Revista avft 3 2014 by felipe espino

Contenido

Modelos animales para el estudio de la infección por el género Helicobacter Animal models for the study of infection of th genus Helicobacter A. Morales Briceño, A. Méndez Sánchez, M. Morales Briceño.

Pubertad precoz central secundario a hamartoma hipotalamico Precocious central puberty secondary to hypothalamic hamartoma Carmen Dávila, Joselyn Rojas, Valmore Bermúdez.

Resistencia a aminoglicosidos y quinolonas en un equino con esofagitis reporte de un caso Aminoglycosides and quinolones resistance in a equine with oesophagitis report of case Morales A, ¹García F, Morales MR, ²Leal L, López P.

ISSN 0798-0264

Señalización de la adrenomedulina en el vermis del cerebelo de la rata (adrenomedullin signaling in rat cerebellar vermis)

Depósito Legal pp. 198202DF62 www.revistaavft.com e-mail: revista.avft@gmail.com

Adrenomedullin signalling in rat cerebellar vermis Figueira Leticia e Israel Anita

Volumen 33, Número 3, 2014

Sociedad Venezolana de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica Dirección: Escuela de Medicina José María Vargas, Cátedra de Farmacología, piso 3, Esquina Pirineos, San José. Caracas - Venezuela. Telfs.:(0212)5619871 - (0414)1361811 (0414) 3805405 Fax: (0212)3214385 www.revistaavft.com e-mail: revista.avft@gmail.com Historia de la revista: AVFT nació en 1982 como una necesidad de tener en Venezuela y Latinoamérica de una revista científica que publique la investigación farmacológica básica y clínica de nuestro país y América Latina, así como la investigación en otras ciencias básicas como Bioquímica, Fisiología, Fisiopatología e Inmunología. Simultáneamente con su creación, también se fundo la Sociedad Interamericana de Farmacología Clínica y Terapéutica y la Sociedad Venezolana de Farmacología y Terapéutica, inmediatamente AVFT se convirtió en el Órgano Oficial de las Sociedades Venezolanas de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica. Se solicito la indización en el Index Médico Latinoamericano y luego AVFT fue seleccionada en los Índices Extramed de la Organización Mundial de la Salud y en el Latinoamericano de Revistas Científicas de la Universidad Autónoma de México. Desde hace una década el FONACIT y el CDCH la apoyan económicamente y la han seleccionada en el Núcleo de Revistas del FONACIT. El FONACIT considera a AVFT como una de las revistas científicas venezolanas arbitradas con contenido más original y de mayor interés. Algunos investigadores connotados como Marcelo Alfonzo, ltala Lippo de Becemberg, Alicia Ponte Sucre, Anita Israel, Luigi Cubeddu, etc. han escogido a AVFT para publicar sus hallazgos básicos y clínicos por su arbitraje, difusión e indización. Actualmente se ha remozado el Comité Editorial y los formatos adecuándolos a las exigencias de índices internacionales como el SCI, Excerpta Medica y Current Contents. A partir de 2002 AVFT se publicará cuatrimestralmente dado la mayor demanda científica. AVFT tradicionalmente ha publicado las reuniones anuales de Farmacología, ASOVAC, Facultad de Farmacia, del Instituto de Medicina Experimental y de Congresos de Farmacología organizados en nuestro país. Periodicidad Trimestral Título abreviado: AVFT

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3.1. Título del artículo, conciso pero informativo.

a. Corto encabezamiento de página, no mayor de cuarenta caracteres (contando letras y espacios) como pie de página, en la página del titulo con su respectiva identificación.

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e. La fuente que ha permitido auspiciar con ayuda económica: equipos, medicamentos o todo el conjunto. f. Debe colocarse la fecha en la cual fue consignado el manuscrito para la publicación.

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car como tales: 3-10 palabras claves o frases cortas que ayuden a los indexadores en la construcción de índices cruzados de su artículo y que puedan publicarse con el resumen, utilice los términos del encabezamiento temático (Medical Subject Heading) del Index Medicus, cuando sea posible.

5. En cuanto al texto, generalmente debe dividirse en: introducción, materiales y método, resultados y discusión.

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Modelos animales

para el estudio de la infección por el género Helicobacter Animal models for the study of infection of th genus Helicobacter

A. Morales Briceño¹, A. Méndez Sánchez¹, M. Morales Briceño². 1Departamento de Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas. Edificio de Sanidad Animal, Campus de Rabanales Ctra. de Madrid km 396, 14071, Córdoba Universidad de Córdoba. España. ²Ejercicio Privado Laboratorio de Microbiología.

Recibido: 20/10/2013

Aceptado: 21/11/2013

Introducción

Helicobacter pylori y organismos asociados a Helicobacter (HLO: Helicobacter like organisms), son microorganismos espiralados-curvos o coccoides, Gram negativos, habitantes de las glándulas gástricas, células parietales y del moco estomacal. Estas bacterias están asociadas a enfermedad inflamatoria y ulceración de la mucosa gástrica (gastritis aguda, gastritis crónica, ulceración gástrica y gastropatías). El número de especies del genero Helicobacter rápidamente se ha expandido desde la pasada década (Fox, 2002). El género ahora incluye por lo menos 24 nombres formales de especies, así como existen numerosas especies de Helicobacter esperando por su identificación formal (Fox, 2002). Ellos han sido clasificados en base a su secuencia 16rRNA , DNA hibridización y su morfología en microscopia electrónica en especies de Helicobacter Gástricas: Helicobacter mustelae, H. felis, H. bizzozeronii, H. salomonis, H. heilmannii, H. acinonychis, H. nemestrinae, H. suncus, Candidatus Helicobacter bovis, Candidatus Helicobacter suis, Gastrospirillum suis y especies de Helicobacter Enterohepaticas: Helicobacter hepaticus, H cinaedi, H. fennelliae, H. pametensis, H. pullorum, H. canadensis, cholecystus, H. mesocricetorum, H. rodentium, H. typhlonicus, H. muridarum, H. flexispira, H. bilis, H. trogontum. La patogénesis de la virulencia de H. pylori- HLO se sustenta en la presencia de dos subunidades compuestas de Ureasa (564 kDa) y un porcentaje total de proteína celular (2%) que se asocia con fallas en el efecto buffer del moco, acúmulo excesivo de Amoníaco y fallas del metabolismo de éste, por las células gástricas. La presencia de flagelos en el Helicobacter indican que la motilidad juega un papel fundamental en la colonización de esta bacteria en las células gástricas (Solnick and Schauer, 2001). La adherencia de Helicobacter a la mucosa gástrica, previa a la colonización intracelular gástrica se conoce que ocurre pero se desconocen los mecanismos envueltos. Sin embargo, la bacteria posee aglutininas que pueden ser inhibidas por proteasas, calor y tripsina. La presencia de Lipopolisacaridos (LPS) capsulares ha sido observado en H. pylori. Aunque este aspecto

no ha sido definido en la virulencia del genero Helicobacter, se acepta el rol que juega el LPS en combinación con los antígenos de las células del huésped para evadir y regular la respuesta inmune contra Helicobacter, favoreciendo así la colonización e infección crónica de esta importante bacteria (Solnik and Schauer, 2001). El uso de los modelos animales para el estudio de la Helicobacteriosis ha sido amplio a nivel mundial, lo cual ha permitido grandes avances en cuanto al conocimiento de la epidemiología, infección y patogenía de Helicobacter especies en la enfermedad gástrica humana. Modelos Animales para el estudio de la infección por el género Helicobacter En la literatura han sido descritos modelos animales experimentales para H. pylori y otras Helicobacter (HLO) específicos por especies. Los hurones o ferrets (Mustela furo), han sido ampliamente utilizados para la infección por H. mustelae con 99% de colonización exitosa a su vez se ha logrado colonización de H pylori con 50% de colonización proveniente de aislados humanos (Dubois, 1998). En ratones y ratas de laboratorio (Mus musculus) son los de mayor uso y aplicación principalmente en la terapéutica. Los ratones y ratas son colonizados por H. muridarium, H. mustelae, H. felis, H. heilmannii, e inclusive H. pylori con 100% de colonización. Primates no humanos: son de gran importancia por las características genéticas e inmunológicas con los humanos. Los lémures (Hapalemur aureus) han sido ampliamente utilizados, seguidos por el mono rhesus (Macaca mulatta), el mono japonés (Macaca fuscata) e inclusive chimpancés (Pan troglodytes), principalmente con H. pylori y en la antibióticoterapia (Dubois, 1998). El modelo animal del canino y felino también ha sido utilizado para las infecciones por H. pylori, H. felis y H. heilmannii con buenos resultados 99% de colonización en infecciones experimentales (Dubois, 1998). El cerdo (Sus scrofa) inclusive cerdos gnotobioticos han sido usados ampliamente ya se han logrado 100% de colonización en inoculaciones vía oral, de H. pylori y H. heilmannii (Dubois, 1998, Krakowka

and Ellis 2006). También se ha ampliado su uso en nuevas terapias para el tratamiento de H. pylori. Ha sido planteado el modelo del cerdo para establecer la interacción de bacterias del género Helicobacter con agentes virales como: coronavirus, circovirus, pestivirus, entre otros, en el desarrollo de ulceras gástricas, es decir la interacción virus-bacterias en la ulcerogénesis gástricas. A la vez el modelo experimental del cerdo, permite estudiar la carcinogénesis gástrica asociada a la infección por H. pylori y HLO. El desarrollo de tumores asociados a la infección crónica por H. pylori ha sido reportada asociada a una hiperplasia del tejido linfoide asociado a mucosa (MALT), reseñados pólipos gástricos, linfomas y

adenocarcinomas gástricos. Varios estudios han asociado la inflamación y citocinas a la carcinogénesis (Kountouras y col. 2007). El aumento de la producción de IL-1b inducida por H. pylori e hipoclorhidria se asocia con un mayor riesgo de cáncer gástrico. Además, el TNF-a xenografted promueve la metástasis de las células del cáncer gástrico humano. Ha sido propuesta la activación de las factor kB nuclear (NF-kB), una característica distintiva de respuestas inflamatorias que con frecuencia se detectan en los tumores (Nardone y col. 2007). En la siguiente tabla se describe detalladamente cada modelo experimental animal establecido en mayor o en menor escala para los estudios de Helicobacter sp.

Línea/Cepa

Obtención

Aplicación

Perro (Canis familiaris)

Beagle

Cría Convencional (SpA) Espontaneo

Infecciones crónicas Inmunidad/Vacunas

Babuino (Papio sp.).

