.) y L-NAME (50 mg/Kg/día i.p., durante 7 días), apocinina (33 μg/Kg/día). Los valores representan la media ± EEM.*p<0,05 comparado con ratas preñadas control. **p<0,01 comparado con ratas preñadas control. ###p<0,001 comparado con ratas preñadas tratadas con L-NAME. ##p<0,01 comparado con ratas preñadas tratadas con L-NAME. #p<0,05 comparado con ratas preñadas tratadas con L-NAME.

Efecto la apocinina sobre la actividad de las enzimas antioxidantes renales en ratas con preeclampsia experimental inducida con L-NAME En la figura 5, se muestra el efecto de la administración de la apocinina a la dosis de 33 μg/Kg/día sobre la actividad de las enzimas antioxidantes del tejido cortical renal de ratas

preñadas controles y ratas preñadas tratadas con L-NAME. El tratamiento con L-NAME en las ratas preñadas induce a una reducción significativa de la actividad renal de las tres enzimas antioxidantes, catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa. El tratamiento con apocinina previno la reducción de la actividad de las tres enzimas antioxidantes inducida por el tratamiento con L-NAME.

L-NAME

APOCININA

L-NAME +APOCININA

10,5 ± 0,5

10,65 ± 0,5

10,75± 1,02

11,0 ± 0,9

PESOS /No. DE FETOS VIVOS(g)

2,64 ± 0,2

2,0 ± 0,05**

2,88 ± 0,12

1,98±0,08##

NUMERO DE FETOS REABSORBIDOS

1,66±0,33***

0,55±0,28

**p<0,01 y ***p<0,001 comparado con el control. ##p<0,01 comparado con APO. N= 4 por grupo.

Discusión Los resultados del presente trabajo están en concordancia con la evidencia acerca de un modelo experimental de PE que resulta de la inhibición crónica de la síntesis de NO mediante la administración de L-NAME a ratas preñadas y ratifican el papel primordial del NO y su desregulación en la PE (Camacho y col., 2011; Camacho e Israel, 2011). En efecto, nuestros resultados demuestran que el tratamiento con L-NAME en las ratas preñadas disminuyó el peso y el crecimiento fetal, e incrementó la reabsorción fetal en forma significativa, signos que probablemente son debidos a la vasoconstricción y a la isquemia de la unidad feto-placentaria descrita en la preeclampsia. De manera que, los signos observados en este modelo por la inhibición de la producción de óxido nítrico en las ratas preñadas podría apoyar aún más su similitud a la preeclampsia desarrollada en humanos (Pandhi y col., 2001). Se ha demostrado que en el embarazo con PE ocurre una disminución significativa de la protección antioxidante, siendo muchas las causas que podrían estar involucradas en el incremento del estrés oxidativo en la preeclampsia. Se ha postulado que el incremento del estrés oxidativo y la producción de anión superóxido en la preeclampsia (Biri y col., 2007) se asocia a una temprana placentación anormal con isquemia placentaria e hipoxia (Gilbert y col., 2008), a la presencia de anticuerpos anti-receptores AT1 de ANG II (Xia y col., 2003), a alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos asociadas a la resistencia a la insulina con sobrepeso y obesidad (Joffe y col., 1998) y a la presencia de infecciones subclínicas en la vagina, el sistema urinario y la enfermedad periodontal (Herrera y col., 2007). Todas estas alteraciones conducen a una reacción inflamatoria intravascular generalizada y un estado de estrés oxidativo que produce disfunción endotelial que predispone a la mujer embarazada a desarrollar PE (Herrera y col., 2001). En estudios de la placenta de mujeres con PE comparada con la placenta normal, se demostró que las primeras presentaron un aumento de la peroxidación de lípidos mitocondriales y de la generación del anión superóxido,

