AVFT 4 2015 by felipe espino

las revistas e tr n e 1 ro la La Núme en Venezue biomédicas

Manuel Velasco, Editor Volumen 34, Número 4, 2015 ISSN 0798-0264 Depósito Legal pp. 198202DF62

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Contenido Análisis funcional de la actividad anti-tripanosoma de compuestos seleccionados Functional analysis of trypanocidal effect of selected compounds A. Ponte-Sucre

47 Marcadores de resistencia en Leishmania: Susceptibilidad in vitro a drogas leishmanicidas vs retención de calceina en aislados de pacientes venezolanos con Leishmaniasis Cutánea Difusa Resistance markers in Leishmania: in vitro drug susceptibility vs leishmanicidas calcein retention in isolated venezuelan patients with diffuse cutaneous leishmaniasis Maritza Padrón-Nieves y Alicia Ponte-Sucre

53 Sobre un caso de intoxicación por el uso de la planta de estropajo o tusa (Luffa cylíndrica) en Venezuela About a case of intoxication by the use of the loofah sponge or tusa (Luffa cylíndrica) in Venezuela Yudith Guerrero, Betty Omaña, Alexis Rodríguez-Acosta

58 Determinación de la glucosa en sangre de equinos pura sangre de carrera medicados con fenilbutazona y flunixin meglumine Determination of glucose of blood in thoroughbred horses medicated with phenylbutazone and flunixin meglumine Abelardo Morales Briceño, Diana Villoria, Mario Rossini, Luís Rivero, Mariam Gómez, Hector Bello

62 Uso de ibopamina como test de provocación en el diagnóstico de glaucoma Use of ibopamine as challenge test in the diagnosis of glaucoma Dr. Michele C. Petitto C. MD1, Dra. Julia De Gregorio Casale, MD, PhD2

65 PARVOVIRUS B19: ¿un agente endémico en el estado Zulia? B19 PARVOVIRUS: An endemic agent in Zulia state? Édixon Ochoa B.1, Melchor Álvarez de M.2, Nereida Valero C.1.

Volumen 34, Número 4, 2015 ISSN 0798-0264

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3.1. Título del artículo, conciso pero informativo.

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Análisis funcional de la actividad

anti-tripanosoma de compuestos seleccionados

Resumen

Abstract

La tripanosomiasis africana humana es una enfermedad transmitida por vectores, fatal si no se trata. La incidencia anual de pacientes solía ser muy alta, pero se ha reducido a menos de 10.000 por año. Esta declaración se esgrime para afirmar que no es necesario invertir en el desarrollo de nuevos fármacos contra la enfermedad del sueño. Sin embargo, la misma puede reaparecer, como en el pasado, cada vez más agresiva. Muy pocos compuestos están siendo analizados en entornos clínicos y la tasa de supervivencia de las moléculas es extremadamente baja; ninguno de los candidatos se encuentra en fase tres de evaluación clínica. En el marco de un proyecto multicéntrico, liderado por los Profesores Ulrike Holzgrabe y Gerhard Bringmann de la Universidad de Würzburg en Alemania, evaluamos previamente los cambios morfológicos y ultraestructurales producidos por compuestos líder sintetizados miembros de las familias estudiadas sobre Trypanosoma brucei. Los datos sugieren que las moléculas estudiadas podrían afectar el retículo endoplasmático (la bisnaftilamida biscuaternaria, 37) y la mitocondria y el cinetoplasto (la sal de N-Arylpyridinium, 88). En este trabajo determinamos si los compuestos 37 y 88 son parasitostáticos o parasiticidas, si actúan de forma sinérgica con las drogas clásicas y si afectan el estado metabólico de la célula. Nuestros resultados sugieren que 37 es parasiticida y 88 parasitostático, que ambos compuestos son sinérgicos con pentamidina y que 37 es sinérgico con eflornitina, y al igual que pentamidina y eflornitina, no altera la relación ADP / ATP o los niveles de glucosa del parásito, sugiriendo que su efecto no está asociado a la alteración del estado metabólico celular.

Human African Trypanosomiasis is a vector-borne disease, fatal if left untreated. The annual incidence of patients used to be outrageous, but it has dropped to less than 10,000 per year. This statement has been used to assert that it is not necessary to invest in the development of new drugs against sleeping sickness. However, the disease may return, increasingly aggressive. Only a small number of compounds are being analyzed in clinical settings and the survival rate of candidates is normally low; none of the candidates is actually in phase three evaluation.

Palabras clave: Trypanosoma brucei, enfermedad del sueño, bisnaftilamida biscuaternaria, sal de N-Arylpyridinium, efecto metabólico, sinergismo.

Previously we assessed the morphological and ultrastructural changes produced by members of families of compounds synthesized within the frame of our university consortium multicenter project, led by Professor Ulrike Holzgrabe and Gerhard Bringmann, University of Würzburg, Germany on Trypanosoma brucei. The data suggested that the endoplasmic reticulum membrane systems (for the bisquaternary bisnaphthalimide 37) and the mitochondria and kinetoplast (for the N-Arylpyridinium salt 88) might be the potential organelles targeted. Herein we have determined whether these compounds are parasitostatic or parasitocydal, act synergistically with classical trypanocydal drugs and if they affect the metabolic status of the cell. Our results suggest that 37 seems to be parasitocidal while 88 seems to be parasitostatic, but that both compounds exert a synergistic effect with pentamidine, and 37 eflornithine. We further determined 37 and 88 did not alter the parasite ADP/ATP ratio or the parasite glucose levels thus indicating that they do not alter the metabolic status of the parasite. Key words: Trypanosoma brucei, sleeping sickness, bisquaternary bisnaphthalimide, N-Arylpyridinium salt, metabolic effect, synergism.

AVFT

A. Ponte-Sucre: Laboratorio de Fisiología Molecular, Instituto de Medicina Experimental, Escuela de Medicina Luis Razetti, Facultad de Medicina Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela, e-mail: aiponte@gmail.com

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 34, número 4, 2015

Functional analysis of trypanocidal effect of selected compounds

Introducción Unos pocos organismos son responsables de las principales enfermedades parasitarias del siglo XX y XXI. De hecho, la incidencia y el número de personas afectadas, y la desolación que estos organismos causan a los pacientes es enorme. Estos patógenos producen un ingente número de víctimas; sobre todo, pero no exclusivamente en los países en desarrollo. Entre estos organismos podemos mencionar los tripanosomas que causan la tripanosomiasis africana humana (HAT)1. Esta es una enfermedad transmitida por vectores, fatal si no se trata. Su incidencia anual solía ser muy alta. Sin embargo, recientemente se ha reducido a menos de 10.000 casos por año2. Este hecho se esgrime para destacar que “no es necesario invertir en el desarrollo de nuevos fármacos contra la enfermedad del sueño”3. Sin embargo, la misma puede resurgir como lo ha hecho en el pasado, y podría volver de una forma más agresiva. Muy pocos fármacos están siendo analizados clínicamente en diversas asociaciones sin fines de lucro, así como por la denominada Iniciativa Medicamentos para Enfermedades Olvidadas (DNDi por sus siglas en inglés)4. Sin embargo, la tasa de supervivencia de los candidatos es extremadamente baja, y ninguno de los compuestos analizados se encuentra en la tercera fase de evaluación clínica5.

Basados en el hecho de que la potencia de un compuesto (que se refleja en su IC50), no necesariamente se traduce en el “mejor fármaco a nivel de mercado” y de que, además de la actividad que las moléculas deben tener en contra de un organismo seleccionado, sus propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) son esenciales para la selección de candidatos para estudios con animales y preclínicos6, en un trabajo anterior, y con el objetivo de perfeccionar la selección de los candidatos a estudios preclínicos, analizamos la correlación entre la actividad anti-tripanosoma de moléculas de diferentes clases estructurales con los parámetros físico-químicos de los compuestos, para delinear la relación entre la estructura química y sus funciones biológicas7. Los datos sugieren que los índices de eficiencia de ligando pueden ser útiles para comprender la relación entre la potencia y las características químicas de los compuestos. En esa oportunidad describimos una buena correlación entre los parámetros físico-químicos de los compuestos seleccionados y los de moléculas comerciales cuyas dianas son organelos específicos. Estos resultados sugieren que nuestra aproximación podría ser útil para impulsar el diseño de compuestos con buenas actividades y propiedades farmacocinéticas aceptables para todas las familias de compuestos7. En este trabajo y a fin de profundizar en el análisis de la potencia de los compuestos líder hemos evaluado varias propiedades funcionales relacionadas con su acción sobre los parásitos. De hecho, analizamos si los mismos ejercen una función parasitostática o parasiticida, si actúan sinérgicamente con fármacos clásicos, y si afectan el estado metabóli-

co de la célula. Nuestros resultados sugieren que los mejores candidatos 37 y 88, son, parasiticida el primero y parasitostático el segundo. Sólo 37 es sinérgico con eflornitina, ambos con pentamidina. Finalmente, 37, al igual que pentamidina o eflornitina, no altera la relación ADP / ATP del parásito o sus niveles de glucosa. Estos resultados indican que su efecto no está relacionado con la alteración del metabolismo celular. Materiales y métodos La descripción de los compuestos usados está resumida en un trabajo previo7. Ellos pueden ser definidos como una bisnaftilamida biscuaternaria (37) y una sal de N-Arylpyridinium (88). Para evaluar la actividad tripanocida de los compuestos, se cultivaron formas sanguíneas monomórficas de Trypanosoma (T.) brucei (TC-221) en medio Baltz, a 37°C, 5% de CO2. El medio se suplementó con 16,7 % de suero fetal bovino inactivado por calor, 16 U ml-1 de penicilina, 16 mg ml-1 de estreptomicina y 0,0001% β-mercaptoetanol. La actividad de los compuestos se determinó mediante el ensayo de Azul de Alamar®. Brevemente, se incubó un número apropiado de tripanosomas (105 células ml-1) en placas de 96 pozos, con concentraciones crecientes de los compuestos en un volumen final de 200 ml. Después de 24 h de incubación a 37°C, 5% CO2, se añadieron 20 ml de Azul de Alamar a cada pozo; seguidamente las placas se incubaron en las mismas condiciones por 48 h y 72 h. Las placas se leyeron en un lector de ELISA (Oasys Expert 96) a una longitud de onda de 550 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm. La absorbancia registrada en los pozos incubados en ausencia de los compuestos determinó el 100% de crecimiento. La absorbancia resultante en cada uno de los otros pozos reflejó el crecimiento celular y su inhibición por los compuestos. Los valores de IC50 se calcularon por interpolación lineal8,9. Para determinar la actividad parasitostática o parasiticida de los compuestos se realizó el ensayo de susceptibilidad de Azul de Alamar. Seguidamente se recogieron las células de los pozos más cercanos a las concentraciones correspondientes al IC10, IC50 e IC90 de cada compuesto. Las células se lavaron dos veces con PBS y se sembraron de nuevo en las mismas condiciones, pero sin fármacos; se incubaron durante 48 h, recibieron 20 ml de Azul de Alamar y se incubaron durante 48 h adicionales para determinar su crecimiento adicional. Para determinar la actividad sinérgica de 37 y 88 se realizaron en paralelo curvas de susceptibilidad con Azul de Alamar para cada compuesto solo y para cada compuesto en presencia de concentraciones IC50 de pentamidina y eflornitina. Con este ensayo definimos el desplazamiento del IC50 de pentamidina y eflornitina hacia concentraciones superiores o inferiores por la acción de los compuestos utilizados. Para determinar las posibles dianas intracelulares de 37 y 88 las células se incubaron como normalmente para los

cubadas solas, sugiriendo que 37 podría ser parasiticida. Por el contrario, 88 presenta características de parasitostático; las células supervivientes recogidas de los pozos incubados incluso a IC90, reanudan su crecimiento al cabo de 48 h de ser incubadas solas.

Posteriormente las células se centrifugaron a 700 x g durante 5 min, se lavaron con PBS y se suspendieron en 200 ml de buffer para ser analizados por citometría de flujo. Para determinar el efecto de 37 y 88 sobre el metabolismo celular los tripanosomas fueron sembrados en placas de 96 pozos en 200 ml de medio a densidades iniciales de 104 células ml-1. Las células se incubaron durante 24 h a 37°C, 5% CO2 solas o en presencia de DMSO (<1%), florizidina (Sigma 274313-1G, 100 mM), DOG (Sigma D6134-1G, 5 mM), pentamidina (Aventis, IC50), o a la IC50 de 37 y 88. Posteriormente las células se centrifugaron a 700 x g durante 5 min, se lavaron con PBS y suspendieron hasta una densidad de 1x105 células ml-1. La relación ADP / ATP y el contenido de glucosa (Sigma MAK135 ADP / ATP Ratio Kit de ensayo, Kit de ensayo de Sigma GAHK20 glucosa (HK)) se determinaron utilizando un luminómetro, a 1 s de tiempo de detección. La relación ADP / ATP se calculó por la siguiente razón: RLUA1 - luminiscencia de ATP; RLUB – luminiscencia de ATP residual después de 10 min; RLUC - luminiscencia después de la conversión enzimática de ADP en ATP; ADP / ATP = (RLUC1-RLUB1) / RLUA1), siendo RLU la luminiscencia detectada en los canales A, B o C. Los niveles de glucosa se ensayaron en el sobrenadante de cada condición a través del ensayo de reducción de la hexoquinasa10. Los experimentos se realizaron al menos dos veces por cuadruplicado y el análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software Graph Pad Prism, versión 6. Resultados La susceptibilidad de los parásitos a los compuestos se determinó mediante el ensayo de Azul de Alamar. Seguidamente, se recogieron las células viables presentes en los pozos más cercanos a las concentraciones IC10, IC50 e IC90 para cada compuesto. Los parásitos se lavaron y sembraron de nuevo en las mismas condiciones, pero sin drogas. Las células se incubaron durante 48 h a 37°C y 5% CO2 y de nuevo se determinó su crecimiento mediante el ensayo de Azul de Alamar. Los resultados obtenidos se representan en la Fig. 1. Las células expuestas a concentraciones IC50 e IC90 de 37 no reanudan su crecimiento, incluso 48 h después de ser in-

La actividad de 37 y 88 se determinó usando el ensayo de Azul de Alamar. Las células vivas de los pozos más cercanos a IC10, IC50 e IC90, se lavaron y sembraron de nuevo en ausencia de fármacos. Las células se incubaron durante 48 h, recibieron 20 ml de Azul de Alamar y se incubaron 48 h adicionales para medir su crecimiento. La figura ilustra un experimento representativo. Para 37 se determinó la IC10 (0,030) mM, IC50 (0,150 mM) e IC90 (0,270 mM), al igual que para 88 IC10 (0,002 mM), IC50 (0,010 mM), IC90 (0,018 mM).

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 34, número 4, 2015

Figura 1

AVFT

ensayos de Azul de Alamar a concentraciones de IC50 de los respectivos compuestos durante 24 h. Al finalizar la incubación las células se suspendieron a una densidad de 2.5 106 ml-1 y se incubaron con los siguientes indicadores: a. en 4 μg ml-1 Hoechst en PBS durante 5 min a temperatura ambiente para marcar el núcleo. b. en 2,5 mM MitoTracker Red durante 30 min a 37°C, 5% de CO2 para marcar la mitocondria. c. en 10 mM Lysotracker, durante 1 h a 37°C, 5% CO2, para marcar los compartimientos ácidos. d. en 10 mM Fm 464 durante 10 min a 4°C, para marcar el sistema de retículo endoplásmico.