Babuino

Cría Convencional Espontaneo

Infecciones crónicas Inmunidad/Vacunas

Cerdo (Sus scrofa)

Gnotobiotic pig Gnotobioticos (Recién nacidos)

Cesaría/Aséptico/Aislador Libre Agentes Patógenos

Infección Experimental Virulencia Inmunidad/Vacunas Carcinogénesis Linfoma/MALT

Cobayos (Cavia porcellus)

Dunkin-Hartley

Charles River en 1968 de Medical Research Council, Millhill, Inglaterra. Línea Comercial

Inmunidad/Vacunas Carcinogénesis química

Gato (Felis catus)

Laboratorio Convencional

Cría Convencional Espontaneo

Inmunidad/Vacunas Gastritis Linfofolicular

Gerbil Mongolia (Meriones unguiculatus)

Laboratorio Convencional

Cría Convencional Espontaneo

Carcinogénesis química

Hamster (Mesocricetus auratus) (Crisetulus griseus)

Laboratorio Convencional

Cría Convencional Espontaneo

Inmunidad y vacunas Carcinogénesis química

Hurones (Mustela furo)

Laboratorio Convencional

Cría Convencional Espontaneo

Infección natural Gastritis Linfocitaria Antral MALT Linfoma gástrico

Lémures (Hapalemur aureus)

Laboratorio Convencional

Cría Convencional Espontaneo

Inmunidad/Vacunas

Mono Rhesus (Macaca mulata)

Laboratorio Convencional

Cría Convencional Espontaneo

Inmunidad/Vacunas

Mono Japones (Macaca fuscata)

Laboratorio Convencional

Cría Convencional Espontaneo

Inmunidad/Vacunas

Inmunocompetetentes (SCID) (C57BLC/6)

C.B17 Homocigotos mutación (SCID) Cepa Consanguínea 1921 por CC pequeño en el Instituto Bussey

BALB/c Mouse House

Nueva York 1920

C3H/HeJ

Mutación espontanea Strong 1920 (Cepa Bagg Albino Hembra/DBA macho)

Deficientes IgA

Mutaciones Dirigidas

Transgénicos Knock-out

Mutaciones Dirigidas rocF, p53, OLFM4 ,MIF, TLR2,TLR4

Ratones (Mus musculus)

Rata (Rattus norvegicus)

Gnotobiotic Rats Gnotobioticos (Recién nacidos) Albinas Wistar Sprague Dawley

Chimpancé (Pan troglodytes)

Laboratorio Convencional

Cesaría/Aséptico/Aislador Libre Agentes Patógenos Espontaneo Espontaneo. 1906 Wistar Institute Filadelfia. Espontanea. R. Dawley, Sprague-Dawley Company, Wisconsin, 1925. A hybrid hooded male was mated to a white female subsequently to his white female Offspring for seven successive generations. Espontaneo

Infección Experimental Virulencia Inmunidad Vacunas Carcinogénesis

Infección Experimental Virulencia Inmunidad

AVFT

Especie

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 33, número 3, 2014

Tabla 1.- . Especie animal, línea o cepa, Modo de obtención, aplicación

Discusión

Referencias

Como se resume en la tabla 1 múltiples animales de experimentación se han utilizado en el estudio del género Helicobacter, sin embargo no hay un modelo animal idóneo para el estudio de infecciones, carcinogénesis gástrica por Helicobacter sp. Cada modelo tiene sus fortalezas y debilidades y la elección de un modelo animal depende de los objetivos experimentales. Sin embargo un área con mayor desarrollo en los últimos años es el uso de animales transgénicos y Knock Out como modelo animal experimental para el estudio del género Helicobacter y sus especies especificas. A nivel mundial es posible derivar estudios del Helicobacter en muchas especies animales, sin embargo gran cantidad de transgénicos y ratones knock out, se están desarrollando por su versatilidad y múltiples ventajas. Los pequeños carnívoros como modelos experimentales permiten estudios a través gastroscopias, biopsias repetidas que están limitados en modelos animales de roedores (ratones y ratas). El costo económico y las condiciones de manejo se pueden considerar como una desventaja. Los primates no humanos por sus características compatibles con el humano se consideran biológicamente y patológicamente como el modelo experimental ideal, pero económicamente se limita su estudio. Las ventajas del ratón sobre otros animales experimentales incluyen la capacidad para manipular la información genética nueva, dentro de la célula y de transmitirla a la línea germinal, tiene un ciclo reproductivo muy corto y los tamaños de las camadas son muy grandes. Así como el ratón es un animal pequeño, manejable, bien caracterizado y muy usado en el laboratorio. Es una especie que cuenta con muchas cepas consanguíneas diferentes. Además, el conocimiento de la biología del ratón es grande. Para el ratón existe un número abundante de anticuerpos y sondas de cDNA, se han construido bibliotecas genómicas y de cDNA para cada cepa de ratón. Los ratones son relativamente baratos en comparación con otros animales experimentales su mantenimiento aún en condiciones de alta seguridad es relativamente sencillo. Por otro lado, en la técnica de células Stem embrionarias, necesaria para crear ratones knock-out, las únicas células disponibles, hasta muy recientemente, han sido las células Stem embrionarias de ratón. El ratón, también, con la técnica de inyección usada en la gran mayoría de casos para hacer animales transgénicos, es muy conveniente, debido a la disponibilidad de números relativamente grandes de huevos fertilizados, y también a su tamaño y resistencia. Es muy importante hacer notar que la conservación evolutiva nos ha mostrado que tanto los ratones como otros mamíferos son embarazosamente similares a los humanos.

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Pubertad precoz

central secundario a hamartoma hipotalamico Precocious central puberty secondary to hypothalamic hamartoma

Carmen Dávila, MD1,2, Joselyn Rojas, MD, MSc3, Valmore Bermúdez, MD, MSc, MPH, PhD3 1 Cursante del Máster en Endocrinología Ginecológica y Reproducción. Universidad de Alcalá, Madrid, España. Director: Dr. Melchor Álvarez de Mon Soto, MD, PhD. 2 INTERECO S.A. Centro De Diagnóstico Por Ultrasonido. Guayaquil, Ecuador. 3 Centro de Investigaciones Endocrino-Metabólicas “Dr. Félix Gómez”. Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela.

Resumen

Summary

Pubertad Precoz se define como la presentación secuencial de cambios puberales (en la configuración de la mama y vello pubiano) antes de los 8 años en las niñas; estando influenciado por factores étnicos, nutricionales, ambientales, geográficos. Su etiopatogenia puede estar a nivel central (dependiente de gonadotropina), a nivel periférico (no dependiente de gonadotropinas) o puede ser parcial (variantes del desarrollo puberal). Tiene una incidencia mayor en niñas en relación 10:1. En el presente caso se sospecha de PPC causada por tumores del SNC, con una sospecha inicial de Hamartoma Hipotalámico (HH). Esta tumoración es derivada del tejido nervioso dependiente del hipotálamo, y en niñas constituye el 16% de los casos y en varones aproximadamente el 50%. Para el diagnóstico la RMN es una opción invalorable, concomitante con la determinación del pico de LH como respuesta a la estimulación con LHRH. La importancia del diagnóstico radica en la necesidad de iniciar un tratamiento, donde para el HH puede ser quirúrgico y/o con Análogos de GnRH.

Precocious puberty is defined as the sequential presentation of (in the configuration of the breast and pubic hair) pubertal changes before age 8 in girls, being influenced by several factors such as ethnic, nutritional, environmental, geographical. Its pathogenesis may be centrally (gonadotropin-dependent), at the peripheral level (not dependent on gonadotropins) or may be partial (variants of pubertal development). The highest incidence is observed in girls with a 10:1 ratio. In the presented case is suspected of PPC caused by CNS tumors the first thing to be discarded is the Hypothalamic Hamartoma, a congenital tumor of the nervous tissue of the hypothalamus; whose incidence in is 16% of cases and in males 50%. The role of MRI imaging for diagnosis is invaluable, concomitant with the determination of the LH surge in response to LHRH stimulation. The importance of the diagnosis lies in the need to initiate treatment; in the HH can be surgical or GnRH analogues; in such a way that part psychosocial and the final size of the patient can not be affected.

Palabras clave: pubertad precoz, dependiente de GNH, Hamartoma hipotalámico

Keywords: puberty early, dependent on GNH, hypothalamic Hamartoma

Introducción

En las especies femeninas del género humano, se está observando una tendencia a pubertad en edades más tempranas, influenciado probablemente por diversos factores tales como los étnicos, raciales, condiciones nutricionales, ambientales y/o geográficas1. Nos referimos a pubertad precoz cuando observamos signos de características sexuales secundarias, categorizados por James Tanner en la década de los sesenta, edad ósea adelantada y una velocidad de crecimiento acelerada en niñas menores de 8 años o por debajo de 2.5 desviaciones estándares por debajo de la media2. La incidencia de pubertad precoz se calcula en 1:5.000 a 1:10.000 recién nacidos vivos3. La frecuencia de presentación es mayor en niñas que en niños, siendo la relación 10:1, sin embargo varios autores lo establecen inclusive en 23:12,3. Etiológicamente la pubertad precoz se clasifica en Pubertad Precoz Central (PPC) la

cual puede ser idiopática ó familiar (con mayor frecuencia en las niñas)4 y secundaria a tumoraciones o malformaciones del SNC; la Pubertad Precoz Periférica (PPP) la cual puede ser congénita o adquirida; y Pubertad Precoz Mixta (tumores productores de esteroides sexuales)2. Es poco frecuente observar PPC en niñas causada por lesiones tumorales del SNC, estas son más frecuentes en varones con un porcentaje de frecuencia de 33-90%. El Hamartoma hipotalámico HH es uno de los primeros diagnósticos a evaluar, definiéndose como una malformación congénita benigna originada por la proliferación excesiva de células del tejido nervioso (neuronas, glías y fibras mielínicas)2, frecuentemente localizado en el piso del tercer ventrículo y con unos diámetros promedio <1.5 cm1. La precisión de la RMN en este diagnóstico hace que sea un método de elec-

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ción. El propósito del conocimiento de la PPC causada por Hamartoma Hipotalámico es llegar a un diagnóstico oportuno a fin de estimar la posibilidad de opciones terapéuticas eficaces. Presentación del caso El presente caso se trata de niña de 1 año y 9 meses, quien es llevada a la consulta por sus padres por presentar sangrado transvaginal cíclico, de 3 meses de evolución, el cual está caracterizado por ciclos de 3-4 dias cada 30 días, simulando ciclo menstrual. El sangrado no es abundante, siendo descrito tipo “spotting” por lo que no se ha asociado con anemia. Se recogen los siguientes antecedentes: nacida por parto eutósico de una gestación a término con todos los controles prenatales normales, donde la madre niega exposición a moduladores tóxicos de la pubertad. Dentro de los antecedentes pertinentes al caso, la madre refiere al primer mes de edad presencia de acné, el cual es manejado por pediatra quien insiste que era un rash insignificante tipo miliaria y que desaparecería con el desarrollo de la lactante. A los 6 meses aparece telarca, motivo por el cual acude de nuevo a pediatra de cabecera quien desestima el signo y lo admite únicamente como un proceso pasajero. A los 8 meses de edad la madre se percata de la presencia de vello púbico y hedor axilar. Finalmente, a los 18 meses se observa por primera vez el sangrado vaginal, cual ocurre por 3 meses consecutivos de 3 – 4 días cada mes y acuden al endocrinólogo pediatra quien solicita exámenes pertinentes para decidir manejo con Análogos de GnRH debido a un diagnóstico presuntivo de Pubertad Precoz.

mas y vello púbico están en estadio Tanner 2. Las resultados de laboratorio indican: FSH 1.13 mUI/ml, LH 1.2 mUI/ml, 17 β estradiol 20 pg/ml, exámenes generales normales (hemograma, proteínas y electrolitos). Permanece con Acetato de Leuprolide 3.75mg 1 ampolla cada 15 días. Figura 1. Radiografía de muñeca izquierda, reportando una edad ósea de 3.6 años, con una edad cronológica de 1.10 meses. Método: Greulich-Pyle.