lo que podría contribuir y formar parte importante como fuente de estrés oxidativo en la placenta (Wang y Walsh, 2001; Wang y Walsh, 1998). Debido a este desbalance oxidativo de origen placentario, se ha postulado que la hipoperfusión sanguínea mediada por la ANG II, la vasoconstricción sistémica y el estrés oxidativo placentario, son factores responsables de la disfunción endotelial vascular renal, y que contribuye con el desarrollo de la PE (Shah, 2005). La PE se asocia con alteraciones funcionales a nivel renal que incluyen disminución del flujo plasmático renal (FPR) como consecuencia del incremento de la resistencia arteriolar aferente y/o reducción en el coeficiente de ultrafiltración. Esta reducción en el FPR, permite una disminución de la tasa de filtración glomerular (TFG), y contribuye a la disminución del volumen plasmático, lo cual favorece a un incremento en la reabsorción tubular proximal acoplada al sodio. Todo ello lleva al incremento de la excreción de proteínas urinarias en preeclampsia, la cual resulta de alteración secundaria del tamaño y/o selectividad de la carga en el filtrado glomerular, que posiblemente incrementa la presión capilar, y con ello compromete la reabsorción tubular, generando proteinuria aún en rango nefrótico (Moran y col., 2003; Jeyabalan y Conrad, 2007). Nuestros resultados revelan la presencia de disfunción renal en la PE experimental inducida por la inhibición de la síntesis de NO ya que se observar que la administración crónica de L-NAME durante 7 días consecutivos, genera una prominente excreción urinaria de proteínas totales, asociada a una reducción significativa del volumen urinario y de la excreción urinaria de sodio y potasio. Uno de los factores que podrían influir en el daño renal en la preeclampsia, es el estrés oxidativo local que resultaría, entre otras causas, por la disminución de la actividad de las enzimas antioxidantes renales. Nuestros resultados apuntan a esa dirección ya que la inhibición de la síntesis de NO que genera un modelo de PE experimental con endoteliosis glomerular (Camacho y col., 2011), estuvo asociada a la dismi-

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CONTROL NUMERO DE FETOS VIVOS

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 33, número 3, 2014

TABLA I. Morfometría Fetal durante el tratamiento con apocinina

nución significativa de la actividad de las tres de las enzimas antioxidantes renales: la catalasa, la superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa. La disminución de la actividad de las enzimas antioxidantes de la corteza renal, las cuales son mecanismos enzimáticos que defienden en situaciones de estrés oxidativo, sugiere que la desregulación de la funcionalidad generalizada y renal local están asociados a una baja protección oxidativa durante la PE, que favorece a la insuficiencia renal (Balal y col., 2003). Efectivamente, la disminución de la actividad de las enzimas antioxidantes se asocia a un aumento en la producción de EROs ya que se sabe que: primero, el peroxinitrito puede inactivar a la GPx (Padmaja y col., 1998) y la Mn-SOD (McMillan-Crow y Thompson, 1999) y, segundo el O2.- puede inactivar a la GPx (Blum y Fridovich, 1985; Rister y Baehner, 1976) y a la catalasa (Rister y Baehner, 1976).

La inactivación de las enzimas antioxidantes por las EROs o por la especies reactivas de nitrógeno como el peroxinitrito, puede deberse a la oxidación o a la nitración de residuos específicos que forman parte del centro catalítico de la enzima. Por ejemplo, la GPx contiene un aminoácido raro, la selenocisteína (Sec45), el cual es esencial para la actividad de la enzima y es más reactiva que los grupos tiol. En este contexto, se ha propuesto que la inactivación de la GPx por el peroxinitrito se debe a la modificación de la Sec45, la cual puede ocurrir a través de 2 vías: la nitración del selenio o bien la formación de un puente Se-S, entre la Sec45 y la Cys95, lo que daría como consecuencia la inactivación de la enzima (Asahi y col., 1997). Por otro lado, se ha observado que la inactivación de la SOD por peroxinitrito puede ocurrir a nivel de los residuos de tirosina independientes del sitio activo de la enzima. La modificación de los residuos de tirosina, incluye no solo la nitración de residuos críticos para la actividad catalítica, sino también la oxidación y la subsiguiente formación de residuos de ditirosina (McMillan-Crow y Thompson, 1999). La reducción de la protección oxidativa incrementa la producción de EROs como el H2O2 (Guidet y Shah, 1989, Yang y col., 1995) y de O2.- (Cuzzocrea y col., 2002), y estas EROs inducen la contracción de las células mesangiales del glomérulo (Duque y col., 1992; Martínez-Salgado y col., 2002). La contracción de estas células altera el área de superficie de filtración y el coeficiente de ultrafiltrado glomerular, factores que llevan a una disminución de la velocidad de filtración glomerular típico de la PE. Además, la disminución en la actividad de las enzimas antioxidantes encontradas en este estudio, favorecería el incremento en los niveles de O2.-. Se sabe que este radical puede reaccionar con el óxido nítrico para formar peroxinitrito, una especie reactiva de nitrógeno citotóxica. Aún más, la inactivación del NO por el O2.- llevaría a la disminución de los niveles de este vasodilatador, lo que finalmente también estaría asociado a la disminución de la velocidad de filtración glomerular observada en la PE (RivasCabañero y col., 1995, 1997).