Con base a los resultados anteriores evaluamos el potencial efecto sinérgico de los compuestos con las drogas clásicas pentamidina y eflornitina. Para ello se incubaron los parásitos con 37 y 88 (a concentraciones de IC10, IC50 e IC90) solos, y para cada molécula en presencia de pentamidina (IC50, Fig. 2), o eflonitina (IC50, Fig. 3). El efecto sinérgico se demostró claramente para pentaminina y 37, ya que incluso cuando 37 se utilizó a concentraciones de IC10 en conjunto con pentamidina (IC50), las células no reanudaron su crecimiento a las 24 y 48 h de comenzado el experimento. Resultados similares se obtuvieron al utilizar 88 en conjunto con pentamidina (IC50) en las mediciones realizadas a las 24 h. Sin embargo, después de 48 h las células incubadas con pentamidina a su IC50, y 88 a su IC10, reanudaron el crecimiento hasta en un 30% del control sin droga. El efecto sinérgico también se demostró para eflornitina y 37 a las 24 y 48 h, al utilizar 37 a concentraciones de IC50. Este no fue el caso para el 88 y eflornitina (IC50), ya que incluso cuando 88 se utilizó a concentraciones IC90 las células continuaron su crecimiento.

Figura 2

Se incubaron las células en presencia de 37 y 88 (a IC10, IC50 e IC90). En paralelo, se incubaron las células con cada compuesto más el IC50 de pentamidina. A las 48 h, los pozos recibieron 20 ml de Azul de Alamar y se incubaron 48 h adicionales para evaluar el crecimiento celular. La figura ilustra un experimento representativo. La IC50 para pentamidina es 0,005 mM.

Figura 3

telial en parásitos tratados con pentamidina y eflornitina, así como con 37 y 88. Los resultados sugieren que sólo se evidencia una disminución en el marcaje con Mitotracker (no significativo) en todas las condiciones, en comparación con los parásitos no tratados. Estos resultados indican que en las condiciones ensayadas este método no permite identificar de forma específica las dianas intracelulares ya que los marcajes no distinguen el efecto de los compuestos con los que trabajamos con respecto a los controles positivos (datos no mostrados). Finalmente, y a fin de evaluar si 37 y 88 alteran el metabolismo del parásito determinamos la relación ADP / ATP y los niveles de glucosa en parásitos tratados y no tratados durante 24 h con los compuestos, comparado con el efecto ejercido por las drogas clásicas pentamidina y eflornitina. La DOG (control positivo) disminuye significativamente la relación ADP/ATP de las células tratadas luego de 24 h de incubación (Fig. 4). Sin embargo, ni las drogas clásicas ni los compuestos experimentales utilizados reproducen este efecto. De igual forma, aunque la DOG, disminuye los niveles de glucosa, las drogas clásicas y los compuestos experimentales no afectan este parámetro (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que 37 y 88 no afectan el metabolismo celular, al menos a las primeras 24 h de tratamiento. Figura 4

Se incubaron las células en presencia de 37 y 88 (a IC10, IC50 e IC90). En paralelo, se incubaron las células con cada compuesto más el IC50 de eflornitina. A las 48 h, los pozos recibieron 20 ml de Azul de Alamar y se incubaron 48 h adicionales para evaluar el crecimiento celular. La figura ilustra un experimento representativo. La IC50 para la eflornitina es 50 mM.

Estudios anteriores sugieren del retículo endoplasmático es la diana celular para la bisnaftilamida bicuaternaria (37) y la mitocondria y el cinetoplasto lo son para la sal de N-Arylpyridinium (88). Para confirmar esta aseveración, utilizamos la citometría de flujo para determinar cambios en el marcaje de organelos como el núcleo, los compartimientos ácidos, la mitocondria y el cinteoplasto, y el sistema retículo endo-

Los parásitos (104 ml-1) se incubaron 24 h a 37 ° C, 5% CO2 solas o en presencia de DMSO (<1%), florizidina (100 mM), DOG (5 mM), pentamidina (IC50), o a la IC50 de 37 y 88. La relación ADP / ATP y el contenido de glucosa se midieron utilizando un luminómetro, en 1 s de tiempo de detección. La relación ADP / ATP se calculó por la siguiente razón: RLUA1 - luminiscencia de ATP; RLUB – luminiscencia de ATP residual después de 10 min; RLUC - luminiscencia después de la conversión enzimática de ADP en ATP; ADP / ATP = (RLUC1-RLUB1) / RLUA1), siendo RLU la luminiscencia detectada en los canales A, B o C.

Nuestros resultados sugieren que 37 es parasiticida y 88 parasitostático, que ambos compuestos actúan de forma sinérgica con pentamidina y que 37 ejerce un efecto sinérgico con eflornitina; finalmente describimos que 37 y 88 no alteran la relación celular ADP / ATP o los niveles de glucosa del parásito, lo cual sugiere que su efecto no está asociado a la alteración del estado metabólico del parásito. El ensayo de la resazurina proporciona una fotografía puntual de la susceptibilidad de los parásitos a diversos compuestos8. Aunque este ensayo permite calcular valores de IC50 reproducibles, no otorga información sobre cómo es la acción de los mismos. Nuestros resultados sugieren que 37 es parasiticida, es decir, es capaz de destruir los parásitos. Por otra parte, los ensayos sugieren que 88 es parasitostático, es decir, es capaz de detener el crecimiento de los parásitos durante el tiempo en el cual el compuesto está presente en el cultivo. Al evaluar el potencial efecto sinérgico de los compuestos con las drogas clásicas pentamidina y eflornitina encontramos que este se evidencia al utilizar pentaminina y 37 (incluso a concentraciones IC10) y pentamidina y 88 (utilizado a concentraciones IC50, a las 24 h). El efecto sinérgico de pentamidina y 88 (a concentraciones IC50) se revierte a las 48 h; en estas condiciones las células reanudan su crecimiento hasta en un 30% del control no tratado.

La glucosa es la fuente de energía preferencial de los tripanosomas. Estos son células que utilizan escasamente las mitocondrias para sintetizar ATP y el mecanismo preferencial de síntesis de esta fuente de energía depende de la glicólisis (en el citosol)14. Los tripanosomas están entre el tipo de células en las que la glicólisis está activa, incluso en presencia de oxígeno. En otro tipo de células la presencia de oxígeno disminuye el flujo glucolítico y favorece la producción de ATP via la fosforilación oxidativa. Bajos niveles de oxígeno en los tripanosomas disminuyen el consumo de glucosa y altas concentraciones de oxígeno inducen la glicólisis, probablemente para inducir la proliferación. Es más, se postula que el ATP producido durante la glicolisis no se utiliza para el crecimiento del parásito; sin embargo, ya que mediante la glicólisis sólo se producen dos moléculas de ATP, estos parásitos deben mantener su relación ADP / ATP muy controlada15.

El efecto sinérgico también se demostró para eflornitina y 37 (utilizado a concentraciones IC50) mas no para eflornitina y 88 (utilizado a concentraciones IC90). Estos resultados sugieren que el uso combinado de 37 y las drogas clásicas pentamidina y eflornitina podría ser beneficioso y confirman el efecto parasitostático de 88.

Por otra parte, las formas sanguíneas de tripanosoma no tienen una mitocondria “normal” sino una forma reducida de este organelo. No posee oxidasas de citocromo (pero si una oxidasa alternativa), el transporte de electrones no genera un potencial de membrana, y por lo tanto, no se utiliza para producir ATP mediante la fosforilación oxidativa. Al contrario, la ATPasa que normalmente sintetiza ATP en este compartimiento lo hidroliza con el fin de generar un potencial de membrana esencial para la importación de proteínas14.

La pentamidina es una droga cuya diana es la mitocondria. Esta droga es efectiva incluso en las formas sanguíneas de T. brucei que no expresan una cadena respiratoria completamente funcional11. Por su parte, la eflornitina, un análogo de aminoácidos, inhibe a la ornitina decarboxilasa durante la síntesis de las poliaminas12. Estudios anteriores realizados en el marco del consorcio mencionado sugieren que la diana celular para 37 es el retículo endoplasmático, mientras la mitocondria y el cinetoplasto lo son para 88. Nuestros resul-

Puesto que se ha demostrado que la inhibición del transporte de glucosa es parasiticida para T. brucei16 y para evidenciar si los compuestos 37 y 88 alteran el metabolismo parasitario y comprometen la relación celular ADP /ATP, evaluamos el efecto de ambos compuestos sobre este parámetro. Comparamos los efectos de 37 y 88 con florizidina, ya que el transporte de glucosa en las especies sanguíneas del parasito requiere iones sodio y el florizidin es un inhibidor de este tipo de transportadores en mamíferos17 y el desacoplante de la

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En este estudio profundizamos el análisis de dos compuestos líder sintetizados en el marco del consorcio liderado por los profesores Gerhard Bringmann y Ulrike Holzgrabe en la Universidad de Würzburg. Nuestro interés fue determinar si los mismos cumplen con propiedades que aumenten la probabilidad de su inclusión en ensayos con animales, preclínicos y clínicos. Específicamente evaluamos si la bisnaftilamida biscuaternaria (37) y la sal de N-Arylpyridinium (88) son parasitostáticos o parasiticidas, si actúan de forma sinérgica con las drogas clásicas pentamidina y eflornitina y si afectan el estado metabólico celular.

tados de citometría de flujo sugieren que en los parásitos tratados con pentamidina y eflornitina, al igual que con 37 y 88 se evidencia una disminución (no significativa) en el marcaje con Mitotracker, con respecto a los parásitos no tratados. Esto no ocurre con el resto de los marcadores utilizados, específicos para compartimientos açídicos, el núcleo y el sistema retículo endotelial. Los resultados globales sugieren que en las condiciones ensayadas la citometría de flujo no parece ser un método idóneo para la identificación específica de las dianas celulares de estos compuestos. Podríamos especular que debido a que los cultivos de tripanosomas son asincrónicos, aunque sean monomórficos como es el caso que nos ocupa13, no hay una reproducción simultánea de todos los miembros de la población. La variabilidad en los estadios de crecimiento podría entonces estar enmascarando el efecto específico de los compuestos sobre los organelos diana, debido a que la población de células con la característica morfológica específica debería ser muy pequeña.

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Discusión

fosforilación oxidativa CCCP, puesto que se ha demostrado su efecto específico sobre los tripanosomas18. Nuestros resultados sugieren que ni la relación ADP / ATP ni el consumo de glucosa se ven alterados por los compuestos 37 y 88 en estas condiciones, lo cual parecería evidenciar que estos compuestos no alteran el estado metabólico de la célula. En conclusión, en este trabajo describimos que el compuesto líder (37) es parasiticida y el 88 es parasitostático. Que ambos compuestos potencian el efecto de pentamidina y 37 el de eflornitina y sugieren que su efecto no está relacionado con una alteración del metabolismo celular. Estos resultados indican la ventaja que traería utilizar un compuesto como 37 para utilizarlo en combinación con pentamidina o eflornitina a fin de reducir los efectos adversos potenciales de estas drogas clásicas. Por otra parte sugieren que las propiedades parasitostáticas de 88, incluso a concentraciones cercanas al IC90 podrían ser explotadas para imitar el efecto de una vacunación con parasito inactivado. Esta acción inhabilitaría al parásito de continuar reproduciéndose por un tiempo, lo cual facilitaría la acción del sistema inmune. Agradecimientos A los miembros del consorcio SFB630 financiado por la Deutsche Forschung Gemainschaft, Alemania y a la Fundación Alejandro de Humboldt, Alemania por su apoyo financiero a APS. A Antje Fuß por su apoyo técnico en la realización de los experimentos.

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Marcadores de resistencia en Leishmania: Susceptibilidad in vitro a drogas leishmanicidas vs retención de calceina en aislados de pacientes venezolanos con Leishmaniasis Cutánea Difusa

Resumen

Abstract

La identificación de parásitos quimio-resistentes con marcadores celulares fáciles de cuantificar, no ha sido descrita en Leishmania. En este trabajo comparamos la susceptibilidad in vitro a drogas leishmanicidas vs. la retención intracelular de calceina, una medida indirecta de la actividad de los transportadores MDR1 y MRP1, en parásitos aislados de pacientes con Leishmaniasis Cutánea Difusa, con fracaso terapéutico a Glucantime. Estos hallazgos los comparamos con resultados obtenidos en especies de referencia de la Organización Mundial de la Salud. Encontramos que el ensayo de susceptibilidad a drogas leishmanicidas, es fácil, rápido y reproducible, mas no necesariamente predictivo de fenotipo quimio-resistente. Adicionalmente, la detección fluorométrica de la retención de calceina permitió diferenciar a los aislados de acuerdo a la funcionalidad de los transportadores ABC. Estos resultados sugieren que de validarse su utilidad, esta metodología podría incorporarse al esquema de diagnóstico y tratamiento de la leishmaniasis, como predictiva del éxito de la terapia leishmanicida.

Chemo-resistance screening with easy to quantify cell markers has not been implemented for leishmaniasis. Herein we compared Leishmania in vitro susceptibility to classical and experimental drugs and calcein retention by parasites isolated from patients suffering Diffuse Cutaneous Leishmaniasis that failed to respond to Glucantime. The results were compared with those obtained from WHO-reference Leishmania strains. Calcein is an ABC transporter substrate and its accumulation may reflect the functionality of both MDR1 and MRP1 transporters. Our results suggest that screening of promastigote´s drug susceptibility is an easy, fast and reproducible assay that might not be predictive of a phenotype confident with chemoresistance. Moreover, theys demonstrate that calcein retention differentiates the isolates according to the functionality of the different ABC transporters. Therefore, if validated, this methodology could be included in a diagnosis and treatment scheme for leishmaniasis as predictive for successful therapy.

Palabras clave: Leishmania, susceptibilidad a fármacos, quimio-resistencia, retención de calceina, transportador ABC.

Key words: Leishmania, drug susceptibility, chemo-resistance, calcein retention, ABC transporter.

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Maritza Padrón-Nieves1 y Alicia Ponte-Sucre2 1 Cátedra de Farmacología y Toxicología. 2Cátedra de Fisiología Humana. 1,2Escuela Luis Razetti. Instituto de Medicina Experimental. Laboratorio de Fisiología Molecular Facultad de Medicina. Instituto de Medicina Experimental. Facultad de Medicina. Universidad Central de Venezuela Autor a quien se dirige la correspondencia: Maritza Padrón-Nieves. Oficina 204. Instituto de Medicina Experimental. Telf: (58-212) 605-3665. Fax: (58-212) 693-4351. Email: mpadron43@gmail.com

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Resistance markers in Leishmania: in vitro drug susceptibility vs leishmanicidas calcein retention in isolated venezuelan patients with diffuse cutaneous leishmaniasis

Introducción Leishmaniasis es el término descriptor de la clínica de la enfermedad causada por Leishmania (L.), parásito intracelular obligado de las células del sistema fagocítico monocitario1. En Venezuela, la leishmaniasis cutánea (98,8% de los casos), es endémica2. Para su tratamiento, el fármaco de elección es el antimoniato de meglumina3,4 (Glucantime®, de Aventis), o la Ulamina, fabricada en Venezuela5. Su administración es intramuscular, el tratamiento es doloroso, largo y con efectos secundarios importantes. Debido a ello el éxito de la terapia puede ser limitada. Adicionalmente puede haber fracaso terapéutico en algunos pacientes, y también recidivas. Desde los años 80 en Venezuela se usa alternativamente la inmunoterapia6.