Figura 2. Evaluación por RMN. Se observa la lesión ocupante de espacio en área hipotalámica, con hallazgos sugestivos de Hamartoma hipotalámico.

Durante la exploración física, se evidencia una lactante mayor normocéfala con perímetro cefálico 52 cm. Al exámen cardiopulmonar, ambos campos pulmonares se auscultan ventilados, con 28 respiraciones por min; mientras que ruidos cardiacos se aprecian rítmicos y sin soplos, con 88 latidos por minuto. El abdomen está blando y sin visceromegalias. Extremidades simétricas con reflejos normales para su edad. Desde el punto de vista antropométrico, se evaluó talla con 99 cm (> P97), peso de 18.4 kg (>P97). Genitales, se observa Tanner 2-3 para vello púbico y Tanner 3-4 para mamas. Los exámenes de laboratorio reportaron lo siguiente: FSH 3.6 mUI/ml, LH 11.27 mUI/ml, 17 β estradiol 137.40 pg/ml, Cortisol 8.8 µg/dl, DHEAS 30 µg/dl,17 Hidroxiprogesterona 1.1 ng/ml, GH 1.2 ng/ml, ACTH 12.40 pg/ml, IGF1 182ng/ ml, IGFBP3 4.73 µg/dl, β HCG <1mUI/ml, Alfafetoproteinas 1.34 IU/ml, Antígeno carcino embrionario 1.31 ng/ml. y función tiroidea normal. Dentro de los exámenes de imágenes, la edad ósea reportó un desarrollo óseo para una niña de 3.6 años de edad (Figura 1). Se realiza RMN, la cual reporta imagen nodular en íntima relación con el piso del III ventrículo que se proyecta a la cisterna supraselar a la derecha de la línea media, inmediatamente por detrás del tallo infundibular, mide en sus ejes mayores 1.1cm x 0.7cm (Figura 2). Se instala tratamiento con Acetato de Leuprolide (3.75mg) 1 ampolla cada 15 días. Acude a control 4 meses después, con una edad cronológica de 2 años 2 meses, midiendo 103 cm y pesando 20 kg. Al examen ginecológico, se observa ma-

Los padres de la niña son aconsejados con respecto a la posibilidad de un abordaje quirúrgico de la lesión y deciden utilizar Acetato de Leuprolide (3.75mg) 1 ampolla mensual. Acuden a consulta 2 meses después, donde se observa que no ha habido mejoría del caso clínico, con estancamiento del Tanner en 2-3 para mamas y vello púbico, pesando 20 kg, y tallando 106 cm. Los exámenes de laboratorio reportan FSH 0.3 mUI/ml, LH 0.17 mUI/ml, 17 β estradiol 41 pg/ml. Se sugiere aumentar la dosis de Acetato de Leuprolide a 1 ampolla (3.75 mg) cada 15 dias. Dos meses más tarde en un nuevo

Discusión La pubertad es un fenómeno orgánico complicado, el cual inicia con el aumento de los pulsos de la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH) en las neuronas autómatas de hipotálamo5-8. Esta hormona actúa sobre la hipófisis, estimulando la secreción de LH – FSH por parte de las neuronas gonadotropas, las que actúan sobre los ovarios para que sinteticen estrógenos. Al mismo tiempo aumenta la hormona de crecimiento GH y el factor de crecimiento similar a la insulina IGF-I7. Son diversos los procesos celulares y moleculares que intervienen para la presentación ordenada y progresiva de estos cambios producto de la neurorregulación8 del eje hipotalamo-hipofisis-gonadal4. La Pubertad Precoz Femenina es la activación prematura del eje hipotalamo-hipofisis-gonada por lo que se incrementa la producción de esteroides sexuales, aparición de los caracteres sexuales secundarios, incremento de la velocidad de crecimiento e inducción de la maduración ósea9, observándose antes de los 8 años, en vez de evolucionar en su marco fisiológico normal a partir de los 10 años en las niñas. En la PP lo irregular radica en la edad de presentación de estos signos, ya que los mecanismos que lo desarrollan son totalmente fisiológicos. Este fenómeno es cada vez es más frecuente, con una incidencia de presentación de 1:5000 – 1:10000 sujetos, siendo mayor en niñas, en un rango de 10:1 4 o 20:110. Los factores que determinan su aparición son variados: genéticos11, socioeconómicos12, nutricionales, raciales2,13, ambientales1 y/ o disrruptores endocrinos10,14. La PP puede presentarse por reactivación o desinhibición de los pulsos de la GnRH siendo esta PP Central o verdadera, la más frecuente. También puede desarrollarse por secreción de esteroides gonadales o extra gonadales independientes de GnRH a esta se llama PP Periférica o pseudopubertad. Con un cuadro clínico sospechoso de esta entidad, los exámenes a solicitarse serán radiografía de los huesos de la mano izquierda para valorar centros de osificación para la

El diagnóstico preciso de PPC causada por tumores del SNC en niños y niñas exige la realización de la RMN del SNC, que confirmará la presencia de Hamartoma hipotalámico, mismos que pueden ser muy pequeños y no rastreables por TAC20. Además permitirá excluir otros diagnósticos tumorales a este nivel como lo son Craneofaringioma, Gliomas, Disgerminomas, Astrocitomas, Ependimomas, Neuroblastoma, Pinealoma, Corioepitelioma; entidades que ofrecen características particulares en neuroimagen, lo que permite su diferenciación. El Craneofaringioma constituye el 3 – 4 % de todas las neoplasias intracraneales, se origina en restos del germen primordial craneofaringeo o células de la hipófisis anterior con desarrollo metaplásico21. Es observado principalmente en niños y adultos jóvenes, y su ubicación es usualmente a nivel supraselar (62%) y menos frecuentemente en región supra e infraselar22. Suelen alcanzar volúmenes de 8-10 cm, presentándose como quiste solitario de contenido oleoso, complejo multiquístico o tumor mixto complejo con componentes quístico y sólidos en su interior inclusive con calcificaciones21,22. Utilizando RMN, los tumores supraselares multiquisticos y las áreas quísticas se ven hipo, híper e iso intensas en T1, mientras que en T2 se observa hipertensa la señal tanto en las zonas sólidas y quísticas, con reforzamiento heterogéneo de la porción solida después de la administración de Gadolinio20-22. Por otro lado, los Gliomas20,22,23 derivan de elementos neurogliales como astrocitos, oligodendrocitos y células ependimarias, los cuales crecen en varias partes del cerebro. Los astrocitomas diferenciados y anaplásicos explican el 20 o 30 % de lo de los gliomas cerebrales y son más frecuentes en niños, a razón de 2:1 con preferencia en varones. Los astrocitomas pielocíticos del tercer ventrículo, el hipotálamo y el quiasma tienden a ocurrir en niños y adultos jóvenes y algunos poseen las características de un Hamartoma21. La localización anatómica del astrocitoma modifica de manera importante el pronóstico. En RMN el astrocitoma anaplásico, se presenta con una señal hipointenso en T1 e hiperintenso en T2, con la utilización de contraste el tejido tumoral se “enciende” y se observa más homogéneo. Nuevas técnicas como la RMN Funcional ayuda a identificar la relación espa-

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Se realiza interconsulta con equipo de neurocirujanos pediatras en Suiza, para evaluar el abordaje quirúrgico, señalan que es improbable la extirpación del tumor por la posición de la lesión. Cinco meses más tarde, la paciente mide 109.5 cm, pesa 20.5 kg, mamas y vello púbico se observan en estadio 2 de Tanner. El control de laboratorio reportó FSH 0.39 mUI/ml, LH 0.11 mUI/ml, 17 β estradiol < 5 pg/ ml, IGF1 152.50 ng/ml, e IGFBP3 4.80 µg/dl. Los padres conocen la evolución de la enfermedad y en la actualidad le administran Acetato de Leuprolide 3.75 mg 1 ampolla cada 10 días. No han aceptado la sugerencia de administrar Acetato de Leuprolide 11.25 mg. cada mes.

edad ósea y deben ser comparados con la edad cronológica de la niña. Los métodos más utilizados son los de Greulich & Pyle15 y el de Tanner, al mismo tiempo como predictor de estatura final puede valerse del método de Bayley5 a pesar de que en condiciones patológicas pierde precisión. El ultrasonido de pelvis evaluará la relación cuerpo/cervix que estará aumentada 2:1, la presencia de línea endometrial, volumen ovárico aumentado >1cc., y presencia de folículos ováricos, son detalles que indican que estos órganos están siendo influenciados por actividad estrogénica16. La determinación de esteroides sexuales y prueba de estimulación LH y FSH por LHRH siendo diagnóstico de PP un pico de LH >7UI/L 17. Si el valor de LH predomina sobre FSH es sugerente de activación puberal particularmente de PPC .18 Además el estudio por TAC y RMN del SNC con atención al hipotálamo- hipófisis permitirá descartar causas tumorales y/o neurogénicas19.

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control, con una edad cronológica 2 años 9 meses, se evidencia progresión del desarrollo óseo con una radiografía de muñeca que reporta 4 años y 2 meses. Midió 106 cm, y pesó 19.8 kg. Los controles hormonales reportan FSH 0.6 mUI/ml, LH 0.3 mUI/ml, y 17 β estradiol 10.2 pg/ml.

cial entre el tumor y la corteza elocuente, y permite dilucidar entre biopsia estereotáxica u operación a “cielo abierto”24. Los gangliomas corresponden al 0.4-2% de los tumores intracraneales, y es considerada como una neoplasia de transición entre tumores gliales y no gliales que se presenta en niños y adultos jóvenes20. Excepcionalmente se presenta antes de los 2 años de edad20,21, y se observa como de apariencia inespecífica, preponderantemente a nivel del lóbulo temporal, pudiendo observarse también a nivel de los lóbulos frontal, parietal y a nivel del cerebelo, la lectura de la RMN de estos sitios puede presentar una masa hipointensa en T1, hiperintensa en T2 con realce variable desde nulo hasta llamativo, en la espectroscopia por RMN de H1 se observa elevación de la colina y del índice Cho/NAA, y disminución de los índices colina/creatinina en relación a las zonas correspondientes en el hemisferio opuesto. Al ser poco vascularizado la Angiografía cerebral no está indicada20,25-27. Dentro de los tumores poco frecuentes, están los neuroblastomas21, los cuales a menudo se observan en los primeros 10 años de vida, comportándose como una neoplasia maligna con altos niveles de recidiva después de la cirugía el tratamiento.