Ahora bien, si el incremento temprano del estrés oxidativo placentario, que cursa antes del inicio de los síntomas maternos, juega un papel fundamental en la disfunción endotelial generalizada y el daño renal, nos planteamos que el tratamiento temprano con antioxidantes o con inhibidores de la NAD(P)H oxidasa podría interrumpir el proceso de este síndrome. Nuestros resultados apoyan ésta posibilidad ya que demuestran que el tratamiento crónico con un compuesto que mimetiza a la SOD, el tempol (Camacho e Israel, 2011), o con un desacoplante del ensamblaje de la NAD(P)H oxidasa como la apocinina (presentes resultados), fueron capaces de reducir significativamente las alteraciones funcionales inducidas por el L-NAME. En efecto, estos compuestos fueron capaces de prevenir tanto las alteraciones de la morfometría fetal observadas (Camacho e Israel, 2011; presentes resultados) en este modelo experimental, así como la hipertensión y la proteinuria promovida por la inhibición de la síntesis de NO. Aún más, la inhibición de la producción de especies reactivas de oxígeno inducida por el L-NAME en ratas preñadas previno la reducción del volumen urinario y de la excreción urinaria de sodio y potasio presente en la PE experimental. Lo más interesante de nuestros hallazgos es que el tempol (Camacho e Israel, 2011) y la apocinina fueron capaces de prevenir la disminución de la actividad de las enzimas antioxidantes en la corteza renal inducida por el bloqueo de la óxido nítrico sintasa. El hecho que un reductor de los niveles del anión superóxido y un desacoplante de la enzima productora de dicho anión fueron capaces de prevenir los signos característicos de la preeclampsia experimental ratifican el papel determinante del estrés oxidativo en las manifestaciones disfuncionales generales y renales en este modelo experimental de la PE. Aun cuando en el presente estudio no evaluamos el agonista responsable de la estimulación de la NAD(P)H oxidasa durante la PE y el posible mecanismo de acción de la prevención por apocinina, existe evidencia en la literatura de la posible mediación de la ANG II y/o del anticuerpo anti-receptor AT1 (AT1-AA) en la fisiopatología de la PE (Dechend y col., 2003). Por lo tanto, aún cuando no pudimos determinar en el presente estudio la posible presencia de AT1-AA en el plasma de las ratas preñadas tratadas con L-NAME, podríamos inferir que el efecto de la apocinina observado se podría deber a la interferencia del efecto de este anti-anticuerpo en la activación de la NAD(P)H oxidasa a través de la activación receptor AT1. Queda por determinar en experimentos futuros la veracidad de esta aseveración. En apoyo a nuestros hallazgos se encuentran los descritos por Hoffmann y col. (2008), quienes demostraron que el tempol es capaz de prevenir la hipertensión, la proteinuria y la función feto-placentaria en un modelo de preeclampsia en ratón, el BPH/5, el cual desarrolla de forma espontánea las características clínicas de la preeclampsia humana. Esto sugiere que la producción de especies reactivas de oxígeno

Agradecimientos Los autores agradecen al Sr. Banny Caraballo por su ayuda técnica en los experimentos. Este trabajo fue subvencionado por el Ministerio Popular de Ciencia Tecnología e Industrias, Proyecto Misión Ciencia, Sub-proyecto 7, ECCV No. 2007001585. Referencias 1.

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Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 33, número 3, 2014

En conclusión, en la preeclampsia experimental inducida por la inhibición crónica de la síntesis de óxido nítrico, la disfunción renal se asocia a una disminución de los mecanismos antioxidantes renales, lo que conduce a un incremento del estrés oxidativo. La producción de especies reactivas de oxígeno parece ejercer un efecto causal importante en la disfunción endotelial generalizada y del daño renal, y por ello el uso de terapéutico de los antioxidantes como tratamiento de la preeclampsia parece ser prometedor.

11. Flohé L, Günzler WA. 1984. Methods Enzymol. Assays of glutathione peroxidase. Display Settings 105:114-21.

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parece ejercer un efecto causal importante en la disfunción endotelial generalizada y del daño renal, y por ello el uso de terapéutico de los antioxidantes como tratamiento de la preeclampsia parece ser prometedor.