La quimio-resistencia, definida como la disminución de la eficacia del medicamento en una población previamente susceptible, es una de las causas del fracaso terapéutico en la leishmaniasis7. La misma puede ser natural o innata (L. braziliensis al ketoconazol); o adquirida, al seleccionar parásitos con características que les permiten sobrevivir en presencia de la droga, al ser expuestos reiteradamente a dosis sub-óptimas de fármacos1,8. Al igual que en células de mamíferos, en Leishmania este fenómeno implica la disminución de la acumulación celular de fármacos, debido a la sobre-expresión de transportadores ABC (por ATP Binding Cassette) responsables de la eliminación efectiva de desechos celulares, toxinas ambientales y otros xenobióticos9,10. El primer transportador ABC descrito, y el más estudiado, fue el ABCB1 (glicoproteína P, P-gp, MDR). Sus sustratos son drogas hidrofóbicas, catiónicas o neutras11. Posteriormente, fueron identificados el ABCC1 (MRP, por su siglas en inglés, Multidrug Resistance-associated Protein), para drogas aniónicas12 y el ABCG2 (MXR, Mitoxantrone Resistance Protein o BCRP, Breast Cancer Resistance Protein) para drogas hidrofóbicas11. En Leishmania, Ouellette y colaboradores13, fueron pioneros al describir el círculo H, una estructura extracromosomal que contiene genes para los transportadores ABCC; el aumento de su expresión y función está asociado a la resistencia a drogas en Leishmania. Los mecanismos de quimio-resistencia pueden ser múltiples y no ser exclusivos para un tipo de droga. Es decir, diversos sistemas contribuirían a la preservación del fenotipo quimio-resistente. Por ejemplo, la expresión de marcadores de metaciclogénesis, y de transportadores asociados a la incorporación de nutrientes disminuye en Leishmania quimio-resistente; adicionalmente, la actividad de enzimas del metabolismo de la glucosa y los amino ácidos está alterada, al igual que los niveles de metabolitos involucrados en la homeostasis redox como pterina y tripanotiona y la actividad de la enzima dihidrofolato-reductasa / timidilato- sintetasa8. Estas alteraciones de la fisiología celular sugieren que la quimio-resistencia podría monitorearse por la determinación de marcadores celulares, tal y como fue propuesto por Croft y su grupo en 20061.

Actualmente para determinar este fenotipo en Leishmania se utiliza el modelo in vitro macrófago-amastigote. El mismo permite correlacionar la respuesta clínica a los medicamentos, con la disminución cuantitativa de la tasa de infección de los macrófagos a concentraciones crecientes de las drogas1. Sin embargo, es una técnica laboriosa y costosa, condiciones que desestimulan su aplicación clínica. Debido al aumento de la incidencia de casos de leishmaniasis con fracaso terapéutico, urge entonces identificar marcadores de resistencia sencillos y fáciles de implementar, para guiar la terapia leishmanicida. En nuestro estudio, pionero en Venezuela, evaluamos si la acumulación de calceina diferencia a los aislados de acuerdo a la funcionalidad de los transportadores ABC, y comparamos los resultados con aquellos que determinan la susceptibilidad de los parásitos a drogas clásicas y experimentales leishmanicidas. La prueba fluorescente que utiliza calceina acetoximetilada (calceina/AM–no fluorescente) es útil para demostrar quimio-resistencia mediada por transportadores ABC en parásitos y otras células14. La calceina/AM difunde a través de las membranas celulares, es degradada por esterasas endógenas y transformada en calceina fluorescente. Los transportadores ABC expresados en la célula eliminan la calceina, la cual no se acumula en el interior celular, por lo cual disminuye la fluorescencia intracelular15. El uso de inhibidores específicos para cada tipo de transportador, permite determinar la contribución funcional de cada uno de ellos. Nuestros resultados sugieren que de validarse su utilidad, esta metodología podría incorporarse al esquema de diagnóstico y tratamiento de la leishmaniasis, como predictiva del éxito de la terapia leishmanicida.

Métodos Se utilizaron especies de referencia, certificadas por la Organización Mundial de la Salud: Leishmania (V.) braziliensis (MHOM/BR/84/LTB300), Leishmania (L.) mexicana (MHOM/ BR/82/Bel21), Leishmania (L.) amazonensis (MHOM/BR/77/ LTB0016) y parásitos aislados de lesiones de tres pacientes con Leishmaniasis Cutánea Difusa con fracaso terapéutico de larga data, al tratamiento con Glucantime [VE2000MM, L. (L.) amazonensis; VE98MR, L. (L.) amazonensis; y VE96ZC, L. (L.) mexicana] identificados por análisis e hibridación molecular (Rodríguez N., comunicación personal). Los aislados se mantuvieron en nitrógeno líquido hasta su uso, se descongelaron según protocolos convencionales, para su crecimiento fueron sub-cultivados en medio semisólido de agarsangre/medio glucosado bajo criterios establecidos. Se evaluó la susceptibilidad de los promastigotes de las especies de referencia a las drogas leishmanicidas [pentamidina (0 a 150 µM) y anfotericina-B (0 a 10 µM)] y no leishmanicidas [glibenclamida (0 a 100 µM)]. Los parásitos (1 x 107 células ml-1) se sembraron y se incubaron a temperatura ambiente (TA). La droga se añadió al segundo día; se determinó la densidad celular

El análisis estadístico de los datos se realizó con los programas Microsoft Excel 2002® y Graph-Pad Prism5®. Los valores se presentan como la media ± el error estándar de al menos tres experimentos realizados por duplicado.

Resultados Inicialmente establecimos la susceptibilidad in vitro de las especies de referencia estudiadas. Para ello determinamos la GI50 para glibenclamida, anfotericina-B y pentamidina. En la Tabla I se listan los valores de GI50 obtenidos 72 h luego de añadir cada droga. Los resultados demuestran que las especies de referencia son más susceptibles a anfotericinaB que a pentamidina, como drogas leishmanicidas clásicas y confirman que glibenclamida es un agente leishmanicida moderado; adicionalmente, sugieren que la GI50 es un indicador confiable de la susceptibilidad diferencial de los promastigotes a los compuestos.

Cepa

Glibenclamida (µM)

Pentamidina (µM)

Anfotericina-B (µM)

LTB300

1,75

0,25

Bel21

4,56

1,05

LTB0016

13,28*

8,84

0,089**

*=Ponte-Sucre y col., 1998; ** =Silva-López y col., no publicado.

Seguidamente se determinó el efecto de concentraciones cercanas al GI90 para las especies de referencia (tres y siete veces mayor al GI50 de las drogas utilizadas) sobre el crecimiento de los parásitos. Los datos se resumen en la Tabla II. Al comparar la supervivencia de las especies con la de los aislados se obtuvieron las siguientes series de susceptibilidad; para pentamidina (LTB0016 > LTB300 = VE2000MM = VE98MR > Bel21 > VE96ZC) y anfotericina-B (LTB0016 >> LTB300 > Bel21 >> VE96ZC = VE2000MM > VE98MR), como agentes leishmanicidas clásicos, y para glibenclamida (LTB0016 >> LTB300 > VE98MR > VE96ZC > VE2000MM = Bel21). Estos datos demuestran que los aislados de los pacientes estudiados son menos susceptibles a las altas concentraciones de las drogas ensayadas, que las especies de referencia, con una supervivencia cercana, o superior al 50%, excepto en el caso de VE98MR y VE2000MM ensayados con pentamidina. Para determinar si la evaluación de la acumulación basal de calceina, nos permitía llegar a conclusiones similares, en base a la expresión funcional de los transportadores ABC, evaluamos este parámetro en los aislados de pacientes con fracaso terapéutico al Glucantime en condiciones control (sin drogas) y en presencia de inhibidores como verapamil, ciclosporina-A y glibenclamida. La retención basal en todos los casos fue de 301 a 382 unidades arbritarias de fluorescencia. Tabla II. Porcentaje de supervivencia de Leishmania spp. a concentraciones máximas de glibenclamida, pentamidina y anfotericina-B LTB300 Bel21 LTB0016 VE2000MM VE98MR glibenclamida 3X pentamidina 7X anfotericina-B 4X

VE96ZC

20**

NX = valor del GI50 multiplicado por N en mM para cada droga utilizada. Valores cercanos al IC90 para todas las drogas *Ponte-Sucre y col., 1998. ** = Silva-López y col., no publicado

La Tabla III resume las concentraciones efectivas (CE50, expresadas en µM) necesarias para aumentar en un 50% la acumulación de calceina en las especies y aislados. Glibenclamida aumentó la acumulación de calceina en todos los casos. La serie de susceptibilidad fue: Bel21 > VE98MR > VE96ZC > VE2000MM > LTB300 >> LTB0016. Nuestros resultados no se deben a la inhibición de canales de potasio Ikr por la glibenclamida17,18, ya que en experimentos realizados con genisteina

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Se evaluó la retención basal de calceina en alícuotas de 100 µl (4 x 108 células ml-1). Para ello se utilizó el protocolo del kit VybrantTM optimizado en el laboratorio17. Alícuotas de 100 µl (4 x 108 células ml-1 se incubaron 30 min a TA en presencia de concentrationes crecientes de ciclosporina-A y verapamil, y glibenclamida; seguidamente se incubaron 30 min a TA en oscuridad, en presencia de calceina/AM (0,25 µM); para detener la reacción, las células se centrifugaron 5 seg a 200 x g; posteriormente, se lavó la preparación con medio glucosado frío y finalmente, se resuspendieron las células en 200 µl del mismo medio. La retención de calceina fue medida como fluorescencia específica en un espectrofluorímetro Perkin Elmer Victor2 Wallac (Finlandia) a λem = 517 nm (λex = 494 nm). La glibenclamida es un inhibidor de transportadores ABCC1 (MRP1) y además de canales de potasio Ikr17,18,19. La ciclosporina-A es un bloqueador de amplio espectro, no competitivo, preferencialmente para transportadores ABCB4 (MDR4)20,21,22. El verapamil es un inhibidor selectivo de los transportadores ABCB1 (MDR1)21,22,23. Se incluyeron dos blancos: B1: alícuota de células solas y B2: alícuota de células con etanol, DMSO y PBS, y un control: C: alícuota de células con calceina.

Tabla I. Concentración Inhibitoria de crecimiento celular 50 (GI50) de las cepas de referencia a las 72 horas

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durante las próximas 24, 48 y 72 h. Se construyeron curvas dosis respuesta y se estableció la GI50, parámetro propuesto por el National Cancer Institute para fijar la concentración de droga que causa 50% de inhibición del crecimiento celular. Su cálculo corrige el valor encontrado en base a la densidad celular a tiempo cero, para cada droga16. Al determinar este parámetro (GI50) para cada especie de referencia y para cada droga, calculamos el porcentaje de crecimiento de cada aislado en presencia concentraciones de 3 a 7 veces el GI50 (≈ GI90 para las especies de referencia) de pentamidina (12,5 µM), anfotericina-B (1 µM) y glibenclamida (100 µM).

(0,02 a 10 μM) a concentraciones en las cuales este compuesto sólo actúa sobre canales de potasio y no sobre MDR1, MRP1 o ABCG217 encontramos que la genisteina (datos no mostrados) no aumentó el porcentaje de retención de calceina en ninguna de las especies, demostrando que la glibenclamida actuó bloqueando transportadores MRP1. Por su parte, verapamil y

ciclosporina-A, a las concentraciones utilizadas (hasta mM), aumentaron la acumulación de calceina sólo en algunas especies y aislados. La susceptibilidad para verapamil fue: (VE2000MM > LTB0016 >LTB300 >>>>> Bel21, VE98MR, VE96ZC) y para ciclosporina-A (VE96ZC = VE98MR > Bel21 > LTB300 >>>>> LTB0016, VE2000MM).

Tabla III. Concentración efectiva de verapamil, ciclosporina A y glibenclamida necesarias para aumentar 50% la retención de calceina de las especies de referencia y aislados de pacientes Verapamil (mM) Ciclosporina-A (mM) Glibenclamida (mM)

LTB300

Bel 21

LTB0016*

VE2000MM

VE98MR

VE96ZC

10,90 + 8,00

>mM

3,0 + 0,8

0,10 + 0,08

>mM

83,40 + 4,00

17,80 + 13,00

>mM

1,20 + 7,00

1,28 + 0,75

6,76 + 4,50

0,43 + 0,26

60,00 + 26,00

5,40 + 2,90

1,80 + 0,97

2,80 + 2,09

* Machuca y col., 2006, > mM, concentraciones superiores a mM

Discusión El aumento de la incidencia de casos de leishmaniasis con fracaso quimioterapéutico resalta la urgencia de seleccionar marcadores de resistencia útiles para identificar parásitos con este fenotipo. En nuestro estudio, pionero en Venezuela, comparamos la susceptibilidad a drogas leishmanicidas de aislados de pacientes con fracaso terapéutico a Glucantime, con la capacidad de los aislados de acumular calceina, substrato de los transportadores ABC y su sensibilidad a inhibidores específicos de los mismos.