Finalmente, el Hamartoma Hipotalámico es una malformación congénita benigna originada por la proliferación excesiva de células del tejido nervioso (neuronas, glías y fibras mielínicas), clasificándose clínicamente en dos grupos28-29: Grupo con PP se caracteriza por inicio temprano de su sintomatología entre el nacimiento y los 3 años de edad y Grupo que presenta crisis parciales y/o complejas de convulsiones gelásticas, retardo mental y perturbaciones psiquiátricas. Cuando los cambios puberales se dan en etapas muy tempranas debemos sospechar de PPC causada por Hamartoma hipotalámico1,2, ya que en niñas constituye el 16% de los casos y en niños aproximadamente el 50% de los casos1,2. El Hamartoma hipotalámico que debuta con PP, radiológicamente se describe como pedunculados o parahipotalamico se localiza adjunto al suelo del III ventrículo o ligado al hipotálamo inferior por un pedúnculo, no desplaza el hipotálamo, suele ser pequeño y muchas veces no da síntomas y debutan con pubertad precoz28. En este caso de debut temprano fue la clínica de PP y no suele estar relacionada a otras variaciones endocrinas 1,2,28. La PPC relacionada con HH se explica mediante dos teorías propuestas: a) las neuronas GnRH funcionan como pulso heterotópico de GnRH, y b) las células astrogliales van a generar TGP α y su receptor erbB-1 las mismas que facilitan la actividad glial sobre el sistema generador de GnRH. El HH por su localización20 puede ser intrahipotalamico y parahipotalamico a este nivel se ve afectado el hipotálamo ventral que tiene relación con el control de la secreción de GnRH11.y según Boyko6 en pedunculares y sésiles. En RMN se observa como una masa homogénea de densidad similar a las partes blandas, que no realza con contraste intravenoso, en secuencias potenciadas en T1 es isointensa, y en T2 puede ser iso o hiperintensa. Basados en RMN los HH se dividen en 4 tipos; a saber: unido al piso del III ventrículo con estrecha interfase

TIPO I , con amplia interfase TIPO II, extendido en el III ventrículo y la cisterna interpeduncular TIPO III, y TIPO IV el HH que se sitúa totalmente dentro del III ventrículo30. La terapia con Análogos de GnRH 31 es una opción que se utiliza con regularidad, la dosis no es estándar más bien constituye una dosis respuesta. Otra alternativa es el tratamiento quirúrgico convencional para resección total o parcial, con abordaje inferior con craneotomía transilviana, subtemporal o transfrontal y el abordaje superior por aproximación transcalloso – interfornical; la desconexión quirúrgica endoscópica constituye una alternativa válida u otras como ablación por radiofrecuencia y radiocirugía estereotáxica (cirugía con gamma knife)32. Actualmente la ablación laser guiada por stereotaxia constituye un método mínimamente invasivo, seguro y con alta eficacia. En este caso descrito el diagnóstico de PPC es evidente, la temprana presentación de los síntomas debemos pensar en Hamartoma hipotalámico como causante de la enfermedad; a pesar de que es menos frecuente en niñas; los valores de laboratorio lo determinan también como parte de este grupo, concomitante con el diagnóstico que nos da la RMN que sitúan la lesión en un lugar, al criterio de los cirujanos neurólogos inaccesible al procedimiento quirúrgico, con la terapia estipulada en base a análogos de GnRH le permite cierta remisión de la sintomatología que como es evidente debe ser ajustada a las necesidades que cada vez han ido en aumento; al inicio fue prescrita para administración de una ampolladle 3.75mg mensual al momento se está administrando la misma dosis cada 10 días. Se espera que con el advenimiento de nuevas técnicas para resección de este tipo de tumoraciones benignas en un futuro cercano se logre ofrecer a esta paciente una resolución favorable a su patología. Referencias 1. Alvarado R, José, López M, José Manuel. Casos Clínicos Hamartoma hipotalámico, una causa de pubertad precoz: Caso clínico. Rev. Méd. Chile 2001;129: 1179-1182 2. Aran E, Pereira J, Castro L, Vaz R. Voluminoso Hamartoma hipotalámico en un niño de 5 meses: epilepsia y cirugía. Neurocirugía 2003;14:294297. 3. Arita K, Ikawa F, Kurisu K, Sumido M, Harada K, Uozumi T, Monden, et al. The relationship between magnetic resonance imaging findings and clinical manifestations of hypotalamic hamartoma. J Neurosurg. 1999;91:212-20. 4. Macedo DB, Cukier P, Mendonca BB, Latronico AC, Brito VN. Advances in the etiology, diagnosis and treatment of central precocious puberty. Arq Bras Endocrinol Metab 2014;58:108-17. 5. Bayley N, Pinneau SR.; Tables for predicting adult height from skeletal age: revised use with the Greulich-Pyle hand standards. J Pediatr 1952; 40: 423-41. 6. Boyko OB, Curnes JT, Oakes WJ, Burger PC. Hamartomas of the tuber cinereum: CT, MR, and pathologic findings. Am J Neuroradiol. 1991;12:309-14. 7. Castaño De La Mota C, Martín Del Valle F, Pérez Villena A, Calleja Gero ML, Losada Del Pozo R, Ruiz-Falcó Rojas, M.L. Hamartoma hipota-

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Resistencia a aminoglicosidos

y quinolonas en un equino con esofagitis reporte de un caso Aminoglycosides and quinolones resistance in a equine with oesophagitis report of case

¹,²Morales A, ¹García F, ³Morales MR, ²Leal L, ²López P. ¹Departamento de Patología Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Central de Venezuela. ²Departamento de Patología Instituto Nacional de Hipódromos “La Rinconada” Caracas Venezuela. ³Maternidad Concepción Palacios Caracas-Venezuela. Email: aamorales13@gmail.com

Recibido: 20/10/2013

Aceptado: 21/11/2013

Resumen

Summary

El objetivo de este estudio fue reportar un caso de resistencia antimicrobiana a aminoglicósidos y quinolonas en un aislado de Escherichia coli en un equino con esofagitis supurativa del Hipódromo “La Rinconada” Caracas Venezuela. Se remite un equino (Equus caballus) con historia obstrucción esofágica, esofagostomia, y esofagitis supurativa no responsiva a terapia combinada con penicilina, gentamicina y ceftiofur sódico con data de 21 días de tratamiento. Se le practicó la técnica de necropsia, toma de muestras para estudio bacteriológico e histopatológico. La necropsia mostró esofagitis severa, necrosis de coagulación, abundante detritus celular, infección de tejido muscular, periarteritis y periflebitis. Pericarditis y epicarditis focal exudativa purulenta. Los cortes histológicos revelaron: Esofagitis abscedada con periarteritis, arteritis, perineuritis, neuritis con necrosis de coagulación, necrosis licuefactiva, respuesta fibroplásica, tejido de granulación en la región cervical derecha y surco yugular. Se observó abundante contenido de bacterias tipo cocos, Gram negativos, empleando la coloración especial Warthing Starry en la coloración especial. El aislamiento bacteriano evidenció la presencia de E. coli, cuyo antibiograma reveló resistencia a Gentamicina, Ciprofloxacina y Ácido Nalidíxico. En conclusión reportamos una resistencia a aminoglucósidos y quinolonas en una infección esofágica en un equino del Instituto Nacional de Hipódromos “La Rinconada” Caracas Venezuela.

The objective was report of case of resistence a aminoglycosides and quinolones resistance in a isolation of Escherichia coli in a equine with suppurative oesophagitis. Refer a horse (Equus caballus) with esophageal obstruction history, esophagostomy and suppurative esophagitis not responsive to combination therapy with penicillin, gentamicin or ceftiofur with dates from 21 days of treatment. Were practice necropsy and sampling for bacteriological and histopathological study. The necropsy showed severe esophagitis suppurative, coagulation necrosis, abundant cellular debris, with infection of muscle tissue, periflebitis and periarteritis. Pericarditis and exudative epicarditis focal purulent. Histological sections revealed esophagitis abscess with periarteritis, arteritis, perineuritis, neuritis with coagulation of necrosis and necrosis liquefact, fibroplasic response and granulation tissue in the neck and right jugular furrow. Were observed content abundant types of bacteria spherical, Gram negative, positive staining especially Warthing Starry. The bacteria isolated showed the presence of E. coli. antibiogram revealed whose resistance to gentamicin, ciprofloxacin and nalidixic acid. In conclusion we report a resistance to aminoglycosides in an esophageal infection in a horse racetrack, National Institute of “La Rinconada Caracas Venezuela. Keywords: esophagitis, antimicrobial resistance, aminoglycosides, equine.

Resultados Estudio Macroscópico: Los hallazgos de necropsia fueron: esofagitis supurativa severa, necrosis de coagulación, abundante detritus celular, con infección de tejido muscular (músculo braquiocefálico y externocefálico), periarteritis y periflebitis (Figura 1). Edema, congestión y hemorragia pulmonar, exudado supurativo en traquea y bronquitis. Pericarditis y epicarditis focal exudativa purulenta. Hepatomegalia severa con necrosis con patrón focal. Esplenocontracción esplénica, nefritis intersticial y pielonefritis bilateral con adherencia de la cápsula renal. Hemorragia cortical de glándulas adrenales bilateral. Gastritis aguda superficial con úlceras focales en los límites del margo plicatus. Figura 1.- Equino (Equus caballus), con solución de continuidad por esofagotomia quirúrgica en la región yugular, con infección supurativa, focos de necrosis de licuefactiva (flechas).