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Efecto de la combinación

levotiroxina-clenbuterol sobre la arteria aorta en ratas Sprague-Dowley

Recibido: 20/10/2013

Aceptado: 21/11/2013

Resumen

Abstract

El objetivo describir el efecto de la medicación combinada Levotiroxina-clenbuterol sobre la aorta en ratas SpragueDowley. Se establecieron 4 grupos de tratamiento para ratas Sprague-Dowley. Los animales fueron medicados por 21 días con Clenbuterol; Levotiroxina; Clenbuterol + Levotiroxina vía oral. Fue practicada eutanasia y necropsia. Se realizo un estudio macroscópico, morfológico de la arteria aorta, fueron colectadas muestras de aorta para estudio histológico. Los resultados se presentan a continuación: el grupo control evidencio la aorta normal. El Grupo Clenbuterol: en la túnica media: cambios degenerativos con vacuolización intracitoplasmatica (25%). Así como necrosis de coagulación focal (10%). Hipertrofia marcada de la intima con aumento en la producción de fibras de colágeno, en la túnica adventicia: cambios degenerativos focales moderados. En el Grupo Levotiroxina: en la túnica media: se observan cambios degenerativos con vacuolización intracitoplasmatica (15%). Hipertrofia marcada de la intima con aumento en la producción de fibras de colágeno, en la túnica adventicia: cambios degenerativos focales leves. El Grupo Clenbuterol + Levotiroxina: en la túnica intima: no se observaron lesiones significativas, en la túnica media: se observan cambios degenerativos con vacuolización intracitoplasmatica (10%). Hipertrofia marcada de la intima con aumento en la producción de fibras de colágeno, en la túnica adventicia: no se observaron lesiones significativas. En conclusión describimos los patrones morfológicos, macroscópicos e histológicos la aorta en la terapéutica con Clenbuterol, Levotiroxina, Clenbuterol-Levotiroxina en ratas Sprague/Dowley.

The aim of this study was to describe the effect of the combined drugs Levothyroxine-clenbuterol on the aorta in Sprague-Dowley rats. Four treatments to Sprague-Dowley rats were established. The animals were dosed for 21 days with Clenbuterol; levothyroxine; Clenbuterol + Levothyroxine orally. Were practiced euthanasia and necropsy. Macroscopic study, morphological aortic artery, aorta samples were collected for histological study was conducted. The results are as follows: Control group evidenced normal aorta. Clenbuterol Group: in the tunica media: degenerative changes with intracytoplasmic vacuolization (25%). Focal necrosis and bleeding (10%). Marked hypertrophy of the intima with increased production of collagen fibers, the adventitia with moderate focal degenerative changes. Levothyroxine In Group: in the tunica media: degenerative changes with intracytoplasmic vacuolization (15%) are observed. Marked hypertrophy of the intima with increased production of collagen fibers in the adventitia: mild focal degenerative changes. Clenbuterol + Levothyroxine Group: the intima: no significant lesions were observed in the tunica media: degenerative changes seen with intracytoplasmic vacuolization (10%). Marked hypertrophy of the intima with increased production of collagen fibers, in the adventitia no significant lesions. In conclusion we describe the morphological, macroscopic and histological patterns in the aorta with Clenbuterol therapy, levothyroxine, Levothyroxine Clenbuterol-in Sprague / Dawley rats.

Palabras claves: aorta, clenbuterol, levotiroxina, ratas.

Keywords: aorta, clenbuterol, levothyroxine, rats.

AVFT

María Armas1, Claudia Guarino1, Manuel Moya2,3, Emilio Suniaga3, Abelardo Morales4 Aniceto Méndez4, Kimberly Brewer5, Thomas Tobin6. 1 Facultad de Farmacia Universidad Santa María, Caracas-Venezuela. 2 Instituto de Medicina Experimental Facultad de Medicina Universidad Central de Venezuela. 3 Instituto Nacional de Higiene Dr. Rafael Rangel. 4Departamento de Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas, Edificio de Sanidad Animal, Campus de Rabanales Ctra. de Madrid km 396, 14071, Córdoba Universidad de Córdoba, España. 51711 Lakefield North Court, Wellington, FL 33414 USA. 6Maxwell H. Gluck Equine Research Center, University of Kentucky, Lexington USA.