Los aislados VE2000MM y VE98MR fueron identificados como L. amazonensis, mientras que VE96ZC lo fue como L., mexicana (Dra. Noris Rodriguez, comunicación personal). Debido a ello en nuestro estudio se compararon los resultados obtenidos con los de las especies de referencia correspondientes. Se incluyó L. braziliensis LTB300 como control negativo. La susceptibilidad in vitro de las especies de referencia a dos agentes leishmanicidas (anfotericina-B y pentamidina), y a una sulfonilurea (glibenclamida) fue similar a la encontrada previamente24,25. Adicionalmente, nuestros datos demuestran que los aislados fueron en general menos susceptibles a anfotericina-B y glibenclamida que sus especies homólogas, con un porcentaje de supervivencia cercano o superior al 50%, a altas concentraciones de las drogas. Por su parte, con pentamidina, sólo el aislado VE96ZC tuvo un porcentaje de supervivencia superior a 50% a altas concentraciones de la droga. Estos resultados indican que la susceptibilidad a drogas en promastigotes es un método fácil, rápido y reproducible, más no necesariamente predictivo de fenotipo quimio-resistente. Sin embargo, la validación de estos hallazgos en un mayor número de aislados es más que deseable. Seguidamente comparamos la acumulación de calceina entre los aislados de pacientes y las especies de referencia. Adicionalmente evaluamos su modulación por inhibidores competitivos

como verapamil, ciclosporina-A y glibenclamda. Este ensayo es válido como medida indirecta de la funcionalidad de los transportadores MDR y MRP en muchos tipos celulares8,26. Los aislados difieren en su comportamiento con LTB300; es por ello que esta especie no será incluida en el siguiente análisis. Rautio y colaboradores27 han definido la fortaleza de los inhibidores de transportadores ABC como alta (A, con IC50 < de 1 µM), media (M, con IC50 1µM < 15 µM) y baja (B, con IC50 > de 15 µM)27. Este análisis además permite establecer el tipo de transportadores preferencialmente expresado en un tipo celular, al utilizar inhibidores selectivos, tal y como se realizó en este trabajo. Basados en nuestros resultados concluimos entonces que, ciclosporina-A es un inhibidor tipo B para el aislado VE2000MM y para LTB0016 (insensibles a la droga hasta niveles mM); y es un inhibidor tipo M para los aislados VE96ZC y VE98MR. Como ciclosporina-A es un inhibidor selectivo de transportadores MDR4, podemos concluir que los mismos deben estar medianamente expresados en VE96ZC y VE98MR (sensibles a la droga entre 1 y 15 µM). Para estos mismos aislados, verapamil es un inhibidor tipo B (insensibles a la droga hasta niveles mM). Sin embargo, es un inhibidor tipo A para el aislado VE2000MM y tipo M para LTB0016. Como verapamil inhibe preferencialmente transportadores MDR1, podemos concluir que los mismos no estén expresados o no son funcionales en VE96ZC y VE98MR, mas si en VE2000M. Verapamil y ciclosporina-A son inhibidores tipo B para Bel21, sugiriendo que esta cepa no expresa (o no son funcionales) ni MDR1 ni MDR4. Finalmente, acorde con la clasificación presentada, glibenclamida es un inhibidor tipo A para Bel21, B para LTB0016, y M para los aislados. Estos datos sugieren la expresión funcional de transportadores MRP1 en los aislados, susceptibles a concentraciones de glibenclamida entre 1 y 15 µM, más no así en LTB0016, tal y como había sido demostrado anteriormente17. En conclusión, en este trabajo Encontramos diferencias al comparar la susceptibilidad y la expresión de transportadores ABC

AGRADECIMIENTOS Al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico, Universidad Central de Venezuela (UCV), PI 09-00-7115-2008, PG 09-007378-2008; Programa de Asistencia a Eventos ICC-09-0022-2012. Coordinación de Investigación de la Facultad de Medicina UCV, CI-ADM-134/2009 y Fundación Alejandro de Humboldt, Alemania, por los financiamientos recibidos. Los parásitos fueron donados por la Dra Noris Rodríguez, Instituto de Biomedicina, Universidad Central de Venezuela (UCV) y por el Dr. Lee Schnurr, Universidad de Jerusalén.

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33.

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de los aislados de pacientes con las especies de referencia. Nuestros resultados sugieren que (a) el ensayo de susceptibilidad en promastigotes de Leishmania es fácil, rápido y reproducible, y podría ser predictivo de la resistencia a antimoniales, (b) la evaluación de la acumulación de calceina como ensayo cualitativo de la expresión y/o funcionalidad de los diversos transportadores ABC podría ser un marcador celular interesante de continuar evaluando por lo cual, es imperativo la validación de estos hallazgos en un mayor número de aislados.

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Sobre un caso de intoxicación

por el uso de la planta de estropajo o tusa (Luffa cylíndrica) en Venezuela About a case of intoxication by the use of the loofah sponge or tusa (Luffa cylíndrica) in Venezuela Yudith Guerrero1,2, Betty Omaña1, Alexis Rodríguez-Acosta2,3 1 Servicio de Toxicología Médica, Hospital “Doctor Leopoldo Manrique Terrero”. 2 Sección de Ultraestructura Toxinológica, Instituto Anatómico, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela. 3 Sección de Inmunoquímica, Instituto de Medicina Tropical, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

Resumen

Abstract

Objetivo: En algunas regiones del mundo, las plantas originan importantes problemas clínicos, causando gran morbilidad y mortalidad, principalmente después de la intoxicación no intencional. Aquí se plantea como objetivo principal, describir un caso de intoxicación con la planta de estropajo (Luffa cylindrica) por el uso inadecuado como instilación nasal.

Objective: In some regions of the world, the plants are important clinical problems, causing great morbidity and mortality, mainly after the non intentional intoxications. In this work an intoxication case is described, by the topic use of an extract of the scouring pad plant (Luffa cylindrica), when it was badly used as nasal medication to treat a chronic sinusitis.

Método: La descripción de la planta utilizada permitió identificar a la familia de las Cucurbitaceas y la especie involucrada. El análisis clínico otorrinolaringológico permitió evidenciar un cuadro agudo, grave con obstrucción de vías aéreas superiores.

Methods: In this case, the description of the used plant allowed to identify the Cucurbitaceous family and the involved species (Luffa cylindrica). The clinical analysis allowed evidencing an acute severe case with respiratory obstruction.

Resultados: Se relata un cuadro de intoxicación, por uso tópico de extracto de la planta de estropajo (Luffa cylíndrica), cuando fue utilizado como medicamento nasal para tratar una sinusitis crónica. El paciente presentó 4 horas después de la instilación, disfonía, con un intenso edema de úvula. Se encontraba confundido, con cefalea, así como con acentuada odinofagia y dificultad respiratoria. Conclusión: Tras revisión de la literatura, se permite plantear que se trata del primer caso referido o publicado de esta inusual intoxicación y daño de vías aéreas superiores ocasionado por esta planta. Fue tratado con oxígeno, hidrocortisona, clorfeniramina y adrenalina (SOS). El paciente se recuperó después de 48 h de tratamiento sintomático. Palabras clave: edema de úvula; estropajo; Luffa cylindrica; plantas tóxicas; sinusitis, tusa.

Results: In this work an intoxication case is described, by the topic use of an extract of the scouring pad plant (Luffa cylindrica), when it was used as nasal medication to treat a chronic sinusitis. Four hours after the instillation, the patient presented, dysphonia, with an intense uvula edema. He was confused, with headache, as well as a severe odynophagia and breathing difficulty. Conclusion: The revision of the literature, allowed us to propose that it is the first described case of this unusual intoxication. The patient was treated with oxygen, hydrocortisone, chlorpheniramine and adrenaline (SOS). He recovered after 48 h of symptomatic treatment. Key words: uvula, edema; loofah sponge; Luffa cylíndrica; odynophagia; toxic plants; sinusitis, tusa.

En muchos países, las plantas son una causa común de intoxicación, siendo común en niños pequeños. En el Primer Mundo la ingestión de plantas es responsable de un número significativo de todas las consultas, pero los envenenamientos graves son raros2,3. En Escandinavia, las plantas fueron responsables de 5% de los casos de intoxicación pediátrica y el 28% de llamadas a un centro de información de veneno4. El envenenamiento por plantas en el mundo desarrollado es fundamentalmente un problema de los niños pequeños que ponen cosas en su boca mientras exploran su entorno. Sin embargo, en el Tercer Mundo, el envenenamiento por plantas es un problema clínico importante. La intoxicación con ellas causan un número importante de muertes cada año en el sur de Asia y casi todas las muertes resultan de suicidio o de homicidio5-8. La intoxicación con frutas inmaduras del árbol de ackee (Blighia sapida) en el Caribe y África occidental seguramente causa decenas a cientos de muertes cada año9. En Centroamérica se describe una neuropatía aguda con el uso de tullidora (Karwinskia humboldtiana) una fruta de uso común. En el caso estudiado en este trabajo, el paciente desarrolla un cuadro inflamatorio difuso de las vías aéreas superiores, que ocasionó un ingente edema de úvula y glotis, que pudo desencadenar una muerte por asfixia, causado por la instilación nasal de una solución de estropajo (Luffa cilíndrica). Tras revisión de la literatura, podemos plantear que se trata del primer caso descrito de esta inusual intoxicación y daño de vías aéreas superiores ocasionado por esta planta. Descripción del caso Este paciente de 55 años de edad, natural de Colombia, sexo masculino, sin antecedentes particulares, pero con una sinusitis crónica, deseando utilizar un tratamiento folklórico, que se sugiere hacer inspiraciones con vapores de estropajo (Luffa cylíndrica), para despejar los senos nasales y paranasales, decide acelerar el tratamiento instilándose la solución hervida de Luffa cilíndrica en gotas nasales. Se presenta a la consulta con incapacidad para hablar, siendo los datos aportados por familiar. El paciente presentó 4 horas después de la instilación, disfonía, con un severo edema de úvula. Se encontraba confundido, con cefalea, así como con intensa odinofagia y dificultad respiratoria.

Fig.1. Intenso edema de úvula

El balance biológico no presentaba particularidades. Electrocardiograma con ritmo sinusal normal. Las funciones renales y hepáticas fueron normales. El paciente fue hospitalizado, se le indicó dieta absoluta y se hidrató con soluciones salinas y de dextrosa alternadas por 24 horas. Hidrocortisona: 500 mg, endovenoso y luego cada 6 horas; clorfeniramina: 1 ampolla 5 mg y luego cada 8 horas; oxígeno: 3 - 4 litros/ por catéter o mascarilla nasal (SOS); adrenalina: 0.4 mL vía subcutánea (SOS). A las 12 horas de hospitalización: en mejores condiciones generales, hidratado, afebríl. ORL: úvula y faringe menos edematosa, mejora disfonía y odinofagia, mejoría para tragar líquidos. El balance biológico sin alteraciones que reportar. En vista de aparición de cifras tensionales elevadas 135/95 mmHg, se indicó: captopril 25 mg sublingual y luego 2 veces al día con control de tensión arterial. Se inició dieta líquida hiperprotéica de 1500 m en 24h. A las 17 horas de hospitalización: se indicó captopril 25 mg, vía oral. Cada 8 horas, por persistencia de cifras tensiónales elevadas: 142/87 mmHg. A las 48 horas de hospitalización: paciente en mejores condiciones generales, a febril con mejoría de sintomatología:

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Hay numerosas plantas que contienen sustancias químicas o que las acumulan, las cuales son venenosas para los seres humanos. Las consecuencias de la intoxicación pueden variar desde irritaciones menores y hasta casos graves, donde el individuo presenta una gran suma de sufrimiento y puede morir. Podrían facilitarse las cosas si las plantas pudieran clasificarse en dos grupos, venenosos y no venenosas. Sin embargo, ello no se puede hacer, porque muchos factores son responsables de los principios tóxicos en las plantas. Lo que puede ser una especie de planta inofensiva en una circunstancia podría ser mortal en otro1.

Al examen físico, es un paciente de raza negra, afebril, hidratado con prurito cutáneo leve, no presencia de erupción, pupilas isocóricas reactivas a la luz. Tensión arterial: 149/87 mmHg,; temperatura: 37 ºC. Boca: hipertrofia y edema de úvula acentuado (Fig. 1), faringe congestiva, amígdalas hipertróficas. Fosas nasales: eritema de mucosa e hipertrofia de cornete inferior y medio. Cuello móvil sin daños aparentes. Cardiopulmonar: ruidos cardiacos normales, sin soplos y frecuencia cardiaca: 95 pulsaciones/min. Respiratorio: ruidos respiratorios normales en ambos campos pulmonares, sin agregados, con frecuencia respiratoria: 18 por minuto. Abdomen: blando, no doloroso a palpación, sin megalias aparentes. Neurológico: consciente, orientado, marcha normal. Lenguaje por señas. Por dificultad para hablar.

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Introducción

no había disfonía ni odinofagia, disminución de eritema de mocosa nasal, amígdalas menos hiperémicas, voz normal y audible. Toleró vía oral. Se indicó dieta blanda. En vista de mejoría de sintomatología y paraclínica normal se indicó su egreso.

traron actividad diurética en ratas10 y molusquicida (fracción triterpénica). La isocucurbitacina B demostró actividad citotóxica in vitro. Algunos de estas sustancias, en su actividad aislada o sinérgicamente, fueron posiblemente las responsables de este cuadro de intoxicación.

Indicaciones de egreso: Cita control en 48 horas por Consulta Externa. Tratamiento ambulatorio: prednisona vía oral, clorfeniramina vía oral cada 8 horas por 5 días.

Estas plantas contienen principios nombrados elaterinas11, donde sobresale la alfaelaterina, levógira fisiológicamente inactiva y la beta-elaterina dextrógira y de enorme actividad laxante, probablemente por lo irritante sobre la mucosa.

Control a las 48 horas de egreso: refiere secreción fétida por fosa nasal, sin referir otra sintomatología. Se indicó: amoxacilina-acido clavulanico 500 mg. Vía oral, cada 8 horas por 14 días. Gotas nasales de monosulfa, cada 4 horas. Paciente no acudió a citas sucesivas. Discusión La Luffa cylíndrica, cuyos nombres comunes son: tusa, estropajo, esponjilla, pertenece a la Familia de las Cucurbitaceae. Crece en África y Asia tropical, siendo Japón el principal productor3. Las fibras de sus frutos maduros son empleados en medicina tradicional China desde el siglo X d.C. Pertenece al grupo de plantas industriales, es una enredadera anual, con hojas grandes lobuladas y flores masculinas amarillas, los frutos son cilíndricos alargados y gruesos (Fig. 2). Fig.2. Fruto de la Luffa cilíndrica

En su composición química se encuentran principios activos, tales como los triterpenos: cucurbitacinas B y D, isocucurbitacinas B, neocucurbitacinas A y B, y gigsogenina. Otros como: buchinina (principio amargo), huffanina y buchina (alcaloides), saponinas, luperósidos A-H (partes aéreas), metacarboxi-fenilalanina, elaterina, y citrulina (semillas). Los extractos acuosos y etanólicos (95%), de los frutos demos-

Esta sustancia activa de la planta, también tiene efecto antiinflamatorio12 (inhibiendo la IL-1 y TNFa en ratones), pero asimismo causa daño celular directo sobre numerosos tejidos in vitro. Esto podría explicar su efecto tóxico que se describe13. En general, los cuadros más severos se han observado en enfermos que utilizaron el jugo de cucurbitáceas sin diluir y en instilación directa en las fosas nasales como ocurrió en nuestro paciente. En un estudio de 42 pacientes con angioedema14 ocasionado por el uso de otra cucurbitacea rica en elaterina la Ecballium elaterium 93% de los casos tenía antecedentes de atopia y el cuadro clínico de angioedema que se desarrolló rápidamente tras la administración del jugo, sugiere que estas reacciones fueron mediadas por un mecanismo de hipersensibilidad tipo I (mediada por IgE). Hay numerosos agentes vegetales que favorecen los principios tóxicos en algunas plantas. Alguna especie de planta individual o sus variedades podrían diferir en su contenido venenoso, de acuerdo a su estadio de madurez. En algunas plantas, hay un aumento en su habilidad de envenenar en sus etapas avanzadas del crecimiento, mientras otras el riesgo disminuye. En otras, el veneno se halla en las plantas frescas pero no en las deshidratadas15. El tratamiento para la mayoría de intoxicaciones por plantas es sintomático y los antídotos específicos se utilizan en sólo unas pocas. Aquí, se describe un cuadro de intoxicación y probablemente una reacción anafilactoide, por uso tópico de extracto de la planta de estropajo (Luffa cylíndrica), cuando fue utilizado como medicamento nasal para tratar una sinusitis crónica, en forma equivocada, ya que la etnomedicina lo sugiere para ser usado como inhalación de sus vapores, que permitan el drenaje de secreciones mucosas o mucopurulentas de los senos nasales congestionados. El paciente presentó 4 horas después de la instilación, disfonía, con un crecido edema de úvula. Llegó a la consulta con cefalea, así como con intensa odinofagia y dificultad respiratoria, que pudo comprometer la vida del paciente. Los síntomas se desarrollaron muy rápidamente y se parecían a una reacción alérgica. En este caso, la descripción de la planta ingerida permitió identificar a la familia de las cucurbitáceas y la especie involucrada, lo cual, tras revisión de la literatura, nos permite plantear que se trata del primer caso descrito de esta inusual intoxicación y daño de vías aéreas superiores ocasionado por esta planta.