Materiales y Métodos Se remite un equino (Equus caballus) de sexo macho, de 2 años de edad, en actividad atletica, del Hipódromo “La Rinconada” Caracas, Venezuela. Con historia de obstrucción esofágica, esofagostomía, esofagitis supurativa post-quirúrgica, emaciación aguda severa, polidipsia, poliurea, pelo hirsuto, anorexia, colapso, shock y muerte con infección exudativa purulenta no responsiva a terapia combinada con penicilina G procainica 22.000 UI/kg IM (cada 12 horas), gentamicina 6.6 mg/kg (cada 24 horas) y ceftiofur sódico 6.6 mg/kg IM (cada 12 horas), todos los antibióticos fueron administrados durante de 21 días. Se le practicó eutanasia, la técnica de necropsia y toma de muestras según el protocolo sistemático descrito para equinos6. Las muestras tomadas fueron fijadas en formol al 10% y procesadas por los métodos convencio-

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La aparición de resistencia bacteriana contra antibióticos tiene considerable importancia médica y se correlaciona con el aumento en el uso de antibióticos para tratamiento de enfermedades infecciosas. Existe una variedad de plásmidos que transportan múltiples genes de resistencia a antibióticos1. Las bacterias pueden ser resistentes a la actividad antimicrobiana de los aminoglucósidos por no tener la capacidad de penetrar al interior de las bacterias, por la escasa afinidad del compuesto por el ribosoma bacteriano o debido a que el medicamento es inactivado por enzimas bacterianas1,2,3. Las mutaciones monofásicas en E. coli, culminan en la sustitución de un aminoácido en una proteína ribosómica crucial, llegan a impedir la unión del fármaco al microorganismo. Las cepas de E. coli mencionadas son altamente resistentes a la Estreptomicina, pero no tienen amplia distribución en la naturaleza. Los mecanismos de resistencia a fármacos que se conocen son: 1.- Adopción por el microorganismo de una vía metabólica alterna para esquivar la reacción inhibidora. 2.- Producción de una enzima o de enzimas que degradan el antibiótico o que inactivan el medicamento por acetilación, adenilación o fosforilación. 3.- Cambio en la permeabilidad con disminución en la captación del medicamento por la célula o por alguna parte especial de la célula. 4.- Blanco para el medicamento cuya estructura se ha alterado. La resistencia en bacterias Gram-negativas a la gentamicina se ha convertido en un problema cada vez más común entre los aislados clínicos de los seres humanos4. Los seres humanos pueden ser colonizados por E. coli de origen animal resistente a los agentes antimicrobianos comúnmente utilizados, y estas bacterias pueden provocar infecciones para las que están limitadas las opciones terapéuticas disponibles. E. coli de origen animal puede actuar como donante de genes de resistencia a antimicrobianos a otros patógenos5. El objetivo de este estudio fue reportar un caso de resistencia antimicrobiana a aminoglucósidos y quinolonas en un aislado de Escherichia coli obtenido en un equino con esofagitis supurativa del Hipódromo “La Rinconada” Caracas Venezuela.

nales histológicos (deshidratación, aclaración, infiltración y cortes al micrótomo7. Se tomaron secciones de tejido esofágico e hisopados, los cuales se colocaron en medio de transporte Stuart y cultivadas según los métodos de aislamiento microbiano. La determinación Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), se realizo a partir de cultivos puros. Fueron tomadas varias colonias y se resuspendieron en 5ml de SFS estéril hasta obtener una turbidez equivalente a solución estándar. De esta suspensión fueron tomados 250 µl y se agregaron en 24,75 ml de SFS estéril para obtener una dilución 1:100, con una concentración final de inóculo de aproximadamente 1x106 ufc/ml. Esta dilución fue sembrada en las placas de microtitulación del método de microdilución en caldo. El cálculo de la CIM90 fue comparado con los criterios de interpretación estándar1,2.

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Introducción

Estudio Histológico: Los cortes histológicos revelaron: esofagitis con periarteritis, arteritis, perineuritis, neuritis con necrosis de coagulación y necrosis licuefactiva, respuesta fibroplásica y tejido de granulación en la región cervical derecha y surco yugular (Figura 2). Se observó abundante contenido de bacterias tipo cocos Gram negativos, positivos a la coloración especial de Gram

y de Warthin Starry (Figura 3 y 4). El tejido renal presentó nefritis intersticial y pielonefritis severa polimorfonuclear neutrofilica con degeneración tubular aguda y necrosis cortical. El resto de los tejidos mostraron cambios consistentes con un síndrome de coagulación intravascular diseminada. Figuras 2.- Microfotografía de esófago con solución de continuidad y esofagitis supurativa erosiva, e infiltración mixta polimornuclear neutrofilico y mononuclear linfocitario, con abundante detritus celular y tejido de granulación (10X).

Figura 3.- Microfotografía de esófago coloración especial (+) Tinción de Gram, se observan cocos Gram negativos abundantes, y los macrofagos cargados con bacterias positivos (20X).

Figura 4.- Microfotografía de esófago coloración especial de sales de plata Warthing Starry (+) se observan cocos abundantes positivos, difusos en el tejido necrosado (40X).

aislamiento de bacterias identificadas E. coli. El antibiograma evidenció resistencia a Gentamicina, Ciprofloxacina y Acido Nalidixico. La concentración mínima inhibitoria (CIM) para gentamicina fue de 1-8 µg/ml, ciprofloxacina 0,5-4 µg/ ml y para ácido nalidixico 2-3 µg/ml. Discusión El resultado clínico, anatomopatológico, aislamiento bacteriano y antibiograma revelan un síndrome de esofagitis supurativa con resistencia a aminoglucósidos y quinolonas en el equino estudiado. La esofagitis supurativa ha sido reportada en equinos asociada a cuadros obstructivos8,9. La resistencia de E. coli ha sido ampliamente reportada en la literatura en equinos4,5,10,11,12, coincidiendo con los resultados obtenidos en nuestro estudio. En estudios de resistencia al comparar los resultados en dos periodos de tiempo hubo un aumento en el porcentaje de aislados de E. coli resistentes a todos los antibióticos excepto a amikacina. La resistencia a gentamicina aumentó en el segundo periodo (1980-1985)10. En equinos han reportado aislados de E. coli con resistencia a sulfametoxazol a trimetropin-sulfametazol asi como gentamicina y tetraciclinas12. Existe una asociación entre la hospitalización y la administración de drogas antimicrobianas con la prevalencia de la resistencia entre cepas de E. coli aisladas de heces de caballos12. Existe un aumento significativo en el porcentaje de cepas resistentes a trimetropin-sulfametoxazol, penicilina, tetraciclina y gentamicina11. La vigilancia periódica de la evolución de la resistencia bacteriana a los agentes antibacterianos es indispensable en la estructura de un hospital. La adopción de buenas prácticas de antibiótico-terapia es esencial para garantizar una disminución de los riesgos de la selección y difusión de una cepa de bacterias resistentes11,13,14. Enterobacterias aisladas en equinos (Enterobacter, Klebsiella, Proteus, y otras bacterias como Pseudomonas), han sido susceptibles a amikacina pero resistentes a gentamicina4. En un estudio en el Hipódromo de Santa Rita (Estado Zulia-Venezuela), La P. aeruginosa y la E. coli fueron las bacterias más resistentes y por tanto más difíciles de tratar13. Las sensibilidades en un 100% de la P. auruginosa, E. coli y K. pneumoniae ante la gentamicina y amikacina, demuestran que estos antibióticos aún tienen utilidad práctica en la antibiótico-terapia de animales que padecen infecciones clínicas o sub-clínicas, como es en el caso de los caballos del Hipódromo Nacional de Santa Rita13. Este reporte difiere con los resultados obtenidos en el caso clínico-patológico en estudio. En conclusión, reportamos un caso de resistencia a aminoglucósidos y quinolonas en una infección esofágica por Escherichia coli en un equino del Instituto Nacional de Hipódromos “La Rinconada” Caracas Venezuela. Referencias 1. Carter GR, Chengappa MM. Micology and Bacteriology Veterinary. 2 ed: Manual Moderno. (Mexico)1994. p. 137-155.

Estudio Bacteriológico: La tinción de Gram evidenció la presencia de cocos Gram negativos abundantes. Se realizo el

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9. Donald M. Special Veterinary Pathology. 3rd ed. Mosby. (USA). 1996. p. 24-29.

Señalización de la adrenomedulina

en el vermis del cerebelo de la rata (adrenomedullin signaling in rat cerebellar vermis) Adrenomedullin signalling in rat cerebellar vermis Figueira Leticia e Israel Anita Laboratorio de Neuropéptidos. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. Caracas - Venezuela. *Correspondencia: Apartado Postal 50176, Sabana Grande 1050A, Caracas, Venezuela. E-mail: astern88@gmail.com

Recibido: 20/10/2013

Aceptado: 21/11/2013

Resumen

Summary

La adrenomedulina (AM) es un péptido ubicuo que se encuentra en el cerebelo, y que ejerce sus acciones a través de la activación de diversas vías de señalización; sin embargo, en el vermis cerebeloso estas vías aún son desconocidas. En el presente estudio se evaluaron las posibles vías de señalización que median la acción de la AM en el vermis cerebeloso, así como los subtipos de receptores de AM involucrados. Para ello, ratas macho Sprague Dawley fueron sacrificadas, se disecó el vermis cerebeloso y estimuló el tejido in vitro con AM, en presencia o ausencia de sus bloqueantes específicos. Posteriormente, se determinó la activación de las ERK, la acumulación de monofosfato de inositol (InsP1) y producción de AMPc, GMPc, NO y proteínas. Se demostró que la AM es capaz de activar a las ERK, la producción de GMPc y NO a través de la estimulación del receptor AM1, y del AMPc a través de los tres subtipos de receptores de AM, lo que apoya que en el cerebelo la AM ejerce acciones a través de la activación de las vías NO/GMPc, AC/AMPc y/o ERK, lo cual sugiere la existencia de un sistema adrenomedulinérgico funcional en el cerebelo de la rata.

Adrenomedullin (AM) is a ubiquitous peptide. In brain, AM is expressed in several localized regions, including the cerebellum. AM signals through several pathways. Little is known about the signaling pathways associated to AM receptor in cerebellum. Therefore, we assessed the signaling pathways mediating AM action in rat cerebellum vermis, as well the receptor involved. For this purpose, male Sprague Dawley rats were sacrificed, the cerebellar vermis was dissected under stereomicroscopic control and the tissue was stimulated in vitro with AM, in the presence or absence of specific blockers of AM receptor subtypes: AM22-52 or CGRP8-37. ERK activation was assayed by western blot. inositol monophosphate (Ins1), cGMP and cAMP accumulation was determined by radioimmunoassay. NO was determined spectrophotometrically. Our findings demonstrate that in cerebellum, AM increased cAMP and cGMP production, NO accumulation and ERK activation. These effects are mediated through the activation of AM1 receptor, since AM22-52 blunted AM action, meanwhile AM increase of cAMP production is also mediated through stimulation of AM2 and CGRP receptors. These results indicate that in cerebellum AM excets its effects through several signaling pathways such NO/cGMP, AC/cAMP and/ or ERK suggesting the presence of a functional adrenomedullinergic system in cerebellum.

Palabras claves: AM, cerebelo, señalización.

Keywords: AM, cerebellum, signaling pathways.