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 33, número 3, 2014

The effect of combined levothyroxine-clenbuterol over aortic artery in Sprague-Dowley rats

Introducción

Material y método

El uso de Clenbuterol y Levothiroxine como suplemento en caballos en entrenamiento es común en muchos Hipódromos a nivel mundial, la muerte súbita de siete caballos en California USA, en los cuales fueron detectadas estas dos substancias ha generado múltiples especulaciones en cuanto a su uso en caballos3. La levotiroxina (Thyro-L), es una hormona tiroidea (T4) que se utiliza para tratar el hipotiroidismo, con el propósito de restaurar la actividad metabólica normal. La levotiroxina tiene efectos similares a la adrenalina que incluyen aumento del ritmo cardíaco, palpitaciones, hipertensión, taquicardia, nerviosismo y aumento del riesgo de arritmias cardiacas 4. Los riesgos de la sobre-medicación de caballos con función tiroidea normal (eutiroideo) incluyen indicaciones claramente cardiovasculares adversos y síntomas de hipertiroidismo que puede ser mortal cuando se combina con otros medicamentos en particular, Clenbuterol y agonistas de receptores N-metil de aspartato (ketamina). Su uso en conjunto con el clenbuterol elimina de manera potente la grasa, mientras que la ketamina puede aumentar el riesgo de insuficiencia cardiaca. El Clenbuterol es un medicamento broncodilatador (agonista ß-2-adrenergico), se emplea en la industria de las carreras para problemas respiratorios y como anabolizante4. El Clenbuterol aumenta el tamaño de las células del músculo del corazón debido a la mayor producción de colágeno, un material elástico que reduce la capacidad del corazón para bombear la sangre y puede potencialmente conducir a un paro cardíaco9. El colágeno también interfiere con las señales eléctricas enviadas a través de las células del músculo cardíaco para que siga bombeando con regularidad y pueden producir arritmias (latidos cardíacos irregulares). Existe un considerable interés en el uso potencial de las drogas (Levothyroxyne, clenbuterol, ractopamina, hidrochloride) y suplementos (picolinato chromion, magnesio) en los programas de pérdida de peso para los caballos3, pero pocos de estos agentes han sido evaluados en estudios bien diseñados. Los estudios en caballos no obesos han demostrado que la administración crónica clenbuterol reduce la adiposidad3. Sin embargo, estos estudios también revelaron efectos adversos incluyen una disminución de la función cardíaca. Por lo tanto, el uso de clenbuterol no puede ser justificado para el manejo de la obesidad. Estudios recientes también han demostrado que la administración de levotiroxina de sodio puede aumentar la pérdida de peso en los caballos; su uso en el manejo de los caballos con síndrome metabólico equino es recomendado10. En algunos países específicamente en la Comunidad Europea es prohibido el uso de clenbuterol en animales, mientras que en otros países es permitido en caballos atletas solo durante entrenamiento pero es prohibido su uso en pruebas públicas (ARCI: Asociación Internacional Comisionada para las Carreras, Penalización Clase B)17,18. En virtud de esta importante área de estudio planteamos como objetivo describir el efecto de la medicación combinada Levotiroxina-clenbuterol sobre la aorta en ratas Sprague-Dowley.

Se establecieron 4 grupos de tratamiento (comprendido por 4 animales cada uno), para ratas Sprague-Dowley, como se muestra en la tabla N°1. Los animales fueron medicados por 21 días de la siguiente manera: Grupo 1.- Clenbuterol: vía oral 5mg/kg4. Grupo 2.- Levotiroxina: vía oral 0.2mg/kg. Grupo 3.- Clenbuterol + Levotiroxina: vía oral (5mg/kg0.2mg/kg). Grupo 4.- Control: se le administro solución fisiológica: vía oral. Tabla N°1.- Grupos de tratamiento de ratas. Animales

Clenbuterol

Ratas SpragueDowley

Levotiroxina Clen+Levo Control Total 4

Fue practicada eutanasia de acuerdo al protocolo internacional y posteriormente se le realizo la técnica de necropsia1,2. Se realizo un estudio macroscópico, morfológico de la aorta, en los cuales se tomaron las medidas de acuerdo a los protocolos descritos en la literatura5,6. Fueron colectadas muestras de aorta, las cuales se fijaron en formol por 24 horas y procesadas por los métodos convencionales de procesamiento histológico2. Se realizo un análisis estadístico (estadística descriptiva) y ANOVA. Resultados Los resultados morfológicos se presentan a continuación:

Tabla N°2.- Presentación de resultados morfológicos de la aorta en ratas Sprague Dowley medicadas con clenbuterol y Levotiroxina. GRUPOS RATAS SPRAGUE DOWLEY /promedio

MORFOMETRIA (micras)

CLENBUTEROL (5mg/kg) 21dias

3658,25

LEVOTIROXINA (2mg/kg) 21dias

3665,96

CLENBUTEROL/LEVOTIROXINA (5mg/kg + 2mg/kg) 21dias

4198,29

CONTROL 21dias

2934,00 Media: 3614,13 Desviación Estándar 519,12

La comparación de grupos fue la siguiente (ANOVA): COMPARACION DE GRUPOS (ANOVA): SS

Between:

3,233,810.583

1,077,936.861

4.000

Within:

3,233,826.893

269,485.574

Total:

6,467,637.476

0.035

Los resultados macroscópicos e histológicos en ratas Sprague-Dowley, se presentan a continuación en la tabla N°3.

Tabla N°3.- Presentación de resultados macroscópicos e histológicos de la aorta de ratas Sprague Dowley medicadas con clenbuterol y Levotiroxina. Grupos ratas sprague dowley

Macroscopia

CLENBUTEROL (5mg/kg) 21dias

No se observaron lesiones significativas.

TUNICA INTIMA: No se observaron lesiones significativas. TUNICA MEDIA: se observan cambios degenerativos con vacuolización intracitoplasmatica (25%). Así como necrosis de coagulación focal (10%). Hipertrofia marcada de la intima con aumento en la producción de fibras de colágeno (Colágeno tipo III y IV). TUNICA ADVENTICIA: cambios degenerativos focales.

No se observaron lesiones significativas.

TUNICA INTIMA: No se observaron lesiones significativas. TUNICA MEDIA: se observan cambios degenerativos con vacuolización intracitoplasmatica (15%). Hipertrofia marcada de la intima con aumento en la producción de fibras de colágeno (Colágeno tipo III y IV). TUNICA ADVENTICIA: cambios degenerativos focales.

CLENBUTEROL/ LEVOTIROXINA (5mg/kg + 2mg/kg) 21dias

No se observaron lesiones significativas.

TUNICA INTIMA: No se observaron lesiones significativas. TUNICA MEDIA: se observan cambios degenerativos con vacuolización intracitoplasmatica (10%). Hipertrofia marcada de la intima con aumento en la producción de fibras de colágeno (Colágeno tipo III y IV). TUNICA ADVENTICIA: No se observaron lesiones significativas.

CONTROL 21dias

No se observaron lesiones significativas.

TUNICA INTIMA: No se observaron lesiones significativas. TUNICA MEDIA: No se observaron lesiones significativas. TUNICA ADVENTICIA: No se observaron lesiones significativas.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 1.- Grupo Control: Histopatología de la arteria aorta (H&E 40X), en la cual se evidencia la Túnica intima, la Túnica media y la Túnica adventicia normal. Figura 2.- Grupo Clenbuterol: Histopatología de la arteria aorta (H&E 40X), en la cual se evidencia en la Túnica intima: No se observaron lesiones significativas, Túnica media: se observan cambios degenerativos con vacuolización intracitoplasmatica (25%). Así como necrosis de coagulación focal (10%). Hipertrofia marcada de la intima con aumento en la producción de fibras de colágeno (Colágeno tipo III y IV). Túnica adventicia: cambios degenerativos focales moderados. Figura 3.- Grupo Levotiroxina: Histopatología de la arteria aorta (H&E 40X), en la cual se evidencia en la Túnica intima: No se observaron lesiones significativas, Túnica media: se observan cambios degenerativos con vacuolización intracitoplasmatica (15%). Hipertrofia marcada de la intima con aumento en la producción de fibras de colágeno (Colágeno tipo III y IV). Túnica adventicia: cambios degenerativos focales leves. Figura 4.- Grupo Clenbuterol + Levotiroxina: Histopatología de la arteria aorta (H&E 40X), en la cual se evidencia en la Túnica intima: No se observaron lesiones significativas, Túnica media: se observan cambios degenerativos con vacuolización intracitoplasmatica (10%). Hipertrofia marcada de la intima con aumento en la producción de fibras de colágeno (Colágeno tipo III y IV), Túnica adventicia: No se observaron lesiones significativas.