Fue tratado con oxígeno, hidrocortisona, clorfeniramina y adrenalina (SOS). El paciente se recuperó después de 48 h de tratamiento sintomático.

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Referencias

Determinación de la glucosa en sangre

de equinos pura sangre de carrera medicados con fenilbutazona y flunixin meglumine Determination of glucose of blood in thoroughbred horses medicated with phenylbutazone and flunixin meglumine

Abelardo Morales Briceño¹³, Diana Villoria³, Mario Rossini¹, Luís Rivero¹, Mariam Gómez², Hector Bello³ ¹Departamento de Patología Facultad de Ciencias Veterinarias, Facultad de ²Agronomia, Universidad Central de Venezuela Maracay, Estado Aragua Venezuela, ³División de Sanidad Animal Junta Liquidadora Instituto Nacional de Hipódromos “La Rinconada” Caracas Venezuela. Email: aamorales13@gmail.com.

Resumen

Se plantea como objetivo describir los niveles de glucosa en sangre asociados a la administración de fenilbutazona y flunixin meglumine respectivamente en equinos. Se estudiaron 7 equinos Pura Sangre de Carrera de 2 años de edad, tres de sexo hembra y cuatro de sexo macho. Fueron tomadas muestras de sangre previa a la medicación. La fenilbutazona fue administrada vía endovenosa a una dosis 4,4mg/kg a tres caballos y el flunixin meglumine fue administrada en dosis de 1,1mg/kg a 3 caballos por vía endovenosa. Los niveles de glucemia fueron estudiados a la 1 hora, 2 horas, 3 horas y 4 horas post medicación de los fármacos en estudio. Los resultados expresados en mg/dL fueron: fenilbutazona 1 hora: 108-126-131, 2 hora: 112-128-130, 3 hora: 115-130-131 y 4 hora: 130-132-134 para flunixin meglumine 1 hora: 111-106110, 2 hora: 114-106-113, 3 hora: 111-108-111 y 4 hora: 111112-114. En conclusión se observan cambios significativos glucosa en sangre en los equinos medicados con fenilbutazona y flunixin meglumine respectivamente. PALABRAS CLAVES: equinos, glucosa, fenilbutazona, flunixin meglumine.

Abstract The aim of this study was to describe the levels of blood glucose associated with the administration of phenylbutazone and flunixin meglumine in horses respectively. We studied 7 thoroughbred race horses 2 years of age, sex three female and four male sex. Blood samples were taken prior to medication. Phenylbutazone was administered intravenously at a dose 4.4 mg / kg to three horses and flunixin meglumine was administered at doses of 1.1 mg / kg to 3 horses intravenously. Blood glucose levels were studied at 1 hour, 2 hours, 3 hours and 4 hours after medication of the study drugs. The results expressed in mg / dL were: phenylbutazone 1 hour: 108-126-131, 2 hours: 112-128-130, 3 hours: 115-130-131 and 4 hours: 130-132-134 for flunixin meglumine 1 hour: 111106-110, 2 hours: 114-106-113, 3 hours: 111-108-111 and 4 hours: 111-112-114. In conclusion, we observed significant changes in blood glucose in horses medicated with phenylbutazone and flunixin meglumine respectively. Keywords: equine, glucose, phenylbutazone, flunixin meglumine.

Materiales y metodos Se estudiaron 7 equinos Pura Sangre de Carrera de 2 años de edad, tres de sexo hembra y cuatro de sexo macho. Fueron tomadas muestras de sangre previa a la medicación. Todos los ejemplares se mantuvieron en ayuna antes y durante el experimento. La fenilbutazona fue administrada vía endovenosa a una dosis 4,4mg/kg a tres caballos y el flunixin meglumine fue administrada en dosis de 1mg/kg a 3 caballos por vía endovenosa. Los niveles de glucemia fueron estudiados a la 1 hora, 2 horas, 3 horas y 4 horas post medicación de los fármacos en estudio. Se empleo un glucómetro marca Abbott y (Blood Glucosa Test strips marca Abbott CPE0807130) para la determinación de glucosa en sangre. Resultados Los valores de glucosa previo al tratamiento con antinflamatorios no esteroideos fueron en promedio de 90-113mg/dL. Los niveles de glucosa con la administración de fenilbutazona y flunixin meglumine se muestran en tabla 1.

Tabla 1.- Niveles de glucosa en horas en caballos Pura Sangre de Carreras en el Hipódromo “La Rinconada”. Previo tratamiento Glucosa mg/dl

Hora 1 mg/dl

Hora 2 mg/dl

Hora 3 mg/dl

Hora 4 mg/dl

Fenilbutazona (3) equinos

90- 110- 100

108-126-131

112-128-130

115-130-131

130-132-134

Flunixin meglumine(3)

100-108-112

111-106-110

114-106-113

111-108-111

111-112-114

113

114

113

115

110

Fármaco

Solución fisiológica (1) equinos

Grafico 1.- Niveles de glucosa en horas en caballos Pura Sangre de Carreras en el Hipódromo “La Rinconada”.

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La fenilbutazona es un anti-inflamatorio no esteroideo (AINES), del grupo de las pirazolonas. Este actúa sobre el proceso inflamatorio, mediante la inhibición de alguno de los pasos del metabolismo del acido araquidonico. En equinos la concentración máxima en sangre se consigue a las 2-3 horas de su administración oral (biodisponibilidad del 70%) (Botana, et al., 2002; MacAllister, 1983). Con dosis suficientemente elevadas, los sistemas enzimáticos de metabolismo del fármaco (oxidasas de función mixta), se saturan y se produce la acumulación del mismo. De esta forma la semivida varía entre 3-10horas (Botana, et al., 2002). Presenta una gran liposolubilidad el volumen de distribución es bajo (alrededor de 0.1L/kg) debido a su alta afinidad por las proteínas plasmáticas (principalmente albúmina), cuyo nivel de unión es de 99% (Jones, 2005). La flunixin meglumine es un potente antinflamatorio no esteroideo de uso oral o parenteral (Botana, et al., 2002). Este inhibe las protaglandinas y leucotrienos, reestablece la presión sanguínea y atenúa el daño a los endotelios capilares (Botana, et al., 2002). Se observan niveles plasmáticos máximos de 3 ug/ml a los 30 minutos por vía oral y 10 ug/ml por vía endovenosa reflejando rápida absorción, casi un 80%, por vía digestiva. Por ambas vías se detecta una rápida declinación de los niveles máximos pudiendo observarse en orina como flunixin libre o sus metabolitos solo hasta 48 horas posterior a la última administración. No se describen, por ahora, efectos tóxicos de la droga incluso, al utilizar cinco veces la dosis recomendada

por un período de 5 días (Botana, et al., 2002). En virtud de esta importante área de estudio se plantea como objetivo describir los niveles de glucosa en sangre asociados a la administración de fenilbutazona y flunixin meglumine respectivamente en equinos.

AVFT

Introduccion

Discusión Se observaron cambios en los niveles de glucosa en los equinos medicados con antinflamatorios no esteroideos. Los niveles de glucosa en los equinos medicados con fenilbutazona fueron mayores en comparación con los caballos medicados con flunixin meglumine así como en el equino no medicado. Estos resultados coinciden con los reportados en la literatura (Jones, 2005; MacAllister, 1983). Los niveles de glucosa asociados a la administración de flunixin meglumine fueron superiores en comparación con el equino no medicado, pero inferiores con los equinos tratados con fenilbutazona. Estos resultados son similares a los reportados en la literatura para equinos Pura Sangre de Carreras (Colahan, 2002) y para Ponies (Fessler, et al., 2002). En conclusión se observan cambios significativos glucosa en sangre en los equinos medicados con fenilbutazona y flunixin meglumine respectivamente.

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Uso de ibopamina como test

de provocación en el diagnóstico de glaucoma

Resumen

Abstract

Propósito: el propósito del presente estudio fue el describir la respuesta ante el uso de ibopamina como test de provocación en individuos sanos con antecedentes familiares de glaucoma crónico de ángulo abierto.

Purpose: the purpose of the study was to evaluate the effect of ibopamine (3,4 di-isobutyrrylester of N-methyldopamine), on intraocular pressure (IOP) in healthy offspring of relatives with antecedent of primary open angle glaucoma.

Materiales y métodos: se seleccionaron individuos sanos con antecedentes familiares de glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) (Grupo I) e individuos sanos sin antecedentes familiares de GPAA (Grupo II). La prueba de ibopamina se realizó con la instilación de 2 gotas en cada ojo de cada individuo separadas por un lapso de 5 minutos. Se realizó medición de la presión intraocular (PIO) a los 45 minutos. Se consideró una respuesta positiva a la prueba si la PIO final era mayor o igual a 3 mmHg comparada con la PIO base.

Materials and Methods: healthy individuals with a family history of primary open angle glaucoma (POAG) and healthy individuals with no family history of chronic open angle glaucoma were selected. Ibopamine test was performed with the instillation of 2 drops per eye of each individual spaced at 5 minutes. Measurement of the intraocular pressure within 45 minutes was performed. A positive response to the test was considered if IOP was greater than or equal to 3 mmHg compared with the initial IOP.

Resultados: La PIO base en el grupo I fue de 14.4±2.49 mmHg y en el grupo II de 15.22±2.30 mmHg. La prueba resultó positiva en un 90% en el grupo I con un incremento promedio de la PIO de 6,86 mmHg, mientras que en el grupo II la prueba resultó negativa en la totalidad de los individuos incluidos.

Results: The mean initial IOP in group I was 14.4±2.49 mmHg, in group II was 15,22±2,30 mmHg. The test was positive in 90% in group I with an average increase of IOP of 6,86 mmHg while in group II, the test was negative in all individuals included.

Conclusiones: el uso de la ibopamina como fármaco estimulante de los receptores D1-dopaminérgicos y el consecuente incremento en la secreción del humor acuoso constituye una herramienta importante para la detección precoz de individuos asintomáticos con alteración potencial del sistema de drenaje ocular del humor acuoso.

Conclusion: the use of ibopamina as a drug to stimulate the D1 dopaminergic receptors and the consequent increase in the production of the aqueous humor is an important tool for early detection of asymptomatic individuals with potential alteration of the ocular drainage system.

Palabras claves: ibopamina, receptor D1-dopaminérgico, test de provocación.

Keywords: Ibopamine, D1-dopaminergic receptor, provocative test.

AVFT

Dr. Michele C. Petitto C. MD1, Dra. Julia De Gregorio Casale, MD, PhD2 1 Médico Oftalmólogo. Especialista en Glaucoma. Clínica de Ojos. Maracaibo. Estado Zulia. 2 Médico Especialista de Diagnóstico por Imágenes. Departamento de Ciencias Morfológicas. Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia. Uso de ibopamina como test de provocación en el diagnóstico de glaucoma

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Use of ibopamine as challenge test in the diagnosis of glaucoma

Introducción La ibopamina (3,4 di-isobutyrrylester de N-methyldopamina) en concentración al 2%, al ser instilada en el saco conjuntival, estimula los receptores D1-dopaminérgicos y los receptores α-adrenérgicos1,2. La ibopamina es una prodroga de la epinine (N-methyldopamine) (Figura 1). Los efectos farmacológicos oculares de la ibopamina son: ●Incrementa la producción de humor acuoso por estimulación de los receptores D1-dopaminérgicos. ●Puede ser utilizada en el tratamiento de la hipotensión ocular. ●Induce midriasis no ciclopléjica (acción α-adrenérgica).

Cuando se aplica ibopamina en ojos de individuos sin antecedentes de glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA), dicha instilación no incrementa la PIO; contrariamente, en individuos con GPAA la ibopamina induce un incremento en la PIO como consecuencia de la disfunción en las estructuras de drenaje del HA. El objetivo del presente estudio fue el de investigar el efecto de la prueba de ibopamina en individuos sanos con antecedentes de GPAA en alguno de sus padre y la respuesta en individuos sanos sin antecedentes familiares de GPAA.

Una vez aplicada en el saco conjuntival, la ibopamina sufre un proceso de hidrolización rápida por las estereasas contenidas en el humor acuoso, convirtiéndose en epinina. Esta hidrólisis sugiere que el componente activo es la epinina. La vida media de la ibopamina en el humor acuoso (HA) es corta (2 minutos) y la formación de la epinina precede la midriasis3,4.Se ha demostrado que luego de la instilación tópica ocular de la ibopamina, solamente la epinina puede ser encontrada en el humor acuoso3. Cuando se produce la hidrolización a epinina ocurre la estimulación de los receptores α-adrenérgicos y D1-dopaminérgicos. La midriasis producida por la ibopamina se debe a la estimulación de los receptores α-adrenérgicos de los músculos dilatadores pupilares. La ibopamina no ejerce ningún efecto en el músculo ciliar, por tanto la midriasis no se acompaña de cicloplejia. El efecto midriático puede ser antagonizado y revertido con la aplicación previa de agentes α-bloqueadores (thymoxamine y dapiprazole). Existen algunos trabajos de investigación en paciente con GPAA, que muestran un incremento de la producción del HA y de la PIO, después de estimular los receptores D15.

Materiales y métodos

La ibopamina tiene muy baja toxicidad tanto local como sistémica y carece de reacción taquifiláctica. La evaluación electrofisiológica demostró que la ibopamina no es retino tóxica6.

Se conformó un grupo control con individuos sin patología ocular y sin antecedentes familiares de GPAA.

Se incluyeron individuos sanos con antecedentes de diagnóstico de GPAA en por lo menos un padre e individuos sanos sin antecedentes familiares de GPAA. Todos los participantes entregaron un consentimiento informado por escrito. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: 1.- Edad comprendida entre 18 y 60 años. 2.- Los diversos registros de la PIO no debían superar los 18 mmHg en las tomas realizadas en los siguientes horarios: 8:00am, 12:00m, 4:00 pm y 8:00 pm. 3.- Estudio de campimetría automatizada estándar 30-2, normal. 4.- Registro fotográfico del nervio óptico sin alteración de su estructura. 5.- Ángulo de la cámara anterior abierto incluyendo en condiciones mesópicas de iluminación.

A los individuos seleccionados se les realizó: 1.- Historia clínica oftalmológica completa. 2.- Agudeza visual sin y con corrección. 3.- Curva tonométrica modificada con tonómetro de aplanación de Goldmann. Horario de los registros: 8:00 am, 12m, 4:00 pm, 8:00 pm. Se ajustaron los registros obtenidos según la paquimetria correspondiente en cada ojo. 4.- Biomicroscopia del segmento anterior. 5.- Gonioscopia. 6.- Perimetria automatizada estándar. Equipo Humphrey®. Programa 30-2. 7.- Biomicroscopia del fondo del ojo con lente de 78 dioptrías, bajo midriasis pupilar. 8.- Registro fotográfico del fondo del ojo.