La AM ejerce sus acciones principalmente a través de su unión con tres subtipos de receptores, el receptor del péptido relacionado al gen de la calcitonina tipo 1 (CGRP1), el receptor de AM tipo 1 (AM1) y tipo 2 (AM2). El CGRP1 está formado por el receptor similar al receptor de calcitonina (CRLR) y la proteína que modifica la actividad del receptor tipo 1 (RAMP1); por su parte, el complejo CRLR/ RAMP2 y CRLR/RAMP3 constituyen los receptores de AM, denominados AM1 y AM2 respectivamente8,23. La AM inicialmente fue caracterizada como un péptido hipotensor19; sin embargo, han sido muchas las acciones descritas para la AM; pues promueve la proliferación celular, apoptosis, migración, inflamación, angiogénesis, inhibición de la secreción de endotelina, inhibición de la ingesta de agua y sal1,2,23. Uno de los mecanismos de acción a través del cual actúa la AM y por el cual fue descubierto fue a través de su capacidad de elevar los niveles de adenosina monofosfato cíclico (AMPc)19. En diferentes tipos celulares como plaquetas, células de músculo liso vascular, endoteliales, tubulares renales, mesangiales, estelares hepáticas y líneas celulares como la oligodendroglial humana KG-1C, entre otras; la AM ha demostrado elevar los niveles de AMPc 1,44,47,48. Adicionalmente, en varios tipos de células, la AM ha demostrado activar otras vías de señalización como la fosfolipasa C (PLC), guanilil ciclasa (GC), quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) y otras proteínas de la familia de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) como MAPK p38 y la proteína quinasa c-Jun NH2 terminal (JNK)13,22. Por lo tanto, los mecanismos de señalización por los cuales la AM media sus funciones varían entre especies y lecho vascular, pero generalmente involucran al AMPc, óxido nítrico (NO) y mecanismos dependientes de calcio. Por su parte, el efecto antiapoptótico de la AM en células de miocardio ha sido relacionado con la vía fosfatidil inositol 3 quinasa (PIK3) – Akt. Finalmente en células endoteliales, la cascada de las MAPK puede ser activada por la AM6. En el sistema nervioso central (SNC), se ha demostrado la presencia de AM y sus sitios de unión en la corteza

Actualmente, se conoce poco acerca de las vías de señalización que median la acción de la AM cerebelar; por lo que en el presente estudio se evaluaron las posibles vías de señalización de la AM en el vermis de cerebelo de la rata, así como los subtipos de receptores que median dicha acción.

Materiales y métodos Animales de Experimentación Se emplearon ratas macho Sprague-Dawley de 250 g, provenientes del Bioterio del Instituto Nacional de Higiene Dr. Rafael Rangel. Los animales fueron mantenidos en jaulas a temperatura ambiente con ciclos de 12 horas luz / oscuridad. La dieta de los animales consistió en Ratarina® y agua ad libitum. Los experimentos fueron realizados siguiendo las buenas prácticas para el manejo de animales de laboratorio32 y la aprobación del Comité de Bioterio de la Facultad de Farmacia de la UCV. Las ratas se sacrificaron por decapitación, los cerebros fueron extraídos y el vermis del cerebelo se disecó mediante microdisección bajo control estereomicroscópico y mantenido en Buffer Krebs-Ringer (KBR) burbujeado con 95% O2 y 5% CO2. Posteriormente cada muestra fue preincubada a 37ºC en presencia o ausencia de los antagonistas o inhibidores y posterior estimulación con agonista. El vermis cerebeloso fue homogenizado mediante sonicación en el buffer de lisis respectivo para cada tipo de ensayo, centrifugado a 10.000 rpm y el sobrenadante recolectado fue utilizado como muestra. Vías de Señalización Determinación de las ERK La determinación de la ERK total y fosforilada se realizó por Western Blot. Para lo cual el tejido estimulado con agonista (AM) en presencia y ausencia de los antagonistas fue homogeneizado en frío mediante sonicación, en

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La adrenomedulina (AM) es un péptido de 52 residuos de aminoácidos perteneciente a la familia de los péptidos de la calcitonina que fue aislado por primera vez en el feocromocitoma humano19. La AM es un péptido ubicuo, pues tanto el péptido como su ARNm han sido encontrados en varios tejidos como la aurícula y ventrículo cardíaco, aorta, pulmón, riñón, páncreas, intestino delgado, hígado, testículo y músculo10,20,38; además se ha evidenciado AM en la circulación, orina, saliva, fluido cerebroespinal y amniótico30.

cerebral, glándula pituitaria, bulbo raquídeo, hipotálamo y cerebelo16,27,33. En el cerebelo, la inmunoreactividad a la AM se ha apreciado en los núcleos lateral, interpósito y medial cerebelar; así como en las capas molecular, de las células de Purkinje y en la granular de la corteza cerebelar40. La presencia del sistema AM cerebelar, sugiere un posible papel de este péptido a este nivel. Sin embargo, muy pocos han sido los estudios sobre la AM en el cerebelo. Recientemente, se ha demostrado la activación de vías de señalización de la AM a este nivel. En este sentido, la presencia de la actividad de la sintasa de óxido nítrico (SON) en el cerebelo, en elementos celulares que presentan receptores para la AM, indica un posible papel de la misma en la regulación de la función celular mediante la posible generación de NO/ guanosina monofosfato cíclico (GMPc), como mediadores de los efectos de dicho péptido35. Estos hallazgos permiten inferir un papel funcional de la AM cerebelosa.

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Introducción

Buffer de lisis para ERK (Tris Base 50 mM, 5mM EDTA, 1mM NaF, Na3VO4, Tritón X-100 1% y mezcla de inhibidores de proteasas compuesto por Pepstatina A 5μM, aprotinina 10μg/ml, leupeptina 10μM, PMSF 2mM, pH 7,4). El homogeneizado fue centrifugado a 4oC, a 10.000 rpm durante 10 minutos, para obtener el sobrenadante, el cual fue congelado a -70ºC hasta el momento de su procesamiento. Para el análisis por Western Blot, alícuotas del homogeneizado (100μg proteínas) diluidas en Laemmli fueron separadas por electroforesis en gel SDSpoliacrilamida al 10 % y transferidas a una membrana de nitrocelulosa durante 1 hora. Las membranas fueron bloqueadas con leche descremada al 10%, y posteriormente incubadas durante toda la noche a 4oC con el anticuerpo primario, anti-fosfo-ERK y anti-ERK de conejos (Cell Signaling) diluido en solución de albúmina sérica bovina al 3% en TBS-Tween al 0,1% (Dilución 1:1000). Las membranas fueron lavadas con TBS- Tween al 0,1% e incubadas con anticuerpo secundario anti conejo conjugado con peroxidasa de rábano, diluido en solución de albúmina sérica bovina al 1,5% en TBS- Tween al 0,1 % (Dilución 1:1000) durante 1 hora en agitación lenta a temperatura ambiente. Las proteínas fueron visualizadas por quimioluminiscencia (SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate) a través de películas para rayos X y cuantificadas mediante análisis densitométrico (Quantity One 1-D ®- BioRad). La expresión de la ERK fosforilada fue normalizada con la ERK total.

KBR (conteniendo en mM: NaCl 125; KCl 3,5; KH2PO4 1,25; MgSO4 1,20; CaCl2 0,75; NaHCO3 25; glucosa 10 y teofilina 1,6) burbujeado con 95% O2 : 5% CO2. Para el ensayo de la activación de la GC cada vermis del cerebelo fue transferido individualmente a tubos Eppendorf conteniendo 180 µL de buffer KBR, sometiéndose a preincubación durante 10 minutos a 37ºC, en presencia o ausencia de los correspondientes antagonistas. La reacción se inició con el agregado de los agonistas (20 µL), o buffer para los controles, al medio de incubación seguidos de 10 minutos adicionales de incubación. La reacción se detuvo agregando 20 µL EDTA (166 mM, pH 7,5) y calentando a 90 ºC durante 3 min. Las muestras fueron mantenidas en hielo y posteriormente homogeneizadas mediante sonicación. Las muestras fueron congeladas a –20ºC para la posterior determinación del GMPc.

Determinación del Recambio de Fosfoinosítidos La hidrólisis de los fosfoinosítidos fue determinada como la acumulación de monofosfato de inositol (InsP1) en presencia de LiCl 10 Mm (11, 24). Para ello, los vermis de los cerebelos fueron marcados durante dos horas a 37°C, en 20 mL de KBR que contenía 0,5 mCi de myo-[23 H]-inositol (Amersham, actividad específica 18,8 Ci/mmol) gasificado continuamente con O2 (95%): CO2 (5%).

La cantidad de GMPc se calculó utilizando una curva estándar (rango de 0 a 4 pmol/tubo). La actividad GC se reportó como pmoles de GMPc formados/10 min/mg de proteínas.

Después del marcaje, los tejidos fueron lavados en KBR fresco gasificado y transferidos a KBR que contenía LiCl 10 mM. El tejido fue transferido a tubos Eppendorf de 1,5 mL que tenían 360 μL de buffer KBR - LiCl y se incubaron por 10 minutos a 37°C con los agonistas en presencia o ausencia de los antagonistas. La reacción fue detenida mediante la adición de 100 mL de ácido tricloroacético (concentración final 6%) en frío. Los tejidos fueron sometidos a ultrasonido en hielo y centrifugados a 10.000 g durante 15 min., a 4°C. El sobrenadante se utilizó para cuantificar la acumulación del InsP1 mediante cromatografía de intercambio aniónico. Las fracciones (5 mL) que contenía el InsP1 fueron recolectadas y la radioactividad cuantificada mediante espectrometría de centelleo líquido. Ensayo de la Guanilil Ciclasa El vermis del cerebelo fue extraído mediante microdisección bajo control estereomicroscópico y mantenido en

Determinación del GMPc Se tomó una alícuota de 100 µL para la determinación del GMPc. El contenido de GMPc se cuantificó por radioinmunoensayo (RIA) por el método descrito por46, utilizando un kit comercial (AmershamÒ International plc, UK). El ensayo se fundamenta en la competencia entre el GMPc no radioactivo (muestra) y una cantidad fija del compuesto marcado, por la unión a un anticuerpo que posee alta especificidad y afinidad por el GMPc. La cantidad de GMPc radioactivo unido al anticuerpo está relacionada inversamente con la concentración de GMPc presente en la muestra.

Determinación de AMPc El contenido de AMPc se cuantificó por ensayo inmunoenzimático (ELISA), utilizando un kit comercial (Arbor Assay, USA). Para ello, se incubó 50 µL de muestra en una placa de 96 pozos cubierta con un anticuerpo para captura. Posteriormente se agregó un conjugado AMPc – peroxidasa. La reacción de unión fue iniciada con la adición de anticuerpo al AMPc. Después de 2 horas de incubación, la placa fue lavada y el sustrato añadido. La absorbancia fue leída a 450 nm. La cantidad de AMPc se calculó utilizando una curva estándar (rango de 0 a 150 pmol/mL). La producción de AMPc se reportó como pmoles de AMPc formados/10 min/mg de proteínas. Ensayo para la determinación de la producción de NO La producción de NO fue determinado colorimétricamente como una medida de la producción de nitrato/nitrito formado. Este ensayo consiste en determinar la acumulación de nitrito (producto final estable de la síntesis de NO) en el sobrenadante mediante la reacción de Griess7. Determinación de las Proteínas Tisulares Las proteínas tisulares totales fueron determinadas utilizando albúmina sérica de bovino como patrón26.