Discusión En cuanto a la medicación establecida clenbuterol, levotiroxina y su combinación (Clenbuterol-Levotiroxina), en general se observaron mayores cambios significativos en la aorta de las ratas medicadas con clenbuterol. Se evidenciaron cambios degenerativos e severos en comparación con los otros grupos de tratamiento y el grupo control, lo cual coincide con los reportes en la literatura e inclusive estudios en miocitos del corazón de ratas en dosis terapeuticas4. Los cambios histológicos fueron menos evidentes en el grupo de levotiroxina en comparación con el grupo Clenbuterol y el grupo Clenbuterol + Levotiroxina. En todos los grupos de tratamiento se observo hipertrofia de la media excepto el grupo control. La cual es una importante evidencia del efecto del clenbuterol a largo plazo como un riesgo potencial circulatorio cardiovascular ya que puede disminuir la capacidad contráctil de la arteria aorta e incrementar la resistencia periférica vascular así como el efecto de estenosis vascular, que se puede evidenciar durante el ejercicio o bajo situaciones de estrés. En este estudio no se consideraron las variables estrés y ejercicio en las ratas pero ha sido propuesto para un experimento futuro en conjunto con los niveles de cortisol. Un estudio en caballos de raza Standardbred medicados con clembuterol a dosis terapéutica de manera crónica mostró un aumento considerable de las dimensiones de la raíz de la aorta 29,9 +/- 6.1%; 24.0 +/- 1,7%), lo que sugiere un mayor riesgo de rotura de la aorta7, esto parece coincidir con los resultados obtenidos en este estudio. Estudios de la pared de la aorta bajo disfunción de las hormonas tiroideas sugieren cambios significativos en la pared de la intima y media de la aorta bajo condiciones de hipotiroidismo. El espesor de la túnica media

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 33, número 3, 2014

A continuación se presentan imágenes de los cortes histológicos de la aorta representativos de cada grupo de tratamiento en ratas.

AVFT

LEVOTIROXINA (2mg/kg) 21dias

Histopatologia

aumentó en los grupos de hipertiroidismo y hipotiroideos en un 75% y 35%10. Además, el área relativa de colágeno aumentó en los grupos mencionados anteriormente por 142% y 120%, respectivamente10.Estos resultados relacionados al incremento del colágeno son similares a los observados el grupo medicado con Levotiroxina. En conclusión describimos los patrones morfológicos, macroscópicos e histológicos la aorta en la terapéutica con Clenbuterol, Levotiroxina, Clenbuterol-Levotiroxina en ratas Sprague/Dowley.

Referencias 1. Aluja A, Constantino C. 2002. Técnicas de necropsia en animales domésticos. 2da edición. Manual Moderno. México, México. 2002. Pág. 103. 2. Banks W. Histología Veterinaria Aplicada. Segunda Edición Manual Moderno México. 1996. 487-492. 3. En: http://tuesdayshorse.wordpress.com/2014/01/08/deadly-to-horses-the-baffert-effect-part-2/ 4. Goodman Gilman A. Las bases farmacológicas de la terapéutica (10ª ed.) (2 vols.) Mcgraw-Hill / interamericana de Mexico, 2003. 5. Jubb KVF, Kennedy Peter C, Palmer Nigel, Maxie M. Grant: Jubb, Kennedy and Palmer's. 2007. Pathology of domesticanimals. 3 volúmenes.Ed M. Grant Maxie. Saunders-Elsevier. 6. Saija M. Savolainen, Julie F. Foley and Susan A. Elmore Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 TO E18.5 2008.NIEHS, Cellular and Molecular Pathology Branch, Research Triangle Park, North Carolina, 27709, USA 7. Sleeper MM1, Kearns CF, McKeever KH.Chronic clenbuterol administration negatively alters cardiac function. Med Sci Sports Exerc. 2002 Apr;34(4):643-50.

8. Tobin; K. Brewer; K. Stirling. World rules for equine drug testing and therapeutic medication regulation. First edition. Wind publications. Chapter 14.- Thoroughbred Racing Regulation for Therapeutic drugs in Central and South America and the Caribean. 2012. 217-.225. 9. Thompson, J. 2009. Effects of clenbuterol on skeletal and cardiac muscle in horses. A Thesis Submitted to the Graduate Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College. USA. 10. Zaki SM1, Youssef MF. Thyroid hormone dysfunctions affect the structure of rat thoracic aorta: a histological and morphometric study. Folia Morphol (Warsz). 2013 Nov;72(4):333-9.