●Aplicación de 1 gota de clorhidrato de proparacaina (Alcaine®, Alcon). ●Ibopamina solución oftálmica al 2% (reconstituida previamente y mantenida estrictamente bajo normas de refrigeración): o Instilación de 1 gota en cada ojo o Instilación de una segunda gota 5 minutos después de la anterior Registro de la PIO a los 45 minutos de la aplicación de la primera gota previa aplicación de anestésico tópico. La prueba de ibopamina se consideró positiva si la PIO se incrementaba 3 o más mmHg a los 45´ luego de la primera gota instilada. Los registros de la PIO fueron tomados por un mismo examinador. El examinador no tenía conocimiento de los de los antecedentes familiares de los sujetos incluidos en el estudio. Los pacientes fueron seleccionados por un médico colaborador en la consulta de la Clínica de Ojos de Maracaibo, estado Zulia, quien estaba en conocimiento de los antecedentes familiares del individuo seleccionado. El estudio fue realizado en el período comprendido: Marzo-Mayo, 2011. Análisis estadístico La data obtenida fue analizada con la prueba t de Student y con el test de correlación de Pearson. Los valores de p<0.01 fueron considerados estadísticamente significativos.

Resultados La tabla N°1 muestra las características demográficas de los dos grupos de estudio contemplados en el presente trabajo. Distribución por edad, sexo y PIO N° de Grupo pacientes M (n) F (n) (n)

Edad±DE (años)

N° de ojos (n)

PIO promedio±DE (mmHg)

29.8±7.25

14.40±2.49

26.8±6.46

15.22±2.30

Grupo 1: individuos sanos con antecedentes familiares de GPAA. Grupo 2: individuos sanos sin antecedentes familiares de GPAA. F: femenino. M: masculino. PIO: presión intraocular. DE: desviación standard.

Gráfico N °1.- Análisis estadístico de la PIO promedio de los dos grupos estudiados. IBO+Grupo 1: corresponde a los individuos con respuesta positiva a la ibopamina con antecedentes familiares de GPAA. IBO─Grupo 1: corresponde al individuo perteneciente al grupo 1 con respuesta negativa a la ibopamina. IBO─Grupo 2: individuos sin antecedentes familiares de GPAA con respuesta negativa a la ibopamina. En el gráfico N° 2 se muestra la correlación entre la PIO base y la respuesta a la ibopamina como diferencia expresada en mm de Hg, en los individuos pertenecientes al grupo I (antecedentes familiares de GPAA) se describió correlación positiva (r, 0.58, P=0.005). la línea roja muestra el límite sobre el cual la prueba se considera como positiva (PIO≥ 3 mmHg). En el gráfico N° 3 se muestra la correlación entre la PIO base y la respuesta a la ibopamina como diferencia expresada en mm de Hg, en los individuos pertenecientes al grupo II.

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Posteriormente, se realizó test de ibopamina siguiendo el protocolo propuesto por el Dr. Michele Virno, descrito a continuación:

El gráfico N° 1 muestra el análisis estadístico del promedio de la PIO en los dos grupos de estudio antes y posterior a la aplicación de la prueba de ibopamina. En el grupo I, nueve de los diez individuos estudiados (antecedentes familiares con GPAA), tuvieron una PIO promedio de 14,05±2,38 mmHg antes del test de ibopamina, comparado con una PIO promedio de 20,91±3,35 mmHg después de la instilación de ibopamina al 2%. Se registró incremento estadísticamente significativo de 6,86 mmHg (p<0,001)(test positivo en un 90%). El estudio mostró que 9 de los 10 participantes con antecedentes familiares de GPAA presentaron in incremento mayor o igual a 5 mmHg en el PIO posterior a la instilación de la ibopamina. Solamente en un participante del grupo I mostró una PIO inicial de 17,5 mmHg y una PIO post aplicación de ibopamina de 19,3 mmHg, con un diferencial en la PIO estadísticamente no significativo. En el grupo II, (10 individuos sin antecedentes familiares de GPAA) se registró una PIO promedio de 15,22±2,30 mmHg antes del test de ibopamina comparado con una PIO promedio post instilación de ibopamina de 14,74±2,43 mmHg. La diferencia no representó significancia estadística representativa.

AVFT

9.- Paquimetria

Gráfico N° 2. Correlación entre prueba de ibopamina y la PIO. Individuos sanos con antecedentes familiares de GPAA

El efecto hipertensivo que induce la aplicación de la ibopamina en ojo con alteración del sistema de drenaje del humor acuoso no se debe a su efecto midriático sino a su efecto estimulante sobre los receptores D1-dopaminérgicos11,12. No existen reportes de efectos adversos secundarios a la aplicación de la ibopamina en forma tópica13. La estimulación de los receptores D1-dopaminérgicos a través de la administración de la ibopamina induce incremento en la producción del humor acuoso siendo utilizado este efecto en forma eficaz para tratar hipotonía ocular por diversas etiologías, v.gr. maculopatia hipotónica secundaria a cirugía filtrante protegida, hipotonía secundaria a cuadros de uveítis crónica.14,15,16,17

Gráfico N°3. Correlación entre prueba de ibopamina y la PIO. Individuos sanos sin antecedentes familiares de GPAA.

Discusión

En estudios previos se ha demostrado que después de 45 minutos de la administración de ibopamina, se induce un incremento promedio en la PIO de 8.31±2.14 mmHg en 96% de globos oculares con GPAA1-3. Este aumento de la PIO puede durar por el lapso de 180 minutos (Gráfico N°4).

Otro punto importante es el reportado por varios estudios realizados en pacientes con glaucoma normotensivo en los cuales se registró incremento de la PIO post aplicación de ibopamina ≥ 3 mmHg lo cual sugiere alteración del sistema de drenaje en estos sujetos18. En el presente estudio se demostró que en el 90% de los individuos sanos con antecedentes familiares positivos para GPAA, la PIO sufría un incremento significativo posterior a la aplicación tópica de ibopamina al 2%. Estos resultados sugieren en forma importante la afectación de las estructuras involucradas en el drenaje del humor acuoso y se correlacionan con los resultados obtenidos en múltiples estudios19,20,21. La positividad de la prueba en personas sanas constituye un instrumento orientar de alta significancia para la evaluación oftalmológica funcional y estructural en esquemas periódicos para evitar la aparición de lesión progresiva e irreversible a nivel del nervio óptico. El diagnóstico precoz del GPAA constituye la piedra angular para el tratamiento adecuado de esta entidad. De manera que una de las principales dificultades que enfrentamos los oftalmólogos es el manejo de esta patología silente es el diagnóstico temprano antes que la enfermedad haya ocasionado lesiones anatomo-funcionales irreversibles. Una de las limitantes a recalcar en este estudio lo constituyó el bajo número de sujetos incluidos. Esto fue condicionado por el alto costo de la ibopamina en el momento del estudio y a la falta de financiamiento por alguna institución relacionada en el campo de la salud para la facilitación en la consecución de las divisas necesarias en los trámites comerciales. La ibopamina utilizada se obtuvo bajo la presentación de polvo liofilizado que era reconstituido en el momento de agrupar la mayor parte de pacientes ya que la misma tenía un tiempo de eficacia de 7 días en condiciones estrictas de refrigeración.

Conclusiones

El efecto hipertensivo de la ibopamina es dosis dependiente y su instilación repetida no induce taquifilaxia7,8,9,10.

La prueba de ibopamina al 2% constituye una herramienta relevante para el diagnóstico precoz de pacientes “sanos” con alteración del sistema de drenaje ocular del humor acuoso aún antes de detectar alteración correspondiente a hip-

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Referencias

AVFT

ertensión ocular. La edad promedio de los individuos sanos incluidos en el grupo con respuesta positiva a la prueba de ibopamina, correspondía a adultos en la tercera década de la vida. Grupo de edad en plena actividad productiva sin alteraciones en la evaluación oftalmológica funcional ni estructural del nervio óptico. Este punto representa un elemento de total relevancia, ya que colocaría en nuestras manos una herramienta para poder orientar en forma comprobada que ese individuo puede desarrollar neuropatía óptica secundaria a glaucoma en algún momento de su vida futura. Otra aplicación de la prueba de ibopamina la constituye su uso para evaluar el funcionalismo de la malla trabecular posterior a procedimiento quirúrgicos como la esclerectomia profunda no penetrante o la realización de trabeculoplastia selectiva con láser. La eventual positividad de la prueba después de la realización de estos procedimientos nos brindaría un alerta para la reintervención o indicación de terapia farmacológica adicional.

Gestión de la comunicación

de valores críticos en el laboratorio clínico

Communication management of critical values in clinical laboratory

Amelia Patricia Panunzio, MSc1*, Milagros Coromoto Núñez, MSc2, Tania María Molero, MSc3 Universidad del Zulia, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Departamento de Salud publica1, Departamento de Morfofisopatología2, Departamento de Quimica3 *Correspondencia: Amelia P. Panunzio, MSc. Universidad del Zulia, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Departamento de Salud Pública. Práctica Profesional Nivel IV, Maracaibo, Venezuela. Email: patrypan@hotmail.com

Resumen

Los valores críticos definidos por George Lundberg hace mas de 40 años, son resultados de los análisis de laboratorio que pueden reflejar un estado fisio patológico tan alejado de lo normal, que son una amenaza para la vida del paciente, si no se toma una acción rápidamente; su notificación clara, precisa y oportuna al personal clínico a cargo del cuidado del paciente, es una responsabilidad fundamental de los laboratorios, como aspecto esencial para la seguridad del paciente y como requisito de calidad en la fase post analítica exigido por las diversas organizaciones de acreditación en el contexto del laboratorio clínico. Los resultados de investigación y experiencias publicadas en la literatura, enfocan la gestión de comunicación de valores críticos, en la definición de los análisis de laboratorio y sus respectivos rangos de valores críticos, la notificación precisa y oportuna de estos resultados y la evaluación de la gestión; practicas que se describen significativamente variables entre los laboratorios de distintos países, tanto en el desarrollo de los procedimientos, como en el manejo de la comunicación, reconociéndose la necesidad de armonización. Las iniciativas actuales al respecto, dirigen la atención a la definición de los procedimientos centrados en el riesgo del paciente y la evaluación del riesgo, así como en la necesidad de evidencias basadas en los resultados de estudios que den cuenta del impacto de la gestión en la seguridad del paciente.

Abstract Critical values defined by George Lundberg over 40 years ago, are results of laboratory analyzes that can reflect a pathophysiological state so far from normal, which are a threat to the life of the patient, if no action is taken urgently; its clear, accurate and timely clinical staff of patient care, notification is a fundamental responsibility of laboratories, as essential to patient safety aspect as quality requirement in the post phase analytical required by the various organizations of accreditation in the context of clinical laboratory. Research results and experiences published in the literature focused communication management of critical values in the definition of laboratory tests and their respective ranges of critical values, accurate and timely these results and evaluation of management reporting; practices described variables significantly between laboratories in different countries, both in the development of procedures and management communication, recognizing the need for harmonization. Current regard, initiatives draw attention to the definition of procedures focused on patient risk and risk assessment, and the need for evidence based on the results of studies that account for the impact of management on the patient safety. Key words: Critical values, Clinical Laboratory, Patient Safety, Critical values notification

Palabras claves: Valores críticos, Laboratorio Clínico, Seguridad del paciente, Notificación de valores críticos Introducción En la práctica habitual los laboratorios clínicos en el análisis de muestras de pacientes, pueden generar resultados con implicaciones diagnósticas y terapéuticas que requieren de acción médica inmediata, porque pueden representar una condición de amenaza inminente de la vida del paciente o de deterioro clínico1; estos resultados fueron definidos originalmente por George Lundberg2 hace más de 40 años bajo el termino de valores críticos (valores pánico), referidos como

resultados de los análisis de laboratorio, que representan un estado fisio patológico tan alejado de lo normal que son una amenaza para la vida del paciente, si no es tomada una acción rápidamente2. Desde la primera definición de Lundberg1, una variedad de términos han sido descritos en la literatura, por ejemplo: alerta, urgente, agudos, anormal, significativamente anormal,

En este aspecto del desempeño de los laboratorio clínicos, sus profesionales a menudo se enfrentan con limitaciones para un efectivo proceso de comunicación de valores críticos, que va desde el establecimiento de criterios clínicamente relevantes para considerar la criticidad de un resultado, como en la resolución de dificultades en el procedimientos de notificación y confirmación de la recepción de los resultados críticos a los responsables clínicos del cuidado del paciente7. Los fallos en la comunicación de valores críticos, se reconocen como una causa potencial de eventos adversos en los pacientes, asociados entre otros, al retraso en la presentación de informes o por su falta de comunicación5,9,11-13. Por tanto, el rol del laboratorio clínico es clave para garantizar la seguridad del paciente, debiéndose responsabilizarse por la detección adecuada de este tipo de resultados, de su notificación efectiva y del seguimiento del desarrollo del proceso3-5,14. La importancia de la comunicación de valores críticos, ha sido reconocida por diversas agencias internacionales de acreditación en el contexto del laboratorio clínico y por organizaciones reguladoras en el ámbito de la atención de salud, como un requisito de calidad de la fase post analítica del proceso del laboratorio clínico. En los Estados Unidos de América, forma parte del estándar de acreditación de la Joint Commission (JC)15 y del College of American Pathologists (CAP)16; es un aspecto clave en la alianza mundial por la seguridad del paciente de la Organización Mundial de la Salud (OMS)17; el estándar de acreditación internacional, más ampliamente aceptado en la comunidad de laboratorios clínicos, la Norma ISO 15189: 201218, su homologación en distintos países, establece como requisito que los laboratorios dispongan de procedimientos para la inmediata comunicación de valores críticos al personal clínico responsable del cuidado del paciente. Los resultados de investigación y experiencias publicadas en la literatura, consistentes con las mejores prácticas para la seguridad del paciente, destacan la gestión de comunicación de valores críticos enfocada en: i) la definición de los análisis de laboratorio y sus respectivos rangos de valores críticos, ii) la notificación precisa y oportuna a los responsables clínicos

Definición de análisis de laboratorio y respectivos valores críticos La gestión de la comunicación de los resultados de análisis de laboratorio que pueden significar un estado fisiopatológico que es potencialmente peligroso para la vida, repercutir en la morbilidad, daños irreversibles o mortalidad y que requieren de atención y acción médica urgente1,2,11,21, prevé inicialmente la definición de los análisis de laboratorio y el establecimiento de los respectivos valores críticos, los cuales deben ser compilados en una lista, como parte de una política acordada entre el laboratorio y el personal clínico, dentro de un marco de tiempo determinado y de acuerdo a procedimientos establecidos para una comunicación efectiva19-21,24. Sin embargo, sobre qué análisis de laboratorio incluir en la lista y cómo se deben definir las distintas categorías de los resultados que necesitan notificación urgente, requiere de armonización porque la práctica es variable20-23. Las evidencias publicadas en la literatura sobre estudios desarrollados en países que gestionan la comunicación de valores críticos en sus instituciones12,20,22,25-29, muestran significativas variaciones en las listas de valores críticos, tanto en el contenido, como en la forma en la cual deben compilarse los análisis y respectivos rangos de valores críticos20-21. Se refiere que las variaciones, pueden ser atribuidas a diferencias determinadas por la población de pacientes y demanda clínica21,25, así como también a diferencias por la metodología analíticas de laboratorio empleadas entre las distintas instituciones7. Los resultados críticos, no sólo pueden ser valores cuantitativos o semi-cuantitativos, sino también, cualitativos que requieren de notificación de urgencia27,30. La formulación de la lista de análisis y el establecimiento de los respectivos valores críticos, debe ser prevista por cada laboratorio, tomando en cuenta las características de la población de pacientes que atiende el servicio, las enfermedades más prevalentes y su fisiopatología y el consenso del equipo de médicos de la institución, primeros destinatarios de tales resultados6,31-33, considerándose que además de la participación de jefes y miembros de los diferentes departamentos clínicos y quirúrgicos, incluir al personal de enfermería y la administración del hospital para determinar los análisis en la lista, de acuerdo a las necesidades clínicas y recursos existentes7,20,31.