Efecto de la AM sobre la activación de las ERK en el cerebelo de la rata. Subtipos de receptores que median la acción de la AM Se evaluó el efecto de la AM sobre la activación de las ERK en el vermis cerebelar de la rata. Como se puede apreciar, la incubación del vermis cerebelar con AM (2X10-7 M) durante 5 min, activó de manera significativa las ERK (p<0,001; N=12). De igual manera, se evaluó la posible participación de los subtipos de receptores de AM en las acciones de la AM sobre la activación de las ERK. Como se observa en la figura 1, el pretratamiento con la AM22-52, antagonista de los receptores de AM, durante 10 min, bloqueó completamente la activación de las ERK inducida por la AM en el vermis cerebelar de la rata (1,3 + 0,2 vs. 0,98 + 0,21 AM22-52 vs. AM22-52+AM). Por su parte, la adición de CGRP8-37, antagonista del receptor CGRP, no alteró la activación de las ERK inducida por la AM (0,91 + 0,02 vs. 1,22 + 0,09 CGRP8-37 vs. CGRP8-37 + AM) (N=12; *p<0,001).

Se evaluó la acumulación de fosfatidilinositoles inducida por la AM en el vermis de cerebelo de la rata. Como se observa, en la figura 2 la incubación del vermis cerebelar con AM (2X10-7 M) durante 5 min, no alteró la acumulación de monofosfato de inositol cuando se compara con su basal (0,035 + 0,003 vs. 0,036 + 0,001 Basal vs. AM). (N=6). Efecto de la AM sobre la activación de la adenilil ciclasa (AC) en el cerebelo de la rata. Subtipos de receptores que median la acción de la AM Se evaluó el efecto de la AM sobre la activación de la AC en el vermis de cerebelo de la rata. Como se observa, en la figura 3 la incubación del vermis cerebelar con AM (2X10-7 M) durante 10 min incrementó significativamente la producción de AMPc, el pretratamiento con la AM22-52, antagonista de los receptores de AM, durante 10 min, bloqueó la acumulación del AMPc inducida por la AM en el vermis cerebelar de rata (17,70 + 1,53 vs. 21,60 + 1,84 AM22-52 vs. AM22-52+AM). De igual manera, la adición de CGRP8-37, antagonista del receptor CGRP, bloqueó la acumulación de AMPc inducido por la AM (15,22 + 3,74 vs. 22,45 + 4,71 CGRP8-37 vs. CGRP8-37 + AM) (N=7; *p<0,0001). Efecto de la AM sobre la activación de la GC en el cerebelo de la rata. Subtipos de receptores que median la acción de la AM Se evaluó el efecto de la AM sobre la activación de la GC en el vermis de cerebelo de la rata. Como se ob-

Figura 1

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Resultados

Efecto de la AM sobre la acumulación de fosfoinositoles en el vermis cerebeloso en la rata.

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Análisis Estadístico Los resultados fueron expresados como la media + error estándar de la media (E.E.M.). Se realizó la prueba de Shapiro-Will, para evaluar la distribución de las variables. La significancia de los resultados fue analizada mediante el análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la prueba de Bonferroni. Un valor de p<0,05 fue considerado significativo. El análisis de los resultados y la elaboración de los gráficos se realizaron empleando el programa Graph Pad Prism versión 5.1.

Efecto de la AM sobre la activación de las ERK y subtipos de receptores de AM involucrados en la activación (fosforilación) de las ERK en el vermis de cerebelo de rata. El vermis cerebelar fue incubado con AM (2 X10-7 M) durante 5 min en presencia y ausencia de AM22-52 (1X10-6M) o CGRP8-37 (1X10-6M) durante 10 min. Se emplearon 100 μg de proteínas provenientes del vermis cerebelar de las ratas para el western blotting. Los resultados fueron expresados como la media + E.E.M. La expresión de la p-ERK fue normalizada con la de la ERK-total. (N=12). *p<0,001 vs. Basal. #p<0,0001 vs. CGRP8-37.

serva, en la figura 4 la incubación del vermis cerebelar con AM (2X10-7 M) durante 10 min, incrementó significativamente la acumulación del GMPc cuando se compara con su basal. De igual manera, se evaluó los subtipos de receptores de AM involucrados en los efectos de la AM sobre la acumulación del GMPc en el vermis de Figura 2

Efecto de la AM sobre la acumulación de monofosfato de inositol en el vermis de cerebelo de ratas. El vermis cerebelar fue incubado con AM (2 X10-7 M durante 5 min) o vehículo (Basal). Los resultados fueron expresados como la media + E.E.M. de la acumulación de [H3]InsP1 (N=6). Figura 4

cerebelo de rata. Como se observa en la figura 4, el pretratamiento con la AM22-52, antagonista de los receptores de AM, durante 10 min, bloqueó la acumulación del GMPc inducida por la AM en el vermis cerebelar (228,82 + 10,91 vs. 214,00 + 8,37 AM22-52 vs. AM22-52+AM). Por el contrario, la adición de CGRP8-37, antagonista del recepFigura 3

Figura 3. Efecto de la AM sobre la activación de la AC en el cerebelo de la rata. Subtipos de receptores que median la acción de la AM. El vermis cerebelar fue incubado con AM (2 X10-7 M) en presencia y ausencia de AM22-52 (1X10-6M) o CGRP8-37 (1X10-6M), durante 10 min. Los resultados fueron expresados como la media + E.E.M. de la acumulación de AMPc. (N=7). *p<0,0001 vs. Basal.

Figura 5

Efecto de la AM sobre la acumulación de GMPc en el vermis de cerebelo de rata. Subtipos de receptores de AM involucrados. El vermis cerebelar fue incubado con AM (2 X10-7 M) en presencia y ausencia de AM22-52 (1X10-6M) o CGRP8-37 (1X10-6M) durante 10 min. Los resultados fueron expresados como la media + E.E.M. de la acumulación de GMPc. (N=23).*p<0,0001 vs. Basal. # p<0,0001 vs. CGRP8-37.

Efecto de la AM sobre la producción de NO en el vermis cerebeloso de la rata. Subtipos de receptores que median la acción de la AM. El vermis cerebelar fue incubado con AM (2 X10-7M) en presencia y ausencia de AM22(1X10-6M) o CGRP8-37 (1X10-6M), durante 15 min. Los resultados fueron 52 expresados como la media + E.E.M. de la producción de nitratos. (N=5). *p<0,05 vs. Basal. # p<0,05 vs. CGRP8-37.

tor CGRP, no alteró la acumulación de GMPc inducido por la AM (273,30 + 13,09 vs. 352,80 + 18,20 CGRP8-37 vs. CGRP8-37 + AM) (N=23; *p<0,0001). Efecto de la AM sobre la producción de NO en el vermis cerebeloso de la rata. Subtipos de receptores que median la acción de la AM. Como se observa, en la figura 5 la incubación del vermis cerebelar con AM (2X10-7 M) durante 10 min, incrementó de forma significativa la acumulación de

nitratos cuando se compara con su basal. El pretratamiento con la AM22-52, antagonista de los receptores de AM, durante 10 min, bloqueó la acumulación de nitratos inducida por la AM en el vermis cerebelar a niveles comparables a sus valores basales (2,01 + 0,16 vs. 2,03 + 0,02 AM22-52 vs. AM22-52+AM). Por el contrario, la adición de CGRP8-37, antagonista del receptor CGRP, no alteró la producción de NO inducido por la AM (2,61 + 0,85 vs. 5,61 + 0,96 CGRP8-37 vs. CGRP8-37 + AM) (N=5; *p<0,05).

AVFT

Figura 6. Propuesta de las vías de señalización activadas por la AM en el vermis de cerebelo de la rata. La AM estimula un receptor específico, activa la adenilil ciclasa y aumenta la producción de AMPc, el cual activa a la PKA que al fosforilar a la SON estimulara la producción de NO y GMPc. Además, la AM estimula la vía de las ERK.

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Figura 6

Discusión Diferentes estudios tanto a nivel central como periférico indican que una de las principales vías a través de la cual la AM ejerce sus efectos es la activación de la vía de la AC/AMPc52. Sin embargo, se sabe que la AM es capaz de activar otras vías de señalización en diversos órganos y tejidos, tales como la PLC, la GC44 y las ERK12. De igual manera, se ha demostrado que la AM es capaz de activar otros mecanismos de señalización intracelular, incluyendo los canales de potasio sensibles a ATP37. Las ERK1/2 son proteínas serina/treonina quinasas que juegan un papel importante en la supervivencia, proliferación y diferenciación de varios tipos celulares34. Diferentes estudios muestran que las ERK1/2 están ampliamente expresadas en tejidos periféricos y centrales. A nivel del cerebelo, existe una alta distribución celular e intracelular de las ERK tanto en ratas jóvenes como adultas. De hecho, estudios de inmunohistoquímica han

demostrado que las células de Purkinje, granulosas y gliales del cerebelo de la rata son inmunoreactivas a las p-ERK1/2 55. En el SNC, algunos estudios han reportado que las MAPK a nivel central pueden cumplir un importante papel en la regulación de la presión arterial, pues Seyedabadi y col.41, demostraron que la inhibición de las MAPK en la región ventrolateral rostral del bulbo raquídeo (RVLM) es vital para el mantenimiento de los niveles tónicos de presión arterial en ratas hipertensas y normotensas. Igualmente, se ha demostrado que las cascadas de las ERK1/2 tienen importancia en la modulación de la potenciación a largo plazo en el hipocampo y es requerida para varias formas de aprendizaje y memoria. Asimismo, se ha indicado que la cascada de las ERK participa en el daño neuronal inducido por isquemia y en la generación de actividad convulsivante en cultivos de neuronas de hipocampo48.

Hasta el presente, se desconoce la vía de señalización de la AM en el cerebelo. En el presente estudio se demostró que la AM fue capaz de activar a las ERK1/2 en el vermis de cerebelo de la rata, siendo dicho efecto mediado principalmente por el receptor de AM1, ya que fue completamente bloqueado por el AM22-52, un inhibidor de los receptores específicos de la AM y no por el pre-tratamiento con CGRP8-37, un bloqueante del receptor CGRP. Nuestros hallazgos, son los primeros que describen el efecto de la AM en el SNC y están avalados por los obtenidos previamente en otros tejidos y órganos donde la AM activa a las ERK1/2. Así, Yoshimoto y col.54, encontraron que la AM activó las ERK1/2 en células de músculo liso. De igual manera, Iwasaki y col.12, encontraron que la AM estimuló la actividad de las MAPK, la expresión de c-fos y subsiguiente proliferación de células de músculo liso vascular a través de una vía dependiente de la proteína tirosina quinasa (PTK), y no a través de la vía AMPc/ PKA o a través de la vía calcio/proteína quinasa C (PKC).