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En la actividad que desempeña el laboratorio clínico como servicio de soporte al proceso de decisión médica, en gran parte de la práctica clínica, al proporcionar información en el ámbito del diagnóstico y tratamiento de enfermedades3-6, una de las funciones más importantes que tiene, es la comunicación en forma clara, precisa y oportuna de los resultados de los análisis clínicos y sobre todo la de aquellos resultados que requieren atención y acción médica urgente4,5,7-10.

el cuidado del paciente y iii) la evaluación de los resultados de la gestión19-21; prácticas que se describen significativamente variables en los laboratorios de distintos países, tanto en el desarrollo de los procedimientos, como en el manejo de la comunicación, considerándose necesaria la armonización de los procedimientos para mejorar la calidad del servicio y la seguridad del paciente13,20-23.

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clínicamente significantes, etc.; definiciones que son alternativas reformuladas de la descripción original, cuya característica principal es que son resultados inesperados, fuera del intervalo de referencia que pueden asociarse a un inminente riesgo para la seguridad y bienestar del paciente1.

Las iniciativas actuales dirigidas a armonizar los procedimientos para la gestión de comunicación de resultados de laboratorio que representan un riesgo para la seguridad del paciente, enfatizan en la consulta de los usuarios clínicos y la aplicación de principios de evaluación del riesgo para la compilación de la lista de los análisis y valores críticos, así como para el desarrollo del procedimiento de notificación precisa y a tiempo20,21. En relación a la fuente de información más confiable a ser empleada para el establecimiento de los valores críticos, no hay consenso21. En diversos estudios se ha descrito que los valores críticos deben ser determinados sobre la base de resultados clínicos, utilizando fuentes publicadas en la literatura o data obtenida a través de consenso de expertos (ej. guías nacionales o internacionales publicadas), por ser fuentes confiables, que se han perfeccionado con el tiempo, la comparación institucional y la práctica clínica7,22,25-27,30,33. Organizaciones en el contexto del laboratorio clínico, The International Federation of Clinical Chemestry and Laboratory Medicine (IFCC)34, así como instituciones, hospitales y centros de salud13,35, publican listas de valores críticos que pueden servir de utilidad para construir la propia lista de valores críticos y para los efectos de comparación.

consulta con los usuarios clínicos, con el objeto que refleje los cambios en las necesidades de la institución e incluya las nuevas pruebas o análisis y cambios de tecnología que puedan ir introduciéndose en el servicio11, 22, 26-27.. Procedimiento para la notificación precisa y oportuna El procedimiento de notificación precisa y oportuna de valores críticos comprende: la verificación del resultado, el tiempo de reporte, la especificación del personal que debe informar y quien debe recibir la información, los canales de comunicación a emplear para notificar la información y el registro de la notificación19-21,24. La detección del valor cítrico por parte del analista, da inicio al proceso de notificación; para lo que el laboratorio debe prever claramente cuando estará indicada una repetición, o algún tipo de verificación antes de su reporte, incluyendo las acciones que deben ser tomadas7. En relación a la verificación del resultado crítico antes del reporte mediante la repetición del análisis, tal como se describe en la literatura, ha sido una práctica común21. No obstante, ha sido muy cuestionada, argumentándose que tiende a retrasar la comunicación y agrega muy poco valor a la seguridad del paciente, lo que exige una reconsideración de tal práctica36,39-41.

Desde el 2001 el programa Q-Probes del CAP, ha sido una útil herramienta de comparación de los datos de valores críticos y sus rangos7,12,22.

Por otra parte, la verificación de un valor crítico, no siempre es posible considerando el tipo de análisis (ej. resultados de un hemocultivo)7.

La selección de los valores de corte de los distintos análisis, mediante la utilización de fuentes de información publicadas en la literatura, debe considerar la variabilidad inherente a la población de pacientes y metodología analítica de laboratorio empleada para los diferentes ensayos7,8,36.

De cualquier manera, en el desarrollo del proceso, la repetición del análisis para verificar un resultado crítico, debe ser estimada por el profesional del laboratorio responsable del análisis solicitado, sobre la base de la eficacia de los procedimientos de control de calidad, que deben garantizar la identificación de las fuentes potenciales de error durante todo el proceso de laboratorio clínico para comunicar solo resultados válidos3,27,33.

En general, las listas comprenden análisis de las diversas áreas del laboratorio, bioquímica, hematología, toxicología, microbiología, tanto de adultos y pediátricos pacientes7,33. Según lo descrito por algunos autores, en las listas se registra para cada análisis, tanto para propiedades ordinales como nominales, las unidades de reporte, los rangos o limites críticos y el periodo de tiempo para su notificación a los responsables de la atención del paciente11,24,37. En el diseño de la lista, es imprescindible cuidar meticulosamente su amplitud o contenido de valores críticos; se admite que un exceso de pruebas y sus resultados críticos, saturaría tanto al laboratorio como a los receptores de la información; así mismo, listas muy exclusivas podrían ser un factor limitante en la consecución del objetivo de la comunicación de valores críticos7,35.

Dentro del proceso de notificación, un indicador por excelencia, es el tiempo de reporte, lapso dentro del cual los resultados necesitan ser notificados, entendido éste, como el tiempo que transcurre desde la disponibilidad del resultado crítico, hasta su notificación al personal clínico responsable10,15,16,19,26. De acuerdo a lo descrito en estudios dirigidos por el CAP16, entre los 15 y 30 minutos a partir del momento que se identifique el valor critico como tal, podría ser un tiempo razonable para la notificación, en el caso de pacientes hospitalizados25,36,42,43.

La lista de valores críticos, una vez aprobada, debe estar disponible para el conjunto de profesionales que emiten y reciben los resultados del laboratorio38.

Sin embargo, el tiempo de reporte, debería ser determinado por cada laboratorio en consenso con los clínicos y considerando las características de la institución y los recursos disponibles21,38.

Asegurar la sostenibilidad de una adecuada gestión de valores críticos, requiere de un proceso de revisión continua y

En relación a quien debe informar un resultado crítico, en la mayoría de los estudios se registra que la responsabilidad,

De acuerdo a estudios llevados a cabo en distintos países12,22,24,26-29, la utilización del teléfono ha sido el modo de transmisión más común en la entrega de resultados críticos. También han sido descritas experiencias exitosas, en el empleo de la mensajería de texto para la trasmisión de tales resultados14,20. Sea el modo verbal o no verbal el que se emplee para la notificación, su recepción debería ser confirmada. Se refiere por varios autores que en la notificación verbal, quien notifica debe recibir la confirmación que la información se recibió correctamente11,16,22,25,27. En el caso de trasmisión de resultados a través de modos no verbales, el destinatario debe confirmar su recepción en un periodo de tiempo pre determinado7,37. Frente a los avances en el campo de la información y la innovación tecnológica los laboratorios tendrán que adaptar la gestión a nuevas oportunidades para garantizar las mejores prácticas4,20,21. Como en todos los procesos de calidad en el laboratorio clínico, el desempeño de la gestión de comunicación de valores críticos, debe ser documentado18-21,23,24. La documentación es la evidencia, a través de registros, de la manera como se manejan los procedimientos. En cuanto a este aspecto dentro de la gestión, la documentación de la notificación debe contener: la fecha y la hora en la cual la notificación fue realizada, la identidad del paciente, fecha y hora en la cual la muestra fue tomada, el análisis realizado, el resultado con sus respectivas unidades de medida, la identidad del receptor de la notificación y fecha y hora de la confirmación de haber recibido la información7,11,16,18,33. Los registros deben ser confiables y deben además incluir todo factor relevante relacionado con las dificultades encontrados durante el desarrollo del procedimiento21. Evaluación de la gestión de comunicación de valores críticos En los resultados de investigación y experiencias publicadas en la literatura médica sobre este contexto, existe consenso en recomendar que en la gestión de comunicación de valores críticos, se incorporen procedimientos para el seguimiento de la eficacia de la gestión y poder establecer mejoras oportunas en conjunto con los servicios clínicos involucrados4,19-21,24.

La lista de análisis y respectivos valores críticos deberá ser revisada periódicamente en consulta con los usuarios clínicos, con el objeto que refleje los cambios en las necesidades de la institución e incluya las nuevas pruebas o análisis y cambios de tecnología que puedan ir introduciéndose en el servicio11,22,26-27. El desempeño en la notificación y recepción de valores críticos debe ser monitoreado para la identificación de problemas que deben tratarse y el seguimiento del proceso en el tiempo3,4,11,19,33. El proyecto “Errores de Laboratorio y Seguridad del Paciente” liderado por un grupo de trabajo de la IFCC45, especifica indicadores aplicables para evaluar y monitorear el desempeño de la notificación de valores críticos en la fase post analítica del proceso de laboratorio clínico, que incluyen: i) el porcentaje de valores críticos que se comunican ii) el promedio de tiempo empleado en la comunicación y iii) el porcentaje de valores críticos comunicados para los cuales se ha recibido confirmación; aplicables tanto para pacientes hospitalizados como ambulatorios4,19,46. Garantizar una gestión de comunicación de valores críticos en el laboratorio clínico, concretamente eficaz y funcional requiere considerar que las variables en grado de influenciar la eficiencia del proceso son múltiples. Con el tiempo se espera que las evidencias emergentes sobre la eficacia de los procedimientos y la innovación tecnológica encaminen la armonización de la gestión para la mejora del servicio y la seguridad del paciente11,19,31.

Conclusión La gestión de la comunicación de valores críticos, varía ampliamente en los laboratorios clínicos y la necesidad de armonización ha sido reconocida universalmente. Las iniciativas de armonización dirigen el foco de atención a la definición y establecimiento de los procedimientos, centrados en el riesgo del paciente y la evaluación del riesgo, lo que requerirá de una estrecha interacción entre laboratorio y personal clínico clave; así como de mayor evidencia basada en los resultados de estudios, que den cuenta de las mejores prácticas en el desarrollo de los procedimientos y del impacto de la gestión en la seguridad del paciente.

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La gestión de comunicación de estos resultados debe ser parte de una política compartida entre el laboratorio y el personal clínico responsable del cuidado del paciente21.

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es del analista de laboratorio clínico que tuvo a cargo la realización del análisis6,7,21,26,27,44; en cuanto a quien debe recibir la información del resultado crítico, el médico inmediatamente responsable del cuidado del paciente, es el personal comúnmente referido6,7,11,16,18,21,26,27,38.

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PARVOVIRUS B19:

¿un agente endémico en el estado Zulia? B19 PARVOVIRUS: An endemic agent in Zulia state?

Édixon Ochoa B.1, Melchor Álvarez de M.2, Nereida Valero C.1. 1 Sección de Virología, Instituto de Investigaciones Clínicas “Dr. Américo Negrette”, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia. 2 Cátedra de Medicina Interna, Departamento de Medicina, Universidad de Alcalá. Instituto de Investigaciones Clínicas “Dr. Américo Negrette”, Sección de Virología. Facultad de Medicina, La Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela. Apartado Postal N° 23. Autora de Correspondencia: Nereida Valero, PhD. La Universidad del Zulia. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Clínicas. Maracaibo, Venezuela. Correo electrónico: valero.nereida@gmail.com Teléfono: 58 414-3624181

Resumen

Abstract

Parvovirus B19 (PB19) es un virus perteneciente a la familia Parvoviridae, como patógeno es causante del eritema infeccioso o quinta enfermedad, así como también de otras enfermedades reumatológicas y hematológicas. Aún cuando Parvovirus B19 (PB19) ha sido descrito esencialmente como patógeno causante de enfermedad exantemática en lactantes, preescolares y escolares, no debe ignorarse su papel como inductor de enfermedad hematológica y reumatológica aguda y crónica en adultos. En el caso de Venezuela, las investigaciones realizadas entre 2006 y 2012, revelan una significativa circulación anual y continua de PB19 en la población lactante, preescolar, escolar, adolescente y adulta del estado Zulia, la cual trascurre desapercibidamente en nuestro medio ante un enfoque casi exclusivo en el diagnóstico de otras enfermedades virales predominantes en nuestro medio, significando así la presencia de un problema de salud pública. Por tal motivo, resulta ostensible un seguimiento continuo de esta situación, y una profundización en el conocimiento de las diferentes formas clínicas de la infección por PB19, por cuanto también pueden afectar a la población antes citada. Todo ello en aras de su detección inicial apropiada y su prevención efectiva, evitando así las notables consecuencias clínicas que a la población susceptible puede acarrear.

Parvovirus B19 (PB19) is a virus belonging to the family Parvoviridae as pathogen is causing erythema infectious or fifth disease, as well as other rheumatic and hematologic diseases. Although Parvovirus B19 (PB19) was essentially as described pathogen causing rash illness in infants, preschool and school, must not ignore its role as an inducer of hematologic disease and acute and chronic adult rheumatology. In the case of Venezuela, research conducted between 2006 and 2012 reveal a significant annual and continuous movement of the infant population PB19, preschool, school, teen and adult Zulia state, which elapses unnoticed in our approach to almost unique in the diagnosis of other viral diseases prevalent in our environment, thus signifying the presence of a public health problem. Therefore, it is ostensible continuously monitor this situation and a deeper knowledge of the different clinical forms of infection PB19, because they may also affect the aforementioned population. All this for the sake of its proper initial detection and effective prevention, avoiding notable clinical consequences that may entail the susceptible population.

Palabras clave: Parvovirus B19, agente endémico, estado Zulia.

Keywords: Parvovirus B19, endemic agent, Zulia state.

PB19 se distribuye mundialmente, afectando comúnmente a niños de 4 a 11 años. Su mayor incidencia en los países estacionales ocurre al final del invierno y comienzos de la primavera, mientras que en los países tropicales los casos de infección se presentan durante todo el año. Se transmite principalmente por medio de las secreciones respiratorias, así como también por vía parenteral (administración de productos sanguíneos y ejecución de tatuajes) y transplacentaria (madre – feto). Igualmente, se afirma que la infección por PB19 está ampliamente distribuida, lo cual se ha inferido a partir de la elevada prevalencia de anticuerpos IgG en la población mundial, encontrada en rangos variables, e incrementada con la edad2. La prevalencia mundial se halla cerca del 2-5% en niños de 1 – 5 años de edad, 15-60% en niños de 6 – 9 años, 30 – 60% en adultos y más del 85% en ancianos3. Para generar una infección, PB19 requiere multiplicarse en células que se dividen rápidamente, de manera que posee un acentuado tropismo por las células eritroides progenitoras, uniéndose a los eritrocitos por medio del antígeno P de los grupos sanguíneos. En la infección por PB19 ocurre una respuesta tipo IgM 10 días después de la misma, y una semana después se produce la IgG. El período de incubación oscila en un rango de 4 y 20 días, previo a la aparición del exantema o los síntomas de crisis aplásica. El período de transmisibilidad para el eritema infeccioso comprende aproximadamente una semana antes de la aparición del brote cutáneo y, en la crisis aplásica, hasta una semana después del comienzo de los síntomas4. No obstante su tropismo por A pesar de su fuerte tropismo por las células eritroides progenitoras, ha podido determinarse que PB19 puede persistir en tejidos no eritroides, como: colon, corazón, hígado, testículo y tiroides. Igualmente, se ha asociado el ARNm y las proteínas de la cápside de PB19 con un aumento de la expresión del gen relacionado con la inflamación5. Entre el 20 y 50% de los pacientes, tanto niños como adultos, la infección por PB19 puede ser asintomática, incluso en los brotes epidémicos. Sin embargo, son comunes las presentaciones clínicas de la infección, en especial el eritema infeccioso o quinta enfermedad, la cual afecta a niños de 4 a

Otras manifestaciones clínicas de PB19 son: la poliartropatía, que ocurre en el 10% de los niños y en el 90% de los adultos, consistente en una poliartritis simétrica y periférica, concomitante con artralgia y edema moderado de 10 días de duración; el hidrops fetal, consistente en un cuadro de anemia grave, falla cardíaca congestiva, edema generalizado, derrame pleural, polihidramnios y posible muerte fetal; la crisis aplásica, que comprende un cuadro de aplasia eritrocítica con anemia hemolítica de base y, ocasionalmente, pancitopenia, autolimitada en ambos casos; la anemia crónica, común en pacientes inmunosuprimidos; y variedades de enfermedad reumatológica como vasculitis sistémica, púrpura de Henoch – Schoenlein, enfermedad de Kawasaki y LES7. También se ha demostrado la posibilidad de coinfección de PB19 con herpesvirus causantes de síndrome mononucleósico. Así lo aseveran Sahiner y cols. (2014) quienes, luego de realizar la PCR en 56 muestras de tejido amigdalino tomadas de 44 niños y 12 adultos, encontraron que de aquellas muestras 53,6% (30/56) fueron positivas para virus de Epstein-Barr, 21,4% (12/56) para PB19, 12,5% (7/56) para adenovirus, 5,4% (3/56) para CMV y 1,8% (1/56) para herpes simplex. Así mismo, PB19 estaba presente en alto número de copias (>500.000 copias/ml) en las muestras amigdalinas respecto a los demás virus, VEB y PB19 fueron mayores en los niños que en los adultos, y, además, se encontró una relación positiva entre la presencia de VEB y PB19 (P = 0,037)8. En individuos inmunocompetentes con infección reciente pueden demostrarse anticuerpos séricos de tipo IgM mediante ELISA, que aparecen una semana después de la viremia, permanecen en suero algunos meses y después son sustituidos por IgG que se mantienen indefinidamente. Al momento de aparecer las IgM, habitualmente no puede ya detectarse PB19 en suero. En sujetos con anemia hemolítica y crisis aplásica transitoria, por el contrario, pueden detectarse durante esta fase tanto IgM como virus y ADN viral en suero9. Debe considerarse que en pacientes inmunocomprometidos puede no detectarse anticuerpos en suero, por lo cual la presencia de PB19 debe corroborarse mediante inmunohistoquímica, o técnicas de genética molecular como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la hibridización del ácido nucleico, en todos los casos sospechosos con negatividad para búsqueda de anticuerpos específicos. El diagnóstico en fetos se sospecha con la presencia de hidrops e IgM materna, y se confirma demostrando ADN viral en líquido amniótico o sangre fetal9. Por otra parte, en individuos asintomáticos se ha reportado la latencia de PB19 en piel, membrana sinovial, miocardio y médula ósea. De allí que en un estudio se efectuaran 70 necropsias en adultos seropositivos (60%) y seronegativos

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 34, número 4, 2015

Parvovirus B19 (PB19) es un virus perteneciente a la familia Parvoviridae, siendo el único miembro de la misma asociado a enfermedad en humanos. Fue descubierto accidentalmente en 1975 en donantes sanguíneos asintomáticos, a quienes se les buscaba el antígeno de superficie de la hepatitis B. Respecto a sus características taxonómicas, este virus mide 18 – 26 nm de diámetro y posee una cápside icosaédrica no envuelta. Su genoma contiene una molécula de ADN de banda única, la cual puede tener sentido positivo o negativo y hallarse empaquetada separadamente del virión. Se conoce un único serotipo, el cual se clasifica dentro del género de los Erythrovirus1.

7 años de edad, estando caracterizada por un eritema facial moderado en las mejillas y semejante a una bofetada6.

AVFT

Introducción

(40%), según la detección de IgG anti PB19. En dichos pacientes, se practicó la PCR para detección de ADN viral en miocardio, hígado, riñón y médula ósea. De acuerdo con los resultados, el genoma viral fue detectado mayormente en las muestras de miocardio (34,3%), seguido de las muestras de médula ósea (20%), riñones (10%) e hígado (8,6%), no existiendo una significativa diferencia en las tasas de persistencia por cuanto la misma varió de 8,3% a 36% en el grupo seropositivo, y de 10% a 30% en el grupo seronegativo7. La infección por PB19 es benigna, transitoria y autolimitada, de manera que el tratamiento resulta innecesario. En el caso de la artropatía, se prescribe el empleo de antiinflamatorios no esteroideos (AINES). En la afectación fetal grave está indicado el tratamiento con inmunoglobulinas e, incluso, se ha llegado a aplicar transfusión intrauterina. El tratamiento de la infección persistente en los pacientes inmunodeprimidos se efectúa con inmunoglobulinas por vía intravenosa a dosis altas: 400 mg/ kg/día durante cinco días o 1000 mg/kg/día durante dos días, con la cual se alcanza la desaparición de la viremia4. Epidemiología En el ámbito mundial, se observa que Parvovirus B19 circula en países desarrollados y en vías de desarrollo, causando brotes infecciosos de importancia en los diferentes grupos de riesgo. Véase el caso de Portugal, donde se realizó un estudio observacional para determinar la prevalencia de PB19 y VHA en donantes de sangre. Durante cuatro meses, en 2005, se recabaron 5.025 donaciones de plasma, de los cuales se aislaron ácidos nucleicos mediante MagNA Pure LC (Roche, Mannheim, Alemania) y PCR en tiempo real (LightCycler, Roche). Ésta se utilizó para amplificar y detectar ácido nucleico, utilizando kits del fabricante. Tras el estudio, se encontró una prevalencia de 0,12 % para PB19 y 0% para el VHA10. 72

Por su parte, en Belarrús, extremo oriental de Europa, un estudio por ELISA en sueros de 906 pacientes con fiebre y exantema, negativos para sarampión y rubéola y recolectados entre 2005 y 2008, demostró positividad para PB19 en más del 35% de las muestras (322/906). Asimismo, los brotes de PB19 acontecieron durante el período de invierno a primavera, pero los casos esporádicos se registraron básicamente durante todo el año. La prevalencia fue mayor en pacientes de 2-10 años (56,5%), con una afectación del 27,3% en individuos de 19-53 años11. Siguiendo el orden de las ideas, una encuesta seroepidemiológica en Japón señaló la prevalencia de la infección por PB19 en individuos de 0-4 y 5-9 años, con una tasa de 0,05 y 0,12 por año, respectivamente, resultando mayor que la encontrada en pacientes de mayor edad (<0,01). Al mismo tiempo, esta investigación confirmó la detección de antígenos específicos contra PB19 entre los donantes de sangre japoneses, principalmente en aquello de 30-39 años, y una casuística anual de 107 muertes fetales y 21 casos de hidropesía fetal por infección en mujeres gestantes12. Por otra parte, El Kissi y col. (2014) realizaron un estudio

seroepidemiológico de casos y controles en el Departamento de Psiquiatría del Hospital General Farhat Hached en Sousse, Túnez, para el cual se seleccionaron 108 pacientes esquizofrénicos y 108 controles sanos libres de cualquier trastorno psicótico y emparejados por edad y sexo. Se recolectaron datos sociodemográficos, historia clínica, comorbilidad y factores de riesgo para infecciones, así como también muestras de suero para determinación de IgM e IgG anti-PB19 mediante la técnica de ELISA. De acuerdo con los resultados, la prevalencia de anticuerpos IgG a PB19 fue significativamente mayor en los pacientes esquizofrénicos que en los controles (73,1% frente a 60,2%; P = 0,04), no existiendo diferencias estadísticas entre ambos grupos grupos respecto a la prevalencia de IgM anti-PB19. Por otra parte, no se encontró asociación entre prevalencia del virus y datos sociodemográficos, factores de riesgo para infección o características clínicas13. A escala continental, se cuenta con una investigación en Córdoba, Argentina, en la cual se analizaron por detección de ADN viral e IgM e IgG anti-PB19 específicos IgM e IgG los sueros de 141 pacientes con fiebre y exantema, y negativos para sarampión y rubéola. Dichas muestras fueron recolectadas en el período 2005-2009, simultáneamente se tomaron muestras de 31 individuos aparentemente sanos. El análisis confirmó la presencia de PB19 en el 14,9% de los casos, y en el 39,1% durante 2007. El ADN viral se detectó en pacientes con positividad para IgM (47,6%) e IgG (2%) y controles sanos (9,7%), indicando infección a largo plazo en <10% de los individuos inmunocompetentes. Por otra parte, los pacientes con infección aguda PB19 reportaron fiebre y exantema, además de adenopatías (85,7%) y artropatías (14,3%). Cabe destacar que fue éste el primer estudio de seguimiento de los marcadores de infección e inmunidad para PB19 en Argentina14. Igualmente, en Brasil, 47 pacientes con hemoglobinopatías (37 con enfermedad de células falciformes, y 10 con β - talasemia mayor) y 47 donantes de sangre sanos fueron examinados para detección de PB19 mediante IgG anti-PB19 determinada por inmunoensayo enzimático, PCR cuantitativa y secuenciación de ADN. La presencia de viremia fue demostrada en el 19,1% de los pacientes, todos los donantes fueron negativos para ADN de PB19, y la IgG anti-PB19 se detectó en el 55,3 % de los pacientes y el 57,4 % de los donantes15. En Venezuela, el arqueo de fuentes revela la aparente inexistencia de investigaciones realizadas en el interior del país referentes a la presencia de PB19. No así en el estado Zulia, donde una serie de estudios científicos de orden serológico y epidemiológico llevados a cabo en la primera década del siglo XXI y comienzos de la segunda, han demostrado una importante circulación de PB19, tanto en neonatos, lactantes y preescolares, como también en adolescentes y adultos, inclusive. La primera evidencia es señalada por González y col. (2006), quienes reportaron, tras un estudio comparativo de técnicas para detección de PB19 en pacientes con crisis aplástica, un

Del anterior estudio se destacó la circulación de PB19 visible en su alta prevalencia entonces detectada en la población zuliana, muy especialmente en los adultos jóvenes, y predominante en las zonas urbanas por cuanto los municipios Cabimas (23,19%) y Maracaibo (18,84%) concentraron el mayor volumen de casos. Se sugirió entonces la vinculación entre PB19 y síndrome febril hemorrágico, presente en la población objeto de estudio3. Sin embargo, un estudio posterior fue realizado por Ochoa y col. (2011) a partir de 114 muestras de niños <1 año – 9 años recolectadas durante enero 2010 – diciembre 2011 reveló resultados complementarios. En el mismo, las muestras fueron seleccionadas según los criterios epidemiológicos y clínicos, detectándose esta vez IgM anti-PB19 mediante la técnica de ELISA. De las 114 muestras analizadas 59 (51,7%) arrojaron positividad para PB19, donde 7 (11,8%) correspondieron al grupo etario de <1 año, 27 (45,7%) al grupo de 1 – 4 años y 24 (40,6%) al grupo de 5 – 9 años, no demostrándose diferencias. La distribución anual en 2010 mostró un pico máximo en agosto con 26,31%, mientras que en 2011 el mayor número de casos se registró en noviembre con 28,5%, pero en ambos años fue continua la detección de casos positivos por mes17. Más adelante, en 2012, Ochoa y col. efectuaron una nueva investigación a partir de 31 muestras de adolescentes y adultos durante el período junio – noviembre de 2012, seleccionados según criterios etarios, clínicos y de negatividad para IgM sérica anti-dengue, detectándose IgM anti-PB19 mediante la técnica de ELISA. De las 31 muestras analizadas 17 (54,8%) resultaron positivas para PB19, donde 4 (23,5%) correspondieron al grupo etario de 10 – 14 años, 3 (17,6%) al grupo de 15 – 24 años, 9 (52,9%) al grupo de 25 – 44 años y 1 (5,8%) al grupo de >45 años. Estos hallazgos confirman que PB19 afecta de manera notable a adolescentes y adultos jóvenes, conforme lo señalado por Maldonado y col. en 2006, sin exceptuar a la población de lactantes, preescolares y escolares, los cuales continúan siendo el principal grupo etario afectado por este agente viral18.

Las evidencias derivadas de las investigaciones antes referidas corroboran la significativa circulación de PB19 en el estado Zulia, la cual trascurre desapercibidamente en nuestro medio ante un enfoque casi exclusivo en el diagnóstico de otras enfermedades virales predominantes en nuestro medio, tales como dengue y mononucleosis infecciosa. Además, dicha circulación se expresa en brotes infecciosos de carácter endémico que transcurren con oscilaciones anuales, y que afectan a lactantes, preescolares, escolares, adolescentes y adultos de la región. Así mismo, puede considerarse que el hallazgo de la circulación de PB19 en el estado Zulia bien podría significar la presencia de un relevante problema de salud pública que pudiera estar aconteciendo subrepticiamente, producto de la exclusividad de enfoque diagnóstico antes referida. En tal sentido, resulta ostensible un seguimiento continuo de esta situación, y una profundización en el conocimiento de las diferentes formas clínicas de la infección por PB19, por cuanto también pueden afectar a la población antes citada. Todo ello en aras de su detección inicial apropiada y su prevención efectiva, evitando así las notables consecuencias clínicas que a la población susceptible puede acarrear.

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Posteriormente, Maldonado y col. (2006) efectuaron una investigación a partir de 188 muestras de suero de individuos entre 1 – 75 años de edad, recolectadas entre enero de 2005 y marzo de 2006, en los cuales se detectó IgG anti-PB19 por medio de la técnica de ELISA. De las mismas, un 73,40% resultaron positivas para PB19, situándose el mayor porcentaje de casos positivos en el grupo de adultos jóvenes, con un 31,92%, seguido de los adultos medios (22,34%), los escolares (18,09%), adultos mayores (9,57%), preescolares y adolescentes (8,51%)3.

Conclusiones

AVFT

72,4% de prevalencia de IgG anti – PB19 en dichos pacientes, frente a un 46,6% de prevalencia en el grupo control. Estos resultados sugieren, conforme a la evidencia serológica, la existencia de una asociación entre crisis aplástica e infección por PB19, así como también una actividad importante de este agente viral en nuestra población16.

11.

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