Existe evidencia que indica que la AM es capaz de incrementar los niveles de calcio intracelular y activar la PKC44. De hecho, la activación de los receptores de AM en células endoteliales de bovino, provoca un incremento en la concentración de calcio intracelular y la activación de la PKC a través de la vía inositol 1,4,5 - trifosfato (IP3) y la producción de diacilglicerol44, lo que sugiere que la AM puede activar a la PLC. De igual manera, se ha demostrado que la AM es capaz de incrementar la concentración intracelular de calcio y la producción de IP3 en la línea celular humana de oligodendrogial, KG-1C48; así como en cultivo de neuronas de hipocampo donde la AM fue capaz de disminuir la concentración de calcio intracelular inducidas por alta concentración de potasio o por IP3 a través de los receptores de AM15, lo que sugiere que la AM puede suprimir la liberación de calcio de los depósitos intracelulares, sensibles a IP3, y además la AM puede bloquear la entrada externa de calcio a la célula mediada por canales de calcio dependientes de voltaje. Aún cuando la evidencia sugiere la relación de la AM con la estimulación de la vía del IP3, bajo nuestras condiciones experimentales en el vermis cerebeloso, la AM no alteró el metabolismo de los fosfoinosítidos, lo que indica que la AM no afecta la actividad de la PLC en el vermis de cerebelo de la rata. En apoyo a nuestros resultados, Iwasaki y col.,12 encontraron que la AM no provocó cambios en la producción de IP3 y de calcio intracelular en células de músculo liso vascular. Diversos estudios han indicado que la AM es capaz de activar la vía de la SON/ GMPc44. En efecto, se ha demostrado que la AM incrementa los niveles de GMPc en células cardíacas de ratas18 y en células endoteliales de aorta de bovino, donde el incremento del GMPc inducido por la AM es dependiente del NO y es inhibido por el L-NAME44, lo que sugiere que este incremento puede mediar la acción hipotensora de la AM.

Los efectos de la AM sobre la producción de NO en el cerebro no son claros; sin embargo se ha demostrado un efecto estimulatorio directo de la AM sobre la producción de NO en células de neuroblastoma humano SK-NSH in vitro53. Igualmente, se sabe que la administración icv de AM incrementa la expresión de c-fos en el hipotálamo y tallo cerebral y activa neuronas que producen NO en los núcleos paraventricular (NPV), supraóptico (NSO) y del tracto solitario (NTS), siendo dicho efecto mediado por los receptores de CGRP14. Igualmente, la administración icv de AM causó una marcada inducción de inmunoreactividad c-fos en el NPV y en la porción dorsal de NSO, siendo este efecto dependiente de los receptores específicos de AM39. Estos hallazgos sugieren que la AM central es responsable de la activación de células neurosecretoras en los NPV y NSO del hipotálamo, a través de receptores específicos de la AM. Aún más, se sabe que la AM fue capaz de incrementar la actividad de la SON y la producción de GMPc en la eminencia media de la rata28, y la administración icv de AM en ratas, incrementó la concentración de nitratos y nitritos en el hipotálamo, así como la expresión inmunohistoquímica de la NAD(P)H diaforasa en las neuronas productoras de NO en el NPV42. Por lo tanto, la evidencia indica que el NO está involucrado en numerosas funciones fisiológicas en el SNC desempeñando un importante papel en la regulación de funciones autonómicas21,50. El NO/GMPc podría actuar como un neurotransmisor en el cerebelo29. En este sentido, se ha encontrado alta expresión del sistema de señalización relacionado con el NO a este nivel, pues existe altos niveles de la enzima GC31 y del GMPc5 en las células de Purkinje. Por otra parte, estudios de inmunohistoquímica revelan alta expresión de la proteína quinasa dependiente de GMPc en las células de Purkinje del cerebelo25. Adicionalmente la SON y GC soluble activada por NO muestran colocalización en diversas regiones del cerebelo4,36. Ahora bien, la coincidencia anatómica entre la SON y elementos celulares que presentan receptores para la AM en el cerebelo, sugiere un posible papel de la misma en la regulación de la función celular mediante la posible generación de NO/GMPc35. En apoyo a esto, en el presente estudio se demostró que el efecto de la AM sobre la producción de NO y GMPc cerebeloso en las ratas fue mediado por el receptor AM1, pues fue bloqueado con AM22-52. Similares hallazgos fueron reportados previamente por Pastorello y col.,35, quienes encontraron que la AM estimula la actividad de la SON cerebelosa, a través de la estimulación de su receptor específico. Desde el descubrimiento de la AM, el AMPc fue considerado inicialmente como la principal molécula de señalización intracelular de este péptido. La AM activa la AC en células de músculo liso vascular produciendo un incremento en los niveles de AMPc; lo que sugiere que el

La vía de señalización AMPc/PKA de la AM ha sido postulada como el principal mecanismo de transducción de la AM para sus efectos biológicos, sin embargo, no es la única vía de señalización. A pesar de que los efectos cardiovasculares de la AM tales como la vasodilatación y el inotropismo positivo generalmente se acompañan de elevación del AMPc, hay pocos estudios que indican que tales acciones son bloqueadas tanto por inhibidores de la PKA o por antagonistas del AMPc. Por lo tanto, se ha sugerido que las acciones pleiotrópicas de la AM (crecimiento celular, migración y apoptosis) son independientes de la vía AMPc/PKA. En relación al vermis cerebeloso, nuestros resultados demuestran la participación de la vía de la AC en la acción de la AM, ya que ésta fue capaz de incrementar la producción tisular de AMPc, siendo dicho efecto mediado por los tres subtipos de receptores de AM: AM1, AM2 y CGRP ya que fue totalmente inhibida por el pretratamiento in vitro con AM22-52 y CGRP8-37. Estos resultados sugieren que en el vermis cerebeloso la AM es capaz de activar la vía AC/AMPc/PKA. Aún cuando no se evaluó en forma directa la participación de

En resumen, los resultados presentados en este estudio se demuestra que la AM es capaz de activar las ERK1/2, incrementar la producción de AMPc el cual probablemente a través de la PKA estimularía la vía SON/ NO/GMPc en el vermis de cerebelo de la rata (Fig. 5). Estos hallazgos apoyan la existencia de un sistema adrenomedulinérgico cerebelar de importancia fisiológica. Agradecimientos Los autores agradecen al Sr. Banny Caraballo por su ayuda técnica en los experimentos. Este trabajo fue subvencionado por el Ministerio Popular de Ciencia Tecnología e Industrias, Proyecto Misión Ciencia, Sub-proyecto 7, ECCV No. 2007001585.

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La acción vasodilatadora de la AM es ejercida mediante esta vía de señalización; de hecho el AMPc es el principal segundo mensajero conocido para la vasodilatación. Por otra parte, la acción mitogénica de la AM también es ejercida mediante esta vía de señalización, ya que algunos estudios en células Swiss 3T3 y queratinocitos han demostrado que la AM incrementa la síntesis de ácido desoxirribonucleico (ADN) y la proliferación celular, siendo estos efectos bloqueados por un inhibidor de la PKA (H-89)17,51. Sin embargo, la vía AMPc/PKA es conocida como un regulador negativo del crecimiento celular; en este sentido la AM ha demostrado inhibir la síntesis de ADN en células de músculo liso vascular que crecen de manera asincrónica y suplementada con suero que contiene varios factores de crecimiento12,43. En vista de ello, se ha sugerido que el papel bi-funcional de la AM para el control del crecimiento celular depende del tipo celular y del estado del ciclo celular; ya que en células quiescientes la AM ejerce su acción mitótica mediante la vía PTK/ERK, mientras que la AM ejerce su acción antimitogénica mediante la vía AMPc/PKA en células que crecen asincrónicamente43.

la PKA en dicha señalización nuestros resultados aún no publicados demuestran que en el vermis cerebeloso el pretratamiento con PKI-6-22 -amida, un inhibidor de la PKA, fue capaz de revertir el efecto inhibitorio de la AM sobre la actividad de las enzimas antioxidantes sin afectar la acción de la ANG II, lo que apoya la posibilidad de que el efecto de la AM es mediado a través de la vía de PKA, tal y como lo han reportado otros estudios en otros tejidos3,45,54.

AVFT

receptor de AM está acoplado a la AC a través de una proteína G estimulatoria (Gs) sensible a toxina de cólera, que activa la proteína AC con producción de AMPc y activación de la PKA9. Adicionalmente, se ha demostrado en células KG1C, que el incremento de los niveles de AMPc inducidos por la AM es mediado por el receptor de AM y el CGRP; ya que este efecto es inhibido por antagonista de los receptores de AM y CGRP, AM22-52 y CGRP8-37 respectivamente, pero no por el antagonista del receptor de amilina, amilina-8-37,47.

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Adenilil ciclasa (AC)

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Adenosina monofosfato cíclico (AMPc)

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Error estándar de la media (E.E.M.)

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Buffer Krebs-Ringer (KBR)

Fosfatidil inositol 3 quinasa (PIK3) Fosfolipasa C (PLC) Guanilil ciclasa (GC) Guanosina monofosfato cíclico (GMPc) Inositol 1,4,5 - trifosfato (IP3) Monofosfato de inositol (InsP1) Núcleo del tracto solitario (NTS) Núcleo paraventricular (NPV)

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Núcleo supraóptico (NSO)

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Óxido nítrico (NO)

Proteína que modifica la actividad del receptor tipo 1 (RAMP1) Proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) Proteína quinasa C (PKC) Proteína quinasa c-Jun NH2 terminal (JNK) Proteína tirosina quinasa (PTK) Quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) Receptor de AM tipo 1 (AM1) Receptor de AM tipo 2 (AM2). Receptor del péptido relacionado al gen de la calcitonina tipo 1 (CGRP1) Receptor similar al receptor de calcitonina (CRLR) Región ventrolateral rostral del bulbo raquídeo (RVLM) Sintasa de óxido nítrico (SON) Sistema nervioso central (SNC)

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 33, número 3, 2014

47. Uezono, Y., Nakamura, E., Ueda, Y., Shibuya, I., Ueta, Y., Yokoo, H., Yanagita, T., Oyohira, Y., Kobayashi, H., Yanagihara, N., Wada, A. Production of cAMP by adrenomedullin in human oligodendroglial cell line KG1C: Comparison with calcitonin gene – related peptide and amylin. Brain Res. Mol., 97: 59 – 69, 2001.

Adrenomedulina (AM)

AVFT

46. Steiner, A., Parker, C., Kipnis, D. Radioimmunoassay for cyclic nucleotides. J. Biol. Chem., 247: 1106 – 1113, 1972.

Ácido desoxirribonucleico (ADN)